DE69829976T2 - Verfahren zur herstellung von zellen - Google Patents

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    • Y10S435/849—Escherichia coli

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, die transformationsfähig bzw. kompetent sind und die für längere Zeiträume bei verschiedenen Temperaturen stabil gelagert werden können. Das Verfahren schließt ein Züchten von Zellen in einem dem Wachstum förderlichen Medium, ein Funktionsfähig- bzw. Kompetentmachen der Zellen und ein Lyophilisieren der kompetenten Zellen ein. Die Erfindung betrifft weiter kompetente Zellen, die durch ein derartiges Verfahren hergestellt werden, Verfahren zum Transformieren von Zellen mit einem DNA-Molekül und ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids aus den transformierten Zellen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Eine Reihe von Methoden zur Herstellung von kompetenten Zellen und die Einführung von DNA in diese Zellen existiert. Zum Beispiel beschreiben Mandel und Higa (Journal of Molecular Biology 53, 159 (1970)) eine Methode, wodurch Bakteriophagen-DNA mit E. coli Zellen in Gegenwart von 50 mM Ca2+ bei 0°C kombiniert werden, gefolgt von einem kurzen Hitzeimpuls bei 37°C-42°C. Dieses Verfahren wurde erweitert zu einer Aufnahme von chromosomaler DNA (Cosloy und Oishi, Proceedings of the National Academy of Science 70, 84 (1973)) und Plasmid-DNA (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972)). Eine Zusammenfassung der Faktoren, die die Effizienz der Transformation beeinflussen, wird in Hanahan (JMB 166, 557 (1983)) aufgeführt. Diese Faktoren schließen die Zugabe anderer Kationen wie beispielsweise Mg, Mn oder Rb zu den Ca-behandelten Zellen sowie die Dauerinkubation von den Zellen in CaCl2 ein. Die Effizienz einer Transformation von E. coli Zellen wird im Wesentlichen durch das von Hanahan beschriebene Verfahren verbessert (JMB (1983), nachstehend bezeichnet als „Hanahan (1983)"). In dem Hanahan (1983) Verfahren werden die Zellen bei 37°C in Gegenwart von 20 mM Mg gezüchtet. Plasmid-DNA wird mit den Zellen bei 0°C in Gegenwart von Mn, Ca, Rb oder K, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dithiothreit (DTT) und Hexamincobaltchlorid kombiniert. Kompetente Zellen verschiedener Stämme von Escherichia coli (E. coli), die durch das letztere Verfahren hergestellt werden, weisen Transformationseffizienzen von 1 bis 5 × 108 Transformanten/μg Plasmid-DNA auf.
  • Ein anderes Verfahren zur Herstellung von kompetenten E. coli Zellen wird in der US Patent Nr. 4,981,797 (Jessee und Bloom, 1991) offenbart. Das Verfahren schließt die Schritte eines Züchtens der Zellen in einem dem Wachstum förderlichen Medium bei einer Temperatur von weniger als 37°C, eines Kompetentmachens der Zellen und deren anschließenden Einfrierens ein.
  • Allgemein weisen gefrorene kompetente Zellen, die durch Verfahren, wie beispielsweise die oben zusammengefassten, hergestellt werden, Transformationseffizienzen von ungefähr 1 × 108 Transformanten/μg Plasmid-DNA auf. Diese kompetenten Zellen können bei –80°C für mehrere Monate ohne signifikanten Verlust der Transformationeffizienz gelagert werden. Jedoch sind Zellen, die durch die oben umrissenen Verfahren hergestellt werden, extrem instabil, wenn sie bei Temperaturen, höher als –80°C (z. B. –20°C), gelagert werden. Stabile Lagerung von kompetenten Zellen bei höheren Temperaturen ist sehr gewünscht, weil viele Forschungslaboratorien keinen Zugang zu –80°C-Gefrierapparaten haben.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, das es erlaubt kompetente Zellen zu lyophilisieren und über längere Zeiträume bei verschiedenen Temperaturen (–80°C bis Raumtemperatur) zu lagern, ohne nennenswert an Transformationeffizienz zu verlieren. Damit stellt das Verfahren der Erfindung prokaryotische kompetente Zellen bereit, die keine Speziallagerungsbedingungen (z. B. extrem niedrige Temperaturen) benötigen, um die Transformationeffizienz solcher Zellen aufrechtzuerhalten.
  • Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Herstellung prokaryotischer Zellen bereit, die transformationskompetent sind, wobei das Verfahren ein Züchten der Zellen in einem dem Wachstum förderlichen Medium, ein Kompetentmachen der Zellen und Lyophilisieren der kompetenten Zellen umfasst. Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden die Zellen durch ein Inkubieren der Zellen in einem Kompetenzpuffer kompetent gemacht, vorzugsweise bei geringer Temperatur (z. B. 0°C bis 4°C), wobei die Zellen dann in Gegenwart eines Gefrierschutzmittels lyophilisiert werden.
  • Die Erfindung betrifft weiter prokaryotische kompetente Zellen, die durch solch ein Verfahren hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen Escherichia Zellen, am meisten bevorzugt E. coli. In einer bevorzugteren Ausführungsform werden die E. coli Zellen aus der Gruppe bestehend aus DH5α und DH10B ausgewählt.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Transformieren der lyophilisierten kompetenten Zellen, die durch das oben zusammengefasste Verfahren mit einem DNA-Molekül hergestellt werden. Die Erfindung betrifft auch die transformierte Zelle, die durch diese Verfahren hergestellt wird.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins durch erstens Erhalten einer lyophilisierten kompetenten Zelle, die durch das obige Verfahren hergestellt wird, durch Transformieren der lyophilisierten kompetenten Zelle mit einem DNA-Molekül, das im Stande ist, das gewünschte Protein zu exprimieren, und dann Kultivieren der transformierten Zelle unter Bedingungen, die geeignet sind, das gewünschte Protein herzustellen. Die Erfindung betrifft auch ein Protein, das durch dieses Verfahren hergestellt wurde.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • 1 ist ein Graph, der die Transformationeffizienz von kompetenten E. coli DH5α zeigt, die lyophilisiert und bei –20°C in NUNC Tieftemperaturampullen gelagert wurden, wobei das verwendete Gefrierschutzmittel entweder Trehalose oder Sucrose war.
  • 2 ist ein Graph, der die Vermehrungsfähigkeit der Zellen von kompetenten E. coli DH5α zeigt, die lyophilisiert und bei –20°C in NUNC Tieftemperaturampullen gelagert wurden, wobei das verwendete Gefrierschutzmittel entweder Trehalose oder Sucrose war.
  • 3 ist ein Graph, der die Transformationeffizienz von kompetenten E. coli DH5α zeigt, die lyophilisiert und bei –20°C gelagert wurden, wobei das Gefrierschutzmittel Trehalose war und das Produkt in Glasampullen absolut abgedichtet wurde.
  • 4A ist ein Graph, der die Transformationeffizienz von kompetenten E. coli DH5α zeigt, die in NUNC Tieftemperaturampullen lyophilisiert wurden, wobei die Zellen zuerst bei –80°C für 16 Stunden eingefroren, lyophilisiert und dann bei –20°C für unterschiedliche Zeiträume gelagert wurden.
  • 4B ist ein Graph, der die Transformationeffizienz von kompetenten E. coli DH5α zeigt, die in NUNC Tieftemperaturampullen lyophilisiert wurden, wobei die Zellen zuerst in flüssigem Stickstoff eingefroren, lyophilisiert und dann bei –20°C für unterschiedliche Zeiträume gelagert wurden.
