DE69830326T2

DE69830326T2 - Iminbildende polysaccharide, deren herstellung und verwendung als zusatzmittel und immunstimulierende mittel

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Publication number: DE69830326T2
Application number: DE69830326T
Authority: DE
Inventors: J. Dante MARCIANI
Original assignee: Galenica Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Galenica Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-02
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2018-10-03
Also published as: IL135148A0; EP1027061A4; ATE296105T1; NZ503488A; WO1999017783A1; AU9597198A; MXPA00003108A; US7196073B2; DE69830326D1; ES2245805T3; BR9815388A; EP1027061B1; JP2001518556A; CA2305599A1; EP1027061A1; US20020150585A1; KR100680014B1; US6960344B2; KR20010030878A; US20040220142A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polysaccharidderivate, deren Herstellung und deren Verwendung in Impfstoffen und immunstimulierenden Zusammensetzungen. Die Adjuvantien sind Derivate von Polysacchariden, die von Antigen präsentierenden Zellen (APCs) erkannt werden.
Adjuvantien werden bei der Aktivierung des Immunsystems verwendet, um die Wirksamkeit vorbeugender und therapeutischer Impfstoffe zu erhöhen. Immunadjuvantien werden verwendet bei: (1) der nicht spezifischen Stimulation der Wirtsresistenz gegenüber Infektionen und Krebs, (2) der Potenzierung einer Immunisierungsstärke eines vorbeugenden Impfstoffs und (3) der Potenzierung einer Immunisierungsstärke eines therapeutischen Impfstoffs. Diese Adjuvantien können vorzugsweise die Zell-vermittelten Immunantworten (T-Zell Antworten, verzögerte Überempfindlichkeit), humorale Antworten (B-Zell-Antworten, Antikörperproduktion) oder beides verstärken. Stimulation einer humoralen Immunität ist für das Vorbeugen bakterieller Infektionen, einiger viraler Infektionen als auch bei der Therapie von im Umlauf befindlichen Krebsen bedeutsam. Die zelluläre Immunität ist von höchster Bedeutung für die Krebstherapie solider Tumoren und einiger viraler Erkrankungen.
Nach einer anfänglichen Stimulation durch ein Fremdagens oder Antigen (beispielsweise Viren, Bakterien oder Parasiten) erkennt das Immunsystem gewöhnlich nach einer erneuten Exposition das Agens und reagiert mit einer beschleunigten Antwort. Diese verstärkte Antwort bildet die Grundlage für den enormen Erfolg der Impfung beim Vorbeugen von Erkrankungen. Die anfängliche Immunantwort auf ein Fremdantigen, die zum Schutz gegenüber hoch virulenten Organismen unzulänglich ist, erfordert jedoch einige Tage zur vollständigen Antwort. Ein Weg eine schnellere schützende Immunantwort zu erreichen besteht in der Impfung oder Immunisierung mit einem gewöhnlich geschwächten bzw. attenuierten oder toten Pathogen. Die Immunisierung mit getöteten Mikroorganismen oder reinen Antigenen ruft in vielen Fällen jedoch eine geringe kurzzeitige Immunantwort hervor, wobei eine schwache oder überhaupt keine Zell-vermittelte Immunität erzeugt wird. In vielen Fällen kann diese schwache Immunantwort durch Zugabe von Adjuvantien zu der Antigenpräparation geändert werden. Es konnte gezeigt werden, dass einige Polysaccharide (Kohlenhydratpolymere) von Mannose (bspw. Mannane), β(1,3) Glucose (bspw. Glucane), β(1,4) acetylierte Mannose (Acemannane), β(1,4) N-Acetyl-Glucosamine (Chitine) und Heteropolysaccharide wie beispielsweise Rhamnogalacturonanen (Pektinen) das Immunsystem stimulieren. Antigen präsentierende Zellen (APCs) besitzen spezifische Zelloberflächenrezeptoren, die Zuckerbestandteile bzw. Zuckerkomponenten dieser und anderer Polysaccharide erkennen und binden. Antigen präsentierende Zellen, wie beispielsweise dendritische Zellen und einige Makrophagen sind für die Aufnahme von Antigenen und deren Verarbeitung bzw. Prozessierung in Endolysosomen zu kleinen Peptiden verantwortlich. Die verarbeiteten Antigene werden auf der Oberfläche von APCs in Verbindung mit Klasse MHC II exprimiert. Insbesondere erkennen reaktive T-Zellen Antigen und Klasse MHC II gleichzeitig, wodurch Immunantworten hervorgebracht werden, die auf die MHC Klasse II beschränkt sind. B-Zellen werden durch prozessierte Antigene stimuliert Antikörper herzustellen. Diese APC-Oberflächenrezeptoren (wie beispielsweise der Mannoserezeptor der Makrophagen und dessen homologer Rezeptor DEC-205 von dendritischen Zellen) sind eine Endozytose vermittelnde transmembrane Proteine und spielen offensichtlich bei dem Vorgang der Antigenpräsentation (Stahl, P.D., Current Opinion in Immunology 4 (1992), 49; Jiang, w., et al., Nature 375 (1995), 151) eine Rolle. Ein Binden dieser Polysaccharide an derartige Rezeptoren induziert bzw. löst, wie durch den Anstieg der Phagozytose, proliferativer Antworten, Freisetzung von Cytokinen und anderen Aktivitäten des Immunsystems dargestellt wurde, eine Immunstimulation aus. Aufgrund dieser immunstimulatorischen Aktivitäten wurden diese Polysaccharide als Impfstoffadjuvantien vorgeschlagen.
Polysaccharidadjuvantien rufen durch Änderung der Cytokinproduktion, wie beispielsweise einem Hinaufregulieren von IL-1, eine immunmodulatorische Wirkung hervor und bewirken eine angemessene Th1-Antwort. Die durch die Th1-Subpopulation von CD4⁺ T-Zellen erzeugte Immunantwort, induziert Komplement bindende Antikörper als auch starke Reaktionen einer mit γ-IFN, IL-2 und IL-12 assoziierten Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ (DTH). Die Wirkungen von Polysacchariden auf die natürliche Proteinkonformation ist mäßig, wobei die zum Hervorrufen einer Antwort neutralisierender Antikörper nötigen Konformationsepitope erhalten bleiben. Da diese Adjuvantien jedoch nicht zulassen, dass exogene Antigene über den endogenen Weg prozessiert werden, induzieren sie keine Antwort von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL). Aufgrund dessen, dass die APCs Zelloberflächenrezeptoren aufweisen, die für bestimmte Kohlenhydratbestandteile spezifisch sind, kann das Zielen auf bzw. Targeting und die Zuführung von Antigenen, die mit diesen Zuckerbestandteilen assoziiert sind, zu diesen Zellen verstärkt werden. Offensichtlich ist die Rolle von Zuckerkomponenten bei dem Zielen einer Antigenzufuhr nicht auf Polysaccharidadjuvantien beschränkt. Die Änderung beispielsweise der Kohlenhydratseitenkette von Quillajasaponin durch Perjodsäureoxidation führt zu einem Verlust deren adjuvanter Eigenschaft. Vermutlich liegt dieses Ergebnis an dem Verlust deren Zielfähigkeit.
Obwohl die Adjuvanteigenschaften bestimmter Polysaccharide seit einiger Zeit bekannt sind, war deren Verwendung größtenteils auf Forschungsanwendungen beschränkt. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Glucane in Mäusen eine Antitumorantwort induzieren können und eine vorbeugende Wirkung auf akute Sepsis aufweisen. Diese Wirkungen sind von dem Molekulargewicht der Glucane und deren Verzweigungsgrad abhängig. Mannane stellen andere Polysaccharide mit adjuvanter Aktivität dar, die ihre Wirkung vermutlich nach einem Binden an den Zelloberflächenmannoserezeptor der Makrophagen ausüben. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine Konjugation eines Proteinantigens an Mannan unter oxidierenden Bedingungen zu einer Zell vermittelten Immunantwort (Apostolopoulos, V. et al., Vaccine 14 (1996), 930) führt. Proteinantigene, die jedoch unter nicht oxidativen Bedingungen an Mannan konjugiert wurden, d.h. ohne Aldehydbildung, lösten lediglich eine humorale Immunität aus (Okawa, Y et al., J. Immunol. Meth. 142 (1992), 127) und (Apostolopoulos, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 10128). Stimulation einer T-Zellimmunität wurde ebenfalls unter experimentellen Bedingungen mit der Galactoseoxidase, durch Erzeugen von Aldehyden in den Galactosylresten von Zelloberflächenpolysacchariden (Zeng, B. et al., Science 256 (1992) 1560) erreicht. Diese Immunstimulation war jedoch nicht zu wiederholen (Rhodes, J. Immunol. Today 17 (1996), 436). Diese Ergebnisse beleuchten die Probleme, die mit einer Aldehydinstabilität und/oder unzureichender Produktion von Aldehyden durch enzymatische Oxidation assoziiert sind.
Dellacherie E und Bonneaux F (Polymer Bulletin 31 (1993), 145-149) beschreiben aldehydische Dextrane zur Verwendung als Arzneimittelträgersystem.
Chen H. und Rhodes J. (J. Mol. Med. 74 (1996), 497-504) besprechen Schiffsche Basen bildende Arzneimittel und deren Mechanismen einer Immunpotenzierung und deren therapeutisches Potential.
Es ist klinisch und ökonomisch für die Impfstoffindustrie bedeutsam neue und wirkungsvolle Adjuvantien aufzuweisen. Die Entwicklung neuer Adjuvantien, die auf Antigen präsentierende Zellen zielen bzw. steuern (target) und kostimulatorische Signale bereitstellen, um T-Zellimmunität zu stimulieren, ist der Gegenstand der vorliegenden Patentoffenbarung.
Die vorliegende Erfindung betrifft den in den Ansprüchen aufgestellten Gegenstand.
Die vorliegende Erfindung ist auf chemische Konjugate (hierin als Polysaccharidkonjugate bezeichnet) gerichtet, die bei der Potenzierung der Immunantwort eines Tieres auf ein Antigen verwendet werden, welches (I) ein Polysaccharid, das an die Zelloberfläche von Antigen präsentierenden Zellen (APCs) binden kann, und (II) ein oder mehrere Moleküle mit einer stabilen Carbonylgruppe (d.h. eine Aldehyd- oder Ketongruppe, die mit Aminogruppen reagieren kann, um ein Imin oder eine Schiffsche' Base zu bilden) umfassen, worin Moleküle (ii) an die Polysaccharide (i) durch (iii) eine direkte kovalente Bindung oder kovalent über einen bifunktionellen Linker in der Weise angebracht sind, die/der die stabile Carbonylgruppe unversehrt belässt. Die Moleküle, die eine Imin-bildende Carbonylgruppe aufweisen können eine aromatische oder nicht-aromatische zyklische, aromatische oder nichtaromatische heterozyklische oder nicht-zyklische Verbindung sein. Vorzugsweise werden aromatische oder heteroaromatische Ketone und Aldehyde als Moleküle (ii) verwendet.
Erfindungsgemäß ist/sind ein oder mehrere Moleküle mit einer stabilen Carbonylgruppe (d.h. eine Aldehyd- oder Ketongruppe, die mit Aminogruppen reagieren kann, um ein Imin oder eine Schiffsche Base zu bilden), entweder direkt oder über ein bifunktionelles Linkermolekül an nicht-adjuvante Kohlenhydratantigene kovalent angebracht, um eine intrinsische adjuvante Eigenschaft bzw. Aktivität an den nicht-adjuvanten Kohlenhydratantigenen bereitzustellen. Die Konjugation von einem oder mehreren Molekülen mit einer stabilen Carbonylgruppe an die Kohlenhydratantigene führt, verglichen mit nicht-konjugierten Kohlenhydratantigenen, zu einem Produkt mit erhöhter Wirksamkeit bei vorbeugenden Impfungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls, wie in den Ansprüchen aufgestellt, die Verwendung der Polysaccharidkonjugate bei der Herstellung eines Impfstoffs oder, wie in den Ansprüchen aufgestellt, eines Medikaments.
Die vorliegende Erfindung ist auf Polysaccharidkonjugate gerichtet, welche umfassen:

(i) ein Polysaccharid, dass an die Oberfläche von Antigen präsentierenden Zellen (APCs) binden kann; und
(ii) ein oder mehrere Moleküle, die eine stabile Carbonylgruppe (d.h. eine Aldehyd- oder Ketongruppe, die mit Aminogruppen reagieren kann, um ein Imin oder eine Schiffsche Base zu bilden, was ebenfalls als eine "Imin-bildende Verbindung" bezeichnet wird) aufweisen; worin ein Polysaccharid (i) durch eine direkte kovalente Bindung oder kovalent über den Rest eines bifunktionellen Linkers an das eine oder die mehreren Moleküle (ii) gebunden wird. Die Verbindungen, die die Imin-bildende Carbonylgruppe aufweisen, können aromatische oder nicht-aromatische zyklische, aromatische oder nicht-aromatische heterozyklische oder nicht-zyklische Verbindungen sein. Vorzugsweise werden aromatische oder heteroaromatische Ketone und Aldehyde als (ii) verwendet.

Um diese erfindungsgemäße Ausführungsform deutlicher zu erläutern, können die Polysaccharidkonjugate durch die Formel I dargestellt werden: P-(L-I)_x Ioder pharmazeutisch verträgliche Salze davon, worin
P ein Polysaccharid ist, das an die Zelloberfläche einer Antigen präsentierenden Zelle binden kann;
jedes L unabhängig eine kovalente Bindung oder der Rest eines bifunktionellen Linkermoleküls ist;
jedes I ein Imin-bildendes Molekül ist. Bevorzugte Imin-bildende Moleküle sind Reste von aromatischen oder heteroaromatischen Verbindungen mit (a) einer Keton- oder Aldehydfunktionalität, und (b) einer zweiten funktionellen Gruppe, die mit einer komplementären funktionellen Gruppe, die auf dem Polysaccharid vorhanden oder dem funktionellen Linkermolekül, wenn es vorhanden ist, reagieren kann; und
x größer als oder gleich Eins ist. Der Wert von x wird durch die Anzahl der reaktiven Gruppen bestimmt, die an dem Polysaccharid kovalent modifiziert sind. Eine Anzahl von Faktoren und Strategien werden den Wert von x beeinflussen, wie hierin sehr ausführlich ausgeführt werden wird. Im Allgemeinen wird x eine Funktion der Anzahl von reaktivem Hydroxyl, terminalem Endhalbacetal, Carboxyl- und/oder Amingruppen sein, die an dem Polysaccharid vorhanden sind. Wegen der unterschiedlichen Molekulargewichtsverteilung brauchbarer Polysaccharide (P), wird der Grad einer Modifikation, wie durch x ausgedrückt, als die Anzahl der pro Hundert Glycosylreste eingeführten Imin-bildenden Gruppen, ausgedrückt. Unter Verwendung dieser Konvention, kann der Wert von x von 1 bis zu mehr als 100, mit einem bevorzugten Bereich von 1 bis ungefähr 50 Imin-bildenden Gruppen pro 100 Glycosylresten variieren.
