DE69837208T2 - Normalisierte nukleinsäurebibliotheken sowie herstellungsverfahren derselben - Google Patents

Normalisierte nukleinsäurebibliotheken sowie herstellungsverfahren derselben Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung liegt im Gebiet der Molekularbiologie und der Genetik. Die Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Verfahren zur Herstellung normalisierter Nukleinsäurebibliotheken, sodass die Variation der Häufigkeit der einzelnen Nukleinsäuremoleküle in der Bibliothek im Wesentlichen reduziert ist (z.B. nicht mehr als ungefähr zwei Größenordnungen). Die Erfindung bezieht sich ebenso auf normalisierte, mittels dieser Verfahren hergestellte Bibliotheken, auf aus diesen Bibliotheken isolierte Nukleinsäuremoleküle, auf genetische Konstrukte (z.B. Vektoren), die diese Nukleinsäuremoleküle umfassen, und auf solche normalisierte Bibliotheken umfassende Wirtszellen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Darstellung des Mechanismus, der das normale Funktionieren lebender Zellen steuert, erfordert ein detailliertes Verständnis der in allen Genen (wofür hierin ebenfalls das Genom als Synonym verwendet wird) codierten Information. Zwecks Kartierung und Sequenzierung der in den Genomen verschiedener Organismen enthaltenen Gene werden normalerweise Messenger-RNA (mRNA)-Sequenzen, die für die Gene oder Genome repräsentativ sind, zur Evaluierung des genetischen Aufbaus der bestimmten Zelle oder des Organismus von Interesse verwendet. Allerdings werden die mRNAs (im Menschen auf 100 000 geschätzt) innerhalb verschiedener Zelltypen bei verschiedenen Niveaus und verschiedenen Entwicklungsstadien hergestellt (z.B. ist von einigen mRNAs weniger als eine Kopie pro Zelle vorhanden, während von anderen mRNAs Millionen von Kopien vorhanden sind). Diese mRNAs, ihre entwicklungs- und zelltypspezifische regulierte Expression und ihre Translation in Protein machen den einzigartigen Charakter eines bestimmten Zelltyps aus. Beispielsweise produzieren adulte Muskelzellen mehr Myoglobin-mRNA, während reife, rote Blutkörperchen viel Hämoglobin enthalten. Im Fötus wird Hämoglobin von der Leber produziert; nach der Geburt allerdings ändern sich sowohl der Typ des produzierten Hämoglobins als auch die Gewebsquelle aufgrund von Änderungen in der Genexpression.
  • Ein Verständnis der molekularen Details der normalen Funktionsweise von Zellen ist ausschlaggebend, um Erbkrankheiten, bei denen die Regulation und Expression von einem oder mehr als einem Genen verändert wurde, verstehen und behandeln zu können. Diesem Zweck entspricht die Herstellung von Bibliotheken klonierter Nukleinsäuren, von denen alle oder im Wesentlichen alle Elemente der Bibliotheken mit annähernd gleicher Wahrscheinlichkeit isoliert werden können.
  • Eine normalisierte Bibliothek mit relativen Konzentrationen ihrer Elemente in einem niedrigeren Bereich, zum Beispiel ungefähr um das 2–4 fache niedriger, hat den Vorteil, im Wesentlichen alle mRNAs für die Isolierung und anschließende Analyse verfügbar zu machen. Diese Art von Bibliothek fördert das Verständnis der normalen Funktionsweise einzelner Gene und des Genoms im Allgemeinen. Allerdings führte keines der vordem berichteten Verfahren zur Herstellung von normalisierten Nukleinsäurebibliotheken, in denen im Wesentlichen alle Nukleinsäuremoleküle oder in einem bestimmten Zell- oder Gewebetyp exprimierten Gene vertreten sind und mit hoher Wahrscheinlichkeit isoliert werden können. Obgleich einige Forscher Normalisierungsversuche (d. h. die Variation der relativen Häufigkeit der Komponenten der Population von Nukleinsäuremolekülen reduzieren) unternommen haben, ist es nicht gelungen, die relative Häufigkeit der Gesamtpopulation auf einen Bereich von zwei Größenordnungen einzuschränken (Bonaldo, M., Lennon, G., Soares, M.B., Genome Res. 6: 791–866 (1996); Ko, M.S.H., Nucl. Acids Res. 18: 5705–5711 (1990); Pantanjali, S.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1943–1947 (1991); Soares, M.B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9228–9232 (1994)). Die daraus hervorgehenden, „normalisierten" Bibliotheken konnten keine Menge neuartiger, zum Verständnis der Expression der meisten Gene notwendiger Informationen bereitstellen. Somit besteht ein Bedarf an Verfahren zur Herstellung normalisierter Nukleinsäurebibliotheken und an mittels solcher Verfahren hergestellter Nukleinsäurebibliotheken.
