DE69831589T2 - Zusammenfügung von knorpelmatrizen unter verwendung isolierter chondrozyten - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Das Gebiet der Erfindung ist die Reparatur von Knorpeln. Erklärung bezüglich staatlich unterstützter Forschungsarbeiten Die vorliegende Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung im Rahmen des National Institutes of Health Grant AR31068 gemacht.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Knorpel, der ein heterogenes Gewebe ist, kann entweder als Gelenksknorpel oder epiphysärer/physärer Knorpel klassifiziert werden. Störungen bei der Knorpelstruktur und -funktion werden bei angeborenen, infektiösen, traumatischen, degenerativen und neoplastischen Zuständen festgestellt. Eine biologische Reparatur von fokalen Gelenksknorpelschäden hat großes Interesse erweckt, wenngleich einige der Variablen dieses Prozesses noch nicht genau definiert worden sind (siehe z. B. Brittberg et al., New Engl. J. Med., 331: 889–895, 1994; und Mankin, New Engl. J. Med., 331: 940–941, 1994). Zu diesen Variablen zählen die biochemischen und biomechanischen Eigenschaften des Reparaturgewebes selbst sowie sein Verbinden mit benachbartem Knorpel und Knochen.
  • Das morphogenetische Gerüst, an das sich Chondrozyten heften und eine Matrix formen können, ist eine der Variablen, welche Auswirkungen auf das Reparaturgewebe haben. Materialien, die als Gerüst verwendet wurden, schließen Collagengel (Fujisato et al., Biomaterials, 17: 155–162, 1995; Hansen et al., Clin. Orthop., 256: 286–298, 1990; Mizuno et al., Exp. Cell. Res., 227: 89–97, 1996; Nixon et al., Am. J. Vet. Res., 54: 349–356, 1993; Sams et al., Osteoarthr. Cartil., 3: 47–59, 1995; Sams et al.., Osteoarthr. Cartil., 3: 61–70, 1995), Fibrin-Kleber (Hendrickson et al., J. Orthop. Res., 12: 485–497, 1994; Homminga et al., Acta Ortopedica Scandinavica, 64: 441–445, 1993; Tsai et al., J. Formosan Med. Assoc., 3(Suppl): 239–245, 1993), Polyglycolsäure (Freed et al., Biotechnology, 12: 689–693, 1994; Vacanti et al., Am. J. Sports Med., 22: 485–488, 1994), Polyethylenoxidgel (Sims et al., Plast. Reconstr. Surgery, 98: 843–850, 1996), Alginatgel (Van Susante et al., Acta Ortopedica Scandinavica, 6: 549–556, 1995), Kohlenstofffaserpads (Brittberg et al., Clin. Orthop., 326: 270–283, 1996) und xenogene Matrix (Caruso et al., J. Orthop. Res., 14: 102–107, 1996) ein.
  • Isolierte und kultivierte Chondrozyten, die in diesen verschiedenen Gerüsten eingebettet sind, wurden für das Füllen und Reparieren von Gelenksknorpelschäden bei Hühnern (Itay et al., Clin. Orthop., 220: 284–303, 1987), Kaninchen (Grande et al., Anatomical Records, 218: 142–148, 1987; Grande et al., J. Orthop. Res. 7: 208–218, 1989; Wakitani et al., J. Bone Joint Surg. [Br.], 71: 74–80, 1989), Hunden (Shortkroff et al., Biomaterials, 17: 147–154, 1996) und Pferden (Hendrickson et al., supra; Sams et al., Osteoarthr. Cartil., 3: 47–59, 1995; Sams et al., Osteoarthr. Cartil., 3: 61–70, 1995) verwendet.
  • Eine vollständige Reparatur von Teilschäden an Knorpeln impliziert ein Seite-zu-Seite-Verbinden von Knorpelmatrizen. Während ein solches Verbinden auf verschiedene Arten untersucht wurde (Hunziker et al., Trans. Orthop. Res. Soc., 17:231, 1992; Reindel et al., J. Orthop. Res., 13: 751-760, 1995; Wolohan et al., J. Orthop. Res., 9: 180-185, 1991), müssen noch mehr Optionen zur Erfüllung dieser Aufgabe in Betracht gezogen werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass sich isolierte Chondrozyten in der Gegenwart eines geeigneten biologischen Gels (z. B. Fibrin-Gel) fortpflanzen und eine Knorpelmatrix erzeugen können, die zwei benachbarte Knorpelstücke fest miteinander verbindet.
  • Infolgedessen sieht die Erfindung die Verwendung von isolierten mit einem flexiblen, biologisch abbaubaren und biokompatiblen Gel vermischten Chondrozyten bei der Herstellung einer Kleberzusammensetzung für das Behandeln von Knorpelschäden durch das Zusammenkleben von einem ersten Knorpelstück mit einem zweiten Knorpelstück vor. Die Kleberzusammensetzung, die isolierte Chondrozyten enthält, die mit einem biologischen Gel vermischt sind, kann auf eine Oberfläche von einem (oder beiden) der Knorpelstücke aufgetragen und die Oberfläche danach mit dem anderen Knorpelstück in Kontakt gebracht werden. Neue Knorpelmatrix, die durch die Kleberzusammensetzung erzeugt wird, wird eine dauerhafte (z. B. 1% oder mehr der normalen Knorpelfestigkeit) Verbindung zwischen den zwei sich berührenden Knorpelstücken bereitstellen. Die Reihenfolge der Schritte in dem oben beschriebenen Verfahren kann verändert werden. Zum Beispiel können die zwei zu verbindenden Knorpelstücke in Apposition gehalten werden und danach wird eine Kleberzusammensetzung aufgetragen, um Lücken bei der Schnittstelle der zwei Knorpelstücke auszufüllen.
