DE69835143T2

DE69835143T2 - Selektion von proteinen mittels rns-protein fusionen

Info

Publication number: DE69835143T2
Application number: DE69835143T
Authority: DE
Inventors: W. Jack Boston SZOSTAK; W. Richard South Pasadena ROBERTS; Rihe Cambridge LIU
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-14
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2018-01-15
Also published as: US6518018B1; IL131016A; CA2278786A1; KR100566859B1; EP0971946B1; TW589323B; ATE332368T1; ES2268763T3; US6207446B1; PT1712623E; ATE529509T1; KR20000070361A; EP0971946A4; JP2002513281A; EP1712623A3; DK0971946T3; IL131016A0; HK1027577A1; US6258558B1; EP1712623B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft Proteinselektionsverfahren.
Die Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter den Förderungen F32 GM 17776-01 und F32 GM 17776-02 gemacht. Die Regierung hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
Es gibt gegenwärtig Verfahren für die Isolierung von RNA- und DNA-Molekülen basierend auf ihren Funktionen. Zum Beispiel zeigten Experimente von Ellington und Szostak (Nature 346:818 (1990) und Nature 355:850 (1992)) und Tuerk und Gold (Science 249:505 (1990) und J. Mol. Biol. 222:739 (1991)), dass sehr seltene (d.h. weniger als 1 pro 1013) Nukleinsäuremoleküle mit gewünschten Eigenschaften aus komplexen Pools von Molekülen durch wiederholte Runden einer Selektion und Amplifikation isoliert werden können. Diese Verfahren bieten Vorteile gegenüber herkömmlichen genetischen Selektionen, dadurch, dass (i) sehr große Kandidatenpools gescreent werden können (> 10¹⁵), (ii) Lebensfähigkeit des Wirts und in vivo-Bedingungen keine kritischen Punkte sind und (iii) Selektionen auch durchgeführt werden können, selbst wenn kein in vivo-genetischer Screen vorhanden ist. Darüber hinaus beschreibt die EP 0 962 527 A ein Molekül, das Genotyp und Phänotyp homologisiert, und Verwendungen davon. Die Leistung einer in vitro-Selektion wurde durch die Definition von neuen RNA- und DNA-Sequenzen mit sehr spezifischen Protein-bindenden Funktionen (vergleiche beispielsweise Tuerk und Gold, Science 249:505 (1990), Irvine et al., J. Mol. Biol. 222:739 (1991), Oliphant et al., Mol. Cell Biol. 9:2944 (1989), Blackwell et al., Science 250:1104 (1990), Pollock und Treisman, Nuc. Acids Res. 18:6197 (1990), Thiesen und Bach, Nuc. Acids Res. 18:3203 (1990), Bartel et al., Cell 57:529 (1991), Stormo und Yoshioka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5699 (1991) und Bock et al., Nature 355:564 (1992)), kleines Molekülbindenden Funktionen (Ellington und Szostak, Nature 346:818 (1990), Ellington und Szostak, Nature 355:850 (1992)) und katalytischen Funktionen (Green et al., Nature 347:406 (1990), Robertson und Joyce, Nature 344:467 (1990), Beaudry und Joyce, Science 257:635 (1992), Bartel und Szostak, Science 261:1411 (1993), Lorsch und Szostak, Nature 371:31-36 (1994), Cuenoud und Szostak, Nature 375:611-614 (1995), Chapman und Szostak, Chemistry and Biology 2:325-333 (1995) und Lohse und Szostak, Nature 381:442-444 (1996)) gezeigt. Ein ähnliches Schema für die Selektion und Amplifikation von Proteinen wurde nicht gezeigt.
Zusammenfassung der Erfindung
Der erfindungsgemäße Zweck ist es, zu ermöglichen, dass die Prinzipien einer in vitro-Selektion und in vitro-Evolution auf Proteine angewendet werden. Die Erfindung erleichtert die Isolierung von Proteinen mit erwünschten Eigenschaften aus großen Pools von teilweise oder vollständig zufälligen Aminosäuresequenzen. Des Weiteren löst die Erfindung das Problem eines Wiederauffindens und einer Amplifizierung der Proteinsequenzinformation durch kovalentes Binden der mRNA-kodierenden Sequenz an das Proteinmolekül.
Im Allgemeinen besteht das erfindungsgemäße Verfahren aus einem in vitro- oder in situ-Transkriptions-/Translationsprotokoll, das Protein erzeugt, das kovalent an das 3'-Ende seiner eigenen mRNA gebunden ist, d.h. eine RNA-Protein-Fusion. Dies erfolgt durch Synthese und in vitro- oder in situ-Translation eines mRNA-Moleküls, bei der ein Peptidakzeptor an das 3'-Ende gebunden ist. Ein bevorzugter Peptidakzeptor ist Puromycin, ein Nukleosidanalogon, das sich an den C-Terminus einer wachsenden Peptidkette anfügt und die Translation terminiert. In einer bevorzugten Gestaltung ist eine DNA-Sequenz zwischen dem Ende der Message und dem Peptidakzeptor vorhanden, die dergestalt ist, dass sie das Ribosom am Ende des offenen Leserahmens pausieren lässt, was zusätzliche Zeit für den Peptidakzeptor (beispielsweise Puromycin) bereitstellt, die entstehende Peptidkette vor Hydrolyse der Peptidyl-tRNA-Bindung aufzunehmen.
Falls gewünscht, ermöglicht die resultierende RNA-Protein-Fusion wiederholte Runden einer Selektion und Amplifikation, da die Proteinsequenzinformation durch reverse Transkription und Amplifikation wieder gewonnen werden kann (beispielsweise durch PCR-Amplifikation, sowie ein jegliches anderes Amplifikationsverfahren, einschließlich RNA-basierende Amplifikationstechniken wie 3SR oder TSA). Die amplifizierte Nukleinsäure kann sodann transkribiert, modifiziert und in vitro- oder in situ-translatiert werden, um mRNA-Protein-Fusionen für die nächste Selektionsrunde zu erzeugen. Die Fähigkeit, mehrere Runden einer Selektion und Amplifika tion durchzuführen, ermöglicht die Anreicherung und Isolierung von sehr seltenen Molekülen, z.B. ein gewünschtes Molekül aus einem Pool von 1015 Mitgliedern. Dies wiederum erlaubt die Isolierung von neuen oder verbesserten Proteinen, die spezifisch nahezu ein jegliches Ziel erkennen oder die gewünschte chemische Reaktion katalysieren.
Dementsprechend wird erfindungsgemäß in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Selektion eines gewünschten Proteins bereitgestellt, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Population von Kandidaten-RNA-Molekülen, die jeweils eine Translationsinitiationssequenz und ein Start-Codon, das an eine Kandidatenprotein-kodierende Sequenz operabel gebunden ist, umfassen und jeweils an einen Peptidakzeptor an dem 3'-Ende der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenz kovalent gebunden sind; (b) in vitro- oder in situ-Translatieren der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenz zur Herstellung einer Population von Kandidaten-RNA-Protein-Fusionen; und (c) Auswählen einer gewünschten RNA-Protein-Fusion, wodurch das gewünschte Protein ausgewählt wird.
In einem verwandten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion eines DNA-Moleküls, das für ein gewünschtes Protein kodiert, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Population von Kandidaten-RNA-Molekülen, die jeweils eine Translationsinitiationssequenz und ein Start-Codon, das an eine Kandidatenprotein-kodierende Sequenz operabel gebunden ist, umfassen und jeweils an einen Peptidakzeptor an dem 3'-Ende der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenz kovalent gebunden sind; (b) in vitro- oder in situ-Translatieren der Kandidatenproteinkodierenden Sequenzen zur Herstellung einer Population von Kandidaten-RNA-Protein-Fusionen; (c) Auswählen einer gewünschten RNA-Protein-Fusion und (d) Erzeugen eines DNA-Moleküls aus dem RNA-Anteil der Fusion, das für das gewünschte Protein kodiert.
In einem weiteren verwandten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion eines Proteins mit einer geänderten Funktion relativ zu einem Referenzprotein, umfassend die Schritte: (a) Herstellen einer Population von Kandidaten-RNA-Molekülen aus einer Population von DNA-Matrizen, wobei die Kandidaten-DNA-Matrizen jeweils eine Kandidatenprotein-kodierende Sequenz aufweisen, die sich von der Referenzprotein-kodierenden Sequenz unterscheidet, wobei die RNA-Moleküle jeweils eine Translationsinitiationssequenz und ein Start-Codon, die an die Kandidatenprotein-kodierende Sequenz operativ gebunden sind, umfassen und jeweils an einen Peptidakzeptor am 3'-Ende kovalent gebunden sind; (b) in vitro- oder in situ-Translatieren der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenzen zur Herstellung einer Population von Kandidaten-RNA-Protein-Fusionen und (c) Auswählen einer RNA-Protein-Fusion mit einer geänderten Funktion, wodurch das Protein mit der geänderten Funktion ausgewählt wird.
In noch einem weiteren verwandten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion eines DNA-Moleküls, das für ein Protein mit einer geänderten Funktion relativ zu einem Referenzprotein kodiert, umfassend die Schritte: (a) Herstellen einer Population von Kandidaten-RNA-Molekülen aus einer Population von Kandidaten-DNA-Matrizen, wobei die Kandidaten-DNA-Matrizen jeweils eine Kandidatenprotein-kodierende Sequenz aufweisen, die sich von der Referenzprotein-kodierenden Sequenz unterscheidet, wobei die RNA-Moleküle jeweils eine Translationsinitiationssequenz und ein Start-Codon, die an die Kandidatenprotein-kodierende Sequenz operabel gebunden sind, umfassen und jeweils an einen Peptidakzeptor an dem 3'-Ende kovalent gebunden sind; (b) in vitro- oder in situ-Translatieren der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenzen zur Herstellung einer Population von RNA-Protein-Fusionen; (c) Auswählen einer RNA-Protein-Fusion mit einer geänderten Funktion und (d) Erzeugen eines DNA-Moleküls aus dem RNA-Anteil der Fusion, das für das Protein mit der geänderten Funktion kodiert.
In noch einem weiteren verwandten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion einer gewünschten RNA, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Population von Kandidaten-RNA-Molekülen, die jeweils eine Translationsinitiationssequenz und ein Start-Codon umfassen, die operabel an eine Kandidatenprotein-kodierende Sequenz gebunden sind, und jeweils an einen Peptidakzeptor an dem 3'-Ende der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenz kovalent gebunden sind; (b) in vitro- oder in situ-Translatieren der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenzen zur Herstellung einer Population von Kandidaten-RNA-Protein-Fusionen und (c) Auswählen einer gewünschten RNA-Protein-Fusion, wodurch die gewünschte RNA ausgewählt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorstehenden Verfahren ist der Peptidakzeptor Puromycin, jedes der Kandidaten-RNA-Moleküle umfasst ferner eine Pausensequenz oder umfasst ferner eine DNA- oder DNA-Analogon-Sequenz, die kovalent an das 3'-Ende der RNA gebunden ist, die Population von Kandidaten-RNA-Molekülen umfasst mindestens 10⁹, vorzugsweise mindestens 10¹⁰, mehr bevorzugt min destens 10¹¹, 10¹² oder 10¹³ und am meisten bevorzugt mindestens 10¹⁴ verschiedene RNA-Moleküle, die in vitro-Translationsreaktion erfolgt in einem Lysat, der aus einer eukaryontischen Zelle oder einem Teil davon hergestellt wird (und erfolgt beispielsweise in einem Retikulozytenlysat oder Weizenkeimlysat), die in vitro-Translationsreaktion erfolgt in einem Extrakt, der aus einer prokaryontischen Zelle (beispielsweise E. coli) oder ein Teil davon hergestellt wird, der Selektionsschritt umfasst eine Bindung des gewünschten Proteins an einen immobilisierten Bindepartner, der Selektionsschritt umfasst ein Testen für eine funktionelle Aktivität des gewünschten Proteins, das DNA-Molekül wird amplifiziert, das Verfahren umfasst ferner ein Wiederholen der Schritte der vorstehend beschriebenen Selektionsverfahren, das Verfahren umfasst ferner eine Transkription eines RNA-Moleküls aus dem DNA-Molekül und eine Wiederholung der Schritte (a) bis (d), das Verfahren umfasst ferner nachfolgend zu dem in vitro-Translationsschritt einen Inkubationsschritt in Gegenwart von 50 bis 100 mM Mg²⁺ und die RNA-Protein-Fusion umfasst ferner eine Nukleinsäure- der Nukleinsäure-Analogon-Sequenz, die proximal zu dem Peptidakzeptor liegt und die die Flexibilität erhöht.
In anderen verwandten Aspekten betrifft die Erfindung eine RNA-Protein-Fusion, die durch ein jegliches der erfindungsgemäßen Verfahren ausgewählt wird, eine Ribonukleinsäure, die kovalent über eine Amidbindung an eine Aminosäuresequenz gebunden ist, wobei die Aminosäuresequenz durch die Ribonukleinsäure kodiert wird, und eine Ribonukleinsäure, die eine Translationsinitiationssequenz und ein Start-Codon umfasst, die operabel mit einer Kandidatenprotein-kodierenden Sequenz verbunden sind, wobei die Ribonukleinsäure kovalent an einen Peptidakzeptor (beispielsweise Puromycin) am 3'-Ende der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenz gebunden ist.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion eines gewünschten Proteins oder einer gewünschten RNA über eine Anreicherung eines Sequenzpools. Dieses Verfahren umfasst die Schritte: (a) Bereitstellen einer Population von Kandidaten-RNA-Molekülen, die jeweils eine Translationsinitiationssequenz und ein Start-Codon, die an eine Kandidatenprotein-kodierende Sequenz operabel gebunden sind, umfassen und jeweils an einen Peptidakzeptor an dem 3'-Ende der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenz kovalent gebunden sind; (b) in vitro- oder in situ-Translatieren der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenzen zur Herstellung einer Population von Kandidaten-RNA-Protein-Fusionen; (c) In-Kontakt-Bringen der Population von RNA-Protein-Fusionen mit einem Bindepartner, der ent weder für den RNA-Anteil oder den Proteinanteil der RNA-Protein-Fusion spezifisch ist, unter Bedingungen, die im wesentlichen die Bindepartner-RNA-Protein-Fusionskomplexe von ungebundenen Mitgliedern der Population trennen; (d) Freisetzen der gebundenen RNA-Protein-Fusionen aus den Komplexen und (e) In-Kontakt-Bringen der Population von RNA-Protein-Fusionen aus Schritt (d) mit einem Bindepartner, der für den Proteinanteil der gewünschten RNA-Protein-Fusion spezifisch ist, unter Bedingungen, die im Wesentlichen den Bindepartner-RNA-Protein-Fusionskomplex von ungebundenen Mitgliedern der Population abtrennen, wodurch das gewünschte Protein und die gewünschte RNA ausgewählt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner eine Wiederholung der Schritte (a) bis (e). Des Weiteren können bezüglich dieser wiederholten Schritte die gleichen oder verschiedene Bindepartner in einer jeglichen Reihenfolge für eine selektive Anreicherung der gewünschten RNA-Protein-Fusion verwendet werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst Schritt (d) die Verwendung eines Bindepartners (beispielsweise eines monoklonalen Antikörpers), der für den Proteinanteil der gewünschten Fusion spezifisch ist. Dieser Schritt erfolgt vorzugsweise nach reverser Transkription des RNA-Anteils der Fusion, um eine DNA zu erzeugen, die für das gewünschte Protein kodiert. Falls erwünscht, kann diese DNA isoliert und/oder durch PCR amplifiziert werden. Diese Anreicherungstechnik kann auch verwendet werden, um ein gewünschtes Protein auszuwählen, oder sie kann verwendet werden, um ein Protein mit einer veränderten Funktion relativ zu einem Referenzprotein zu selektieren.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen der Anreicherungsverfahren ist der Peptidakzeptor Puromycin, ein jedes der Kandidaten-RNA-Moleküle umfasst ferner eine Pausensequenz oder umfasst ferner eine DNA- oder DNA-Analogon-Sequenz, die kovalent an das 3'-Ende der RNA gebunden ist, die Population an Kandidaten-RNA-Molekülen umfasst mindestens 10⁹, vorzugsweise mindestens 10¹⁰, mehr bevorzugt mindestens 10¹¹, 10¹² oder 10¹³ und am meisten bevorzugt mindestens 10¹⁴ verschiedene RNA-Moleküle, die in vitro-Translationsreaktion erfolgt in einem Lysat, der aus einer eukaryontischen Zelle oder einem Teil davon hergestellt wird (und erfolgt beispielsweise in einem Retikulozytenlysat oder Weizenkeimlysat), die in vitro-Translationsreaktion erfolgt in einem Extrakt, der aus einer prokaryontischen Zelle oder einem Teil davon (beispielsweise E. coli) hergestellt wird, das DNA-Molekül wird amplifiziert, mindestens einer der Bindepartner ist auf einem Festträger immobilisiert, das Verfahren umfasst nach dem in vitro-Translationsschritt ferner einen Inkubationsschritt in Gegenwart von 50 bis 100 mM Mg²⁺ und die RNA-Protein-Fusion umfasst ferner eine Nukleinsäure- oder Nukleinsäureanalogon-Sequenz, die proximal zu dem Peptidakzeptor liegt und die die Flexibilität erhöht.
In einem verwandten Aspekt betrifft die Erfindung Kits zum Durchführen eines jeglichen der hier beschriebenen Selektionsverfahren.
In einem dritten und abschließenden Aspekt betrifft die Erfindung einen Mikrochip, der eine Anordnung von immobilisierten einzelsträngigen Nukleinsäuren umfasst, wobei die Nukleinsäuren an RNA-Protein-Fusionen hybridisiert sind. Vorzugsweise wird die Proteinkomponente der RNA-Protein-Fusion durch die RNA kodiert.
Wie hier verwendet, betrifft eine „Population" mehr als ein Molekül (beispielsweise mehr als ein RNA-, DNA- oder RNA-Protein-Fusion-Molekül). Da die erfindungsgemäßen Verfahren Selektionen erleichtern, die, falls gewünscht, mit großen Anzahlen an Kandidatenmolekülen starten, betrifft eine „Population" erfindungsgemäß vorzugsweise mehr als 10⁹ Moleküle, mehr bevorzugt mehr als 10¹¹, 10¹² oder 10¹³ Moleküle und am meisten bevorzugt mehr als 10¹³ Moleküle.
„Selektion" betrifft wesentliches Abtrennen eines Moleküls aus anderen Molekülen in einer Population. Wie hierin verwendet stellt ein „Selektionsschritt" mindestens eine 2-fache, vorzugsweise eine 30-fache, mehr bevorzugt eine 100-fache und am meisten bevorzugt eine 1000-fache Anreicherung eines gewünschten Moleküls im Verhältnis zu ungewünschten Molekülen in einer Population nach dem Selektionsschritt bereit. Wie hier angegeben, kann ein Selektionsschritt beliebig häufig wiederholt werden, und verschiedene Arten an Selektionsschritten können in einem gegebenen Ansatz kombiniert werden.
„Protein" betrifft jegliche zwei oder mehrere natürlicherweise auftretende oder modifizierte Aminosäuren, die durch eine oder mehrere Peptidbindungen verbunden sind. „Protein" und „Peptid" werden hier austauschbar verwendet.
„RNA" betrifft eine Sequenz von zwei oder mehreren kovalent gebundenen, natürlich auftretenden oder modifizierten Ribonukleotiden. Ein Beispiel einer modifizierten RNA, die von diesem Begriff umfasst ist, ist Phosphorothioat-RNA.
„Translationsinitiationssequenz" betrifft eine jegliche Sequenz, die fähig ist, eine funktionelle Ribosomeneintrittsstelle bereitzustellen. In bakteriellen Systemen wird diese Region manchmal als Shine-Dalgarno-Sequenz bezeichnet.
„Start-Codon" betrifft drei Basen, die den Start einer Protein-kodierenden Sequenz signalisieren. Im Allgemeinen sind diese Basen AUG (oder ATG). Jedoch kann ein jegliches anderes Basentriplet, das in dieser Weise verwendet werden kann, substituiert werden.
„Kovalent gebunden" an einen Peptidakzeptor bedeutet, dass der Peptidakzeptor mit einer „Protein-kodierenden Sequenz" entweder direkt über eine kovalente Bindung oder indirekt über eine andere kovalent gebundene Sequenz (beispielsweise DNA, die einer Pausenstelle entspricht) verbunden ist.
„Peptidakzeptor" betrifft ein jegliches Molekül, das an den C-Terminus einer wachsenden Proteinkette durch die katalytische Aktivität der ribosomalen Peptidyltransferasefunktion angefügt werden kann. Typischerweise enthalten solche Moleküle (i) eine Nukleotid- oder Nukleotid-ähnliche Gruppe (beispielsweise Adenosin oder ein Adenosin-Analogon (Di-Methylierung an der N-6-Aminoposition ist annehmbar)), (ii) eine Aminosäure- oder Aminosäure-ähnliche Gruppe (beispielsweise eine jegliche der 20 D- oder L-Aminosäuren oder ein jegliches Aminosäure-Analogon davon (beispielsweise O-Methyltyrosin oder ein jegliches der von Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301, 1991 beschriebenen Analoga)) und (iii) eine Bindung zwischen den zwei (beispielsweise eine Ester-, Amid- oder Ketonbindung an der 3'-Position oder weniger bevorzugt der 2'-Position). Vorzugsweise stört diese Bindung nicht signifikant die Falte des Rings der natürlichen Ribonukleotid-Konformation. Peptidakzeptoren können auch ein Nukleophil aufweisen, die in nicht begrenzender Weise eine Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Sulfhydrylgruppe sein können. Des Weiteren können Peptidakzeptoren aus Nukleotidmimetika, Aminosäuremimetika oder Mimetika der kombinierten Nukleotidaminosäure-Struktur aufgebaut sein.
Peptidakzeptor, positioniert „am 3'-Ende" einer Protein-kodierenden Sequenz bedeutet, dass das Peptidakzeptor-Molekül nach dem letzten Codon der Proteinkodierenden Sequenz positioniert ist. Dieser Begriff umfasst in nicht begrenzender Weise ein Peptidakzeptormolekül, das genau am 3'-Ende der Protein-kodierenden Sequenz positioniert ist, sowie eines, das von dem letzten Codon durch eine dazwischen liegende kodierende oder nicht-kodierende Sequenz getrennt ist (beispielsweise eine Sequenz, die einer Pausenstelle entspricht). Dieser Begriff umfasst auch Konstrukte, bei denen kodierende oder nicht-kodierende Sequenzen dem Peptidakzeptor-Molekül folgen (d.h. sie sind 3' dazu). Des Weiteren umfasst dieser Begriff in nicht begrenzender Weise ein Peptidakzeptormolekül, das kovalent an die Proteinkodierende Sequenz gebunden ist (entweder direkt oder indirekt über eine dazwischen liegende Nukleinsäuresequenz), sowie ein Molekül, das an die Protein-kodierende Sequenz auf nicht-kovalente Art und Weise gebunden ist, beispielsweise durch Hybridisierung unter Verwendung einer zweiten Nukleinsäuresequenz, die bei dem 3'-Ende oder in der Nähe des 3'-Endes der Protein-kodierenden Sequenz bindet und die ihrerseits an ein Peptidakzeptormolekül gebunden ist.
„Geänderte Funktion" betrifft eine jegliche qualitative oder quantitative Veränderung hinsichtlich der Funktion eines Moleküls.
„Pausensequenz" betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die verursacht, dass ein Ribosom seine Translationsgeschwindigkeit verlangsamt oder diese abbricht.