  • WO 95/08647 beschreibt ein Verfahren zur Konstruktion von normalisierten cDNA-Bibliotheken und Verwendungen derselben.
  • Bonaldo Fatina de M et al., Genome Research, Vol. 6, Nr. 9, 1. September 1996, Seiten 791–806, beschreibt „Normalisierung" und „Subtraktion" – zwei Ansätze zur Erleichterung von Genentdeckungen.
  • Ko, Nucleic Acids Research, Vol. 18, Nr. 19, 1990, Seiten 5705–5711, beschreibt eine „äquilibrierte cDNA-Bibliothek" durch Reassoziieren kurzer, doppelsträngiger cDNAs.
  • WO 95/11986 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer subtrahierten cDNA-Bibliothek und Verwendungen der Bibliothek.
  • Hongping Jiang et al., Molecular and Celluar Differentiation, Vol. 1, Nr. 3, 1993, Seiten 285–299, beschreibt die Verwendung eines empfindlichen und effizienten Subtraktions-Hybridisierungs-Protokolls zur Identifizierung von unterschiedlich regulierten Genen während der Induktion von Differenzierung in humanen Melanomzellen.
  • Sankhavaram et al., P.N.A.S. (USA), Vol. 88, Nr. 5, 1. März 1991, Seiten 1943–1947, beschreibt die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek mit uniformer Häufigkeit (normalisiert).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Normalisierung einer Nukleinsäurebibliothek bereit, das folgendes umfasst:
    • (a) Inkubieren einer Nukleinsäurebibliothek, zur Normalisierung mit synthetischen, haptenylierten Nukleinsäuremolekülen, die zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle dieser Bibliothek komplementär sind, unter Bedingungen, die die Hybridisierung der zahlreicheren Moleküle dieser Bibliothek mit diesen haptenylierten Nukleinsäuremolekülen begünstigen; und
    • (b) Entfernen dieser hybridisierten Moleküle durch Hapten-Ligand-Wechselwirkungen, wodurch eine normalisierte Bibliothek hergestellt wird.
  • Die vorliegende Erfindung erfüllt somit diesem Bedarf durch Bereitstellen von Verfahren zur Herstellung normalisierter Nukleinsäurebibliotheken (d. h. Bibliotheken klonierter Nukleinsäuremoleküle, von denen jedes Nukleinsäuremolekülelement mit annähernd gleicher Wahrscheinlichkeit isoliert werden kann). Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Normalisierung einer Nukleinsäurebibliothek, die wie in den Ansprüchen dargestellt eine einzelsträngige oder doppelsträngige cDNA-Bibliothek sein kann.
  • Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung liegt die relative Konzentration aller Elemente der normalisierten Bibliothek innerhalb einer oder zwei Größenordnungen. Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt ermöglicht die Erfindung das Entfernen oder Eliminieren kontaminierender Nukleinsäuremoleküle aus der normalisierten Bibliothek. Eine solche Kontamination kann Vektoren innerhalb der Bibliothek einschließen, die keine Inserts enthalten (z.B. Background). Auf diese Art und Weise umfasst die gesamte oder ein wesentlicher Teil der normalisierten Bibliothek Vektoren mit integrierten Nukleinsäuremolekülen der Bibliothek.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenso auf solche Verfahren, bei denen die Bedingungen, die die Hybridisierung der zahlreicheren Moleküle der Bibliothek mit den haptenylierten Molekülen, begünstigen, ausgewählt werden aus der Gruppe, die folgendes enthält: (a) einen Cot-Wert gleich oder größer 25; (b) einen Cot-Wert gleich oder größer 50; (c) einen Cot-Wert gleich oder größer 100; (d) einen Cot-Wert gleich oder größer 1 000; (e) einen Cot-Wert gleich oder größer 2 000; (f) einen Cot-Wert gleich oder größer 5 000; (g) einen Cot-Wert von ungefähr 10 bis 10 000; (h) einen Cot-Wert von ungefähr 25 bis 10 000; (i) einen Cot-Wert von ungefähr 50 bis 10 000; (j) einen Cot-Wert von ungefähr 1 000 bis 10 000; (k) einen Cot-Wert von ungefähr 5 000 bis 10 000; (I) einen Cot-Wert von ungefähr 500 bis 5 000; (m) einen Cot-Wert von ungefähr 100 bis 1 000; und (n) einen Cot-Wert kleiner 10 000.
  • Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird eine Population von mRNA unter ausreichenden Bedingungen, um eine Population von cDNA-Molekülen herzustellen, die zu allen oder einem Teil dieser mRNA-Moleküle komplementär sind, inkubiert. Bevorzugt wird eine solche Population von cDNA-Molekülen (z.B. einzelsträngige cDNA) durch Mischen der Population von mRNA-Molekülen (Templatmoleküle) mit einem oder mehr als einem Polypeptiden mit reverser Transkriptase-Aktivität und Inkubieren dieser Mischung unter ausreichenden Bedingungen, um eine Population von einzelsträngigen cDNA-Molekülen, die zu allen oder einem Teil dieser mRNA-Moleküle komplementär sind, herzustellen, hergestellt. Die einzelsträngigen cDNA-Moleküle können dann als Templatmoleküle zur Herstellung doppelsträngiger cDNA-Moleküle durch Inkubieren der Mischung unter geeigneten Bedingungen bei Vorhandensein von einer oder mehr als einer DNA-Polymerase verwendet werden. Die daraus hervorgehende Population von doppelsträngigen oder einzelsträngigen cDNA-Bibliotheken kann erfindungsgemäß normalisiert werden. Bevorzugt werden solche cDNA-Bibliotheken vor der Normalisierung in einen oder mehr als einen Vektor inseriert. Alternativ können die cDNA-Bibliotheken vor der Insertion in einen oder mehr als einen Vektoren normalisiert werden und nach der Normalisierung können sie in einen oder mehrere Vektoren kloniert werden.
  • Gemäß einem besonders bevorzugten Aspekts der Erfindung ist die zu normalisierende Bibliothek in einem oder mehr als einem Vektor, die ein Plasmid, ein Cosmid, ein Phagemid und dergleichen sein können, enthalten (inseriert). Solche Vektoren umfassen bevorzugt einen oder mehr als einen Promotor, der/die die Synthese von zumindest einem RNA-Molekül aller oder eines Teils der Nukleinsäuremoleküle (bevorzugt cDNA-Moleküle), die in den Vektor inseriert sind, ermöglicht/ermöglichen. Somit können durch die Verwendung der Promotoren erfindungsgemäß zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek komplementäre, haptenylierte RNA-Moleküle hergestellt und erfindungsgemäße für die Normalisierung der Bibliothek verwendet werden. Solche synthetisierten RNA-Moleküle (die haptenyliert wurden) sind zu allen oder einem Teil der Vektor-Inserts der Bibliothek komplementär. Zahlreichere Moleküle in der Bibliothek können dann bevorzugt durch Hybridisieren der haptenylierten RNA-Moleküle zu der Bibliothek entfernt werden, wodurch die normalisierte Bibliothek der Erfindung hergestellt wird. Die synthetisierten RNA-Moleküle sollen ohne Einschränkung für die Bibliothek repräsentativ sein; das bedeutet, zahlreichere Substanzen in der Bibliothek führen unter Verwendung des obigen Verfahrens zu zahlreicherer, haptenylierter RNA. Die relative Häufigkeit der Moleküle innerhalb der Bibliothek und folglich innerhalb der haptenylierten RNA bestimmt die Entfernungsgeschwindigkeit bestimmter Substanzen aus der Bibliothek; wenn die Häufigkeit einer bestimmten Substanz hoch ist, kann eine solch häufige Substanz einfacher entfernt werden, während weniger häufige Substanzen weniger mühelos aus der Population entfernt werden. Die Normalisierung durch diesen Vorgang ermöglicht somit die wesentliche Äquilibration der Niveaus jeder Substanz in der Bibliothek.
  • Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung ist es nicht notwendig, die zu normalisierende Bibliothek vor der Normalisierung in einen oder mehrere Vektoren zu inserieren. Gemäß einem solchen Aspekt der Erfindung können die Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek unter Verwendung gut bekannter Techniken zur Synthese haptenylierter Nukleinsäuremoleküle verwendet werden. Beispielsweise können haptenylierte Nukleinsäuremoleküle bei Vorhandensein von einer oder mehr als einer DNA-Polymerase, von einem/einer oder mehr als einem/einer geeigneten Primer oder Sonde oder von einem oder mehr als einem Nukleotid synthetisiert werden (die Nukleotide und/oder Primer oder Sonden können haptenyliert sein). Auf diese Art und Weise werden erfindungsgemäß haptenylierte DNA-Moleküle hergestellt und können für die erfindungsgemäße Normalisierung der Bibliothek verwendet werden. Alternativ können ein oder mehr als ein Promotor den Bibliotheksmolekülen hinzugefügt (oder an diese ligiert werden) werden, wodurch die Synthese der haptenylierten RNA-Moleküle zwecks erfindungsgemäßer Verwendung zur Normalisierung der Bibliothek ermöglicht wird. Beispielsweise werden Adaptoren, die einen oder mehr als einen Promotor enthalten, einem oder mehreren Enden der doppelsträngigen Bibliotheksmoleküle hinzugefügt (z.B. aus einer Population von RNA-Molekülen hergestellte cDNA-Bibliothek). Somit können solche Promotoren dann verwendet werden, um die haptenylierten, zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek komplementären RNA-Moleküle herzustellen.
