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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Auftrennung und zum Nachweis
von Polynucleotid-Fragmenten mit hohem dynamischem Bereich, die
besonders bei der Durchführung
des Verfahrens zur Quantifizierung und partiellen Sequenzierung
eines Nucleinsäure-Analyten
nützlich
ist, der in einer Probe vorliegt, wie es in der verwandten US Patent Application
Serial No. 08/819,912, eingereicht am 18. März 1997, und in einer PCT-Anmeldung,
die deren Priorität
beansprucht und am 18. März
1998 eingereicht wurde, offenbart ist. In diesem Verfahren wird eine
Nucleinsäure-haltige
Probe mit einem Kontroll-Polynucleotid vereinigt und dann mit mehreren Primersätzen amplifiziert,
um ein Kontroll-Nucleinsäure-Fragment,
das durch die Amplifikation des Kontroll-Polynucleotids erzeugt
wurde, konservierte Nucleinsäure-Fragmente,
die durch Amplifikation einer konservierten Region der Nucleinsäure in der Probe
erzeugt wurden, um ein quantitatives Maß der Anwesenheit einer Ziel-Nucleinsäure in der
Probe zu produzieren, und Sequenzierungs-Fragmente zu produzieren,
die bevorzugt durch Amplifikation eines variableren Teils der Nucleinsäure in der
Probe erzeugt wurden und nach der Sequenzierung eine Information
bereitstellen können,
welche verschiedene, aber eng verwandte Formen einer Ziel-Nucleinsäure, einschließlich, ohne
jedoch darauf beschränkt zu
sein, unterschiedlicher allelischer oder mutierter Formen von Genen
oder im Fall von Mikroorganismen Unterarten, Serovaren, Stämmen, Untertypen, Biovaren,
Varianten oder Serotypen, oder eng verwandte Arten des Ziels betreffen
und/oder zwischen diesen unterscheiden. Die resultierenden Fragmente werden mittels
Größe zum Beispiel
durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt, und die Kontroll-
und konservierten Fragmente werden durch Fluoreszenz einer Markierung
nachgewiesen, die an dem Amplifikationsprimer angebracht ist.
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Abhängig von
den unterschiedlichen Mengen von Kontroll- und Ziel-Nucleinsäure, die
in der Probe vorliegen, können
sich die Größen der
Signale, die den Kontroll- und
konservierten Fragmenten entsprechen, um mehrere Größenordnungen
unterscheiden. In der Vergangenheit hat dies, da Instrumente, die
zum Messen der Fluoreszenz aus Elektrophoresegelen verwendet wurden,
einen relativ niedrigen dynamischen Bereich aufwiesen, im Allgemeinen
bedeutet, dass wiederholte Experimente bei verschiedenen Verdünnungen
durchgeführt
werden müssen,
um zu ermöglichen,
dass beide Peaks gemessen werden. Derartige Verdünnungen erhöhen die Kosten eines Assays
wegen der erhöhten
Zeit, die erforderlich ist, um die Probe herzustellen, und des verringerten
instrumentellen Durchsatzes, und sie können eine Fehlerquelle bei
der Quantifizierung der Menge an Material in der Probe sein, da
Verdünnungsserien
sowohl eine präzise
Herstellung als auch Berechnung nach der Messung erfordern, um zu
einem quantitativen Ergebnis zu gelangen.
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Vorrichtungen
für die
elektrophoretische Auftrennung und Analyse der fluoreszierend markierten Fragmente
sind in der Technik bekannt, zum Beispiel aus der internationalen
Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/18892. Jedoch wäre
es, um die Möglichkeit zu
maximieren, quantitative Ergebnisse für die Menge einer Ziel-Nucleinsäure in einer
Probe zu erhalten, ohne dass Verdünnungsserien durchgeführt werden müssen, wünschenswert, über eine
Vorrichtung für die
elektrophoretische Auftrennung und den Echtzeit-Nachweis von Nucleinsäuren zu
verfügen,
die einen höheren
dynamischen Bereich, zum Beispiel in der Größenordnung von 104 bis
106 oder mehr, aufweist. Es ist ein Ziel
der vorliegenden Erfindung, eine derartige Vorrichtung bereitzustellen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zur Nucleinsäure-Sequenzierung
mit hohem dynamischem Bereich bereit, wie im Anspruch 1 definiert.
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Bei
einer ersten Ausführungsform
der Erfindung ist ein Strahlteiler vorgesehen, der aus jeder Anregungs-/Nachweisstelle
einen Strahl emittierten Lichts mit hoher Intensität und einen
Strahl emittierten Lichts mit niedriger Intensität erzeugt und einen Strahl
zu jedem von zwei Detektoren lenkt, die der Anregungs-/Nachweisstelle zugeordnet
sind. Bei einer zweiten Ausführungsform
der Erfindung kann eine Modulation der Intensität des Anregungsstrahls verwendet
werden, um den dynamischen Bereich des Instruments zu verbessern.
Ein Anregungsstrahl von abwechselnd hoher und niedriger Intensität kann verwendet
werden, und Messungen werden in Abhängigkeit von der Stärke des
Signals entweder während
der Niedrigenergiefenster oder der Hochenergiefenster vorgenommen.