„Bindepartner" betrifft hier ein jegliches Molekül, das eine spezifische, kovalente oder nicht-kovalente Affinität für einen Teil einer gewünschten RNA-Protein-Fusion aufweist. Beispiele für Bindepartner umfassen in nicht begrenzender Weise Mitglieder von Antigen/Antikörper-Paaren, Protein/Inhibitor-Paaren, Rezeptor/Ligand-Paaren (beispielsweise Zelloberflächenrezeptor/Ligand-Paare wie Hormonrezeptor/Peptidhormon-Paare), Enzym/Substrat-Paare (beispielsweise Kinase/Substrat-Paare), Lektin/Kohlenhydrat-Paare, oligomerische oder heterooligomerische Proteinaggregate, DNA-bindendes Protein/DNA-Bindungsstelle-Paare, RNA/Protein-Paare und Nukleinsäureduplexe, -heteroduplexe oder ligierte Stränge, sowie ein jegliches Molekül, das zur Ausbildung von einer oder mehreren kovalenten oder nicht-kovalenten Bindungen (beispielsweise Disulfidbindungen) mit einem jeglichen Teil einer RNA-Protein-Fusion fähig ist. Bindepartner umfassen in nicht begrenzender Weise ein jegliches der in 2 gezeigten „Selektionsmotive".
„Festträger" betrifft in nicht begrenzender Weise jegliche Säulen (oder Säulenmaterialien), Partikel, Teströhrchen, Mikrotiterschalen, Festpartikel (beispielsweise Agarose oder Sepharose), Mikrochips (beispielsweise Silizium-, Silizium-Glas- oder Goldchips) oder Membranen (beispielsweise die Membran eines Liposoms oder eines Vesikels), an die ein Affinitätskomplex entweder direkt oder indirekt (beispielsweise durch andere Bindepartner-Intermediate wie andere Antikörper oder Protein A) ge bunden werden kann, oder in die ein Affinitätskomplex eingebettet werden kann (beispielsweise über einen Rezeptor oder einen Kanal).
Die beanspruchte Erfindung stellt eine Reihe von signifikanten Vorteilen bereit. Zuallererst ist sie das erste Beispiel dieses Schema-Typs für eine Selektion und Amplifizierung von Proteinen. Diese Technik überwindet die Sackgasse, die durch die Notwendig entstand, Nukleotidsequenzen, die gewünschten, isolierten Proteinen entsprechen, wiederzugewinnen (da nur Nukleinsäuren repliziert werden können). Insbesondere traf dies für viele Verfahren im Stand der Technik, die die Isolierung von Proteinen aus teilweise oder vollständig randomisierten Pools ermöglichten, zu, da diese einen in vivo-Schritt aufwiesen. Verfahren dieser Art umfassen monoklonale Antikörper-Technologie (Milstein, Sci. Amer. 243:66 (1980) und Schultz et al., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)), Phagen-Display (Smith, Science 228:1315 (1985), Parmley und Smith, Gene 73:305 (1988) und McCafferty et al., Nature 348:552 (1990)), Peptid-lac-Repressor-Fusionen (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 (1992)) und klassische genetische Selektionen. Im Gegensatz zu der vorliegenden Technik beruht ein jedes dieser Verfahren auf einer topologischen Verbindung zwischen dem Protein und der Nukleinsäure, so dass die Information des Proteins beibehalten wird und in einer lesbaren Nukleinsäureform wieder gewonnen werden kann.
Des Weiteren bietet die vorliegende Erfindung Vorteile gegenüber dem gestoppten Translationsverfahren (Tuerk und Gold, Science 249:505 (1990), Irvine et al., J. Mol. Biol. 222:739 (1991), Korman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1844-1848 (1982), Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 (1994), Mattheakis et al., Meth. Enzymol. 267:195 (1996) und Hanes und Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937 (1997)), eine Technik, bei der eine Selektion für eine Eigenschaft einer entstehenden Proteinkette erfolgt, die immer noch im Komplex mit dem Ribosom und ihrer mRNA vorliegt. Im Gegensatz zu der gestoppten Translationstechnik beruht das vorliegende Verfahren nicht auf einer Aufrechterhaltung der Integrität eines mRNA: Ribosom: entstehende Kette-ternären Komplexes, ein Komplex, der sehr fragil ist und daher im Hinblick auf die Selektionsarten, die technisch machbar sind, begrenzend ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet auch Vorteile gegenüber dem verzweigte Synthese-Verfahren gemäß Brenner und Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383 (1992)), in dem DNA-Peptid-Fusionen hergestellt werden und die ge netische Information theoretisch nach einer Selektionsrunde wieder gewonnen wird. Im Gegensatz zu dem verzweigte Synthese-Verfahren erfordert das erfindungsgemäße Verfahren nicht die Regeneration eines Peptids aus dem DNA-Anteil einer Fusion (was in dem verzweigte Synthese-Ansatz im Allgemeinen durch einzelne Runden einer chemischen Synthese erfolgt). Dementsprechend ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren wiederholte Runden einer Selektion unter Verwendung von Populationen an Kandidatenmolekülen. Des Weiteren ist das erfindungsgemäße Verfahren im Gegensatz zu dem verzweigte Synthese-Verfahren, das im Allgemeinen auf die Selektion von ziemlich kurzen Sequenzen begrenzt ist, auf die Selektion von Proteinmolekülen einer beträchtlichen Länge anwendbar.
In noch einem weiteren Vorteil können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren einer Selektion und gerichteten Evolution sehr große und komplexe Bibliotheken von Kandidatensequenzen verwendet werden. Im Gegensatz dazu sind bestehende Proteinselektionsverfahren, die auf einem in vivo-Schritt beruhen, typischerweise auf verhältnismäßig kleine Bibliotheken einer begrenzten Komplexität beschränkt. Dieser Vorteil ist besonders wichtig, falls auf funktionelle Proteinsequenzen selektiert wird, bedenkt man beispielsweise, dass 10¹³ mögliche Sequenzen für ein Peptid von nur 10 Aminosäuren Länge bestehen. Bei klassischen genetischen Techniken, den lac-Repressor-Fusionsverfahren und Phagen-Display-Verfahren, liegen maximale Komplexitäten im Allgemeinen in Größenordnungen von unter 10¹³ Mitgliedern. Eine große Bibliotheksgröße stellt auch einen Vorteil für Anwendungen mit gerichteter Evolution dadurch bereit, dass ein Sequenzraum in einer größeren Tiefe um eine jegliche bestehende Ausgangssequenz untersucht werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich auch von früheren Ansätzen dadurch, dass der Selektionsschritt Kontext-unabhängig erfolgt. In vielen anderen Selektionsschemata kann der Kontext, in dem beispielsweise ein exprimiertes Protein vorliegt, tief greifend die Art der erzeugten Bibliothek beeinflussen. Zum Beispiel kann ein exprimiertes Protein nicht in einem bestimmten System richtig exprimiert oder kann nicht richtig präsentiert werden (beispielsweise auf der Oberfläche eines Phagenpartikels). Alternativ kann die Expression eines Proteins mit einem oder mehreren kritischen Schritten in einem Selektionszyklus wie der Phagen-Lebensfähigkeit oder Infektiösität oder der lac-Repressor-Bindung interferieren. Diese Probleme können zu einem Verlust von funktionellen Molekülen oder in Begrenzungen hinsichtlich der Art der Selektionsverfahren, die angewendet werden können, führen.
Schlussendlich ist das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft, da es für eine Steuerung des Proteinrepertoirs sorgt, das getestet werden kann. In bestimmten Verfahren (beispielsweise bei der Antikörperselektion) gibt es nur wenig oder keine Kontrolle bezüglich der Art des Ausgangspools. In noch einer weiteren Technik (beispielsweise bei lac-Fusionen und Phagen-Display) muss der Kandidaten-Pool in dem Kontext eines Fusionsproteins exprimiert werden. Im Gegensatz dazu stellen RNA-Protein-Fusionskonstrukte eine Kontrolle hinsichtlich der Art der für ein Screening verfügbaren Kandidaten-Pools bereit. Des Weiteren kann die Kandidaten-Pool-Größe so groß sein wie RNA- oder DNA-Pools (~ 10¹⁵ Mitglieder) und ist lediglich durch die Größe der in vitro-Translationsreaktion, die durchgeführt wird, begrenzt. Der Aufbau des Kandidaten-Pools hängt vollständig lediglich von dem experimentellen Aufbau ab. Zufällige Regionen können isoliert oder innerhalb des Kontextes eines gewünschten Fusionsproteins gescreent werden und die meisten, wenn nicht alle, möglichen Sequenzen können in Kandidaten-Pools von RNA-Protein-Fusionen exprimiert werden.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachstehenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich werden.
Detaillierte Beschreibung
Die Zeichnungen werden zuerst kurz beschrieben werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A-1C sind schematische Darstellungen von Schritten, die bei der Herstellung von RNA-Protein-Fusionen beteiligt sind. 1A zeigt ein Proben-DNA-Konstrukt für eine Erzeugung eines RNA-Anteils einer Fusion. 1B zeigt die Herstellung eines RNA/Puromycin-Konjugats. 1C zeigt die Herstellung einer RNA-Protein-Fusion.
2 ist eine schematische Darstellung eines verallgemeinerten Selektionsprotokolls gemäß der Erfindung.
3 ist eine schematische Darstellung eines Syntheseprotokolls für minimale Translationsmatrizen mit 3'-Puromycin. Schritt (A) zeigt das Anfügen von Schutz gruppen an die reaktiven funktionellen Gruppen von Puromycin (5'-OH und NH₂). In ihrem modifizierten Zustand sind diese Gruppen geeigneterweise für eine Verwendung bei der Phosphoramidit-basierenden Oligonukleotidsynthese geschützt. Das geschützte Puromycin wurde an Aminohexyl-gesteuertes Porenglas (CPG) über die 2'-OH-Gruppe unter Verwendung des Standardprotokolls für ein Anbringen von DNA über ihre 3'-OH-Gruppe gebunden (Gait, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)). Bei Schritt (B) wurde eine minimale Translationsmatrize (als „43-P" bezeichnet) mit 43 Nukleotiden und Verwendung von Standard-RNA- und -DNA-Chemie synthetisiert (Millipore, Bedford, MA), unter Verwendung von NH₄OH und TBAF entschützt und Gel-aufgereinigt. Die Matrize enthielt 13 Basen von RNA an dem 5'-Ende, gefolgt von 29 Basen von DNA, die an das 3'-Puromycin über seine 5'-OH-Gruppe gebunden waren. Die RNA-Sequenz enthielt (i) eine Shine-Dalgarno-Konsensus-Sequenz, die zu 5 Basen von 16S-rRNA komplementär war (Stormo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982), Shine und Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346 (1974) und Steitz und Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738 (1975)), (ii) einen 5-Basen-Spacer und (iii) ein einziges AUG-Start-Codon. Die DNA-Sequenz war dA₂₇dCdCP, worin „P" Puromycin ist.
4 ist eine schematische Darstellung eines bevorzugten Verfahrens für die Herstellung von geschütztem CPG-gekoppelten Puromycin.
5 ist eine schematische Darstellung, die Möglichkeiten für einen Methionineinbau in eine erfindungsgemäße Matrize zeigt. Wie in Reaktion (A) gezeigt, bindet die Matrize an das Ribosom, was die Bildung des 70S-Initiationskomplexes ermöglicht. Fmet-tRNA bindet an die P-Stelle und ist mit der Matrize Basen-gepaart. Das Puromycin am 3'-Ende der Matrize tritt in die A-Stelle in einer intramolekularen Weise ein und bildet eine Amidbindung zu N-Formylmethionin über das Peptidyltransferasezentrum, wodurch die tRNA deacyliert wird. Phenol/Chloroform-Extraktion der Reaktion ergibt die Matrize mit kovalent gebundenem Methionin. In Reaktion (B) ist eine unerwünschte intermolekulare Reaktion der Matrize mit Puromycin-enthaltenden Oligonukleotiden gezeigt. Wie zuvor stimuliert die Minimalmatrize eine Bildung des 70S-Ribosoms, das fmet-tRNA in Bindung an die P-Stelle enthält. Dies wird durch einen Eintritt einer zweiten Matrize in trans gefolgt, was ein kovalent gebundenes Methionin ergibt.
Die 6A-6H sind Fotographien, die den Einbau von ³⁵S-Methionin (³⁵S-Met) in Translationsmatrizen zeigen. 6A zeigt die Magnesium (Mg²⁺)-Abhängigkeit der Reaktion. 6B zeigt die Basenstabilität des Produkts. Die Veränderung hinsichtlich der Mobilität, die in dieser Figur gezeigt ist, entspricht einem Verlust der 5'-RNA-Sequenz von 43-P (auch als „Met-Matrize" bezeichnet), was den DNA-Puromycin-Anteil, als 30-P bezeichnet, produziert. Die Rückbehaltung der Markierung nach einer Basenbehandlung war mit der Bildung einer Peptidbindung zwischen ³⁵S-Methionin und dem 3'-Puromycin der Matrize konsistent. 6C zeigt die Hemmung einer Produktbildung in Gegenwart von Peptidyltransferase-Inhibitoren. 6D zeigt die Abhängigkeit eines ³⁵S-Methionin-Einbaus von einer Matrizen-kodierenden Sequenz. 6E zeigt die Abhängigkeit des ³⁵S-Methionin-Einbaus von der Länge der DNA-Matrize. 6F zeigt eine cis-gegenüber-trans-Produkt-Bildung unter Verwendung der Matrizen 43-P und 25-P. 6G zeigt cis-gegenübertrans-Produkt-Bildung unter Verwendung der Matrizen 43-P und 13-P. 6H zeigt cis-gegenüber-trans-Produkt-Bildung unter Verwendung der Matrizen 43-P und 30-P in einem Retikulozytenlysatsystem.
Die 7A-7C sind schematische Darstellungen von Konstrukten für das Testen der Bildung und Selektion von Peptidfusionen. 7A zeigt LP77 („ligiertes Produkt", „77" Nukleotide lang) (auch als „kurze myc-Matrize" bezeichnet) (SEQ ID NO: 1). Diese Sequenz enthält den c-myc-monoklonaler Antikörper-Epitop-Tag EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 2) (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610-3616 (1985)), flankiert von einem 5'-Start-Codon und einem 3'-Linker. Die 5'-Region enthält eine bakterielle Shine-Dalgarno-Sequenz, die zu der von 43-P identisch ist. Die kodierende Sequenz wurde bezüglich Translation in bakteriellen Systemen optimiert. Insbesondere enthielten die 5'-UTRs von 43-P und LP77 eine Shine-Dalgarno-Sequenz, die zu 5 Basen von 16S-rRNA komplementär (Steitz und Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738 (1975)) und ähnlich zu ribosomalen Proteinsequenzen beabstandet war (Stormo et al., Nucleic Acids Res. 10:2971-2996 (1982)). 7B zeigt LP 154 (ligiertes Produkt, 154 Nukleotide lang) (auch als „lange myc-Matrize" bezeichnet) (SEQ ID NO: 3). Diese Sequenz enthält den Code für die Herstellung des Peptids, das für eine Isolierung des c-myc-Antikörpers verwendet wurde. Das 5'-Ende enthält eine verkürzte Version der TMV-Stromaufwärtssequenz (als „TE" bezeichnet) . Diese 5'-UTR enthielt eine 22 Nukleotide lange Sequenz, die von der 5'-UTR von TMV abgeleitet war, die zwei ACAAAUUAC-direkte Wiederholungen umfasst (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 16:883 (1988)). 7C zeigt Pool #1 (SEQ ID NO: 4), eine beispielhafte Sequenz, die für eine Peptidselektion zu verwenden ist. Die letzten sieben Aminosäuren aus dem ursprünglichen myc-Peptid wurden in die Matrize eingebaut, um als die 3'-konstante Region zu dienen, die für eine PCR-Amplifizierung der Matrize notwendig ist. Es ist bekannt, dass diese Sequenz nicht Teil des Antikörper-bindenden Epitops ist.
8 ist eine Fotographie, die die Synthese von RNA-Protein-Fusionen unter Verwendung der Matrizen 43-P, LP77 und LP154 und von Retikulozyten- („Retic") und Weizenkeimtranslationssystemen („Weizen") zeigt. Die linke Hälfte der Figur zeigt den ³⁵S-Methionin-Einbau in eine jede der drei Matrizen. Die rechte Hälfte der Figur zeigt die sich ergebenden Produkte nach einer RNase A-Behandlung einer jeden der drei Matrizen, um die RNA-kodierende Region zu entfernen. Gezeigt sind ³⁵S-Methionin-markierte DNA-Protein-Fusionen. Der DNA-Anteil war jeweils identisch zu dem Oligo 30-P. Somit waren Unterschiede in der Mobilität proportional zu der Länge der kodierenden Regionen, was mit dem Auftreten von Proteinen unterschiedlicher Länge in jedem Fall konsistent ist.
9 ist eine Fotographie, die die Proteaseempfindlichkeit einer RNA-Protein-Fusion zeigt, die aus LP154 synthetisiert und mittels denaturierender Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert worden war. Spur 1 enthält ³²P-markiertes 30-P. Die Spuren 2-4, 5-7 und 8-10 enthalten die ³⁵S-markierten Translationsmatrizen, die aus Retikulozytenlysat-Reaktionen entweder ohne Behandlung, mit RNase A-Behandlung oder mit RNase A- und Proteinase K-Behandlung wieder gewonnen worden waren.
10 ist eine Fotographie, die die Ergebnisse von Immunpräzipitationsreaktionen unter Verwendung eines in vitro-translatierten 33 Aminosäuren langen myc-Epitop-Proteins zeigt. Die Spuren 1 und 2 zeigen die Translationsprodukte von dem myc-Epitop-Protein bzw. den β-Globin-Matrizen. Die Spuren 3-5 zeigen die Ergebnisse einer Immunpräzipitation des myc-Epitop-Peptids unter Verwendung eines c-myc-monoklonalen Antikörpers und PBS-, DB- bzw. PBSTDS-Waschpuffern. Die Spuren 6-8 zeigen die gleichen Immunpräzipitationsreaktionen unter Verwendung von jedoch dem β-Globin-Translationsprodukt.
11 ist eine Fotographie, die eine Immunpräzipitation einer RNA-Protein-Fusion aus einer in vitro-Translationsreaktion zeigt. Die Picomole von verwendeter Matrize in der Reaktion sind angegeben. Die Spuren 1-4 zeigen RNA124 (der RNA-Anteil der Fusion LP154) und die Spuren 5-7 zeigen die RNA-Protein-Fusion LP154.
Nach Immunpräzipitation unter Verwendung eines c-myc-monoklonalen Antikörpers und von Protein G-Sepharose wurden die Proben mit RNase A und T4-Polynukleotidkinase behandelt und sodann auf ein denaturierendes Harnstoffpolyacrylamidgel geladen, um die Fusion sichtbar zu machen. In den Spuren 1-4 mit Proben, die entweder keine Matrize oder nur den RNA-Anteil der langen myc-Matrize (RNA124) enthielten, war keine Fusion zu erkennen. In den Spuren 5-7 waren Banden, die der Fusion entsprachen, deutlich sichtbar. Die Position von ³²P-markiertem 30-P ist angegeben und die Menge an Einsatz-Matrize ist oben in der Figur angegeben.
12 ist ein Diagramm, das eine Quantifizierung von Fusionsmaterial zeigt, das aus einer in vitro-Translationsreaktion erhalten wurde. Die Intensität der Fusionsbanden, die in den Spuren 5-7 von 11 gezeigt sind, und der 30-P-Bande (in einer parallelen Weise auf dT₂₅ isoliert, nicht gezeigt) wurden auf Phosphorimager-Platten quantifiziert und als eine Funktion der Einsatz-LP154-Konzentration aufgetragen. Wieder gewonnenes modifiziertes 30-P (linke y-Achse) war linear proportional zur Einsatzmatrize (x-Achse), während Linker-Peptid-Fusion (rechte y-Achse) konstant war. Aus dieser Analyse wurde berechnet, dass ~10¹² Fusionen pro ml an Translationsreaktionsprobe gebildet wurden.
13 ist eine schematische Darstellung von Thiopropylsepharose und dT₂₅-Agarose und der Fähigkeit dieser Substrate, mit den erfindungsgemäßen RNA-Protein-Fusionen wechselzuwirken.
14 ist eine Fotographie, die die Ergebnisse einer sequenziellen Isolierung von erfindungsgemäßen Fusionen zeigt. Spur 1 enthält ³²P-markiertes 30-P. Die Spuren 2 und 3 zeigen LP154, das aus Translationsreaktionen isoliert und mit RNase A behandelt worden war. In Spur 2 wurde LP154 sequenziell unter Verwendung von Thiopropylsepharose, gefolgt von dT₂₅-Agarose isoliert. Spur 3 zeigt eine Isolierung unter Verwendung von lediglich dT₂₅-Agarose. Die Ergebnisse zeigten an, dass das Produkt eine freie Thiolgruppe, wahrscheinlich das vorletzte Cystein in der myc-Epitop-kodierenden Sequenz, enthielt.
Die 15A und 15B sind Fotographien, die die Bildung von Fusionsprodukten unter Verwendung von β-Globin-Matrizen wie gemessen durch SDS-Tricin-PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese) zeigen. 15A zeigt den Einbau von ³⁵S unter Verwendung entweder keiner Matrize (Spur 1), einer Syn-β-Globin-Matrize (Spuren 2-4) oder einer LP-β-Globin-Matrize (Spuren 5-7). 15B (Spuren wie in 15A markiert) zeigt ³⁵S-markiertes Material, das durch Oligonukleotid-Affinitätschromatographie isoliert wurde. Kein Material wurde ohne einen 30-P-Schwanz isoliert (Spuren 2-4).
Die 16A-16C sind Diagramme und Fotographien, die die Anreicherung von myc-dsDNA gegenüber Pool-dsDNA durch in vitro-Selektion zeigen. 16A ist ein Schema des Selektionsprotokolls. Vier Gemische der myc- und Pool-Matrizen wurden in vitro translatiert und auf dT₂₅-Agarose, gefolgt von TP-Sepharose isoliert, um die Matrizenfusionen aus nicht-modifizierten Matrizen aufzureinigen. Die mRNA-Peptid-Fusionen wurden sodann revers transkribiert, um eine jegliche sekundäre oder tertiäre Struktur, die in den Matrizen vorhanden ist, zu unterdrücken. Aliquots eines jeden Gemisches wurden sowohl vor (16B), als auch nach (16C) Affinitätsselektion entfernt, durch PCR in Gegenwart eines markierten Primers amplifiziert und mit einem Restriktionsenzym, das nur die myc-DNA spaltet, verdaut. Die Einsatz-Gemische von Matrizen waren reines myc (Spur 1) oder 1:20, 1:200 oder 1:2000 myc:Pool (Spuren 2-4). Das nicht-selektierte Material wich von den Einsatz-Verhältnissen aufgrund einer bevorzugten Translation und reversen Transkription der myc-Matrize ab. Die Anreicherung der myc-Matrize während dem Selektionsschritt wurde aus der Änderung des Pool:myc-Verhältnisses vor und nach Selektion berechnet.
17 ist eine Fotographie, die die Translation von myc-RNA-Matrizen zeigt. Die nachfolgenden Linker wurden verwendet: Spuren 1-4, dA₂₇dCdCP, Spuren 5-8, dA₂₇rCrCP und Spuren 9-12, dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP. In jeder Spur betrug die Konzentration von RNA-Matrize 600 nM und ³⁵S-Met wurde für eine Markierung verwendet. Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Spuren 1, 5 und 9, 30°C für 1 Stunde, Spuren 2, 6 und 10, 30°C für 2 Stunden, Spuren 3, 7 und 11, 30°C für 1 Stunde, –20°C für 16 Stunden, und Spuren 4, 8 und 12, 30°C für 1 Stunde, –20°C für 16 Stunden mit 50 mM Mg²⁺. In dieser Figur stellt „A" freies Peptid dar und „B" stellt mRNA-Peptid-Fusion dar.
18 ist eine Fotographie, die die Translation von mit ³²P-markierten myc-RNA-Matrizen zeigt. Der verwendete Linker war dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP. Eine Translation erfolgte bei 30°C für 90 Minuten und Inkubationen erfolgten bei –20°C für 2 Tage ohne weiteres Mg²⁺. Die Konzentrationen von mRNA-Matrizen betrugen 400 nM (Spur 3), 200 nM (Spur 4), 100 nM (Spur 5) und 100 nM (Spur 6). Spur 1 zeigt eine mit ³⁵S-Met markierte mRNA-Peptid-Fusion. Spur 2 zeigt mit ³²P markierte mRNA. In Spur 6 erfolgte die Reaktion in Gegenwart von 0,5 mM Cap-Analogon.