  • Isolierte Chondrozyten sind Chondrozyten, die von der Knorpelmatrix getrennt sind und die aus Knorpelgewebe oder Knochenmark erhalten werden können. Sowohl frisch isolierte als auch kultivierte Chondrozyten können verwendet werden.
  • Ein biologisches Gel ist eine flexible, biologisch abbaubare (d. h. bioresorbierbare) und biokompatible (d. h. es weist keine oder eine vernachlässigbare In-Vivo-Toxizität auf und ist mit In-Vivo-Bedingungen kompatibel) Zusammensetzung, die typischer Weise Poren aufweist, die groß genug sind, um eine Besiedelung durch Chondrozyten zu ermöglichen. Ein beispielhaftes biologisches Gel ist Fibrin-Gel (auch als Fibrin-Kleber bezeichnet). Fibrin-Gel wurde als Grundlage vieler biologischer Kleber oder haftender Matrizen verwendet und kann mit Gerinnungsfaktoren, einschließlich Thrombin und Fibrinogen, hergestellt werden. Fibrinogen wird durch Thrombin gespalten, um Fibrin am Beginn der Gerinnung zu bilden.
  • Eines oder beide Knorpelstücke, die verbunden werden sollen, können von endogenen (d. h. angeborenen) Chondrozyten befreit werden, bevor die isolierten Chondrozyten aufgetragen werden. Die zu verbindenden Knorpelstücke können Gelenksknorpel, Fibroknorpel oder Wachstumsknorpel sein und aus dem zu behandelnden Patienten oder aus einem Spender der selben oder einer anderen Spezies gewonnen werden.
  • Die Kleberzusammensetzung kann verwendet werden, um bei einem Säugetier (z. B. einem Menschen, einer Maus, Ratte, einem Hund, einem Pferd, Lamm, Schaf usw.) beschädigten Gelenksknorpel (z. B. einen teilweisen oder vollen Dicke-Fehler) zu reparieren (d. h. mit einer neuen Oberfläche zu versehen). In diesem Fall ist eines der zu verbindenden Stücke der schadhafte Knorpel, und das andere Stück stellt einen Teil eines Knorpelimplantats dar, und die verwendeten Chondrozyten können aus dem Säugetier selbst gewonnen werden. Die Kleberzusammensetzung kann auch verwendet werden, um Schäden in anderen Arten von Knorpeln zu verwenden, z. B. einem Meniskusriss in Fibroknorpel oder einem Resektionsschaden, der sich aus dem Herausschneiden eines physären Stabs aus einer verletzten Wachstumsplatte ergibt.
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die im vorliegenden Dokument verwendet werden, die Bedeutungen, so wie sie im Allgemeinen ein Fachmann auf dem Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, versteht.
  • Beispielhafte Verfahren und Materialien werden unten beschrieben.
  • Die Materialien, Verfahren und Beispiele, die hierin beschrieben werden, haben ausschließlich beispielhaften und keinerlei einschränkenden Charakter.
  • Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen erkennbar.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A und 1B sind Diagramme, welche eine angewendete Verschiebung durch Zug bzw. gemessene Zugbelastung aus einer experimentellen Knorpelzusammensetzung zeigen, die mit isolierten Chondrozyten geimpft und in vivo 21 Tage lang implantiert wurde.
  • 1C ist ein Diagramm, dass eine Belastungs-Spannungs-Kurve zeigt, die aus Daten, die in 1A und B gezeigt werden, durch Normalisieren der Verlagerungsdaten auf eine gemessene Probendicke und der Belastungsdaten auf die Probenfläche erzeugt werden. SUTS steht für die Reißfestigkeit, ϵf für Bruchspannung, M für den dynamischen Zugmodul und Ef für Bruchenergie.
  • 2A–2D sind Diagramme, welche den Zeitverlauf der Veränderungen bei der Zugfestigkeit, der Bruchspannung, Bruchenergie und dem Zugmodul von experimentellen bzw. Kontroll-Knorpelzusammensetzungen zeigen. Die Zusammensetzungen wurden in nackte Mäuse für den Zeitraum implantiert, der auf der horizontalen Achse angeführt ist. Alle Daten werden als mittlere ± Standardabweichung gezeigt, wobei die Anzahl der Datenpunkte an jedem Zeitpunkt von 4 bis 6 für die experimentellen Zusammensetzungen und von 2 bis 4 für die Kontrollgruppen reicht. In jeder der vier Figuren stellt „*" den entsprechenden p-Wert für das Ausmaß des Unterschieds zwischen der experimentellen Gruppe und der Kontrollgruppe zum jeweiligen Zeitpunkt dar.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Kleberzusammensetzung der Erfindung ist für das Verbinden von zwei oder mehr Knorpelstücken nützlich. Die Kleberzusammensetzung umfasst isolierte Chondrozyten, die mit einem biologischen Gel vermischt sind (z. B. ungefähr 105 bis 107 Zellen/pro ml Gel). Die Kleberzusammensetzung wird danach auf die Schnittstelle der zwei Knorpelstücke aufgetragen. Alternativ dazu kann zuerst eines oder können beide der Knorpelstücke (z. B. entvitalisierte Stücke) mit isolierten Chondrozyten (mit einer Konzentration von ungefähr 105 bis 107 Zellen/pro ml Medium) co-kultiviert werden, und danach kann ein biologisches Gel auf die Schnittstelle der Stücke aufgetragen werden. Die Chondrozyten, welche die Knorpelstücke infiltriert haben, werden dann in das Gel wandern.