In Abhängigkeit
von der Erholungszeit des verwendeten Detektors und der Verweilzeit
eines wandernden bzw. migrierenden Elektrophoresebandes innerhalb
der Anregungs-/Nachweisstelle kann diese Ausführungsform entweder einen einzigen
oder mehrere Detektoren pro Stelle verwenden. Ein Betriebszyklus
aus abwechselnden Ein- und Aus-Perioden mit veränderlichen Zeiten kann ebenfalls
verwendet werden, insbesondere in Fällen, wo die kleinste Integrationszeit des
Detektors zum Nachweis sehr großer
Peaks zu lang sein mag.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die 1A und
B zeigen eine Vorrichtung gemäß der Erfindung;
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die 2A und
B zeigen alternative Mittel, um die Anregungsstrahlung zu einem
Array von Anregungs-/Nachweisstellen zu lenken;
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die 3A-C
veranschaulichen die Peak-Größe, die
aufgefangene Lichtintensität
und das Detektorsignal für
eine Ausführungsform
der Erfindung;
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4 zeigt
eine zweite Ausführungsform
der Mittel zur Vergrößerung des
dynamischen Bereichs der Vorrichtung der Erfindung;
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die 5A-D
veranschaulichen die Verwendung eines modulierten Anregungsstrahls
gemäß der vorliegenden
Erfindung; und
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die 6A und
B veranschaulichen ein Verfahren, bei dem die Vorrichtung der Erfindung
in geeigneter Weise verwendet wird.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Nucleinsäure-Sequenzierung mit
hohem dynamischem Bereich, umfassend:
- (a) ein
Gehäuse,
das angepasst ist, um einen Elektrophoresegel-Halter aufzunehmen,
der ein mit Fluorophor-markierten Proben beladenes Elektrophoresegel
enthält;
- (b) eine oder mehrere Strahlungsquellen, wie Laserdioden, zur
Bereitstellung von Strahlung einer Frequenz, die zur Anregung des
Fluorophors geeignet ist;
- (c) Mittel, um die Strahlung zu einer Mehrzahl von Anregungs-/Nachweisstellen
auf dem Elektrophoresegel zu lenken;
- (d) ein Array von Detektoren, die mit den Anregungs-/Nachweisstellen
ausgerichtet sind, um Fluoreszenzemissionen aufzufangen und ein elektrisches
Ausgangssignal zu erzeugen, das für die Intensität der Fluoreszenzemissionen
bezeichnend ist; und
- (e) Mittel zum Vergrößern des
dynamischen Bereichs der Vorrichtung um mindestens eine Größenordnung.
Die Vorrichtung kann für
die Auftrennung und den Nachweis von Polynucleotid-Fragmenten, wie
Fragmenten, die in einer Nucleinsäure-Amplifikations- oder Sequenzierungsreaktion erzeugt
werden, einen Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus(RFLP)-Assay
oder einen Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus(SSCP)-Assay
sowie für
jeden anderen Test verwendet werden, in dem die Auftrennung und der
Nachweis von Polynucleotid-Fragmenten erforderlich ist. Die Vorrichtung
der Erfindung ist insbesondere für
die Verwendung bei der Auftrennung und dem Nachweis von Polynucleotid-Fragmenten
in Mischungen geeignet, in denen mehrere verschiedene Polynucleotid-Fragmente
in sehr unterschiedlichen Mengen vorliegen können. So ist die Vorrichtung
der Erfindung beispielsweise gut für die Auftrennung und den Nachweis
der Polynucleotid-Fragmente geeignet, die in dem Verfahren erzeugten,
das in der verwandten US Patent Application Serial No. 08/819,912
und der PCT-Anmeldung, die deren Priorität beansprucht, offenbart ist.
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1A veranschaulicht
den grundlegenden Aufbau einer Vorrichtung der Erfindung. Wie dargestellt,
weist die Vorrichtung ein Gehäuse 10 auf,
in dem die Mittel zur elektrophoretischen Trennung und zum Nachweis
der Probe angeordnet sind. Das Gehäuse 10 liefert vorteilhafterweise
eine geschlossene lichtdichte Umgebung, in der die Verarbeitung
der Probe durchgeführt
wird.
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Innerhalb
des Gehäuses 10 ist
ein beladenes Elektrophoresegel 102 in einem Gel-Halter 101 auf einer
Montageplatte 109 angeordnet, die das Gel in einer feststehenden
Position in Bezug zum Rest der Vorrichtung hält, einschließlich der
Anregungs-/Nachweisteile der Vorrichtung. Das beladene Gel kann
festgehalten werden, indem unter Verwendung einer Saugpumpe 110 und
von Rohrleitungen 113 ein Unterdruck durch die Montageplatte 109 hindurch
erzeugt wird, obwohl andere Verfahren zum Festhalten des beladenen
Gels verwendet werden können.
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Entgegengesetzte
Enden des beladenen Gels 102 werden mit zwei Elektroden,
wie Lösungselektroden 104 und 105,
in Kontakt gebracht. Diese Elektroden sind mit einer Stromversorgung 114 verbunden,
die innerhalb des Gels ein elektrisches Feld erzeugt. Dieses Feld
bewirkt, dass die Probe im Gel von der Beladungsstelle 103 in
Richtung der Anregungs-/Nachweisstelle 106 wandert.