19 ist eine Fotographie, die die Translation von myc-RNA-Matrize unter Verwendung von Lysat zeigt, das von Ambion (Spur 1), Novagen (Spur 2) und Amersham (Spur 3) erhalten worden war. Der verwendete Linker war dA₂₇dCdCP. Die Konzentration der Matrize betrug 600 nM und ³⁵S-Met wurde für eine Markierung verwendet. Translationen erfolgten bei 30°C für eine Stunde und Inkubationen erfolgten bei –20°C über Nacht in Gegenwart von 50 mM Mg²⁺.
Es wird hier ein allgemeines Verfahren für die Selektion von Proteinen mit erwünschten Funktionen unter Verwendung von Fusionen beschrieben, bei denen diese Proteine kovalent an ihre eigene Messenger-RNA gebunden sind. Diese RNA-Protein-Fusionen werden durch in vitro- oder in situ-Translation von mRNA-Pools mit einem an ihre 3'-Enden angebrachten Peptidakzeptor synthetisiert (1B). In einer bevorzugten Ausführungsform pausiert das Ribosom nach Auslesen des offenen Leserahmens der mRNA, wenn es die entworfene Pausenstelle erreicht, und die Akzeptorgruppe besetzt die ribosomale A-Stelle und empfängt die entstehende Peptidkette von der Peptidyl-tRNA in der P-Stelle, um die RNA-Protein-Fusion zu erzeugen (1C). Die kovalente Verbindung zwischen dem Protein und der RNA (in Form einer Amidbindung zwischen dem 3'-Ende der mRNA und dem C-Terminus des Proteins, das sie kodiert), erlaubt, dass die genetische Information in dem Protein nach einer Selektion durch reverse Transkription der RNA wieder gewonnen und amplifiziert wird (beispielsweise durch PCR). Sobald die Fusion erzeugt ist, erfolgt eine Selektion oder Anreicherung basierend auf den Eigenschaften der mRNA-Protein-Fusion oder alternativ kann eine reverse Transkription unter Verwendung der mRNA-Matrize erfolgen, während sie an das Protein gebunden ist, um eine jegliche Wirkung der einzelsträngigen RNA auf die Selektion zu vermeiden. Wenn das mRNA-Protein-Konstrukt verwendet wird, können selektierte Fusionen getestet werden, um zu bestimmen, welche Gruppe (das Protein, die RNA oder beides) die gewünschte Funktion bereitstellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform fungiert Puromycin (das Tyrosyladenosin darstellt) als der Akzeptor, um das wachsende Peptid an seine mRNA anzufügen. Puromycin ist ein Antibiotikum, das durch Terminierung der Peptidelongation fungiert. Als ein Mimetikum von Aminoacyl-tRNA fungiert es als universeller Hemmstoff der Proteinsynthese durch Bindung an die A-Stelle, Empfangen der wachsen den Peptidkette und Abfallen von dem Ribosom (bei einem Kd = 10^–4 M) (Traut und Monro, J. Mol. Biol. 10:63 (1964), Smith et al., J. Mol. Biol. 13:617 (1965)). Eines der am meisten attraktiven Merkmale von Puromycin ist die Tatsache, dass es eine stabile Amidbindung zu der wachsenden Peptidkette ausbildet, was stabilere Fusionen ermöglicht als mögliche Akzeptoren, die instabile Esterbindungen ausbilden. Insbesondere enthält das Peptidyl-Puromycin-Molekül eine stabile Amidbindung zwischen dem Peptid und dem O-Methyltyrosin-Anteil des Puromycins. Das O-Methyltyrosin ist wiederum durch eine stabile Amidbindung mit der 3-Aminogruppe des modifizierten Adenosin-Anteils von Puromycin verbunden.
Andere Möglichkeiten für Akzeptoren umfassen tRNA-ähnliche Strukturen am 3'-Ende der mRNA, sowie andere Verbindungen, die ähnlich wie Puromycin fungieren. Solche Verbindungen umfassen in nicht begrenzender Weise jegliche Verbindungen, die eine Aminosäure aufweisen, die an ein Adenin oder an eine Adenin-ähnliche Verbindung gebunden ist, z.B. die Aminosäure-Nukleotide, Phenylalanyl-Adenosin (A-Phe), Tyrosyl-Adenosin (A-Tyr) und Alanyl-Adenosin (A-Ala), sowie Amid-gekoppelte Strukturen wie Phenylalanyl-3'-deoxy-3'-aminoadenosin, Alanyl-3'-deoxy-3'-aminoadenosin und Tyrosyl-3'-deoxy-3'-aminoadenosin. In jeglichen dieser Verbindungen können jegliche der natürlich auftretenden L-Aminosäuren oder ihre Analoga verwendet werden. Des Weiteren kann erfindungsgemäß ein kombiniertes tRNA-ähnliches 3'-Struktur-Puromycin-Konjugat verwendet werden.
In 2 ist ein bevorzugtes Selektionsschema gemäß der Erfindung gezeigt. Die bei dieser Selektion beteiligten Schritte werden im Allgemeinen wie folgt ausgeführt.
Schritt 1. Herstellung der DNA-Matrize. Als ein Schritt zur Herstellung der erfindungsgemäßen RNA-Protein-Fusionen wird der RNA-Anteil der Fusion hergestellt. Dies kann durch direkte chemische RNA-Synthese oder häufiger durch Transkription einer geeigneten doppelsträngigen DNA-Matrize erfolgen.
Solche DNA-Matrizen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden (einschließlich einer jeglichen Technik einer rekombinanten DNA-Technologie, chemischer Synthese oder beidem). Im Prinzip kann ein jegliches Verfahren, das eine Herstellung einer oder mehrerer Matrizen mit einer bekannten, zufälligen, randomisierten oder mutagenisierten Sequenz erlaubt, für diesen Zweck verwendet werden. In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Oligonukleotid (beispielsweise mit zufälligen Basen) synthetisiert und vor einer Transkription amplifiziert (beispielsweise durch PCR). Eine chemische Synthese kann auch verwendet werden, um eine zufällige Kassette zu erzeugen, die sodann in die Mitte einer bekannten Proteinkodierenden Sequenz inseriert wird (vgl. beispielsweise Kapitel 8.2, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons und Greene Publishing Company, 1994). Dieser letztere Ansatz erzeugt eine hohe Dichte von Mutationen um eine spezifische interessierende Stelle in dem Protein.
Eine Alternative zu einer Totalrandomisierung einer DNA-Matrizensequenz ist eine teilweise Randomisierung und ein auf diese Art und Weise synthetisierter Pool wird im Allgemeinen als „gedopter" Pool bezeichnet. Ein Beispiel für diese Technik, das mit einer RNA-Sequenz erfolgt, ist beispielsweise durch Ekland et al. (Nucl. Acids Research 23:3231 (1995)) beschrieben. Eine teilweise Randomisierung kann chemisch durch Beeinflussen der Synthesereaktionen erfolgen, so dass jedes Basenadditionsreaktionsgemisch einen Überschuss an einer Base und kleine Mengen einer jeden der anderen enthält. Durch vorsichtige Steuerung der Basenkonzentrationen kann eine erwünschte Mutationshäufigkeit durch diesen Ansatz erreicht werden. Teilweise randomisierte Pools können auch unter Verwendung von PCR-Techniken mit Fehlerraten erzeugt werden, wie beispielsweise in Beaudry und Joyce (Science 257:635 (1992)) und Bartel und Szostak (Science 261:1411 (1993)) beschrieben.
Zahlreiche Verfahren sind auch für eine Herstellung eines DNA-Konstrukts verfügbar, das mit einer bekannten Sequenz startet und sodann einen mutagenisierten DNA-Pool bildet. Beispiele für solche Techniken sind in Ausubel et al. (supra, Kapitel 8) und Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Kapitel 15, Cold Spring Harbor Press, New York, 2. Auflage, 1989) beschrieben. Zufällige Sequenzen können auch durch die in Stemmer (Nature 370: 389 (1994)) beschriebene „Shuffling"-Technik erzeugt werden.
Um ein erfindungsgemäßes Selektionsschema zu optimieren, können auch die Sequenzen und Strukturen an den 5'- und 3'-Enden einer Matrize verändert werden. Vorzugsweise erfolgt dies in zwei getrennten Selektionen, wobei jede die Insertion von zufälligen Domänen in die Matrize proximal zu dem geeigneten Ende, gefolgt von einer Selektion umfasst. Diese Selektionen können dazu dienen, (i) die Menge an hergestellter Fusion zu erhöhen (und somit die Komplexität einer Bibliothek zu maximieren) oder (ii) optimierte Translationssequenzen bereitzustellen. Ferner kann das Verfahren in Kombination mit mutagener PCR auf die Optimierung von Trans lationsmatrizen sowohl in den kodierenden, als auch nicht-kodierenden Regionen allgemein anwendbar sein.
Schritt 2. Herstellung von RNA. Wie vorstehend beschrieben kann der RNA-Anteil einer RNA-Protein-Fusion chemisch unter Verwendung von Standardverfahren einer Oligonukleotidsynthese synthetisiert werden. Alternativ dazu wird insbesondere, wenn längere RNA-Sequenzen verwendet werden, der RNA-Anteil durch in vitro-Transkription einer DNA-Matrize hergestellt. In einem bevorzugten Verfahren wird T7-Polymerase verwendet, um enzymatisch den RNA-Strang herzustellen. Andere geeignete RNA-Polymerasen dafür umfassen in nicht begrenzender Weise die SP6-, T3- und E. coli-RNA-Polymerasen (beschrieben beispielsweise in Ausubel et al., supra, Kapitel 3). Zusätzlich kann die synthetisierte RNA vollständig oder teilweise modifizierte RNA sein. In einem speziellen Beispiel kann Phosphorothioat-RNA unter Verwendung von modifizierten Ribonukleotiden und Standardtechniken hergestellt werden (beispielsweise durch T7-Transkription). Solche modifizierte RNA stellt den Vorteil einer Nukleasestabilität bereit.
Schritt 3. Ligation von Puromycin an die Matrize. Sodann wird Puromycin (oder ein jeglicher anderer geeigneter Peptidakzeptor) kovalent an die Matrizensequenz gebunden. Dieser Schritt kann unter Verwendung von T4-RNA-Ligase erfolgen, um das Puromycin direkt an die RNA-Sequenz anzubringen, oder vorzugsweise kann das Puromycin mit Hilfe eines DNA-„Splints" unter Verwendung von T4-DNA-Ligase oder eines jeglichen anderen Enzyms, das fähig ist, zwei Nukleotidsequenzen miteinander zu verbinden, angebracht werden (vgl. 1B) (vgl. auch beispielsweise Ausubel et al., supra, Kapitel 3, Abschnitte 14 und 15). tRNA-Synthetasen können auch verwendet werden, um Puromycin-ähnliche Verbindungen an RNA anzubringen. Beispielsweise verbindet Phenylalanyl-tRNA-Synthase Phenylalanin mit Phenylalanyl-tRNA-Molekülen mit einer 3'-Aminogruppe, wodurch RNA-Moleküle mit Puromycin-ähnlichen 3'-Enden erzeugt werden (Fraser und Rich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2671 (1973)). Andere Peptidakzeptoren, die verwendet werden können, umfassen in nicht begrenzender Weise eine jegliche Verbindung, die eine Aminosäure aufweist, die mit einer Adenin- oder Adenin-ähnlichen Verbindung gekoppelt ist, wie die Aminosäurenukleotide Phenylalanyladenosin (A-Phe), Tyrosyladenosin (A-Tyr) und Alanyladenosin (A-Ala), sowie Amid-gekoppelte Strukturen wie Phenylalanyl-3'-deoxy-3'-aminoadenosin, Alanyl-3'-deoxy-3'-aminoadenosin und Tyrosil-3'-deoxy-3'-aminoadenosin. In allen diesen Verbindungen können eine jegliche der natürlicherweise auftretenden L-Aminosäuren oder deren Analoga verwendet wer den. Eine Reihe von Peptidakzeptoren sind beispielsweise in Krayevsky und Kukhanova, Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology 23:1 (1979) beschrieben.
Schritt 4. Herstellung und Gewinnung von RNA-Protein-Fusionen. Um RNA-Protein-Fusionen herzustellen, kann ein jegliches in vitro- oder in situ-Translationssystem verwendet werden. Wie nachstehend gezeigt sind eukaryontische Systeme bevorzugt und zwei besonders bevorzugte Systeme umfassen die Weizenkeim- und Retikulozytenlysat-Systeme. Im Prinzip ist jedoch ein jegliches Translationssystem, das die Bildung einer RNA-Protein-Fusion erlaubt und nicht-signifikant den RNA-Anteil der Fusion abbaut, erfindungsgemäß geeignet. Des Weiteren können, um einen RNA-Abbau in einem jeglichen dieser Systeme zu verringern, Abbau-blockierende Antisense-Oligonukleotide in das Translationsreaktionsgemisch eingebaut werden. Solche Oligonukleotide hybridisieren spezifisch mit und decken Sequenzen innerhalb des RNA-Anteils des Moleküls ab, die einen Abbau auslösen (vgl. beispielsweise Hanes und Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937 (1997)).
Wie vorstehend beschrieben ist eine Reihe von eukaryontischen Translationssystemen für eine erfindungsgemäße Verwendung verfügbar. Diese umfassen in nicht begrenzender Weise Lysate aus Hefe, Asziten, Tumorzellen (Leibowitz et al., Meth. Enzymol. 194:536 (1991)) und Oozyten-Eiern von Xenopus. Geeignete in vitro-Translationssysteme aus bakteriellen Systemen umfassen in nicht begrenzender Weise die in Zubay (Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973)), Chen und Zubay (Meth. Enzymol. 101:44 (1983)) und Ellman (Meth. Enzymol. 202:301 (1991)) beschriebenen.
Des Weiteren können Translationsreaktionen in situ erfolgen. In einem spezifischen Beispiel kann eine Translation durch Injektion von mRNA in Xenopus-Eier unter Verwendung von Standardverfahren erfolgen.
Nach ihrer Bildung können RNA-Protein-Fusionen aus dem Translationsreaktionsgemisch durch ein jegliches Standardverfahren einer Protein- oder RNA-Aufreinigung wieder gewonnen werden. Typischerweise werden Protein-Aufreinigungstechniken verwendet. Wie nachstehend gezeigt kann beispielsweise eine Aufreinigung einer Fusion durch die Verwendung von geeigneten chromatographischen Reagenzien wie dT₂₅-Agarose oder Thiopropylsepharose erleichtert werden. Eine Aufreinigung kann jedoch auch oder alternativ eine Aufreinigung basierend auf dem RNA- Anteil der Fusion umfassen. Techniken für eine derartige Aufreinigung sind beispielsweise in Ausubel et al. (supra, Kapitel 4) beschrieben.
Schritt 5. Selektion der gewünschten RNA-Protein-Fusion. Eine Selektion einer gewünschten RNA-Protein-Fusion kann durch ein jegliches Verfahren erfolgen, das verwendbar ist, um selektiv eine gewünschte Fusion von einer Population von Kandidatenfusionen zu partitionieren oder zu isolieren. Beispiele für Isolationstechniken umfassen in nicht begrenzender Weise selektive Bindung, beispielsweise an einen Bindepartner, der direkt oder indirekt an einer Säule, einem Partikel, einer Membran oder einem anderen Festträger immobilisiert ist, und Immunpräzipitation unter Verwendung eines Antikörpers, der für den Proteinanteil der Fusion spezifisch ist. Die erste dieser Techniken verwendet ein immobilisiertes Selektionsmotiv, das aus einer jeglichen Molekülart bestehen kann, an die eine Bindung möglich ist. Eine Liste von möglichen Selektionsmotiv-Molekülen findet sich in 2. Eine Selektion kann auch auf der Verwendung von Substratmolekülen, die an eine Affinitätsmarkierung gebunden sind (beispielsweise Substrat-Biotin), die sich mit einem Kandidatenmolekül umsetzen, oder auf einer jeglichen anderen Art einer Interaktion mit einem Fusionsmolekül basieren. Des Weiteren können Proteine basierend auf ihrer katalytischen Aktivität in einer Weise selektiert werden, die analog zu der von Bartel und Szostak für die Isolierung von RNA-Enzymen beschriebenen (supra) ist. Gemäß dieser spezifischen Technik werden gewünschte Moleküle basierend auf ihrer Fähigkeit ausgewählt, sich selbst mit einem Zielmolekül zu verbinden, und die funktionellen Moleküle werden sodann basierend auf dem Vorhandensein des Ziels isoliert. Selektionsschemata für eine Isolierung neuer oder verbesserter katalytischer Proteine unter Verwendung dieses gleichen Ansatzes oder einer jeglichen anderen funktionellen Selektion sind durch die Erfindung ausführbar beschrieben.
Des Weiteren kann wie hier beschrieben eine Selektion einer gewünschten RNA-Protein-Fusion (oder ihrer DNA-Kopie) durch eine Anreicherung bezüglich der Fusion in einem Pool von Kandidatenmolekülen erleichtert werden. Um eine derartige optionale Anreicherung durchzuführen, wird eine Population von Kandidaten-RNA-Protein-Fusionen mit einem Bindepartner (beispielsweise einem der vorstehend beschriebenen Bindepartner), der für entweder den RNA-Anteil oder den Proteinanteil der Fusion spezifisch ist, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die im Wesentlichen den Bindepartner-Fusions-Komplex von ungebundenen Mitgliedern in der Probe abtrennen. Dieser Schritt kann wiederholt werden und die Technik umfasst vorzugsweise mindestens zwei sequenzielle Anreicherungsschritte, einen, in dem die Fusionen durch Verwendung eines Bindepartners, der für den RNA-Anteil spezifisch ist, ausgewählt werden, und einen anderen, bei dem die Fusionen unter Verwendung eines Bindepartners, der für den Protein-Anteil spezifisch ist, ausgewählt werden. Des Weiteren werden, falls Anreicherungsschritte, die auf den gleichen Anteil der Fusion (beispielsweise den Proteinanteil) abzielen, wiederholt werden, vorzugsweise unterschiedliche Bindepartner verwendet. In einem spezifischen hier beschriebenen Beispiel wird eine Population von Molekülen bezüglich erwünschter Fusionen dadurch angereichert, dass zuerst ein Bindepartner verwendet wird, der für den RNA-Anteil der Fusion spezifisch ist, und sodann in zwei sequenziellen Schritten zwei unterschiedliche Bindepartner verwendet werden, die beide für den Proteinanteil der Fusion spezifisch sind. Erneut können diese Komplexe von Probenbestandteilen durch eine jegliche Standardabtrennungstechnik abgetrennt werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise Säulen-Affinitätschromatographie, Zentrifugation oder Immunpräzipitation.
Darüber hinaus kann eine Elution einer RNA-Protein-Fusion aus einem Anreicherungs- (oder Selektions-) Komplex durch eine Reihe von Verfahren erfolgen. Beispielsweise kann man wie hier beschrieben einen denaturierenden oder nichtspezifischen chemischen Elutionsschritt verwenden, um eine erwünschte RNA-Protein-Fusion zu isolieren. Ein derartiger Schritt erleichtert die Freisetzung von Komplex-komponenten voneinander oder von einem assoziierten Festträger in einer verhältnismäßig nicht-spezifischen Weise durch Aufbrechen von nicht-kovalenten Bindungen zwischen den Bestandteilen und/oder zwischen den Bestandteilen und dem Festträger. Wie hier beschrieben ist ein beispielhaftes denaturierendes oder nicht-spezifisches chemisches Elutionsreagenz 4% HOAc/H₂O. Weitere beispielhafte denaturierende oder nicht-spezifische chemische Elutionsreagenzien umfassen Guanidin, Harnstoff, Hochsalz, Detergenz oder jegliche andere Mittel, durch die nicht-kovalente Addukte im Allgemeinen entfernt werden können. Alternativ kann man einen spezifischen chemischen Elutionsansatz verwenden, bei dem eine Chemikalie eingesetzt wird, die die spezifische Freisetzung eines Fusionsmoleküls bewirkt. In einem speziellen Beispiel können, falls der Linkerarm eines erwünschten Fusionsproteins eine oder mehrere Disulfidbindungen enthält, gebundene Fusionsaptamere durch die Zugabe von beispielsweise DTT eluiert werden, was zu einer Reduktion der Disulfidbindung und einer Freisetzung des gebundenen Ziels führt.
Alternativ kann eine Elution durch spezifische Durchbrechung von Affinitätskomplexen erfolgen. Solche Techniken setzen selektiv Komplexkomponenten durch die Zugabe eines Überschusses an einem Mitglied des Komplexes frei. Beispielsweise erfolgt in einer ATP-bindenden Selektion eine Elution durch die Zugabe von einem Überschuss an ATP zu dem Inkubationsgemisch. Schlussendlich kann man einen Schritt einer enzymatischen Elution durchführen. Durch diesen Ansatz spaltet ein gebundenes Molekül selbst oder eine exogen zugegebene Protease (oder ein anderes geeignetes hydrolytisches Enzym) und setzt entweder das Ziel oder das Enzym frei. In einem speziellen Beispiel kann eine Protease-Zielstelle in eine der Komplexkomponenten eingebaut werden und die gebundenen Moleküle durch Zugabe der Protease eluiert werden. Alternativ kann bei einer katalytischen Selektion eine Elution als ein Selektionsschritt für eine Isolierung von Molekülen verwendet werden, die fähig sind, sich selbst von einem Festträger (beispielsweise durch Spaltung) freizusetzen.
Schritt 6. Herstellung einer DNA-Kopie der RNA-Sequenz unter Verwendung von reverser Transkriptase. Falls erwünscht, ist eine DNA-Kopie einer ausgewählten RNA-Fusionssequenz einfach durch reverse Transkription der RNA-Sequenz unter Verwendung einer jeglichen Standardtechnik verfügbar (beispielsweise unter Verwendung von Superskript-reverser Transkriptase). Dieser Schritt kann vor dem Selektions- oder Anreicherungsschritt (beispielsweise wie in 16 beschrieben) oder nach diesem Schritt erfolgen. Alternativ dazu kann das Verfahren einer reversen Transkription vor der Isolierung der Fusion aus dem in vitro- oder in situ-Translationsgemisch erfolgen.
Sodann wird die DNA-Matrize amplifiziert, entweder als teilweise oder vollständige doppelsträngige Sequenz. Vorzugsweise werden in diesem Schritt Volllängen-DNA-Matrizen erzeugt, wobei geeignete Oligonukleotide und PCR-Amplifikation eingesetzt werden.
Diese Schritte und die Reagenzien und Techniken zur Durchführung dieser Schritte werden nun im Detail unter Verwendung spezieller Beispiele beschrieben. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und sind nicht begrenzend zu verstehen.
HERSTELLUNG FÜR MATRIZEN FÜR RNA-PROTEIN-FUSIONEN
Wie in den 1A und 2 gezeigt, macht das erfindungsgemäße Selektionsschema vorzugsweise Verwendung von doppelsträngigen DNA-Matrizen, die eine Reihe von Designelementen einschließen. Das erste dieser Elemente ist ein Promotor, der in Verbindung mit einer gewünschten RNA-Polymerase für eine mRNA-Synthese zu verwenden ist. Wie in 1A gezeigt und hier beschrieben ist der T7-Promotor bevorzugt, obwohl ein jeglicher anderer Fromotor, der in der Lage ist, eine Synthese von einer linearen doppelsträngigen DNA zu steuern, verwendet werden kann.