  • 5 ist ein Graph, der die Vermehrungsfähigkeit der Zellen von kompetenten E. coli DH5α zeigt, die in NUNC Tieftemperaturampullen lyophilisiert und bei –20°C für unterschiedliche Zeiträume gelagert wurden, wobei einer Lyophilisierung und Lagerung bei –20°C entweder ein Einfrieren bei –80°C für 16 Stunden oder ein Einfrieren in flüssigem Stickstoff vorausgegangen ist.
  • 6 ist ein Graph, der die Transformationeffizienz von kompetenten E. coli DH5α zeigt, die gemäß Beispiel 3 lyophilisiert wurden.
  • 7 ist ein Graph, der die Vermehrungsfähigkeit der Zellen von kompetenten E. coli DH5α zeigt, die gemäß Beispiel 3 lyophilisiert wurden.
  • 8 ist ein Graph, der die Transformationeffizienz von kompetenten E. coli DH10B zeigt, die in Glasampullen lyophilisiert, die absolut abgedichtet waren, und bei –20°C gelagert wurden, wobei das verwendete Gefrierschutzmittel entweder Trehalose oder Sucrose war.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Definitionen
  • In der Beschreibung, die folgt, wird eine Anzahl von Begriffen weitreichend verwendet, die in der DNA-Rekombinationstechnik benutzt werden. Um ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche bereitzustellen, einschließlich des durch derartige Begriffe zu verleihenden Schutzumfangs, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt.
  • DNA-Molekül
  • Ein beliebiges DNA-Molekül, einer beliebigen Größe, aus einer beliebigen Quelle, einschließlich DNA von viralen, prokaryotischen und eukaryotischen Organismen. Das DNA-Molekül kann in beliebiger Form vorliegen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf linear oder ringförmig und einzel- oder doppelsträngig. Nichtbeschränkende Beispiele von DNA-Molekülen schließen Plasmide, Vektoren und Expressionsvektoren ein.
  • Klonierungsvektor
  • Ein Plasmid, Phage-DNA, ein Cosmid oder anderes DNA-Molekül, das fähig ist, autonom in einer Gastzelle zu replizieren und das durch eine oder eine kleine Zahl von Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen gekennzeichnet ist, an denen derartige DNA-Sequenzen in einer festsetzbaren Art und Weise ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vektors geschnitten werden können und in die ein DNA-Fragment gespleißt werden kann, um Replikation und Klonierung hiervon zu bewirken. Der Klonierungsvektor kann weiter einen Marker enthalten, der für die Verwendung zur Identifikation von Zellen geeignet ist, die mit dem Klonierungsvektor transformiert wurden. Marker sorgen zum Beispiel für Tetracyclin-Resistenz oder Ampizillin-Resistenz.
  • Expressionsvektor
  • Ein Vektor ähnlich einem Klonierungsvektor, der aber im Stande ist, ein Gen zu exprimieren, das in ihn kloniert wurde, nach Transformierung in einen Gast. Das klonierte Gen ist gewöhnlich unter der Steuerung von (z. B. funktionsfähig verknüpft mit) bestimmten Kontrollsequenzen wie beispielsweise Promotersequenzen gestellt.
  • Stabil gelagert
  • In der Bedeutung der vorliegenden Erfindung sind kompetente Zellen, die "stabil gelagert" werden können, fähig einer Lagerung für längere Zeiträume bei einer geeigneten Temperatur standzuhalten, ohne nennenswert ihre Transformationeffizienz zu verlieren. Mit dem Ausdruck „ohne nennenswert ihre Transformationeffizienz zu verlieren" ist gemeint, dass die kompetenten Zellen ungefähr 40 % bis 100 %, vorzugsweise 60 % bis 100 %, bevorzugter 70 % bis 100 % und am meisten bevorzugt ungefähr 80 % bis 100 % ihrer ursprünglichen Transformationeffizienz (gleich nach einer Lyophilisierung) während einer Lagerungsperiode von 30 Tagen, vorzugsweise von 60 Tagen, bevorzugter von 90 Tagen und am meisten bevorzugt von 120 Tagen, bei einer Temperatur von –20°C aufrechterhalten. Geeignete Lagerungstemperaturen variieren von ungefähr Raumtemperatur bis ungefähr –180°C. Vorzugsweise reicht die Lagerungstemperatur von ungefähr 4°C bis ungefähr –80°C, vorzugsweise von ungefähr –20°C bis ungefähr –80°C. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung werden die Zellen bei ungefähr –20°C gelagert. Die Lagerungsperiode oder -zeit kann von ungefähr 0 Tagen bis ungefähr 150 Tagen reichen, vorzugsweise von ungefähr 240 Tagen bis ungefähr 365 Tagen und bevorzugter von ungefähr 365 Tagen bis ungefähr 450 Tagen, obgleich längere Lagerungszeiten bei Temperaturen von ungefähr –20°C und darunter verwendet werden können.
  • Kompetente Zellen
  • Zellen, die die Fähigkeit aufweisen, ein exogenes DNA-Molekül aufzunehmen und zu etablieren bzw. hervorzubringen.
  • Im Wesentlichen rein
  • Wie hier verwendet, bedeutet es, dass das gewünschte gereinigte Protein frei von verunreinigenden zellulären Komponenten ist, die sich mit dem Protein in der Natur verbinden würden. „Im Wesentlichen rein" deutet nicht an, dass das Protein vollständig von allen Verunreinigungen frei sein muss.
  • Das Verfahren der Erfindung sorgt für die Herstellung von prokaryotischen Zellen, die transformationskompetent sind und die für längere Zeiträume bei unterschiedlichen Temperaturen stabil gelagert werden können. Sowohl gramnegative als auch grampositive prokaryotischen Zellen (z. B. Bakterien) können gemäß der Erfindung verwendet werden. Beispiele für geeignete prokaryotischen Zellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Escherichia sp., Klebsiella sp., Salmonella sp., Bacillus sp., Streptomyces sp., Streptococcus sp., Shigella sp., Staphylococcus sp. und Pseudomonas sp. Nichtbeschränkende Beispiele von Arten in jeder einzelnen oben genannten Gattung, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, schließen Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Streptomyces aureus, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae und Pseudomonas syringae ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen, die durch das beanspruchte Verfahren kompetent gemacht werden, Escherichia, am meisten bevorzugt E. coli. Nichtbeschränkende Beispiele von E. coli-Stämmen, die durch die beanspruchten Verfahren kompetent gemacht werden können, schließen ein: DH5, DH5α, DH10, DH10B, HB101, RR1, JV30, DH11S, DM1, DH10B/p3, DH5αMCR, DH5α5'IQ, DH5α5', SCS1, Stab2, DH12S, DH5α-E, DH10BAC, XL1-Blue MRF, XL2-Blue MRF, XL1-Blue MR, SURE-Stamm, SURE 2-Stamm, XL1-Blue, XL2-Blue, AG1, JM101, JM109, JM110/SCS110, NM522, TOPP-Stämme, ABLE-Stämme, XL 1-Red, BL21-Stämme, TK B1-Stamm und Derivate davon.
  • Gemäß dem Verfahren der Erfindung werden die Zellen, um kompetent gemacht zu werden, in einem dem Wachstum förderlichen Medium gezüchtet. Ein beliebiges Medium, das im Stande ist, das Wachstum der Zellen zu unterstützen, um sie kompetent zu machen, kann verwendet werden. Beispiele derartiger Medien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: Luria Broth, Luria Broth ergänzt mit 20 mM MgCl2, 0,001 % Thiamin und 0,2 % Glukose; SOB-Medium, das 0,001 % PPG (Rezeptur unten angegeben) enthält; und 15/10 Medium (Rezeptur unten angegeben). Andere geeignete Medien werden von dem Fachmann leicht erkannt.
  • Die Inkubationstemperaturen, um die Zellen zu züchten, können von ungefähr 10° bis ungefähr 42°C variieren. Vorzugsweise reichen die Temperaturen von ungefähr 12° bis ungefähr 37°C, bevorzugter von ungefähr 15°C bis ungefähr 32°C und am meisten bevorzugt von ungefähr 20° bis ungefähr 25°C. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung werden die Zellen bei ungefähr 23°C gezüchtet.