  • Die Bibliothek kann dann erfindungsgemäß normalisiert und, falls erwünscht, in einen oder mehrere Vektoren inseriert werden.
  • Obgleich bei der Normalisierung von Bibliotheken haptenylierte RNA bevorzugt wird, können weitere erfindungsgemäße, haptenylierte Nukleinsäuremoleküle verwendet werden. Beispielsweise kann haptenylierte DNA erfindungsgemäß aus der Bibliothek synthetisiert und verwendet werden.
  • Für die Verwendung bei den Verfahren der Erfindung geeignete Haptene schließen Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G, einen Zelloberflächen-Fc-Rezeptor, ein antikörperspezifisches Antigen, ein enzymspezifisches Substrat, Polymyxin B, Endotoxin-neutralisierendes Protein (ENP), Fe3+, einen Transferrin-Rezeptor, einen Insulin-Rezeptor, einen Cytokin-Rezeptor, CD4, Spektrin, Fodrin, ICAM-1, ICAM-2, C3bi, Fibrinogen, Faktor X, Ankyrin, ein Integrin, Vitronektin, Fibronektin, Kollagen, Laminin, Glycophorin, Mac-1, LFA-1, β-Aktin, gp-120, ein Cytokin, Insulin, Ferrotransferrin, Apotransferrin, Lipopolysaccharid, ein Enzym, einen Antikörper, Biotin und Kombinationen hiervon ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Ein besonders bevorzugtes Hapten ist Biotin.
  • Mittels der oben beschriebenen Verfahren hergestellte hybridisierte Moleküle können erfindungsgemäß isoliert werden, beispielsweise durch Extraktion oder durch Hapten-Ligand-Wechselwirkungen. Bevorzugt werden Extraktionsverfahren (z.B. Verwendung organischer Lösungsmittel) verwendet. Das Isolieren durch Hapten-Ligand-Wechselwirkungen kann durch Inkubieren der haptenylierten Moleküle mit einem festen, zumindest einen haptenbindenden Liganden umfassenden Träger ausgeführt werden. Für die Verwendung bei solchen Isolierungsverfahren bevorzugte Liganden entsprechen dem bestimmten, verwendeten Hapten und schließen Biotin, einen Antikörper, ein Enzym, Lipopolysaccharid, Apotransferrin, Ferrotransferrin, Insulin, ein Cytokin, gp-120, β-Aktin, LFA-1, Mac-1, Glycophorin, Laminin, Kollagen, Fibronektin, Vitronektin, ein Integrin, Ankyrin, C3bi, Fibrinogen, Faktor X, ICAM-1, ICAM-2, Spektrin, Fodrin, CD4, einen Zytokinrezeptor, einen Insulin-Rezeptor, einen Transferrin-Rezeptor, Fe3+, Polymyxin B, Endotoxin-neutralisierendes Protein (ENP), ein enzymspezifisches Substrat, Protein A, Protein G, einen Zelloberflächen-Fc-Rezeptor, ein antikörperspezifisches Antigen, Avidin, Streptavidin oder Kombinationen hiervon ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Der bei diesen Isolierungsverfahren verwendete feste Träger kann Nitrozellulose, Diazozellulose, Glas, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Sepharose, Agar, Stärke, Nylon, ein Latex-Kügelchen, ein magnetisches Kügelchen, ein paramagnetisches Kügelchen, ein superparamagnetisches Kügelchen oder eine Mikrotiterplatte sein.