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Eine
Anregungsquelle 107, die elektromagnetische Strahlung mit
einer Frequenz liefert, welche wirksam ist, um den als Markierung
verwendeten Fluorophor anzuregen, ist so innerhalb des Gehäuses 10 angeordnet,
dass Strahlung aus der Anregungsquelle 110 gelenkt wird,
um an den Anregungs-/Nachweisstellen 106 auf das Gel zu
treffen. Ein Mehrfach-Strahlteiler 202 kann verwendet werden,
um eine Mehrzahl von Flecken in einem linearen Array zu erzeugen,
einen Fleck an jeder Anregungs-/Nachweisstelle auf einem ebenen
Elektrophoresegel. Alternativ kann ein lineares Array von Anregungs-/Nachweisstellen
von einem Array von Laserdioden erzeugt werden, wobei jede Diode
so angeordnet ist, dass sie Anregungsenergie an eine einzige Anregungs-/Nachweisstelle
liefert. In jedem Fall werden Fluoreszenzemissionen aus Fluorophor-markierten
Molekülen
an der Anregungs-/Nachweisstelle unter Verwendung eines optischen
Systems 115 aufgefangen und unter Verwendung eines Detektors 108 erfasst
bzw. nachgewiesen. Das analoge Ausgangssignal aus dem Detektor 108 kann dann
unter Verwendung eines A/D-Wandlers 116 in ein digitales
Signal umgewandelt und zur weiteren Verarbeitung und/oder Anzeige
ausgegeben werden.
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1B zeigt
einen Querschnitt einer weiteren Ausführungsform der Vorrichtung
der Erfindung. Die verschiedenen Komponenten der Vorrichtung sind
innerhalb eines Gehäuses 90 angeordnet,
das an seiner Vorderseite eine Zugangstüre 91 aufweist. Die
Zugangstüre 91 ist
schwenkbar, um eine Bewegung zwischen einer geschlossenen Stellung
(durchgezogene Linie) und einer offenen Stellung (strichpunktierte
Linie) zu ermöglichen.
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Innerhalb
des Gehäuses 90 wird
der Gel-Halter 901 zwischen zwei Lösungselektroden 902, 902' gegen eine
Montageplatte 903 anliegend festgehalten. Die Montageplatte 903 und
die Lösungselektroden
sind um einen Bolzen 925 nach außen schwenkbar, um eine Beladung
eines Elektrophoresegels zu erleichtern. Ein Heizelement 904 ist im
Wärmekontakt
mit der Rückseite
der Montageplatte 903 angeordnet, um eine Erwärmung des
Gels zu ermöglichen.
Ein Gebläse 905,
das von einem Untergehäuse 906 umgeben
und zur Außenseite
des Gehäuses 90 hin
mit einer Luftzufuhr versehen ist, bläst Luft mit Raumtemperatur über die
Rückseite
des Heizelements 904. Durch eine Kombination von Heizen und
Kühlen,
für die
mittels des Heizelements 904 bzw. des Gebläses 905 gesorgt
wird, kann eine gewünschte
Temperatur im Bereich von 30 bis 55 Grad C mit einer Toleranz von
0,5 Grad aufrechterhalten werden.
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Ein
Detektormodul 907, bestehend aus einem Array von Photodioden,
von denen jede mit einer Leiterplatte verbunden ist, ist mit der
Anregungs-/Nachweisstelle im Gel ausgerichtet und fängt Licht
auf, das senkrecht zur Oberfläche
des Gel-Halters 901 emittiert wird. Die Leiterplatte enthält einen Analog/Digital(A/D)-Wandler,
der den von der Diode abgegebenen analogen Strom in ein digitales
Spannungssignal umwandelt. Dieses digitale Signal kann dann von
der innerhalb des Gehäuses
angeordneten Computer-Leiterplatte 914 weiterverarbeitet
oder zur Verarbeitung zu einem externen Computer übermittelt
werden.
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Der
Anregungsstrahl wird von einer Laserdiode 908 bereitgestellt,
die in Ausrichtung mit einer asphärischen Linse 909 montiert
ist. Die asphärische Linse 909 kollimiert
die aus der Laserdiode 908 abgegebene Strahlung und lenkt
sie in Richtung eines Strahlteilers, in diesem Fall ein lichtdurchlässiges Beugungsgitter 920,
welches das Licht aus der Laserdiode in 16 Teilstrahlen von im Wesentlichen
gleicher Intensität
aufteilt. Diese Teilstrahlen werden von einer Linse 921 und
Spiegeln 910, 911 zu einer Zylinderlinse 912 geleitet,
welche die zerquetschten Flecken an den Anregungs-/Nachweisstellen
bildet. Die Spiegel 910, 911 können aus Aluminium oder aus Aluminium-beschichtetem
Glas sein, wenn die Anregungswellenlänge unter 650 nm liegt, sind
jedoch für längere Wellenlängen wegen
des größeren Reflexionsvermögens von
Gold bei diesen Wellenlängen vorteilhafterweise
aus Gold-beschichtetem Glas. Dielektrische Spiegel können ebenfalls
verwendet werden, obwohl sie wesentlich teurer sind.