  • Wie ein Durchschnittsfachmann verstehen wird, können Züchtungsbedingungen und Alter der Kultur sowohl die Vermehrungsfähigkeit als auch die Transformationeffizienz der Zellen nach der Kältekonservierung beeinflussen. Zellen, die in Schüttelkolben-Kultur gezüchtet wurden, sind allgemein resistenter gegenüber den Beanspruchungen der Gefriertrocknung als es statische Brutkulturen sind. Weiterhin übt das Alter einer Kultur ebenso Wirkung auf die Fähigkeit der Kultur, die Gefriertrocknung zu überleben. Allgemein zeigen Zellen, die im späten exponentiellen oder frühen stationären Wachstum geerntet werden, die größte Resistenz gegenüber der Gefriertrocknung.
  • Damit werden gemäß der vorliegenden Erfindung die Zellen in Schüttelkolben gezüchtet, obwohl andere Wachstumsmittel einschließlich Fermentatoren genutzt werden können. Schüttelkolben, die in der Erfindung verwendet werden, können jede beliebige Größe und Bauform haben. Vorzugsweise werden 2,8-l-Liter-Schüttelkolben mit Schikanen für dies Verfahren verwendet. Inkubationszeiten werden gemäß den verwendeten Bedingungen (Temperatur, Medium, Belüftung usw.) und dem Zelltyp variiert. Die Belüftung in Kolben variiert gemäß der verwendeten Drehung pro Minute (U/min), wobei höhere U/min zu stärkerer Belüftung führen. Kolben werden typischerweise bei 100-500 U/min geschüttelt, vorzugsweise bei 200-400 U/min und am meisten bevorzugt bei 200-300 U/min, obwohl ein Durchschnittsfachmann andere bevorzugte Bereiche festlegen kann. Zellen werden typischerweise für eine Zeitdauer und unter Bedingungen gezüchtet, die ausreichen, um eine optische Dichte (OD) bei 550 nm zwischen 0,1 to 2,0 zu erreichen. Vorzugsweise reicht die OD von 0,1 bis 1,0, bevorzugter von 0,3 bis 0,8, bevorzugter von 0,5 bis 0,8, noch bevorzugter von 0,5 bis 0,7, noch mehr bevorzugt von 0,6 bis 0,8 und am meisten bevorzugt von 0,66 bis 0,75.
  • Nachdem die Zellen die gewünschte OD erreicht haben, können die Zellen für eine Weiterverarbeitung eingesammelt werden. Gemäß der Erfindung können, wenn die gewünschte OD nicht erreicht oder überschritten wird, die Zellen wieder neu geimpft werden und das Zuchtverfahren kann wiederholt werden, bis eine Kultur von ausreichender optischer Dichte erhalten wird.
  • Nachdem die Zellen eingesammelt wurden (durch Zentrifugieren, Filtration usw.), können sie optional gekühlt werden (z. B. 0° bis 4°C für 5 Minuten bis 2 Stunden). Ein Einsammeln der Zellen kann durch Zentrifugieren der Zellen begleitet werden, um einen Zellenniederschlag zu erhalten. Ein Einsammeln kann auch durch ein Anreichern der Zellen und dann Zentrifugieren der konzentrierten Kulturen begleitet werden, um einen Zellenniederschlag erhalten. Verfahren zum Anreichern der Zellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Entwässern der Kultur, Filtern oder Unterwerfen der Kultur einer Größenausschlusschromatographie, z. B. unter Verwendung von CentriconTM Säulen (Amicon Corp., Lexington, MA).
  • Nachdem die Zellen eingesammelt wurden, werden die Zellen in einem Kompetenzpuffer wieder suspendiert. Ein Kompetenzpuffer ist eine beliebige Lösung, die Zellen befähigt, exogene DNA aufzunehmen und zu etablieren. Nichtbeschränkende Beispiele von Kompetenzpuffern schließen ein: 50 mM CaCl2, 10 mM Tris/HCl (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ed., Cold Spring Harbor, NY (1989)); 0,1 M MOPS (pH 6,5), 50 mM CaCl2, 10 mM RbCl2, 23 % V/V DMSO; CCMB80 Puffer (10 mM Kaliumacetat pH 7,0, 80 mM CaCl2·H2O, 20 mM MnCl2·4H2O, 10 mM MgCl2·6H2O, 10 % Glycerin, mit 0,1 N HCl eingestellt auf pH 6,4); TFB Puffer (Liu et al., Biotechniques 8(1), 23-25 (1990)); und χ1776 Puffer (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ed., Cold Spring Harbor, NY (1989)). Andere geeignete Puffer werden in Tang et al., Nucl. Acids Res, 22(14), 2857-2858 (1994); Chung et al., Proc. Natal. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989); M. Dagert und S. D. Ehrlich, Gene 6, 23-28 (1974); Kushner, S. R., In: Genetic Engineering (H. W. Boyer und S. Nicosia, Hrsg.) S. 17-23, Elsevier/North Holland, Amsterdam (1978); Mandel und Higa, J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970); US Patent Nr. 4,981,797 von Jessee; und Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983) offenbart.
  • Die Zellen, die in dem Kompetenzpuffer suspendiert wurden, werden für eine ausreichende Zeit und bei einer Temperatur, die ausreicht die Zellen für eine DNA-Aufnahme kompetent zu machen, inkubiert. Vorzugsweise werden die Zellen bei geringer Temperatur (0 bis 4°C) für 0 bis 3 Stunden inkubiert, bevorzugter 5 min bis 1 Std. und am meisten bevorzugt 5 min bis 30 min. Nachdem die Zellen kompetent gemacht wurden, kann ein Gefrierschutzmittel direkt zu der Zellsuspension zugefügt werden. Vorzugsweise werden die Zellen eingesammelt und dann in einem Gefrierschutzmittel wieder suspendiert. Die Konzentration des Gefrierschutzmittels wird abhängig vom Zelltyp, den verwendeten Puffern, der Art des Gefrierschutzmittels und anderer Faktoren variieren. Optimale Bedingungen können durch einen Fachmann ohne unangemessenes Experimentieren festgelegt werden. Gefrierschutzmittel sorgen für Schutz der Zellen während des Einfriervorgangs durch Absenken des Gefrierpunkts, Minimieren des Effekts des Lösungswechsels außerhalb der Zelle, durch Durchdringen der Zelle, um gegen Konzentrationseffekte von gelösten Substanzen zu schützen, und/oder durch Verschieben der optimalen Kühlrate zu niedrigeren Werten (F. P. Simione, Journal of Parenteral Science & Technology, 46(6), 226-232 (1992)). Selbstverständlich darf das Gefrierschutzmittel nicht toxisch gegenüber den Zellen sein. Weitere Informationen bezüglich der Konservierung lebender Zellen durch Gefriertrocknen können bei Simione, 1992, gefunden werden.
  • Ein beliebiges Gefrierschutzmittel und eine Kombination davon kann gemäß der Erfindung verwendet werden. Wie ersichtlich wird, kann die verwendete Art und Menge abhängig vom Zelltyp und den verwendeten Bedingungen variieren. Gefrierschutzmittel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: Kohlenhydrate und Kohlenhydrat-Derivate, wie beispielsweise Trehalose, Sucrose, Lactose, Maltose, Mannitol, Galactose, Ribose, Fructose, Xylose, Mannose, Dextrose, Glucose und Sorbitol sowie Polymere, wie beispielsweise Polyethylenamin, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Ficoll usw. Andere Gefrierschutzmittel, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, wie beispielsweise Gummiarabicum, Albumin, Gelatine und Zuckeralkohole werden leicht von einem Fachmann erkannt werden.