  • Bevorzugte feste Träger sind magnetische Kügelchen, paramagnetische Kügelchen und superparamagnetische Kügelchen und insbesondere bevorzugt sind solche Kügelchen, die ein oder mehr als ein Streptavidin- oder Avidinmolekül umfassen.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden normalisierte Bibliotheken weiteren Isolierungs- oder Selektionsschritten ausgesetzt, die das Entfernen von ungewollter Kontamination oder ungewolltem Background ermöglichen. Solche Kontamination oder solcher Background können unerwünschte Nukleinsäuren einschließen. Beispielsweise bei der Konstruktion einer zu normalisierenden Bibliothek in einen oder mehr als einen Vektor kann ein geringer Prozentsatz an Vektoren (ohne Inserts) in der Bibliothek vorhanden sein. Nach der Normalisierung können solche wenig häufigen Moleküle (z.B. Vektor-Background) aufgrund des Normalisierungsvorgangs als Bestandteil an Bedeutung gewinnen. Das bedeutet, dass das relative Niveau eines solch wenig häufigen Backgrounds als Teil des Normalisierungsvorgangs angehoben werden kann.
  • Das Entfernen solcher kontaminierender Nukleinsäuren kann durch Inkubieren einer normalisierten Bibliothek mit einer oder mehr als einer haptenylierten, für die Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek spezifischen Sonde (z.B. zielspezifische Sonden) ausgeführt werden. Prinzipiell kann das Entfernen der kontaminierenden Sequenzen durch Selektion der die Sequenz von Interesse aufweisenden Nukleinsäuren oder durch Eliminieren jener Moleküle, die keine Sequenzen von Interesse enthalten, ausgeführt werden. Das Entfernen der kontaminierenden Nukleinsäuremoleküle kann erfindungsgemäß auf jeder beliebigen, normalisierten Bibliothek ausgeführt werden (unabhängig davon, ob die Bibliothek kann in einen Vektor konstruiert ist oder nicht). Somit können die Sonden so gestaltet werden, dass sie kontaminierende Nukleinsäuren nicht erkennen oder an diese hybridisieren (wie in der bevorzugten, die oligodA-NotI-3'-Biotin-Sonde verwendenden Ausführungsform). Nach der Hybridisierung der haptenylierten Sonde mit Nukleinsäuremolekülen der Bibliothek binden die haptenylierten Sonden an selektierte, erwünschte Sequenzen innerhalb der normalisierten Bibliothek an und lassen die kontaminierenden Nukleinsäuremolekülen zurück, was zu einer selektierten, normalisierten Bibliothek führt. Dann kann die selektierte, normalisierte Bibliothek isoliert werden. Gemäß einem bevorzugten Aspekt sind solch isolierte, selektierte, normalisierte Bibliotheken einzelsträngig und können nach der Selektion durch Inkubieren der einzelsträngigen Bibliothek unter ausreichenden Bedingungen, um die Nukleinsäuremoleküle doppelsträngig zu machen, doppelsträngig gemacht werden. Die doppelsträngigen Moleküle werden dann in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen. Alternativ kann die normalisierte Bibliothek unter Verwendung der haptenylierten Sonde oder des haptenylierten Primers (bevorzugt zielspezifisch) doppelsträngig gemacht werden und dann durch Extraktion oder Ligand-Hapten-Wechselwirkungen selektiert werden. Solche doppelsträngigen Moleküle können dann in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung können die kontaminierenden Nukleinsäuren durch Inkubieren der normalisierten Bibliothek bei Vorhandensein von einem oder mehr als einem für Bibliothekssequenzen spezifischen Primer reduziert oder eliminiert werden (spezifisch für Klone, die Inserts enthalten, z.B. oligodA-NotI). Dieser Aspekt der Erfindung kann das Inkubieren der einzelsträngigen, normalisierten Bibliothek mit einem oder mehr als einem Nukleotid (bevorzugt Nukleotide, die den synthetisierten Nukleinsäuremolekülen Nukleaseresistenz verleihen) und mit einem oder mehr als einem Polypeptid mit Polymerase-Aktivität bei ausreichenden Bedingungen, um die Nukleinsäuremoleküle doppelsträngig zu machen, umfassen. Die daraus hervorgehenden, doppelsträngigen Moleküle können dann in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden. Alternativ können die daraus hervorgehenden, doppelsträngigen Moleküle, die Nukleaseresistenz verleihende Nukleotide enthalten, mit solch einer Nuklease verdaut oder in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt kann das Eliminieren oder Entfernen der kontaminierenden Nukleinsäure vor der Normalisierung der Bibliothek ausgeführt werden, was zu der selektierten, normalisierten Bibliothek der Erfindung führt. Bei einem solchen Verfahren kann die zu normalisierende Bibliothek jedem beliebigen, hierin beschriebenen Verfahren zum Entfernen ungewollter Nukleinsäuremoleküle ausgesetzt werden und die Bibliothek kann dann mittels des erfindungsgemäßen Vorgangs zwecks Bereitstellen selektierter, normalisierter Bibliotheken der Erfindung normalisiert werden.
  • Doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle werden erfindungsgemäß bevorzugt vor der Hybridisierung einzelsträngig gemacht. Somit können die Verfahren der Erfindung ferner die Behandlung der oben beschriebenen doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek unter ausreichenden Bedingungen, um die Nukleinsäuremoleküle einzelsträngig zu machen, umfassen. Solche Bedingungen können den Abbau eines Stranges der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle (bevorzugt unter Verwendung von Gen II Protein und Exonuklease III) oder Denaturieren der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle unter Verwendung von Wärme, Lauge und dergleichen umfassen.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenso auf normalisierte Nukleinsäurebibliotheken, auf selektierte, normalisierte Nukleinsäurebibliotheken und auf transformierte Wirtszellen, die mittels der oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.
  • 1 ist ein Schema des Phagemids, der zur Konstruktion einer direktional klonierten cDNA-Bibliothek verwendet wurde.
  • 2 ist ein schematisches Diagramm der Herstellung von normalisierten Phagemid-Bibliotheken unter Verwendung von subtraktiver Hybridisierung mit einer biotinylierten Gesamtbibliotheks-Driver-RNA, auf die unter dem Synonym haptenylierte Nukleinsäuremoleküle Bezug genommen wird.
  • 3 ist ein Diagramm, das zeigt, wie 3'-biotinylierte, zielspezifische Sonden zur Herstellung von normalisierten Phagemid-Bibliotheken mit niedrigem Background, die hierin auch als selektierte, normalisierte Bibliotheken bezeichnet werden, verwendet werden können.
  • 4 ist ein Diagramm, das zeigt, wie eine 5'-biotinylierte, zielspezifische Sonde zur Reduktion von Background von normalisierten Phagemid-Bibliotheken, die hierin auch als selektierte, normalisierte Bibliotheken bezeichnet werden, verwendet werden kann.
  • 5 ist ein Diagramm, das zeigt, wie nukleaseresistente Nukleotide und eine Nuklease zu normalisierten Phagemid-Bibliotheken mit niedrigem Background, die hierin auch als selektierte, normalisierte Bibliotheken bezeichnet werden, führen.
  • 6 ist eine Fotografie eines Ethidiumbromid-gefärbten Gels der Anreicherung zahlreicher TGFβ cDNAs, die in einer nicht-normalisierten cDNA-Bibliothek bei gewichtig unterschiedlichen Häufigkeiten oder in einer normalisierten Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn bei verschiedenen Cot-Werten der Subtraktion vorhanden sind, bei denen zwei unterschiedliche Verfahren zum Eliminieren von Background angewandt wurden.
  • 7 ist eine schematische Darstellung der Normalisierung einer Bibliothek unter Verwendung von Adaptoren, die Promotoren umfassen. Nach der Normalisierung kann die Bibliothek in einen Vektor kloniert werden. Bei diesem Verfahren kann das Entfernen der kontaminierenden Vektorsequenzen unnötig sein, da die Selektion der Background-Sequenzen vor dem Klonieren ausgeführt werden kann.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen
  • In der nachfolgenden Beschreibung wird eine Reihe von im Bereich der rekombinanten DNA-Technologie verwendeter Begriffe ausführlich verwendet. Zwecks eines besseren und einheitlichen Verständnisses der Beschreibung und der Ansprüche, einschließlich dem solchen Begriffen zu verleihendem Umfang, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt.
  • Bibliothek.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Bibliothek" oder „Nukleinsäurebibliothek" ein Set von Nukleinsäuremolekülen (ringförmig oder linear), die alle oder einen Teil des DNA-Inhalts eines Organismus repräsentieren (eine „Genom-Bibliothek"), oder ein Set von Nukleinsäuremolekülen, die alle oder einen signifikanten Teil der exprimierten Gene in einer Zelle, einem Gewebe, einem Organ oder einem Organismus repräsentieren (eine „cDNA-Bibliothek"). Solche Bibliotheken können in einem oder mehr als einem Vektor enthalten sein oder nicht.
  • Normalisiert.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „normalisiert" oder "normalisierte Bibliothek" eine Nukleinsäurebibliothek, die bevorzugt unter Verwendung der Verfahren der Erfindung manipuliert wurde, um die relative Variation der Häufigkeit der Nukleinsäuremolekülelemente in der Bibliothek auf einen Bereich von nicht größer als ungefähr 25-fach, nicht größer als ungefähr 20-fach, nicht größer als ungefähr 15-fach, nicht größer als ungefähr 10-fach, nicht größer als ungefähr 7-fach, nicht größer als ungefähr 6-fach, nicht größer als ungefähr 5-fach, nicht größer als ungefähr 4-fach, nicht größer als ungefähr 3-fach oder nicht größer als ungefähr 2-fach, zu reduzieren.