  • Das biologische Gel dient als biologisch abbaubares und biokompatibles Gerüst, auf dem sich die Chondrozyten vermehren und dauerhafte Knorpelmatrix erzeugen werden. Zu den biologischen Gels, die verwendet werden können, zählen – ohne darauf beschränkt zu sein – Collagengel, Fibrin-Kleber, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Polyethylenoxidgel, Alginat oder Kalziumalginatgel, Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat) (d. h. ein Hydrogel), Polyorthoester, Hyaluronsäure, Polyanhydrid, Gelatine, Agarose und andere bioresorbierbare und biokompatible Materialien, wie jene, die in EP 0705878 A2 beschrieben sind. Um die Chondrozytenvermehrung und -funktion zu fördern, kann das biologische Gel zusätzlich geeignete Nährstoffe (z. B. Serum, Salze wie Kalziumchlorid, Ascorbinsäure und Aminosäuren) sowie Wachstumsfaktoren (z. B. Somatomedin, basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, umformender Wachstumsfaktor β, Knorpelwachstumsfaktor, knochengewonnener Wachstumsfaktor oder eine Kombination daraus) enthalten. Eine Auswahl des optimalen biologischen Gels kann mit Hilfe der in den Beispielen unten angeführten Angaben erfolgen.
  • Die in der Kleberzusammensetzung nützlichen Chondrozyten können z. B. aus Gelenksknorpel oder einer epiphysären Wachstumsplatte durch Digerieren mit Collagenase und wahlweise Trypsin isoliert werden. Mesenchymale Zellen, die aus dem Knochenmark erhalten werden, können ebenfalls unter geeigneten Kulturbedingungen, so wie z. B. von Butnariu-Ephrat et al, Clinical Orthopaedics and Related Research, 330: 234–243, 1996, beschrieben, in Chondrozyten differenziert werden. Andere Quellen, aus denen Chondrozyten gewonnen werden können, sind u. a. Hautzellen und pluripotente Stammzellen. Die Kleberzusammensetzung der Erfindung kann verwendet werden, um schadhaften Gelenksknorpel zu reparieren. Zu diesem Zweck wird ein Knorpelstück, das in die Form und Größe eines schadhaften Teils geschnitten wurde (siehe z. B. Chu et al., Arch. Am. Acad. Orthop. Surg., 1: 9–14, 1997) eingepresst und mit dem schadhaften Teil verbunden. Das Knorpelimplantat kann zum Beispiel autogen, isogen (z. B. aus einem identischen Zwilling), allogen oder xenogen sein. Bevor eine neue Knorpelmatrix an der Schnittstelle des Implantats und dem Wirtsbett erzeugt wird, was zu einer dauerhaften Verbindung zwischen dem Implantat und dem Wirtsbett führt, kann das Implantat in Position gehalten werden, z. B. durch bioresorbierbare Stifte (siehe z. B. Chu et al., supra) oder ein Stück von periostealem/perichondrialem Gewebe, das über die Implantierungsstelle genäht ist (siehe z. B. Minas et al., Orthopedics, 20: 525–538, 1997; und WO 97/30662). Es kann auch ein haftendes biologisches Gel (z. B. Fibrin-Gel) ausgewählt werden, das eine vorübergehende Haftung zwischen den zwei Knorpelstücken bereitstellt. Die für das Reparieren der Knorpelschäden verwendeten Chondrozyten können z. B. autogen, isogen oder allogen sein. Vor dem Implantieren kann der zu reparierende Wirtsknorpel z. B. mit einem Enzym behandelt werden, um Proteoglycane und andere Substanzen zu entfernen, die sich auf das Verbinden auswirken können.
  • Folgende Beispiele stellen die Verfahren und Materialien der vorliegenden Erfindung dar.
  • BEISPIEL I: Herstellung des Knorpelimplantats
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Chondrozytenisolierung
  • Gelenksknorpel wurde aus Lammhüften und -schultern durch Entfernen der Oberflächenschichten des Gelenksknorpels unter sterilen Bedingungen gewonnen. Der subchondrale Knochen wurde vermieden. Knorpelstücke wurden 8 Stunden lang bei 37°C in HAM-Medium mit Glutamax-1 (GibcoBRL, Grand Island, NY) inkubiert, das 0,075% Collagenase Typ 2 (Worthington Biochemical Co. Freehold, NJ), 10% Kälberfötenserum (Sigma, St. Louis, MO), 50 μg/ml Ascorbinsäure, 1% antibiotische/antimycotische Lösung (Sigma; jeder ml der Lösung enthält 10.000 Einheiten Penicillin, 10 mg Streptomycin und 25 μg Amphotericin B in 0,9% NaCl) und L-Glutamin 292 mg/l enthielt. Nach der Inkubation wurden nicht digeriertes Gewebe und Abfall entfernt, indem die Zellsuspension durch eine sterile Nylongase gefiltert wurde.
  • Verarbeiten von allogener Matrix
  • Scheiben von Gelenksknorpel, von denen jede ungefähr 3 Millimeter („mm") breit, 5 mm lang und 1 mm dick war, wurden aus Knien und Schultern von nicht verwandten Lämmern unter sterilen Bedingungen geerntet. Danach wurden diese in 50 ml Teströhrchen angeordnet, welche eine phosphatgepufferte Salzlösung („PBS") und 2% der antibiotischen/antimycotischen Lösung (Sigma) enthielten, und fünf Tage lang bei minus 20°C gefroren. Nach dem Auftauen wurde die PBS-Lösung verworfen, und die Knorpelscheiben wurden fünf Gefrier-Auftau-Zyklen in Abwesenheit von PBS unterzogen.