  • Nachdem die Zellen mit dem Gefrierschutzmittel gemischt wurden, kann die Zellsuspension in gleiche Teile in Behältnisse verteilt werden, um zur Lyophilisierung und Lagerung verwendet zu werden, wie beispielsweise gekühlte Tieftemperaturampullen, z. B. NUNC Rohre (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Katalognr. 366656) oder Glasampullen (Wheaton, Millville, N.J.). Vor der Lyophilisierung werden die Zellen bei ungefähr –20°C bis ungefähr –180°C eingefroren, vorzugsweise bei ungefähr –80°C bis ungefähr –180°C, am meisten bevorzugt bei ungefähr –80°C.
  • Verfahren zum Einfrieren einer Probe bis zu einer Temperatur von ungefähr –80°C bis ungefähr –180°C sind auf dem Gebiet gut bekannt. Dies schließt eine Lagerung über Nacht (ungefähr 16 Stunden) der Ampullen, die die Zellen enthalten, in einem –80°C-Gefriergerät oder ein Tauchen der Ampullen, die die Zellen enthalten, in Trockeneis oder in einem Nieder-Temperaturbad, wie beispielsweise Trockeneis/Ethanol, oder in einem Bad, das flüssigen Stickstoff enthält ein. Andere derartige Systeme werden in The Chemist's Companion: A Handbook of Practical Data, Techniques und References, Gordon, A. J., et al., Hrsg., John Wiley und Sons, NY (1972) offenbart.
  • Die Zellen werden dann durch Techniken, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, lyophilisiert. Lyophilisierung ist ein Verfahren, durch das Eis und/oder Feuchtigkeit von den gefrorene Zellen durch Sublimation im Vakuum bei niedrigen Temperaturen unter Null Grad (z. B. –40° bis –50°C) entfernt werden. Eine beliebige Restfeuchte, die mit der „Trocken"-Herstellung einhergeht, wird dann durch allmähliches Anheben der Temperatur entfernt, was zur Evaporation führt. Damit umfasst gemäß der Erfindung eine Lyophilisierung ein Unterwerfen der gefrorenen Zellen einem Vakuum unter Bedingungen, die ausreichen im Wesentlichen Feuchtigkeit und/oder Eis von den Zellen zu entfernen (hier auch bezeichnet als im Wesentlichen getrocknete Zellen). Die im Wesentlichen getrockneten Zellen können bei verschiedenen Temperaturen gelagert werden (Raumtemperatur bis ungefähr –180°C, vorzugsweise ungefähr 4°C bis ungefähr –80°C, bevorzugter ungefähr –20°C bis ungefähr –80°C und am meisten bevorzugt ungefähr –20 C).
  • Ein derartiges Verfahren zum Lyophilisieren von Zellen umfasst die Schritte:
    • (a) Laden eines Behältnisses, das gefrorene Zellen enthält, in einen Gefriertrockenapparat, wobei der Gefriertrockenapparat eine Temperatur von ungefähr –40° bis ungefähr –50°C aufweist;
    • (b) Unterwerfen der Zellen einem Vakuum; und
    • (c) im Wesentlichen Trocknen der Zellen.
  • Vorzugsweise ist das Vakuum geringer als ungefähr 100 μm und die Zellen werden getrocknet durch:
    • (i) Halten der Temperatur der Kammer bei ungefähr –45°C für ungefähr 2 Stunden; und
    • (ii) Ansteigen der Temperatur der Kammer von ungefähr –45°C bis ungefähr 10°C bei einer Rate von ungefähr 0,1° bis 1,0°C/Std. (vorzugsweise 0,5° bis 0,8°C/Std. und am meisten bevorzugt 0,6° bis 0,8°C/Std.).
  • Das Zellbehältnis kann dann abgedichtet und für einen längeren Zeitraum bei verschiedenen Temperaturen gelagert werden.
  • Die Lebendzellzahl der kompetenten Zellen, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, wird bei mehr als ungefähr 1 × 107 Zellen/ml bleiben, vorzugsweise bei mehr als ungefähr 1 × 108 Zellen/ml und bevorzugter bei mehr als ungefähr 1 × 109 Zellen/ml, wenn sie bei –20°C für einen beliebigen Zeitraum von ungefähr 0 Tagen bis ungefähr 450 Tagen gelagert werden, vorzugsweise von ungefähr 240 Tagen bis ungefähr 365 Tagen und bevorzugter von ungefähr 365 Tagen bis ungefähr 450 Tagen. Diese Zellen werden eine Transformationeffizienz von mindestens ungefähr 1 × 105 behalten, vorzugsweise mindestens ungefähr 1 × 106, bevorzugter mindestens ungefähr 1 × 107, noch bevorzugter mindestens ungefähr 1 × 108 und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 1 × 109 Transformanten pro Mikrogramm DNA (T/μg). Geeignete Lagerungstemperaturen variieren von ungefähr Raumtemperatur bis ungefähr –180°C. Vorzugsweise bewegt sich die Lagerungstemperatur von ungefähr 4°C bis ungefähr –80°C, vorzugsweise von ungefähr –20°C bis ungefähr –80°C. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung werden die Zellen bei ungefähr –20°C gelagert. Der Lagerungszeitraum oder -zeit kann sich von ungefähr 0 Tagen bis ungefähr 45 Tagen bewegen, vorzugsweise von ungefähr 0 Tagen bis ungefähr 90 Tagen, noch bevorzugter von ungefähr 0 Tagen bis ungefähr 150 Tagen, noch bevorzugter von ungefähr 240 Tagen bis ungefähr 365 Tagen, und noch bevorzugter von ungefähr 365 Tagen bis ungefähr 450 Tagen, obwohl längere Lagerungszeiten bei Temperaturen von ungefähr –20°C und darunter verwendet werden können. Kompetente Zellen, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, können bei –20°C für mindestens ein Jahr gelagert werden, während ihre Transformationeffizienz im Wesentlichen erhalten bleibt. Wesentliche Erhaltung der Transformationeffizienz bedeutet, dass nach einer Lyophilisierung die Zellen eine Transformationeffizienz nach einer Lagerung aufweisen, die ungefähr 40 % bis 100 % beträgt, vorzugsweise ungefähr 60 % bis 100 %, bevorzugter ungefähr 70 % bis 100 % und am meisten bevorzugt ungefähr 80 % bis 100 % der Transformationeffizienz der Zellen unmittelbar nach einer Lyophilisierung.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Transformieren einer lyophilisierten kompetenten Zelle, die gemäß des Verfahrens der Erfindung hergestellt wurde. Ein Transformieren der lyophilisierten kompetenten Zellen umfasst ein Erhalten einer lyophilisierten kompetenten Zelle, Mischen der Zelle mit einem DNA-Molekül und Inkubieren der Mischung unter Bedingungen, ausreichend die Zelle mit dem DNA-Molekül zu transformieren. Gemäß dieses Aspekts der Erfindung kann die lyophilisierte kompetente Zelle beliebige grampositive oder gramnegative Bakterien sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Bacillus, Streptomyces, Streptococcus und Pseudomonas. Vorzugsweise werden gramnegative prokaryotische Zellen gemäß dem Verfahren der Erfindung transformiert, bevorzugter Escherichia und am meisten bevorzugt E. coli. Gemäß der Erfindung kann ein beliebiges DNA-Molekül (z. B. Vektoren, Plasmide, Phagemide, Expressionsvektoren usw.) verwendet werden. Vorzugsweise werden die Zellen mit dem DNA-Molekül in Gegenwart eines Kompetenzpuffers gemischt. Gemäß der Erfindung kann der Kompetenzpuffer zu den lyophilisierten kompetenten Zellen zugefügt werden, bevor das DNA-Molekül zugefügt wird, oder das DNA-Molekül und der Kompetenzpuffer können gleichzeitig zu den lyophilisierten kompetenten Zellen zugefügt werden. Obwohl das Mischen der lyophilisierten kompetenten Zelle mit dem DNA-Molekül und einem Kompetenzpuffer bevorzugt ist, kann eine beliebige Lösung zum Rehydrieren verwendet werden und, um die kompetenten Zellen mit dem DNA-Molekül zu mischen. Derartige Lösungen schließen Wasser, Salzlösung oder beliebige geeignete Puffer ein.