  • Driver.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Driver" auf eine Population von Nukleinsäuremolekülen (bevorzugt RNA), die zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle einer Bibliothek komplementär sind. Ein solcher Driver umfasst bevorzugt ein oder mehr als ein Hapten und ist bevorzugt im Vergleich zu der Bibliothek von Interesse in molarem Überschuss (größer als 10-fach, bevorzugt größer als 20-fach). Der Driver wird erfindungsgemäß bevorzugt aus der zu normalisierenden Bibliothek synthetisiert und dann zur Normalisierung dieser Bibliothek verwendet.
  • Background.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich Background auf kontaminierende Nukleinsäuremoleküle, die in einer konstruierten Bibliothek vorhanden sein können. Übliche kontaminierende Nukleinsäuremoleküle sind Vektoren, in denen die Bibliothek konstruiert wurde, die aber das inserierte Nukleinsäuremolekül (durch Deletion oder auf andere Weise) verloren haben oder die keine Nukleinsäure-Inserts enthalten. Die hierin beschriebenen, zielspezifischen Sonden oder Primer werden nicht zu kontaminierenden oder Background-Sequenzen hybridisieren.
  • Vektor.
  • Wie hierin verwendet, ist ein „Vektor" ein Plasmid, Cosmid, Phagemid oder eine DNA-Phage oder ein weiteres DNA-Molekül, der zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle fähig ist und der sich durch eine oder eine geringe Anzahl von Erkennungsstellen für Restriktionsendonuklease charakterisiert, an der/denen solche DNA-Sequenzen in einer vorbestimmten Art und Weise ohne Verlust einer wesentlichen, biologischen Funktion des Vektors geschnitten werden können und in den zwecks Replikation und Klonierung DNA-Sequenzen inseriert werden kann. Der Vektor kann ferner ein für die Verwendung bei der Identifizierung von mit dem Vektor transformierten Zellen geeigneter Marker sein. Marker schließen beispielsweise Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Primer.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „Primer" auf ein einzelsträngiges Oligonukleotid, das durch kovalente Bindung des Nukleotid-Monomers während der Amplifikation oder Polymerisation eines DNA-Moleküls verlängert wird.
  • Sonde.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „Sonde" auf ein einzelsträngiges Oligonukleotid, das zur Hybridisierung und/oder Isolierung von einem oder mehr als einem Nukleinsäuremolekül von Interesse verwendet werden kann. Solche Sonden können ein oder mehr als ein Hapten umfassen oder nicht.
  • Templat.
  • Der Begriff „Templat" bezieht sich wie hierin verwendet auf doppelsträngige oder einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle, die amplifiziert, synthetisiert oder sequenziert werden sollen. Bei einem doppelsträngigen Molekül wird das Denaturieren seiner Stränge zur Bildung eines ersten und eines zweiten Stranges bevorzugt vor der Amplifikation, Synthese oder Sequenzierung dieser Moleküle ausgeführt oder das doppelsträngige Molekül kann direkt als ein Templat verwendet werden. Bei einzelsträngigen Templaten wird ein zu einem Teil des Templats komplementärer Primer unter geeigneten Bedingungen hybridisiert und eine oder mehr als eine Polymerase können dann ein zu dem gesamten oder einem Teil dieses Templats komplementäres Nukleinsäuremolekül synthetisieren. Alternativ können bei doppelsträngigen Templaten ein oder mehr als ein Promotor (z.B. Promotor) in Kombination mit einer oder mehreren Polymerasen zur Bildung von zu dem gesamten oder einem Teil des Templats komplementären Nukleinsäuremolekülen verwendet werden. Die Länge der neu synthetisierten Moleküle kann erfindungsgemäß gleich der Länge oder kleiner als die Länge des ursprünglichen Templats sein.
  • Inkorporieren.
  • Der Begriff „Inkorporieren" wie hierin verwendet bedeutet das Teilwerden eines DNA- und/oder RNA-Moleküls oder Primers.
  • Amplifikation.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „Amplifikation" auf jedes beliebige in vitro Verfahren zur Erhöhung der Anzahl an Kopien einer Nukleotidsequenz durch die Verwendung einer Polymerase. Nukleinsäure-Amplifikation führt zum Inkorporieren von Nukleotiden in ein DNA- und/oder RNA-Molekül oder einen Primer, wodurch ein neues, zu einem Templat komplementäres Molekül gebildet wird. Das gebildete Nukleinsäuremolekül und sein Templat können als Template zur Synthese zusätzlicher Nukleinsäuremoleküle verwendet werden. Wie hierin verwendet, kann eine Amplifikationsreaktion aus mehreren Replikationsrunden bestehen. DNA-Amplifikationsreaktionen schließen beispielsweise Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) ein. Eine PCR-Reaktion kann aus 5 bis 100 Synthese- und Denaturierungs-„Zyklen" eines DNA-Moleküls bestehen.