  • Danach wurde die Chondrozytenlebensfähigkeit in beispielhaften Stücken durch Trypanblaufärbung (Trypanblau 0,2%, Sigma) und Fluoreszenzmikroskopie, wie zuvor beschrieben (Vacanti et al., supra), evaluiert. Dieses Verfahren zeigte, dass das zyklische Einfrieren und Auftauen alle angeborenen Chondrozyten in den Knorpelscheiben getötet hatte.
  • Knorpelscheiben mit keinen erfassbaren Chondrozyten wurden als „nicht lebende Knorpelmatrix" oder „entvitalisierte Knorpelmatrix" bezeichnet.
  • Co-Kultivieren von Chondrozyten mit allogener Matrix
  • Die wie oben beschrieben erhaltene Zellsuspension wurde zehn Minuten lang mit 4000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert und in PBS, die 2% der antibiotischen/antimycotischen Lösung enthielt, gewaschen. Die Lebensfähigkeit der Chondrozyten wurde mit Hilfe von Trypanblaufärbung ermittelt und als ein Prozentsatz von lebenden Chondrozyten pro Hochleistungsfeld aufgezeichnet. Nur jene Chondrozytenkulturen mit einem Lebensfähigkeitswert von 90% oder darüber wurden für die weiteren, unten beschriebenen, Studien verwendet. Die genaue Zellzahl pro ml wurde mit Hilfe eines Hämocytometers festgestellt. Chondrozytenlösungen wurden auf eine Konzentration von 106 Zellen/ml vor Verwendung eingestellt.
  • Das Co-Kultivieren von Chondrozyten mit allogener Matrix wurde ausgeführt, indem drei Scheiben von nicht lebender Knorpelmatrix in ein 12 ml Teströhrchen (Corning, NY, USA) gegeben wurden, das 4 ml von F12-Medium (Sigma) und 1 ml der eingestellten Chondrozytenlösung enthielt. Die Knorpelscheiben und die Chondrozyten wurden in dem F12-Medium 21 Tage lang co-kultiviert. Kontrollproben, die keine Chondrozyten enthielten, wurden unter denselben Kulturbedingungen gehalten. In allen Kulturen wurde das Medium zwei Mal wöchentlich gewechselt. Bei den experimentellen Gruppen enthielt das frische Medium 106 Chondrozyten/ml.
  • Herstellung von Matrixzusammensetzungen
  • Nach dem Co-Kultivieren wurden die drei Knorpelscheiben, die mit Chondrozyten infiltriert wurden (d.h. die experimentellen Scheiben), aus dem Medium entfernt. Dies erfolgte, indem das Teströhrchen auf eine Wirbelmaschine angeordnet wurde, um Chondrozyten zu resuspendieren, die nur lose an den Knorpelscheiben hafteten. Danach wurde das Medium durch Absaugen entfernt und die Knorpelscheiben in frischem Medium resuspendiert.
  • Daraufhin wurde das Waschverfahren mehrere Male wiederholt, die drei Knorpelscheiben auf eine sterile Petrischale gegeben und auf einer sterilen 27-Gauge-Insulinnadel gestapelt, indem jede in der Mitte durchstochen wurde. Danach wurde Fibrin-Klebergel, das aus humanem Cryopräzipitat und Rinderthrombin (USP-Thrombostat, Parke Davis Lambert Co, Morris Plains, NJ) hergestellt wurde, um die drei Scheiben herum aufgetragen, um eine zusammengesetzte Knorpeleinheit zu bilden. Der Fibrin-Kleber wurde in ein paar Minuten fest und die Nadel daraufhin entfernt.
  • Kontrollzusammensetzungen wurden mit nicht lebenden Knorpelscheiben hergestellt, die nicht mit isolierten Chondrozyten co-kultiviert worden waren.
  • Tiermodell
  • Die Implantierung von experimentellen und Kontroll-Matrixzusammensetzungen erfolgte unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Strömungshaube. Die Zusammensetzungen wurden in subkutane Taschen an vier Stellen in den Rücken von nackten Mäusen implantiert. Zwei experimentelle und zwei Kontrollzusammensetzungen wurden in jedes Tier implantiert. Nachdem die Tiere getötet worden waren, wurden die Knorpelzusammensetzungen unter sterilen Bedingungen entfernt und wie unten beschrieben evaluiert.
  • Evaluierung von aus den Mäusen gewonnenen Zusammensetzungen
  • Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden drei getrennte Tiergruppen für drei unterschiedliche Studien verwendet.
  • Die erste Gruppe, die aus vier Mäusen (jede mit vier Zusammensetzungen) bestand, wurde verwendet, um das Verbinden und die Histologie der Matrixzusammensetzungen zu verschiedenen Zeiten (d. h. an den Tagen 7, 14, 21, 28 und 42 nach der Implantierung) zu bewerten. Die Zusammensetzungen wurden mit einem Paar Juwelierpinzetten auf das Vorhandensein von Fusion an den Kontaktebenen zwischen den benachbarten Knorpelscheiben und die Trennbarkeit der Scheiben durch die Öffnungskraft der Pinzetten untersucht. Jede Zusammensetzung von drei Knorpelscheiben wies zwei Kontaktebenen auf. Die Daten bezüglich des Verbindens zwischen den Knorpelscheiben, die unten und in Tabelle 2 angeführt werden, beziehen sich auf die 16 Kontaktebenen in den acht experimentellen Knorpelzusammensetzungen und auf die 16 Kontaktebenen in den acht Kontrollknorpelzusammensetzungen für den jeweiligen Zeitraum. Es wurde eine Reihenfolgenskala verwendet, um das Verbinden zwischen den Knorpelscheiben aufzuzeichnen. Wenn die Knorpelscheiben an ihren Kontaktebenen vollständig miteinander fusioniert waren, wurde ein Wert 1 zugewiesen. Wenn es zu irgendeiner Trennung zwischen Scheiben aufgrund der Pinzetten kam, wurde eine 0 zugewiesen. Das Verbinden wurde in absoluten Zahlen und in Prozentsätzen für jede einzelne Gruppe angeführt. Die Zusammensetzungen, die für eine histologische Analyse verwendet wurden, wurden in 10% phosphatgepuffertem Formalin fixiert, eingebettet in Paraffin, bei fünf Mikrometern geschnitten, mit Safranin-O gefärbt und unter einem Lichtmikroskop bei 200X oder 400X untersucht.