Das Verhältnis von Imin-bildenden Molekülen variiert weit abhängig von der verwendeten Konjugationsstrategie. Steuern dieses Verhältnisses wird nachfolgend beschrieben.
Eine freie Hydroxyl-, terminale Endhalbacetal-, Carboxylsäure- oder Amingruppe des Polysaccharids wird verwendet, um das Polysaccharid (P) an entweder (L) oder (I) kovalent zu binden. Eine oder mehrere dieser reaktiven Gruppen, die auf dem Polysaccharid vorhanden sind, können zuerst "aktiviert" (wie hierin weiter beschrieben) werden, um die Reaktivität dieser Gruppen zu erhöhen, oder das Polysaccharid kann mit einer Iminbildenden Verbindung, die eine "aktivierte" funktionelle Gruppe aufweist, reagieren.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist auf Konjugate gerichtet, die eine oder mehrere Verbindungen mit einer Carbonylgruppe umfassen, worin die Verbindungen entweder direkt oder über den Rest eines bifunktionellen Linkermoleküls an nicht-adjuvante Kohlenhydratantigene kovalent gebunden sind, um eine intrinsisch adjuvante Aktivität an den nicht-adjuvanten Kohlenhydratantigenen bereitzustellen. Die Konjugation von Iminbildenden Molekülen an das Kohlenhydratantigen führt, verglichen mit Kohlenhydratantigenen alleine, zu einem Produkt mit erhöhter Wirksamkeit bei vorbeugenden Impfungen. Kohlenhydratantigene beinhalten Polysaccharide einschließlich Lipopolysacchariden und Peptidoglycanen von Streptococci, Staphylococci und anderen Bakterien, die als Impfstoffantigene verwendet werden.
Polysaccharide
Polysaccharide, die verwendet werden können, um erfindungsgemäße Konjugate zu bilden, umfassen jedes natürlich vorkommende oder chemisch modifizierte Polysaccharid, das an Zelloberflächenrezeptoren auf APCs bindet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, umfassen brauchbare Polysaccharide ein Minimum von zwei Sacchariden, vorzugsweise sieben oder mehr Saccharide und sind unverzweigt oder verzweigt und können ein Molekulargewicht von ungefähr 1000 bis einige Millionen Dalton aufweisen. Bevorzugte Polysaccharide weisen ein Molekulargewicht von ungefähr 1.000 bis ungefähr 500.000 auf. Die Polysaccharide können, wie hierin beschrieben, chemische Modifikationen aufweisen.
Der Begriff "Antigen präsentierende Zelle" oder die Abkürzung "APCs" bedeutet für den Zweck der vorliegenden Erfindung dendritische Zellen und Makrophagen, die für die Aufnahme von Antigenen, deren Bearbeitung zu kleinen Peptiden und Exprimieren dieser auf deren Oberfläche in Verbindung mit MHC Klasse II zur Präsentation an T- und B-Zellen, verantwortlich sind.
Während der Evolution entwickelten Makrophagen und dendritische Zellen Oberflächenrezeptoren, die die Kohlenhydratkomponenten von verschiedenen Mikroorganismen erkennen. Diese Rezeptoren spielen bei der Phagozytose als auch bei der Pinozytose, zwei Vorgängen, die in die Antigenpräsentation einbezogen sind, eine wichtige Rolle. Polysaccharide, die durch diese Zelloberflächenrezeptoren erkannt werden, wären für die Konstruktion von diesen Adjuvantien geeignet, da derartige Polysaccharide einen wirksamen Mechanismus zum APC-Targeting bereitstellen. In einigen Fällen weisen Kohlenhydratsequenzen von Bakterien, Pilzen und tierischen Ursprungs Gemeinsamkeiten mit Pflanzenpolysacchariden auf. Pflanzenpolysaccharide können daher in einigen Fällen eine praktische Quelle eines Startmaterials bereitstellen. Obwohl diese Adjuvantien mit sowohl löslichen als auch unlöslichen Polysacchariden hergestellt werden können, sind die löslichen Formen bevorzugt.
Die Anwendungen der vorliegenden Offenbarung sind in keiner Weise auf Pflanzenpolysaccharide beschränkt. Sie können auf andere, von verschiedenen Quellen stammende, kohlenhydrathaltige Verbindungen, die durch Oberflächenrezeptoren von APCs erkannt werden, ausgedehnt werden. Beispielhaft für diese anderen Polysaccharide sind Chitine und Dextrane, die tierischen beziehungsweise bakteriellen Ursprungs sind. Beispielhaft für geeignete kohlenhydrathaltige Verbindungen sind bakterielle Teichonsäuren und deren Derivate, bakterielle Lipopolysaccharide, Lipid A und deren Derivate.
Schließlich wird die Konjugation von Verbindungen, die Imin-bildende Carbonylgruppen enthalten an nicht-adjuvante kohlenhydrathaltige Produkte beim Bereitstellen intrinsisch adjuvanter Aktivität an diese Produkte und um die Wirksamkeit vorbeugender Immunisierungen zu erhöhen, als nützlich betrachtet. Beispielhaft für diese Produkte sind Polysaccharide von Streptococci, Staphylococci und anderen Bakterien, die als Impfstoffantigene verwendet werden.
Unter den bevorzugten Polysacchariden, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, befinden sich: β-Glucane, Mannane, Pektine und 2-Acetamindoglucane. Derivate, einschließlich Wasser löslicher Derivate dieser Polysaccharide sind ebenfalls nützlich. Siehe vorläufige Anmeldung Nr. 60/083,106.
Bevorzugte Polysaccharide werden nachfolgend ausführlicher beschrieben.
β-Glucane:
β-Glucane weisen eine Rückgradekette von (1→3) gebundenen β-D-Glucopyranosyleinheiten auf, wobei die β-D-Glucopyranosyleinheiten durch (1→6) Bindungen angebracht sind. Sie werden in einigen Quellen, wie beispielsweise Hefe, Pilzen, Algen und Getreiden aufgefunden. Sei weisen einen breiten Bereich von Molekulargewichten d.h. zwischen 5.000 bis > 500.000 auf, wodurch deren immunmodulatorische Eigenschaften beeinflusst werden. Im Allgemeinen weisen β-Glucane mit einem hohen Molekulargewicht, die in Wasser relativ unlöslich sind eine höhere biologische Aktivität auf. Dieser Mangel an Löslichkeit jedoch schloss die systematische Verabreichung von Glucanen aus. Modifikation dieser Polysaccharide durch Einführung anionischer Gruppen, wie beispielsweise Phosphat, Sulfat, Carboxyl und anderen, führte zu löslichen Formen, die offensichtlich deren biologische Aktivität behielten. Lösliche Glucane können durch eine der folgenden Verfahren hergestellt werden: i) Isolation aus Hefeextrakten (Hahn & Albersheim, 66 Plant Physiol. (1978), 107), ii) Ultraschallbehandlung von Glucanpartikeln (Januz et al.„ J. Immunol. 137 (1986), 327 und iii) Einführung von anionischen Gruppen in unlösliche Glucane durch Sulfonylierung, Phosphorylierung, Carboxylierung oder Sulfatisieren (Bohn & BrMiller, Carbhydr. Polm. 28 (1995), 3), (Di Luzio, U.S. Paten 4,739,046, 4/1988). Der einzige reduzierende Glycosylrest (verknüpft an Position 3) in β-Glucanen ist an dem Terminus der Rückgradkette von (1→3) verknüpften β-D-Glucosylresten angeordnet. Die durch (1→6) Bindungen an die Rückgradkette verknüpften Glycosylreste weisen keine freien reduzierenden Gruppen auf. Das kleinste Fragment, das an den Glucanrezeptor des Monozyten binden kann ist ein (1→3)-verknüpftes β-Glucanheptasaccharid. Dieses Oligosaccharid weist jedoch keine immunstimulierende Aktivität auf.
Mannane:
Mannane sind lineare oder verzeigte Polysaccharide, die ausschließlich aus Mannose aufgebaut sind. Mannane werden in Pflanzen, Schimmel, Bakterien oder anderen Organismen aufgefunden. In bestimmten Pflanzen bestehen lineare Mannane aus β-(1→4) verknüpften Mannosylresten, wohingegen in einigen Hefen die Mannosylreste durch α-(1→2) und α-(1→6) Bindungen verknüpft sind. In den verzweigten Mannanen aus Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) besteht das Mannan aus einer α-(1→6) verknüpften Mannopyranosylrückgradstruktur, die an den O-2 Atomen durch Seitenketten von α-D-Mannopyranosyl, α-D-Mannopyranosyl-α-(1→2)-α-D-Mannopyranosyl und α-D-Mannopyranosyl α-(1→)-α-D-Mannopyranosyl-α-(1→2)-α-D-Mannopyranosyl substituiert ist. Zusätzlich kann das Mannan aus S. cerevisiae ebenfalls phosphoryliert sein (Barreto-Bergter and P.A. Gorin, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 41 (1983), 67; Vinogradov, E. et al., Carbohydr. Res. 307 (1998), 177). Obwohl die Fähigkeit von Mannanen aus S. cerevisiae die Zell vermittelte Immunität zu stimulieren in Frage steht, erhöhen sie die Wirkung von Lipopolysacchariden beim Stimulieren von T-Zellantworten (Otha, M. et al., Immunology 60 (1987), 503). Es scheint, das Mannane, deren immunstimulatorische Wirkungen durch Binden an die Mannose bindenden Zelloberflächenrezeptoren der Makrophagen ausüben können. Ein Derivat von β-Mannanen, die acetyliete β-(1→4) Polymannose scheint das Immunsystem in einer zu Mannanen ähnlichen Weise zu stimulieren.
Pectinsaure Polysaccharide:
Einige pektinsaure Polysaccharide sind anti-komplementär bzw. weisen eine anti-Komplement Aktivität auf und sie können verschiedene Grade immunpotenzierender Aktivität aufweisen (Yamada, H. et al., Planta Medica 56 (1990), 182). Oxidation dieser Polysaccharide mit Perjodsäure führt zu einem Verlust der antikomplementären Aktivität auf den klassischen Weg, erhöht jedoch die Aktivität auf den alternativen Weg (Yamada, H and Kiyohara, H. Abstracts of Chinese Medicine 3 (1989), 104). Die Polysaccharide, die eine gewisse immunpotenzierende Aktivität zeigen und somit durch Zelloberflächenrezeptoren erkannt werden, können grob in Homogalacturonane, Rhamnogalacturonane, Arabane, Galaktane und Arabinogalaktane eingeteilt werden. Nicht alle dieser Verbindungen jedoch würden biologische Aktivität aufweisen. In einigen Fällen wäre die Aktivität von der Struktur, dem Molekulargewicht, Aggregatzustand und anderen Parametern abhängig. Im Allgemeinen stellen pektinsaure Polysaccharide eine Gruppe von Zuckerpolymeren dar, die mit 1,4-verknüften α-D-Galactosyluronsäureresten assoziiert sind. Diese Polysaccharide können einige verzweigte Oligosaccharide aufweisen, die an den Galactosyluronsäureresten des Rückgrads verknüpft sind. Aus vorausgehenden Untersuchungen mit Saponinen und anderen Polysacchariden wurde geschlossen, dass verzweigte Oligosaccharide für eine adjuvante Aktivität bedeutsam erscheinen.
2 Acetamidoglucane: Chitin, Murein und deren Derivate:
Chitin ist ein lineares N-Acetyl-D-Glucosamin(NAG)polymer, das durch β-(1→4) Bindungen verknüpft ist, das ungefähr 16 Prozent dessen NAG-Reste deacetyliert aufweist. In der Natur kommt es weit verbreitet vor: es wurde in den Exoskeletten von Arthropoden und in den Zellwänden von Pilzen gefunden. Dieses Polysaccharid weist Ketten auf, die extensiv intermolekulare Wasserstoffbindungen bilden, wodurch es in Wasser und in verschiedenen organischen Lösungsmitteln unlöslich wird. Entfernung der N-Acetyl-Gruppen durch starke Alkalibehandlung aus Chitin, führt zu Chitosan, einem β-(1-4) Poly-D-Glucosamin, einem wasserlöslichen Polykation. Chitosan, dem 70% dessen N-Acetyl-Gruppen entfernt wurden (deacetyliertes Chitin), zeigt eine signifikante immunstimulatorische Aktivität (Azuma, I. Vaccine 10 (1992), 1000). Um die Beschränkungen, die durch dessen Unlöslichkeit aufgezwungen werden, zu vermeiden, wurden einige besser in Wasser lösliche Chitinderivate, wie beispielsweise Glycolchitin (Senzyu, K. et al., J. Japan, Agri. Chem. Soc. 23 (1950), 432) und Carboxymethylchitin entwickelt, die ebenfalls immunstimulatorische Eigenschaften aufweisen können. Durch begrenzte saure Hydrolyse (Berger, L.R. et al., Biochem. Biophys. Acta 29 (1958), 522) wurden wasser-lösliche alkohol-unlösliche Chitodextrine hergestellt, die sich aus Heptameren oder größeren NAG-Oligosacchariden zusammensetzen. Murein der hauptsächliche Bestandteil bakterieller Zellwände, ist ein Polysaccharid, das aus β-(1-4) verknüpftem NAG hergestellt ist, wobei eine der NAG-Einheiten an C-3 mit einer O-Milchsäuregruppe durch eine Etherbindung substituiert ist, um N-Acetyl-D-Muraminsäure (NAM) zu erhalten, die die sich wiederholende Sequenz NAG-NAM bildet. Aufgrund der Milchsäurereste sind isolierte Mureine wasserlöslich. In der bakteriellen Zellwand ist Murein an bestimmte Peptide gebunden, um ein vernetztes Peptidoglycan zu bilden. Aufgrund deren struktureller Ähnlichkeiten werden Chitin und Murein durch das Enzym Lysozym und offensichtlich ebenfalls durch Rezeptoren auf der Zelloberfläche des Makrophagen erkannt. Diese strukturellen Ähnlichkeiten, die ebenfalls im Glycolchitin vorkommen, können die immunstimulatorischen Eigenschaften von Chitin und einiger dessen Derivate erklären.
