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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die genetische Modifikation von Pflanzen.
Es wird insbesondere die Kontrolle der Genintegration und -expression
in Pflanzen bereitgestellt.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Genetische
Modifikationstechniken erlauben es, exogene Nucleotidsequenzen in
das Genom eines Organismus zu insertieren. Für die genetische Modifikation
von Pflanzen wurde eine Reihe von Verfahren beschrieben. Alle diese
Verfahren basieren auf der Einführung
einer fremden DNA in die Pflanzenzelle, Isolierung der Zellen, die
die fremde DNA in das Genom integriert enthalten, gefolgt von anschließender Regeneration einer
ganzen Pflanze. Unglücklicherweise
produzieren solche Verfahren transformierte Zellen, die die eingeführte Fremd-DNA
statistisch durch das Genom und oft in vielen Kopien insertiert
haben.
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Die
statistische Insertion von eingeführter DNA in das Genom von
Wirtszellen kann letal sein, wenn die Fremd-DNA in ein kritisch
wichtiges natives Gen insertiert wird und somit dieses mutiert.
Selbst wenn ein statistisches Insertionsereignis das Funktionieren
eines Wirtszellgens nichts verschlechtert, kann die Expression eines
insertierten Fremdgens durch "Positionseffekte", die durch die umgebende
genomische DNA bewirkt werden, beeinflusst werden. In einigen Fällen wird
das Gen in Stellen insertiert, in denen die Positionseffekte stark
genug sind, um die Synthese einer wirksamen Produktmenge aus dem
eingeführten
Gen zu verhindern. In anderen Fällen
hat eine Überproduktion
des Genproduktes nachteilige Effekte auf die Zellen.
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Eine
Transgenexpression wird typischerweise durch die Sequenzen, einschließlich Promotoren
und Enhancer, die physikalisch mit dem Transgen verbunden sind,
gesteuert. Derzeit ist es nicht möglich, die Struktur von Transgenen
genau zu modulieren, sobald sie in Pflanzenzellen eingeführt wurden.
In vielen Anwendungen der Transgentechnologie wäre es wünschenswert, das Transgen in
einer Form einzuführen
und dann fähig zu
sein, das Transgen in definierter Art zu modifizieren. Durch dieses
Mittel könnten
Transgene aktiviert oder inaktiviert werden, wenn die Sequenzen,
die eine Transgenexpression kontrollieren, verändert werden können, indem
entweder Sequenzen, die im ursprünglichen
Transgen vorhanden sind, entfernt werden, oder in dem zusätzliche
Sequenzen in das Transgen insertiert werden.
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Für höhere Eukaryoten
ist die homologe Rekombination ein essentielles Ereignis, das an
Prozessen, wie DNA-Reparatur und Chromatidaustausch während der
Mitose und Meiose beteiligt ist. Eine Rekombination hängt von
zwei in hohem Maße
homologen ausgedehnten Sequenzen und mehreren Hilfsproteinen ab. Eine
Strangtrennung kann an einem beliebigen Punkt zwischen Homologieregionen
erfolgen, obgleich besondere Sequenzen die Effizienz beeinflussen
können.
Diese Prozesse können
für eine
gezielte Integration von Transgenen in das Genom bestimmter Zelltypen
ausgenutzt werden.
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Selbst
mit den Fortschritten bei der genetischen Modifikation höherer Pflanzen
blieben die Hauptprobleme, die mit den herkömmlichen Gentransformationstechniken
verbunden sind, was die oben diskutierten Probleme bezüglich variabler
Expressionslevel infolge chromosomaler Positionseffekte und Kopienzahlvariation
transferierter Gene angeht, im Wesentlichen ungelöst. Aus
diesen Gründen
werden effiziente Verfahren zum Targeting und zur Kontrolle der
Insertion von Nucleotidsequenzen, die in ein Pflanzengenom integriert werden
sollen, benötigt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
werden Zusammensetzungen und Verfahren für die targetierte Integration
von Nucleotidsequenzen in eine transformierte Pflanze bereitgestellt.
Die Verfahren verwenden Transferkassetten, die von nicht-identischen
Rekombinationsstellen flankiert werden.
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Die
Verfahren finden beim Targeting der Integration von Nucleotidsequenzen
von Interesse an eine spezifische chromosomale Stelle, beim Auffinden
optimaler Integrationsstellen in einem Pflanzengenom, einem Vergleichen
der Promotoraktivität
in transformierten Pflanzen, der Entwicklung chromosomaler Neuordnungen
und anderer genetischer Manipulation von Pflanzen Verwendung.
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Es
werden auch transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die entsprechende
nicht-identische
Rekombinationsstellen enthalten, bereitgestellt.
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Dementsprechend
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Targeting der Insertion einer
Nucleotidsequenz von Interesse zu einer spezifischen chromosomalen
Stelle innerhalb eines Genoms einer Pflanzenzelle bereit, umfassend:
- (a) Einführen
einer Transferkassette, die die Nucleotidsequenz von Interesse flankiert
von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst,
in die Pflanzenzelle, deren Genom eine Targetstelle flankiert von
nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst; und
- (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination
an den nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Anlegen bevorzugter Integrationsstellen
innerhalb eines Genoms einer Pflanzenzelle bereit, umfassend Einführen in
die Pflanzenzelle eine Targetstelle, die eine Nucleotidsequenz flankiert
von nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst (a) Bestimmen
des Expressionslevels der Nucleotidsequenz, und (b) Selektieren
einer Pflanzenzelle, die die Nucleotidsequenz exprimiert.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Abschätzung einer Promotoraktivität in einer
Pflanzenzelle bereit, umfassend: (a) Einführen in die Pflanzenzelle,
deren Genom eine Targetstelle flankiert von nicht-identischen Rekombinationsstellen
umfasst, einer Transferkassette, die einen Promotor funktionell
an eine Nucleotidsequenz, die für
ein Markergen codiert, gebunden umfasst, wobei die Transferkassette
von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert
wird; und (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination
an nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Minimierung oder Eliminierung
einer Expression, die aus einer statistischen Integration von DNA-Sequenzen
in das Genom einer Pflanzenzelle resultiert, bereit, umfassend:
(a) Einführen
einer Nucleotidsequenz, die eine Targetstelle umfast, welche zwei
nicht-identische Rekombinationsstellen umfasst, in das Genom einer
Pflanzenzelle, wobei die Targetstelle stromabwärts eines Promotors, fusioniert
an eine ATG-Translationsstartsequenz,
positioniert ist; (b) Einführen
einer Transferkassette, die eine Nucleotidsequenz von Interesse,
flankiert von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen, umfasst,
wobei die ATG-Translationsstartsequenz der Nucleotidsequenz von
Interesse durch eine der entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen
der Targetstelle ersetzt wurde, und zwar derart, dass nach erfolgreichem
Targeting die Nucleotidsequenz von Interesse im korrekten Leseraster
positioniert ist, um eine translationale Fusion zwischen der ATG-Translationsstartsequenz
und der Nucleotidsequenz von Interesse zu bilden; und (c) Bereitstellen
einer Rekombinase, die eine Rekombination an die nicht-identischen
Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zum direkten Selektieren transformierter
Pflanzenzellen bereit, umfassend (a) Einführen in Pflanzenzellgenome
einer Transferkassette, wobei die Pflanzenzellgenome eine Targetstelle
umfassen, welche einen Promotor funktionell an eine Nucleotidsequenz,
welche eine erste nicht-identische Rekombinationsstelle, eine Nucleotidsequenz
von Interesse und eine zweite nicht-identische Rekombinationsstelle
umfasst, gebunden, umfasst, und wobei die Transferkassette eine
Nucleotidsequenz, welche für
ein selektierbares Markergen, nicht-funktionell an einen Promotor
gebunden, codiert, umfasst, wobei die Transferkassette von der ersten
und zweiten nicht-identischen Rekombinationsstelle flankiert ist,
und (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die einer Rekombination
an den nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt, und
Wachsenlassen der Pflanzenzelle auf einem geeigneten selektiven
Agens, um Zellen zu gewinnen, die den selektierbaren Marker exprimieren.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Reduzierung der Integrationskomplexität von Transgenen in
einem Pflanzenzellgenom bereit, umfassend (a) Einführen einer
Transferkassette, die von nicht-identischen Rekombinationsstellen
flankiert ist, in die Pflanzenzelle, wobei die Transferkassette
eine Nucleotidsequenz von Interesse umfasst, das Pflanzenzellgenom
eine Targetstelle umfasst, welche entsprechende nicht-identische
Rekombinationsstellen umfasst; (b) Bereitstellen einer Rekombinase,
die eine Rekombination an den nicht-identischen Rekombinationsstellen
erkennt und durchführt,
und (c) Selektieren von Pflanzenzellen mit einfachen Integrationsmustern
in ihrem Genom.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Kombinieren
mehrerer Transferkassetten an einem Ort in einem Genom einer Pflanzenzelle
bereit, umfassend (a) Einführen
einer Transferkassette, die wenigstens drei nicht-identische Rekombinationsstellen
umfasst, in das Genom einer Pflanzenzelle, wobei wenigstens zwei
der nicht-identischen Rekombinationsstellen, hierin als die erste
und zweite Retargetingstelle bezeichnet, in naher Nachbarschaft zueinander
sind; (b) Einführen
einer zweiten Transferkassette, die von zwei nicht-identischen Rekombinationsstellen
flankiert ist, welche den ersten Retargetingstellen der ersten Transferkassette
entsprechen, in das Genom der Pflanzenzelle; und (c) Bereitstellen
einer Rekombinase, die eine Rekombination an der ersten Retargetingstelle
erkennt und durchführt.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Kombinieren mehrerer Transferkassetten
an einem Ort in einem Genom einer Pflanzenzelle bereit, wobei das
Verfahren umfasst: (a) Einführen
einer Targetstelle, die wenigstens eine erste und eine zweite nicht-identische
Rekombinationsstelle umfasst, in die Pflanzenzelle; (b) Einführen einer
ersten Transferkassette, die in der folgenden Reihenfolge wenigstens
die erste, eine dritte und die zweite nicht-identische Rekombinationsstelle
umfasst, in die Pflanzenzelle, wobei die erste und die dritte nicht-identische
Rekombinationsstelle der ersten Transferkassette eine erste Nucleotidsequenz
von Interesse flankieren; (c) Bereitstellen einer ersten Rekombinase,
die eine Rekombination an der ersten und der zweiten nicht-identischen
Rekombinationsstelle erkennt und durchführt; (d) Einführen einer
zweiten Transferkassette, die wenigstens die zweite und die dritte
nicht-identische Rekombinationsstelle umfasst, in die Pflanzenzelle, wobei
die zweite und die dritte nicht-identische
Rekombinationsstelle der zweiten Transferkassette eine zweite Nucleotidsequenz
von Interesse flankieren; und (e) Bereitstellen einer zweiten Rekombinase,
die eine Rekombination an der zweiten und der dritten nicht-identischen
Rekombinationsstelle erkennt und durchführt.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Entfernung einer Nucleotidsequenz
von Interesse, die in das Genom einer Pflanzenzelle eingeführt wurde,
bereit, umfassend: (a) Bereitstellen der Pflanzenzelle, in der die
Nucleotidsequenz von Interesse von nicht-identischen Rekombinationsstellen
flankiert wird; (b) Einführen eines
chimären
RNA-DNA-Oligonucleotidmoleküls,
das fähig
ist, eine Nucleotidumwandlung in einer der nicht-identischen Rekombinationsstellen
der Transferkassette zu erkennen und durchzuführen, um so zwei identische
Rekombinationsstellen zu schaffen, in die Pflanzenzelle; und (c)
Bereitstellen einer Rekombinase, die ein Ausschneiden der Sequenzen
zwischen zwei identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine Dikotylen- oder Monokotylen-Pflanzenzelle
bereit, die stabil in ihr Genom eingebaut hat, entweder: (a) eine
Transferkassette, die eine Nucleotidsequenz von Interesse umfasst,
welche von wenigstens zwei nicht-identischen FRT-Rekombinationsstellen flankiert wird
oder diese umfasst; oder (b) wenigstens eine erste und eine zweite
Transferkassette, wobei: (i) die erste Transferkassette eine erste
Nucleotidsequenz von Interesse flankiert von einer ersten und einer
zweiten Rekombinationsstelle umfasst, wobei die erste und die zweite
Rekombinationsstelle nicht identisch sind; (ii) die zweite Transferkassette
eine zweite Nucleotidsequenz von Interesse flankiert von der zweiten
Rekombinationsstelle und einer dritten Rekombinationsstelle umfasst,
wobei die dritte Rekombinationsstelle mit der ersten und der zweiten
Rekombinationsstelle nicht identisch ist; und (iii) die zweite Re kombinationsstelle
zwischen der ersten und der zweiten Transferkassette so aufgeteilt
ist, dass das Genom der Pflanzenzelle in der folgenden Reihenfolge
die erste Rekombinationsstelle, die erste Nucleotidsequenz von Interesse,
die zweite Rekombinationsstelle, die zweite Nucleotidsequenz von
Interesse und die dritte Rekombinationsstelle umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine Monokotylen-Pflanzenzelle
bereit, die stabil in ihr Genom eine Transferkassette eingebaut
hat, die eine Nucleotidsequenz von Interesse umfasst, welche von
wenigstens zwei nicht-identischen FRT-Rekombinationsstellen oder
zwei nicht-identischen LOX-Rekombinationsstellen flankiert ist oder
diese umfasst, wobei die Pflanzenzelle aus einer Monokotyle stammt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine transformierte Pflanze bereit,
die eine Pflanzenzelle der Erfindung umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch einen transformierten Samen einer
solchen Pflanze bereit.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 liefert
ein Schema zum "gene
stacking" über eine
ortsspezifische Integration unter Verwendung des FLP-Systems.