Das zweite Element der Matrize, das in 1A gezeigt ist, wird als 5'-nichttranslatierte Region (oder 5'-UTR) bezeichnet und entspricht der RNA, die stromaufwärts von der Translationsstartstelle liegt. In 1A ist eine bevorzugte 5'-UTR (als „TE" bezeichnet) gezeigt, die eine Deletionsmutante der 5'-nichttranslatierten Region von Tabak-Mosaikvirus ist und insbesondere den Basen entspricht, die direkt 5' zu dem TMV-Translationsstart liegen. Die Sequenz dieser UTR ist wie folgt: rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA (die ersten 3 G-Nukleotide sind inseriert, um eine Transkription zu verstärken) (SEQ ID NO: 5). Eine jegliche andere geeignete 5'-UTR kann verwendet werden (vgl. z.B. Kozak, Microbiol. Rev. 47:1 (1983)).
Das dritte Element, das in 1A gezeigt ist, ist die Translationsstartstelle. Im Allgemeinen ist dies ein AUG-Codon. Jedoch gibt es Beispiele, bei denen Codons, die von AUG verschieden sind, in natürlich auftretenden kodierenden Sequenzen verwendet werden, und diese Codons können auch in dem erfindungsgemäßen Selektionsschema verwendet werden.
Das vierte Element in 1A ist der offene Leserahmen des Proteins (als ORF bezeichnet, der für die Proteinsequenz kodiert). Dieser offene Leserahmen kann eine jegliche natürlich auftretende, zufällige, randomisierte, mutagenisierte oder vollständig synthetische Proteinsequenz kodieren.
Das fünfte Element, das in 1A gezeigt ist, ist die 3'-konstante Region. Diese Sequenz erleichtert eine PCR-Amplifizierung der Pool-Sequenzen und eine Ligation des Puromycin-enthaltenen Oligonukleotids an die mRNA. Falls erwünscht, kann diese Region auch eine Pausenstelle umfassen, eine Sequenz, die verursacht, dass das Ribosom pausiert und dadurch einer Akzeptorgruppe (beispielsweise Puromycin) mehr Zeit gibt, eine entstehende Peptidkette von der Peptidyl-tRNA zu empfangen. Diese Pausenstelle ist detaillierter nachstehend beschrieben.
Um die erfindungsgemäße Methodik zu entwickeln, wurden RNA-Protein-Fusionen anfänglich unter Verwendung von hochgradig vereinfachten mRNA-Matrizen mit 1-2 Codons erzeugt. Dieser Ansatz wurde aus zwei Gründen verfolgt. Zuerst konnten Matrizen dieser Größe einfach durch chemische Synthese hergestellt werden. Zweitens erlaubte ein kleiner offener Leserahmen ein einfaches Testen von kritischen Merkmalen der Reaktion, einschließlich Wirksamkeit einer Verbindung, Enden-Heterogenität, Matrizenabhängigkeit und Genauigkeit einer Translation.
Entwerfen des Konstrukts. Ein grundlegendes Konstrukt wurde für eine Erzeugung von Test-RNA-Protein-Fusionen verwendet. Das Molekül bestand aus einer mRNA mit (i) einer Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz für eine Translationsinitiation, die eine 3-Basendeletion der SD-Sequenz von ribosomalem Protein L1 enthielt und zu den 5 Basen von 16S-rRNA komplementär war (d.h. rGrGrA rGrGrA rCrGrA rA) (SEQ ID NO: 6) (Stormo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982), Shine und Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346 (1974) und Steitz und Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738 (1975)), (ii) einem AUG-Start-Codon, (iii) einem DNA-Linker, der als Pausenstelle fungiert (d.h. 5'-(dA)₂₇), (iv) dCdC-3' und (v) einem 3'-Puromycin (P). Die Poly-dA-Sequenz wurde ausgewählt, da bekannt war, dass sie schlecht in der A-Stelle als Matrize für tRNA fungierte (Morgan et al., J. Mol. Biol. 26:477-497 (1967), Ricker und Kaji, Nucleic Acid Research 19:6573-6578 (1991)) und sie entworfen worden war, um als eine gute Pausenstelle zu fungieren. Die Länge des Oligo-dA-Linkers wurde derart ausgewählt, dass er die ~60-70 Å Distanz zwischen der dekodierenden Stelle und dem Peptidyltransferzentrums des Ribosoms überspannt. Das dCdCP ahmte das CCA-Ende einer tRNA nach und wurde derart entworfen, dass es eine Bindung des Puromycins an die A-Stelle des Ribosoms erleichterte.
Chemische Synthese der Minimalmatrize 43-P. Um das Konstrukt 43-P (in 3 gezeigt) zu synthetisieren, wurde Puromycin zuerst an einen Festträger in einer solchen Weise angebracht, dass es mit einer Standardphosphoramidit-Oligonukleotid-Synthesechemie kompatibel sein würde. Das Syntheseprotokoll für dieses Oligo ist schematisch in 3 gezeigt und detaillierter nachstehend beschrieben. Um Puromycin an einen Festträger aus gesteuertem Porenglas (CPG) anzubringen, wurde die Aminogruppe mit einer Trifluoracetylgruppe wie in dem Applied Biosystems Verwenderbulletin #49 für das DNA-Synthesegerät Modell 380 (1988) beschrieben geschützt. Sodann erfolgte ein Schützen der 5'-OH-Gruppe unter Verwendung eines Standard-DMT-CI-Ansatzes (Gait, Oligonucleotide Synthesis, A practical approach, The Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)) und ein Binden an Aminohexyl-CPG über die 2'-OH-Gruppe wurde in genau der gleichen Weise bewirkt, wie die 3'-OH-Gruppe für eine Bindung eines Desoxynukleosids verwendet werden würde (vgl. 3 und Gait, supra, S. 47). Das 5'-DMT-CPG-gekoppelte geschützte Puromycin war sodann für eine Kettenverlängerung mit Phosphoramiditmonomeren geeignet. Die Synthese des Oligos schritt in der 3' → 5'-Richtung in der Reihenfolge voran: (i) 3'-Puromycin, (ii) pdCpdC, (iii) ~27 Einheiten von dA als Linker, (iv) AUG und (v) Shine-Dalgarno-Sequenz. Die Sequenz des 43-P-Konstrukts ist nachstehend gezeigt.
Synthese von CPG-Puromycin. Die Synthese von geschütztem CPG-Puromycin folgte dem allgemeinen Weg, der wie zuvor beschrieben für Desoxynukleoside verwendet wurde (Gait, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)). Hauptsächliche Abweichungen umfassen die Auswahl einer geeigneten N-Blockierungsgruppe, ein Anbringen an der 2'-OH-Gruppe an den Festträger und die Kopplungsreaktion an den Festträger. Im letzteren Fall erfolgte die Reaktion bei sehr niedrigen Konzentrationen von aktiviertem Nukleotid, da dieses Material signifikant teurer war als der Festträger. Die sich ergebende Ausbeute (~20 μmol/g Träger) war ziemlich zufriedenstellend, wenn man die verdünnten Reaktionsbedingungen berücksichtigt.
Synthese von N-Trifluoracetylpuromycin. 267 mg (0,490 mmol) Puromycin·HCl wurde zuerst in die Form einer freien Base durch Lösen in Wasser, Zugabe von Carbonatpuffer, pH 11, und Extraktion (3X) in Chloroform konvertiert. Die organische Phase wurde zur Trockne verdampft und abgewogen (242 mg, 0,513 mmol). Die freie Base wurde sodann in 11 ml trockenem Pyridin und 11 ml trockenem Acetonitril gelöst und 139 μl (2,0 mmol) Triethylamin (TEA) und 139 μl (1,0 mmol) Trifluoressigsäureanhydrid (TFAA) wurden unter Rühren zugegeben. TFAA wurde sodann zu der trüben Lösung in 20 μl-Aliquots zugegeben, bis kein Ausgangsmaterial verblieb, wie durch Dünnschichtchromatographie (tlc) gemessen wurde (93:7, Chloroform/MeOH) (insgesamt 280 μl). Die Reaktion schritt eine Stunde voran. Zu diesem Zeitpunkt zeigten sich zwei Banden in einer Dünnschichtchromatographie, die beide eine höhere Mobilität aufwiesen als das Ausgangsmaterial. Eine Aufarbeitung der Reaktion mit NH₄OH und Wasser verringerte das Produkt zu einer einzelnen Bande. Silicachromatographie (93:7 Chloroform/MeOH) ergab 293 mg (0,515 mmol) des Produkts, N-TFA-Pur. Das Produkt dieser Reaktion ist schematisch in 4 gezeigt.
Svnthese von N-Trifluoracetvl-5'-DMT-Puromycin. Das Produkt aus der vorstehenden Reaktion wurde aliquotiert und 2X mit trockenem Pyridin co-verdampft, um Wasser zu entfernen. Mehrere Röhrchen wurden hergestellt, um mehrere Reaktionsbedingungen zu testen. In einem kleinen Maßstab wurden 27,4 mg (48,2 μmol) N-TFA-Pur in 480 μl Pyridin mit 0,05 eq DMAP und 1,4 eq TEA gelöst. Zu diesem Gemisch wurden 20,6 mg Tritylchlorid (60 μmol) gegeben, und es wurde der Reaktion ermöglicht, zur Vollständigkeit unter Rühren voranzuschreiten. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens an Wasser (etwa 500 μl) zu der Lösung abgestoppt. Da diese Reaktion erfolgreich zu sein schien, wurde eine Version im großen Maßstab durchgeführt. Insbesondere wurden 262 mg (0,467 mmol) N-TFA-Pur in 2,4 ml Pyridin gelöst, gefolgt von einer Zugabe von 1,4 eq TEA, 0,05 eq DMAP und 1,2 eq Tritylchlorid. Nach etwa zwei Stunden wurden weitere 50 mg (0,3 eq) Dimethoxytrityl·Cl (DMT·Cl) zugegeben und der Reaktion wurde ermöglicht, 20 weitere Minuten voranzuschreiten. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 3 ml Wasser abgestoppt und dreimal mit CH₃CN co-verdampft. Die Reaktion wurde durch 95:5 Chloroform/MeOH auf einer Säule mit 100 ml Silica (trocken) und einem Durchmesser von 2 mm aufgereinigt. Aufgrund einer unvollständigen Aufreinigung erfolgte ein zweiter Lauf auf einer identischen Säule mit 97,5:2,5 Chloroform/MeOH. Die Gesamtausbeute betrug 325 mg oder 0,373 mmol (oder eine Ausbeute von 72%). Das Produkt dieser Reaktion ist schematisch in 4 gezeigt.
Svnthese von N-Trifluoracetyl-5'-DMT-2'-succinylpuromycin. In einer Reaktion in kleinem Maßstab wurden 32 mg (37 μmol) des vorstehend synthetisierten Produkts mit 1,2 eq DMAP, gelöst in 350 μl Fyridin, kombiniert. Zu dieser Lösung wurden 1,2 Äquivalente Bernsteinsäureanhydrid in 44 μl trockenem CH₃CN zugegeben und über Nacht rühren gelassen. Dünnschichtchromatographie zeigte wenig verbliebenes Ausgangsmaterial. In einer Reaktion in großem Maßstab wurden 292 mg (336 μmol) des vorigen Produkts mit 1,2 eq DMAP in 3 ml Pyridin vereinigt. Dazu wurden 403 μl 1 M Bernsteinsäureanhydrid in trockenem CH₃CN gegeben und das Gemisch über Nacht rühren gelassen. Dünnschichtchromatographie zeigte erneut wenig verbliebenes Ausgangsmaterial. Die zwei Reaktionen wurden vereinigt und weitere 0,2 eq DMAP und Succinat zugegeben. Das Produkt wurde mit Toluol einmal co-verdampft und zu einem gelben Schaum unter stark vermindertem Druck getrocknet. CH₂Cl₂ wurde zugegeben (20 ml) und diese Lösung wurde zweimal mit 15 ml 10% eiskalter Zitronensäure und sodann zweimal mit reinem Wasser extrahiert. Das Produkt wurde getrocknet, in 2 ml CH₂Cl₂ erneut gelöst und durch Zugabe von 50 ml Hexan unter Rühren ausgefällt. Das Produkt wurde sodann vortexiert und bei 600 UpM 10 Minuten in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert. Die Hauptmenge des Elutionsmittels wurde abgezogen und der Rest des Produkts wurde zuerst bei gering vermindertem Druck und sodann bei stark vermindertem Druck in einem Desikator getrocknet. Die Ausbeute dieser Reaktion betrug etwa 260 μmol für eine schrittweise Ausbeute von ~70%.
Synthese von N-Trifluouracetyl-5'-DMT-2'-succinyl-CPG-puromycin. Das Produkt aus dem vorhergehenden Schritt wurde sodann mit 1 ml Dioxan, gefolgt von 0,2 ml Dioxan/0,2 ml Pyridin gelöst. Zu dieser Lösung wurden 40 mg p-Nitrophenol und 140 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gegeben und der Reaktion wurde ermöglicht, 2 Stunden voranzuschreiten. Der unlösliche Cyclohexylharnstoff, der durch diese Reaktion produziert wurde, wurde durch Zentrifugation entfernt und die Produktlösung wurde zu 5 g Aminohexyl-gesteuertem Porenglas (CPG), suspendiert in 22 ml trockenem DMF, gegeben und über Nacht gerührt. Das Harz wurde sodann mit DMF, Methanol und Ether gewaschen und getrocknet. Das sich ergebende Harz enthielt 22,6 μmol Trityl pro Gramm, was gut innerhalb des akzeptablen Bereichs für diesen Trägertyp liegt. Der Träger wurde sodann durch Inkubation mit 15 ml Pyridin, 1 ml Essigsäureanhydrid und 60 mg DMAP für 30 Minuten gecappt. Das sich ergebende Säulenmaterial ergab einen negativen (keine Farbe) Ninhydrintest, im Gegensatz zu den Ergebnissen, die vor einer Blockierung erhalten wurden, worin das Material eine dunkelblaue Farbreaktion erzeugte. Das Produkt dieser Reaktion ist schematisch in 4 gezeigt.
Synthese von mRNA-Puromycin-Konjugat. Wie vorstehend beschrieben kann ein Oligo mit Puromycin auf zweierlei Art und Weise verwendet werden, um ein mRNA-Puromycin-Konjugat herzustellen, das als Translationsmatrize fungiert. Bezüglich extrem kurzer offener Leserahmen wird das Puromycin-Oligo typischerweise chemisch mit RNA- oder DNA-Monomeren verlängert, um eine vollständig synthetische Matrize herzustellen. Wenn längere offene Leserahmen erwünscht sind, wird das RNA- oder DNA-Oligo im Allgemeinen an das 3'-Ende einer mRNA unter Verwendung eines DNA-Splints und T4-DNA-Ligase wie von Moore und Sharp beschrieben (Science 256:992 (1992)) ligiert.
IN VITRO-TRANSLATION UND TESTEN VON RNA-PROTEIN-FUSIONEN
Die vorstehend erzeugten Matrizen wurden in vitro unter Verwendung von sowohl bakterieller als auch eukaryontischer in vitro-Translationssysteme wie folgt translatiert.
In vitro-Translation von Minimalmatrizen. 43-P und verwandte RNA-Puromycin-Konjugate wurden zu mehreren unterschiedlichen in vitro-Translationssysteme gegeben, einschließlich: (i) des S30-Systems, das von E. coli MRE600 abgeleitet ist (Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973), Collins, Gene 6:29 (1979), Chen und Zubay, Methods Enzymol., 101:44 (1983), Pratt, in Transcription and Translation: A Practical Approach, B.D. Hammes, S.J. Higgins, Hrsg. (IRL Press, Oxford, 1984) Seiten 179-209 und Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991)), hergestellt wie von Ellman et al. (Methods Enzymol. 202:301 (1991)) beschrieben, (ii) der ribosomalen Fraktion, die von dem gleichen Stamm abgeleitet ist, hergestellt wie beschrieben von Kudlicki et al. (Anal. Chem. 206:389 (1992)) und (iii) des S30-Systems, das von E. coli BL21 abgeleitet ist, hergestellt wie von Lesley et al. beschrieben (J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)). In jedem Fall war der verwendete Vormix der von Lesley et al. (J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)) und die Inkubationen erfolgten für 30 Minuten Dauer.
Testen der Art der Fusion. Die 43-P-Matrize wurde zuerst unter Verwendung von S30-Translationsextrakten aus E. coli getestet. 5 (Reaktion „A") zeigt die erwünschte intramolekulare (cis) Reaktion, bei der 43-P an das Ribosom bindet und als eine Matrize für und einen Empfänger von fMet zur gleichen Zeit dient. Der Einbau von ³⁵S-Methionin und seine Position in der Matrize wurden zuerst getestet und die Ergebnisse sind in den 6A und 6B gezeigt. Nach einer Extraktion des in vitro-Translationsreaktionsgemisches mit Phenol/Chloroform und einer Analyse des Produkts durch SDS-PAGE erschien eine ³⁵S-markierte Bande mit der gleichen Mobilität wie die 43-P-Matrize. Die Menge dieses synthetisierten Materials war von der Mg²⁺-Konzentration abhängig (6A). Die optimale Mg²⁺-Konzentration schien zwischen 9 und 18 mM zu liegen, was ähnlich zu dem Optimum für eine Translation in diesem System lag (Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen und Zubay, Methods Enzymol., 101:44 (1983); Pratt, in Transcription and Translation: A Practical Approach, B.D. Hammes, S. J. Higgins, Hrsg. (IRL Press, Oxford, 1984), Seiten 179-209; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991); Kudlicki et al., Anal. Chem. 206:389 (1992) und Lesley et al., J.
Biol. Chem. 266:2632 (1991)). Ferner war die eingebaute Markierung gegenüber einer Behandlung mit NH₄OH stabil (6B), was anzeigt, dass die Markierung an der 3'-Hälfte des Moleküls (der basenstabile DNA-Anteil) lag und durch eine basenstabile Bindung gebunden war, wie für eine Amidbindung zwischen Puromycin und fMet erwartet.
Ribosomen- und Matrizenabhängigkeit. Um zu zeigen, dass die vorstehend beobachtete Reaktion an dem Ribosom erfolgte, wurden die Wirkungen spezifischer Inhibitoren der Peptidyltransferasefunktion des Ribosoms getestet (6C) und die Wirkung einer Veränderung der für Methionin kodierenden Sequenz wurde untersucht (6D). 6C zeigt deutlich, dass die Reaktion stark durch die Peptidyltransferase-Inhibitoren Virginiamycin, Gougerotin und Chloramphenicol gehemmt wurde (Monro und Vazquez, J. Mol. Biol. 28:161-165 (1967) und Vazquez und Monro, Biochemica et Biophysical Acta 142:155-173 (1967)). 6D zeigt, dass eine Veränderung einer einzigen Base in der Matrize von A zu C einen Einbau von ³⁵S-Methionin bei 9 mM Mg²⁺ beseitigte und stark bei 18 mM verringerte (konsistent mit der Tatsache, dass hohe Mengen an Mg²⁺ ein falsches Lesen der Message ermöglichen). Diese Experimente zeigten, dass die Reaktion an dem Ribosom in einer matrizen-abhängigen Weise stattfand.
Linkerlänge. Auch getestet wurde die Abhängigkeit der Reaktion von der Länge des Linkers (6E). Die ursprüngliche Matrize wurde derart entworfen, dass der Linker die Distanz von der dekodierenden Stelle (durch das AUG der Matrize besetzt) bis zu der Akzeptorstelle (von der Puromycingruppe besetzt), eine Entfernung, die etwa die gleiche Länge aufwies wie die Entfernung zwischen der Anti-Codon-Schleife und dem Akzeptor-Arm in einer tRNA oder etwa 60-70 Å, überspannte. Der erste getestete Linker war 30 Nukleotide lang, basierend auf einem Minimum von 3,4 Å pro Base (≥ 102 Å). In einem Bereich zwischen 30 und 21 Nukleotiden (n = 27-18; Länge ≥ 102-71 Å) war eine geringe Veränderung in der Wirksamkeit der Reaktion zu erkennen. Dementsprechend kann die Linkerlänge variiert werden. Während ein Linker von 21-30 Nukleotiden eine bevorzugte Länge darstellt, können Linker, die kürzer als 80 Nukleotide sind, und vorzugsweise kürzer als 45 Nukleotide sind, auch erfindungsgemäß verwendet werden.
Intramolekulare gegenüber intermolekularen Reaktionen. Schlussendlich wurde getestet, ob die Reaktion in einer intramolekularen Weise (5, Reaktion „A") wie erwünscht oder intermolekular (5, Reaktion „B") stattfand. Dies wurde durch Zugabe von Oligonukleotiden mit 3'-Puromycin, jedoch ohne Ribosomenbindesequenz (d.h. Matrizen 25-P, 13-P und 30-P) zu den Translationsreaktionen mit der 43-P-Matrize getestet (6F, 6G und 6H). Falls die Reaktion durch einen intermolekularen Mechanismus erfolgte, würden auch die kürzeren Oligos markiert werden. Wie in den 6F-6H gezeigt, fand wenig Einbau von ³⁵S-Methionin in die drei kürzeren Oligos statt, was anzeigt, dass die Reaktion vorherrschend in einer intramolekularen Weise stattfand. Die Sequenzen von 25-P (SEQ ID NO: 10), 13-P (SEQ ID NO: 9) und 30-P (SEQ ID NO: 8) sind nachstehend gezeigt.
Retikulozytenlysat. 6H zeigt, dass ³⁵S-Methionin in die 43-P-Matrize unter Verwendung eines Kaninchen-Retikulozytenlysats (vergleiche nachstehend) für eine in vitro-Translation zusätzlich zu den vorstehend verwendeten E. coli-Lysaten eingebaut werden kann. Diese Reaktion erfolgte wie erwünscht hauptsächlich in einer intramolekularen Weise.
SYNTHESE UND TESTEN VON FUSIONEN MIT EINEM C-MYC-EPITOP-TAG
Beispielhafte Fusionen wurden auch erzeugt, die innerhalb des Proteinanteils den Epitop-Tag für den c-myc-monoklonalen Antikörper 9E10 enthielten (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610 (1985)).
Entwurf von Matrizen. Drei anfängliche Epitop-Tag-Matrizen (d.h. LP77, LP154 und Pool # 1) wurden entworfen und sind in den 7A-C gezeigt. Die ersten zwei Matrizen enthielten die c-myc-Epitop-Tag-Sequenz EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 2) und die dritte Matrize war der Entwurf, der bei der Synthese eines zufälligen Selektionspools verwendet wurde. LP77 kodierte eine 12 Aminosäuren lange Sequenz, wobei die Codons für eine bakterielle Translation optimiert worden waren. LP 154 und seine Derivate enthielten eine 33 Aminosäuren lange mRNA-Sequenz, bei der die Codons für eine eukaryontische Translation optimiert worden waren. Die kodierte Aminosäuresequenz von MAEEQKLISEEDLLRKRREQKLKHKLEQLRNSCA (SEQ ID NO: 7) entsprach dem ursprünglichen Peptid, das verwendet worden war, um den 9E10-Antikörper zu isolieren. Pool # 1 enthielt 27 Codons von NNG/C (um zufällige Peptide zu erzeugen), gefolgt von einer Sequenz, die den letzten sieben Aminosäuren des myc-Peptids entsprach (die nicht Teil der myc-Epitopsequenz waren). Diese Sequenzen sind nachstehend gezeigt.
Retikulozyten- gegenüber Weizenkeim-in vitro-Translationssystemen. Die 43-P-, LP77- und LP154-Matrizen wurden in sowohl Kaninchen-Retikulozyten-, als auch Weizenkeimextrakt- (Promega, Boehringer Mannheim) Translationssystemen getestet (8).