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Innerhalb
der in 1B dargestellten Vorrichtung
befindet sich auch eine mit Öffnungen
versehene Sperre 922 zwischen dem letzten Spiegel 911 und
der Zylinderlinse 912, die so ausgerichtet ist, dass jeder
Teilstrahl durch eine einzelne Öffnung
(1-3 mm Durchmesser) in der Sperre hindurchtritt. Diese Sperre reduziert
die Menge an Streulicht, welche die Anregungs-/Nachweisstelle erreicht.
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Eine
Stromversorgung 913 ist innerhalb des Gehäuses 90 angeordnet
und ist mit den Lösungselektroden 902 verbunden,
um den Spannungsgradienten für
die Elektrophorese bereit zu stellen.
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2A zeigt
ausführlicher
die Funktionsweise der Strahlteiler 202 (920 in 1B).
Strahlung 201 aus einer Anregungsquelle 107 wird
durch Verwendung eines Mehrfach-Strahlteilers 202, wie
eines Fleckarray-Erzeugungsgitters, das den einfallenden Strahl
in eine Anzahl von Teilstrahlen, im Allgemeinen von 2 bis 24 Teilstrahlen,
aufteilt, zur Anregungsstelle 106 gelenkt. Bevorzugte Beugungsgitter
sind von der Art, die als "durchlässige" oder "Phasen"-Gitter bekannt sind,
weil solche Gitter ausgelegt werden können, um unter den resultierenden
Teilstrahlen eine Lichtverteilung von gleichmäßiger Intensität zu erzeugen.
Bei der dargestellten Ausführungsform wird
ein einfallender Laserstrahl von einer Frequenz, die zur Anregung
des Fluorophors geeignet ist, in ein binäres Phasengitter von ungefähr 1 Quadratzentimeter
gelenkt, das auf Glas, thermoplastischem Kunststoff oder dergleichen
von ungefähr
1/8-Inch Dicke montiert ist (Semiconductor Technology Inc., Pointe
Claire, Quebec). Der durchgelassene Strahl wird in ein lineares
Array der gewünschten
Anzahl von Anregungs-Teilstrahlen 203 unterteilt, einer
für jede
vorgesehene Anregungs-/Nachweisstelle 106. Die
Teilstrahlen werden zu einer Fokussierlinse 204 gelenkt
(z.B. Stock Nr. G69, 129, Katalog 1994 Edmund Scientific). Bei der
dargestellten Ausführungsform
weist die Fokussierlinse vorzugsweise eine Brennweite f von 505
mm auf. Die Größe des Flecks an
jeder Anregungsstelle kann durch Veränderung des Abstandes d2 zwischen der Linse und der Anregungsstelle
verändert
werden. Die Flecken weisen zweckmäßigerweise einen Durchmesser
zwischen 0,1 mm und 0,2 mm auf. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
teilt das zur Erzeugung des Fleckarrays dienende Gitter den einfallenden
Laserstrahl in ein lineares Array von 16 Flecken, und die Linse
ist zwischen 200 bis 500 mm vom Gel angeordnet.
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Als
Alternative zu der in 2A dargestellten Ausführungsform
kann die Fokussierlinse 204 weggelassen werden. In diesem
Fall ist der Strahl 201 leicht konvergent, während er
das Beugungsgitter 202 beleuchtet, so dass die einfallende
Strahlung auf die Gel-Oberfläche
fokussiert wird.
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Ein
bevorzugtes Fleckarray-Erzeugungsgitter zur Verwendung in einer
Vorrichtung mit 16 Kanälen
ist ein 1- bis 16-fach-Strahlteiler, wie derjenige, der von Dinova
Optics, Quebec, Canada (Teile-Nr. QP 960101-6) erhältlich ist.
Fleckarray-Erzeugungsgitter,
die einen einfallenden Strahl in eine größere oder kleinere Anzahl von
Flecken mit denselben Wellenlängeneigenschaften
wie der einfallende Strahl teilen, können verwendet werden, um Strahlung
für eine
Vorrichtung mit einer größeren oder
kleineren Anzahl von Kanälen
bereit zu stellen. Mehrere Fleckarray-Erzeugungsgitter können auch
parallel mit mehreren zugehörigen
Lichtquellen verwendet werden, zum Beispiel können für eine 32-Kanal-Vorrichtung zwei
1- bis 16-fach-Strahlteiler und zwei Laserdioden verwendet werden.
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Ein
alternatives Verfahren zum Erzeugen eines linearen Arrays von Flecken
auf einem planaren Gel 220 ist in 2B dargestellt.
Bei diesem Verfahren ist eine zweckbestimmte Laserdiode 221 so
angeordnet, dass sie elektromagnetische Strahlung zu jeder Anregungs-/Nachweisstelle 222 abgibt.
Die Laserdioden 221 sind in einem Array zusammengesetzt.
Jede Laserdiode 221 kann ihre eigene Stromversorgung 223 mit
unabhängiger
Stromeinstellung aufweisen, oder der zugeführte Strom kann verkettet werden.