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2 liefert
ein Konstrukt des repräsentativen
Plasmids PHP10616.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Es
werden Zusammensetzungen und Verfahren für die gerichtete, targetierte
Integration von exogenen Nucleotiden in eine transformierte Pflanze
bereitgestellt. Die Verfahren verwenden neue Rekombinationsstellen
in einem Gentargeting-System, das ein gerichtetes Targeting von
gewünschten
Genen und Nucleotidsequenzen in entsprechende Rekombinationsstellen,
die vorher in das Target-Pflanzengenom eingeführt wurden, erleichtert.
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In
den erfindungsgemäßen Verfahren
wird eine Nucleotidsequenz, die von zwei nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert
wird, in das Genom des Targetorganismus bzw. Zielorganismus eingeführt, was eine
Targetstelle zur Insertion von Nucleotidsequenzen von Interesse
einrichtet. Sobald eine stabile Pflanze oder ein kultiviertes Gewebe
entwickelt ist, wird ein zweites Konstrukt oder eine Nucleotidsequenz
von Interesse, die von entsprechenden Rekombinationsstellen, wie
die, die die Targetstelle flankiert, flankiert wird, in die stabil
transformierte Pflanze oder die stabil transformierten Gewebe in
Gegenwart eines Rekombinaseproteins eingeführt. Dieses Verfahren resultiert
in einem Austausch der Nucleotidsequenzen zwischen den nicht-identischen
Rekombinationsstellen der Targetstelle und der Transferkassette.
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Es
ist anerkannt, dass die transformierte Pflanze mehrere Targetstellen
umfassen kann; d.h., Sätze nicht-identischer
Rekombinationsstellen umfassen kann. Auf diese Weise sind mehrere
Manipulationen der Targetstelle in der transformierten Pflanze verfügbar. Mit
Targetstelle in der transformierten Pflanze ist eine DNA-Sequenz
gemeint, die in das Genom der transformierten Pflanze insertiert
wurde und nicht-identische Rekombinationsstellen umfasst.
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Beispiele
für Rekombinationsstellen
zur Verwendung in der Erfindung sind auf dem Fachgebiet bekannt
und umfassen FRT-Stellen (siehe z.B. Schlake und Bode (1994) Biochemistry
33: 12746–12751;
Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19: 443–448; Paul
D. Sadowski (1995) In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular
Biology Bd. 51, S. 53–91;
Michael M. Cox (1989) In Mobile DNA, Berg und Howe (Herausg.) American
Society of Microbiology, Washington D. C., S. 116–670; Dixon
et al. (1995) 18: 449–458;
Umlauf und Cox (1988) The EMBO Journal 7: 1845–1852; Buchholz et al. (1996)
Nucleic Acids Research 24: 3118–3119;
Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9: 413–421: Rossant und Geagy (1995)
Nat. Med. 1: 592–594; Albert
et al. (1995) The Plant J. 7: 649–659: Bayley et al. (1992)
Plant Mol. Biol. 18: 353–361:
Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223: 369–378; und Dale und Ow (1991)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10558–105620; die alle hier durch
Bezugnahme aufgenommen sind); Lox (Albert et al. (1995) Plant J.
7: 649–659;
Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1706–1710; Stuurman
et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 901–913; Odell et al. (1990) Mol.
Gen. Gevet. 223: 369–378;
Dale et al. (1990) Gene 91: 79–85;
und Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353–361).
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Das
Zwei-Mikron-Plasmid, das in den meisten natürlich vorkommenden Stämmen von
Saccharomyces cerevisiae gefunden wird, codiert für eine ortsspezifische
Rekombinase, die eine Inversion der DNA zwischen zwei invertierten
Wiederholungen begünstigt.
Diese Inversion spielt bei der Plasmidkopienzahl-Amplifikation eine
zentrale Rolle. Das Protein, das FLP-Protein genannt wird, katalysiert ortsspezifische
Rekombinationsereignisse. Die Minimalrekombinationsstelle (FRT,
SEQ ID NO 1) wurde definiert und enthält zwei invertierte 13-Basenpaar (bp)-Wiederholungen,
die einen asymmetrischen 8 bp-Spacer umgeben. Das FLP-Protein spaltet die
Stelle an den Verbindungen der Wiederholungen und des Spacers und
ist über
ein 3'-Phosphat
kovalent an die DNA gebunden.
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Ortsspezifische
Rekombinasen, wie FLP, spalten und religieren DNA an spezifischen
Targetsequenzen, was in einer präzise
definierten Rekombination zwischen zwei identischen Stellen resultiert.
Um zu arbeiten, benötigt
das System die Rekombinationsstellen und die Rekombinase. Es werden
keine Hilfsfaktoren benötigt.
Demnach kann das gesamte System in Pflanzenzellen insertiert werden
und dort arbeiten.
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Es
wurde gezeigt, dass das ortsspezifische Hefe-FLP/FRT-Rekombinationssystem
in Pflanzen funktioniert. Bis dato wurde das System zum Ausschneiden
unerwünschter
DNA verwendet. Siehe Lyznik et al. (1993) Nucleic Acid Res. 21:
969–975.
Im Gegensatz dazu verwendet die vorliegende Erfindung nicht-identische
FRTs für
den Austausch, das Targeting, die Neuordnung, Insertion und Kontrolle
der Expression von Nucleotidsequenzen im Pflanzengenom.
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Zur
Durchführung
der erfindungsgemäßen Verfahren
wird eine transformierte Pflanze, die eine Targetstelle in ihr Genom
integriert enthält,
benötigt.
Die Targetstelle ist dadurch charakterisiert, dass sie von nicht-identischen
Rekombinationsstellen flankiert wird. Außerdem ist eine Targetingkassette
erforderlich, die eine Nucleotidsequenz enthält, die von entsprechenden
nicht-identischen Rekombinationsstellen, wie solche Stellen, die
in der Targetstelle des transformierten Organismus enthalten sind,
flankiert wird. Eine Rekombinase, die die nichtidentischen Rekombinationsstellen
erkennt und eine ortsspezifische Rekombination katalysiert, ist
erforderlich.
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Es
ist bekannt, dass die Rekombinase durch ein beliebiges, auf dem
Fachgebiet bekanntes Mittel, bereitgestellt werden kann. D.h., sie
kann im Organismus oder der Pflanzenzelle bereitgestellt werden,
indem der Organismus mit einer Expressionskassette transformiert
wird, die fähig
ist, die Rekombinase in den Organismus durch transiente Expression
zu exprimieren, oder indem Messenger-RNA (mRNA) für die Rekombinase oder
das Rekombinaseprotein bereitgestellt wird.
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Mit "nicht-identische
Rekombinationsstellen" ist
gemeint, dass die flankierenden Rekombinationsstellen in der Sequenz
nicht identisch sind und nicht rekombinieren werden oder dass eine
Rekombination zwischen den Stellen minimal sein wird. D.h., eine
flankierende Rekombinationsstelle kann eine FRT-Stelle sein, wo
die zweite Rekombinationsstelle eine mutierte FRT-Stelle sein kann.
Die in den Verfahren der Erfindung verwendeten nicht-identischen
Rekombinationsstellen verhindern eine Rekombination zwischen den
zwei flankierenden Rekombinationsstellen und ein Ausschneiden der
darin enthaltenen Nucleotidsequenz oder unterdrücken diese stark. Folglich
ist es anerkannt, dass beliebige geeignete nicht-identische Rekombinationsstellen
in der Erfindung verwendet werden können, einschließlich FRT-
und mutierter FRT-Stellen, FRT- und lox-Stellen, lox- und mutierte
lox-Stellen, wie auch andere Rekombinationsstellen, die auf dem
Fachgebiet bekannt sind.
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Eine
geeignete nicht-identische Rekombinationsstelle impliziert, dass
in Gegenwart von aktiver Rekombinase eine Exzision von Sequenzen
zwischen zwei nicht-identischen Rekombinationsstellen, wenn überhaupt,
nur mit einer Effizienz erfolgt, die beachtlich unter der der durch
Rekombination vermittelten Austauschtargeting-Neuordnung von Nucleotidsequenzen
im Pflanzengenom liegt. Somit umfassen geeignete nicht-identische
Stellen zur Verwendung in der Erfindung solche Stellen, bei denen
die Effizienz einer Rekombination zwischen den Stellen niedrig ist;
beispielsweise bei denen die Effizienz weniger als etwa 30 bis etwa
50%, vorzugsweise weniger als etwa 10 bis etwa 30%, bevorzugter
weniger als etwa 5 bis etwa 10%, ist.
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Wie
oben betont wurde, entsprechen die Rekombinationsstellen in der
Targetingkassette denen in der Targetstelle der transformierten
Pflanze. D.h., wenn die Targetstelle der transformierten Pflanze
flankierende, nicht-identische Rekombinationsstellen von FRT und
einem mutanten FRT enthält,
wird die Targetingkassette dieselben FRT- und mutanten FRT-nicht-identischen Rekombinationsstellen
enthalten.
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Es
wird weiter erkannt, dass die Rekombinase, die in der Erfindung
verwendet wird, von den Rekombinationsstellen in der Targetstelle
der transformierten Pflanze und der Targetingkassette abhängen wird.
D.h., wenn FRT-Stellen verwendet werden, wird die FLP-Rekombi nase
benötigt
werden. Ebenso ist Cre-Rekombinase erforderlich, wenn lox-Stellen
verwendet werden. Wenn die nicht-identischen Rekombinationsstellen
sowohl eine FRT- als auch eine lox-Stelle umfassen, wird sowohl
die FLP- als auch die Cre-Rekombinase in der Pflanzenzelle benötigt werden.
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Die
FLP-Rekombinase ist ein Protein, das eine ortsspezifische Reaktion
katalysiert, die beim Amplifizieren der Kopienzahl des 2-Mikron-Plasmids
von S. cerevisiae während
der DNA-Replikation involviert ist. Das FLP-Protein wurde kloniert
und exprimiert. Siehe z.B. Cox (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80: 4223–4227.
Die FLP-Rekombinase zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
kann die sein, die von der Gattung Saccharomyces stammt. Es kann
bevorzugt sein, die Rekombinase unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter
Kodons für
eine optimale Expression in einer Pflanze von Interesse zu synthetisieren.
Siehe z.B. die US-Patentanmeldung,
Serial-Nr. 08/972 258, eingereicht am 18. November 1997, mit dem
Titel "Novel Nucleic Acid
Sequence Encoding FLP Recombinase".
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Die
Bakteriophagen-Rekombinase Cre katalysiert eine ortsspezifische
Rekombination zwischen zwei lox-Stellen. Die Cre-Rekombinase ist
auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Guo et al. (1997) Nature
389: 40–46;
Abremski et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1509–1514; Chen et al. (1996) Somat.
Cell Mol. Genet. 22: 477–488;
und Shaikh et al. (1977) J. Biol. Chem. 272: 5695–5702. Eine
solche Cre-Sequenz kann auch unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter
Kodons synthetisiert werden.
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Wo
es möglich
ist, können
die in das Pflanzengenom zu insertierende Nucleotidsequenzen für eine verstärkte Expression
in der transformierten Pflanze optimiert werden. Wenn in der Erfindung
Säuger-,
Hefe- oder Bakteriengene verwendet werden, können sie unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter
Kodons zur verbesserten Expression synthetisiert werden. Es ist
anerkannt, dass Dikotylengene zur Expression in Monokotylen auch
unter Verwendung Monokotylen-bevorzugter Kodons synthetisiert werden
können.
Auf dem Fachgebiet sind Verfahren zur Synthese von Pflanzen-bevorzugten
Genen verfügbar.
Siehe z.B. US-Patent Nrn. 5 380 831, 5 436 391, und Murray et al.
(1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498.
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Die
Pflanzen-bevorzugten Kodons können
aus den Kodons bestimmt werden, die häufiger in den Proteinen, die
in der Pflanze von Interesse exprimiert werden, verwendet werden.
Es ist bekannt, dass Monokotylen- oder Dikotylen-bevorzugte Sequenzen
ebenso wie Pflanzen-bevorzugte
Sequenzen für
besondere Pflanzenspezies konstruiert werden können. Siehe z.B. EPA 0359472;
EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88: 3324–3328;
und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498. US-Patent
Nr. 5 380 831; US-Patent Nr. 5 436 391; und dergleichen. Es ist
außerdem
bekannt, dass die gesamte Gensequenz oder ein beliebiger Teil der
Gensequenz optimiert oder synthetisch sein kann. D.h., es können auch
vollständig
optimierte oder partiell optimierte Sequenzen eingesetzt werden.
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Es
ist bekannt, dass zusätzliche
Sequenzmodifikationen eine Genexpression in einem zellulären Wirt verstärken und
in der Erfindung verwendet werden können. Diese umfassen Eliminierung
von Sequenzen, die für
unechte Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellen-Signale,
Transposon-artige Wiederholungen codieren, und andere gut charakterisierte
Sequenzen, die für
eine Genexpression schädlich
sein können.
Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Level eingestellt werden, die
für einen
gegebenen zellulären
Wirt durchschnittlich sind, wie es unter Bezugnahme auf bekannte
Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, errechnet wird. Wenn
es möglich
ist, wird die Sequenz so modifiziert, dass vorausgesagte Haarnadelstrukturen
sekundärer
mRNA vermieden werden.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch neue FLP-Rekombinationstargetstellen
(FRT). Die FRT (SEQ ID NO 1) wurde als Minimalsequenz identifiziert,
die zwei 13-Basenpaar-Wiederholungen,
getrennt durch einen 8-Basen-Spacer, wie folgt umfasst:
5'-GAAGTTCCTATTC[TCTAGAAA]GTATAGGAACTTC3'
worin die Nucleotide
in den Klammern die Spacerregion angeben. Die Nucleotide in der
Spacerregion können durch
eine Kombination von Nucleotiden ersetzt werden, solange die zwei
13-Basen-Wiederholungen durch acht Nucleotide getrennt werden. Es
scheint, dass die tatsächliche
Nucleotidsequenz des Spacers nicht kritisch ist, allerdings können zur
Durchführung
der Erfindung einige Substitutionen von Nucleotiden in der Spacerregion
besser arbeiten als andere.
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Der
Acht-Basenpaar-Spacer ist bei der DNA-DNA-Paarung während des
Strangaustauschs involviert. Die Asymmetrie der Region bestimmt
die Richtung der Stellenanordnung im Rekombinationsereignis, das
anschließend
entweder zur Inversion oder zur Exzision führen wird. Wie oben angegeben
wurde, kann das meiste des Spacer ohne Funktionsverlust mutiert
werden. Siehe z.B. Schlake und Bode (1994) Biochemistry 33: 12746–12751.
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Neue
mutierte FRT-Stellen werden zur Verwendung bei der Durchführung der
erfindungsgemäßen Verfahren
bereitgestellt. Derartige mutierte Stellen können durch Mutagenese auf PCR-Basis
konstruiert werden. Obgleich hier mutierte FRT-Stellen (SEQ ID NOs
2, 3, 4 und 5) bereitgestellt werden, ist es anerkannt, dass andere
mutante FRT-Stellen bei der Durchführung der Erfindung verwendet
werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt nicht die Verwendung eines besonderen
FRT oder einer besonderen Rekombinationsstelle dar, sondern eher,
dass nicht-identische Rekombinationsstellen oder FRT-Stellen für eine targetierte
Insertion und Expression von Nucleotidsequenz in einem Pflanzengenom
verwendet werden können.
So können andere
mutierte FRT-Stellen konstruiert werden und auf der Basis der vorliegenden
Offenbarung verwendet werden.
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Wie
oben diskutiert wurde, führt
ein Zusammenbringen genomischer DNA, die eine Targetstelle mit nicht-identischen
Rekombinationsstellen enthält,
mit einem Vektor, der eine Transferkassette mit entsprechenden nicht-identischen
Rekombinationsstellen enthält,
in Gegenwart der Rekombinase zu einer Rekombination. Die Nucleotidsequenz
der Transferkassette, die sich zwischen den flankierenden Rekombinationsstellen
befindet, wird mit der Nucleotidsequenz der Targetstelle, die sich
zwischen den flankierenden Rekombinationsstellen befindet, ausgetauscht.
Auf diese Weise können
Nucleotidsequenzen von Interesse präzise in das Genom des Wirts
eingebaut werden.
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Es
ist bekannt, dass viele Variationen der Erfindung durchgeführt werden
können.
Beispielsweise können
Targetstellen konstruiert werden, die viele nicht-identische Rekombinationsstellen
haben. Auf diese Weise können
mehrere Gene oder Nucleotidsequenzen an genauen Orten "gestapelt" oder im Pflanzengenom
angeordnet werden. Ebenso können,
sobald eine Targetstelle innerhalb des Genoms angeordnet wurde,
weitere Rekombinationen eingeführt
werden, indem solche Stellen in die Nucleotidsequenz der Transferkassette
eingebaut werden und der Transfer der Stellen zu der Zielsequenz
bzw. Targetsequenz durchgeführt
wird. Sobald eine Targetstelle etabliert ist, ist es somit möglich, anschließend durch
Rekombination Stellen anzufügen
oder Stellen zu verändern.
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Eine
andere Variation beinhaltet die Bereitstellung einer Promotor- oder
Transkriptionsinitiations-Region, die funktionell mit einer Targetstelle
verknüpft
ist, in einem Organismus. Vorzugsweise wird der Promotor 5' zu der ersten Rekombinationsstelle
sein. Durch Transformieren des Organismus mit einer Transferkassette, die
eine codierende Region umfasst, wird eine Expression der codierenden
Region nach Integration der Transferkassette in die Targetstelle
erfolgen. Diese Ausführungsform
sorgt für
ein Verfahren zur Selektion transformierter Zellen, insbesondere
Pflanzenzellen, indem eine selektierbare Markersequenz als codierende
Sequenz bereitgestellt wird.
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Andere
Vorzüge
des erfindungsgemäßen Systems
umfassen die Fähigkeit,
die Komplexität
der Integration von Transgenen oder transformierte DNA in einen
Organismus zu reduzieren, indem Transferkassetten, wie sie oben
diskutiert wurden, verwendet werden, und Organismen mit einfachen
Integrationsmustern selektiert werden. In der gleichen Weise können bevorzugte
Stellen innerhalb des Genoms identifiziert werden, indem mehrere
Transformationsereignisse verglichen werden. Eine bevorzugte Stelle
innerhalb des Genoms umfasst eine, die die Expression von essentiellen
Sequenzen nicht unterbricht und für eine adäquate Expression der Transgensequenz
sorgt.
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Die
Verfahren der Erfindung sorgen auch für Mittel, um mehrere Kassetten
an einem Ort innerhalb des Genoms zu kombinieren. Siehe z.B. 1.
Rekombinationsstellen können
an Targetstellen innerhalb des Genoms addiert oder deletiert werden.
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Um
die drei Komponenten des Systems zusammen zu bringen, können beliebige
Mittel, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, in der Erfindung eingesetzt
werden. Beispielsweise kann eine Pflanze stabil transformiert werden,
um die Targetstelle in ihrem Genom zu beherbergen. Die Rekombinase
kann transient exprimiert oder bereitgestellt werden. Alternativ
kann eine Nucleotidsequenz, die fähig ist, die Rekombinase zu
exprimieren, stabil in das Genom der Pflanze integriert werden.
In Gegenwart der entsprechenden Targetstelle und der Rekombinase wird
die Transferkassette, die von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen
flankiert ist, in das Genom der transformierten Pflanze insertiert.
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Alternativ
können
die Komponenten des Systems durch sexuelle Kreuzung transformierter
Pflanzen zusammengebracht werden. In dieser Ausführungsform kann eine transformierte
Pflanze, Elter eins, der eine Targetstelle in seinem Genom integriert
hat, sexuell mit einer zweiten Pflanze, Elter zwei, der genetisch
mit einer Transferkassette, die flankierende nicht-identische Rekombinationsstellen
enthält,
welche denen in Pflanze eins entsprechen, transformiert ist, gekreuzt
werden. Entweder Pflanze eins oder Pflanze zwei enthält in ihrem
Genom eine Nucleotidsequenz, die Rekombinase exprimiert. Die Rekombinase
kann unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren
Promotors stehen.
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Induzierbare
Promotoren umfassen durch Wärme
induzierbare Promotoren, auf Östradiol
reagierende Promotoren, durch Chemikalien induzierbare Promotoren
und dergleichen. Durch ein Pathogen induzierbare Promotoren umfassen
von Pathogenese abgeleitete Proteine (PR-Proteine), die nach Infektion
mit einem Pathogen induziert werden, z.B. PR-Proteine, SAR-Proteine,
beta-1,3-Glucanase, Chitinase, usw. Siehe z.B. Redolfi et al. (1983)
Neth. J. Plant Pathol. 89: 245–254;
Uknes et al. (1992) The Plant Cell 4: 645–656; und Van Loon (1985) Plant
Mol. Virol. 4: 111–116.
Auf diese Weise kann eine Expression von Rekombinase und anschließender Aktivität an den
Rekombinationsstellen kontrolliert werden.
-
Konstitutive
Promotoren zur Expression von Genen in Pflanzen sind auf dem Fachgebiet
bekannt. Solche Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
den 35S-Promotor von Blumenkohl-Mosaikvirus (Depicker et al. (1982)
Mol. Appl. Genet. 1: 561–573;
Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812), Ubiquitin-Promotor (Christensen
et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675–689), Promotoren aus Genen,
wie Ribulosebiphosphatcarboxylase (De Almeida et al. (1989) Mol.
Gen. Genet. 218: 78–98),
Actin (McElroy et al. (1990) Plant J. 2: 163–171), Histon, DnaJ (Baszczynski
et al. (1997) Maydica 42: 189–201),
und dergleichen.
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Die
Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung finden beim Targeting
die Integration von transferierten Nucleotidsequenzen zu einer spezifischen
chromosomalen Stelle Verwendung. Die Nucleotidsequenz kann für eine beliebige
Nucleotidsequenz von Interesse codieren. Besondere Gene von Interesse
umfassen die, die ein einfach analysierbares, funktionelles Merkmal
für die
Wirtszelle und/oder den Organismus bereitstellen, z.B. Markergene,
wie auch andere Gene, die den Phänotyp
der Empfängerzelle
verändern,
und dergleichen. Somit können
Gene, die das Pflanzenwachstum, die Größe, die Suszeptibilität für eine Krankheit, für Insekten,
den Nährwert
und dergleichen beeinflussen, in der Erfindung ausgenützt werden.
Die Nucleotidsequenz kann auch für
eine "Antisense"-Sequenz codieren,
um die Genexpression abzustellen oder zu modifizieren.
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Es
wird erkannt, dass die Nucleotidsequenzen in einer funktionellen
Expressionseinheit oder -kassette verwendet werden können. Mit
funktioneller Expressionseinheit oder -kassette ist die interessierende
Nucleotidsequenz mit einem funktionellen Promotor, und in den meisten Fällen einer
Terminationsregion, gemeint. Es gibt verschiedene Wege, um die funktionelle
Expressionseinheit bei der Durchführung der Erfindung zu erreichen.
In einer Ausführungsform
der Erfindung wird die Nucleinsäure
von Interesse in das Genom als funktionelle Expressionseinheit transferiert
oder insertiert. Alternativ kann die Nucleotidsequenz in eine Stelle
innerhalb des Genoms, welche 3' zu
einer Promotorregion ist, insertiert werden. In diesem zuletzt genannten
Fall ist die Insertion der codierenden Sequenz 3' zu der Promotorregion so, dass eine
funktionelle Expressionseinheit nach Integration erreicht wird.
Aus Gründen
der Zweckdienlichkeit können
zur Expression in Pflanzen die Nucleinsäure, die für die Zielstellen und die Transferkassetten,
die die Nucleotidsequenzen von Interesse enthalten, codiert, innerhalb
der Expressionskassetten enthalten sein. Die Expressionskassette
wird eine transkriptionale Initiationsregion oder einen Promotor
funktionell mit der Nucleinsäure,
welche für
das Peptid von Interesse codiert, verknüpft, umfassen. Eine solche
Expressionkassette ist mit einer Vielzahl von Restriktionsstellen
für die
Insertion des Gens oder der Gene von Interesse ausgestattet, um
unter der Transkriptionsregulation der regulatorischen Regionen
zu stehen.
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Die
transkriptionale Initiationsregion, der Promotor, kann für den Wirt
nativ oder homolog oder fremd oder heterolog sein oder könnte die
natürliche
Sequenz oder eine synthetische Sequenz sein. Mit fremd ist gemeint,
dass die transkriptionale Initiationsregion im Wildtyp-Wirt, in den die
transkriptionale Initiationsregion eingeführt wird, nicht gefunden wird.
Bezüglich
der codierenden Sequenz von Interesse kann entweder ein nativer
oder heterologer Promotor verwendet werden.
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Die
Transkriptionskassette wird in 5'→3'-Richtung der Transkription
eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion, eine DNA-Sequenz
von Interesse und eine Transkriptions- und Translations-Terminierungsregion,
die in Pflanzen funktionell ist, einschließen. Die Terminierungsreaktion
kann mit der Transkriptionsinitiierungs-Region nativ sein, kann
mit der DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann aus einer
anderen Quelle stammen. Zweckdienliche Terminationsregionen sind
aus dem Kartoffelproteinase-Inhibitor (PinII)-Gen oder aus dem Ti-Plasmid
von A. tumifaciens verfügbar,
z.B. die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminationsregionen.
Siehe auch Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141–144; Proudfoot (1991)
Cell 64: 671–674;
Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141–149; Morgen et al. (1990)
Plant Cell 2: 1261–1272;
Munroe et al. (1990) Gene 91: 151–158; Ballas et al. (1989)
Nucleic Acids Res. 17: 7891–7903; Joshi
et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627–9639.