  • Tabelle 1
    Figure 00090001
  • Die Anzahl von verwendeten nackten Mäusen ist in eckigen Klammem [] angefürt. Die Zusammensetzungen wurden in subkutane Taschen auf dem Rücken der Maus an vier unterschiedlichen Stellen eingefügt. Zwei experimentelle und zwei Kontroll-Zusammensetzungen wurden nach dem Zufallsprinzip zwei kranialen und zwei kaudalen Stellen zugewiesen und dort implantiert.
  • Tabelle 2
    Figure 00090002
  • Die zweite Gruppe, die aus 12 Mäusen (jede mit vier Zusammensetzungen) bestand, wurde gleichmäßig in drei Untergruppen aufgeteilt, um die Chondrozytenaufteilung an den Tagen 14, 28 bzw. 42 nach dem chirurgischen Implantationseingriff zu evaluieren. Um die Chondrozytenaufteilung zu evaluieren, wurde jede gewonnene Zusammensetzung mit 16 μCi/ml [3H]Thymidin 24 Stunden lang in einer Atmosphäre von 92% Luft und 8% CO2 inkubiert. Danach wurde jede Zusammensetzung hydrolysiert und mit 3 ml CYTOSCINTTM (ICN, Costa Mesa, CA) kombiniert. Die Radioaktivität, die aus der Zusammensetzung freigesetzt wurde, wurde mit einem BECKMAN LS5000TD β-Szintillationszähler (Beckman, Fullerton, CA) bestimmt.
  • Die dritte Tiergruppe bestand ebenfalls aus 12 Mäusen und wurde verwendet, um Zusammensetzungen, die daraus gewonnen wurden, mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie zu evaluieren. Fünfzehn 100 μm dicke Abschnitte von experimentellen und Kontroll-Zusammensetzungen wurden unter Verwendung eines 752M VIBROSLICETM Mikrotoms (Campden Instruments LTD, Loughborough, England) hergestellt. Diese Abschnitte wurden danach mit 100 μl Fluoreszenzfärblösung (bestehend aus 3 μl Calcein AM und 8 μl Ethidiumhomodimer in 5 ml PBS; Molecular Probes, Eugene, OR) eine Stunde lang inkubiert. Die Zelllebensfähigkeit innerhalb der Matrix von experimentellen und Kontroll-Knorpelzusammensetzungseinheiten wurde auf frischen 100 μm dicken Abschnitten mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops (Nikon MICROPHOT-FXTM, Garden City, NY) bewertet. Das Calcein wird von den lebenden Zellen aufgenommen und fluoresziert stark grün, was als eine Region mit hoher Lichtintensität auf Schwarz-Weiß-Fotografien zu sehen ist. Das Ethidiumhomodimer dringt passiv in nicht lebende Zellen ein und fluoresziert schwach rot, was als eine Region mit geringer Lichtintensität auf Schwarz-Weiß-Fotografien zu sehen ist.
  • Die Baseline-Werte auf den Zusammensetzungen vor dem Implantieren wurden für das Verbinden (0/16), die Histologie, [3H]Thymidinaufnahme und Fluoreszenz erhalten.
  • Statistische Analyse
  • Ungepaarte Student-t-Tests wurden verwendet, um die Werte für die [3H]Thymidinaufnahme (mittlere ± Standardabweichung) zu vergleichen, die während der untersuchten Zeiträume erfasst wurden. Die Bonferrni-Modifikation wurde angewendet, um eine Typ-I-Fehlerrate von 0,05 über alle Vergleiche hinweg zu erzielen. Außerdem wurden die experimentellen und Kontrollwerte während jeder Sitzung der Studie mit Hilfe von ungepaarten Student-t-Tests verglichen (p < 0,05).
  • ERGEBNISSE
  • Beginnend mit Tag 7 nach der Implantierung wurden faserige Kapseln durch den Fibrinkleber ausgebildet, der zuvor aufgetragen worden war, um die Stücke zusammenzuhalten, und diese verdickten sich im Laufe der Zeit. Die Kapseln wurden zur Evaluierung der Verbindung entfernt. Das Verbinden der experimentellen Matrixen, die mit lebenden Chondrozyten infiltriert worden waren, stieg im Laufe der Zeit an, bis alle Proben ungefähr bei den Tagen 28 bis 42 verbunden waren. Eine makroskopische Ansicht der experimentellen Zusammensetzungen am Tag 42 nach der Implantierung zeigte, dass die Zusammensetzung – obwohl die ursprünglichen Scheiben der Matrix erkennbar waren – zu einer festen Knorpelmasse verbunden war. Zu allen untersuchten Zeitpunkten trennten sich jedoch die Knorpelstücke in den Kontroll-Zusammensetzungen voneinander spontan und unmittelbar nach dem Entfernen der faserigen Kapsel. Somit war die Unterscheidung zwischen erfolgreichem und fehlgeschlagenem Verbinden leicht festzustellen.