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Licht
aus jeder Laserdiode 221 wird durch eine sphärische Linse 224 hindurchgeführt, um
es zu der entsprechenden Anregungs-/Nachweisstelle 222 auf
dem Gel 220 zu lenken. Emittiertes Licht aus jeder Anregungs-/Nachweisstelle 222 wird
von einer Linse 226 aufgefangen, von einem optischen Filter 227 gefiltert,
um Streulicht der Anregungswellenlänge zu beseitigen, und dann
von einer Linse 228 zu einem Photodioden-Detektor 229 gelenkt.
Die Detektoren 229 sind mit einer elektrischen Leiterplatte 230 zur
Verarbeitung der Detektor-Ausgangsgröße verbunden.
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Bei
der Vorrichtung der Erfindung ist die Anregungs-Strahlungsquelle
eine Laserdiode mit einer Wellenlänge, die zur Anregung eines
Fluorophors geeignet ist, der an den gerade analysierten Polynucleotidfragmenten
angebracht ist. Im Fall der Fluoreszenzmarkierung Cy 5.5 ist eine
geeignete Anregungs-Strahlungsquelle
eine Phillips 20 mW-Laserdiode (Teile-Nr. CQL806/D), die Licht mit
einer Wellenlänge
von 675-677 nm erzeugt. Emittiertes Licht wird durch einen 695-735
nm-Bandpassfilter (Omega Optical, Brattleboro, VT) hindurch geleitet
und unter Verwendung eines Arrays von Silicium-Photodioden-Detektoren
(Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan, Teile-Nr. S2386-18K)
erfasst bzw. nachgewiesen.
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Die
in der Vorrichtung der Erfindung enthaltenen Mittel zur Vergrößerung des
dynamischen Bereichs sind wirksam, um den dynamischen Bereich des
Instruments im Verhältnis
zu demselben Instrument ohne dieses Element um mindestens eine Größenordnung
zu vergrößern. Verschiedene
Mittel zum Vergrößern des
dynamischen Bereichs können
verwendet werden.
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Bei
einer ersten Ausführungsform
der Erfindung sind die Detektoren mit einem Signalverarbeitungssystem
verbunden, das zwei unterschiedliche Signalintegrationsperioden
aufweist, d.h. zwei unterschiedliche Perioden, während deren man den Detektor
Signal akkumulieren lässt,
bevor er abgetastet oder gelesen wird. Wenn die Intensität des emittierten
Lichts hoch ist, kann es sein, dass der Detektor in einem verhältnismäßig kurzen
Zeitraum gesättigt
ist. Eine kurze Integrationsperiode gestattet die Erfassung bzw.
den Nachweis von sinnvollem Signal, bevor diese Sättigung
stattfindet. Wenn andererseits die emittierte Lichtintensität niedrig
ist, kann eine längere
Integrationsperiode erforderlich sein. Indem man zwischen kurzen
und langen Integrationsperioden abwechselt, kann der Detektor daher
für einen breiteren
dynamischen Bereich sorgen. Der bevorzugte Bereich von kurzen zu
langen Perioden liegt zwischen 1:1000 und 1:10 und beträgt vorzugsweise 1:100.
Eine geeignete Mindestperiode beträgt 10 ms und eine geeignet
lange Periode würde
1 s betragen. Die Abtastperioden sind durch die Zeit getrennt, die man
benötigt,
um den Detektor aufzusummieren, ungefähr 1 ms. Diese Technik ist
in der US Patent Application Serial No. 08/452,719 vollständiger offenbart.
Im Allgemeinen wird jedoch die Integrationsperiode durch einen Mikroprozessor
bestimmt, der festlegt, wann der Photodioden-Detektor abgetastet
werden soll. Speziell erzeugt die Photodiode einen Strom, der proportional
zu den erfassten Photonen ist. Der Strom wird in einem Kondensator
gespeichert, der Teil eines Integriergliedes ist. Die Spannung auf
dem Kondensator wird in den vom Mikroprozessor festgelegten Zeitpunkten
mittels eines A/D-Wandlers abgetastet (oder gelesen), wobei er nach
der Abtastung entladen und zurückgesetzt
werden kann. Alternativ kann nach dem Lesen des Wertes am Ende der
kurzen Integrationsperiode das Integrierglied bis zum Ende der langen
Integrationsperiode fortfahren, Zählwerte zu akkumulieren, ohne
dass der Kondensator entladen und zurückgesetzt wird, zu welchem
Zeitpunkt das Integrierglied abgetastet (oder gelesen) und dann
entladen und zurückgesetzt wird.
Bei dieser Ausführungsform überlappt
die kurze Integrationsperiode zeitlich die lange Integrationsperiode.
In beiden Fällen überträgt das Integrierglied den
abgetasteten Wert als Datenpunkt für eine weitere Verarbeitung.
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3A zeigt
einen Ausdruck einer emittierten Lichtintensität in Abhängigkeit von der Zeit für eine Probe,
die einen Peak 300 mit hoher Intensität und einen Peak 301 mit
niedriger Intensität
enthält. 3B zeigt
das vom Detektor in Abhängigkeit
von der Zeit akkumulierte Signal (Zählwerte), wenn der Detektor
mit abwechselnden langen Perioden (zum Beispiel 988 ms) und kurzen
Perioden (zum Beispiel 10 ms) abgetastet wird, mit einer Lücke (von
zum Beispiel 1 ms) zur Abtastung und zum Zurücksetzen nach jeder Periode.