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Die
Expressionskassetten können
zusätzlich
5'-Leadersequenzen
im Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Solche Leadersequenzen
können
zur Verstärkung
der Translation wirken. Translations-Leader sind auf dem Fachgebiet
bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, z.B. EMCV-Leader (Encephalomyokarditis 5'-nicht-codierende
Region) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., und Moss, B. (1989) PNAS
USA, 86: 6126–6130); Potyvirus-Leader,
z.B. TEV-Leader
(Tabakätzvirus)
(Allison et al. (1986); MDMV-Leader (Maisverzwergungs-Mosaikvirus);
Virology, 154: 9–20)
und humanes Immunglobulin-schwere Kette-bindendes Protein (BiP),
(Macejak, D. G. und P. Sarnow (1991) Nature, 353: 90–94); nicht-translatierter
Leader aus der Hüllprotein-mRNA
von Alfalfa-Mosaikvirus (AMV RNA 4) (Jobling, S. A., und Gehrke,
L., (1987) Nature, 325: 622–625);
Tabak-Mosaikvirus-Leader (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology
of RNA, Seiten 237–256, Gallie
et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 3257–3273); und Mais-chlorotische
Fleckungsvirus-Leader (MCMV) (Lommel, S. A. et al. (1991) Virology,
81: 382–385).
Siehe auch Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology, 84: 965–968. Andere
Verfahren, von denen bekannt ist, dass sie die Translation verstärken, können auch
verwendet werden, z.B. Introns und dergleichen.
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Die
Expressionskassetten können
ein oder mehr als ein Gen oder eine oder mehr als eine Nucleinsäuresequenz
enthalten, das/die übertragen
und in der transformierten Pflanze exprimiert werden soll/sollen.
Auf diese Weise wird jede Nucleinsäuresequenz funktionell an regulatorische
5'- und 3'-Sequenzen gebunden.
Alternativ können
mehrere Expressionkassetten bereitgestellt werden.
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Im
Allgemeinen wird die Expressionskassette ein selektierbares Markergen
für die
Selektion transformierter Zellen umfassen. Für die Selektion transformierter
Zellen oder Gewebe werden selektierbare Markergene verwendet.
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Siehe
allgemein G. T. Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech., 3: 506–511; Christopherson
et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6314–6318; Yao
et al. (1992) Cell, 71: 63–72;
W. S. Reznikoff (1992) Mol. Microbiol., 6: 2419–2422; Barkley et al. (1980)
The Operon, S. 177–220;
Hu et al. (1987) Cell, 48: 555–566; Brown
et al. (1987) Cell, 49: 603–612;
Figge et al. (1988) Cell, 52: 713–722; Deuschle et al. (1989)
Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 86: 5400–5404; Fuerst et al. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2549–2553; Deuschle et al. (1990)
Science, 248: 480–483;
M. Gossen (1993) PhD Thesis, Universität Heidelberg; Reines et al.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1917–1921; Labow et al. (1990)
Mol. Cell Bio., 10: 3343–3356;
Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3952–3956; Baim
et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5072–5076; Wyborski
et al. (1991) Nuc. Acids res., 19: 4647–4653; A. Hillenand-Wissmann (1989) Topics
in Mol. and Struc. Biol., 10: 143–162; Degenkolb et al. (1991)
Antimicrob. Agents Chemother., 35: 1591–1595; Kleinschnidt et al.
(1988) Biochemistry, 27: 1094–1104;
Gatz et al. (1992) Plant J., 2: 397–404; A. L. Bonin (1993) PhD
Thesis, Universität
Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:
5547–5551; Oliva
et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother., 36: 913–919; Hlavka
et al. (1985) Handbook of Exp. Pharmacology, 78; Gill et al. (1988)
Nature 334: 721–724.
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können
auch ausgenutzt werden, um optimale Integrationsstellen innerhalb
eines Pflanzengenoms zu finden. Auf diese Weise wird eine Pflanze
mit einer Expressionskassette, die ein selektierbares Markergen
umfasst, transformiert. Die Expressionskassette ist eine Targetstelle,
weil das Markergen von nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert
ist. Transformierte Protoplasten, Gewebe oder ganze Pflanzen können getestet
werden, um die Aktivitätslevel
des insertierten Gens zu bestimmen. Durch Vergleich zel lulärer Aktivitäten des
Gens in unterschiedlichen Insertionsstellen können bevorzugte Integrationsstellen
gefunden werden, in denen das Gen bei hohen oder akzeptablen Leveln
exprimiert wird. Diese Pflanzen können dann mit nachfolgenden
Retargeting-Techniken verwendet werden, um das Markergen durch andere
Gene oder Nucleotidsequenzen von Interesse zu ersetzen. Auf diese
Weise können
viele Gene an der optimalen Stelle zur Expression insertiert werden.
Siehe z.B. 2, die ein Schema zum "gene stacking" darstellt, welches
eine ortsspezifische Integration unter Verwendung des FRT/FLP-Systems
verwendet.
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Es
sind eine Vielzahl von genetischen Manipulationen verfügbar, die
die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwenden, einschließlich z.B.
der Vergleich der Promotoraktivität in einer transformierten Pflanze.
Vor der vorliegenden Erfindung konnte die Promotoraktivität nicht
genau analysiert und verglichen werden, da die chimären Gene
an verschiedenen Stellen innerhalb des Pflanzengenoms insertiert
wurden. Solche chromosomalen Stellen beeinträchtigten die Aktivität. Durch
Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein direkter
Vergleich der Promotoraktivität
in einem definierten chromosomalen Kontext möglich. Unter Verwendung der
Verfahren kann so eine verstärkte
Aktivität
von Genen erreicht werden, indem optimale chromosomale Stellen,
wie auch optimale Promotoren, zur Expression in der Pflanzenzelle
selektiert werden.
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Die
vorliegende Erfindung kann zur Transformation beliebiger Pflanzenspezies
eingesetzt werden; diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf:
Mais (Zea mays), Raps (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), Alfalfa
(Medicago sativa), Reis (Oryza sativa), Roggen (Secale cereale),
Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Sonnenblume (Helianthus
annuus), Weizen (Triticum aestivum) Sojabohne (Glycine max), Tabak
(Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnuss (Arachis
hypogaea), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus),
Manihot (Manihot esculenta), Kaffee (Cofea spp.), Kokosnuss (Cocos nucifera),
Ananas (Ananas comosus), Zitrusbäume
(Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis),
Banane (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feigenbaum (Ficus
casica), Guayave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive
(Olea europaea), Papaya (Carica papaya), Cashew (Anacardium occidentale),
Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta
vulgaris), Hafer, Gerste, Gemüse,
Zierpflanzen und Koniferen.
-
Gemüse umfassen
Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z.B. Lactuca sativa),
grüne Bohnen (Phaseolus
vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Lathyrus spp.)
und Mitglieder der Gattung Cucumis, z.B. Gurke (C. sativus), Kantalupe
(C. cantalupensis) und Zuckermelone (C. melo). Zierpflanzen umfassen
Azaleen (Rhododendron spp.), Hortensien (Macrophylla hydrangea),
Hibiskus (Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa
spp.), Narzissen (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), Nelken
(Dianthus caryophyllus), Weihnachtsstern (Euphorbia pulcherrima)
und Chrysanthemen. Koniferen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können,
umfassen z.B. Kiefern, wie Taedaföhre (Pinus taeda), Karibische
Kiefer (Pinus elliotii), Gelbkiefer (Pinus ponderosa), Drehkiefer
(Pinus contorta) und Montereykiefer (Pinus radiata); Douglasien
(Pseudotsuga menziesii); Westamerikanische Hemlocktanne (Tsuga canadensis);
Sitkafichte (Picea glauca); Redwood (Sequoia sempervirens); echte
Tanne, wie Silbertanne (Abies amabilis) und Balsamtanne (Abies balsamea);
und Zedern, z.B. Rote Westernzedern (Thuja plicata) und Alaska-Gelbzeder (Chamaecyparis
nootkatensis). Vorzugsweise sind Pflanzen der vorliegenden Erfindung
Nutzpflanzen (z.B. Mais, Alfalfa, Sonnenblume, Canola, Sojabohne,
Baumwolle, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Tabak, usw.), bevorzugter Mais-
und Sojabohnenpflanzen, noch bevorzugter Maispflanzen. Es wird erkannt,
dass die Verfahren der Erfindung in einem beliebigen Pflanzensystem
angewendet werden können. Verfahren
zur Transformation sind auf dem Fachgebiet bekannt. Auf diese Weise
können
genetisch modifizierte Pflanzen, Pflanzenzellen, genetisch modifiziertes
Pflanzengewebe, genetisch modifizierter Pflanzensamen und dergleichen
erhalten werden. Transformationsprotokolle können in Abhängigkeit vom Typ der Pflanze
oder der Pflanzenzelle, d.h., Monokotyle oder Dikotyle, der zur
Transformation targetiert wird, variieren. Geeignete Verfahren zum
Transformieren von Pflanzenzellen umfassen Mikroinjektion (Crossway
et al. (1986) Biotechniques 4: 320–334), Elektroporation (Riggs
et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 5602–5606, Agrobacterium-vermittelte
Transformation (Hinchee et al. (1988) Biotechnology, 6: 915–921), direkten
Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J., 3: 2717–2722) und
ballistische Partikelbeschleunigung (siehe z.B. Sanford et al.,
US-Patent 4 945 050; WO91/10725 und McCabe et al. (1988) Biotechnology,
6: 923–926).
Siehe auch Weissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet., 22: 421–477; Sanford
et al. (1987) Particulate Science and Technology, 5: 27–37 (Zwiebel);
Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671–674 (Sojabohne); McCabe et
al. (1988) Bio/Technology, 6: 923–926 (Sojabohne); Datta et
al. (1990) Biotechnology, 8: 736–740 (Reis); Klein et al. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305–4309 (Mais); Klein et al.
(1988) Biotechnology, 6: 559–563
(Mais); WO91/10725 (Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol., 91:
440–444
(Mais); Fromm et al. (1990) Biotechnology, 8: 833–839; und
Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell, 2: 603–618 (Mais); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984)
Nature (London), 311: 763–764;
Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5345–5349 (Liliaceae);
De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,
Herausg. G. P. Chapman et al., S. 197–209. Longman, NY (Pollen);
Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports, 9: 415–418; und
Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet., 84: 560–566 (Whisker-vermittelte
Transformation); D'Halluin
et al. (1992) Plant Cell, 4: 1495–1505 (Elektroporation); Li
et al. (1993) Plant Cell Reports, 12: 250–255, und Christou und Ford
(1995) Annals of Botany, 75: 407–413 (Reis); und Osjoda et
al. (1996) Nature Biotechnology, 14: 745–750 (Mais via Agrobacterium
tumefaciens).
-
Die
Zellen, die transformiert wurden, können nach herkömmlichen
Ansätzen
zu Pflanzen wachsen gelassen werden. Siehe z.B. McCormick et al.
(1986) Plant Cell Reports, 5: 81–84. Diese regenerierten Pflanzen können dann
entweder mit demselben transformierten Stamm oder unterschiedlichen
Stämmen
bestäubt
werden, und der resultierende Hybrid, der das gewünschte phänotypische
Merkmal hat, identifiziert werden. Es können zwei oder mehr Generationen
wachsen gelassen werden, um sicherzustellen, dass das gewünschte phänotypische
Merkmal in stabiler Weise beibehalten und vererbt wird, und dann
können
Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der gewünschte Phänotyp oder
eine andere Eigenschaft erhalten wurde.
-
Es
ist anzuerkennen, dass viele Mittel der Transformation für die vorliegende
Erfindung eingesetzt werden können.
Zum Insertieren der Targetstelle in die transformierte Pflanze kann
allerdings eine Agrobacterium-vermittelte Transformation bevorzugt
sein. Eine Agrobacteriumvermittelte Transformation neigt im Allgemeinen
dazu, eine niedrigere Kopienzahl an transformierter DNA zu insertieren
als dies bei Partikelbeschuss oder einem anderen Transformationsmittel
der Fall ist.
-
Die
folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung angeführt.
-
Experimentelles
-
Die
vorliegende Erfindung stellt im Allgemeinen ein Verfahren zur Verwendung
existierender und neuer FRT-Stellen in einem neuen Gentargeting-System
bereit, welches ein gerichtetes Retargeting von gewünschten
Genen in FRT-Stellen, die vorher in das Genom des Targetorganismus
eingeführt
worden waren, erleichtert. Die neuen FRT-Stellen unterscheiden sich
von den früher
beschriebenen FRT-Stellen in der Sequenz der 8 bp-Spacerregionen
der FRT-Stellen.