Moleküle, die eine stabile Carbonylgruppe (Imin-bildende Moleküle) aufweisen Das zweite Element der erfindungsgemäßen Konjugate besteht darin, dass ein oder mehrere Moleküle eine stabile Carbonylgruppe (d.h. eine Aldehyd- oder Ketongruppe) aufweisen, die mit Aminogruppen reagieren kann, um ein Imin oder eine Schiffsche Base zu bilden. Die Moleküle, die die Imin-bildende Gruppe aufweisen, können ein aromatischer oder nicht-aromatischer (gesättigter oder teilweise ungesättigter) zyklischer Kohlenwasserstoff (carbocycle), eine aromatische oder nicht-aromatische (gesättigte oder teilweise ungesättigte) heterozyklische oder eine nicht-zyklische, aliphatische Verbindung sein, die eine oder mehrere ungesättigte Bindungen aufweist.
Es gibt Hinweise, dass bestimmte aromatische Verbindungen mit Carbonylgruppen nach Reaktion mit Aminogruppen an einen bestimmten/an bestimmte Th-Zelloberflächenrezeptor(en) sehr wirksam bei der Bildung von Iminen oder Schiffschen Basen sind. Aufgrund dessen, dass an aromatische Verbindungen verknüpfte Carbonylgruppen sehr stabil sind (wohingegen aliphatische Aldehyde im Allgemeinen nicht stabil sind), weisen deren Derivate gewöhnlich eine längere Haltbarkeit auf. Weiterhin wird die hydrophobe Eigenschaft der zyklischen Verbindungen, die die Carbonylgruppen enthalten, die Interaktionen zwischen den Zelloberflächenrezeptoren und den Polysaccharidkonjugaten stärken. Aryl oder Heteroaryl Aldehyde oder Ketone sind folglich vorzugsweise die zu verwendenden Verbindungen, um die Polysaccharide zu modifizieren. Um den Zugang dieser Verbindungen zu den Aminogruppen auf T-Zellen zu fördern, weisen sie noch bevorzugter ebenfalls einige hydrophile Eigenschaften auf.
Verbindungen, die einen gewissen Grad von allen vorstehend erwähnten Eigenschaften verwirklichen, sind bevorzugte Agentien zum Modifizieren der Polysaccharide. Vorzugsweise beinhalten die Verbindungen mono- und disubstituierte C_6-10 Arylaldehyde und C_6-10 Aryl(C_1-4)alkylaldehyde, Verbindungen, die eine Arylgruppe umfassen, beispielsweise Phenyl oder Naphtyl und einen Formyl- oder einen Formyl(C_1-4)alkylsubstituenten beinhalten. Vorzugsweise beinhalten diese Verbindungen weiter eine oder zwei zusätzliche Substituenten, beispielsweise Halogen, Hydroxyl, C_1-4 Alkyl, C_1-4 Hydroxyalkyl, C_1-4 Alkoxy, Trifluormethyl oder Benzyloxy. Geeignete Werte beinhalten Benzaldehyd und Naphthaldehyd, die durch ein oder zwei Hydroxyl und Halogene substituiert sind. Beispielhaft sind 2,3-, 2,4- 2,5- und 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, 5-Chlor-2-hydroxybenzaldehyd, Vanillin, Ethylvanillin, Naringenin, 3- und 4-Hydroxybenzaldehyd und 4-Hydroxyphenylacetaldehyd umfasst. Eine zweite bevorzugte Gruppe umfasst Hydroxyl substituierte C_1-4 Alkyl (C_6-10)arylketone, wie beispielsweise 2-, 3-, und 4-Hydroxyacetophenon und Hydroxyl substituierte Arylketone, wie beispielsweise 6-Hydroxy-1,2-naphthoquinone. Eine dritte bevorzugte Gruppe umfasst Heteroarylaldehyde und Heteroarylketone. Brauchbare Heteroarylgruppen sind Thiophen, Furan, Benzothiophen, Benzofuran, Pyridin, Quinolin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3-Triazol, 1,2,4-Triazol, Isoxazol und Oxazol, wobei jedes einen Keto-, Formyl- oder Formyl(C_1-4)alkylsubstituenten und vorzugsweise zusätzlich einen Halogen- oder Hydroxylsubstituenten umfasst, wenn diese durch verfügbare Kohlenstoffringatome untergebracht werden können. Vorzugsweise sind Furanyl-, Pyridyl- und Indolylaldehyde und Ketone brauchbare Heteroarylkerne. Beispiele brauchbarer Heteroarylaldehyde und Ketone umfassen Pyridoxal, 2-Thiophencarboxaldehyd und 3-Thiophencarboxaldehyd.
Eine andere relativ stabile Gruppe zyklischer Verbindungen, die bestimmte Iminbildende Carbonylgruppen beinhaltet sind Triterpenoide und Steroide mit einem Keton-, Formyl- oder Formylalkylsubstituenten. Beispielhaft sind Androsteron, Formyldienolon, Progesteron, Prednisolon und andere Derivate umfasst.
Bifunktionelle Linker
Im Stand der Technik sind Bifunktionelle Linker für verschiedene Verwendungen (Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press 1996) gut bekannt. Eine Anzahl bifunktioneller Linker kann verwendet werden, um zwischen einem geeigneten Polysaccharid und einer geeigneten Imin-bildenden Verbindung eine Verbindung auszubilden. "Rest eines bifunktionellen Linkers" bezieht sich auf die Struktur, die eine stabile Carbonylverbindung mit dem Polysaccharid verknüpft, nachdem die terminalen Enden des bifunktionellen Linkers an die Verbindung und das Polysaccharid kovalent gebunden sind.
Nicht beschränkende Beispiele von Linkergruppen, die verwendet werden können, um die stabilen Carbonylgruppe-beinhaltenden Verbindung an das Polysaccharid zu knüpfen, sind Alkylendiamine (NH₂-(CH₂)_n-NH₂), worin n von 2 bis 12 ist, Aminoalkohole (HO-(CH₂)_r-NH₂), worin r von 2 bis 12 ist, Aminothiole (HS-(CH₂)_r-NH₂), worin r von 2 bis 12 ist und Aminosäuren, die wahlweise carboxy-geschützt sind, Ethylen und Polyethylenglycole (H-(O-CH₂-CH₂)_n-OH, worin n 1-4 ist. Geeignete Bifunktionelle Diaminverbindungen umfassen Ethylendiamin, 1,3-Propandiamin, 1,4-Butandiamin, Spermidin, 2,4-Diaminobuttersäure, Lysin, 3,3'-Diaminodipropylamin, Diaminopropionsäure, N-(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin, 2-(4-aminophenyl)ethylamin und ähnliche Verbindungen.
Wird eine Carboxylgruppe des Polysaccharids als die konjuierende Gruppe verwendet, dann können eine oder mehrere Aminosäuren als die bifunktionellen Linkermoleküle verwendet werden. Somit kann eine Aminosäure, wie beispielsweise β-Alanin oder γ-Aminobuttersäure oder ein Oligopeptid, wie beispielsweise Di- oder Trialanin als geeignetes Verbindungs- bzw.
Linkermolekül verwendet werden.
Bevorzugte bifunktionelle Verbindungsgruppen umfassen:
-NH-(CH₂)_r-NH-, worin r von 2-5 ist,
-O-(CH₂)_r-NH-, worin r von 2-5 ist,
-NH-CH₂-C(O)-,
-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-,
-NH-NH-C(O)-CH₂-,
-NH-C(CH₃)₂-C(O)-,
-S-(CH₂)_r-C(O)-, worin r von 1-5 ist,
-S-(CH₂)_r-NH-, worin r 2-5 ist,
-S-(CH₂)_r-O-, worin r 1-5 ist,
-S-(CH₂)-CH(NH₂)-C(O)-,
-S(CH₂)-CH(COOH)-NH-,
-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-S-CH(CO₂H)-NH-,
-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-S-CH(NH₂)-C(O)-,
-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-,
-S-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-, und
-NH-O-C(O)-CH₂-CH₂-O-P(O₂H)-.
Die bevorzugten Kombinationen von Polysaccharid, Imin-bildender Verbindung, Linkern und die Verhältnisse können für jede umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf:
Herstellung von Imin-bildenden Polysaccharidadjuvantien
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls auf Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Polysaccharidkonjugaten gerichtet. Struktur/Funktionsuntersuchungen adjuvanter Polysaccharide und Saponine zeigten, dass die Integrität von Strukturen der Kohlenhydratketten für deren adjuvante Aktivität bedeutsam ist. Offensichtlich ist die Erkennung der Kohlenhydratkomponenten durch Oberflächenrezeptoren der APCs wesentlich zum Targeting der Zellen als auch, um deren immunstimulatorische Wirkungen auszuüben. Die adjuvante Aktivität von Triterpensaponinen erfordert ebenfalls eine Aldehydgruppe in der Triterpenoidkomponente. Es wurde ebenfalls kürzlich gezeigt, dass kleine organische Mole küle, die in der Lage sind Imine oder Schiffsche Basen zu bilden, T-Zellen ein kostimulatorisches Signal bereitstellen können, wodurch das Erfordernis für deren Stimulation durch auf APCs vorkommendem B7-1 Rezeptor (Rhodes, J., et al., Nature 377 (1995), 71) beseitigt wird. Eine Addition von (i) einer zyklischen oder heterozyklischen aromatischen Verbindung, oder zyklischen Verbindungen mit Imin-bildenden Carbonylgruppen an (ii) bestimmte Polysaccharide, die durch APCs erkannt und gebunden werden, wird zu Produkten mit hervorragenden adjuvanten Eigenschaften führen. Diese adjuvanten Moleküle werden immunmodulatorische und Targeting Eigenschaften aufweisen.
A. Addition von Imin-bildenden Verbindungen an terminale reduzierende Glycolsylreste
Ein Verfahren zur kovalenten Verbinden Imin-bildender Verbindungen mit terminalen reduzierenden Glycolsylresten von β-Glucanen und β-Mannanen wird mit Bezugnahme auf Schema 1 hierin beschrieben.
Schema 1 Addition von Imin-bildenden Verbindungen an β-Glucane über ein terminales Halbacetalende
Aufgrund dessen, dass β-Glucane und β-Mannane sowohl von Glucosyl- als auch Mannosylresten umfasst werden, sind die für chemische Modifikationen verfügbaren funktionellen Gruppen größten Teils Hydroxylgruppen (-OH) mit begrenzter Reaktivität. Zusätzlich ist ein terminaler reduzierender Glucosylrest pro Polymerkette vorhanden. Im Allgemeinen sind die primären Hydroxylgruppen von Glucosylresten reaktiver als die sekundären Hydroxylgruppen. Es ist jedoch möglich, dass die Struktur eines besonderen Polysaccharids der Reaktivität der Hydroxylgruppe bestimmte Beschränkungen (sterisch oder elektronisch) aufzwingt. Dies erzeugt eine Hierarchie von Hydroxylgruppen, die die Herstellung bestimmter dominanter Produkte unter beschränkenden Reaktionsbedingungen fördern könnte.
Die begrenzte Anzahl terminaler reduzierender Zucker in Glucanen und Mannanen, stellt eine hoch spezifische Stelle zur Einführung neuer chemischer Gruppen dar. Diese Eigentümlichkeit macht die terminalen Glycosylhalbacetalenden zu einer bevorzugten Gruppe für eine kommerzielle Herstellung modifizierter erfindungsgemäßer Polysaccharidadjuvantien.
Die hierin beschriebenen chemischen Modifikationen können mit löslichen oder unlöslichen Glucanen aus verschiedenen Organismen verwendet werden. Sie stellen jedoch lediglich Beispiele und keine Beschränkungen der verfügbaren synthetischen Verfahren dar. Aufgrund dessen, dass die Rolle der Kohlenhydratkamponenten in diesen neuen Adjuvantien in dem Targeting von APCs besteht, kann der brauchbare Molekulargewichtsbereich sehr breit sein, d.h. von ungefähr Tausend bis zu einigen Millionen. Erfindungsgemäß werden lösliche Oligo- und Polysaccharide mit einem Molekulargewicht von ungefähr 1.000 bis einigen Hunderttausend bevorzugt.