  • Nachdem die Zellen mit dem interessierenden DNA-Molekül transformiert worden sind, können die transformierten Zellen in einem dem Wachstum förderlichen Medium gezüchtet werden. Typischerweise enthält ein derartiges dem Wachstum förderlichen Medium ein Antibiotikum, um bei einer Auswahl der transformierten Zellen zu helfen. Das heißt, dass das zu transformierende DNA-Molekül einen selektiven Marker enthalten kann (z. B. ein Antibiotikumresistenzgen), der die Auswahl der transformierten Zellen erlaubt, wenn das entsprechende Antibiotikum im Medium verwendet wird.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins durch Transformieren einer lyophilisierten kompetenten Zelle mit einem DNA-Molekül, das für das gewünschte Protein kodiert. Damit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins, das ein Erhalten einer lyophilisierten kompetenten Zelle, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde, ein Transformieren der Zelle mit einem DNA-Molekül, das im Stande ist, das gewünschte Protein zu exprimieren, und ein Kultivieren der transformierten Zelle unter Bedingungen, die ausreichen das gewünschte Protein herzustellen, umfasst. Zellen, die gemäß diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden können, schließen sowohl gramnegativer und grampositiver Bakterien ein, vorzugsweise Escherichia und am meisten bevorzugt E. coli. Bezüglich dieses Aspekts der Erfindung werden die Zellen durch Mischen der Zellen mit einem DNA-Molekül und Inkubieren der Mischung unter Bedingungen, die ausreichen die Zelle mit dem DNA-Molekül zu transformieren, transformiert. Dieser Mischungsschritt kann in einer beliebigen Lösung vollzogen werden. Am meisten bevorzugt werden die lyophilisierten kompetenten Zellen in einem Kompetenzpuffer rehydriert, bevor das DNA-Molekül zugegeben wird, oder die lyophilisierten kompetenten Zellen werden gleichzeitig mit dem DNA-Molekül und dem Kompetenzpuffer gemischt. Transformierte Zellen können gemäß gut bekannter Techniken auf dem Gebiet ausgewählt werden, einschließlich zum Beispiel einer Auswahl für Markergene auf dem DNA-Molekül (z. B. Antibiotikumresistenzgene). Nachdem die transformierte Zelle ausgewählt wurde, kann die Zelle dann gemäß gut bekannter Techniken in einem dem Wachstum förderlichen Medium kultiviert werden. Beim Kultivieren der Zelle unter geeigneten Bedingungen ist die Zelle im Stande, das gewünschte Protein herzustellen. Das gewünschte Protein kann dann isoliert und ein im Wesentlichen reines Protein durch gut bekannte Proteinreinigungstechniken erhalten werden.
  • Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird dasselbe leichter verstanden durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die zur Erläuterung bereitgestellt werden und nicht zum Einschränken vorgesehen sind.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Eine Stammkultur von E. coli DH5α Zellen (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) wurden wie folgt hergestellt: DH5α Zellen wurden auf eine LB-Platte ausgestrichen (32 g Bibco BRL LB Agar (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) pro Liter destilliertes Wasser) und die Platte wurde für 36 Stunden bei 23°C inkubiert. Verschiedene Kolonien wurden in einem 500 ml Schüttelkolben ohne Schikanen gesammelt, der 25 ml SOB Medium (2 % Bacto Tryptone, 0,5 % Bacto Hefeextrakt 10mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4) enthielt.
  • Der Kolben wurde bei 23°C, 275 U/min, für mehrere Stunden geschüttelt und die optische Dichte bei 550 nm wurde verfolgt. Als die optische Dichte 0,5 erreicht hatte, wurden 10 ml der Zellen mit 10 ml von SOB:Glycerin 60:40 (60 ml SOB, 40 ml Glycerin, (Gibco BRL) in einem 50 ml konischen Röhrchen gemischt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Vortex Mixers gemischt und durften für 10 min auf Eis bleiben. 1 ml Aliquots wurden in NUNC-Tieftemperaturampullen verteilt (Katalognr. 366656) (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) und in einem Trockeneis-Ethanol-Bad für mindestens 5 Minuten eingefroren. Die Saaten bzw. Impfkulturen wurden bei –80°C gelagert.
  • Eine bei –80°C gelagerte Impfkultur DH5α Zellen wurde für 10 min auf Eis aufgetaut. 0,450 ml der aufgetauten Impfkultur wurde in 1500 ml SOB-Medium geimpft, das 0,001 % PPG in einem 2,8-l-Fernbach-Kolben enthält. Der Kolben wurde bei 23°C (275 U/min) geschüttelt. Nach näherungsweise 20 Stunden hat die Kultur eine optische Dichte bei at 550 nm von 0,66 erreicht. Die Zellen wurden auf Eis für 15 min abgekühlt und durch Zentrifugieren unter Verwendung von Corning 250-ml-Flaschen mit 250 ml Zellkultur/Flasche eingesammelt. Die Zellen wurden in einem GS3 Rotor bei 4000 U/min und 4°C für 10 Minuten in einer Sorvall RC2B Zentrifuge zentrifugiert.
  • Jeder einzelne Zellniederschlag wurde in 75 ml kaltem CCMB80 Puffer (10 mM Kaliumacetat pH 7,0, 80 mM CaCl2·H2O, 20 mM MnCl2·4H2O, 10 mM MgCl2·6H2O, 10 % Glycerin eingestellt auf pH 6,4 mit 0,1 NHCl) wieder suspendiert. Die Zellen wurden auf Eis für 20 min aufbewahrt. Der Zellniederschlag wurde bei 4°C durch Zentrifugieren eingesammelt und jeder einzelne Zellniederschlag wurde in 16 ml entweder 9 % wässriger Trehalose (Quadrant, Cambridge England) oder 12 % wässriger Sucrose suspendiert wieder. (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). 250μl der Zellsuspension wurde in gleiche Teile in gekühlte 1,0 ml NUNC Tieftemperaturampullen verteilt (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, Katalognr. 366656). Die Kappen wurden lose oben auf die Ampullen gesetzt und die Ampullen wurden in ein –80°C Gefriergerät für 16 Stunden gesetzt.
  • Alternativ wurden die Zellen in gekühlte 5 ml Glasampullen abgefüllt (Wheaton, Millville, N.J., Katalognr. 223712). Ein Gummistopfen wurde lose oben auf die Ampulle gesetzt und die Ampulle wurde bei einer Temperatur von –80°C für 16 Stunden gelagert.
  • Nach Lagerung über Nacht in dem –80°C Gefriergerät wurden die Ampullen in einen Hull-Gefriertrockenapparat gesetzt und wurden einem Vakuum, das gemäß dem folgenden Protokoll trocknet, unterworfen:
    • (a) Einstellen einer Lagertemperatur bis –45°C.
    • (b) Laden der gefrorenen DH5α-Proben gleichmäßig auf jeder Ablage.
    • (c) Schließen der Kammer und Anschalten des Vakuumsystems. Wenn das Vakuum kleiner als 100 m. ist, Start des Trocknungsprogramms, das aus folgenden 3 Teile besteht: i) Halten der Lagertemperatur bei –45°C für 2 Stunden. ii) Erhöhung der Lagertemperatur von –45°C bis 10°C bei der Rate von ungefähr 0,7°C/Stunde (55°C in 72 Stunden).