Frühere
Publikationen haben auch gezeigt, dass eine Rekombination von Sequenzen
zwischen zwei FRT-Stellen in Gegenwart von FLP-Protein nur effizient
mit zwei identischen FRT-Stellen erfolgt. Siehe z.B. Umlauf und
Cox (1988) Embo J. 7: 1845–1852;
Schlake und Bode (1994) Biochem. 33: 12746–12751. Um die Erfindung zu
verwenden, wird ein Gen oder eine DNA-Sequenz von zwei nicht-identischen
FRT-Stellen flankiert und in das Genom eines Targetorganismus eingeführt. Das eingeschlossene
Gen kann ein selektierbarer Marker sein, wodurch eine Selektion
auf erfolgreich eingeführte Sequenzen
ermöglicht
wird. Eine molekulare Charakterisierung bestätigt die Integration von erwünschten
Sequenzen, einschließlich
vollständiger
FRT-Stellen. Die nachfolgend angegebene Liste zeigt allgemeine Beispiele
für Vektorkonstruktionen,
die bei der Durchführung
der Erfindung nützlich
sind:
- A. FRTa-P1-G1-T1-FRTb
- B. FRTa-P1-G1-T1-FRTa
- C. FRTb-P1-G1-T1-FRTb
- D. P1-FRTa-P1-G1-T1-FRTb
- E. P1-FRTa-P1-G1-T1-FRTa
- F. P1-FRTb-P1-G1-T1-FRTb
- G. P1-ATG::FRTa::G1(keinATG)-T1-P2-G2-T2-FRTb
- H. P1-ATG::FRTa::G1(keinATG)-T1-P2-G2-T2-FRTb-P3-G3-T3
- I. P1-ATG::FRTa::G1(keinATG)-T1-FRTa::G2(keinATG)-T2-FRTb
- J. P1-ATG::FRTa::G1(keinATG)-T1-FRTa::G2(keinATG)-T2-FRTb-P3-G3-T3
- K. P1-FRTa-G1-T1-P2-G2-T2-FRTb
- L. P1-FRTa-G1-T1-P2-G2-T2-FRTb-P3-G3-T3
- M. P1-FRTa-G1-T1-FRTa-G2-T2-FRTb
- N. P1-FRTa-G1-T1-FRTa-G2-T2-FRTb-P3-G3-T3
-
Variationen
davon können
mit anderen Promotoren, Genen, Terminatoren oder FRT-Stellen konstruiert
werden.
-
FRTa
und FRTb sind zwei Beispiele für
nicht-identische FRT-Stellen. P1, P2 und P3 sind unterschiedliche
Promotoren, G1, G2 und G3 sind unterschiedliche Gene, T1, T2 und
T3 sind unterschiedliche Terminatoren. ATG ist das Starttranslationskodon
für das
nachfolgende Gen. Die Bezeichnung keinATG zeigt an, dass dieses
bestimmte Gen frei vom ATG-Translationsstartkodon
ist. Das Symbol :: beinhaltet eine Fusion zwischen benachbarten
Elementen, und wo es zwischen ATG, FRT und einem Gen verwendet wird,
impliziert es, dass die Sequenzen aneinandergefügt sind, um eine "Im-Raster"-Translationsfusion
zu erzeugen, die in einem korrekt exprimierten und funktionellen
Genprodukt resultiert.
-
A
bis F sind bevorzugte Konfigurationen zum Testen neuer FRT-Stellen
auf die Fähigkeit,
Sequenzen zwischen ihnen zu rekombinieren; die gewünschte Situation
ist die, dass, wenn zwei gleiche Stellen verwendet werden, die Rekombination
effizient ist, und dass, wenn zwei unterschiedliche Stellen verwendet
werden, in Gegenwart des FLP-Proteins keine Rekombination zwischen
ihnen stattfindet. G bis J sind bevorzugte Konfigurationen für eine allgemeine
Verwendung bei der Entwicklung von Linien zum Retargeting. Es ist
selbstverständlich,
dass eine beliebige Anzahl von Genen oder andere Kombinationen von
Sequenzen zur Verwendung als Teil dieser Erfindung zusammengefügt werden
können.
K bis N sind mögliche
Konfigurationen, die auch verwendet werden könnten.
-
Sobald
eine stabile Pflanze oder ein kultiviertes Gewebe mit einem der
obigen Konstrukte erhalten wird, wird ein zweites Konstrukt, das
von denselben FRT-Stellen, die zum Flankieren der Sequenzen im ersten Konstrukt
oben verwendet wurden, flankiert ist, in Verbindung mit der Expression
des FLP-Proteins eingeführt. Die
neuen Vektorkonstrukte können
die Folgenden sein, sind aber nicht auf diese beschränkt:
- O. FRTa::G1(keinATG)-T1-FRTb
- P. FRTa::G1(keinATG)-T1-P2-G2-T2-FRTb
- Q. FRTa-G1-T1-FRTb
- R. FRTa-G1-T1-P2-G2-T2-FRTb
-
Das
FLP-Protein kann durch a) Co-Transformieren mit einem Plasmid, das
ein Gen trägt,
das für
FLP codiert; b) Co-Einführen
von FLP-mRNA oder Protein direkt; c) Verwendung einer Linie für die Anfangstransformation,
die FLP entweder konstitutiv oder nach Induktion exprimiert; oder
d) Auswachsenlassen der Pflanzen, die die ursprünglichen targetierten Vektoren
tragen, Kreuzen zu Pflanzen, die aktives FLP-Protein exprimieren,
und Selektieren von Ereignissen in der Nachkommenschaft, geliefert
werden.
-
Als
Arbeitsbeispiel wird die obige Sequenz O in eine Linie eingeführt, die
eine Kopie der Sequenz G stabil in das Genom integriert enthält, und
zwar in Gegenwart von funktionellem FLP-Protein. Zwischen identischen
FRT-Stellen findet eine Rekombination statt, so dass die Sequenz
zwischen FRT-Stellen in O die Sequenz zwischen den entsprechenden
FRT-Stellen von Sequenz G ersetzt, was eine gelenkt targetierte,
reintegrierte neue Sequenz liefert. Das neue Gen in O wird nun von
dem P1-Promotor in G angetrieben. Der Zweck der Entwicklung einiger
der Konstrukte ohne ein ATG-Startkodon an dem Gen ist der, dass,
wenn eine zufällige Integration
auftritt, es eine extrem niedrige Wahrscheinlichkeit der Expression
des eingeführten
Gens gibt, da, damit dies auftritt, das Fragment hinter einer endogenen
Promotorregion und im korrekten Leseraster integriert werden müsste. Dies
wäre extrem
selten, und unsere Daten bis heute haben keine Beispiele für dieses
Ereignis unter Verwendung einer Sequenz, wie z.B. O, worin das enthaltene
Gen ein leicht bewertbares GUS-Gen ist, geliefert. Eine Anforderung
für jedes
Gen, das auf diese Weise konstruiert werden soll (d.h., kein ATG
auf dem Gen, aber mit dem ATG stromaufwärts der FRT-Stelle), ist der
Beweis, dass das Gen eine Fusion der FRT-Sequenz zwischen dem ATG-Kodon und dem
zweiten Kodon des Proteins tolerieren kann. Bis jetzt funktionierte
dies für
eine ziemliche Anzahl, nicht aber für alle Gene; in den letztgenannten
Fällen
könnte
die andere Form des Konstrukts, die das ATG beibehält (z.B.
Q.), verwendet werden. Von all den oben aufgelisteten Sequenzen
wird erwartet, dass sie in diesem Schema funktionieren, einige mit
unterschiedlichen Frequenzen oder Effizienzien als andere.
-
Ein
Problem, dem sich diese Strategie zuwendet, sind Beschränkungen
mit gängigen
Transformationsansätzen,
insbesondere bei Pflanzen, wo eine Abgabe von DNA in Zellen oder
Zellkerne und eine anschließende
Integration in das Genom mehr oder weniger zufällig und nicht vorhersagbar
erfolgt. Dies gilt insbesondere für Verfahren des Partikelbeschusses;
es wurde argumentiert, dass Verfahren auf Agrobacterium-Basis die
Tendenz zeigen, T-DNA-Randflankierte Sequenzen an stärker aktiv
transkribierte Regionen des Genoms abzugeben, dass darüber hinaus
aber das Verfahren noch zufallsbedingt bleibt. Für eine kommerzielle Produktentwicklung
müssen
daher große
Zahlen (Schätzungen > 200) an Ereignissen
erzeugt werden, um ein Ereignis zu identifizieren: a) das bei dem
gewünschten
Level exprimiert; b) bei dem das Genprodukt funktionell und wirksam
ist; c) das eine einfache Integrationskomplexität hat, um eine Züchtung zu
erleichtern; d) das keine externen Sequenzen enthält, die
mögliche
regulatorische Probleme aufwerfen; e) das über Generationen Stabilität bei der
Expression aufrecht erhält;
f) am wichtigsten, das keinen negativen Einfluss auf die agonomischen
Leistungscharakteristika hat, wenn es während eines Züchtungsprogramms
durchgeführt
wird, das eine Introgression des Merkmals in verschiedene genetische
Hintergründe
involviert. Die Ressourcenausnutzung ist sehr groß, und so
wären Schemata,
die den Ressourcenbedarf deutlich verringern, für eine Produktion größerer Zahlen
gewünschter
Endprodukte äußerst günstig.
-
Beispiel 1. Schaffung
neuer nicht-identischer FRT-Stellen
-
DNA-Fragmente,
die neue FRT-Sequenzen enthalten, wurden entweder durch Synthese,
Annealing und Ligieren komplementärer Oligonucleotide oder durch
Schaffung von Primern zur PCR-Amplifikation (Mullis und Faloona,
1987) eines DNA-Produkts, das die neue FRT-Sequenz nahe dem 5'-Ende des PCR-Produkts enthält, konstruiert.
Das neu konstruierte FRT-Produkt
umfasst flankierende Restriktionsstellen, die zur Klonierung in
Pflanzenexpressionseinheiten einsetzbar sind. Im Allgemeinen wird
das 5'-Ende durch
eine NheI-Stelle und eine terminale NcoI-Stelle flankiert. Die NcoI-Stelle
enthält
die Basen ATG, die vorteilhafterweise in neu entwickelten Vektorkonstrukten
als Erkennungssequenz zur Initiierung eines offenen Leserasters
verwendet werden. In Konstrukten auf Sequenzbasis, die keinATG/FRT
genannt werden, wird die NheI-Stelle zur Klonierung verwendet; dadurch
wird das stromaufwärts
gelegen ATG im Verfahren eliminiert. Am 3'-Ende der FRT-Sequenz ist eine Restriktionsstelle
enthalten, die eine spezifische Identifizierung der einzelnen Spacersequenze
ermöglicht.
Als spezifische Beispiele werden genannt: die Wildtyp-FRT-Stelle
(hier FRT1 genannt) wird mit einer flankierenden BglII-Stelle kloniert,
die FRT5-Stelle (Spacer TTCAAAAG) hat eine ScaI-Stelle, die FRT6-Stelle
(Spacer TTCAAAAA) hat eine AatII-Stelle und die FRT7-Stelle (Spacer
TTCAATAA) hat eine SpeI-Stelle. Die äußerste flankierende Restriktionsstelle
ist eine XhoI-Stelle,
und diese wird verwendet, um ein Gen von Interesse in das offene
Leseraster zu klonieren.
-
Nachfolgend
werden die Strukturen und Sequenzen der FRT-Stellen, wie sie geplant
und/oder im erfindungsgemäßen Beispiel
verwendet wurden, gezeigt, wobei die Positionen der Restriktionsstellen,
Wiederholungen und Spacerregionen angegeben sind.
- 1) Wiederholung 1
- 2) Wiederholung 2
- 3) Invertierte Wiederholung
-
Beispiel 2. Schaffung
von Pflanzentransformationsvektoren, die neue nicht-identische FRT-Stellen
enthalten.
-
Auf
der Basis des oben beschriebenen Konzepts von FRT-Stellen wurden
PCR- oder Standardmutagenese-Protokolle verwendet, um eine XhoI-Stelle
zu schaffen, die mit dem Start einer Gensequenz überlappt, welche zur Klonierung
stromabwärts
der FRT-Stelle verwendet werden soll; dadurch wird das ATG-Startkodon in
GTG umgewandelt. Eine Ligation einer FRT mit der mutierten Gensequenz
an XhoI erzeugt ein neues offenes Leseraster, das 5' zu der FRT beginnt.
Eine zweite FRT-Sequenz kann stromabwärts des Terminators kloniert
werden, wobei eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich PCR
oder Ligation, verwendet werden. Die FRT/Gen/Terminator/FRT-Einheit
kann dann verwendet werden, um Target- oder Substratkonstrukte herzustellen.
-
Targets
werden geschaffen, indem ein Promotor an der NcoI-Stelle stromaufwärts der
ersten FRT insertiert wird. Dies hält ein vollständiges offenes
Leseraster für
die FRT/Gen-Fusion
aufrecht. Diese Targetkonstrukte sind zur Verwendung in Transformationsexperimenten,
um erwünschte "Targetlinien" zu schaffen. Substratvektoren
werden durch Klonierung mit der NheI-Stelle unter Verkürzung des
Startkodons der FRT/Gen-Einheit konstruiert, wodurch das geeignete
offene Leseraster eliminiert wird. Diese Substratvektoren werden
in Experimenten eingesetzt, die so konzipiert sind, dass sie ein
neues Gen, das durch FRT-Stellen flankiert wird, in die entsprechenden
FRT-Stellen, die vorher in die Targetlinien eingeführt wurden,
retargetieren. Um Mehrfach-Gen-Kassetten zu schaffen, werden in
jedem Fall zusätzliche
Promotor/Gen/Terminator-Einheiten zwischen dem Terminator und der
zweiten FRT in Target- oder Substratmoleküle insertiert.
-
Beispiel 3. Beweis der
Funktionalität
neuer FRT-Stellen und des Erfordernisses für zwei identische Stellen für eine effiziente
Rekombination von DNA-Sequenzen, die zwischen zwei FRT-Stellen positioniert
sind.