Der reduzierende Terminus von Oligosacchariden liefert eine selektive und geeignete Stelle für die direkte kovalente Bindung von Molekülen mit Aminogruppen, wie beispielsweise bifunktionelle Diaminverbindungen. Das reduktive Aminierungsverfahren schließt ein Reagieren des/der terminalen reduzierenden Glycosylrestes(reste) in dem Oligosaccharid (oder Polysaccharid) in der Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid (NaCNBH₃) mit einer Verbindung ein, die ein oder mehrere primäre Aminogruppen trägt. Das Cyanoborhydridanion reduziert selektiv das Imin oder die Schiffsche Base, die durch ein Aldehyd oder Ketone und ein Amin gebildet wurden. Da lediglich für einen kleinen Prozentanteil der Zeit die terminalen Glucosylhalbacetale in deren Formyl oder offenen Form vorliegen, kann die Reaktion mit einer sehr niedrigen Geschwindigkeit fortschreiten. Aufgrund dessen, dass die Gegenwart von sowohl Imin-bildenden Carbonylen als auch primären Aminen in einem Molekül größtenteils zu der Produktion unerwünschter Produkte führen würde, werden die Additionen in einem Zweischrittverfahren, wie nachfolgend zusammengefasst, ausgeführt:

Schritt 1. Glucan-/Mannanoligosaccharide oder Polysaccharide (1) werden in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise wässrigem Acetonitril, Dimethylformamid (DMF), Pyridin oder wässrigen Puffern, die einen tertiären Aminpuffer mit einem pH-Wert von 9.0 umfassen, suspendiert und eine geeignete Diaminverbindung (2), worin n von ungefähr 2 bis ungefähr 12, vorzugsweise 2 bis 4 beträgt, in das gleiche auf einen pH-Wert von 9.0 eingestellte Lösungsmittel zugegeben wird. [Geeignete bifunktionelle Diaminverbindungen sind Ethylendiamin, 1,4-Butandiamin, Spermidin, 2,4-Diaminobuttersäure, Lysin, 3,3'-Diaminodipropylamin, Diaminopropionsäure, N-(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin, 2-(4-Aminophenyl)ethylamin und ähnliche Verbindungen]. Die zugegebene Diaminverbindung sollte, verglichen mit dem molaren Äquivalent freier Aldehydgruppen in dem Kohlenhydrat ungefähr im 5 bis 10-fachen Überschuss vorliegen (d.h. ein freies Aldehyd pro Kohlenhydratpolmerkette). Natriumcyanoborhydrid, das in 50% Acetonitril gelöst wurde, wird dem Reaktionsgemisch zugegeben und die Reaktion kann bei 25°C mit leichtem Rühren für einige Tage fortschreiten. Die Menge der in das Polysaccharid eingebauten Aminverbindung ist von den Reaktionsbedingungen als auch von der Glucanpräparation abhängig. Die Menge der eingebauten Diaminverbindung wird somit täglich bestimmt, um die benötigte Reaktionszeit zu ermitteln, so dass der erforderliche Grad eines Diamineinbaus erreicht wird. Das modifizierte aminierte Glucan/Mannan (3), das 1 Mol Diaminspacer pro Polysaccharidkette beinhaltet, wird durch Präzipitation mit 6 Volumen Ethanol oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel für 8 Stunden bei 4°C rückgewonnen. Das Präzipitat wird erneut in Wasser gelöst, gefiltert und erneut mit 5 Volumen Ethanol für 24 Stunden bei 4°C präzipitiert. Das Material wird in Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
Schritt 2. Aromatische zyklische oder heterozyklische Verbindungen mit einer Iminbildenden Carbonylgruppe (4) und eine oder mehrere Hydroxylgruppen, wie beispielsweise 4-Hydroxybenzaldehyd, 2,4-Dihydroxybenzaldehyd, Vanillin, Ethylvanillin, Naringenin und andere ähnliche Verbindungen werden für eine Addition an die aminierten Polysaccharide bevorzugt. Andere Verbindungen mit Carbonylgruppen jedoch, wie beispielsweise Steroid- und Triterpenoidderivate können ebenfalls verwendet werden. Kleine Aliquots von 10 mmol von sowohl 4-Hydroxybenzaldehyd (1,2 g), Vanillin (1,5 g) oder 5-Chlor-2-hydroxybenzaldehyd (1,6 g), die in 10 ml Dioxan oder Aceton gelöst sind, werden zu 10 mmol(1,6 g) von 1,1'-Carbonyldiimidazol (Carbodiimidazol oder CDI) oder N,N'-Carbonyldiimidazol, die in 10 ml wasserfreiem Dioxan oder Aceton gelöst sind, zugegeben. Das Gemisch reagiert für 6-8 Stunden bei Raumtemperatur unter Mischen, geschützt vor Luftfeuchtigkeit. Die Reaktionsprodukte sind ein hoch reaktives Imidazolcarbamatzwischenprodukt (5), das mit dem Hydroxyl aus der aromatischen Aldehydderivate plus Imidazol gebildet wird.
Schritt 3. Dieses Reaktionsgemisch kann zu den aminierten Polysacchariden ohne vorherige Isolation des Imidazolcarbamatzwischenprodukts zugegeben werden. Das Carbamat koppelt an die modifizierten Aminogruppen der Polysaccharide, um stabile Carbamatverbindungen hervorzubringen. (Imidazolcarbamatderivate können durch Chromatographie, differentielle Extraktionen oder andere Verfahren isoliert werden). Um Reaktionen der Hydroxylgruppen der Polysaccharide mit dem Imidazolcarbamatzwischenprodukt zu minimieren, sollte die Kopplungsreaktion in der Gegenwart äquimolarer Mengen von Amino- und Imidazolcarbamatgruppen stattfinden. Die Menge von Aminogruppen in dem aminierten Polysaccharid wird mit Trinitrobenzensulfonsäure (TNBS) bestimmt oder wird aus dessen Gehalt an C, N, H und O durch Elementaranalyse ermittelt. Das aminierte Glucan oder Mannan wird in einem geeigneten wasserfreien Lösungsmittel, wie beispielsweise DMF, Dioxan oder Pyridin suspendiert und der pH-Wert wird mit Triethylamin auf ungefähr 9.5-10 eingestellt. Ein Aliquot des Carbamatzwischenprodukts, das eine äquivalente Menge an den Aminogruppen der Polysaccharidpräparation aufweist, wird zugegeben und die Reaktion kann für 12 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur, geschützt vor Feuchtigkeit, fortschreiten. Ungefähr 6-8 Volumen kalten Ethanols werden zu der Reaktion zugegeben, um das Polysaccharidaromatisches Aldehyd Konjugat (6) zu präzipitieren, das durch Filtration gesammelt wird. Das konjugierte Polysacchard wird in Wasser erneut gelöst und erneut mit 6-8 Volumen Ethanol oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel präzipitiert. Die Kopplungswirksamkeit wird durch eine der folgenden Verfahren bestimmt: i) Erfassen der restlichen Aminogruppen in der Präparation mit TNBS, ii) spektralphotometrisches Bestimmen der in der Präparation vorkommenden Menge von aromatischer Verbindung oder iii) durch direkte Abschätzung der Aldehydgruppen entweder mit Schiffschem Reagenz oder spektralphotometrisch mit N-Methylbenzothiazolonhydrazon (MBTH) (Paz, M. A., et al., Archiv. Biochem. Biophys. 109 (1965), 548). Das Polysaccharid-aromatisches Aldehyd Konjugat wird in Wasser gelöst und gefriergetrocknet.

In der Polysaccharidkette können durch milde Oxidation mit Perjodsäure ebenfalls neue Aldehydgruppen erzeugt werden. Nach Oxidation wird das Polysaccharid mit der zusätzlichen Aldehydgruppe mit Alkohol präzipitiert und einer, wie vorstehend beschriebenen, reduktiven Aminierung unterzogen.
B. Addition Imin-bildender Verbindungen über die Hydroxylgruppe des Polysaccharids
Ein anderes Verfahren, um Glucan oder Mannan herzustellen, die an Carbonylgruppe enthaltende Verbindungen konjugiert sind, muss die Hydroxylgruppen der Polysaccharide zur Konjugatbildung verwenden. Dieses Verfahren wird unter Bezugnahme von Schema 2 erläutert. Dieses Verfahren gestattet aufgrund der Anzahl von Hydroxylgruppen pro Glycosylrest die Herstellung von Konjugaten mit höheren Carbonylgruppendichten. Die Hydroxylgruppen des Polysaccharids können aktiviert und mit dem Carbonylgruppeenthaltenden/tragenden Molekül zur Reaktion gebracht werden.
Schema 2 Addition Imin-bildender Verbindungen an β-Glucan über -OH Gruppen
Eine Konjugation von Carbonylgruppen tragenden Verbindungen an die Hydroxylgruppen von Polysacchariden kann mit N,N'-Disuccinimidylcarbonat (DSC) ausgeführt werden. Die Hydroxylgruppen, die mit DSC aktiviert werden, reagieren nahezu ausschließlich mit primären Aminen, wodurch das Vernetzen der Polysaccharidketten über deren -OH Gruppen vermieden wird. Die Hydroxylgruppen von β-1,3 Glucanen werden mit DSC aktiviert und reagieren anschließend mit Ethylendiamin, um Aminogruppen in das Glucan einzuführen. Diese Aminogruppen können dann mit einem der folgenden N-Hydroxysuccinimid (NHS)-ester reagieren: 3- oder 5-Formylsalicylsäure, 4-Formylcinnamonsäure und 3- oder 4-Carboxybenzaldehyd, um ein aromatisches Aldehyd-Glucankonjugat zu bilden. Scleroglucan (7), ein β-1,3 Glucan mit einzelnen β-1,6 verbundenen D-Glucoseabzweigungen an jeder dritten Glucoseeinheit und mit einem Molekulargewicht von ungefähr 130.000, wird in Wasser (2,5% Lösung) gelöst und gefriergetrocknet, um ein pulvriges Produkt zu erhalten, das leicht in organischen Lösungsmitteln suspendiert werden kann. Zwei g des gefriergetrockneten Scleroglucans (12 mmol Glucosylreste) werden in 40 ml DMF suspendiert, das 0,8 g DSC (3 mmol) aufweist. Dieser Suspension werden in einer Stunde 20 ml trockenen Pyridins, das 0,75 ml wasserfreien Triethylamins (5,5 mmol) aufweist, zugegeben und kann für weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Dieser Reaktion wird ein Volumen von Aceton zugegeben und das unlösliche aktivierte Scleroglucansuccinimidylcarbonat (8) wird gesammelt und durch Filtration ausgespült. Das in 20 ml Wasser gelöste oder suspendierte aktivierte Scleroglucan wird unter Rühren zu 100 ml einer 0,2 M K Kaliumbicarbonatlösung, enthaltend 2 ml Ethylendiamin (30 mmol oder 10-facher Überschuss über die maximal aktivierten -OH Gruppen der Polysaccharide) zugegeben und auf einen pH-Wert von 8.5 eingestellt. Nach 4 Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktion konzentriert und gegen Wasser dialysiert, um von dem aminierten Scleroglucanderivat (9) überschüssige Reaktanden zu entfernen und gefriergetrocknet. Das aminierte Polysaccharid reagiert anschließend mit Succinimidyl-3-formylsalicylsäureester.
Succinimidyl-3-formylsalicylsäureester wird wie folgt hergestellt: zu 0,49 g einer 3-Formylsalicylsäure (3 mmol) und 0,42 g von NHS (3,5 mmol), die in 10-15 ml DMF gelöst sind, werden 1,28 g CMC oder 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid p-toluensulfonat (3 mmol) zugegeben und werden, vor Feuchtigkeit geschützt, für 5 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Zu diesem Reaktionsgemisch werden 2,1 ml 2-Mercaptoethanol (30 mmol) zugegeben, um das nicht umgesetzte CMC zu quenchen, werden vermischt und das Reaktionsgemisch kann für 10 Minuten bei Raumtemperatur reagieren und der Succinimidyl-3-formylsalicylsäureester (10) wird sofort verwendet. (Die 3-Formylsalicylsäure kann durch eine äquimolare Menge von 5-Formylsalicylsäure, 4-Formylphenoxyessigsäure oder 3-Carboxybenzaldehyd ersetzt werden).
Zu dem aminierten Scleroglucan (ungefähr 2 g), das in 25 ml eines 0,1 M MOBS (4-[Morpholino]butansulfonsäure)-puffers, pH-Wert von 7.6 gelöst ist, wird unter Rühren das DMF, das den Succinimidyl-3-formylsalicylsäureester und das Mercaptoethanol beinhaltet, zugegeben und kann unter Rühren bei Raumtemperatur für 4-6 Stunden reagieren. Das 3-Formylsalicylsäure-Scleroglucanderivat (11) wird mit 6-8 Volumen Ethanol präzipitiert und gesammelt und mit Ethanol gewaschen, um überschüssige Reaktanden zu entfernen. Das präzipitierte Scleroglucanderivat wird in 50 ml Wasser gelöst, gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Der 3-Formylsalicylsäuregehalt des Scleroglucanderivats kann aus dessen H, C, N und O Elementarzusammensetzung bestimmt werden. Der Gehalt an aromatischen Aldehydresten in dem Scleroglucanderivat kann ebenfalls spektralphotometrisch, wie folgt bestimmt werden: Lösen von 5-8 mg des Scleroglucanderivats in 4 ml einer 0,05 M KOH und Ablesen der LTV-Spektren zwischen 220 und 320 nm, unter Verwendung eines Blindwerts einer Lösung mit einer gleichen Konzentration nicht modifizierten Scleroglucans in einer 0,05 M KOH. Berechnen der eingebauten 3-Formylsalicylsäure unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten für diese in 0,05 M KOH bestimmten Verbindung. Der Aldehydgehalt kann ebenfalls entweder kolorimetrisch mit Schiffschem Reagenz oder spektralphotometrisch mit MBTH bestimmt werden.
Eine Konjugation von Verbindungen, die sowohl Carbonylgruppen als auch Hydroxylgruppen aufweisen, an Polysaccharide, wie beispielsweise Mannane, kann durch Aktivieren der Hydroxylgruppen der Polysaccharide mit p-Toluensulfonyl (Tosyl) chlorid (Nilsson, K., et al., Acta Chem. Scan. 35 (1981), 19, Nilsson, kK., et al., Methods Enzymol. 104 (1984), 56-69) ausgeführt werden. Siehe Schema 3-a.
Schema 3-a Addition von Imin-bildenden Verbindungen an Mannan
Aufgrund dessen, dass einige der primären Hydroxylgruppen in Mannan aus S. cerevisiae entweder phosphoryliert oder an Phosphorester gebunden vorliegen und nicht für eine Tosylierung zur Verfügung stehen, ist es notwendig das Phosphat durch alkalische Hydrolyse unter reduzierenden Bedingungen zu entfernen. Bäckerhefemannan, 4-5 g, wird in 200 ml einer 1,5 M KOH, die 1% Natriumborhydrid aufweist, gelöst und bei 100°C für 2 Stunden unter konstantem Rühren unter Rückfluss gekocht. Nach 2 Stunden bei 100°C wird die Lösung auf ungefähr 50°C gekühlt und mit ungefähr 18 ml Essigsäure neutralisiert. Die neutralisierte Mannanlösung wird unter Rühren zu 1,5 Litern eisgekühlten Ethanols zugegeben und das Gemisch wird für 4 Stunden stehen gelassen, um das Mannan zu präzipitieren. Das präzipitierte Mannan wird durch Filtration gesammelt, in Wasser gelöst, gegen Wasser dialysiert, um Salze zu entfernen und gefriergetrocknet.