    • (d) Sobald die Lagertemperatur 10°C erreicht, werden die Zellen in einen 4°C kalten Raum gebracht.
    • (e) Lagern der Ampullen bei –20°C.
  • Wenn der Lyophilisierungszyklus abgeschlossen war, wurden die Zellen aus dem Gefriertrockenapparat entfernt und in einen 4°C kalten Raum gebracht, wo die Kappen festgemacht wurden. Die Zellen wurden dann in einen Folienbeutel gebracht, der ein Trockenmittel enthält, und die Beutel werden in einen –20°C-Gefrierapparat zur Lagerung gebracht.
  • Um die Zellen auf die Transformationeffizienz und Lebendzellzahl zu untersuchen, werden die Ampullen aus dem –20°C-Gefrierapparat entfernt und für 6 Minuten auf feuchtes Eis gesetzt. Die Zellen wurden in 400μl einer 1:1 Mischung von CCMB80 Puffer ohne Glycerin (10 mM Kaliumacetat pH 7,0, 80 mM CaCl2·2H2O, 20 mM MnCl2·4H2O, 10 mM MgCl2·6H2O, eingestellt auf pH 6,4 mit 0,1 N HCl) und FSB Puffer (10 mM Kaliumacetat pH 7.0, 100 mM KCl, 45 mM MnCl2·4H2O, 10 mM CaCl2·2H2O, 3 mM Hexaamincobalt(III)chlorid, 10 % Glycerin, 5 % wässrige Sucrose, eingestellt auf pH 6,4 mit 0,1 N HCl) rehydriert. 100μl der Zellen wurden aus der Ampulle entfernt und in ein gekühltes FalconTM 2059 Rohr (Becton Dickenson) zur Untersuchung mit 50 pg pUC19 Plasmid-DNA gebracht. Die Lebendzellzahl der wieder suspendierten Zellen wurde auch durch Standardverdünnung unter Verwendung von 0,85 % NaCl bestimmt. Die Zellen wurden dann auf Transformationseffizienz und Lebendzellzahl nach Lagerung bei –20°C erneut untersucht. Die Ergebnisse einer solchen Stabilitätsuntersuchung werden in den 1, 2 und 3 gezeigt.
  • 1 zeigt, dass DH5α Zellen, die in NUNC-Tieftemperaturampullen unter Verwendung von entweder Sucrose oder Trehalose als Gefriermittel lyophilisiert wurden, eine Transformationseffizienz von > 1,0 × 107 T/μg behalten, wenn sie für mindestens 12 Monate bei ungefähr –20°C gelagert wurden. 2 zeigt, dass die Lebendzellzahl von den Zellen, die in NUNC-Tieftemperaturampullen bei ungefähr –20°C gelagert wurden, bei näherungsweise 1,0 × 109 Zellen/ml für mindestens 12 Monate bleibt. 3 zeigt, dass die Zellen, die unter Verwendung von Trehalose in Glasampullen lyophilisiert wurden, die absolut abgedichtet waren, eine Transformationeffizienz von > 1,0 × 108 T/μg nach Lagerung bei –20°C für 12 Monate behalten.
  • Beispiel 2
  • Das folgende Beispiel wurde im Wesentlichen wie Beispiel 1 ausgeführt, mit den folgenden Ausnahmen. Die DH5α Impfkultur, gelagert bei –80°C, wurde aufgetaut und 600μl der Impfkultur wurden in 1,7 l SOB-Medium geimpft, das 0,001 % PPG in einem 2,8-l-Fernbach-Kolben enthielt. Der Kolben wurde für 18 Stunden bei 23°C, 275 U/min, geschüttelt. Als die optische Dichte bei 550 nm 0,194 erreicht hatte, wurden 175 ml der Kultur in 1,7 l SOB-Medium geimpft, das 0,001 % PPG in einem 2,8-l-Fernbach-Kolben enthielt. Der Kolben wurde für näherungsweise 4 Stunden bei 23°C, 275 U/min, geschüttelt. Als die optische Dichte bei 550 nm 0,09 erreichte, wurden 2,7 ml der Kultur in 2 Fernbach-Kolben geimpft, die jeder 1,7-l-SOB-Medium und 0,001 % PPG enthielten. Die Kolben wurden bei 23°C, 275 U/min, für näherungsweise 22 Stunden geschüttelt. Als die optische Dichte bei 550 nm zwischen 0,648 und 0,722 erreichte, wurden die Kulturen geerntet und wie in Beispiel 1 aufgearbeitet, mit der Ausnahme, dass die Zellen nicht vor der Einsammlung durch Zentrifugieren abgekühlt wurden. 200 ml der Zellen wurden dann bei ungefähr 4°C zentrifugiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und der Zellniederschlag wurde in 60 ml kaltem CCMB80 Puffer erneut suspendiert. Die Zellen wurden für 20 Minuten auf Eis gesetzt und wieder durch Zentrifugieren bei ungefähr 4°C eingesammelt. Der Zellniederschlag wurde in 25,6 ml kalter 12 % wässriger Sucrose erneut suspendiert und die Zellen wurden für 2 Stunden auf Eis gesetzt. 250 μl der Zellen wurden nach einer 2-Stunden-Inkubation auf Eis in gekühlte NUNC-Tieftemperaturampullen abgefüllt. Die Zellen wurden durch Setzen der Ampullen in einen –80°C-Gefrierapparat für 16 Stunden eingefroren oder wurden durch Eintauchen in ein Flüssigstickstoffbad eingefroren. Die Zellen wurden lyophilisiert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die Ergebnisse werden in den 4A, 4B und 5 gezeigt. Wie in den 4A und 4B zu sehen, könnten die Zellen, die in Sucrose lyophilisiert wurden, bei –20°C für mindestens 5 Monate ohne wesentlichen Verlust der Transformationeffizienz gelagert werden. Die Transformationeffizienz der Proben war mindestens 1 × 107 T/μg. Proben, die in entweder Flüssigstickstoff (4B) oder durch Lagerung bei –80°C für 16 Stunden (4A) eingefroren wurden, behalten vor einer Lyophilisierung eine Transformationeffizienz von > 1,0 × 107 T/μg. Wie in 5 zu sehen, könnten die lyophilisierten DH5α Zellen bei –20°C ohne signifikanten Verlust der Vermehrungsfähigkeit der Zelle gelagert werden. Einfrieren in entweder Flüssigstickstoff oder durch Lagerung bei –80°C für 16 Stunden vor einer Lyophilisierung führt zu einer stabilen Lagerung der Zellen. Alle Proben sind vor dem Einfüllen in Ampullen für mindestens 2 Stunden auf Eis geblieben. Daher zeigen diese Daten, dass die Zellen auf Eis in dem Gefrierschutzmittel vor einer Einfrierung und Lyophilisierung für mindestens 2 Stunden bleiben können, bei einer im Wesentlichen Erhaltung der Transformationeffizienz und der Vermehrungsfähigkeit der Zelle.
  • Beispiel 3
  • Das folgende Beispiel wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 ausgeführt, mit den folgenden Ausnahmen. Zwei DH5α Impfkulturen wurden aufgetaut und 800μl wurden in zwei 2,8-l-Fernbach-Kolben geimpft, die jeder 1,7 l SOB-Medium und 0,001 % PPG enthielten. Die Kolben wurden bei 23°C, 275 U/min, für näherungsweise 19 Stunden geschüttelt. Die optische Dichte der zwei Kolben betrug 0,3918 bzw. 0,3578. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren eingesammelt bei 4°C. Jeder einzelne Zellniederschlag wurde in 10 ml SOB-Medium bei Raumtemperatur, das 0,001 % PPG enthielt, erneut suspendiert und wurde aufgefüllt (insgesamt 120 ml). Eine 1:100 Verdünnung der Zellen hatte eine optische Dichte von 0,0754, was zeigt, dass die Zelldichte 7,54 betrug. Zwanzig ml der Zellen wurden in 6 Fernbach-Kolben geimpft, wobei jeder 1,7 l SOB-Medium und 0,001 % PPG enthielt. Die Kolben wurden bei 23°C, 275 U/min, für 6,5 Stunden geschüttelt, zu welcher Zeit die optischen Dichten der Kolben 0,705, 0,783, 0,701, 0,749, 0,704, und 0,702 betrugen. Die Kolben wurden auf Eis für 15 Minuten abgekühlt. Zehn Liter der Zellen wurden in dem 4°C kalten Raum durch Entwässerung zu 3 l in folgender Weise konzentriert.