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Plasmide,
die zwei identische oder zwei unterschiedliche FRT-Sequenzen enthalten,
wurden auf Effizienz der Rekombination von Sequenzen zwischen den
FRT-Stellen durch Transformation in 294-FLP, einer Variante des
E. coli-Stamms MM294, mit FLP-Rekombinase,
integriert in den lacZ-Lokus (Buchholz et al., 1996), untersucht.
Die Stämme
wurden über
Nacht bei 37°C
unter Schütteln
wachsen gelassen, was eine konstitutive Expression von FLP-Rekombinase
in den Kulturen ermöglicht.
Die Plasmid-DNA wurde unter Anwendung von Standardverfahren isoliert
und mit Restriktionsenzymen verdaut, die neue Restriktionsfragmente nach
FLP-vermittelter Rekombination schaffen. Das Ausmaß einer
Rekombination zwischen FRT-Stellen wurde abgeschätzt, indem Bandenmuster auf
einem Agarosegel untersucht wurden. Tabelle 1 fasst Daten aus der Genanalyse
zusammen.
-
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Die
Resultate aus diesen Untersuchungen zeigen, dass eine Exzision von
Sequenzen zwischen identischen FRT-Stellen im Allgemeinen mit hoher
Effizienz erfolgt (FRT5-Stelle, SEQ ID NO 3, schien insgesamt weniger
effizient zu sein als FRT1-Stelle, SEQ ID NO 2 oder die neue FRT6-Stelle,
SEQ ID NO 4, und die neue FRT7-Stelle, SEQ ID NO 5). Von Bedeutung
ist, dass eine Rekombination mit zwei unterschiedlichen FRT-Stellen
fehlte oder wenigstens unter den Bedingungen dieses Assays für alle Kombinationen,
außer
FRT6, SEQ ID NO 4 und FRT7, SEQ ID NO 5, wo ein geringer Rekombinationsgrad
festgestellt wurde, zumindest nicht nachweisbar war. Diese Daten
lieferten eine starke Unterstützung
für die
potentielle Verwendbarkeit von nicht-identischen FRT-Stellen bei
der Entwicklung eines gesteuerten Gen-Integrationssystems. Ein zu bemerkender
Punkt ist der, dass, da eine Rekombination von Sequenzen zwischen
zwei identischen FRT-Stellen mit unterschiedlichen Effizienzien
in Abhängigkeit
von der spezifischen verwendeten FRT-Stelle (z.B. FRT5, SEQ ID NO
3, im vorliegenden Experiment) auftreten kann, die Entwicklung von
Konstrukten für
eine gelenkte targetierte Integration eine wohlüberlegte Selektion von Paaren
der FRT-Stellen erfordern kann, um so die gewünschte Rekombinationseffizienz
zu optimieren oder eine unerwünschte
Rekombination zu vermeiden.
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Beispiel 4. Einführung von
DNA-Sequenzen, die neue nicht-identische FRT-Stellen enthalten, in Pflanzenzellen,
Erzeugung und Gewinnung von stabilen transgenen Ereignissen ("Targetlinien"), Konservierung
von "Targetlinien" und Regeneration
von Pflanzen.
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Es
wurde eine Reihe stabiler transgener Ereignisse produziert, die
FRT-Targetstellen tragen. Diese Targetlinien wurden erzeugt, indem
eines einer Reihe von Konstrukten, einschließlich z.B. PHP9643, PHP10616,
PHP11407, PHP11410, PHP11457, PHP11599, PHP11893 oder PHP14220 (siehe
Tabelle 2), in Maiszellen eingeführt
wurde, und zwar entwe der durch Partikelbeschuss, wie bei Register
et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25: 951–961 beschrieben wurde, oder
via Agrobacterium-Co-Kultur, wie es bei Heath et al. (1997) Mol.
Plant-Microbe Interact.
10: 22–227;
Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271–282 und Ishida et al. (1996)
Nat. Biotech. 14: 745–750,
und US-Patentanmeldung Serial-Nr. 60/045 121 für "Agrobacterium Mediated Sorghum Transformation", eingereicht am
30. April 1997, beschrieben ist. Alle Vektoren wurden unter Verwendung
von Standardtechniken der Molekularbiologie konstruiert, wie sie
z.B. in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor,
N.Y.) beschrieben sind. Die folgende Tabelle 2 beschreibt die Komponenten
in jedem der Vektoren, die zur Schaffung eines neuen Satzes an Targetlinien
eingesetzt wurden. Die Kombinationsstrategie war wie folgt. Die
erste Expressionseinheit enthält
in jedem Fall das 2,0 kb PstI-Fragment des Mais-Ubiquitin-Promotors
Ubi-1 (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675–689). Stromabwärts zum
Ubiquitin-Promotor wurden variierende FRT-Sequenzen insertiert,
wobei NcoI oder andere Stellen verwendet wurden, die das ATG-Startkodon
beibehielten. PHP10616 hat die codierende Sequenz mo-PAT (vorläufige US-Patentanmeldung,
Serial Nr. 60/035 560, "Methods
for Improving Transformation Efficiency", eingereicht am 14. Januar 1997) im
Raster fusioniert an der XhoI-Stelle, die FRT1 (siehe oben, SEQ
ID NO 2) flankiert. PHP11407 und PHP11893 haben GFPm-C3 (PCT/US97/07688, eingereicht
am 1. Mai 1997, aus der vorläufigen
Anmeldung 60/016345, eingereicht am 1. Mai 1996), das das zweite
Intron aus Kartoffel-ST-LS1 enthält
(Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220: 245–250) im
Raster fusioniert an der XhoI-Stelle von FRT1 bzw. FRT6. Der Kartoffel-Proteinase-Inhibitor
II (PinII)-Terminator (Basen 2 bis 310 von An et al. (1989) Plant
Cell 1: 115–122)
wurde stromabwärts
der codierenden Sequenzen ligiert. PHP10616 hat eine FRT5-Sequenz
(SEQ ID NO 3) stromabwärts
des PinII-Terminators kloniert.
-
-
Die
zweiten Expressioneinheiten haben entweder den Mais-Ubiquitin-Promotor
oder alternativ entweder die verstärkte oder die Standardvariante
des Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotors.
Der Standard-35S-Promotor enthält
die Basen –421
bis +2 (von Gardner et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 2871–2888), und
die verstärkte
Variante hat eine Basenverdoppelung –421 bis –90 stromaufwärts dieses
Standard-35S-Promotors. Der 79 bp Tabak-Mosaikvirus-Leader O' (Gallie et al. (1987)
Nucl. Acids Res. 15: 3257–3273)
wird stromabwärts
des 35S-Promotors,
gefolgt von dem ersten Intron des Maisalkoholdehydrogenase-ADH1-S-Gen
(Dennis et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 3983–3990), insertiert. Codierende
Sequenzen in diesen zweiten Expressionseinheiten umfassen entweder
das Gen mo-PAT, bar (Thompson et al. (1987) EMBO J. 6: 2519–2523) oder
das Gen HM1 (Johal und Briggs, Science 258: 985–987), gefolgt entweder vom PinII-Terminator
oder dem 35S-Terminator (Nucleotide 7487–7639 in Gardner et al. (1981)
Nucl. Acids Res. 9: 2871–2888).
Variierende FRT-Stellen werden stromabwärts der Terminatoren ligiert,
wie es in der Tabelle gezeigt ist. In PHP9643 ist eine dritte Expressionseinheit
vorhanden, und sie hat eine FRT1/GFPm-Fusion, kloniert unter Verwendung
der flankierenden NheI-Stelle von FRT1 (SEQ ID NO 2), um das ATG-Startkodon
von GFPm zu entfernen, wodurch es im existierenden Konstrukt nicht-funktionell
gemacht wird, wobei aber eine korrekte Exzision von Sequenzen zwischen
FRT1 (SEQ ID NO 2)-Stellen das GFPm mit dem Ubiquitin-Promotor und
dem ATG der ersten Expressionseinheit in ein Raster bringen kann,
wodurch es funktionell gemacht wird. Stromabwärts von GFPm ist der PinII-Terminator, gefolgt
von einer FRT5-Sequenz (SEQ ID NO 3).
-
PHP9643
wurde in eine von pUC abgeleitete Plasmid-Hauptkette kloniert. Alle
anderen Vektoren wurden in ein Plasmid vom pSB11-Typ (siehe z.B.
EPA0672752A1, EPA0604662A1, EPA0687730A1 und US-Patent Nr. 5 591
616) kloniert, wobei die Expressionseinheiten zwischen den TDNA-Bordersequenzen
enthalten waren. Alle sind mit der Expressionseinheit eins benachbart
zu dem rechten Border ausgerichtet. Die Plasmide auf pSB11-Basis wurden in das
superbinäre
Plasmid pSB1 (siehe z.B. EPA0672752A1, EPA0604662A1, EPA0687730A1
und US-Patent Nr. 5 591 616) durch homologe Rekombination zwischen
den zwei Plasmiden integriert. Der E. coli-Stamm HB101, der die
pSB11-Derivate enthielt, wurde mit dem Agrobacterium-Stamm LBA4404,
der pSB1 beherbergt, gepaart, um die co-integrierten Plasmide PHP10616,
PHP11407, PHP11410, PHP11457, PHP11599, PHP11893 und PHP14220 in
Agrobacterium zu schaffen (durch das Verfahren von Ditta et al.
(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 7347–7351). Die Co-Integrationsprodukte
wurden durch Agrobacterium-Resistenz gegenüber Spectinomycin und SalI-Restriktions-Verdau
bewiesen.
-
Tabelle
2 enthält
auch ein Beispiel für
einen Vektor zur Schaffung einer Targetlinie, bei der die FRT-Stellen
in das Mais-Ubiquitin-Intron (letzter Eingang) als alternativer
Ort zur Anordnung von FRT- oder anderen Targetstellen insertiert
sind.
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Nach
Selektion von stabil transformierten Ereignissen wurden Proben dieser
Targetlinien als Vorrat für zukünftige Experimente
kryokonserviert, wobei der Ansatz verwendet wurde, der von Peterson
(siehe Anmeldung 08/859 313) beschrieben wurde. Für einige,
nicht aber für
alle Ereignisse, wurde weitere Kallusprobe aus verschiedenen der
stabilen transgenen Ereignisse wachsen gelassen, auf Regenerationsmedium übertragen, um
eine Schösslingsbildung
zu induzieren, und anschließend
wurden Pflanzen isoliert und zur Reife wachsen gelassen (Register
et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25: 951–961).
-
Beispiel 5. Beweis der
Funktionalität
neuer FRT-Stellen in Pflanzen.
-
(A) Exzision von DNA-Sequenzen
zwischen zwei identischen FRT-Stellen, aber nicht, wenn sie von
zwei nicht-identischen FRT-Sequenzen flankiert werden
-
Das
Ausmaß einer
Intraplasmid-Rekombination wurde in Pflanzen untersucht, wobei die
in der folgenden Tabelle 3 beschriebenen FRT-Exzisionskonstrukte
verwendet wurden. Die Vektoren PHP10968, PHP10998, PHP10969, PHP11272,
PHP11243, PHP11244, PHP12140, PHP12141, PHP12156 und PHP12157 wurden
konstruiert, indem der Mais-Ubiquitin-Promotor stromaufwärts der
FRT-Sequenzen unter Verwendung von NcoI, oder an anderen Stellen,
die das ATG-Startkodon beibehielten, ligiert wurde. Die FRT-Sequenz
wurde im Raster an der flankierenden XhoI-Stelle an eine GFPm-Sequenz
fusioniert, die eine Serin-zu-Threonin-Mutation am Amionsäurerest 65 in der Wildtypsequenz
enthält
(neue Sequenz GFPm-S65T genannt). Der pinII-Terminator wurde stromabwärts von
GFPm kloniert. Die zweite Expressionseinheit besteht aus einem Promotor-freien
FRT, kloniert mit der 5'-flankierenden
NheI-Stelle, um
das ATG-Startkodon zu entfernen, im Raster fusioniert an die GUS-codierende
Sequenz (Jefferson et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:
8447–8451)
und gefolgt vom pinII-Terminator. Die Vektor-Hauptkette ist in allen
Fällen
ein von pUC abgeleitetes Plasmid. Es wurden Experimente durchgeführt, indem
die angegebenen Plasmide zusammen mit dem Konstrukt PHP5096, das
eine funktionelle Expressionskassette für FLP-Protein trägt, in Maiszellen
geschossen wurden. PHP5096, der FLPm-Expressionsvektor, der in Experimenten
mit den Exzisions- und Substratvektoren verwendet wurde, besteht
aus dem Mais-Ubiquitin-Promotor, kloniert stromaufwärts der FLPm-codierenden
Sequenz (US-Patentanmeldung, Serial Nr. 08/972 258 mit dem Titel "Novel Nucleic Acid Sequence
Encoding FLP Recombinase"),
und dem pinII-Terminator in einer von pUC abgeleiteten Plasmid-Hauptkette.
In jedem Fall würde
eine erfolgreiche Exzision intervenierende Sequenzen zwischen den
angegebenen FRT-Stellen entfernen und dadurch ein inaktives uidA
(GUS)-Gen in das Raster mit und in Nachbarschaft zu dem Ubiquitin-Promotor
bringen, was zu GUS-Aktivität
führt.
Wenn keine Exzision erfolgt, wird keine GUS-Expression erwartet.