Translationen erfolgten 60 Minuten bei 30°C. Matrizen wurden unter Verwendung von dT₂₅-Agarose bei 4°C isoliert. Die Matrizen wurden aus der Agarose mit Hilfe von 15 mM NaOH, 1 mM EDTA, neutralisiert mit NaOAc/HOAc-Puffer, eluiert, unmittelbar mit Ethanol (2,5-3 vol) ausgefällt, gewaschen (mit 100% Ethanol) und auf einem Speedvac-Konzentrationsgerät getrocknet. 8 zeigt, dass ³⁵S-Methionin in alle drei Matrizen, sowohl in den Weizenkeim-, als auch in den Retikulozytensystemen, eingebaut wurde. Weniger Abbau der Matrize wurde in den Fusionsreaktionen des Retikulozytensystems festgestellt und dementsprechend ist dieses System für die Herstellung von RNA-Protein-Fusionen bevorzugt. Des Weiteren sind im Allgemeinen eukaryontische Systeme gegenüber bakteriellen Systemen bevorzugt. Da eukaryontische Zellen dazu neigen, niedrigere Mengen an Nukleasen zu enthalten, ist die Lebensdauer von mRNA im Allgemeinen 10-100-fach länger in diesen Zellen als in bakteriellen Zellen. In Experimenten mit einem spezifischen E. coli-Translationssystem wurde eine Bildung von Fusionen bei Verwendung einer Matrize, die für das c-myc-Epitop kodierte, nicht beobachtet. Eine Markierung der Matrize an verschiedenen Stellen zeigte, dass dies möglicherweise an einem Abbau von sowohl den RNA-, als auch DNA-Anteilen der Matrize lag.
Um den Peptidanteil dieser Fusionen zu untersuchen, wurden Proben mit RNase behandelt, um die kodierenden Sequenzen zu entfernen. Nach dieser Behandlung lief das 43-P-Produkt mit annähernd einer identischen Mobilität wie das ³²P-markierte 30-P-Oligo, was mit einem zu dem 30-P hinzugefügten kleinen Peptid (möglicherweise nur Methionin) übereinstimmt. Im Fall von LP77 erzeugte die Entfernung der kodierenden Sequenz ein Produkt mit einer geringeren Mobilität als das 30-P-Oligo, was mit der Feststellung übereinstimmt, dass ein 12 Aminosäuren langes Peptid zu dem Puromycin hinzugefügt wurde. Schlussendlich erzeugte im Fall von LP 154 ein Entfernen der kodierenden Sequenz ein Produkt mit einer noch geringeren Mobilität, was mit einem Anfügen einer 33 Aminosäuren langen Sequenz an das 30-P-Oligo übereinstimmt. Kein Oligo war in der RNase-behandelten LP154-Retikulozytenspur aufgrund eines Beladungsfehlers zu erkennen. In 9 zeigte sich, dass die Mobilität dieses Produkts gleich zu der des Produkts ist, das in dem Weizenkeimextrakt erzeugt wurde. Zusammengefasst wiesen diese Ergebnisse darauf hin, dass RNase-beständige Produkte an die Enden des 30-P-Oligos angefügt worden waren, dass die Größen der Produkte proportional zu der Länge der kodierenden Sequenzen waren und dass die Produkte ziemlich homogen in der Größe waren. Des Weiteren schien, obwohl beide Systeme ähnliche Fusionsprodukte produzierten, das Retikulozytensystem aufgrund einer höheren Matrizenstabilität überlegen.
Empfindlichkeit gegenüber RNase A und Proteinase K. In 9 wurden die Empfindlichkeit gegenüber RNase A und Proteinase K unter Verwendung der LP154-Fusion getestet. Wie in den Spuren 2-4 gezeigt, wurde ein Einbau von ³⁵S-Methionin für die LP154-Matrize gezeigt. Wenn dieses Produkt mit RNase A behandelt wurde, nahm die Mobilität der Fusion ab, war jedoch immer noch signifikant größer als die des ³²P-markierten 30-P-Oligonukleotids, was mit dem Anfügen eines 33 Aminosäuren langen Peptids an das 3'-Ende übereinstimmt. Wenn dieses Material auch mit Proteinase K behandelt worden war, verschwand das ³⁵S-Signal vollständig, was erneut mit der Feststellung übereinstimmt, dass die Markierung in einem Peptid am 3'-Ende des 30-P-Fragments vorlag. Ähnliche Ergebnisse wurden in gleichwertigen Experimenten unter Verwendung der 43-P- und LP77-Fusionen erhalten.
Um zu bestätigen, dass die Matrizenmarkierung durch ³⁵S-Met eine Konsequenz einer Translation war und spezifischer aus der Peptidyltransferase-Aktivität des Ribosoms resultierte, wurde die Wirkung verschiedener Inhibitoren auf die Markierungsreaktion untersucht. Die spezifischen Inhibitoren einer eukaryontischen Peptidyltransferase, Anisomycin, Gougerotin und Sparsomycin (Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis (Springer-Verlag, New York), Seite 312 (1979)), sowie die Translokationsinhibitoren Cycloheximid und Emetin (Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis (Springer-Verlag, New York), S. 312 (1979)) verringerten alle eine Bildung von RNA-Peptid-Fusionen um ~95% bei Verwendung der langen myc-Matrize und eines Retikulozytenlysat-Translationsextrakts.
Immunpräzipitationsexperimente. In einem Experiment, das dergestalt war, um die Wirksamkeit einer Immunpräzipitation einer mRNA-Peptid-Fusion zu zeigen, wurde der Versuch unternommen, ein freies c-myc-Peptid, das durch in vitro-Translation erzeugt wurde, immun zu fällen. 10 zeigt die Ergebnisse dieser Experimente, die auf einem SDS-PAGE-Peptidgel getestet wurden. Die Spuren 1 und 2 zeigen das markierte Material aus Translationsreaktionen mit entweder RNA124 (der RNA-Anteil von LP 154) oder β-Globin-mRNA. Die Spuren 3-8 zeigen die Immunpräzipitation dieser Reaktionsproben unter Verwendung des c-myc-monoklonalen Antikörpers 9E10 unter mehreren verschiedenen Pufferbedingungen (nachstehend beschrieben). Die Spuren 3-5 zeigen, dass das von RNA 124 abgeleitete Peptid wirksam immunpräzipitiert wurde, wobei der beste Fall Spur 4 war, wo ~83% des gesamten TCA-präzipitierbaren Signals isoliert wurden. Die Spuren 6-8 zeigen wenig β-Globin-Protein, was eine Aufreinigung von > 100-fach anzeigt. Diese Ergebnisse zeigten, dass das durch RNA 124 (und LP 154) kodierte Peptid quantitativ durch dieses Immunpräzipitationsprotokoll isoliert werden kann.
Immunpräzipitation der Fusion. Sodann wurde die Möglichkeit getestet, ein chimäres RNA-Peptid-Produkt unter Verwendung einer LP154-Translationsreaktion und des c-myc-monoklonalen Antikörpers 9E10 immunzupräzipitieren (11). Die Translationsprodukte aus einer Retikulozytenreaktion wurden durch Immunpräzipitation (wie hier beschrieben) isoliert und mit 1 μg RNase A bei Raumtemperatur 30 Minuten behandelt, um die kodierende Sequenz zu entfernen. Dies schuf eine 5'-OH-Gruppe, die mit T4-Polynukleotidkinase ³²P-markiert und durch denaturierende PAGE getestet wurde. 11 zeigt, dass ein Produkt mit einer Mobilität ähnlich zu der, die für die Fusion des c-myc-Epitops mit 30-P, erzeugt durch RNase-Behandlung der LP154-Fusion (vgl. vorstehend) festgestellt wurde, isoliert wurde, dass jedoch kein entsprechendes Produkt hergestellt wurde, wenn nur der RNA-Anteil der Matrize (RNA 124) translatiert wurde. In 12 wurde die Quantität des isolierten Fusionsproteins bestimmt und gegen die Menge an nicht modifiziertem 30-P aufgetragen (nicht in dieser Figur gezeigt). Eine Quantifizierung des Verhältnisses von unmodifiziertem Linker zu Linker-myc-Peptid-Fusion zeigt, dass 0,2 bis 0,7% der Einsatz-Message zu Fusionsprodukt umgewandelt wurde. Ein höherer Anteil der Einsatz-RNA wurde zu Fusionsprodukt in Gegenwart eines höheren Ribosomen/Matrizen-Verhältnisses umgewandelt. Über den Bereich an Einsatz-mRNA-Konzentrationen, die getestet wurden, wurden etwa 0,8 bis 1,0 × 10¹² Fusionsmoleküle pro ml Translationsextrakt hergestellt.
Des Weiteren zeigten die Ergebnisse, dass die an die RNA-Spezies gebundenen Peptide durch diese mRNA kodiert wurden, d.h. das entstehende Peptid wurde nicht auf das Puromycin irgendeiner anderen mRNA übertragen. Kein Anzeichen einer Kreuzübertragung war zu erkennen, wenn ein Linker (30-P) mit der langen myc-Matrize in Translationsextrakten in Verhältnissen von so hoch wie 20:1 co-inkubiert wurde. Genauso wenig verringerte die Anwesenheit von freiem Linker signifikant die Menge an produzierter langer myc-Fusion. In ähnlicher Weise produzierte eine Co-Translation der kurzen und langen Matrizen, 43-P und LP154, nur die Fusionsprodukte, die zu erkennen waren, wenn die Matrizen alleine translatiert wurden, und keine Produkte einer intermediären Mobilität wurden beobachtet, wie für eine Fusion der kurzen Matrize mit dem langen myc-Peptid erwartet werden würde. Beide diese Ergebnisse legten nahe, dass eine Fusionsbildung hauptsächlich zwischen einem entstehenden Peptid und mRNA, die an das gleiche Ribosom gebunden ist, auftrat.
Sequenzielle Isolierung. Als eine weitere Bestätigung der Art des in vitro-translatierten LP154-Matrizenprodukts wurde das Verhalten dieses Produkts auf zwei unterschiedlichen Arten von chromatographischen Medien untersucht. Thiopropyl (TP-Sepharose) erlaubt die Isolierung eines Produkts mit einem freien Cystein (beispielsweise das LP154-Produkt, das einen zu dem C-Terminus benachbarten Cysteinrest aufweist) (13). In ähnlicher Weise ermöglicht dT₂₅-Agarose die Isolierung von Matrizen mit einer Poly-dA-Sequenz (beispielsweise 30-P) (13). 14 zeigt, dass eine sequenzielle Isolierung von TP-Sepharose, gefolgt von dT₂₅-Agarose das gleiche Produkt erzeugte, wie eine Isolierung auf dT₂₅-Agarose allein. Die Tatsache, dass das in vitro-Translationsprodukt sowohl einen Poly-A-Trakt, als auch ein freies Thiol enthielt, wies deutlich darauf hin, dass das Translationsprodukt die erwünschte RNA-Peptid-Fusion war.
Die vorstehenden Ergebnisse sind mit der Fähigkeit konsistent, mRNA-Peptid-Fusionen zu synthetisieren und diese intakt aus in vitro-Translationsextrakten wiederzugewinnen. Die Peptid-Anteile von Fusionen, die so synthetisiert wurden, schienen die beabsichtigten Sequenzen aufzuweisen, wie durch Immunpräzipitation und Isolierung oder Verwendung geeigneter chromatographischer Techniken gezeigt wurde. Gemäß den vorstehend beschriebenen Ergebnissen sind die Reaktionen intramolekular und erfolgen in einer Matrizen-abhängigen Weise. Schlussendlich erleichtert das erfindungsgemäße System sogar bei einer Matrizen-Modifikation von weniger als 1% Selektionen auf der Basis von Kandidatenkomplexitäten von etwa 10¹³ Molekülen.
C-Myc-Epitop-Wiedergewinnungsselektion. Um weitere c-myc-Epitope auszuwählen, wird eine große Bibliothek von Translationsmatrizen (beispielsweise 10¹⁵ Mitglieder) mit einer randomisierten Region erzeugt (vgl. 7C und nachstehend). Diese Bibliothek wird verwendet, um ~10¹²-10¹³ Fusionen (wie hier beschrieben) zu erzeugen, die mit dem Anti-c-myc-Antikörper (beispielsweise durch Immunpräzipi tation oder Verwendung eines auf einer Säule oder einem anderen Festträger immobilisierten Antikörpers) behandelt werden, um bezüglich c-myc-kodierender Matrizen in wiederholten Runden einer in vitro-Selektion anzureichern.
Modelle für Fusionsbildung. Ohne auf eine bestimmte Theorie beschränkt werden zu wollen, wird ein Modell für den Mechanismus einer Fusionsbildung vorgeschlagen, in dem eine Translation normal initiiert wird und eine Elongation zu dem Ende des offenen Leserahmens voranschreitet. Wenn das Ribosom den DNA-Anteil der Matrize erreicht, stoppt die Translation. An diesem Punkt hat der Komplex zwei Möglichkeiten: Dissoziation des entstehenden Peptids oder Transfer des entstehenden Peptids auf das Puromycin am 3'-Ende der Matrize. Die Wirksamkeit der Transferreaktion wird wahrscheinlich durch eine Reihe von Faktoren gesteuert, die die Stabilität des gestoppten Translationskomplexes und den Eintritt des 3'-Puromycinrestes in die A-Stelle des Peptidyltransferasezentrums beeinflussen. Nach der Transferreaktion verbleibt die mRNA-Peptid-Fusion wahrscheinlich in einem Komplex mit dem Ribosom, da die bekannten Freisetzungsfaktoren die stabile Amidbindung zwischen den RNA- und Peptiddomänen nicht hydrolysieren können.
Sowohl das klassische Modell einer Elongation (Watson, Bull. Soc. Chim. Biol. 46:1399 (1964)), als auch das Modell eines Intermediatzustandes (Moazed und Noller, Nature 342:142 (1989)) erfordern, dass die A-Stelle für einen Eintritt von Puromycin in das Peptidyltransferasezentrum leer ist. Damit das Puromycin in die leere A-Stelle eintritt, muss der Linker entweder um das äußere des Ribosoms eine Schleife bilden oder direkt von der dekodierenden Stelle über die A-Stelle in das Peptidyltransferasezentrum eintreten. Die hier beschriebenen Daten unterscheiden nicht deutlich zwischen diesen Alternativen, da der kürzeste getestete Linker (21 Nukleotide) immer noch lang genug ist, um die Außenseite des Ribosoms zu umwinden. In manchen Modellen einer Ribosomenstruktur (Frank et al., Nature 376:441 (1995)) ist die mRNA durch einen Kanal gewunden, der sich auf beiden Seiten der dekodierenden Stelle erstreckt, wobei in diesem Fall eine Entwindung des Linkers von dem Kanal erforderlich sein würde, um dem Puromycin zu erlauben, das Peptidyltransferasezentrum durch die A-Stelle zu erreichen.
Ein Transfer des entstehenden Peptids auf das Puromycin schien im Verhältnis zu dem Elongationsprozess langsam, wie durch die Homogenität und Länge des an den Linker gebundenen Peptids gezeigt. Falls das Puromycin wirksam mit Aminoacyl-tRNAs während einer Elongation kompetitierte, würde man erwarten, dass die Lin ker-Peptid-Fusionen in den Fusionsprodukten eine heterogene Größe aufwiesen. Ferner schien das Ribosom nicht in die Linkerregion zu lesen, wie durch die Ähnlichkeit hinsichtlich der Gelmobilitäten zwischen der Met-Matrizenfusion und dem unmodifizierten Linker angezeigt. dA_3n sollte für (Lysin)_n kodieren, was sicherlich die Mobilität des Linkers verringern würde. Die niedrige Geschwindigkeit einer Entwindung der mRNA kann die niedrige Geschwindigkeit einer Fusionsbildung im Verhältnis zu der Translokationsgeschwindigkeit erklären. Vorläufige Ergebnisse legen nahe, dass die Menge an gebildetem Fusionsprodukt nach einer ausgedehnten Posttranslation-Inkubation bei niedriger Temperatur merklich zunimmt, möglicherweise aufgrund der verlängerten Zeitspanne, die für einen Transfer des entstehenden Peptids auf das Puromycin verfügbar ist.
GENAUE BESCHREIBUNG DER MATERIALEN UND METHODEN
Nachstehend sind Materialien und Methoden, die die in vitro-Translation und ein Testen von RNA-Protein-Fusionen, einschließlich Fusionen mit einem myc-Epitop-Tag betreffen, genau beschrieben.
Sequenzen. Eine Reihe von Oligonukleotiden wurde vorstehend für die Erzeugung von RNA-Protein-Fusionen verwendet. Diese Oligonukleotide weisen die nachstehenden Sequenzen auf.
Alle Oligonukleotide sind in 5'- nach 3'-Richtung aufgeführt. Ribonukleotidbasen sind durch ein kleines „r" vor der Bezeichnung des Nukleotids angegeben. P ist Puromycin und rN zeigt gleiche Mengen von rA, rG, rC und rU an. rS zeigt gleiche Mengen von rG und rC an und alle anderen Basenbezeichnungen beschreiben DNA-Oligonukleotide.
Chemikalien. Puromycin-HCl, langkettiges Alkylamin-gesteuertes Porenglas, Gougerotin, Chloramphenicol, Virginiamycin, DMAP, Dimethyltritylchlorid und Essigsäureanhydrid wurden von Sigma Chemical (St. Louis, MO) bezogen. Pyridin, Dimethyl formamid, Toluol, Bernsteinsäureanhydrid und para-Nitrophenol wurden von Fluka Chemical (Ronkonkoma, NY) bezogen. Beta-Globin-mRNA wurde von Novagen (Madison, WI) bezogen. TMV-RNA wurde von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) bezogen.
Enzyme. Proteinase K wurde von Promega (Madison, WI) bezogen. DNase-freie RNase wurde entweder gemäß Sambrook et al. (supra) hergestellt oder von Boehringer Mannheim bezogen. T7-Polymerase wurde durch das veröffentlichte Protokoll von Grodberg und Dunn (J. Bacteriol. 170:1245 (1988)) mit den Modifikationen von Zawadzki und Gross (Nucl. Acids Res. 19:1948 (1991)) hergestellt. T4-DNA-Ligase wurde von New England Biolabs (Beverly, MA) bezogen.
Ouantifizierung eines Einbaus von Radiomarkierung. Für radioaktive Gelbanden wurde die Menge an Radiomarkierung (³⁵S oder ³²P) in jeder Bande durch entweder Quantifizierung auf einem Betagen 603-Blot-Analysegerät (Betagen, Waltham, MA) oder durch Verwendung von Phosphorimagerplatten (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) bestimmt. Für flüssige und feste Proben wurde die Menge an vorhandener Radiomarkierung (³⁵S oder ³²P) durch Szintillationszählen (Beckman, Columbia, MD) bestimmt.
Gelbilder. Bilder von Gelen wurden durch Autoradiographie (unter Verwendung von Kodak XAR-Film) oder durch Verwendung von Phosphorimagerplatten (Molecular Dynamics) erhalten.
Synthese von CPG-Puromycin. Detaillierte Protokolle einer Synthese von CPG-Puromycin sind vorstehend beschrieben.
Enzymatische Reaktionen. Im Allgemeinen war die Herstellung von Nukleinsäuren für Kinase-, Transkriptions-, PCR- und Translationsreaktionen unter Verwendung von E. coli-Extrakten identisch. Jedes präparative Protokoll startete mit einer Extraktion unter Verwendung eines gleichen Volumens von 1:1 Phenol/Chloroform, gefolgt von einer Zentrifugation und Isolierung der wässrigen Phase. Natriumacetat (pH 5,2) und Spermidin wurden in einer Endkonzentration von 300 mM bzw. 1 mM zugegeben und die Probe wurde durch Zugabe von 3 Volumina 100%iges Ethanol und Inkubation bei –70°C für 20 Minuten ausgefällt. Proben wurden bei > 12000 g zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Pellets mit einem Überschuss an 95% Ethanol bei 0°C gewaschen. Die sich ergebenden Pellets wurden sodann unter vermindertem Druck getrocknet und resuspendiert.
Oligonukleotide. Die gesamte synthetische DNA und RNA wurde auf einem Millipore Expedite-Synthesegerät unter Verwendung von Standardchemie wie von dem Hersteller bereitgestellt (Milligen, Bedford, MA) synthetisiert. Oligonukleotide mit 3'-Puromycin wurden unter Verwendung von CPG-Puromycinsäulen, die mit 30-50 mg Festträger (~20 μmol Puromycin/Gramm) gepackt worden waren, synthetisiert. Oligonukleotide mit einem 3'-Biotin wurden unter Verwendung von 1 μmol bioteg-CPG-Säulen von Glen Research (Sterling, VA) synthetisiert. Oligonukleotide mit einem 5'-Biotin wurden durch Zugabe von bioteg-Phosphoramidit (Glen Research) als die 5'-Base synthetisiert. Oligonukleotide für eine Ligation an die 3'-Enden von RNA-Molekülen wurden entweder am 5'-Ende (unter Verwendung von chemischem Phosphorylierungsreagenz von Glen Research) vor einer Entschützung chemisch phosphoryliert oder unter Verwendung von ATP und T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) nach einer Entschützung enzymatisch phosphoryliert. Proben mit nur DNA (und 3'-Puromycin oder 3'-Biotin) wurden durch Zugabe von 25% NH₄OH gefolgt von einer Inkubation für 12 Stunden bei 55°C entschützt. Proben mit RNA-Monomeren (wie 43-P) wurden durch Zugabe von Ethanol (25% v/v) zu der NH₄OH-Lösung und Inkubation für 12 Stunden bei 55°C entschützt. Die 2'OH-Gruppe wurde unter Verwendung von 1 M TBAF in THF (Sigma) 48 Stunden bei Raumtemperatur entschützt. TBAF wurde unter Verwendung einer NAP-25-Sephadex-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) entfernt.
Entschützte DNA- und RNA-Proben wurden sodann unter Verwendung von denaturierender PAGE, gefolgt von entweder Saug- oder Elektroeluierung aus dem Gel unter Verwendung einer Elutrap (Schleicher und Schuell, Keene, NH) und Entsalzen unter Verwendung entweder einer NAP-25-Sephadex-Säule oder Ethanolpräzipitation wie vorstehend beschrieben aufgereinigt.
Myc-DNA-Konstruktion. Zwei DNA-Matrizen mit dem c-myc-Epitop-Tag wurden konstruiert. Die erste Matrize wurde aus einer Kombination der Oligonukleotide 64.27 (5'-GTT CAG GTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT TTC GTC CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3') (SEQ ID NO: 18) und 18.109 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-31 (SEQ ID NO: 19) hergestellt. Eine Transkription unter Verwendung dieser Matrize erzeugte RNA 47.1, die für das Peptid MEQKLISEEDLN (SEQ ID NO: 20) kodierte. Eine Ligation von RNA 47.1 an 30-P ergab LP77, das in 7A gezeigt ist.
Die zweite Matrize wurde zuerst als ein einzelnes Oligonukleotid mit 99 Basen Länge, der Bezeichnung RWR 99.6 und der Sequenz 5' AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG TTC CAG TTT GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTC TTC AGA GAT CAG TTT CTG TTC TTC AGC CAT-3' (SEQ ID NO: 21) hergestellt. Doppelsträngige Transkriptionsmatrizen mit dieser Sequenz wurden durch PCR mit den Oligos RWR 21.103 (5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-31 (SEQ ID NO: 22) und RWR 63.26 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA GAA CAG AAA CTG-31 (SEQ ID NO: 23) gemäß veröffentlichten Protokollen konstruiert (Ausubel et al., supra, Kapitel 15). Eine Transkription unter Verwendung dieser Matrize erzeugte eine als RNA 124 bezeichnete RNA, die für das Peptid MAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA (SEQ ID NO: 24) kodierte. Dieses Peptid enthielt die Sequenz, die für eine Erzeugung von monoklonalem Antikörper 9E10 bei einer Konjugation an ein Trägerprotein verwendet wurde (Oncogene Science Technical Bulletin). RNA124 war 124 Nukleotide lang und eine Ligation von RNA 124 an 30-P erzeugte LP 154, das in 7B gezeigt ist. Die Sequenz von RNA 124 ist wie folgt (SEQ ID NO: 32): 5'-rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrG rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA rGrArA rGrArC rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG rCrUrG rArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGrCrU-3'
Herstellung des randomisierten Pools. Der randomisierte Pool wurde als einzelnes Oligonukleotid mit 130 Basen Länge, bezeichnet als RWR130.1, hergestellt. Beginnend am 3'-Ende war die Sequenz 3' CCCTGTTAATGATAAATGTTAATGTTAC (NNS)₂₇ GTC GAC GCA TTG AGA TAC CGA-5' (SEQ ID NO: 25). N bezeichnet eine zufällige Position und diese Sequenz wurde gemäß dem Standard-Syntheseprotokoll erzeugt. S bezeichnet ein gleiches Gemisch von dG- und dC-Basen. Eine PCR erfolgte mit den Oligonukleotiden 42.108 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA) (SEQ ID NO: 26) und 21.103 (5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG) (SEQ ID NO: 27). Eine Transkription von dieser Matrize erzeugte eine als Pool 130.1 bezeichnete RNA. Eine Ligation von Pool 130.1 an 30-P ergab Pool # 1 (auch als LP160 bezeichnet), wie in 7C gezeigt.