Ein g gefriergetrockneten Mannans (12) (~6 mmol Mannose), das durch Suspension in Pyridin getrocknet und dem das Azeotrop entfernt wurde, wird in 15 ml DMF resuspendiert und mit in 5 ml DMF gelösten 2,5 g Tosylchlorid (2,15 mmol) vermischt. Diesem Gemisch werden 5 ml Pyridin zugegeben und reagiert unter Rühren für 18 Stunden bei Raumtemperatur, um ein tosyliertes Mannan (13) mit 1 Tosylgruppe für jede 20-25 Mannosylreste zu erhalten. Der Grad einer Tosylierung wird in einer Probe des aktivierten Mannans bestimmt, das präzipitiert und mit Alkohol, wie folgt, gewaschen wurde. Lösen von 8 mg des präzipitierten Mannans in 4 ml einer 0,1 N KOH und Erfassen dessen UV-Absorptionsspektren (220 bis 320 nm) gegenüber einem Blindwert eines nicht modifizierten Mannans (8 mg in 4 ml einer 0,1 N KOH). Bestimme den Gehalt an Tosylgruppen unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten für Tosyl von 480 M^-1cm bei 261 nm. Der in 20 ml einer 0,5 M K-bicarbonatlösung resuspendierten tosylierten Mannan (13)präparation (~ 0,9 g) werden 2 g eines 2-Cysteamin HCl (18 mmol) zugegeben und der pH-Wert wird mit 1 N KOH auf 9.5-10 eingestellt. Die Reaktion reagiert für 24 Stunden bei 40°c unter Rühren und unter einer Stickstoffatmosphäre, um ungefähr 1 Cysteaminrest pro tosyliertem -OH einzuführen. Dialysieren der Reaktionen gegen Wasser, um überschüssige Reaktanden und Salze zu entfernen und Gefriertrocknen des Mannan-Cysteaminderivats (14). Die Menge des an das tosylierte Mannan gebundenen Cysteamins kann aus der H, C, S, O und N Elementarzusammensetzung des Derivats bestimmt werden. Der Cysteamineinbau kann ebenfalls durch Vermischen von 10 ml eines 0,05 M K-Carbonatpuffers, pH 9.5, der 2 mg des aminierten Mannans beinhaltet, mit 1 ml von wässrigem TNBS (7,2 mg/ml) und Reaktion/reagieren lassen für 2 Stunden bei 40°C, bestimmt werden. Erfassen der Absorption bei 363 nm gegen einen Blindwert eines Puffers plus TNBS und Bestimmen des eingebauten -NH₂ unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 11.000 M^-1cm^-1.
Schema 3-b Addition von Imin-bildenden Verbindungen an Mannan
Schema 3-b erläutert ein Anbringen einer Imin-bildenden Verbindung an Mannan-Cysteamin. Suspendieren des gefriergetrockneten Mannan-Cysteamins (0,8-0,9 g) in 20 ml Pyridin, Entfernen des Azeotrops unter vermindertem Druck, um Wasser zu beseitigen und Resuspendieren des Mannan-Cysteaminrestes (14) in 40 ml einer Pyridin:Tetrahydrofuran-Lösung (10:1). Dieser Suspension werden 0,37 g DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) (1,8 mmol), 0,3 g p-Carboxybenzaldehyd und 0,21 g NHS (1,8 mmol) zugegeben, um das p-Carboxybenzaldehyd-NHS Esterzwischenprodukt (10) zu bilden. Die Reaktion verläuft für 24 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 ml Wasser zu dem Gemisch, um die Bildung von DCU zu beschleunigen. Nach 30 Minuten werden zusätzlich 400 ml Wasser zugegeben, um das p-Carboxybenzaldehyd-Mannanderivat (15) zu lösen. Nach 6 Stunden Rühren bei Raumtemperatur kann sich der Dicylcohexylharnstoff (DCU) über Nacht absetzten und wird durch Dekantieren entfernt. Der Überstand wird gefiltert, unter vermindertem Druck konzentriert, gegen Wasser dialysiert und das p-Carboxybezaldehyd-Mannanderivat (15) wird gefriergetrocknet. Der in das Mannan eingebaute aromatische Aldehyd kann spektralphotometrisch wie folgt bestimmt werden. Lösen von 5-8 mg des Mannanderivats in 4 ml einer 0,05 M KOH und Ablesen der UV-Spektren zwischen 220 und 320 nm unter Verwendung einer Lösung einer gleichen Konzentration eines nicht modifizierten Mannans in 0,05 M KOH als Blindwert. Um die p-Carboxybenzaldehydkonzentration zu berechnen, wird deren Extinktionskoeffizient in 0,05 M KOH bestimmt. Der Aldehydgehalt kann ebenfalls entweder kolorimetrisch mit Schiffschem Reagenz oder spektralphotometrisch mit MBTH bestimmt werden.
C. Addition von Imin-bildenden Verbindungen an Carboxylgruppen pektinsaurer Polysaccharide
Carboxylgruppen von pektinsauren Polysacchariden (Homogalacturonanen, Rhamnogalacturonanen, Arabinogalactanen, Arabanen oder Galactanen) wie beispielsweise Galacturon-, Glucoron-, Aceri(aceric)-, Kdo- oder 3-Desoxy-D-Manno-octulosonsäure und andere Säuren, sind reaktive Gruppen, die verwendet werden können die Pektine an Carbonylgruppe beinhaltende (Imin-bildende) Verbindungen zu koppeln. Carboxylgruppen können unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) spezifisch an Amine gekoppelt werden. Siehe Schema 4.
Schema 4 Addition von Imin-bildenden Verbindungen an pektinsaure Polysaccharide
Diese Reaktion kann in organischen Lösungsmitteln wie beispielsweise Dioxan, DMF, Pyridin, Acetonitril oder Gemischen derselben ausgeführt werden. Die Kopplungsreaktion kann ebenfalls in wässrigen oder halb-wässrigen Medien unter Verwendung eines der wasserlöslichen Carbodiimiden, wie beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) oder CMC in Verbindung mit entweder N-Hydroxysulfosuccin imid (Sulfo-NHS) oder NHS ausgeführt werden. Die Anzahl der Aminogruppen pro Glycosylrest kann unter Verwendung einer begrenzten Menge von CMC in Gegenwart eines Überschusses eines Diaminliganden ausgewählt werden. Dieser Ansatz wird in Schema 4 erläutert. In einem Beispiel werden zu 2,0-2,2 g eines in 50 ml heißen Wassers gelösten niedrig methoxylierten Na⁺ Pektinats (< 11 mmol Galacturonsäure) 15 ml eines sedimentierten starken Kationen-Austauscher Polystyrensulfonsäureharzes in H⁺ Form (Dowex, 50-X8) zugegeben und für 2 Stunden gerührt. Die Suspension wird gefiltert, um das Harz zu entfernen und das Harz wird in 20 ml warmen Wassers gewaschen. Die Pektin (H+-Form) (16)-löung wird durch teilweises Gefriertrocknen, Niedrigdruck Rotationsverdampfung oder Umkehrosmose auf ungefähr 40 ml reduziert. Der Pektinlösung (H⁺-Form) wird Pyridin zugegeben, um den pH-Wert auf ~ 7.6 einzustellen. Dieser Lösung werden 1 g CMC (2,35 mmol) und 0,41 g NHS (3,4 mmol), die in 10 ml Pyridin gelöst sind und 2 ml Ethylendiamin (30 mmol) unter Rühren zugegeben und das Gemisch kann über Nacht bei Raumtemperatur unter konstantem Rühren reagieren. Abtrennung des aminierten Polysaccharids (17) von den anderen Reaktanden wird durch dessen Präzipitieren mit 6-8 Volumen Ethanol erreicht. Das mit Ethanol gewaschene, präzipitierte, aminierte Pektin wird in Wasser gelöst, dialysiert und gefriergetrocknet, um ein pulvriges Produkt zu erhalten, das leicht in Wasser gelöst und dessen Aminogruppengehalt mit TNBS bestimmt werden kann. Das aminierte Pektin reagiert anschließend mit Succinimidyl-3-formylsalicylsäureester, der wie folgt hergestellt wird. Die in 10-15 ml DMF gelösten 0,49 g 3-Formylsalicylsäure (3 mmol) und 0,42 g NHS (3,5 mmol) werden zu 1,28 g CMC (3 mmol) gegeben und reagieren, geschützt vor Feuchtigkeit, für 5 Stunden bei Raumtemperatur. Zu diesem Reaktionsgemisch werden 2,1 ml 2-Mercaptoethanol (30 mmol) zugegeben, um das nicht umgesetzte CMC zu quenchen und nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wird der gebildete Succinimidyl-3-formylsalicylsäureester (10) sofort verwendet. (Die 3-Formylsalicylsäure kann durch eine äquimolare Menge eines 3-Carboxybenzaldehyds, einer 4-Formyl-phenoxyessigsäure oder 4,5-Dioxoheptanonsäure ersetzt werden).
Dem Reaktionsgemisch in DMF, das den Succinimidyl-3-formylsalicylsäureester und das Mercaptoethanol beinhaltet werden 2 g eines aminierten Pektins, das in 30 ml eines 0,1 M MOBS (4-[N-morpholino]butansulfonsäure)-puffers, pH-Wert 7.6, gelöst ist, zugegeben und kann für 6 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur reagieren. Das 3-Formylsalicylsäure-Pektinderivat (18) wird mit 6-8 Volumen Ethanol präzipitiert und anschließend gesammelt und mit Ethanol gewaschen, um überschüssige Reaktanden zu entfernen. Das präzipitierte Pektinderivat wird in einem minimalen Volumen von Wasser gelöst, gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Das aminierte Pektin kann ebenfalls mit einem Succinimidylcarbonatzwischenprodukt einer hydroxylierten Carbonylgruppe beinhaltenden Verbindung, wie beispielsweise 4-Hydroxyphenylacetaldehyd, 6-Hydroxy-2- naphthoquinon, 4-Hydroxybenzaldehyd, 2,4-Dihydroxybenzaldehyd, Formyldienolon, Progesteron, Androsteron, Prednisolon oder Pyridoxal zur Reaktion gebracht werden. Nach Vermischen der Reaktion mit 6 Volumen Ethanol wird anschließend das Aldehydgruppebeinhaltende Pektinpolysaccharidderivat durch Filtration erhalten, in Wasser gelöst, gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.
Alternativ kann das aminierte Pektin (17) mit einer Verbindung, die sowohl eine freie und eine geschützte Aldehydgruppe beinhaltet, wie Terephthaldehydmonodiethylacetal zur Reaktion gebracht werden. Das aminierte Pektin reagiert zuerst mit der freien Aldehydgruppe, um eine stabile Bindung zu bilden und anschließend wird der geschützte Aldehyd durch milde saure Hydrolyse, wie hier beschrieben, freigesetzt. Zu 2 g aminierten Pektins, das in 30 ml wässrigen Tetrahydrofurans oder einem andren geeigneten Lösungsmittel suspendiert ist, werden 0,43 g Terephthaldehydmonodiethylacetal (2 mmol), 0,18 g Natriumcyanoborhydrid (3 mmol) zugegeben und über Nacht bei 40°C unter Rühren zur Reaktion gebracht, um das Terephthaldehydmonodiethylacetalderivat eines Pektins (19) zu erhalten. Das Pektinderivat wird mit 6 Volumen Ethanol präzipitiert, gesammelt und durch Filtration mit weiterem Ethanol gewaschen. Das Terephthaldehydmonodiethylacetalpektinderivat wird in einem minimalen Volumen einer 0,05 M HCl gelöst und für 15 Minuten bei 100°C erhitzt, um das Acetal zu der Aldehydform umzuwandeln. Nach Hydrolyse wird die Lösung des Phenylacetaldehydpektinderivats (20) mit NaOH auf Neutralität eingestellt, gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Der Gehalt eines aromatischen Aldehyds der Pektinderivate wird spektralphotometrisch, wie folgt, bestimmt: Lösen von 5-8 mg des konjugierten Pektins in 3 ml einer 0,05 N NaOH und scannen der LTV-Spektren zwischen 220 und 320 nm gegen eine Blindwertlösung, die die gleiche Menge eines nicht modifizierten Pektins beinhaltet. Die Konzentration eines aromatischen Aldehyds des Pektinderivats wird unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten des freien aromatischen Aldehyds, wie er in 0,05 M NaOH bestimmt wurde, berechnet. Der Aldehydgehalt kann ebenfalls spektralphotometrisch mit MBTH oder kolorimetrisch mit Schiffschem Reagenz bestimmt werden.
Alternativ kann der Einbau von Carbonylgruppe beinhaltenden Verbindungen in pektinsaure Polysaccharide in organischen Lösungsmitteln ausgeführt werden. In einem Beispiel werden CMC, NHS und ein 10-facher Überschuss eines Diamins bezüglich CMC zu in DMF-Pyridin (6:4, v/v) suspendiertem, wasserfreiem gefriergetrocknetem Pektin (H⁺-Form) zugegeben und das Gemisch wird unter Rühren bei Raumtemperatur über Nacht zur Reaktion gebracht. Die Anzahl von Aminogruppen pro Glycosylrest kann unter Verwendung einer begrenzten Menge CMC in Gegenwart eines Überschusses eines Diaminliganden ausgewählt werden. Abtrennung des aminierten Polysaccharids von den anderen Reaktanden wird durch dessen Präzipitieren mit 6-8 Volumen Ethanol erreicht. Das mit Ethanol gewaschene, präzipitierte, aminierte Pektin wird in Wasser gelöst und gefriergetrocknet, um ein pulvriges Produkt zu erhalten, das leicht in DMF-Pyridin zu resuspendieren ist. Das aminierte Pektin wird in DMF-Pyridin mit entweder (i) einem Succinimidylester einer carboxylierten Carbonylgruppe beinhaltenden Verbindung, wie beispielsweise 4,5-Dioxoheptanonsäure, 3- oder 5-Formylsalicylsäure, 4-Formylcinnanonsäure oder 3- oder 4-Carboxybenzaldehyd oder (ii) den Succinimidylcarbonatzwischenprodukten einer hydroxylierten, Carbonylgruppe beinhaltenden Verbindung, wie beispielsweise 2,4-Dihydroxybenzaldehyd, 4-Hydroxybenzaldehyd, 4-Hydroxyphenylacetaldehyd, 4'-Hydroxyacetophenon, 6-Hydroxy-2-naphthoquinon, Formyldienolon, Progesteron, Androsteron, Prednisolon, Pyridoxal zur Reaktion gebracht. Das Aldehydgruppe beinhaltende Pektinpolysaccharidderivat wird anschließend nach Vermischen der Reaktion mit 6 Volumen Ethanol durch Filtration gewonnen, in Wasser gelöst, gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.