Die Resultate für
eine GUS-Expression aus diesen Experimenten sind in Tabelle 4 unten
angegeben. Bei diesen Untersuchungen trat nur eine effiziente Exzision
auf, wenn Konstrukte zwei identische FRT-Stellen enthielten. Im
Falle der Kombination FRT6 (SEQ ID NO 4) und FRT7 (SEQ ID NO 5)
wurde ein geringer Rekombinationsgrad beobachtet, was wiederum die
Notwendigkeit zum Testen von Targetstellenkombinationen und zum
wohlüberlegten
Selektieren geeigneter Kombinationen für die Anwendung unterstreicht.
-
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B) Transiente Integration
einer zweiten DNA-Sequenz, die von zwei nicht-identischen FRT-Sequenzen flankiert wird,
in Pflanzenzellen
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In
Tabelle 5 unten sind Daten aus Experimenten zusammengefasst, in
denen Targetlinien, die unter Verwendung der in Tabelle 2 beschriebenen
Plasmide geschaffen worden waren, mit einem Substratplasmid beschossen
wurden, das ein GUS-Reportergen, flankiert durch die entsprechenden
FRT-Stellen, die in den Targetkonstrukten eingesetzt wurden, enthält. Dieses
Experiment maß die
Fähigkeit,
eine transiente GUS-Expression kurz nach Einführung des Substratplasmids
zu detektieren. Da es keinen Promotor vor der ersten codierenden
Sequenz in den Substratplasmiden gibt, würde eine zufällige Integration,
wenn sie nicht im Raster hinter einer geeigneten regulatorischen
Sequenz irgendwo im Genom auftritt, nicht zu einer GUS-Expression führen. Dieses
Assaysystem beurteilt dann die Fähigkeit,
FRT-flankierte Gene in FRT-Stellen im Genom zu targetieren. Im Allgemeinen
werden FRT-Substratvektoren (Tabelle 6) als Promotor-lose FRT/Gen-Fusionen
konstruiert, die unter Verwendung der 5'-flankierenden NheI-Stelle des FRT kloniert
sind, um das ATG-Startkodon zu entfernen. Gene, die im Raster an
die FRT mit der flankierenden XhoI-Stelle fusioniert sind, umfassen
eines von mehreren bewertbaren oder selektierbaren Markergenen,
z.B. aadA (Svab et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14: 197–205), uidA,
GFPm, GFPm-C3/Intron oder bar; auf diese folgt ein pinII-Terminator.
In einigen Fällen (PHP10259,
PHP10603, PHP11561 und PHP11633) enthalten Plasmide eine einzelne
Expressionseinheit, und die zweite heterologe FRT-Stelle ist stromabwärts des
pinII-Terminators
kloniert. Die Substratplasmide PHP10859, PHP10997, PHP11204, PHP11699
und PHP12190 haben zusätzlich
zu der ersten Expressionseinheit, die oben beschrieben wurde, eine
zweite Einheit, bestehend aus dem Mais-Ubiquitin-Promotor, dem verstärkten 35S-Promotor
oder einem chimären
Promotor, bestehend aus der 35S-Enhancer-Region, kloniert stromaufwärts eines
synthetischen Kernpromotors, der Rsyn7 genannt wird (US-Patentanmeldung,
Seri al Nr. 08/661 601, eingereicht am 11. Juni 1996), kloniert stromaufwärts entweder
der codierenden Sequenzen HM1, aadA, GUS oder bar, und dem pinII-Terminator.
Stromabwärts
des zweiten Terminators ist eine heterologe FRT insertiert. Schließlich enthalten
PHP11003 und PHP11809 drei Expressionseinheiten. Die erste Einheit
ist eine Promotor-lose keinATG/FRT/Gen-Fusion, wie sie oben beschrieben
wurde, die zweite Einheit enthält
entweder den chimären
35S-Enhancer/Rsyn7-Promotor, der oben beschrieben wurde, oder den
ZmdJ1-Promotor (Baszczynski
et al. (1997) Maydica 42: 189–201)
stromaufwärts
der GUS-codierenden Sequenz kloniert, und den pinII-Terminator.
Die dritte Expressionseinheit besteht aus dem Mais-Ubiquitin-Promotor,
kloniert stromaufwärts
der HM1-codierenden Sequenz, den pinII-Terminator und eine heterologe FRT-Sequenz.
Alle FRT-Substratvektoren werden in eine von pUC-abgeleitete Plasmid-Hauptkette
kloniert. Details der Komponenten dieser Vektoren sind in Tabelle
6 beschrieben. In Tabelle 6 sind auch zwei Vektoren mit einer alternativen
Anordnung von FRT-Stellen im Ubiquitin-5'-UTR oder -Intron aufgelistet.
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Die
Resultate in Tabelle 5 zeigen, dass die Häufigkeit und der Grad der GUS-Expression unter
unterschiedlichen Ereignissen variiert, wie es für Gene vorausgesagt werden
könnte,
die in unterschiedlichen Positionen im Genom insertiert sind. Die
Voraussage ist, dass, sobald eine mit hoher Frequenz in hohem Level
exprimierende Linie identifiziert ist, die Expression der Gene,
die anschließend
in dieselben Stellen eingeführt werden,
auch höher
sein wird als in anderen, niedriger exprimierenden Ereignissen.
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C) Stabile Integration
einer zweiten DNA-Sequenz, die von zwei nicht-identischen FRT-Sequenzen flankiert wird,
in Pflanzenzellen
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Ein
Untersatz der stabilen transgenen "Targetlinien", die in Beispiel 4 oben beschrieben
wurden, wurde in Experimenten eingesetzt, die darauf abzielen, ein
neues Gen, das von denselben FRT-Stellen, die in den Targetlinien
verwendet wurden und in einem zweiten Konstrukt "Substrat"-Plasmid-kloniert wurden, in diese primären Targetlinien
in stabiler Weise zu retargetieren. Tabelle 7 listet die Konstrukte,
die in den primären
Targetlinien (aus Tabelle 2) enthalten sind, die FRT-Stellen, die
in diesen Linien enthalten sind, und die Substratplasmide (aus Tabelle
6), die anschließend
in die Targetlinien retargetiert wurden, auf.
-
Tabelle
8 präsentiert
Daten aus stabilen transgenen Ereignissen, die ein erfolgreiches
und reproduzierbares Targeting von eingeführten Sequenzen an vorher geschaffenen
genomischen Targetstellen beweisen. Die angegebenen Daten sind für 18 unabhängige Targetlinien,
jede mit einem Promotor-losen GUS-Konstrukt retargetiert, angegeben.
Da das bar-Gen gleichzeitig in dasselbe Plasmid eingeführt wurde,
liefert das Verhältnis
von GUS-exprimierenden Ereignissen, die bei einer Bialophos-Selektion
gewonnen wurden, ein Maß für die Retargetinghäufigkeit
im Vergleich zur zufälligen
Integration.
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Beispiel 6. Beurteilung
des Einflusses von eingeführten
FRT-Sequenzen auf die Pflanzenentwicklung, Genexpression und die
agronomische Leistung.
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Eine
Anfangsbeurteilung des Einflusses der eingeführten Sequenzen auf Pflanzenwachstum
und Genexpression wird im Gewächshaus
durchgeführt,
indem regelmäßige Beobachtungen
von der Bestäubung
bis zum Samenansatz durchgeführt
werden. Pflanzen werden sowohl selbstbestäubt als auch mit anderen Genotypen
gekreuzt, um T1-Samen für
eine anschließende
Gewächshaus-
und Feldbeurteilung zu erhalten. Zur Beurteilung der Genexpression
werden sowohl qualitative wie auch quantitative Daten gesammelt
und analysiert. T1-Samen von transgenen Ereignissen, die akzeptable
oder wünschenswerte
Expressionslevel liefern und die keinen signifikanten negativen
Einfluss auf die Pflanzenentwicklung haben (beispielsweise normale
Entwicklungsmorphologie haben, männlich
und weiblich fertil sind, usw.), werden dann zu sammen mit nicht-transgenen
Kontrollpflanzen in bewirtschafteten Feldparzellen wachsen gelassen,
und es werden Standarddaten für die
agronomische Leistungsfähigkeit
gesammelt und beurteilt.
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Beispiel 7. Umwandlung
einer eingeführten
funktionellen FRT-Sequenz in eine zweite nicht-identische funktionelle
FRT-Sequenz
-
Der
hier durchgeführte
Ansatz zur Entwicklung eines Verfahrens zur Umwandlung zwischen
verschiedenen FRT-Stellen zur Verwendung in verschiedenen Anwendungen
basiert auf der vorher beschriebenen "Chimeraplasty"-Strategie zur Herstellung spezifischer
targetierter Nucleotidmodifikationen an einer spezifizierten extrachromosomalen
oder genomischen Zielsequenz in Tierzellen (Yoon et al. (1996) Proc.
Natl. Acad. Sci. 93: 2071–2076;
Cole-Strauss et al. (1996) Science 273: 1386–1389). Diese Fähigkeit
in Pflanzen ist, wie es kürzlich
in unseren Labors bewiesen wurde, zur Ausweitung der potentiellen
Verwendung der vorliegenden Erfindung für eine breitere Anwendung günstig. Die
vorgeschlagene Verwendung dieser "Chimeraplasty"-Technologie in der vorliegenden Erfindung
würde Nucleotide
in einer FRT-Stelle eines Paars nicht-identischer FRT-Stellen, die
eine DNA-Sequenz von Interesse flankieren, targetieren und modifizieren, so
dass die zwei FRT-Stellen identisch gemacht werden. Eine anschließende oder
gleichzeitige Expression von FLP-Rekombinase in Zellen mit diesen
FRT-Stellen-Modifikationen
wird zu einer Exzision der Sequenzen zwischen diesen nun identischen
FRT-Stellen führen,
wodurch spezifisch die unerwünschten
DNA-Sequenzen aus dem vorher geschaffenen stabilen transgenen Ereignis,
das solche Sequenzen enthält,
entfernt werden. Eine Anwendung dieses Ansatzes wäre z.B.
der Fall eines selektierbaren Markers, der während der Anfangsschritte eines
Züchtungs-
oder Rückkreuzungsprogramms
notwendig ist, um bevorzugte einzelne Pflanzen aufrecht zu erhalten
und zu selektieren, der aber im Endprodukt nicht erwünscht ist.
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A) Vektor-Entwicklung
und -Konstruktion zum Testen einer FRT-Stellenumwandlung auf der
Basis der "Chimeraplasty"
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Die
Targetvektoren zur Beurteilung dieser FRT-Stellen-Modifikationsstrategie
sind unten allgemein dargestellt, worin P1 und P2 zwei verschiedene
Promotoren darstellen, G1 und G2 zwei Gene darstellen und T1 und
T2 zwei Terminatorregionen darstellen; diese Regionen sind als weiße Kästchen gezeigt.
Andere FRT-Stellen sind angegeben und sind als dunkle Kästchen gezeigt.
Eine Variante des Konstrukts hat eine dritte einmal vorkommende
FRT-Stelle stromabwärts
des zweiten Gens eingebaut und wird verwendet, um zu beurteilen,
ob die targetierte Konversion, in diesem Fall von FRT5 in FRT6 (SEQ
ID NO 4) auch zu einer Umwandlung der stromabwärts gelegenen FRT1 (SEQ ID
NO 2)-Stelle zu einer FRT6 (SEQ ID NO 4)-Stelle führt. Im erstgenannten Fall
sollte die Expression des stromabwärts gelegenen Gens (G1) detektiert
werden, während, wenn
die Umwandlung nicht für
FRT5 (SEQ ID NO 3) spezifisch ist und auch die FRT1 (SEQ ID NO 2)-Stelle umgewandelt
wird, dann werden beide Genaktivitäten verloren gehen. Für die hier
verwendeten spezifischen Beispiele ist P1 der Mais- Ubiquitin-Promotor,
ist P2 der verstärkte
CaMV-35S-Promotor, ist G1 das uidA (GUS)-Gen, ist G2 das bar-Gen
und sind T1 und T2 pinII-Terminatoren. Auf der Basis der verschiedenen
Beschreibungen der Vektorkonstrukte vorher in der vorliegenden Anmeldung
ist es verständlich,
dass eine Vielzahl verschiedener Promotoren, Gene, Terminatoren
oder DNA-Sequenzen oder FRT-Stellen bei der Durchführung dieses
Komponentenverfahrens verwendet werden können. Die DNA-Kassetten, wie
sie unten gezeigt sind, könnten
entweder zu einem Plasmid auf pUC-Basis für direkte DNA-Abgabeverfahren
(z.B. Partikelbeschuss) oder zu einem binären Vektor für eine Agrobacterium-basierte
Transformation, wie sie früher
beschrieben wurde, angeordnet werden.
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B) Entwicklung von chimären Oligonucleotid-Molekülen für Chimeraplasty-basierte, targetierte
Umwandlung einer FRT-Stelle
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Unten
sind spezifische Beispiele für
chimäre
Moleküle
gezeigt, die verwendet werden, um ein einzelnes Nucleotid so zu
modifizieren, dass die FRT5 (SEQ ID NO 3)-Stelle in Konstrukten,
wie den oben Beschriebenen, in eine FRT6 (SEQ ID NO 4)-Stelle umgewandelt
wird. Sowohl die lineare Sequenz dieser chimären Moleküle wie auch die vorausgesagte
aktive Form des Moleküls
(auf der Basis der obigen Publikationen von Yoon et al. und Cole-Strauss
et al.) sind gezeigt. DNA-Reste sind in Großbuchstaben angegeben, RNA-Reste sind
in Kleinbuchstaben angegeben, und die Stelle, die modifiziert werden
soll (ein einzelnes Nucleotid als Unterschied zwischen FRT5, SEQ
ID NO 3, und FRT6, SEQ ID NO 4), ist unterstrichen und fettgedruckt.