Sieben Zyklen einer PCR erfolgten gemäß veröffentlichten Protokollen (Ausubel et al., supra) mit den folgenden Ausnahmen: (i) die Ausgangskonzentration von RWR130.1 war 30 Nanomolar, (ii) jeder Primer wurde bei einer Konzentration von 1,5 μM verwendet, (iii) die dNTP-Konzentration betrug 400 μM für jede Base und (iv) die Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim) wurde bei 5 Einheiten pro 100 μl verwendet. Das doppelsträngige Produkt wurde durch nicht-denaturierende PAGE aufgereinigt und durch Elektroelution isoliert. Die Menge an DNA wurde sowohl durch UV-Absorption bei 260 nm, als auch durch Ethidiumbromid-Fluoreszenzvergleich mit bekannten Standards bestimmt.
Enzymatische Synthese von RNA. Transkriptionsreaktionen von doppelsträngiger PCR-DNA und synthetischen Oligonukleotiden erfolgten wie beschrieben (Milligan und Uhlenbeck, Meth. Enzymol. 180:51 (1989)). Volllängen-RNA wurde durch denaturierende PAGE aufgereinigt, elektroeluiert und wie vorstehend beschrieben entsalzt. Die Pool-RNA-Konzentration wurde unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1300 O.D./μmol, 1250 O.D./μmol für RNA 124 und 480 O.D./μmol für RNA 47.1 bestimmt. Eine Transkription von doppelsträngiger Pool-DNA erzeugte 90 Nanomol von Pool-RNA.
Enzymatische Synthese von RNA-Puromycin-Konjugaten. Eine Ligation der myc- und Pool-Messenger-RNA-Sequenzen an das Puromycin-enthaltende Oligonukleotid erfolgte unter Verwendung eines DNA-Splints, bezeichnet als 19.35 (5'-TTT TTT TTT TAG CGC AAG A) (SEQ ID NO: 28) und eines Verfahrens, das zu dem von Moore und Sharp (Science 250:992 (1992)) analog ist. Die Reaktion bestand aus mRNA, Splint und Puromycin-Oligonukleotid (30-P, dA27dCdCP) in einem Molverhältnis von 0,8 : 0,9 : 1,0 und 1-2,5 Einheiten DNA-Ligase pro Picomol Pool-mRNA. Reaktionen erfolgten eine Stunde bei Raumtemperatur. Für die Konstruktion der Pool-RNA-Fusionen betrug die mRNA-Konzentration ~6,6 μmolar. Nach einer Ligation wurde das RNA-Puromycin-Konjugat wie vorstehend für enzymatische Reaktion beschrieben hergestellt. Das Präzipitat wurde resuspendiert und Volllängen-Fusionen durch denaturierende PAGE aufgereinigt und durch Elektroelution wie vorstehend beschrieben isoliert. Die Pool-RNA-Konzentration wurde unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1650 O.D./μmol und 1600 O.D./μmol für die myc-Matrize bestimmt. Dadurch wurden 2,5 Nanomol Konjugat erzeugt.
Herstellung von dT₂₅-Streptavidin-Agarose. dT₂₅ mit einem 3'-Biotin (synthetisiert auf bioteg-Phosphoramiditsäulen (Glen Research)) wurde bei 1-10 μmol mit einer Aufschlemmung von Streptavidin-Agarose 50% Agarose nach Volumen (Pierce, Rockford, IL) eine Stunde bei Raumtemperatur in TE (10 mM Tris-Chlorid, pH 8,2, 1 mM EDTA) inkubiert und gewaschen. Die Bindekapazität der Agarose wurde sodann optisch durch das Verschwinden von Biotin-dT₂₅ aus der Lösung und/oder durch Titration des Harzes mit bekannten Mengen an komplementärem Oligonukleotid bestimmt.
Translationsreaktionen unter Verwendung von Extrakten und Ribosomen aus E. coli. Im Allgemeinen erfolgten Translationsreaktionen mit erworbenen Kits (beispielsweise E. coli S30-Extrakt für lineare Matrizen, Promega, Madison, WI). Jedoch wurde auch E. coli-MRE600 (von der ATCC, Rockville, MD) verwendet, um S30-Extrakte, die gemäß veröffentlichten Protokollen hergestellt worden waren (beispielsweise Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301 (1991)), sowie eine ribosomale Fraktion, die gemäß Kudlicki et al. (Anal. Biochem. 206:389 (1992)) hergestellt worden war, zu erhalten. Die Standardreaktion wurde in einem 50 μl-Volumen mit 20-40 μCi von ³⁵S-Methionin als Marker durchgeführt. Das Reaktionsgemisch bestand aus 30% Extrakt v/v, 9-18 mM MgCl₂, 40% Vormix ohne Methionin (Promega) v/v und 5 μM Matrize (beispielsweise 43-P). Für Co-Inkubierungsexperimente wurden die Oligos 13-P und 25-P bei einer Konzentration von 5 μM zugegeben. Für Experimente unter Verwendung von Ribosomen wurden 3 ul Ribosomenlösung pro Reaktion anstelle des Lysats zugegeben. Alle Reaktionen wurden bei 37°C 30 Minuten inkubiert. Matrizen wurden wie vorstehend beschrieben unter enzymatischen Reaktionen aufgereinigt.
Weizenkeim-Translationsreaktionen. Die in 8 beschriebenen Translationsreaktionen erfolgten unter Verwendung von erworbenen Kits ohne Methionin (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Matrizenkonzentrationen betrugen 4 μM für 43-P und 0,8 μM für LP77 und LP154. Reaktionen erfolgten bei 25°C mit 30 μCi ³⁵S-Methionin in einem Gesamtvolumen von 25 μl.
Retikulozyten-Translationsreaktionen. Translationsreaktionen erfolgten entweder mit erworbenen Kits (Novagen, Madison, WI) oder unter Verwendung von Extrakt, der gemäß veröffentlichten Protokollen hergestellt worden war (Jackson und Hunt, Meth. Enzymol. 96:50 (1983)). Retikulozyten-reiches Blut wurde von Pel-Freez Biologicals (Rogers, AK) bezogen. In beiden Fällen waren die Reaktionsbedingungen diejenigen, die für eine Verwendung mit Red Nova-Lysat (Novagen) empfohlen wurden. Reaktionen bestanden aus 100 mM KCl, 0,5 mM MgOAc, 2 mM DTT, 20 mM HEPES, pH 7,6, 8 mM Creatinphosphat, 25 μM einer jeden Aminosäure (mit Ausnahme von Methionin, falls ³⁵S-Met verwendet wurde) und 40% v/v Lysat. Eine Inkubation erfolgte bei 30°C eine Stunde. Matrizenkonzentrationen hingen von dem Experiment ab, betrugen jedoch im Allgemeinen 50 nM bis 1 μM mit Ausnahme von 43-P (6H), wo sie 4 μM betrug.
Für eine Erzeugung des randomisierten Pools erfolgten 10 ml Translationsreaktion bei einer Matrizenkonzentration von ~0,1 μM (1,25 Nanomol Matrize). Zusätzlich wurde ³²P-markierte Matrize in die Reaktion eingebaut, um eine Bestimmung der Menge an Material zu ermöglichen, das bei jedem Schritt des Aufreinigungs- und Selektionsverfahrens vorlag. Nach einer Translation bei 30°C für eine Stunde wurde die Reaktion auf Eis 30-60 Minuten abgekühlt.
Isolierung einer Fusion mit dT₂₅-Streptavidin-Agarose. Nach Inkubation wurde die Translationsreaktion etwa 150-fach mit Isolationspuffer (1,0 M NaCl, 0,1 M Tris-Chlorid, pH 8,2, 10 mM EDTA, 1 mM DTT) mit mehr als einem 10-fachen molaren Überschuss an dT₂₅-Biotin-Streptavidin-Agarose, deren dT₂₅-Konzentration ~10 μM betrug (Volumen der Aufschlemmung war gleich oder größer als das Volumen des Lysats), verdünnt und unter Rühren bei 4°C eine Stunde inkubiert. Die Agarose wurde sodann aus dem Gemisch entweder durch Filtration (Millipore Ultrafree MC-Filter) oder Zentrifugation entfernt und mit kaltem Isolationspuffer 2-4mal gewaschen. Die Matrize wurde sodann von der dT₂₅-Streptavidin-Agarose durch wiederholtes Waschen mit 50-100 ml Aliquots an 15 mM NaOH, 1 mM EDTA befreit. Das Elutionsmittel wurde unmittelbar in 3 M NaOAc, pH 5,2, 10 mM Spermidin neutralisiert und mit Ethanol gefällt. Für die Pool-Reaktion zeigte die gesamte wiedergewonnene Radioaktivität an, das etwa 50-70% der Einsatz-Matrize wiedergewonnen worden waren.
Isolierung einer Fusion mit Thiopropylsepharose. Fusionen mit Cystein können unter Verwendung von Thiopropylsepharose-6B wie in 13 (Pharmacia) aufgereinigt werden. In den hier beschriebenen Experimenten erfolgte eine Isolierung entweder direkt aus der Translationsreaktion oder nach einer anfänglichen Isolierung der Fusion (z.B. mit Streptavidin-Agarose). Für direkt aufgereinigte Proben wurde ein Verhältnis von 1:10 (v/v) Lysat-zu-Sepharose verwendet. Für den Pool wurden 0,5 ml Sepharose-Aufschlemmung verwendet, um das gesamte Fusionsmaterial aus 5 ml Reaktionsgemisch zu isolieren. Proben wurden in eine 50:50 (v/v)-Aufschlemmung an Thiopropylsepharose in 1 × TE 8,2 (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,2) mit DNase-freier RNase (Boehringer Mannheim) verdünnt und bei Rotation 1-2 Stunden für 4°C inkubiert, um einen Abschluss der Reaktion zu ermöglichen. Die überschüssige Flüssigkeit wurde entfernt und die Sepharose wiederholt mit Isolierungspuffer mit 20 mM DTT gewaschen und durch Zentrifugation oder Filtration wiedergewonnen. Die Fusionen wurden aus der Sepharose unter Verwendung einer Lösung von 25-30 mM Dithiothreitol (DTT) in 10 mM Tris-Chlorid, pH 8,2, 1 mM EDTA eluiert. Die Fusion wurde sodann durch eine Kombination einer Verdampfung unter stark vermindertem Druck und Ethanolfällung wie vorstehend beschrieben konzentriert. Für die Pool-Reaktion zeigte die gesamte wiedergewonnene Radioaktivität an, dass etwa 1% der Matrize in die Fusion umgewandelt worden waren.
Für bestimmte Anwendungen wurde dT₂₅ zu diesem Eluat gegeben und eine Stunde bei 4°C rotiert. Die Agarose wurde dreimal mit kaltem Isolierungspuffer gespült, durch Filtration isoliert und das gebundene Material wie vorstehend beschrieben eluiert. Träger-tRNA wurde hinzugegeben und das Fusionsprodukt mit Hilfe von Ethanol ausgefällt. Die Probe wurde in TE, pH 8,2, mit DNase-freier RNase resuspendiert, um den RNA-Anteil der Matrize zu entfernen.
Immunpräzipitationsreaktionen. Eine Immunpräzipitation von Peptiden aus Translationsreaktionen (10) erfolgte durch Mischen von 4 μl Retikulozyten-Translationsreaktion, 2 μl normalen Mausseren und 20 μl Protein G + A-Agarose (Calbiochem, La Jolla, CA) mit 200 μl von entweder PBS (58 mM Na₂HPO₄, 17 mM NaH₂PO₄, 68 mM NaCl), Verdünnungspuffer (10 mM Tris-Chlorid, pH 8,2, 140 mM NaCl, 1% v/v Triton X-100) oder PBSTDS (PBS + 1% Triton X-100, 0,5% Deoxycholat, 0,1% SDS). Proben wurden sodann eine Stunde bei 4°C rotiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 2500 UpM für 15 Minuten. Das Elutionsmittel wurde entfernt und 10 μl von c-myc-monoklonalem Antikörper 9E 10 (Calbiochem, La Jolla, CA) und 15 μl Protein G + A-Agarose wurden hinzugefügt und 2 Stunden bei 4°C rotiert. Die Proben wurden sodann mit zwei 1 ml-Volumina PBS, Verdünnungspuffer oder PBSTDS gewaschen. 40 μl Gelladepuffer (Calbiochem Product Bulletin) wurden zu dem Gemisch hinzugegeben und 20 μl wurden auf eine denaturierende PAGE wie von Schagger und von Jagow beschrieben (Anal. Biochem. 166:368 (1987)) geladen.
Immunpräzipitationen von Fusionen (wie in 11 gezeigt) erfolgten durch Mischen von 8 μl Retikulozyten-Translationsreaktion mit 300 μl Verdünnungspuffer (10 ml/l Tris-Chlorid, pH 8,2, 140 mM NaCl, 1% v/v Triton X-100), 15 μl Protein G-Sepharose (Sigma) und 10 μl (1 μg) c-myc-Antikörper 9E10 (Calbiochem), gefolgt von einer Rotation für mehrere Stunden bei 4°C. Nach Isolierung wurden Proben gewaschen, mit DNase-freier RNase A behandelt, mit Polynukleotidkinase und ³²P-Gamma-ATP markiert und durch denaturierende Harnstoff-PAGE aufgetrennt (11).
Reverse Transkription eines Fusionspools. Reverse Transkriptionsreaktionen erfolgten gemäß den Anweisungen des Herstellers für Superscript II, mit der Ausnahme, dass die Matrize, Wasser und Primer bei 70°C für lediglich 2 Minuten inkubiert wurden (Gibco BRL, Grand Island, NY). Um eine Verlängerung zu überwachen, wurden 50 μCi alpha-³²P-dCTP in manche Reaktionen eingebaut. In anderen Reaktionen wurde eine reverse Transkription unter Verwendung von 5'-³²P-markierten Primern überwacht, die unter Verwendung von ³²P-αATP (New England Nuclear, Boston, MA) und T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs, Beverly, MA) hergestellt worden waren.
Herstellung von Protein G- und Antikörpersepharose. Zwei Aliquots von 50 μl Protein G-Sepharose-Aufschlemmung (50% Feststoff nach Volumen) (Sigma) wurden mit Verdünnungspuffer (10 mM Tris-Chlorid, pH 8,2, 140 mM NaCl, 0,025% NaN₃, 1% v/v Triton X-100) gewaschen und durch Zentrifugation isoliert. Das erste Aliquot wurde für eine Verwendung als eine Vorsäule vor der Selektionsmatrix zurückbehalten. Nach Resuspendierung des zweiten Aliquots in Verdünnungspuffer wurden 40 μg c-myc-AB-1-monoklonaler Antikörper (Oncogene Science) zugegeben und die Reaktion über Nacht bei 4°C unter Rotation inkubiert. Die Antikörpersepharose wurde sodann durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 1500-2500 UpM in einer Mikrozentrifuge aufgereinigt und 1-2mal mit Verdünnungspuffer gewaschen.
Selektion. Nach Isolierung der Fusion und Synthese des komplementären Stranges wurde die gesamte reverse Transkriptionsreaktion direkt in dem Selektionsverfahren verwendet. Zwei Protokolle sind hier beschrieben. Für Runde 1 wurde die reverse Transkriptase-Reaktion direkt zu der wie vorstehend beschrieben hergestellten Antikörpersepharose gegeben und 2 Stunden inkubiert. Für darauf folgende Runden wird die Reaktion ~2 Stunden mit gewaschener Protein G-Sepharose vor der Antikörpersäule inkubiert, um die Anzahl an Bindern zu verringern, die mit Protein G, im Gegensatz zu dem immobilisierten Antikörper, wechselwirken.
Um den Pool von der Matrix zu eluieren, können mehrere Ansätze verfolgt werden. Der erste ist ein Waschen der Selektionsmatrix mit 4% Essigsäure. Dieses Verfah ren befreit das Peptid von der Matrix. Alternativ kann ein stringenteres Waschen (z.B. unter Verwendung von Harnstoff oder einem anderen Denaturierungsmittel) anstelle von oder zusätzlich zu dem Essigsäureansatz verwendet werden.
PCR von ausgewählten Fusionen. Ausgewählte Moleküle werden durch PCR unter Verwendung von Standardprotokollen wie vorstehend für die Konstruktion des Pools beschrieben amplifiziert.
SYNTHESE UND TESTEN VON R-GLOBIN-FUSIONEN
Um ein β-Globin-Fusionskonstrukt zu synthetisieren wurde β-Globin-cDNA aus 2,5 μg Globin-mRNA durch reverse Transkription mit 200 pmol Primer 18.155 (5'-GTG GTA TTT GTG AGC CAG) (SEQ ID NO: 29) und Superscript-reverser Transkriptase (Gibco BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Die Primersequenz war zu den 18 Nukleotiden von β-Globin 5' zu dem Stopp-Codon komplementär. Um einen T7-Promotor anzufügen, wurden 20 μl der reversen Transkriptionsreaktion entfernt und 6 Zyklen einer PCR mit den Primern 18.155 und 40.54 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C) (SEQ ID NO: 30) unterzogen. Die sich ergebende „Syn-β-Globin"-mRNA wurde sodann durch T7-Runoff-Transkription gemäß Milligan und Uhlenbeck (Methods Enzymol. 180:51 (1989)) erzeugt und die RNA Gel-aufgereinigt, elektroeluiert und wie hier beschrieben entsalzt. „LP-β-Glo-bin" wurde sodann aus dem Syn-β-Globin-Konstrukt durch Ligation des Konstrukts an 30-P gemäß Moore und Sharp (Science 256:992 (1992)) unter Verwendung des Primers 20.262 (5'-TTT TTT TTT T GTG GTA TTT G) (SEQ ID NO: 31) als Splint erzeugt. Das Produkt der Ligationsreaktion wurde sodann Gelaufgereinigt, elektroeluiert und wie vorstehend beschrieben entsalzt. Die Konzentration des Endprodukts wurde durch Absorption bei 260 nm bestimmt.
Diese β-Globin-Matrizen wurden sodann in vitro wie in Tabelle 1 beschrieben in einem Gesamtvolumen von jeweils 25 μl translatiert. Mg²⁺ wurde aus einer 25 mM Stammlösung zugegeben. Alle Reaktionen wurden bei 30°C eine Stunde inkubiert und über Nacht auf –20°C gestellt. dTas-präzipitierbare CPMs wurden sodann zweimal unter Verwendung von 6 μl Lysat bestimmt und der Durchschnitt abzüglich Hintergrund gebildet.
TABELLE 1 Translationsreaktionen mit Beta-Globin-Matrizen
Um die Proben für eine Gelanalyse herzustellen, wurden 6 μl einer jeden Translationsreaktion mit 1000 μl Isolierungspuffer (1 M NaCl, 100 mM Tris-Cl, pH 8,2, 10 mM EDTA, 0,1 mM DTT), 1 μl RNase A (DNase-frei, Boehringer Mannheim) und 20 μl 20 μM dTas-Streptavidin-Agarose gemischt. Proben wurden bei 4°C eine Stunde unter Rotieren inkubiert. Überschüssiger Isolierungspuffer wurde entfernt und die Proben zu einem Millipore-MC-Filter gegeben, um jeglichen verbleibenden Isolierungspuffer zu entfernen. Proben wurden sodann viermal mit 50 μl HaO und zweimal mit 50 μl 15 mM NaOH, 1 mM EDTA gewaschen. Die Probe (300 μl) wurde mit 100 μl TE, pH 6,8 (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) neutralisiert, 1 μl 1 mg/ml RNase A (wie vorstehend) wurde zugegeben und die Proben wurden bei 37°C inkubiert. 10 μl 2 × SDS-Ladepuffer (125 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 2% β-Mercaptoethanol, 20% Glycerin, 0,001% Bromphenolblau) wurde sodann hinzugefügt und die Probe zur Trockne lyophilisiert und in 20 μl H₂O und 1% β-Mercaptoethanol resuspendiert. Proben wurden sodann auf ein Peptid-auflösendes Gel gemäß Schagger und von Jagow (Analytical Biochemistry 166:368 (1987)) geladen und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den 15A und 15B gezeigt. Wie in 15A gezeigt, wurde ³⁵S-Methionin in den Proteinanteil der Syn-β-Globin- und LP-β-Globin-Fusionen eingebaut. Das Protein war heterogen, jedoch wies eine starke Bande die für β-Globin-mRNA erwartete Mobilität auf. Auch verblieb wie in 15B gezeigt nach einer dT₂₅-Isolierung und einem RNase A-Verdau kein ³⁵S-markiertes Material in den Syn-β-Globin-Spuren (15B, Spuren 2-4). Im Gegensatz dazu wurde in den LP-β-Globin-Spuren ein ³⁵S-markiertes Produkt einer homogenen Größe festgestellt.
Diese Ergebnisse zeigten, dass wie vorstehend ein Fusionsprodukt durch Oligonukleotid-Affinitätschromatographie nur dann isoliert wurde, wenn die Matrize ein 3'-Puromycin enthielt. Dies wurde durch Szintillationszählen (vgl. Tabelle 1) bestätigt. Es wird erwartet, dass das erhaltene Material den 30-P-Linker in Fusion an einen Teil von β-Globin enthält. Das Fusionsprodukt schien ziemlich homogen hinsichtlich der Größe zu sein, wie durch Gelanalyse festgestellt wurde. Jedoch war es, da das Produkt eine Mobilität aufwies, die sehr ähnlich zu der von natürlichem β-Globin war (15A und 15B, Kontrollspuren), schwierig, die genaue Länge des Proteinanteils des Fusionsprodukts zu bestimmen.
WEITERE OPTIMIERUNG EINER BILDUNG VON RNA-PROTEIN-FUSION
Es stellte sich heraus, dass bestimmte Faktoren weiter die Wirksamkeit einer Bildung von RNA-Peptid-Fusionen erhöhen. Eine Fusionsbildung, d.h. der Transfer der entstehenden Peptidkette von ihrer tRNA auf die Puromycingruppe am 3'-Ende der mRNA, ist eine langsame Reaktion, die der anfänglichen, verhältnismäßig schnellen Translation des offenen Leserahmens, um das entstehende Peptid zu schaffen, folgt. Das Ausmaß einer Fusionsbildung kann wesentlich durch eine posttranslationelle Inkubation bei erhöhten Mg²⁺-Bedingungen (vorzugsweise in einem Bereich von 50-100 mM) und/oder durch die Verwendung eines flexibleren Linkers zwischen der mRNA und der Puromycingruppe verstärkt werden. Des Weiteren führen auch lange Inkubationen (12-48 Stunden) bei niedrigen Temperaturen (vorzugsweise –20°C) zu erhöhten Ausbeuten von Fusionen mit einem geringeren mRNA-Abbau als eine Inkubation bei 30°C. Durch eine Kombination dieser Faktoren können bis zu 40% der Einsatz-mRNA in mRNA-Peptid-Fusionsprodukte wie nachstehend gezeigt umgewandelt werden.