D. Addition von Imin-bildenden Verbindungen an Aminogruppen von Chitinderivaten
Die Unlöslichkeit von Chitin in den meisten Lösungsmitteln verhindert dessen Addition an Imin-bildende Verbindungen. Einführung von Carbonylgruppe beinhaltenden Verbindungen in das wasserlösliche Chitosan liefert jedoch wasserlösliche Gele, die vermutlich das Ergebnis eines Kreuzvernetzens zwischen den Amingruppen des Glucosamins und den Carbonylgruppen von verschiedenen Polysaccharidketten durch Schiffsche Basen sind. Diese Hindernisse werden durch Verwendung wasserlöslicher Chitinderivate vermieden, in denen ungefähr 85% der Amingruppen, wie beispielsweise Glycolchitin (6-o-Hydroxypropylchitin oder 6-o-Hydroxyethylchitin) N-acetyliert sind, wobei primäre Hydroxyle des Glucosamins hydroxyethyliert sind. Schema 5 erläutert dieses Verfahren.
Schema 5 Addition von Imin-bildenden Verbindungen an Glycolchitin
In einer Ausführungsform wird Glycolchitin wie folgt hergestellt. Zu 5 g fein zerkleinertem Chitin (22) (entsprechend zu 21,25 mmol von N-Acetylglucosamin und 3,75 mmol Glucosamin), das in 30 ml einer 42% NaOH für 2 Stunden bei Raumtemperatur suspendiert ist, werden unter Rühren 70 ml eines Eis-Wassergemisches zugegeben, um eine hoch viskose Dispersion alkalischen Chitins zu erhalten. Zu dieser Dispersion werden 5 g Ethylenoxid (114 mmol) durch Durchblasen (bubbling) in die Lösung zugegeben, während für 1-2 Stunden bei 30-35°C gerührt wird. Das Glycolchitin (23) wird anschließend mit 6 Volumen 80% Ethanols präzipitiert, auf Glasfilterpapier mit 80% Ethanol gewaschen, in Wasser gelöst, gegen Wasser dialysiert, gefriergetrocknet und der Gehalt an freien Amingruppen wird kolorimetrisch mit TNBS bestimmt. Zu 1,7-2 g gefriergetrockneten Glycolchitins (ungefähr 1,5 mmol Glucosamin), die in 40 ml Wasser gelöst/suspendiert sind, werden 40 ml einer 1,60 g Terephthaldehydmonodiethylacetal (7,5 mmol), 0,4 g Natriumcyanoborhydrid (6 mmol) beinhaltende Pyridinlösung zugegeben und für 4 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Das Terephthaldehydmonodiethylacetalderivat von Glycolchitin (24) wird mit 4-6 Volumen Ethanol präzipitiert, das Präzipitat wird resuspendiert und mit 80% Ethanol gewaschen, um alle überschüssigen Reaktanden zu entfernen. Das Glycolchitinderivat (24) wird in 40-50 ml einer 0,05 M HCl gelöst und für 20-30 Minuten bei 100°C erhitzt, um die Aldehydgruppen frei zusetzten, um das Benzaldehydderivat von Glycolchitin (25) zu erhalten. Der Benzaldehydgehalt des Glycolchitinderivats wird wie folgt spektralphotometrisch bestimmt: Lösen von 5-8 mg des Glycolchitinderivats in 4 ml einer 0,05 MKOH und Ablesen der UV-Spektren zwischen 220 und 320 nm unter Verwendung einer Blindwertlösung gleicher Konzentration von Glycolchitin in 0,05 M KOH. Berechnen des eingebauten Benzaldehyds unter Verwendung des in 0,05 M KOH bestimmten Extinktionskoeffizienten für diese Verbindung. Der Aldehydgehalt kann ebenfalls entweder spektralphotometrisch mit MBTH oder kolorimetrisch mit Schiffschem Reagenz bestimmt werden.
In einer anderen Ausführungsform, die in Schema 6 beschrieben wird, reagiert, das wie vorstehend beschrieben gebildete Glycolchitin (23) mit Succinimidyl-5-formylsalicylsäureester (10), das wie folgt hergestellt wird. Zu 0,5 g 3-Formylsalicylsäure (3 mmol) und 0,42 g NHS (3,5 mmol), die in 10-15 ml DMF gelöst sind, werden 1,28 g CMC (3 mmol) zugegeben und bei Raumtemperatur für 5-6 Stunden, geschützt vor Feuchtigkeit, zur Reaktion gebracht. Zu diesem Reaktionsgemisch werden 2,1 ml p-Mercaptoethanol (30 mmol) zugegeben, um das nicht umgesetzte CMC zu quenchen, vermischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht und der Succinimidyl-5-formylsalicylsäureester wird sofort verwendet. Die 5-Formylsalicylsäure kann durch eine äquimolare Menge einer anderen carboxylierten Carbonylgruppe beinhaltenden Verbindung, wie beispielsweise 4,5-Dioxohetanonsäure, 4-Formylcinnanonsäure, 3-Carboxybenzaldehyd oder 4-Formylphenoxyessigsäure ersetzt werden. Zu dem Glycolchitin (1,7 -2 g), die in 40 ml MOBS-Puffer, pH-Wert von 7.6 gelöst ist, wird unter Rühren die den Succinimidyl-5-formylsalicylsäureester und das Mercaptoethanol beinhaltende DMF-Lösung zugegeben und unter Rühren bei Raumtemperatur für 4-6 Stunden zur Reaktion gebracht. Das 3-Formylsalicylsäurederivat von Glycolchitin (26) wird mit 6 Volumen Ethanol präzipitiert und mit 80% Ethanol gewaschen, um überschüssige Reaktanden zu entfernen. Das präzipitierte Glycolchitinderivat wird in 50-60 ml Wasser gelöst, gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Der Gehalt an 3-Formylsalicylsäure des Glycolchitinderivats wird spektralphotometrisch wie folgt bestimmt: Lösen von 5-8 mg des Glycolchitinderivats in 4 ml einer 0,05 M KOH und Ablesen der UV-Spektren zwischen 220 und 320 nm unter Verwendung einer Lösung gleicher Konzentration nicht modifizierten Glycolchitins in 0,05 M KOH als Blindwert. Berechnen des eingebauten 3-Formylsalicylats unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten für diese in 0,05 M KOH bestimmten Verbindung. Der Aldehydgehalt kann ebenfalls entweder kolorimetrisch mit Schiffschem Reagenz oder spektralphotometrisch mit MBTH bestimmt werden.
Schema 6 Addition von Imin-bildenden Verbindungen an Glycolchitin
Zusätzlich zu den hier beschriebenen Verfahren können andere Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung von Glycidylethern, aktivierten Halogenen und anderen verwendet werden, um Carbonylgruppe beinhaltende Verbindungen an die Glycolsylreste von Polysacchariden zu konjugieren. Siehe beispielsweise Maron et al., Biochem. Biophys. Acta 278 (1972), 243 und Erlanger et al., J. biol. Chem. 228 (1957), 713.
Andere brauchbare Kohlenhydrat-beinhaltende Verbindungen, die durch Oberflächenrezeptoren der APCs erkannt werden, umfassen Chitine und Dextrane tierischen beziehungsweise pflanzlichen Ursprungs. Beispiele geeigneter Kohlenhydrat beinhaltender Verbindung sind bakterielle Teichonsäuren und deren Derivate, bakterielle Lipopolysaccharide, Lipid A und deren Derivate.
Eine Konjugation von Verbindungen, die Imin-bildende Carbonylgruppen enthalten, an nicht adjuvante Kohlenhydrat beinhaltende Produkte wird als nützlich angesehen, um diesen Produkten eine intrinsisch adjuvante Aktivität bereitzustellen und die Wirksamkeit vorbeugender Immunisierungen zu erhöhen. Beispielhaft für diese Produkte sind Polysaccharide aus Streptococci, Staphylococci und anderen Bakterien, die als Impfstoffantigene verwendet werden.
Pharmazeutische und Veterinärzusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung
In einem weiteren Aspekt kann ein erfindungsgemäßes Konjugat, beispielsweise eine Verbindung der Formal I oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon, zur Behandlung von Erkrankungen bei denen ein Fehler im Immunsystem und/oder ein unwirksamer Verteidigungsmechanismus des Wirts vorliegt oder um die Aktivität des Immunsystems über normale Niveaus bzw. Spiegel zu verstärken, verwendet werden.
Eine Verbindung der Erfindung oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon, kann zur Behandlung oder Prophylaxe eines immungeschwächten Säugers alleine oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln, beispielsweise mit anderen anti-viralen Mitteln oder mit anderen Antikrebsmitteln verabreicht werden.
Ein erfindungsgemäßes Konjugat, beispielsweise eine Verbindung der Formel I und pharmazeutisch verträgliche Salze davon können zur Behandlung oder Prophylaxe immungeschwächter Säuger alleine oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln, beispielsweise mit anderen anti-viralen Mitteln oder mit anderen Antikrebsmitteln verabreicht werden.
Immunadjuvantien sind Verbindungen, die wenn sie einem Individuum verabreicht oder in vitro getestet werden, die Immunantwort auf ein Antigen in einem Subjekt oder in einem Untersuchungssystem, dem das Antigen verabreicht wurde, erhöht.
Der Begriff eine "wirksame Menge" bedeutet eine Menge eines erfindungsgemäßen Konjugats, das eine Immunfunktion auf im Wesentlichen normale Niveaus wiederherstellen wird oder eine Immunfunktion über normale Niveaus erhöht, um eine Infektion zu beseitigen.
Eine Potenzierung einer Immunantwort bedeutet eine Wiederherstellung einer gesenkten Immunfunktion, Verstärkung einer normalen Immunfunktion oder beides. Eine Immunfunktion wird als die Entwicklung und Expression einer humoralen (Antikörper vermittelten) Immunität, zellulären (T-Zell vermittelten) Immunität oder Makrophagen und Granulozyten vermittelten Resistenz definiert.
In dieser Beschreibung wird der Begriff "immungeschwächter Patient" verwendet, um Patienten mit einem geschwächten oder fehlerhaften Immunsystem zu beschreiben. Ein immungeschwächter Patient kann durch einen T-Lymphozyten Proliferations- bzw. Vermehrungstest charakterisiert werden. Unter Verwendung dieses Tests werden immungeschwächte Patienten durch eine verminderte Fähigkeit der T-Zellen auf Stimulation durch Mitogene zu antworten, charakterisiert. Ein häufig in diesem Test verwendetes Mitogen ist beispielsweise Phytohämagglutinin (PHA).
Es wird angenommen, dass eine Immunschwäche und Immunsuppression in vielen klinischen Situationen, bei denen Veränderungen bei Übertragungssignalen an Lymphozyten vorkommen, insbesondere T-Zellen, die die Immunantwort orchestrieren. Die T-Zellen benötigen, um eine wirksame Immunantwort in Gang zu bringen zwei Signale:

(i) Besetzung des für Antigen spezifischen T-Zellrezeptors, uns
(ii) Stimulation durch kostimulatorische Rezeptoren.

Bei Abwesenheit von Signal (ii) schaffen die T-Zellen nicht zu antworten und können ebenfalls chronisch paralysiert oder anerg werden. Persistierende virale oder bakterielle Infektionen und eine neoplastische Erkrankung können eine mangelhafte T-Zell-Reaktionsfähigkeit erzeugen, in dem auf verschiedene Weisen in die Zuführung bzw. Lieferung sekundärer Signale eingegriffen wird und auf diese Weise der Immunantwort ausweichen. Die erfindungsgemäßen Konjugate scheinen durch Ersetzen oder anderweitiges Ausgleichen unzulänglicher kostimulatorischer Signale an/für T-Zellen zu wirken.
Neuste Untersuchungen (Rhodes, J. Immunology Today, 17 (1996), 436) zeigten, dass exogene Schiffsche Basen bildende Verbindungen natürliche Spender von Carbonylgruppen ersetzten und CD4 T-Helfer (Th)-zellen ein kostimulatorisches Signal liefern können. In einer ähnlichen Untersuchung (Zheng, B., et al., Science 256 (1992), 1560) führte eine Behandlung von APCs mit Galactoseoxidase, um neue Aldehydgruppen zu bilden zu einer adjuvanten Wirkung, wenn sie mit einem Antigen Mäusen verabreicht wurde.
Diese Ergebnisse unterstreichen die Rolle von Schiffsche Base bildenden Verbindungen als Stimulatoren des Immunsystems. Während der Wechselwirkung zwischen einer APC und Th-Zelle kommt es vorübergehend zwischen den Carbonylgruppen einer spezialisierten APC und den auf immer noch nicht definierten Zelloberflächenrezeptoren angeordneten Aminogruppen der Th-Zelle zur Bildung einer Schiffschen Base. Folgen der Bildung der Schiffschen Base sind: Die Beeinflussung des Immunsystems in Richtung einer Th1-Typantwort mit einem Anstieg in der IL-2 und IFN-γ Produktion in Th-Zellen und der Verstärkung der CTL-Antwort. Schiffsche Base bildende Verbindungen scheinen durch ein Überbrücken bzw. Kurzschließen des kostimulatorischen Weges, der den CD28 Rezeptor auf Th-Zellen und den auf APCs vorkommenden B7-1 Rezeptor einbindet, zu wirken.