Wenn der große
Proben-Peak 300 durch
die Nachweisstelle hindurchtritt, wird der Detektor gesättigt, wenn
die lange Integrationszeit verwendet wird, was zu einem abgeschnittenen
Peak 302 führt.
Andererseits führt
die kurze Integrationsperiode dazu, das jeweils eine verarbeitbare
Anzahl von Zählwerten
akkummuliert wird, wie durch den Peak 303 wiedergeben.
Umgekehrt erzeugt, wenn sich der kleine Peak in der Nachweisstelle
befindet, die lange Integrationsperiode verarbeitbare Pegel von
Zählwerten,
wie durch Peaks 304 wiedergegeben, während die kurze Integrationsperiode
im Wesentlichen nicht in der Lage ist, irgendwelche Zählwerte
oberhalb des Hintergrunds zu akkumulieren, wie durch die Mulden 305 wiedergegeben.
Die akkumulierten Signale aus dem Detektor erzeugen zwei Datenspuren,
wie in 3C dargestellt. Nach einer Korrektur
hinsichtlich der Unterschiede der Akkumulationsperiode liefern diese
zwei Spuren zusammen genommen Informationen über sämtliche der Peaks in der Probe.
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Diese
Technik kann verwendet werden, um für eine bedeutende Vergrößerung des
dynamischen Bereichs zu sorgen, die vom Unterschied zwischen der
langen Integrationsperiode und der kurzen Integrationsperiode abhängt. Im
Allgemeinen sind zwei Integrationsperioden ausreichend, um den dynamischen
Bereich einer erfindungsgemäßen Vorrichtung so
zu vergrößern, dass
der gesamte Bereich abgedeckt wird, der benötigt werden könnte, um
getrennte DNA-Fragmente auszuwerten. Im Fall, dass ein sehr hoher
dynamischer Bereich erforderlich ist, kann es wünschenswert sein, drei oder
mehr Integrationsperioden von unterschiedlicher Länge zu verwenden, um
drei oder mehr Datenspuren zu erzeugen, die hinsichtlich des Unterschieds
der Integrationsperiode korrigiert und dann kombiniert werden.
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4 zeigt
eine zweite Ausführungsform
der Erfindung, bei der ein Strahlteiler 401, wie eine Glasplatte
mit oder ohne Antireflexionsbeschichtung 402, Emissionen 403 aus
der Anregungs-/Nachweisstelle 404 in einen Mehrheits- 405 und
Minderheits- 406 Anteil aufteilt. Wie dargestellt, kann
jeder Anteil mit seinem eigenen Detektor 407 quantifiziert
werden. Alternativ kann ein Zerhacker verwendet werden, um Licht
aus den zwei Strahlen abwechselnd zu einem einzigen Detektor durchzulassen.
Indem man die Frequenz, mit welcher der akkumulierte Photonenzählwert vom
Detektor aufgefangen wird, mit der Frequenz verknüpft, mit
welcher der Zerhacker durchlässt,
können
zwei Signale erzeugt werden, die den zwei Teilen des aufgeteilten
Emissionsstrahls entsprechen.
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In
Abhängigkeit
vom Unterschied zwischen den vom Strahlteiler erzeugten Strahlen
ist diese Ausführungsform
der Erfindung imstande, für
Verbesserungen im dynamischen Bereich eines Instruments von etwa
1 bis 2 Größenordnungen
zu sorgen. Eine ebene Glasplatte wird an jeder Oberfläche etwa 4
% des Strahls reflektieren und 92 % Durchlass erlauben; mit einer
Antireflexionsbeschichtung kann dieser Unterschied auf 1 % zu 99
% vergrößert werden.
Ein hochgradig reflektierender Spiegel kann ebenfalls verwendet
werden, der 95 % des Lichts ablenkt und 5 % Durchlass zulässt. In
beiden Fällen
ergibt der Minderheitsstrahl-Detektor
für einen
Nachweis nützliche
Ergebnisse im linearen Bereich, wenn der Mehrheitsstrahl seinen
Detektor sättigt,
und der Mehrheitsstrahl kann im Allgemeinen selbst dann für einen
Nachweis sorgen, wenn der Minderheitsstrahl zu schwach ist.
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Die 5A und
B veranschaulichen eine dritte Ausführungsform der Erfindung, bei
der eine Modulation der Intensität
des Anregungsstrahls verwendet wird, um den dynamischen Bereich
des Instruments zu verbessern. Die Leistung von Halbleiterlasern
kann sehr genau moduliert werden. Zum Beispiel kann eine Phillips
20 mW-Laserdiode über den
Bereich von 1-20 mW sehr schnell moduliert werden, indem man einen üblichen
elektrischen Impulsgenerator verwendet, der die benötigte Modulationstiefe
aufweist, um die elektrischen Strompegel durch die Laserdiode zu
erzeugen, welche die gewünschten
hohen und niedrigen Intensitätspegel
produzieren. Die Ausgangsintensität steht bei diesen Laserdioden über einen
Ausgangsbereich von 0,5 bis 20 mW in linearer Beziehung zum elektrischen
Strom.