Synthese von mRNA-Puromycin-Konjugaten. Bei diesen Optimierungsexperimenten wurden Puromycin-enthaltende Linkeroligonukleotide an die 3'-Enden von mRNAs unter Verwendung von Bakteriophagen-T4-DNA-Ligase in Gegenwart von komplementären DNA-Splints im Allgemeinen wie vorstehend beschrieben ligiert. Da T4-DNA-Ligase eine präzise Basenpaarung in der Nähe der Ligationsverbindung bevorzugt und Run-Off-Transkriptionsprodukte mit T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase häufig heterogen an ihren 3'-Enden sind (Nucleic Acids Research 15:8783 (1987)), wurden nur die RNAs mit dem korrekten 3'-Terminalnukleotid wirksam ligiert. Wenn ein Standard-DNA-Splint verwendet wurde, wurden etwa 40% der Runoff-Transkriptionsprodukte an das Puromycin-Oligo ligiert. Die Menge an Ligationsprodukt war durch Verwendung von überschüssiger RNA erhöht, war jedoch nicht bei Verwendung von überschüssigem Puromycin-Oligonukleotid erhöht. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden werden zu wollen, schien es, dass der limitierende Faktor für eine Ligation die Menge an RNA war, die vollständig zu der entsprechenden Region des DNA-Splints komplementär war.
Um eine Ligation derjenigen Transkripte zu erlauben, die mit einem weiteren, nicht-Matrizen-kodierten Nukleotid. am 3'-Terminus (als „N + 1-Produkte" bezeichnet) enden, wurde ein Gemisch des Standard-DNA-Splints mit einem neuen DNA-Splint mit einer weiteren zufälligen Base an der Ligationsverbindung verwendet. Die Ligationswirksamkeit erhöhte sich auf mehr als 70% für eine beispielhafte myc-RNA-Matrize (d.h. RNA124) in Gegenwart eines solchen gemischten DNA-Splints.
Zusätzlich zu diesem modifizierten DNA-Splint-Ansatz wurde die Wirksamkeit einer mRNA-Puromycin-Konjugat-Bildung auch weiter durch Berücksichtigung der nachstehenden drei Faktoren optimiert. Zum einen wurden mRNAs vorzugsweise entworfen oder verwendet, denen 3'-Termini mit einer jeglichen signifikanten, stabilen Sekundärstruktur fehlte, die mit einer Hybridisierung an ein Splint-Oligonukleotid wechselwirken würde. Des Weiteren wurde, da eine hohe Konzentration von Salz manchmal ein Versagen der Ligationsreaktion verursachte, ein gründliches Entsalzen der Oligonukleotide unter Verwendung von NAP-25-Säulen vorzugsweise als ein Schritt in das Verfahren eingebaut. Schlussendlich wurden, da die Ligationsreaktion relativ schnell verlief und im Allgemeinen innerhalb von 40 Minuten bei Raumtemperatur abgeschlossen war, signifikant längere Inkubationszeiträume nicht allgemein verwendet und diese führten häufig zu einem unnötigen Abbau der RNA.
Unter Verwendung der vorstehenden Bedingungen wurden mRNA-Puromycin-Konjugate wie folgt synthetisiert. Eine Ligation der myc-RNA-Sequenz (RNA124) an das Puromycin-enthaltende Oligonukleotid erfolgte unter Verwendung von entweder ei nem Standard-DNA-Splint (z.B. 5'-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA) oder eines Splints mit einer zufälligen Base (N) an der Ligationsverbindung (z.B. 5'-TTTTTTTTTTNAGCGCAAGA). Die Reaktionen bestanden aus mRNA, dem DNA-Splint und dem Puromycin-Oligonukleotid in einem molaren Verhältnis von 1,0 1,5-2,0 : 1,0. Ein Gemisch dieser Bestandteile wurde zuerst bei 94°C eine Minute erhitzt und sodann auf Eis 15 Minuten abgekühlt. Ligationsreaktionen erfolgten eine Stunde bei Raumtemperatur in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA, 15 μM Puromycin-Oligo, 15 μM mRNA, 22,5-30 μM DNA-Splint, RNasin-Inhibitor (Promega) bei 1 U/μl und 1,6 Einheiten T4-DNA-Ligase pro Picomol Puromycin-Oligo. Nach der Inkubation wurde EDTA in einer Endkonzentration von 30 mM zugegeben und die Reaktionsgemische wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert. Volllängen-Konjugate wurden durch denaturierende PAGE aufgereinigt und durch Elektroelution isoliert.
Allgemeine Retikulozyten-Translationsbedingungen. Zusätzlich zu einer Verbesserung der Synthese des mRNA-Puromycin-Konjugats wurden Translationsreaktionen auch weiter wie folgt optimiert. Reaktionen erfolgten in Kaninchen-Retikulozytenlysaten aus unterschiedlichen käuflichen Quellen (Novagen, Madison, WI; Amersham, Arlington Heights, IL; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; Ambion, Austin, TX und Promega, Madison, WI). Ein typisches Reaktionsgemisch (25 μl Endvolumen) bestand aus 20 mM HEPES, pH 7,6, 2 mM DTT, 8 mM Creatinphosphat, 100 mM KCl, 0,75 mM Mg(OAc)₂, 1 mM ATP, 0,2 mM GTP, 25 μM einer jeden Aminosäure (0,7 μM Methionin, falls ³⁵S-Met verwendet wurde), RNasin bei 1 U/μl und 60% (v/v) Lysat. Die Endkonzentration an Matrize lag in einem Bereich von 50 nM bis 800 nM. Für jede Inkubation wurden alle Bestandteile mit Ausnahme des Lysats vorsichtig auf Eis gemischt und das gefrorene Lysat unmittelbar vor einer Verwendung aufgetaut. Nach Zugabe von Lysat wurde das Reaktionsgemisch sorgfältig durch vorsichtiges Pipettieren gemischt und bei 30°C inkubiert, um eine Translation einzuleiten. Die optimalen Konzentrationen von Mg²⁺ und K⁺ variierten innerhalb von Bereichen von 0,25 mM bis 2 mM bzw. 75 mM bis 200 mM für verschiedene mRNAs und wurden vorzugsweise in Vorexperimenten bestimmt. Insbesondere wurden für schwach translatierte mRNAs die Konzentrationen an Hemin, Creatinphosphat, tRNA und Aminosäuren manchmal auch optimiert. Kaliumchlorid wurde im Allgemeinen gegenüber Kaliumacetat für Fusionsreaktionen bevorzugt, jedoch erzeugte ein Gemisch aus KCl und KOAc manchmal bessere Ergebnisse.
Nach einer Translation bei 30°C für 30 bis 90 Minuten wurde die Reaktion auf Eis 40 Minuten abgekühlt und Mg²⁺ zugefügt. Die Endkonzentration von Mg²⁺, das an diesem Schritt zugefügt worden war, wurde auch bezüglich unterschiedlicher mRNA-Matrizen optimiert, lag jedoch im Allgemeinen in einem Bereich von 50 mM bis 100 mM (wobei 50 mM vorzugsweise für Pools von gemischten Matrizen verwendet wurde).
Das sich ergebende Gemisch wurde bei –20°C 16 bis 48 Stunden inkubiert. Um die markierten Fusionsprodukte sichtbar zu machen, wurden 2 μl des Reaktionsgemisches mit 4 μl Ladepuffer gemischt und das Gemisch bei 75°C 3 Minuten erhitzt. Das sich ergebende Gemisch wurde sodann auf ein 6% Glycin-SDS-Polyacrylamidgel (für ³²P-markierte Matrizen) oder ein 8% Tricin-SDS-Polyacrylamidgel (für ³⁵S-Met-markierte Matrizen) geladen. Als eine Alternative für diesen Ansatz können die Fusionsprodukte auch unter Verwendung von dT₂₅-Streptavidin-Agarose oder Thiopropylsepharose (oder beidem) im Allgemeinen wie hier beschrieben isoliert werden.
Um den RNA-Anteil des RNA-Linker-Puromycin-Peptid-Konjugats für eine darauf folgende Analyse durch SDS-PAGE zu entfernen, wurde eine geeignete Menge an EDTA nach einer post-translationellen Inkubation hinzugefügt und das Reaktionsgemisch unter Verwendung einer Mikron-10- (oder Mikron-30-) Säule entsalzt. 2 μl des sich ergebenden Gemisches (etwa 25 μl insgesamt) wurden mit 18 μl RNase H-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7,8, 30 mM (NH₄)₂SO₄, 8 mM MgCl₂, 1,5 mM β-Mercaptoethanol und eine angemessene Menge an komplementärem DNA-Splint) gemischt und das Gemisch bei 4°C 45 Minuten inkubiert. RNase H wurde sodann hinzugegeben und ein Verdau erfolgte 20 Minuten bei 37°C.
Qualität von Puromycin-Oligo. Die Qualität des Puromycin-Oligonukleotids war auch für die wirksame Erzeugung von Fusionsprodukten wichtig. Die Kopplung von 5'-DMT-2'-succinyl-N-trifluoracetylpuromycin mit CPG war nicht so wirksam wie die Kopplung der Standardnukleotide. Als solches wurde die Kopplungsreaktion vorsichtig überwacht, um die Bildung von CPG mit einer zu geringen Konzentration von gekoppelten Puromycin zu vermeiden, und nicht-umgesetzte Aminogruppen auf dem CPG wurden vollständig abgestoppt, um eine darauf folgende Synthese von Oligonukleotiden ohne ein 3'-terminales Puromycin zu vermeiden. Es war auch wichtig, die Verwendung von CPG mit Partikeln einer sehr feinen Meshgröße zu vermeiden, da diese fähig waren, Probleme hinsichtlich einer Ventilverstopfung wäh rend darauf folgender automatisierter Oligonukleotidsyntheseschritte hervorzurufen.
Des Weiteren wurde das synthetisierte Puromycin-Oligo vorzugsweise vor einer Verwendung in einem großen Maßstab getestet, um das Vorhandensein von Puromycin am 3'-Ende sicherzustellen. In unseren Experimenten wurde keine Fusion nachgewiesen, falls Puromycin durch ein Desoxyadenosin mit einer primären Aminogruppe am 3'-Ende substituiert wurde. Um auf das Auftreten von 3'-Hydroxylgruppen (d.h. die unerwünschte Synthese von Oligos, denen ein 3'-terminales Puromycin fehlt) zu testen, kann das Puromycin zuerst radiomarkiert (beispielsweise durch 5'-Phosphorylierung) werden und sodann als ein Primer für eine Verlängerung mit terminaler Desoxynukleotidyltransferase verwendet werden. In Gegenwart einer 3'-terminalen Puromycingruppe sollte kein Verlängerungsprodukt beobachtet werden.
Zeitlicher Verlauf einer Translation und post-translationelle Inkubation. Die Translationsreaktion verlief relativ schnell und war im Allgemeinen innerhalb 25 Minuten bei 30°C abgeschlossen. Die Fusionsreaktion war jedoch langsamer. Wenn ein Standardlinker (dA₂₇dCdCP) bei 30°C verwendet wurde, erreichte eine Fusionssynthese ihr Maximum bei weiteren 45 Minuten. Die post-translationelle Inkubation konnte bei niedrigeren Temperaturen, beispielsweise Raumtemperatur, 0°C oder –20°C erfolgen. Weniger Abbau der mRNA-Matrize wurde bei –20°C beobachtet und die besten Fusionsergebnisse wurden nach Inkubation bei –20°C für 2 Tage erhalten.
Wirkung der Mg²⁺-Konzentration. Eine hohe Konzentration von Mg²⁺ in der posttranslationellen Inkubation stimulierte stark die Fusionsbildung. Beispielsweise wurde im Fall der vorstehend beschriebenen myc-RNA-Matrize eine 3-4-fache Stimulierung einer Fusionsbildung bei Verwendung eines Standardlinkers (dA₂₇dCdCP) in Gegenwart von 50 mM Mg²⁺ während der 16-stündigen Inkubation bei –20°C festgestellt (17, vergleiche Spuren 3 und 4). In ähnlicher Weise wurde eine wirksame Fusionsbildung auch bei Verwendung einer post-translationellen Inkubation in Gegenwart einer Mg²⁺-Konzentration von 50-100 mM festgestellt, wenn die Reaktionen bei Raumtemperatur für 30 bis 45 Minuten erfolgten.
Linkerlänge und -sequenz. Die Abhängigkeit der Fusionsreaktion von der Länge des Linkers wurde auch untersucht. In einem Bereich von 21 bis 30 Nukleotiden (n = 18-27) war eine geringe Veränderung hinsichtlich der Wirksamkeit der Fusionsreaktion (wie vorstehend beschrieben) zu erkennen. Kürzere Linker, wie 13 Nukleotide lang, führten zu weniger Fusion. Des Weiteren verbleibt, obwohl spezielle Linker mit einer größeren Länge (d.h. mit 45 Nukleotiden und 54 Nukleotiden) auch zu etwas geringeren Fusionswirksamkeiten führten, es wahrscheinlich, dass noch längere Linker auch verwendet werden können, um die Wirksamkeit der Fusionsreaktion zu optimieren.
In Hinblick auf Linkersequenzen veränderte eine Substitution von Desoxyribonukleotidresten in der Nähe des 3'-Endes durch Ribonukleotidreste nicht signifikant die Fusionswirksamkeit. Die dCdCP- (oder rCrCP-) Sequenz am 3'-Ende des Linkers war jedoch für die Fusionsbildung wichtig. Eine Substitution von dCdCP durch dUdUP verringerte die Wirksamkeit einer Fusionsbildung signifikant.
Linkerflexibilität. Die Abhängigkeit der Fusionsreaktion von der Flexibilität des Linkers wurde auch getestet. Bei diesen Experimenten wurde bestimmt, dass die Fusionswirksamkeit niedrig war, falls die Steifheit des Linkers durch Hybridisieren mit einem komplementären Oligonukleotid in der Nähe des 3'-Endes erhöht wurde. In ähnlicher Weise war, falls ein flexiblerer Linker (beispielsweise dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP, worin C₉ HO(CH₂CH₂O)₃PO₂ darstellt) verwendet wurde, die Fusionswirksamkeit signifikant verbessert. Im Vergleich zu dem Standardlinker (dA₂₁dCdCP) verbesserte eine Verwendung des flexibleren Linkers (dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP) die Fusionswirksamkeit für RNA124 stärker als 4-fach (17, vgl. Spuren 1 und 9). Des Weiteren erforderte im Gegensatz zu der Matrize mit dem Standardlinker, dessen posttranslationelle Fusion schwach ohne eine hohe Konzentration von Mg²⁺ voranschritt (17, Spuren 3 und 4), die Matrize mit dem flexiblen Linker nicht erhöhte Mengen an Mg²⁺, um eine gute Ausbeute an Fusionsprodukt in einer verlängerten posttranslationellen Inkubation bei –20°C zu erzeugen (17, vgl. Spuren 11 und 12). Dieser Linker war daher sehr hilfreich, falls post-translationelle Zugaben von hohen Konzentrationen an Mg²⁺ nicht erwünscht waren. Des Weiteren erzeugte der flexible Linker auch optimale Fusionsausbeuten in Gegenwart von erhöhtem Mg²⁺.
Quantifizierung der Fusionswirksamkeit. Fusionswirksamkeit kann als entweder die Fraktion von in ein Fusionsprodukt konvertiertes translatiertes Peptid oder die Fraktion von Einsatz-Matrize, die zu Fusionsprodukt umgewandelt wird, ausgedrückt werden. Um die Fraktion von in ein Fusionsprodukt konvertiertes translatiertes Peptid zu untersuchen, wurde eine ³⁵S-Met-Markierung des translatierten Peptids verwendet. Bei diesen Experimenten wurden, falls ein dA₂₇dCdCP- oder dA₂₇rCrCP-Linker verwendet wurde, etwa 3,5% des translatierten Peptids an seine mRNA nach einer Translationsinkubation bei 30°C für eine Stunde fusioniert. Dieser Wert erhöhte sich auf 12% nach Inkubation über Nacht bei –20°C. Wenn die post-translationelle Inkubation in Gegenwart einer hohen Konzentration von Mg²⁺ erfolgte, wurden mehr als 50% des translatierten Peptids an die Matrize fusioniert.
Im Fall einer Matrize mit einem flexiblen Linker wurden etwa 25% des translatierten Peptids an die Matrize nach einer Stunde Translation bei 30°C fusioniert. Dieser Wert erhöhte sich auf mehr als 50% nach einer Inkubation über Nacht bei –20°C und auf mehr als 75%, falls die post-translationelle Inkubation in Gegenwart von 50 mM Mg²⁺ erfolgte.
Um den Prozentsatz der Einsatzmatrize, die in Fusionsprodukt umgewandelt wurde, zu bestimmen, erfolgten die Translationen unter Verwendung von ³²P-markierter mRNA-Linker-Matrize. Wenn der flexible Linker verwendet wurde und die posttranslationelle Inkubation bei –20°C ohne Zugabe von Mg²⁺ erfolgte, wurden etwa 20%, 40%, 40%, 35% bzw. 20% der Einsatzmatrize zu mRNA-Peptid-Fusion umgewandelt, wenn die Konzentration der Einsatz-RNA-Matrize 800, 400, 200, 100 bzw. 50 nM betrug (18). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die posttranslationelle Inkubation in Gegenwart von 50 mM Mg²⁺ erfolgte. Die besten Ergebnisse wurden bei Verwendung von Lysaten erreicht, die von Novagen, Amersham oder Ambion erhalten wurden (19).
Die Mobilitätsunterschiede zwischen mRNAs und mRNA-Peptid-Fusionen, wie durch SDS-PAGE gemessen, können sehr klein sein, falls die mRNA-Matrize lang ist. In solchen Fällen kann die Matrize am 5'-Ende des Linkers mit ³²P markiert werden. Der lange RNA-Anteil kann sodann mit RNase H in Gegenwart eines komplementären DNA-Splints nach Translation/Inkubation verdaut werden, und die Fusionswirksamkeit durch eine Quantifizierung des Verhältnisses an unmodifiziertem Linker zu Linker-Peptid-Fusion bestimmt werden. Im Vergleich zu einem RNase A-Verdau, der 3'-P- und 5'-OH-Gruppen erzeugt, weist dieser Ansatz den Vorteil auf, dass die ³²P-Gruppe am 5'-Ende des Linkers nicht entfernt wird.
Intramolekulare gegenüber intermolekularer Fusion während einer post-translationalen Inkubation. Zusätzlich zu den vorstehenden Experimenten wurde getestet, ob die Fusionsreaktion, die bei –20°C in Gegenwart von Mg²⁺ auftrat, hinsichtlich ihrer Art intra- oder intermolekular war. Freier Linker (dA₂₇dCdCP oder dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP, worin C₉-O(CH₂CH₂O)₃PO₂- bedeutet) wurde mit einer Matrize mit einem DNA-Linker, jedoch ohne Puromycin am 3'-Ende unter den vorstehend beschriebenen Translations- und post-translationellen Inkubationsbedingungen coinkubiert. In diesen Experimenten wurde keine nachweisbare Menge (d.h. weniger als 2% der normalen Menge) an ³⁵S-Met in das Linker-Peptid-Produkt eingebaut, was nahe legt, dass eine post-translationelle Fusion hauptsächlich zwischen dem entstehenden Peptid und der an das gleiche Ribosom gebundenen mRNA stattfand.
Optimierungsergebnisse. Wie vorstehend gezeigt wurden durch Verwendung des flexiblen Linkers und/oder die Durchführung der post-translationellen Inkubation in Gegenwart einer hohen Konzentration an Mg²⁺ Fusionswirksamkeiten auf etwa 40% der Einsatz-mRNA erhöht. Diese Ergebnisse zeigten, dass so viele wie 10¹⁴ Moleküle an mRNA-Peptid-Fusion pro ml in vitro-Translations-Reaktions-Gemisch erzeugt werden konnten, was Pools an mRNA-Peptid-Fusionen einer sehr hohen Komplexität für eine Verwendung in in vitro-Selektionsexperimenten erzeugt.
SELEKTIVE ANREICHERUNG VON RNA-PROTEIN-FUSIONEN
Es wurde die Möglichkeit einer Verwendung von RNA-Peptid-Fusionen in Selektions- und Evolutionsexperimenten durch Anreicherung einer bestimmten RNA-Peptid-Fusion aus einem komplexen Pool von zufälligen Sequenzfusionen auf der Basis des kodierten Peptids gezeigt. Insbesondere wurde eine Reihe von Gemischen hergestellt, in denen eine kleine Menge einer bekannten Sequenz (in diesem Fall die lange myc-Matrize, LP154) mit einer Menge an zufälligem Sequenzpool (d.h. LP160) vereinigt wurde. Diese Gemische wurden translatiert und die RNA-Peptid-Fusionsprodukte durch Oligonukleotid- und Disulfidaffinitätschromatographie wie hier beschrieben selektiert. Die myc-Matrizenfusionen wurden selektiv mit anti-myc-monoklonalem Antikörper immunpräzipitiert (16A). Um die in diesem Selektionsschritt erhaltene Anreicherung zu messen, wurden Aliquots des Gemisches von cDNA/mRNA-Peptidfusionen vor und nach der Immunpräzipitation durch PCR in Gegenwart eines radiomarkierten Primers amplifiziert. Die amplifizierte DNA wurde mit einer Restriktionsendonuklease verdaut, die die myc-Matrizensequenz, jedoch nicht den Pool spaltete (16B und 16C). Eine Quantifizierung des Verhältnisses an gespaltener und nicht-gespaltener DNA zeigte, dass die myc-Sequenz 20-40-fach im Verhältnis zu der zufälligen Bibliothek durch Immunpräzipitation angereichert wurde.
Diese Experimente wurden wie folgt durchgeführt.
Translationsreaktionen. Translationsreaktionen erfolgten im Allgemeinen wie vorstehend beschrieben. Spezifisch erfolgten Reaktionen bei 30°C für eine Stunde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Novagen) und wurden über Nacht bei –20°C eingefroren. Zwei Versionen von 6 Proben wurden hergestellt, eine mit ³⁵S-Methionin und eine mit kaltem Methionin, das in einer Endkonzentration von 52 μmol hinzugegeben wurde. Reaktionen 1-6 enthielten die Mengen an Matrizen, die in Tabelle 2 beschrieben sind. Alle in Tabelle 2 gezeigten Zahlen stellen Picomol an Matrize pro 25 μl Reaktionsgemisch dar.
TABELLE 2 Matrizenverhältnisse, die in der gedopten Selektion verwendet wurden
Herstellung von dT₂₅-Streptavidin-Agarose. Streptavidin-Agarose (Pierce) wurde dreimal mit TE 8,2 (10 mM Tris-Cl, pH 8,2, 1 mM EDTA) gewaschen und als 1:1 (v/v)-Aufschlemmung in TE 8,2 resuspendiert. Das 3'-Biotinyl-T₂₅, das unter Verwendung von Bioteg-CPG (Glen Research) synthetisiert worden war, wurde sodann in der gewünschten Endkonzentration (im Allgemeinen 10 oder 20 μM) zugegeben und eine Inkubation erfolgte unter Schütteln für eine Stunde. Die dT₂₅-Streptavidin-Agarose wurde sodann dreimal mit TE 8,2 gewaschen und bei 4°C bis zu einer Verwendung aufbewahrt.
Aufreinigung von Matrizen aus Translationsreaktionen. Um Matrizen aus Translationsreaktionen aufzureinigen, wurden 25 μl einer jeden Reaktion entfernt und zu 7,5 ml Isolierungspuffer (1 M NaCl, 100 mM Tris-Cl, pH 8,2, 10 mM EDTA, 0,1 mM DTT) und 125 μl 20 μM dT₂₅-Streptavidin-Agarose gegeben. Diese Lösung wurde bei 4°C eine Stunde unter Rotation inkubiert. Die Röhrchen wurden zentrifugiert und das Elutionsmittel entfernt. 1 ml Isolierungspuffer wurde hinzugegeben, die Auf schlemmung resuspendiert und die Gemische in 1,5 ml-Mikrozentrifugationsröhrchen überführt. Die Proben wurden sodann viermal mit 1 ml Aliquots an eiskaltem Isolierungspuffer gewaschen. Heiße und kalte Proben aus identischen Reaktionen wurden sodann in einer Millipore-MC-Filtereinheit vereinigt und von der dT₂₅-Agarose durch Waschen mit 2 Volumina 100 μl HaO, 0,1 mM DTT, und 2 Volumina 15 mM NaOH, 1 mM EDTA eluiert.