  • Die verwendete peristaltische Pumpe war ein Masterflex Modell 7529-30 (Cole Palmer) und die verwendete Säule war eine Microgon Säule Nr. M22M-300-01N. Die Säule wurde mit der Pumpe verbunden und einmal mit 2 Liter autoklaviertem deionisiertem Wasser gespült. Die Pumpe wurde angeschaltet und 2 Liter der 0,37 %igen Bleiche zirkulierten durch das System für 20 Minuten. Das System wurde dann mit 10 Liter autoklaviertem deionisiertem Wasser gespült. 10 Liter der Zellsuspension wurden in den Vorratsbehälter gegossen. Die Zellsuspension zirkulierte dann durch das System mit der auf 3,5 eingestellten Pumpengeschwindigkeit, um das Volumen auf 3 Liter zu reduzieren. Das Verfahren benötigt näherungsweise 25 Minuten (näherungsweise 280 ml/Minute). Die 3 Liter der konzentrierten Zellsuspension wurden aus dem Vorratsbehälter durch Pumpen der Zellsuspension aus dem Vorratsbehälter zurückgewonnen.
  • Sechs Flaschen, die jede 250 ml der konzentrierten Zellsuspension enthielten, wurden in einem GS3 Rotor bei 4000 U/min für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Jeder einzelne Zellniederschlag wurde in 250 ml kaltem CCMB80 Puffer erneut suspendiert. Die Zellen blieben für 20 Minuten auf Eis, und die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren bei 4°C eingesammelt. Jeder einzelne Zellniederschlag wurde erneut in 53 ml kalter 9 %iger wässriger Trehalose suspendiert. Die Zellen wurden für 1 Stunde auf Eis gesetzt und 250 μl der Zellen wurden in 1,0 ml Tieftemperaturampullen abgefüllt (Wheaton, Millville, N.J.). Die Ampullen wurden in einen –80°C Gefrierapparat gesetzt und blieben für 16 Stunden vor einer Lyophilisierung. Die Zellen wurden lyophilisiert in einem Tri-PhilizerTM Modell TRI585 Gefriertrockenapparat (FTS Systems Inc.), wobei die Temperatur mit einer Rate von 0,6°C/Std angehoben wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 6 und 7 gezeigt. 6 zeigt, dass die Zellen bei –20°C für mindestens 4 Monate gelagert werden können und eine Transformationeffizienz größer als 1 × 107 T/μg beibehalten. 7 zeigt, dass die Vermehrungsfähigkeit der Zelle größer als 1 × 109 Zellen/ml nach Lagerung für 4 Monate bei –20°C bleibt.
  • Beispiel 4
  • Dies Beispiel wurde im Wesentlichen wie Beispiel 1 durchgeführt, mit folgenden Ausnahmen. E. coli Stamm DH10B wurde abgestrichen von einer bei –80°C gelagerten Master- bzw. Originalimpfkultur auf eine LB-Platte, die 100 μg/ml Streptomycin enthielt. Die Platte wurde für 24 Stunden bei 23°C inkubiert. Eine Einzelkolonie wurde von der Platte entnommen und in einen Kolben geimpft, der 250 ml eines 15/10 Mediums enthielt (1,0 % Bacto Tryptone, 1,5 % Bacto Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 0,001 % Polypropylenglykol (PPG)). Der Kolben wurde bei 23°C, 260 U/min, in einem New Brunswick PsycrothermTM Schüttler für 16 Stunden geschüttelt. Sechs ml der Kultur wurden in einen 2,8-l-Fernbach-Kolben geimpft, der 1,25 l eines 15/10 Mediums enthielt, und der Kolben wurde bei 23°C, 260 U/min, geschüttelt. Die optische Dichte bei 550 nm betrug anfangs 0,1. Der Kolben wurde geschüttelt, bis die optische Dichte 0,7 betrug, und die Zellen waren dann durch Zentrifugieren bei 4°C eingesammelt. Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 aufbereitet. Nach erneuter Suspension in dem Gefrierschutzmittel wurde 1 ml der Zellsuspension in sterile 5 ml Glasampullen (Wheaton) in gleichen Teilen verteilt und die Zellen wurden für 5 Minuten in ein Trockeneis-Ethanol-Bad eingefroren. Gummistopfen wurden lose auf den Ampullen angebracht und die Ampullen wurden in den Gefriertrockenapparat gesetzt. Die Zellen wurden lyophilisiert gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Programm, außer dass die Ampullen unter Vakuum abgedichtet wurden.
  • Nach Lyophilisierung wurden die Ampullen aus dem Gefriertrockenapparat entfernt und wurden bei –20°C in Folienbeutel gelagert, die ein Trockenmittel enthielten. In Abständen wurden die Ampullen aus dem Gefrierapparat entfernt und wurden im Wesentlichen auf Transformationeffizienz wie in Beispiel 1 untersucht, mit der Ausnahme, dass die Zellen in 2 ml CCMB80 Puffer ohne Glycerin erneut suspendiert wurden. Die Ergebnisse werden in 8 gezeigt. Die Daten zeigen, dass ein E. coli Stamm DH10B lyophilisiert und bei –20°C für mindestens 6 Monate gelagert werden kann, während ihre Transformationeffizienz im Wesentlichen erhalten bleibt. Proben behalten eine Transformationeffizienz von > 1 × 108 T/μg nach längerer Lagerung bei –20°C.
  • Es wird klar sein, dass die Erfindung in anderer Weise, als insbesondere in den vorhergehenden Beschreibung und Beispielen beschrieben, benutzt werden kann.

Claims (59)

  1. Verfahren zur Herstellung von prokaryotischen Zellen, welche transformationsfähig bzw. kompetent sind, wobei Verfahren umfasst a) Züchten der Zellen in einem dem Wachstum förderlichen Medium, b) Funktionsfähig- bzw. Kompetentmachen der Zellen, und c) Lyophilisieren der kompetenten Zellen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen bei etwa 10°C bis etwa 42°C gezüchtet werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen bei etwa 12°C bis etwa 37°C gezüchtet werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen bei etwa 15°C bis etwa 32°C gezüchtet werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen bei etwa 20°C bis etwa 25°C gezüchtet werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen bei etwa 23°C gezüchtet werden.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen gram-negative prokaryotische Zellen sind.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Zellen ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Escherichia, Klebsiella, Salmonella und Pseudomonas.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zellen Escherichia Zellen sind.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Zellen E. coli Zellen sind.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die E. coli Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus DH5, DH5α, DH10, DH10B, HB101, RR1, JV30, DH11S, DM1, DH10B/p3, DH5αMCR, DH5'IQ, DH5α5', SCS1, Stab2, DH12S, DH5α-E, DH10BAC, XL1-Blue MRF, XL2-Blue MRF, XL1-Blue MR, SURE Stamm, SURE 2 Stamm, XL1-Blue, XL2-Blue, AG1, JM101, JM109, JM110/SCS110, NM522, Topp Stämme, ABLE Stämme, XL1-Red, BL21 Stämme, TK B1 Stamm, und Abkömmlinge davon.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Lyophilisationsschritt a) das Einfrieren der Zellen, und b) Aussetzen der gefrorenen Zellen einem Vakuum, um die Zellen im wesentlichen ausreichend zu trocknen, umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Kompetentmachens der Zellen das Suspendieren der Zellen in einem Kompetenzpuffer umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Kompetenzpuffer CCMB80 ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren ferner das Mischen der Zellen mit einem Gefrierschutzmittel vor der Lyophilisation umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Gefrierschutzmittel ein Kohlenhydrat oder ein Derivat davon ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kohlenhydrat ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Trehalose, Succrose, Sorbitol, Glucose und Acacia.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Kohlenhydrat Trehalose, Sucrose oder eine Mischung davon ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die lyophilisierten Zellen bei einer Temperatur von etwa Raumtemperatur bis etwa –180°C gelagert werden.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die lyophilisierten Zellen bei einer Temperatur von etwa 4°C bis etwa –80°C gelagert werden.