Es kommen verschieden Umstände vor, bei denen das Immunsystem geschwächt oder fehlerhaft sein kann. Beispielsweise liegt gewöhnlich eine Immunsystemschwäche bei unreifen oder frühreifen Kindern (Neugeborenen) vor. Sie kann ebenfalls von einer Unterdrückung durch bestimmte Arzneimittel hervorgerufen werden, wobei sie bspw. eine beabsichtigte Nebenwirkung einer Krebschemotherapie sein kann. Ein gestörtes Wachstum von einem oder mehreren Bestandteilen des Immunsystems, kann ebenfalls, bspw. wie bei bestimmten Krebsformen, zu einer Immunschwäche führen. Eine Immunschwäche kann ebenfalls durch virale Infektionen, einschließlich das menschliche Immunschwächevirus (HIV) verursacht werden.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Behandlung immungeschwächter Patienten bereit, welches Verabreichen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Konjugats, beispielsweise einer Verbindung der Formel I oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon, an einen Säuger umfasst.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Konjugats, beispielsweise einer Verbindung der Formel I oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon zur Behandlung und/oder Prophylaxe akuter oder chronischer Virusinfektionen bereit.
Beispielhaft für akute Viren, gegen welche die immunpotenzierende Therapie mit einem erfindungsgemäßen Konjugat, beispielsweise einer Verbindung der Formel I oder einem physiologisch verträglichen Salz davon, vorzugsweise in Kombination mit einem anti-viralen Mittel, verwendet werden kann, werden genannt:
Herpesviren, Influenzaviren, Parainfluenzaviren, Adenoviren, Coxsakieviren, Picornaviren, Rotaviren, Hepatitis A Virus, Mumpsvirus, Rötelvirus, Masernvirus, Pockenviren, respiratorisches Synzytial-Viren, Papillomaviren und Enteroviren, Arenaviren, Rhinoviren, Poliovirus, Newcastle-Virus/Virus der nichtklassischen Geflügelpest, Tollwutvirus und Arboviren.
Beispielhaft für chronische Virusinfektionen gegen welche die immunpotenzierende Therapie mit erfindungsgemäßen Konjugaten verwendet werden kann, werden persistierende Herpesvirusinfektionen, Epstein Barr Virusinfektionen, persistierende Rötelinfektionen, Papillomavirusinfektionen, Hepatitisvirusinfektionen und Infektionen mit menschlichem Immunschwäche Virus, genannt.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können alleine oder in Kombination mit anderen therapeutisch wirksamen Mitteln zur Behandlung der vorstehend genannten Infektionen oder Zuständen verwendet werden. Erfindungsgemäße Kombinationstherapien umfassen die Verabreichung von mindestens einem erfindungsgemäßen Konjugat, beispielsweise einer Verbindung der Formel I oder einem physiologisch verträglichen Salz davon und mindestens einem anderen pharmazeutisch aktiven Bestandteil. Der/die pharmazeutisch aktive(n) Bestandteile) und erfindungsgemäßen Verbindungen können zusammen oder getrennt verabreicht werden und falls sie getrennt verabreicht werden, kann dies gleichzeitig oder aufeinander folgend oder in irgendeiner Reihenfolge erfolgen. Die Mengen des/der pharmazeutisch aktiven Bestandteils(e) und der erfindungsgemäßen Verbindungen und die relativen Zeitpunkte einer Verabreichung werden derart ausgewählt, dass die erwünschte kombinierte therapeutische Wirkung erzielt wird. Vorzugsweise zieht die Kombinationstherapie die Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung und der hierin nachfolgend erwähnten Mittel ein.
Beispiele derartiger weiterer therapeutisch wirksamer Mittel umfassen Mittel, die bei der Behandlung von HIV-Infektionen oder assoziierten Zuständen wirksam sind, wie beispielsweise 3'-Azido-3'-desoxythymidin (Zidovudine), andere 2',3'-Didesoxynucleoside wie beispielsweise 2',3'-Didesoxycytidin, 2',3'-Didesoxyadenosin und 2',3'-Didesoxyinosin, Carbovir, azyklische Nukleoside (beispielsweise, Acyclovir), 2',3'-Dideshydrothymidin, Proteasehemmstoffe wie beispielsweise N-tert-Butyldecahydro-2-[-2(R)-hydroxy-4-phenyl-3(S)-[[N-2-quinolylcarbonyl)-L-asparginyl]butyl]-(4aS,8aS)-isoquinolin-3(S)-carboxamid (Ro31-8959), Oxathiolannukleosideanaloge wie beispielsweise cis-1-(2-Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-cytosin oder cis-1-(2-Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin, 3'-Desoxy-3'-fluorthymidin, 2',3'-Didesoxy-5-ethynyl-3'-fluoruridine, 5-Chlor-2',3'-didesoxy-3'-fluoruridin, Ribavirin, 9-[4-Hydroxy-2-(hydroxymethyl)but-1-yl]guanin (H2G), TAT Hemmstoffe wie beispielsweise 7-Chlor-5-(2-pyrryl)-3H-1,4-benzodiazepin-2(H)-on (Ro5-3335) oder 7-Chlor-1,3-dihydro-5-(1H-pyrrol-2-yl)-3H-1,4-benzodiazepin-2-amin (Ro24-7429), Interferone wie beispielsweise α-Interferon, renale Exkretionshemmstoffe wie beispielsweise Probenecid, Nucleosidtransporthemmstoffe wie beispielsweise Dipyridamol, Pentoxifyllin, N-Acetylcystein, Präzession (precession), α-Trichosanthin, Phosphonoameisensäure, als auch Immunmodulatoren wie beispielsweise Interleukin II, Granulozyten Makrophagen Kolonie stimulierende Faktoren, Erythropoetin, löslicher CD4 and gentechnisch veränderte Derivate davon. Beispiele von weiteren therapeutisch wirksamen Mitteln, die bei der Behandlung von HBV Infektionen wirksam sind, umfassen Carbovir, Oxathiolannucleosidanaloge wie beispielsweise cis- 1-(2-Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)cytosin oder cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin, 2',3'-Didesdoxy-5-ethynyl-3'-fluoruridin, 5-Chlor-2',3'-didesdoxy-3'-fluor uridin, 1-(β-D-Arabinofuranosyl)-5-propynyluracil, Acyclovir und Interferone wie beispielsweise α-Interferon.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Verwendung eines erfindungsgemäßen Konjugats, beispielsweise einer Verbindung der Formel I oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Pneumocystis carinii Infektion in Säugern bereitgestellt.
In einer noch weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Verwendung eines erfindungsgemäßen Konjugats, beispielsweise einer Verbindung der Formel I oder eines physiologisch verträglichen Salzes, bereitgestellt, um Zustände zu behandeln, die von relativen T-Zellschwächen, wie beispielsweise DiGeorge Syndrom, Pilzinfektionen, Mycoplasmeninfektionen, Tuberkulose, Lepra und systemischem Lupus erythematodes hervorgerufen werden.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Verwendung eines erfindungsgemäßen Konjugats, beispielsweise einer Verbindung der Formel I oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krebs in Säugern bereitgestellt.
Beispiele von Krebsformen, die insbesondere zur Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindung geeignet sind, sind: Melanom, Brustkrebs, Darmkrebs, Krebs des Kopfes und Nackens, Magenkrebs, Nierenkrebs, Kehlkopfkrebs, Enddarmkrebs und Non-Hodgkin-Lymphom. Bei Krebs, der tumorspezifische Antigene oder selten exprimierte oder mit sehr geringer Dichte auf normalen Zellen exprimierte Antigene exprimiert, stellen jene wahrscheinlich therapeutische Ziele dar. Bei Krebs, der anerge oder in anderer Weise nicht wirksame tumorspezifische zytotoxische T-Zellen beinhaltet, stellen jene wahrscheinliche Ziele dar. Chirurgisch entfernte Tumore, bei denen ein hohes Risiko eines wiederholten Auftretens besteht, sind ebenfalls zur Therapie mit erfindungsgemäßen Verbindung geeignet.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Verwendung eines erfindungsgemäßen Konjugats, beispielsweise einer Verbindung der Formel I oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon als ein Impfstoffadjuvant bereitgestellt. Ein Impfstoff kann somit durch Formulieren eines antigenen Bestandteils mit einem erfindungsgemäßen Konjugat hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können einem menschlichen Empfänger durch eine Route ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oral, parenteral (einschließlich subkutan, intradermal, intramuskulär und intravenös), rektal und Inhalation, verabreicht werden. Die Größe bzw. Umfang einer wirksamen Dosis einer Verbindung wird von einer Anzahl Faktoren, einschließlich der Persönlichkeit des Empfängers, des involvierten Typs einer Immunpotenzierung, der Schwere des zu behandelnden Zustands und der Verabreichungsroute abhängen und wird schließlich dem Ermessen des behandelnden Arztes unterliegen.
Die wirksame Dosis wird im Allgemeinen in dem Bereich von 0,03 bis 250 mg pro Individuum und vorzugsweise zwischen ungefähr 0,05 bis ungefähr 100 mg pro Dosis liegen. Immunstimulatoren werden vorzugsweise lediglich einmal oder zweimal wöchentlich und in einigen Fällen weniger oft verabreicht. Die Häufigkeit und Dauer einer Behandlung ist zwischen den Arten und Individuen verschieden.
Obwohl die Möglichkeit besteht die erfindungsgemäßen Verbindungen als das Rohchemikalie zu verabreichen, wird bevorzugt sie als eine pharmazeutische Formulierungspräparation anzubieten. Die erfindungsgemäßen Formulierungen umfassen eine erfindungsgemäße Verbindung zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Trägern und wahlweise anderen therapeutisch wirksamen Bestandteilen. Der/die Träger muss in dem Sinne verträglich sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung zusammenpasst und nicht für den Empfänger davon schädlich ist.
Immunadjuvantien sind Verbindungen, die wenn sie einem Individuum verabreicht oder in vitro getestet werden, die Immunantwort auf ein Antigen in einem Subjekt oder in einem Untersuchungssystem, dem das Antigen verabreicht wurde, erhöht. Einige Antigene sind schwach immunogen, wenn sie alleine verabreicht werden oder für ein Subjekt bei Konzentrationen, die brauchbare Immunantworten in einem Subjekt hervorrufen, toxisch. Ein Immunadjuvant kann die Immunantwort des Subjekts auf das Antigen verstärken, indem das Antigen stärker immunogen gemacht wird. Die adjuvante Wirkung kann ebenfalls zu der Fähigkeit führen eine geringere Antigendosis zu verabreichen, um eine nützliche Immunantwort in einem Subjekt zu erzielen.
Die immunogen-auslösende Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen und Zusammensetzungen kann durch eine Anzahl bekannter Verfahren bestimmt werden. Der Anstieg im Antikörpertiter gegen ein bestimmtes Antigen nach Verabreichung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann dazu verwendet werden eine immunogene Aktivität zu erfassen. (Dalsgaard, K., Acta Veterinia Scandinavica 69 (1978), 1-40). Ein Verfahren erfordert intradermales Injizieren von CD-1 Mäusen mit einer Testzusammensetzung, die ein oder mehrere exogene Antigene umfasst. Seren von den Mäusen werden zwei Wochen später geerntet und durch einen ELISA auf Anti-immunogen Antikörper getestet.
Zusammensetzungen der Erfindung sind als Impfstoffe nützlich, um eine aktive Immunität auf Antigene in Subjekten hervorzurufen. Jedes Tier, das die vorteilhaften Wirkungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erfahren kann, liegt innerhalb des Umfangs der Subjekte die behandelt werden können. Die Subjekte sind vorzugsweise Säuger und noch bevorzugter Menschen.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können als Einzeladjuvant verwendet oder alternativ zusammen mit anderen Adjuvantien gemeinsam verabreicht werden. Derartige mit der vorliegenden Erfindung brauchbare Adjuvantien umfassen Öladjuvantien (Freund's vollständiges und unvollständiges), Saponine, modifizierte Saponine, Liposomen, Mineralsalze (beispielsweise AlK(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, AlNH₄(SO₄), Siliziumoxid, Alaun, Al(OH)₃, Ca₃(PO₄)₂, Kaolin, und Kohlenstoff), Polynukleotide (beispielsweise Poly IC- und Poly AU-Säuren), und bestimmte natürliche Substanzen (beispielsweise Wachs D von Mycobacterium tuberculosis, als auch Substanze, die in Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, und Mitglieder des Genus Brucella gefunden werden), Rinderserumalbumin, Diphtherietoxin, Tetanustoxin, Edestin, Keyhol-Limpet Hämocyanin, Pseudomonas Toxin A, Choleragenoid, Choleratoxin, Pertussis-Toxin, virale Proteine und eukaryotische Proteine wie beispielsweise Interferone, Interleukine, oder Tumor Nekrose Faktor. Derarige Proteine können von natürlichen oder rekombinanten Quellen entsprechend der dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Werden sie aus rekombinanten Quellen erhalten, dann kann das Nicht-Saponinadjuvant ein Proteinfragment umfassen, das mindestens den immunogenen Anteil des Moleküls umfasst. Andere bekannte immunogene Makromoleküle, die in der Praxis der Erfindung verwendet wreden können, umfassen sind jedoch nicht beschränkt auf Polysaccharide, tRNA, nicht metabolisierbare synthetische Polymere wie beispielsweise Polyvinylamin, Polymethacrylsäure, Polyvinylpyrrolidon, vermischte Polykondensate (mit relativ hohem Molekulargewicht) von 4',4-Diaminodiphenylmethane-3,3'-dicarboxysäure und 4-Nitro-2-aminobenzoesäure (Siehe Sela, M., Science 166 (1969), 1365-1374) oder Glycolipide, Lipide oder Kohlenhydrate.
Die erfindungsgemäßen Konjugate zeigen adjuvante Wirkungen, wenn sie über einen breiten Dosierungsbereich und einen breiten Bereich von Verhältnissen zu einem oder mehreren bestimmten verabreichten Antigenen, verabreicht werden.