Zu diesem Elutionsmittel wurden 40 μl einer 50%-Aufschlemmung an gewaschener Thiopropylsepharose (Pharmacia) gegeben und eine Inkubation erfolgte bei 4°C unter Rotation für eine Stunde. Die Proben wurden sodann mit drei 1 ml-Volumina an TE 8,2 gewaschen und das Elutionsmittel wurde entfernt. 1 μl an 1 M DTT wurde zu dem Feststoff (Gesamtvolumen etwa 20-30 μl) gegeben und die Probe mehrere Stunden inkubiert, entfernt und viermal mit 20 μl H₂O (Gesamtvolumen von 90 μl) gewaschen. Das Elutionsmittel enthielt 2,5 mM Thiopyridon wie durch UV-Absorption bestimmt. 50 μl dieser Probe wurden mit Ethanol durch Zugabe von 6 μl 3 M NaOAc, pH 5,2, 10 mM Spermin, 1 μl Glycogen (10 mg/ml, Boehringer Mannheim) und 170 μl 100% EtOH, Inkubation für 30 Minuten bei –70°C und Zentrifugation für 30 Minuten bei 13000 UpM in einer Mikrozentrifuge gefällt.
Reverse Transkriptase-Reaktionen. Reverse Transkriptionsreaktionen erfolgten sowohl mit den Ethanol-gefällten, als auch den Thiopyridon-eluierten Proben wie folgt: im Fall der Ethanol-präzipitierten Proben wurden 30 μl an resuspendierter Matrize, HaO auf 48 μl und 200 Picomol Primer 21.103 (SEQ ID NO: 22) bei 70°C 5 Minuten hybridisiert und auf Eis gekühlt. Zu dieser Probe wurden 16 μl Erststrangpuffer (250 mM Tris-Cl, pH 8,3, 375 mM KCl und 15 mM MgCl₂, erhältlich von Gibco BRL, Grand Island, NY), 8 μl 100 mM DTT und 4 μl 10 mM NTP gegeben und bei 42°C äquilibriert, und 4 μl Superscript II-reverse Transkriptase (Gibco BRL, Grand Island, NY) wurden zugegeben. H₂O (13 μl) wurde zu dem TP-Sepharose-Elutionsmittel (35 μl) gegeben und Reaktionen erfolgten wie vorstehend beschrieben. Nach einer Inkubation für eine Stunde wurden gleich nummerierte Proben vereinigt (Gesamtvolumen von 160 μl). 10 μl an Probe wurden für die PCR mit jeder nichtselektierten Probe reserviert und 150 μl Probe wurden für eine Immunpräzipitation reserviert.
Immunpräzipitation. Um Immunpräzipitationen durchzuführen, wurden 170 μl reverse Transkriptionsreaktion zu 1 ml Verdünnungspuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,2, 140 mM NaCl, 1% v/v Triton X-100) und 20 μl Protein G/A-Konjugat (Calbiochem, La Jolla, CA) gegeben und durch Inkubation bei 4°C unter Rotation für eine Stunde vorgeklärt. Das Elutionsmittel wurde entfernt und 20 μl G/A-Konjugat und 20 μl monoklonaler Antikörper (2 μg, 12 Picomol) zugegeben und die Probe unter Rotation 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Das Konjugat wurde durch Mikrozentrifugation bei 2500 UpM 5 Minuten ausgefällt, das Elutionsmittel entfernt und das Konjugat dreimal mit 1 ml Aliquots an eiskaltem Verdünnungspuffer gewaschen. Die Probe wurde sodann mit 1 ml eiskaltem 10 mM Tris-Cl, pH 8,2, 100 mM NaCl gewaschen. Die gebundenen Fragmente wurden unter Verwendung von 3 Volumina gefrorenem 4% HOAc entfernt und die Proben zur Trockne lyophilisiert.
PCR von selektierten und nicht-selektierten Proben. PCR-Reaktionen erfolgten durch Zugabe von 20 μl an konzentrierter NH₄OH zu 10 μl des nicht-selektierten Materials und dem gesamten selektierten Material und Inkubation für 5 Minuten bei jeweils 55°C, 70°C und 90°C, um eine jegliche in der Probe vorhandene RNA zu zerstören. Die Proben wurden sodann zur Trockne unter Verwendung einer Speedvac verdampft. 200 μl PCR-Gemisch (1 μM Primer 21.103 und 42.108, 200 μM dNTP in PCR-Puffer mit Mg²⁺ (Boehringer Mannheim) und 2 μl Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim)) wurden zu jeder Probe gegeben. 16 Zyklen einer PCR erfolgten mit der nicht-selektierten Probe Nr. 2 und 19 Zyklen erfolgten mit allen anderen Proben.
Proben wurden sodann in Gegenwart von 5'-³²P-markiertem Primer 21.103 gemäß Tabelle 3 amplifiziert und zweimal einzeln unter Verwendung von Wizard-direkter PCR-Aufreinigungskits (Promega) aufgereinigt, um alle Primer und kürzeren Fragmente zu entfernen.
TABELLE 3 Amplifikation von selektierten und nicht-selektierten PCR-Proben
Restriktionsverdaus. ³²P-markierte DNA, die in einer jeden der vorstehenden PCR-Reaktionen hergestellt worden war, wurde in gleichen Mengen (gemäß cpm an Probe) zu Restriktionsverdaureaktionen gemäß Tabelle 4 gegeben. Das Gesamtvolumen einer jeden Reaktion betrug 25 μl. 0,5 μl an AlwnI (5 Einheiten, New England Biolabs) wurden zu jeder Reaktion gegeben. Die Proben wurden bei 37°C für eine Stunde inkubiert und das Enzym wurde durch 20 Minuten Inkubation bei 65°C Hitzeinaktiviert. Die Proben wurden sodann mit 10 μl denaturierendem Beladungspuffer (1 ml ultrareines Formamid (USB), 20 μl 0,5 M EDTA und 20 μl 1 M NaOH) gemischt, 1 Minute bei 90°C erhitzt, abgekühlt und auf ein 12% denaturierendes Polyacrylamidgel mit 8 M Harnstoff geladen. Nach Elektrophorese wurde das Gel mit 10% (v/v) HOAc, 10% (v/v) MeOH, H₂O, fixiert.
TABELLE 4 Restriktionsverdaubedingungen mit AlwnI
Quantifizierung des Verdaus. Die Menge an myc- gegenüber Pool-DNA in einer Probe wurde unter Verwendung eines Phosphorimagers (Molecular Dynamics) quantifiziert. Die Menge an in jeder Bande vorhandenem Material wurde als das integrierte Volumen an identischen Rechtecken gemessen, die um die Gelbanden gezogen wurden. Der in jeder Bande vorhandene Gesamt-cpm-Wert wurde als das Volumen abzüglich des Hintergrunds berechnet. Drei Werte für den Hintergrund wurden verwendet: (1) ein Durchschnitt an identischen Quadraten außerhalb des Bereichs, bei denen Signale auf dem Gel auftraten, (2) die in der Spur des nicht-selektierten Pools vorhandenen cpm, wo die myc-Bande auftreten sollte (keine Bande erscheint an dieser Position auf dem Gel) und (3) ein normalisierter Wert, der den nächsten Wert zu den 10-fachen Matrizen-Zunahmen zwischen nicht-selektierten Spuren reproduzierte. Die Spuren 2, 3 und 4 der 16B und 16C zeigen eine Anreicherung der Ziel- gegenüber der Pool-Sequenz. Die sichtbare Anreichung in Spur 3 (nicht-selektiert/selektiert) ergab die größten Werte (17-, 43- bzw. 27-fach unter Verwendung der Verfahren 1-3) aufgrund der Optimierung des Signals auf ein Rauschverhältnis für diese Probe. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
TABELLE 5 Anreicherung von myc-Matrize gegenüber Pool
In einem zweiten Satz an Experimenten wurden die gleichen PCR-Produkte einmal unter Verwendung von Wizard-direkter PCR-Aufreinigungskits aufgereinigt und Verdauansätze wurden durch das vorstehende Verfahren (2) quantifiziert. Bei diesen Experimenten wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Anreicherungen von 10,7-, 38- bzw. 12-fach wurden für Proben gemessen, die zu denen in den Spuren 2, 3 und 4 vorstehend äquivalent waren.
VERWENDUNG VON PROTEIN-SELEKTIONSSYSTEMEN
Die erfindungsgemäßen Selektionssysteme weisen kommerzielle Anwendungen in einem jeglichen Bereich auf, in dem Proteintechnologie verwendet wird, um therapeutische, diagnostische oder industrielle Probleme zu lösen. Diese Selektionstechnologie ist für eine Verbesserung oder Veränderung bestehender Proteine, sowie für eine Isolierung neuer Proteine mit gewünschten Funktionen verwendbar. Diese Proteine können natürlich auftretende Sequenzen sein, sie können veränderte Formen von natürlich auftretenden Sequenzen sein oder sie können teilweise oder vollständig synthetische Sequenzen sein.
Isolierung von neuen Bindereagenzien. In einer spezifischen Ausführungsform ist die hier beschriebene RNA-Protein-Fusionstechnologie für die Isolierung von Proteinen mit spezifischen Bindungseigenschaften (beispielsweise Ligandbindung) verwendbar. Proteine, die hochgradig spezifische Bindungswechselwirkungen aufweisen, können als Nicht-Antikörper-Erkennungsreagenzien verwendet werden, was es der RNA-Protein-Fusionstechnologie erlaubt, herkömmliche monoklonale Antikörper-Technologie zu umgehen. Reagenzien des Antikörpertypus, die durch dieses Verfahren isoliert werden, können in einem jeglichen Bereich verwendet werden, in dem herkömmliche Antikörper verwendet werden, einschließlich in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen.
Verbesserung von menschlichen Antikörpern. Die Erfindung kann auch verwendet werden, um menschliche oder humanisierte Antikörper für die Behandlung einer jeglichen Erkrankung zu verbessern. In dieser Anwendung werden Antikörperbibliotheken entwickelt und in vitro gescreent, was den Bedarf für Techniken wie Zellfusion oder Phagendisplay beseitigt. In einer wichtigen Anwendung ist die Erfindung für eine Verbesserung von einzelkettigen Antikörperbibliotheken verwendbar (Ward et al., Nature 341:544 (1989) und Goulot et al., J. Mol. Biol. 213:617 (1990)). Für diese Anwendung kann die variable Region entweder von einer menschlichen Quelle konstruiert werden (um mögliche gegenteilige Immunreaktionen des Empfängers zu minimieren) oder sie kann eine vollständig randomisierte Kassette enthalten (um die Komplexität der Bibliothek zu maximieren). Um auf verbesserte Antikörpermoleküle zu screenen wird ein Pool an Kandidatenmolekülen bezüglich einer Bindung an ein Zielmolekül getestet (beispielsweise ein Antigen, das wie in 2 gezeigt immobilisiert ist). Ein höherer Grad einer Stringenz wird sodann in dem Bindungsschritt angelegt wie die Selektion von einer Runde zur nächsten fortschreitet. Um die Stringenz zu erhöhen, werden Bedingungen wie die Anzahl an Waschschritten, die Konzentration an überschüssigem Kompetitor, Pufferbedingungen, die Länge einer Bindungs-Reaktionszeit und die Wahl der Immobilisierungsmatrix verändert.
Einzelkettige Antikörper können entweder direkt für eine Therapie oder indirekt für ein Entwerfen von Standardantikörpern verwendet werden. Solche Antikörper können eine Reihe von möglichen Anwendungen aufweisen, einschließlich der Isolierung von Anti-Autoimmunantikörpern, Immunsuppression und bei der Entwicklung von Vakzinen bei viralen Erkrankungen wie AIDS.
Isolierung von neuen Katalysatoren. Die Erfindung kann auch verwendet werden, um neue katalytische Proteine zu selektieren. Eine in vitro-Selektion und Evolution wurde zuvor für die Isolierung neuer katalytischer RNAs und DNAs verwendet und sie wird erfindungsgemäß für die Isolierung neuer Proteinenzyme verwendet. In einem speziellen Beispiel dieses Ansatzes kann ein Katalysator indirekt durch Selektion auf eine Bindung an ein chemisches Analogon des Übergangszustandes des Katalysators isoliert werden. In einem weiteren spezifischen Beispiel kann eine direkte Isolierung durch Selektion auf Bildung einer kovalenten Bindung mit einem Substrat (beispielsweise unter Verwendung eines an einen Affinitätstag gebundenen Substrats) oder durch Spaltung (beispielsweise durch Selektion auf die Fähigkeit, eine spezifische Bindung aufzubrechen und dadurch katalytische Mitglieder einer Bibliothek aus einem Festträger freizusetzen) erfolgen.
Dieser Ansatz für die Isolierung neuer Katalysatoren weist mindestens zwei wichtige Vorteile gegenüber der katalytischen Antikörpertechnologie auf (zusammengefasst in Schultz et al., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)). Zum einen ist bei der katalytischen Antikörpertechnologie der anfängliche Pool im Allgemeinen auf die Immunglobulinfaltung begrenzt. Im Gegensatz dazu kann die Ausgangsbibliothek von RNA-Protein-Fusionen entweder vollständig zufällig sein oder kann ohne Begrenzung aus Varianten bekannter enzymatischer Strukturen oder Proteingerüste bestehen. Des Weiteren beruht die Isolierung katalytischer Antikörper im Allgemeinen auf einer anfänglichen Selektion auf eine Bindung an Reaktionsanaloga im Übergangszustand, gefolgt von einem arbeitsaufwändigen Screening für aktive Antikörper. Erneut ist im Gegensatz dazu eine direkte Selektion auf Katalyse unter Verwendung eines RNA-Protein-Fusionsbibliothek-Ansatzes möglich, wie zuvor unter Verwendung von RNA-Bibliotheken gezeigt. Bei einem alternativen Ansatz für eine Isolierung von Proteinenzymen können die Übergangszustand-Analogon- und direkte Selektions-Ansätze vereinigt werden. Enzyme, die durch dieses Verfahren erhalten werden, sind hochgradig wertvoll. Beispielsweise gibt es gegenwärtig einen starken Bedarf für neue und wirksame industrielle Katalysatoren, die eine Entwicklung von chemischen Prozessen ermöglichen. Ein Hauptvorteil der Erfindung ist, dass Selektionen unter zufälligen Bedingungen erfolgen können und nicht beispielsweise auf in vivo-Bedingungen begrenzt sind. Die Erfindung erleichtert daher die Isolierung von neuen Enzymen oder verbesserten Varianten von bestehenden Enzymen, die hochgradig spezifische Transformationen durchführen können (und dadurch die Bildung unerwünschter Nebenprodukte minimieren), während sie in vorbestimmten Umgebungen, beispielsweise Umgebungen mit erhöhter Temperatur, erhöhtem Druck oder einer erhöhten Lösungsmittelkonzentration, fungieren.
Eine in vitro-Wechselwirkungsfalle. Die RNA-Protein-Fusionstechnologie ist auch für einen Screenen von cDNA-Bibliotheken und ein Klonieren neuer Gene auf der Basis von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendbar. Durch dieses Verfahren wird eine cDNA-Bibliothek aus einer gewünschten Quelle (beispielsweise durch das Verfahren von Ausubel et al., supra, Kapitel 5) erzeugt. An eine jede der Kandidaten-cDNAs wird ein Peptidakzeptor (beispielsweise ein Puromycin-Schwanz) ligiert (beispielsweise unter Verwendung der vorstehend für die Erzeugung von LP77, LP154 und LP160 beschriebenen Techniken). RNA-Protein-Fusionen werden sodann wie hier beschrieben erzeugt und die Fähigkeit dieser Fusionen (oder verbesserten Versionen der Fusionen), mit bestimmten Molekülen wechselzuwirken, wird sodann wie vorstehend beschrieben getestet. Falls erwünscht, können Stopp-Codons und 3'-UTR-Regionen in diesem Verfahren durch entweder (i) Anfügen von Suppressor-tRNA, um ein Durchlesen der Stopp-Regionen zu ermöglichen, (ii) Entfernen des Freisetzungsfaktors von der Translationsreaktion durch Immunpräzipitation, (iii) eine Kombination von (i) und (ii) oder (iv) Entfernen des Stopp-Codons und der 3'-UTR aus den DNA-Sequenzen vermieden werden.
Die Tatsache, dass der Wechselwirkungsschritt in vitro stattfindet, ermöglicht eine vorsichtige Steuerung der Reaktionsstringenz unter Verwendung von nichtspezifischen Kompetitor-, Temperatur- und Ionenbedingungen. Eine Veränderung von normalen kleinen Molekülen durch nicht-hydrolysierbare Analoga (wie ATP gegen ATPgS) stellt Selektionen bereit, die zwischen unterschiedlichen Konformeren des gleichen Moleküls unterscheiden. Dieser Ansatz ist für sowohl die Klonierung, als auch funktionelle Identifizierung vieler Proteine geeignet, da die RNA-Sequenz des ausgewählten Bindepartners kovalent gebunden ist und daher einfach isoliert werden kann. Zusätzlich ist die Technik für eine Identifizierung von Funktionen und Wechselwirkungen der ~50-100.000 menschlichen Gene verwendbar, deren Sequenzen gegenwärtig durch das menschliche Genomprojekt bestimmt werden.
VERWENDUNG VON RNA-PROTEIN-FUSIONEN IN EINEM MIKROCHIP-FORMAT
„DNA-Chips" bestehen aus räumlich definierten Anordnungen von immobilisierten Oligonukleotiden oder klonierten Fragmenten an cDNA oder genomischer DNA und weisen Anwendungen wie eine schnelle Sequenzierung und eine schnelle Transkriptprofilierung auf. Durch eine Hybridisierung eines Gemisches an RNA-Protein-Fusionen (beispielsweise erzeugt aus einem zellulären DNA- oder RNA-Pool) an einen solchen DNA-Chip ist es möglich, einen „Protein-Display-Chip" zu erzeugen, bei dem ein jeder Punkt, der einer immobilisierten Sequenz entspricht, fähig ist, an seine entsprechende RNA-Sequenz in den Pool von RNA-Protein-Fusionen zu hybridisieren. Durch diesen Ansatz wird das entsprechende Protein in einer räumlich definierten Weise aufgrund seiner Bindung an seine eigene mRNA immobilisiert und Chips mit Sätzen an DNA-Sequenzen zeigen den entsprechenden Satz an Proteinen. Alternativ dazu können Peptidfragmente dieser Proteine dargestellt werden, falls die Fusionsbibliothek aus kleineren Fragmenten von cDNAs oder genomischen DNAs erzeugt wird.
Solche geordneten Anordnungen von Proteinen und Peptiden weisen viele Verwendungen auf. Beispielsweise stellen sie leistungsfähige Werkzeuge für die Identifizierung von zuvor unbekannten Protein-Protein-Wechselwirkungen dar. In einem spezifischen Format ist ein Sondenprotein nachweisbar markiert (beispielsweise durch einen Fluoreszenzfarbstoff) und das markierte Protein wird mit einem Protein-Display-Chip inkubiert. Durch diesen Ansatz wird die Identität von Proteinen, die fähig sind an das Sondenprotein zu binden, aus der Position der Punkte auf dem Chip, die aufgrund einer Bindung der Sonde markiert werden, bestimmt. Eine andere Anwendung ist die schnelle Bestimmung von Proteinen, die über die Wirkung von modifizierenden Enzymen chemisch modifiziert werden (beispielsweise Proteinkinasen, Acyltransferasen und Methyltransferasen). Durch Inkubation des Protein-Display-Chips mit dem interessierenden Enzym und einem radioaktiv markierten Substrat, gefolgt von einem Waschen und einer Autoradiographie kann die Position und somit die Identität derjenigen Proteine einfach festgestellt werden, die Substrate für das modifizierende Enzym sind. Des Weiteren ermöglicht die Verwendung dieses Ansatzes mit einer geordneten Präsentation von kleinen Peptiden die weitere Lokalisierung solcher Modifikationsstellen.
Protein-Display-Technologie kann unter Verwendung von Anordnungen von Nukleinsäuren (einschließlich RNA, jedoch vorzugsweise DNA), die auf einem jeglichen geeigneten Festträger immobilisiert sind, erfolgen. Beispielhafte Festträger können aus Materialien wie Glas (z.B. Glasplatten), Silizium oder Silizium-Glas (z.B. Mikrochips) oder Gold (z.B. Goldplatten) bestehen. Verfahren für ein Anbringen von Nukleinsäuren an spezifische Regionen auf solchen festen Oberflächen wie fotolithographische Verfahren sind bekannt und können für eine Erzeugung von Festträgern (wie DNA-Chips) für eine erfindungsgemäße Verwendung eingesetzt werden. Beispielhafte Verfahren für diesen Zweck umfassen in nicht begrenzender Weise Schena et al., Science 270:467-470 (1995); Kozal et al., Nature Medicine 2:753-759 (1996), Cheng et al., Nucleic Acids Research 24:380-385 (1996), Lipshutz et al., BioTechniques 19:442-447 (1995), Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026 (1994), Fodor et al., Nature 364:555-556 (1993), Pirrung et al., US-PS Nr. 5,143,854 und Fodor et al., WO 92/10092.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Selektion eines gewünschten Proteins oder einer gewünschten RNA, umfassend: (a) Bereitstellen einer Population von Kandidaten-RNA-Molekülen, die jeweils eine Translationsinitiations-Sequenz und ein Start-Codon, das operabel an eine Kandidatenprotein-kodierende Sequenz gebunden ist, umfassen und die jeweils an einen Peptidakzeptor an dem 3'-Ende der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenz kovalent gebunden sind; (b) in vitro- oder in situ-Translatieren der Kandidatenprotein-kodierenden Sequenzen zur Herstellung einer Population von Kandidaten-RNA-Proteinfusionen; (c) In-Kontakt-Bringen der genannten Population von RNA-Proteinfusionen mit einem Bindungspartner, der spezifisch für entweder den RNA-Teil oder den Proteinteil der genannten RNA-Proteinfusion ist, unter Bedingungen, welche den genannten Bindungspartner-RNA-Proteinfusionskomplex von den nicht-gebundenen Mitgliedern der genannten Population überwiegend abtrennen; (d) Freisetzen der genannten gebundenen RNA-Proteinfusionen von dem genannten Komplex; und (e) In-Kontakt-Bringen der genannten Population von RNA-Proteinfusionen aus Schritt (d) mit einem Bindungspartner, der spezifisch für den Proteinteil der genannten gewünschten RNA-Proteinfusion ist, unter Bedingungen, welche den genannten Bindungspartner-RNA-Proteinfusionskomplex von den nicht-gebundenen Mitgliedern der genannten Population überwiegend abtrennen, wobei dadurch das gewünschte Protein und die gewünschte RNA ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren weiter das Wiederholen der Schritte (a) bis (e) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der genannte Peptidakzeptor Puromycin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jedes der genannten Kandidaten-RNA-Moleküle weiter eine Pausensequenz einschließt oder weiter eine DNA- oder DNA-Analog-Sequenz umfasst, die an das 3'-Ende des genannten RNA-Moleküls kovalent gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte Population von Kandidaten-RNA-Molekülen mindestens 1013 unterschiedliche RNA-Moleküle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte in vitro-Translationsreaktion in einem Lysat durchgeführt wird, das von einer eukaryontischen Zelle oder einem Teil davon hergestellt wurde.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die genannte in vitro-Translationsreaktion in einem Retikulozytenlysat oder einem Weizenkeimlysat durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte in vitro-Translationsreaktion in einem Extrakt durchgeführt wird, der von einer prokaryontischen Zelle oder einem Teil davon hergestellt wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens einer der genannten Bindungspartner an einen Festträger immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach dem in vitro-Translationsschritt eine Inkubation in der Gegenwart von 50 bis 100 mM Mg²⁺ durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte RNA-Proteinfusion weiter eine Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analog-Sequenz umfasst, die proximal zu dem genannten Peptidakzeptor positioniert ist, was die Flexibilität erhöht.