  • Die histologische Evaluierung zeigte, dass vor der Implantierung die experimentellen Zusammensetzungen lebende Chondrozyten auf der Oberfläche ihrer entvitalisierten Knorpelscheiben aufwiesen, während in den Kontroll-Zusammensetzungen nur einige Kern-Abfälle von toten Zellen, aber keine lebenden Zellen, gefunden wurden.
  • Die mikroskopische Untersuchung von Knorpelzusammensetzungen, die nach der Implantierung gewonnen wurden, zeigte, dass Chondrozyten an den Kontaktebenen zwischen den allogenen Scheiben der experimentellen Zusammensetzungen eine Matrix bildeten und dass diese neue Knorpelschicht in der Zeit von Tag 7 bis Tag 42 an Dicke zunahm. Am Tag 7 nach der Implantierung wurden lebende Chondrozyten, welche eine Matrix bildeten, auf den Kontaktoberflächen von Knorpelscheiben gefunden, und der Fibrin-Kleber bildete eine relativ dicke Schicht zwischen den Kontaktoberflächen. Am Tag 14 hatte jede Schicht an lebenden Chondrozyten an Dicke zugenommen, und die Fibrin-Kleberschicht war zurückgegangen. Bis zum Tag 21 war der Kontaktraum zwischen den ellipsenförmig geformten allogenen Matrixen mit lebenden Chondrozyten gefüllt, die neue Matrizen bildeten, und der Fibrin-Kleber war großteils absorbiert. 28 Tage nach der Implantierung war die gesamte Kontaktregion zwischen benachbarten Knorpelscheiben mit neuem Knorpel gefüllt. Sprossen neuer Knorpel begannen in die entvitalisierten Matrizen zu wachsen. Am Tag 42 wurde mehr Einwachsung der Sprossen, von denen einige Verzweigungen aufwiesen, festgestellt, und es kam zu einem Verlust von Safranin-O-Färbung der entvitalisierten Matrix um den neuen Knorpel herum, was darauf hinwies, dass matrixerzeugende Chondrozyten in die entvitalisierte Matrix eindrangen. Zu diesem Zeitpunkt hatte neuer Knorpel, dessen Aufbau im Groben jenem von reifem Knorpel entsprach, die Löcher in den Knorpelscheiben, die durch die Nadel entstanden waren, die für den Zusammenbau der Zusammensetzung mit Fibrin-Kleber verwendet wurde, vollständig gefüllt. Auch die Safranin-O-Färbung hatte in dem neuen Knorpel zugenommen. Einige mitotische Figuren wurden in der neuen Knorpelschicht zu jedem Zeitpunkt gefunden.
  • Die Kontroll-Zusammensetzungen wiederum zeigten zu keinem der Zeitpunkte, zu dem Untersuchungen durchgeführt wurden, die Bildung einer neuen Matrix. Ein Schneiden dieser Zusammensetzungen konnte nur aufgrund der umgebenden faserigen Kapsel durchgeführt werden. Die Kapsel färbte sich nur mit dem Fast-Green-Counter-Farbstoffund nicht mit Safranin-O. Es wurden keine lebenden Chondrozyten vorgefunden.
  • Die Prüfung der Chondrozytenaufteilung zeigte eine statistisch signifikante Abnahme von [3H]Thymidinaufnahme in die experimentellen Zusammensetzungen, beginnend mit Tag 0 (ungefähr 85.000 Zählungen pro Minute oder cpm) bis Tag 28 (ungefähr 10.000 cpm), gefolgt von einem Anstieg an Tag 42 (ungefähr 43.000 cpm). Die Unterschiede zu den verschiedenen Zeitpunkten für die experimentellen Zusammensetzungen waren signifikant, wobei p weniger als 0,01 bei dem Student-t-Test ausmachte. Die Aufnahme von [3H]Thymidin in die Kontrollzusammensetzungen unterschied sich zu keinem Zeitpunkt signifikant von der Grundlinie (ungefähr 2.000 cpm). Die Unterschiede zwischen der experimentellen und der Kontrollgruppe waren zu jedem überprüften Zeitpunkt (d. h. an den Tagen 0, 14, 28 und 42) signifikant (p < 0,05).
  • Die Überprüfung der experimentellen Zusammensetzungen mit Fluoreszenzmikroskopie (bei 100X) bestätigte, dass das Wachstum der neuen Matrix bei einem gleichzeitigen interstitiellen Anstieg von lebenden Chondrozyten erfolgte. Die Fluoreszenzfärbung von experimentellen Zusammensetzungen am Tag 42 zeigte, dass die entvitalisierten Matrizen kein Calcein aufnahmen, während die neue Knorpelschicht, die zwischen benachbarten Matrizen ausgebildet worden war, hell mit Calcein fluoreszierte, was auf die Gegenwart von lebenden Zellen in der Schicht hinweist. Sprossen von neuem Knorpel, die hell mit Calcein fluoreszierten, wurden auch beobachtet, als sie in die entvitalisierte Matrix eindrangen. Lebende Cluster von Chondrozyten wurden an den Tagen 28 und 42 innerhalb der allogenen Matrizen festgestellt.