Die Konjugate können entweder einzeln oder vermischt mit anderen im Wesentlichen reinen Adjuvantien verabreicht werden, um eine Verstärkung der Immunantwort auf ein Antigen zu erzielen.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können verwendet werden, um die Immunantwort auf ein oder mehrere Antigene zu verstärken. Gewöhnliche Antigene, die für die Immunantwort hervorrufenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Antigene, die von irgendeinem der Folgenden abgeleitet sind: Viren wie beispielsweise Influenza, Katzen-Leukämievirus, Katzen-Immunschwächevirus, HIV-1, HIV-2, Tollwut, Masern, Hepatitis B oder Maul und Klauenseuche, Bakterien wie beispielsweise Anthrax, Diphtherie, Lyme-Krankheit oder Tuberkulose oder Protozoen wie beispielsweise Babeosis bovis oder Plasmodium. Das Antigen kann Proteine, Peptide, Polysaccharide oder Gemische davon sein. Die Proteine und Peptide können aus einer natürlichen Quelle gereinigt, durch eine Festphasensynthese synthetisiert oder können durch rekombinante Genetik erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können zur Behandlung chronischer Infektionskrankheiten, insbesondere bei Immun beeinträchtigten (immune compromised) Patienten alleine verabreicht werden, um das Immunsystem zu potenzieren. Beispiele von Infektionskrankheiten, für die die erfindungsgemäßen Konjugate zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung verwendet werden können, sind in der US-A-5,508,310 beschrieben. Potenzierung des Immunsystem durch Saponinkonjugate kann ebenfalls als eine vorbeugende Maßnahme verwendet werden, um das Risiko nosokomialer und/oder post-operativer Infektionen zu begrenzen.
Die Verabreichung der Verbindungen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kann parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intranasal oder auf jede geeignete Weise erfolgen. Die verabreichte Dosierung kann von dem Alter, Gewicht, der Art einer begleitenden Behandlung, wenn irgendeine und der Beschaffenheit des verabreichten Antigens abhängen. Im Allgemeinen können die Saponin-/Antigenkonjugate über einen breiten Dosierungsbereich und einen breiten Bereich von Verhältnissen zu dem verabreichten Antigen, verabreicht werden. Der anfänglichen Dosis kann nach einer Dauer von ungefähr vier Wochen eine Verstärkerdosierung folgen, um die immunogene Antwort zu verstärken. Weitere Verstärkerdosierungen können ebenfalls verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können in derartigen Formen wie Kapseln, flüssigen Lösungen, Emulsionen, Suspensionen oder Elixieren zur oralen Verabreichung oder sterilen Formen wie beispielsweise Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, verwendet werden. Irgendein inerter Träger, wie beispielsweise physiologische Kochsalzlösung oder Phosphatgepufferte-Salzlösung wird vorzugsweise verwendet oder irgendein derartiger Träger in dem die verwendeten Verbindungen in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Löslichkeitseigenschaften zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren aufweisen.

Claims

Polysaccharidkonjugat zur Verwendung bei der Potenzierung der Immunantwort eines Tieres auf ein Antigen, worin das Polysaccharidkonjugat umfasst: (i) ein Polysaccharid, das an die Oberfläche von Antigen präsentierenden Zellen (APCs) bindet, worin das Polysaccharid ein Minimum von sieben Sacchariden umfasst; und (ii) eines oder mehrere Moleküle, die eine stabile Carbonylgruppe aufweisen, wobei die einen oder mehreren Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus aromatischen Aldehyden, aromatischen Ketonen, Cycloalkylaldehyden, Cycloalkylketonen, Cycloalkenylaldehyden, Cycloalkenylketonen, heterocyclischen Aldehyden, heterocyclischen Ketonen, heteroaromatischen Ketonen, heteroaromatischen Aldehyden, Alkylaldehyd, Alkylketonen, Alkenylaldehyden und Alkenylketonen; worin das Polysaccharid (i) an die Moleküle (ii) durch (iii) eine direkte kovalente Bindung oder kovalent über einen bifunktionellen Linker in einer Weise verbunden ist, die die stabile Carbonylgruppe unbeschädigt hält.
Polysaccharidkonjugat nach Anspruch 1, worin ein Potenzieren der Immunantwort eines Tieres auf ein Antigen ein Verstärken der Immunantwort des Tiers umfasst.
Polysaccharidkonjugat nach Anspruch 1, worin das Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Glucanen, Mannanen, pektischen Polysacchariden und 2-Acetamidoglucanpolysacchariden.
Polysaccharidkonjugat nach Anspruch 1, worin die Moleküle, die eine stabile Carbonylgruppe aufweisen, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus mono- und disubstituierten C_6- ₁₀ Arylaldehyden, C_6-10 Aryl(C_1-4)alkylaldehyden und Gemischen davon; Phenyl oder Naphtyl, die durch einen Formyl- oder Formyl(C_1-4)alkyl-Substituenten substituiert sind und wahlweise einen oder zwei zusätzliche Substituenten umfassen, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Halo, Hydroxy, C_1-4 Alkyl, C_1-4 Alkoxy, Trifluormethyl, und Benzyloxy; Benzaldehyd und Naphthaldehyd, die durch ein oder zwei von Hydroxy und Halo substituiert sind; 2,3-, 2,4- 2,5- und 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, 5-Chlor-2-hydroxybenzaldehyd, Vanillin, Ethylvanillin, Naringenin, 3- und 4-Hydroxybenzaldehyd oder 4-Hydroxyphenylacetaldehyd, Hydroxy substituierte C_1-4 Alkyl(C_6-10)arylketone und Hydroxy substituierte Arylketone; 2-Hydroxyacetophenon, 3-Hydroxyacetophenon, 4-Hydroxyacetophenon und 6-Hydroxy-1,2-naphthoquinon; Heteroarylaldehyde und Heteroarylketone; Thiophen, Furan, Benzothiophen, Benzofuran, Pyridin, Quinolin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3-Triazo1, 1,2,4-Triazol, Isoxazol oder Oxazol, die jeweils einen Keto-, Formyl- oder Formyl(C_1-4)-Substituenten aufweisen und vorzugsweise einen zusätzlichen Halo- oder Hydroxy-Substituenten umfassen, wenn diese durch verfügbare Ringatome aufgenommen werden können; Pyridoxal, 2-Thiophencarboxaldehyd und 3-Thiophencarboxalehyd.
Polysaccharidkonjugat nach Anspruch 1, worin der Rest eines bifunktionellen Linkermoleküls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H₂N-(CH₂)_r-NH₂, worin r von 2 bis 12 ist; HO-(CH₂)_r-NH₂, worin r von 2 bis 12 ist; HS-(CH₂)_r-NH₂, worin r von 2 bis 12 ist; Aminosäuren, die wahlweise Carboxy-geschützt sind; und H-(O-CH₂-CH₂)_n-OH wobei n 1-4 ist, Ethylendiamin, 1,4-Butandiamin, Spermidin, 2,4-Diaminobuttersäure, Lysin, β-Alanin, γ-Aminobuttersäure, Dialanin, Trialanin, 3,3'-Diaminodipropylamin, Diaminopropionsäure, N-(2-Aminoethyl)1,3-propandiamin und 2-(4-Aminophenyl)ethylamin, -NH-(CH₂)_r-NH-, worin r von 2-5 ist, -O-(CH₂)_r-NH-, worin r von 2-5 ist, -NH-CH₂-C(O)-, -O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-, -NH-NH-C(O)-CH₂-, -NH-C(CH₃)₂-C(O)-, -S-(CH₂)_r-C(O)-, worin r von 1-5 ist, -S-(CH₂)_r-NH-, worin r von 2-5 ist, -S-(CH₂)_r-O-, worin r von 1-5 ist, -S-(CH₂)-CH(NH₂)-C(O)-, -S-(CH₂)-CH(COOH)-NH-, -O-CH₂-CH(OH)-CH₂-S-CH(CO₂H)-NH-, -O-CH₂-CH(OH)-CH₂-S-CH(NH₂)-C(O)-, -O-CH₂-CH(OH)-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-, -S-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-, und -NH-O-C(O)-CH₂-CH₂-o-P(O₂H)-.
Polysaccharidkonjugat nach Anspruch 1, worin das Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Glucanen, Mannanen, pektischen Polysacchariden, Chitin und seinen Derivaten, Murein, bakteriellen Fructanen, Xanthanen, bakteriellen Heteropolysacchariden, Pullulan vom Pilz und Ester, Sulfonate, Sulfate, Phosphate; Ether und quervernetzte Derivate davon.
Polysaccharidkonjugat nach Anspruch 1, worin das Polysaccharid ein β-Glucan mit einer Rückgradkette von (1→3)-verknüpften β-D-Glucopyranosyleinheiten ist und welches β-D-Glucopyranosyleinheiten, die durch (1→6) Verbindungen verbunden sind und ein Molekulargewicht zwischen 5.000 bis 500.000 aufweist und worin das β-Glucan wahlweise durch die Addition von einem oder mehreren anionischen, kationischen oder nicht-ionischen Gruppen modifiziert ist.
Polysaccharidkonjugat nach Anspruch 1, worin das Polysaccharid ein β-Mannan ist, das eine (1→4) Polymannose mit einem den Terminus reduzierenden Mannosylrest oder das Acetylierungsprodukt davon umfasst.
Polysaccharidkonjugat nach Anspruch 1, worin das Polysaccharid ein pektisches Polysaccharid ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Homogalacturonanen, Rhamnogalacturonanen, Arabanen, Galactanen und Arabinogalactanen und worin das pektische Polysaccharid immunpotenzierende Aktivität besitzt.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats bei der Herstellung eines Medikaments zum Behandeln einer Erkrankung, worin das Polysaccharid umfasst (i) ein Polysaccharid, das an die Oberfläche von Antigen präsentierenden Zellen (APCs) bindet, worin das Polysaccharid ein Minimum von sieben Sacchariden umfasst; und (ii) eines oder mehrere Moleküle, die eine stabile Carbonylgruppe aufweisen, wobei die einen oder mehreren Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus aromatischen Aldehyden, aromatischen Ketonen, Cycloalkylaldehyden, Cycloalkylketonen, Cycloalkenylaldehyden, Cycloalkenylketonen, heterocyclischen Aldehyden, heterocyclischen Ketonen, heteroaromatischen Ketonen, heteroaromatischen Aldehyden, Alkylaldehyd, Alkylketonen, Alkenylaldehyden und Alkenylketonen, worin Polysaccharid (i) an Moleküle (ii) durch (iii) eine direkte kovalente Bindung oder kovalent über einen bifunktionellen Linker in einer Weise verbunden ist, die die stabile Carbonylgruppe unbeschädigt hält, und worin die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Krebs oder einer bakteriellen oder viralen Infektion oder die Folge von Krebs oder einer bakteriellen oder viralen Infektion, oder DiGeorge Syndrom, Pilzinfektionen, Mycoplasmeninfektionen, Tuberkulose, Legra und systemischer Lupus erythematodes ist.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 10, worin das Medikament ein Impfstoff ist.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 10 oder 11, weiter mindestens ein therapeutisches Agens oder Adjuvans umfassend.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 10, worin die virale Infektion die Folge eines Virus ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Herpes, Epstein-Barr, Rubella, Pappilovirus und menschlichem Ummunschwäche Virus.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 10, worin die Erkrankung Hepatitis ist.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 10, worin der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Non-Hodgkin-Lymphom, Melanom, Brust-, Colon-, Kopf- und Nacken-, Magen-, Nieren-, Kehlkopf-, und Enddarmkrebs, Krebs der Antigene exprimiert, Krebs, der anerge tumorspezifische cytotoxische T-Zellen aufweist und chirurgisch entfernten Krebs, bei dem ein Rückfallrisiko besteht.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 10, worin die Erkrankung eine Pneumocystis carinii Infektion ist.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 10, weiter ein Antigen umfassend.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 10, worin das Antigen von einem Virus, Bakterium oder Protozoen stammt.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 18, worin das Antigen von einem der Folgenden stammt Grippe, felide Leukämie, Felides Immunschwäche Virus, HIV-1, HIV-2, Tollwut, Masern, Hepatitis B, Maul und Klauenseuche, Anthrax, Diphtherie, Lyme-Krankheit, Tuberkulose, Babeosis bovis oder Plasmodium.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 12, worin das therapeutische Agens ein antivirales oder Antikrebsmittel ist.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 20, worin das antivirale Agens ein Agens für die Behandlung von Viren ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Herpes, Gruppe, Parainfluenza, Adenoviren, Coxsaki, Picorna, Rotaviren, Hepatitis A, Mumps, Rubella, Masern, Pocken, respiratorisches Synzytial, Papilloma, Enteroviren, Arenaviren, Rhinoviren, Polio, Newcastle Krankheit, Tollwut und Arboviren.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 20, worin das antivirale Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3'-Azido-3'-desoxythymidin, 2',3'-Didesoxycytidin, 2',3'-Didesoxyadenosin, 2',3'-Didesoxyinosin, Carbovir, 2',3'-Didehydrothymidin, N-ter-Butyldecahydro-2-[-2(R)-hydroxy-4-phenyl-3(S)-[[N-2-quinolylcarbonyl)-L-asparginyl]butyl]-(4aS,-8aS)-isoquinolin-3(S)-carboxamid, cis-1-(2-hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-cytosin oder cis-1-(2-hydroxymethyl)-1,3-oxarhiolan-5-yl)-5-fluor-cytosin, 3'-Desoxy-3'-fluorthymidin, 2',3'-Didesoxy-5-ethynyl-3'-fluoruridin, 5-Chlor-2',3'-Didesoxy-3'-Fluoruridin, Ribavirin, 9-[4-Hy droxy-2-(hydroxymethyl)but-1-yl]guanin, 7-Chlor-5-(2-pyrryl)-3H-1,4-benzodiazepin-2(H)-on, 7-Chlor-l,3-dihydro-5-(1H-pyrrol-2-yl)-3H-1,4-benzodiazepin-2-amin, α-Interferon, Probenecid, Dipyridamol, Pentoxifyllin, N-Acetylcystein, Precession, α-Trichosanthin, Phosphonoameisensäure, Interleukin Π, Erythropoetin, und 1-(β-D-Arabinofuranosyl)5-propynyluracil.
Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach Anspruch 12, worin das Adjuvans ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Öl-Adjuvantien, Saponinen, modifizierte Saponinen, Liposomen, Mineralsalzen, Polynukleotiden, bestimmten natürlichen Substanzen, die von Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis oder Mitgliedern der Gattung Brucella isoliert sind, Rinderserum, Albumin, Diphtherietoroid, Edestin, Schlüssellochlimpethämocyanin, Pseudomonas Toxin A, Choleragenoid, Choleratoxin, Pertussis-Toxin, viralen Proteinen, eukarytotischen Proteinen, Polysaccharid, RNA, Polyvinylamin, Polymethacrylsäure, Polyvinylpynolidon, Polykondensaten, Glycolipiden, Lipiden und Kohlenhydraten.