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Indem
man die Ausgangsleistung der Laserdiode in einer Rechteckwellenfunktion,
wie in 5A dargestellt, zwischen einem
Anregungsstrahl hoher Intensität
(zum Beispiel 20 mW) und einem Anregungsstrahl niedriger Intensität (zum Beispiel
1 mW) moduliert und das ansprechend auf den Anteil hoher und niedriger
Intensität
des Anregungsstrahls erzeugte emittierte Licht getrennt erfasst
bzw. nachweist, kann man eine 20-fache Verbesserung im dynamischen
Bereich der Vorrichtung erhalten, vorausgesetzt, dass sich die Probe
an der Anregungsstelle im linearen Bereich verhält (d.h. kein Pendeln oder Ausbleichen).
Anstelle der Rechteckwellenfunktion können auch andere Schwingungsfunktionen
verwendet werden, zum Beispiel eine Sinuswelle.
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Eine
getrennte Erfassung des emittierten Lichts, das ansprechend auf
die Anteile des Anregungsstrahls mit hoher und niedriger Intensität erzeugt
wird, um zwei Datenspuren zu erzeugen, wie in 5B dargestellt,
kann unter Verwendung von zwei Detektoren für jede Anregungs-/Nachweisstelle
erreicht werden, oder sie kann unter Verwendung eines einzigen Detektors
erreicht werden, wobei das akkumulierte Signal vom Detektor auf
synchrone Weise mit der Frequenz der Rechteckwellenmodulation des Anregungsstrahls
aufgefangen wird.
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Die
Vorrichtung der Erfindung kann ein beliebiges der mehreren Mittel
zur Vergrößerung des
dynamischen Bereichs der Vorrichtung einschließen, oder sie kann mehr als
eines dieser mehreren Mittel in Kombination einschließen. Indem
man alle drei Mittel in einer einzigen Vorrichtung kombiniert, kann man
eine Verbesserung des dynamischen Bereichs in der Größe von vier
bis fünf
Größenordnungen
oder mehr erhalten.
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Zum
Beispiel wird bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung
eine Modulation des Anregungsstrahls mit der Verwendung von langen
und kurzen Integrationsperioden kombiniert, um den dynamischen Bereich
der Vorrichtung zu vergrößern. Vorzugsweise
werden die Perioden mit hoher und niedriger Intensität mit den Zeiträumen von
langen bzw. kurzen Integrationsperioden koordiniert. Wie in 5C dargestellt,
wird so die Laserleistung für
einen Zeitraum t1 auf einen hohen Pegel
P1 (zur Beobachtung von kleinen Peaks am
besten geeignet) in Synchronisation mit einer langen Integrationsperiode
(ebenfalls am besten zur Beobachtung von kleinen Peaks geeignet)
eingestellt. Die Laserleistung wird dann in Synchronisation mit einer
kurzen Integrationsperiode für
einen kurzen Zeitraum t2 auf einen niedrigen
Pegel P2 verringert, um einen Bereich bereitzustellen,
der für
die Beobachtung von großen
Peaks geeignet ist. Der dynamische Bereich in einer solchen Vorrichtung
wird um ein Maß gleich
P1t1/P2t2 vergrößert.
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Eine
Modulation der Eingangsstrahlung zwischen einem Ein-Zustand und
einem Aus-Zustand kann ebenfalls verwendet werden, um den dynamischen
Bereich des Instruments zu vergrößern. Dieser
Ansatz kann mit Instrumenten verwendet werden, die eine einzige
Integrationsperiode aufweisen, wie in 5D dargestellt,
wo die Laserleistung während der
ganzen Integrationsperioden I1 und I3 eingeschaltet ist, jedoch nur während eines
Teils der Integrationsperiode I2. Dieser
Ansatz kann auch in Kombination mit veränderlichen Integrationsperioden
verwendet werden und ist besonders nützlich, wenn die kürzeste Integrationsperiode,
die von einer Kombination aus Detektor und Integrationsglied erreicht
werden kann, noch immer zu lang ist, um eine quantitative Messung
eines sehr intensiven Peaks zu erlauben. Indem man die Dauer der
Belichtung mit der Anregungsenergie während der kurzen Integrationsperiode
verkürzt,
wird die Anzahl von Zählwerten,
die während
dieser Periode akkumuliert werden, weiter verringert, womit die
Fähigkeit
der Vorrichtung vergrößert wird,
große
Peaks zu quantifizieren.
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Die
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist besonders gut zur Durchführung einer
Auftrennung und eines Nachweises von Polynucleotid-Fragmenten geeignet,
wenn Fragmente verschiedener Größen in signifikant
unterschiedlicher Menge vorliegen können. Dies kann zum Beispiel
in Assays der Fall sein, in denen eine Kontroll-Nucleinsäure zu einer
Probe gegeben und dann coamplifiziert wird. Ein derartiges Verfahren
ist in den 6A-6B veranschaulicht.