Zwei Beispiele von Chimären
sind unten angegeben, die sich in der Zahl der Reste stromabwärts der
FRT5 (SEQ ID NO 4)-Stelle unterscheiden, die im chimären Molekülkonzept
enthalten sein wird, und damit die Spezifität für die Targetsequenz bestimmen
werden.
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1.
Chimäre
lineare Oligonucleotidsequenz (Sequenz enthält sechs Targetspezifische
Reste stromabwärts
der FRT-Stelle, die im Targetkonstrukt modifiziert wird, und sollte
nur diese einzige spezifische FRT5-Stelle, SEQ ID NO 3, in eine
FRT6-Stelle, SEQ ID NO 4, umwandeln)
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Aktive
Oligonucleotid-Konformation
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2.
Chimäre
lineare Oligonucleotidsequenz (Sequenz enthält Reste, die nur für Sequenzen
in der FRT-Stelle spezifisch sind, und so nur eine FRT5-Stelle,
SEQ ID NO 3, in einem Zielmolekül
in einer FRT6-Stelle (SEQ ID NO 4) umwandeln sollten)
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Aktive
Oligonucleotid-Konformation
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Vektorkonstruktionen
und chimäre
Oligonucleotid-Moleküle,
wie sie oben beschrieben sind, wurden gebildet und in Experimenten
verwendet.
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C) Beweis einer Umwandlung
einer FRT-Stelle in eine andere
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Stabile
transgene Maislinien werden mit den Konstrukten, wie sie oben beschrieben
wurden, oder mit verwandten, durch Transformieren in die Konstrukte
und Selektieren an Bialophos, wie vorstehend beschrieben, erzeugt.
Gewebe, die zur chimären
Abgabe zu verwenden sind, werden in nicht-Bialophos-enthaltende Medien übertragen,
und die chimären
Oligonucleotide werden in Zellen dieser stabilen Ereignisse durch
Partikelbeschuss zusammen mit Co-Abgabe von PHP5096, das eine funktionelle
FLP-Rekombinase-Expressionskassette trägt, abgegeben. In Kontrollexperimenten
werden nur chimäre
Moleküle
oder nur PHP5096 abgegeben. Nach genügend Zeit, um Zellen ohne Bialophos-Selektion
zu gewinnen, werden Proben der beschossenen Ereignisse auf GUS-Experession
beurteilt. Für
diese beschossenen Ereignisse, die das Konstrukt mit der stromabwärts gelegenen
FRT1-Stelle (SEQ ID NO 2) enthalten, die keine GUS-Expression zeigen,
wird eine entsprechende Probe von Zellen plattiert und auf Medium
mit oder ohne Bialophos-Selektion plattiert und wachsen gelassen,
um die Empfindlichkeit gegenüber
der Chemikalie zu analysieren. Wenn die chimären Moleküle spezifisch sind, um nur
die FRT5-Stelle (SEQ ID NO 3) zu modifizieren, dann sollten zwischen
Behand lungen mit oder ohne Selektion keine Unterschiede in der Zahl
und im Wachstum von Zellen beobachtet werden. Anderenfalls sollte
reduziertes Wachstum und reduzierte Gewinnung festgestellt werden.
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D) Molekulare Verifikation
einer stabilen Umwandlung von FRT-Stellen
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DNA
von den Proben, die eine GUS-Expression aufweisen, wird isoliert,
bei Bedarf durch PCR amplifiziert und durch Standardverfahren in
der Region, die der vorausgesagten Nucleotidkonversion entspricht, sequenziert.
Eine ausreichende Strecke an DNA wird sequenziert, um die gesamte
ursprünglich
eingeführte DNA-Region
abzudecken, um so eine korrekte und spezifische Umwandlung zu bestätigen. Unter
Verwendung von Standardverfahren für PCR, Southern-Analyse und/oder
Sequenzierung von GUS-exprimierenden und nicht-exprimierenden Proben wird das Vorliegen
oder das Fehlen spezifischer DNA-Fragmente vor und nach dem chimären Molekül und FLP-Rekombinase-Abgabe
entwickelt, und somit werden die oben gemachten visuellen und biochemischen
Beobachtungen untermauert.
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E) Verwendbarkeit der
FRT-Stellenumwandlung auf Chimeraplasty in einer "transgene stacking"-Strategie für Pflanzen
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In 1 ist
eine potentielle Strategie zum Kombinieren oder "stacking" mehrerer gewünschter Transgene an einem
genomischen Ort unter Verwendung des Systems der vorliegenden Erfindung
beschrieben, welches auf nicht-identischen FRT beruht. Während ein "gene stacking" ohne die Verwendung
des targetierten FRT-Umwandlungsverfahrens, das in diesem Beispiel
7 beschrieben wird, erreicht werden kann, erweitert dieses zuletzt
genannte Verfahren die Fähigkeit
des Systems, indem es eine in vivo-Umwandlung von FRT-Stellen unter
Schaffung neuer Stellen anstatt einer Wiedereinführung neuer FRT-Stellen durch
Transformation ermöglicht.
Im Schaubild von 1 zeigt eine FRT-Stelle mit
einem Stern daneben an, dass sie ursprünglich geschaffen wurde, um
bezüglich
einer Rekombination zwischen ihr und der äquivalenten FRT-Stelle ohne
Stern nicht funktionell zu sein, die aber bei Umwandlung mit dem
hier beschriebenen Ansatz auf Chimeraplasty-Basis zur Rekombination
mit ihrem äquivalenten
Gegenstück
ohne Stern fähig
gemacht wird. In dem in der Figur präsentierten spezifischen Beispiel
würde diese
z.B. die Entfernung eines selektierbaren Markers, entweder um ihn
nicht länger
vorliegen zu haben, oder um eine Wiederverwendung des selektierbaren
Markers in zukünftigen
Transformationen zu ermöglichen,
erleichtern. Somit liefert dieses Verfahren auch einen Mechanismus
zum Recycling selektierbarer Marker, wie es bei der Verwendung des
FRT-Systems der vorliegenden Erfindung allein möglich ist.
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Diskussion
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Bis
dato war die Hauptanwendung des FLP/FRT-Systems in Pflanzen die
DNA-Exzision (Lyznik
et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 969–975). Beispielsweise wird
zuerst ein Gen, z.B. ein selektierbarer Marker, der von FRT-Stellen
flankiert wird, durch einen von mehreren Transformationsansätzen eingeführt, und
stabile transgene Ereignisse oder Pflanzen werden über geeignete
Selektion gewonnen. Um das selektierbare Markergen zu eliminieren,
wird dann das FLP-Protein in den Zellen entweder transient durch
Einführung
eines Plasmids, das eine FLP-Expressionskassette trägt, oder
stabil durch Integration einer eingeführten FLP-Expressionskassette oder durch Kreuzen
von Pflanzen, die das FRT-flankierte, selektierbare Markergen tragen, mit
Pflanzen, die Sequenzen für
aktives FLP-Protein tragen und exprimieren, exprimiert (US-Patentanmeldung,
Serial Nr. 08/972 258, "Novel
Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Rekombinase").
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Ein
Hauptproblem, das mit der Entwicklung des FLP/FRT-Systems zum Integrieren
von Genen in Tiere oder Pflanzen verbunden ist, resultiert aus der
Tatsache, dass die durch Hefe-FLP-Rekombinase
katalysierte Rekombinationsreaktion ein reversibler Prozess ist
(Sadowski (1995) in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular
Biology 51: 53–91).
Beispielsweise sollte eine Rekombination nach Einführung einer
DNA-Sequenz, die von ähnlich
orientierten FRT-Stellen flankiert wird, in Pflanzenzellen in Gegenwart
von aktiv exprimierender FLP-Rekombinase
zur Insertion der neuen DNA-Sequenzen an der endogenen FRT-Stelle
führen. Allerdings
würde die
Umkehrreaktion bei fortgesetzter Expression des FLP-Enzyms zur Reexzision
der eingeführten
Sequenzen führen,
und zwar infolge einer Rekombination zwischen den identischen FRT-Stellen.
Da die Reaktion reversibel ist, können Integration und Exzision
sich wiederholt in Richtung eines Gleichgewichts fortsetzen. Wenn
sich die Zellen teilen und die DNA-Substratkonzentration pro Zelle
abnimmt, nimmt die Integrationswahrscheinlichkeit ab, so dass, solange
das aktive FLP-Protein exprimiert wird, die Reaktion in Richtung
des nicht-integrierten
Zustands gesteuert werden wird. Um eine Integration zu begünstigen,
muss eine Situation entwickelt werden, die eine Reexzision ausschließt, sobald
eine Integration auftritt. Es wurde eine Reihe von Strategien vorgeschlagen,
einschließlich
Begrenzung der Aktivitätsdauer
von FLP-Rekombinase durch induzierbare Expression oder durch direkte
Einführung
von FLP-Protein
oder RNA in Zellen (Sadowski (1995) Progress in Nucleic Acid Research
and Molecular Biology 51: 53–91),
aber bis dato wurde kein routinemäßiges, nicht-zufälliges Integrationssystem
für Pflanzen
entwickelt.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt die Entwicklung eines nützlichen
neuen Gentargeting-Systems für
Pflanzen, das die Hefe-FLP-Rekombinase oder eine modifizierte FLP-Rekombinase verwendet,
die so konzipiert ist, dass sie in bestimmten Pflanzenspezies arbeitet
und das neue nicht-identische FRT-Stellen verwendet, die für eine gerichtete,
nicht-reversible DNA-Integration verwendet werden können. Außerdem wird
hierin eine neue Verwendung von akzessorischen Technologien, z.B. "Chimeraplasty", beschrieben, die
eine in vivo- oder in vitro-Modifikation
von DNA-Sequenzen, z.B. FRT-Stellen, um die Nützlichkeit des Systems weiter
auszudehnen, ermöglicht.
Bereitgestellte Daten beweisen die erfolgreiche, stabile Integration
von DNA-Sequenzen zwischen vorher eingeführten, nicht-identischen FRT-Stellen
in Mais. Wir zeigen auch, dass die DNA-Sequenzen zwischen den FRT-Stellen
anschließend
durch eine zweite DNA-Sequenz, die durch dieselben FRT-Stellen wie
die erste flankiert wird, ersetzt werden können. Zusammen beweisen diese
Resultate, dass es möglich
ist, Paare nicht- identischer
FRT-Stellen an bestimmten genomischen Orten einzuführen und
wiederzugewinnen, dass man wünschenswerte
oder bevorzugte genomische Orte zum Exprimieren von DNA-Sequenzen von Interesse
selektieren kann und dass diese selektierten Orte eingesetzt werden
können,
um andere DNA-Sequenzen von Interesse zu retargetieren. Außer dem
offensichtlichen Nutzen, fähig
zu sein, Gene in das Genom von Pflanzen zu integrieren, stellt die
vorliegende Erfindung ein Mittel zur Erleichterung der Einführung von
neuen Genen oder DNA-Sequenzen in genomische Orte, von denen vorher
bestimmt wurde, dass sie unter dem Gesichtspunkt der Bereitstellung
geeigneter Level einer stabilen Expression des eingeführten Gens
(der eingeführten
Gene) günstig
sind und keine nachteiligen Einflüsse auf agronomische Charakteristika, einschließlich Ertrag,
haben, bereit. Außerdem
stellt die Erfindung ein System bereit, durch das eine Integration
von zwei oder mehr Genen auf denselben genomischen Ort targetiert
werden kann, wodurch ein Mechanismus zum "gene stacking" geliefert wird. Diese gestapelten Gene
können
dann aufrecht erhalten werden und in Züchtungsprogrammen als ein eng
verknüpftes
Paar von Merkmalen behandelt werden. Somit stellt die vorliegende
Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Einführung, Beibehaltung und Züchtung mehrerer
genetischer Merkmale von Interesse, einschließlich agronomischer Merkmale,
kommerziell wichtiger Gene oder heterologer Genprodukte, bereit.
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Die
Erfindung schlägt
ferner eine Verwendung des nicht-rekombinanten Merkmals nicht-identischer FRT-Stellen
vor, um die Schaffung eines Satzes von "Elter"-Linien zu ermöglichen, die zunächst für die gewünschte Expression
und Leistungsparameter, die oben beschrieben werden, gut charakterisiert
werden. Diese Linien dienen dann als Grundlage zur Einführung neuer
Merkmale in dieselben vorher definierten Stellen im Genom, in das
die Anfangsgene eingeführt
worden waren. Es müssten
viel weniger Ereignisse erzeugt werden, da eine Integration vorzugsweise
in Stellen erfolgt, von denen gezeigt wurde, dass sie gut exprimieren und
einen minimalen negativen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit
haben.
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Obgleich
die vorstehende Erfindung durch Erläuterung und Beispiele zu Zwecken
der Klarheit des Verständnisses
im Detail beschrieben wurde, wird es klar sein, dass gewisse Änderungen
und Modifikationen innerhalb des Rahmens der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden
können.
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