  • Beispiel ll: biochemische Bewertung der Knorpelbindung
  • Um die Festigkeit der Bindung zu testen, die zwischen zwei Knorpelscheiben ausgebildet wurde, so wie in dem Beispiel oben beschrieben, wurde das Paar verbundener Scheiben auf Plexiglasstäbe geklebt und in die Backen einer Testmaschine befestigt. Die verbundenen Scheiben wurden bis auf Zugversagen gezogen, so wie entweder durch sichtbare Trennung der Knorpelscheiben angezeigt oder so lange, bis die gemessene Belastung weniger als 0,05 Newton betrug. Die resultierenden Belastungen wurden auf einem Personal Computer aufgezeichnet und die Daten mit einer Geschwindigkeit von 5 Punkten/Sekunde gesammelt. Die Probenpaare wurden während des gesamten Testverfahrens hindurch mit PBS hydriert gehalten.
  • Angewendete Verschiebungen und gemessene Belastungen wurden auf Probendicke und -fläche normalisiert, wobei unter Verwendung dieser Daten eine Belastungs-Spannungs-Kurve für jede Probe erstellt wurde. Aus der Belastungs-Spannungs-Kurve wurde die Reißfestigkeit (SUTS) durch Prüfung als jene Spannung bestimmt, bei der durch weitere Spannungszunahmen weniger Belastungen erzeugt wurden. Die Bruchspannung (ϵf) wurde ebenfalls durch Überprüfung festgestellt. Die Bruchenergie (Ef), die als die Fläche definiert ist, die bis zum Versagen unter der Belastungs-Spannungs-Kurve ist, wurde numerisch unter Verwendung des Reimann-Summenverfahrens berechnet, wobei das Partitionselement durch den Spannungsintervall zwischen Datenpunkten gegeben war. Der dynamische Festigkeitsmodus (M) für die vorgegebene Belastungsrate jeder Probe wurde als der Anstieg des linearen Abschnitts der Belastungs-Spannungs-Kurve unter Verwendung eines standardmäßigen Fehlerquadratalgorithmus berechnet.
  • Die in nackte Mäuse implantierten Knorpelzusammensetzungen, wie in Beispiel I beschrieben, wurden bis zu sechs Wochen lang in wöchentlichen Abständen entnommen. Die Zugfestigkeit, Bruchspannung, Spannungsenergie und der Zugmodus der Knorpelbindung, die in diesen Zusammensetzungen ausgebildet worden ist, wurde bewertet. Die Werte dieser Parameter zeigen die Verbindungsfestigkeit an. Die in 2A–2D angeführten Daten zeigten, dass die Werte der vier Parameter bei den Knorpelzusammensetzungen, die isolierte Chondrozyten enthielten, deutlich höher waren als bei solchen Zusammensetzungen, die keine Chondrozyten enthielten. Darüber hinaus stiegen die Werte im Laufe der Zeit in den ersteren Zusammensetzungen stetig an, und bis Woche 6 erreichten sie 5–10% der entsprechenden Werte von normalem Gelenksknorpel.
  • Nach den biochemischen Tests wurden Proben zur histologischen Evaluierung entnommen. Die histologische Evaluierung wurde auch auf einigen Proben durchgeführt, die nicht biochemisch getestet wurden. Für eine histologische Analyse vor und nach dem Test wurden Proben in 10% phosphatgepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Es wurden serielle Schnitte mit einer Dicke von 5 μM erhalten und mit Safranin-O gefärbt.
  • Die histologische Analyse von biomechanisch getesteten Proben zeigte, dass es zu einem Bindungsversagen bei der Schnittstelle zwischen dem neuen und dem entvitalisierten Knorpel in den experimentellen Gruppen oder zwischen den zwei Knorpelscheiben im Fall der Kontrollgruppen gekommen ist. Nachdem die zwei Schichten der neuen Matrix ungefähr am Tag 21 fusionierten, wurde kein Versagen mehr in der Dicke des neuen Gewebes beobachtet, aber immer an der Schnittstelle der neu ausgebildeten Matrix und des entvitalisierten Knorpels.
  • Bei Proben, die während des Testverfahrens fixiert wurden, wurde das neu ausgebildete Gewebe von der entvitalisierten Knorpelmatrix weggezogen. Dies war analog zu einem scheinbaren Riss, der sich entlang der Schnittstelle zwischen der neuen und der entvitalisierten Matrix ausbreitete. Eine Beobachtung dieses Prozesses zeigte, dass, in der Nähe der Spitze des Risses, Zellen entlang der Bruchlinie scheinbar in die Richtung langgezogen sind, die senkrecht zu der Linie der Ausbreitung des Risses verläuft. Gelegentlich kam es zu Brüchen an gegenüberliegenden Seiten und beide breiteten sich zum Zentrum hin aus, wobei die Verbindung intakt blieb.
  • In Fällen, in denen Chondrozyten in eine entvitalisierte Matrix eindrangen, kam es zu einem Bruch an der gegenüberliegenden Schnittstelle in 80% der Proben-Schnitte.
  • Wie oben gezeigt, nimmt die Festigkeit der Schnittstelle zwischen dem neuen Gewebe und der bestehenden Matrix im Laufe der Zeit zu, was eine Neumodellierung des neuen Gewebes zeigt, selbst nachdem der Raum zwischen den Matrixstücken mit neuem Gewebe gefüllt worden ist. Obwohl die Gesamtfusion der zwei Schichten von neuer Matrix ungefähr am Tag 21 erfolgte, wie durch die Histologie gezeigt, ergab die biomechanische Studie eine Zunahme der Festigkeit des Reparatwgewebes zu späteren Evaluierungszeitpunkten (Tag 28 und Tag 42). Dieses Phänomen könnte durch die Bildung von Sprossen erklärt werden, die von dem neuen Gewebe in die entvitalisierte Matrix eindringen, wodurch das Konstrukt stabilisiert und die Schnittstelle gestärkt wird; dies stimmt mit histologischen Erkenntnissen überein, dass in 80% der Proben-Schnitte ein Versagen auf der gegenüberliegenden Schnittstelle auftrat, wenn eine Penetration vorhanden war.