  21. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die lyophilisierten Zellen bei einer Temperatur von etwa –20°C bis etwa –80°C gelagert werden.
  22. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die lyophilisierten Zellen bei einer Temperatur von etwa –20°C gelagert werden.
  23. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die lyophilisierten Zellen eine Transformationseffizienz von mindestens etwa 1 × 106 Transformanten pro μg DNS aufweisen.
  24. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Transformationseffizienz der lyophilisierten Zellen nach der Lagerung im wesentlichen beibehalten wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Lagerung von 0 bis etwa 450 Tage beträgt.
  26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Lagerung von etwa 240 bis etwa 365 Tagen beträgt.
  27. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Lagerung von etwa 365 bis etwa 450 Tagen beträgt.
  28. Kompetente Zellen hergestellt durch das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 12 oder 15.
  29. Kompetente Zellen nach Anspruch 28, wobei die kompetenten Zellen Escherichia Zellen sind.
  30. Kompetente Zellen nach Anspruch 28, wobei die Zellen E. coli Zellen sind.
  31. Verfahren zur Transformation einer lyophilisierten kompetenten Zelle, welches a) Erhalten einer lyophilisierten kompetenten Zelle hergestellt nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1, 12 oder 15 b) Mischen der Zelle mit einem DNS Molekül, und c) Inkubieren des Gemischs unter Bedingungen, ausreichend zur Transformation der Zelle mit dem DNS Molekül, umfasst.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Zellen Escherichia Zellen sind.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Zellen E. Coli Zellen sind.
  34. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das DNS Molekül ein Vektor ist.
  35. Verfahren nach Anspruch 31, welches ferner die Rehydrierung der lyophilisierten Zellen in einem Kompetenzpuffer vor dem Mischungsschritt umfasst.
  36. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Mischungsschritt ein Mischen der lyophilisierten Zellen mit einem Kompetenzpuffer und dem DNS Molekül mit einschliesst.
  37. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins, welches a) Erhalten einer lyophilisierten kompetenten Zelle hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 12 oder 15, b) Transformieren der Zelle mit einem DNS Molekül, das zum Exprimieren des gewünschten Proteins geeignet ist, c) Kultivieren der transformierten Zelle unter Bedingungen, ausreichend zur Herstellung des gewünschten Proteins, umfasst.
  38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Zelle eine Escherichia Zelle ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Zelle eine E, coli Zelle ist.
  40. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das DNS Molekül ein Vektor ist.
  41. Verfahren nach Anspruch 37, wobei der Transformationsschritt das Mischen der Zelle mit einem Kompetenzpuffer und dem DNS Molekül umfasst.
  42. Kompetente lyophilisierte prokariotische Zellen.
  43. Kompetente Zellen nach Anspruch 42, wobei die Zellen gram-negative prokariotische Zellen sind.
  44. Kompetente Zellen nach Anspruch 43, wobei die Zellen ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Escherichia, Klebsiella, Salmonella und Pseudomonas.
  45. Kompetente Zellen aus Anspruch 44, wobei die Zellen Escherichia Zellen sind.
  46. Kompetente Zellen aus Anspruch 45, wobei die Zellen E. coli Zellen sind.
  47. Kompetente Zellen aus Anspruch 42, wobei die E. coli Zellen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus DH5, DH5α, DH10, DH10B, HB101, RR1, JV30, DH11S, DM1, DH10B/p3, DH5αMCR, DH5'IQ, DH5α5', SCS1, Stab2, DH12S, DH5α-E, DH10BAC, XL1-Blue MRF, XL2-Blue MRF, XL1-Blue MR, SURE Stamm, SURE 2 Stamm, XL1-Blue, XL2-Blue, AG1, JM101, JM109, JM110/SCS110, NM522, Topp Stämme, ABLE Stämme, XL1-Red, BL21 Stämme, TK B1 Stamm, und Abkömmlinge davon.
  48. Kompetente Zellen nach Anspruch 42, wobei die Zellen eine Transformationseffizienz von mindestens 1 × 105 Transformanten pro μg DNS aufweisen.
  49. Kompetente Zellen nach Anspruch 48, wobei die Zellen eine Transformationseffizienz von mindestens 1 × 108 Transformanten pro μg DNS aufweisen.
  50. Kompetente Zellen nach Anspruch 49, wobei die Zellen eine Transformationseffizienz von mindestens 1 × 107 Transformanten pro μg DNS aufweisen.
  51. Kompetente Zellen nach Anspruch 50, wobei die Zellen eine Transfonnationseffizienz von mindestens 1 × 108 Transformanten pro μg DNS aufweisen.
  52. Kompetente Zellen nach Anspruch 51, wobei die Zellen eine Transformationseffizienz von mindestens 1 × 109 Transformanten pro μg DNS aufweisen.
  53. Kompetente Zellen nach Anspruch 42, wobei die Zellen eine Anzahl lebensfähiger Zellen von mehr als 1 × 107 Zellen/ml aufweisen, nachdem sie bei –20°C für 0 bis 450 Tage gelagert worden sind.
  54. Kompetente Zellen nach Anspruch 53, wobei die Zellen eine Anzahl lebensfähiger Zellen von mehr als 1 × 108 Zellen/ml aufweisen, nachdem sie bei –20°C für 0 bis 450 Tage gelagert worden sind.
  55. Kompetente Zellen nach Anspruch 54, wobei die Zellen eine Anzahl lebensfähiger Zellen von mehr als 1 × 109 Zellen/ml aufweisen, nachdem sie bei –20°C für 0 bis 450 Tage gelagert worden sind.
  56. Kompetente Zellen nach Anspruch 42, wobei die Zellen, nachdem sie bei –20°C für mindestens ein Jahr gelagert worden sind, eine Transformationseffizienz aufweisen, die 40 % bis 100 % der Transformationseffizienz von Zellen unmittelbar nach der Lyophilisation beträgt.
  57. Kompetente Zellen nach Anspruch 56, wobei die Zellen, nachdem sie bei –20°C für mindestens ein Jahr gelagert worden sind, eine Transformationseffizienz aufweisen, die 60 % bis 100 % der Transformationseffizienz von Zellen unmittelbar nach der Lyophilisation beträgt.
  58. Kompetente Zellen nach Anspruch 57, wobei die Zellen, nachdem sie bei –20°C für mindestens ein Jahr gelagert worden sind, eine Transformationseffizienz aufweisen, die 70 % bis 100 % der Transformationseffizienz von Zellen unmittelbar nach der Lyophilisation beträgt.
  59. Zellen nach Anspruch 58, wobei die Zellen, nachdem sie bei –20°C für mindestens ein Jahr gelagert worden sind, eine Transformationseffizienz aufweisen, die 80 % bis 100 % der Transformationseffizienz von Zellen unmittelbar nach der Lyophilisation beträgt.
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