Gesamt-Nucleinsäuren (DNA
oder RNA) 601 werden aus einer bekannten Menge einer Patientenprobe
hergestellt. Das Präparat 601 wird mit
einer Kontroll-Nucleinsäure 602 mit
bekannter Menge gemischt, um eine Reaktionsvormischung 603 zu
schaffen. Die Vormischung 603 wird mit Reagenzien 604 behandelt,
um eine Amplifikationsreaktionsmischung 605 zu schaffen,
wenn die Probe DNA ist, oder es werden, wenn die Probe RNA ist,
Reagenzien 604 vereinigt, um eine vereinigte Reverse Transcriptions-
und Amplifikationsreaktionsmischung 605 zu schaffen. In
beiden Fällen
werden zwei Paare von Amplifikationsprimern A, B und C, D zu der
Amplifikationsmischung 605 gegeben.
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Das
erste Primerpaar (A, B) hybridisiert spezifisch mit dem Sinn- und
Antisense-Strang
einer konservierten Region des Nucleinsäure-Analyten und der Kontroll-Nucleinsäure 602.
Ein Primer des ersten Paars (A, B) ist an seinem 5'-Ende an eine nachweisbare
Markierung, wie einen Fluoreszenzmarker, konjugiert. Das zweite
Primerpaar (C, D) hybridisiert spezifisch mit dem Sinn- und Antisense-Strang
einer zweiten verschiedenen Region des Nucleinsäure-Analyten, die von der konservierten Region
getrennt und verschieden ist und für eine Typisierung durch Sequenzanalyse
geeignet ist. Ein Primer des zweiten Paars (C, D) ist an seinem
5'-Ende an Biotin oder
eine ähnliche
Markierung konjugiert, welche(s) ein physikalisches Einfangen des
Primers ermöglicht.
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Wenn
die Amplifikationsreagenzien 604 zugegeben werden und die
resultierende Reaktionsmischung 605 einem Thermocycling
für die
Amplifikation unterzogen wird, werden drei amplifizierte Reaktionsprodukte
erzeugt, wenn der Nucleinsäure-Analyt in der Patientenprobe
vorliegt. Die zwei amplifizierten Reaktionsprodukte, die aus dem
ersten Primerpaar erwartet werden, sind i) ein Fragment 606 mit
fester Länge
aus einer Region des Analyten, die unter allen Varietäten oder
Untertypen des Pathogens hoch konserviert ist (das "konservierte Fragment"); und ii) ein Fragment 607 mit
einer anderen Länge,
das aus der Kontroll-Nucleinsäure
erzeugt wird (das "Kontroll-Fragment"). Diese zwei Fragmente
sind nachweisbar markiert. Das Amplifikationsprodukt des zweiten
Primerpaars erstreckt sich über
eine Region hoher Variabilität
oder klinischer Relevanz unter Varietäten oder Subtypen des Pathogens
(das "Sequenzierungs-Fragment"). Dieses Fragment 608 ist
im Allgemeinen länger
als die anderen beiden und ist mit Biotin oder einer ähnlichen
Markierung markiert, welche(s) das physikalische Einfangen des Sequenzierungs-Fragments
ermöglicht.
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Die
Quantifizierung wird durchgeführt,
indem man einen Teil der Reaktionsmischung in eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung lädt
und ein elektrisches Feld anlegt, um die amplifizierten Fragmente
gemäß ihrer
Größe aufzutrennen.
Die Peaks 609, 610, die dem konservierten und
dem Kontroll-Fragment 606, 607 entsprechen,
werden durch Messen der Fläche
unter jedem Peak des Ausgangssignals quantifiziert (6B).
Da das Kontroll-Fragment in bekannter Menge zugegeben wird, kann
die Menge der Nucleinsäure
in der ursprünglichen
Patientenprobe durch Extrapolation berechnet werden. Das Sequenzierungs-Fragment
wird in diesem Schritt nicht nachgewiesen, sondern wird stattdessen
als Ausgangspunkt für
einen anschließenden Sequenzierungsschritt
für eine
qualitative Auswertung der Natur der Nucleinsäure in der Probe verwendet.
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Jede
Vorrichtungskonfiguration innerhalb des Bereichs der vorliegenden
Erfindung kann eine unterschiedliche Beziehung zwischen der Menge
an vorhandenem Polynucleotid und der Fluoreszensintensität darstellen,
die über
den breiten dynamischen Bereich gemessen wird, der von Interesse
sein kann. Zum Beispiel kann für
eine Vorrichtung in einer Konfiguration eine 100-fache Vergrößerung der
Probe zu einer 100-fachen Vergrößerung des
Signals und in einer anderen Konfiguration nur zur einer 10-fachen Vergrößerung des
Signals führen.
Somit wird jede Vorrichtungskonfiguration zu Beginn kalibriert,
um diese Beziehung für
die Vorrichtung festzulegen, indem Verdünnungsserien einer Standardprobe
mit bekannter Konzentration ausgewertet werden. Diese Kalibrierung
kann in einem zusammen mit der Vorrichtung bereitgestellten Datenverarbeitungssystem enthalten
sein oder kann vom Benutzer durchgeführt werden.