  • Beispiel III: Meniskusreparatur
  • Dieses Beispiel verwendet das Knorpelreparaturverfahren von Beispiel I für eine Meniskusreparatur.
  • Gelenksknorpel wurde aus Lammgelenken geerntet und die Chondrozyten wie in Beispiel I oben beschrieben isoliert. Meniskus-Chips wurden aus den Knien von Lämmern derselben Spezies geerntet.
  • Menisken wurden aus nicht verwandten Lämmern geerntet, wobei jeder Meniskus in drei Teile aufgeteilt wurde. Der vaskularisierte Abschnitt wurde aus der avaskulären Zone jedes Teils entfernt, und die Menisken wurden unter Verwendung von fünf Gefrier-/Auftau-Zyklen entvitalisiert. Eine 4 mm lange Korbhenkel-Läsion (auch als Fraktur bezeichnet) wurde in jeden Meniskus ungefähr 2 mm von dem freien Rand der avaskulären Zone geschnitzt.
  • Die entvitalisierten Chips wurden mit Lamm-Chondrozyten co-kultiviert, wie in Beispiel I beschrieben. Die Menisken wurden in vier Gruppen aufgeteilt. In Gruppe A wurde ein mit Chondrozyten geimpfter Chip innerhalb der Korbhenkelfraktur des Meniskus genäht. In Gruppe B wurde ein ungeimpfter Chip auf die Fraktur genäht. In Gruppe C wurde die Meniskusfraktur ohne einen Chip genäht. In Gruppe D wurde die Fraktur nicht behandelt (kein Nähen).
  • Das in Beispiel I beschriebene Fibrin-Klebergel wurde danach auf die Meniskusproben in jeder Gruppe aufgetragen, um die Proben mit dem Gel zu umgeben. Jede der zwei Proben aus jeder Gruppe wurde in die subkutane Tasche einer nackten Maus, bei acht Mäusen insgesamt, implantiert.
  • Nach 14 Wochen wurden die Meniskusproben aus den Mäusen entfernt, grob histologisch untersucht und auf eine Knorpelreparatur, wie in Beispiel I beschrieben, untersucht. Die Proben aus Gruppe A behielten ihre Form und waren vollständig repariert, während die Proben aus den Gruppen B-D keinerlei Hinweise auf eine Reparatur aufwiesen.
  • Beispiel IV: klinische Reparatur von Gelenksknorpel Dieses Beispiel beschreibt ein prophetisches Protokoll (adaptiert aus Chu et al., supra) für das Reparieren eines Vollhaut-Gelenkknorpel-Schadens in einem Kniegelenk eines Menschen. Das chirurgische Verfahren schließt den Eintritt in das Kniegelenk durch einen standardmäßigen Medianschnitt ein. Die beschädigte Gelenksoberfläche wird mit einem Osteotom in einem rechtwinkeligen Muster entfernt. Ungefähr 5 mm subchondraler Knochen werden mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer entfernt. Danach wird das Wirtsbett gemessen.
  • Ein allogenes Transplantat mit ähnlicher Größe und Position wird aus einem frischen Kadaverknie eines gesunden Spenden entfernt. Das Kadaverknie entspricht der Größe nach dem schadhaften Knie, so wie durch die anteroposteriore Abmessung des Schienbeinkopfes auf standardmäßigen Röntgenbildern bestimmt. Der allogene subchondrale Knochen wird mit einem Schneidewerkzeug auf eine Dicke von 5 bis 10 mm geschnitten. Pulsatile Spülung wird verwendet, um zellulare Elemente aus dem Mark auszuspülen. Eine Kleberzusammensetzung, die Fibrin-Gel und Chondrozyten enthält, die aus dem Knochenmark des Patienten gewonnen wurden (ungefähr 106 Zellen/ml), wird auf das Wirtsbett und das allogene Transplantat an Stellen aufgetragen, wo die beiden einander berühren werden. Das allogene Transplantat wird dann in das Wirtsbett eingepresst und ungefähr 1 bis 2 mm oberhalb der Gelenksoberfläche des Wirtsknochens positioniert. Resorbierbare Stifte werden für die vorübergehende interne Fixierung verwendet.
  • Andere Ausführungsformen
  • Es ist zu verstehen werden, dass die Erfindung zwar in Zusammenhang mit der detaillierten Beschreibung derselben dargelegt wurde, dass die vorhergehende Beschreibung jedoch nur erläuternden Charakter hat und den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränkt, der vielmehr durch den Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche definiert wird.

Claims (4)

  1. Verwendung von isolierten Knorpelzellen (Chondrozyten) vermischt mit einem flexiblen, biologisch abbaubaren und biokompatiblen Gel in der Herstellung einer Kleberzusammensetzung für das Behandeln von Knorpelschäden durch das Zusammenkleben von einem 1. Knorpelstück mit einem 2. Knorpelstück
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das 1. Knorpelstück keine lebenden, endogen Chondrozyten enthält
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das 2. Knorpelstück ein fehlerhafter Teil eines Säugetiergelenkes ist.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das flexible, biologischabbaubare und biokompatible Gel ein Fibrin-Gel ist.
DE69831589T 1997-10-30 1998-10-29 Zusammenfügung von knorpelmatrizen unter verwendung isolierter chondrozyten Revoked DE69831589T2 (de)

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