  • Oligonukleotid.
  • „Oligonukleotid" bezieht sich auf ein synthetisches oder natürliches Molekül, das eine kovalent gebundene Nukleotidsequenz, die mittels einer Phosphodiester-Bindung zwischen der 3'-Position der Desoxyribose oder Ribose von einem Nukleotid und der 5'-Position der Desoxyribose oder Ribose des darunterliegenden Nukleotids verbunden sind. Ein blockierendes Oligonukleotid bezieht sich auf Oligonukleotide, die verwendet werden, um die Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen (z.B. eine Sonde oder ein Primer) an ungewollten oder unerwünschten Moleküle zu vermeiden. Beispielsweise kann das blockierende Oligonukleotid vermeiden, dass die 5'- und in einigen Fällen die 3'-Endsequenzen der Driver-Komponenten an den Bibliotheksvektor hybridisieren.
  • Nukleotid.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „Nukleotid" auf eine Kombination aus Base, Zucker und Phosphat. Nukleotide sind monomere Einheiten einer Nukleinsäuresequenz (DNA und RNA). Der Begriff Nukleotid schließt Ribonukleosidtriphosphat ATP, UTP, CTP, GTP und Desoxyribonukleosidtriphosphat wie etwa dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP und Derivate davon ein. Solche Derivate schließen beispielsweise [αS]dATP, 7-Deaza-dGTP und 7-Deaza-dATP und Nukleotidderivate, die den diese enthaltenden Nukleinsäuremolekülen Nukleaseresistenz verleihen, ein. Der Begriff Nukleotid bezieht sich wie hierin verwendet ebenfalls auf Didesoxyribosenukleosidtriphosphate (ddNTPs) und ihre Derivate. Beispiele von Didesoxyribosenukleosidtriphosphaten schließen ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP und ddTTP ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Ein „Nukleotid" kann erfindungsgemäß unmarkiert oder durch gut bekannte Techniken detektierbar markiert sein. Detektierbare Marker schließen beispielsweise radioaktive Isotope, fluoreszierende Marker, chemilumineszierende Marker, biolumineszierende Marker und Enzymmarker ein.
  • Hybridisierung.
  • Die Begriffe „Hybridisierung" und „Hybridisieren" beziehen sich auf eine Basenpaarung von zwei komplementären, einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen (RNA und/oder DNA), um ein doppelsträngiges Molekül zu ergeben. Wie hierin verwendet, können zwei Nukleinsäuremoleküle hybridisiert werden, obwohl die Basenpaarung nicht vollständig komplementär ist. Dementsprechend verhindern Mismatch-Basen die Hybridisierung von zwei Nukleinsäuremolekülen nicht, unter der Voraussetzung, dass geeignete, im Stand der Technik gut bekannte Bedingungen verwendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Hybridisierung" insbesondere auf die Hybridisierung eines Drivers an eine zu normalisierende Bibliothek. Weitere, im Bereich der rekombinanten DNA-Technologie und Molekular- und Zellbiologie verwendete Begriffe sind wie hierin für einen Durchschnittsfachmann in der angewandten Technik verständlich.
  • Überblick
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren zur Herstellung von normalisierten Nukleinsäurebibliotheken und auf mittels dieser Verfahren hergestellte normalisierte Bibliotheken. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die hergestellte normalisierte Bibliothek eine cDNA-Bibliothek, die einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann. Die Normalisierung einer Nukleinsäurebibliothek wird erfindungsgemäß unter Verwendung haptenylierter Nukleinsäuremoleküle (d. h. Nukleinsäuremoleküle, die über ein oder mehr als ein, hieran gebundenes Haptenmolekül verfügen, wie bei den unten beschriebenen), die die zahlreicheren Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek schneller hybridisieren, ausgeführt. Solche haptenylierten Nukleinsäuremoleküle werden auch als Driver bezeichnet. Diese Hybridisierung bildet Komplexe aus Nukleinsäuremolekülen, die dann bevorzugt mittels Ligand-Hapten-Wechselwirkungen oder mittels Extraktionstechniken entfernt werden können (wodurch die Häufigkeit der gebundenen Nukleinsäuremoleküle in der Bibliothek reduziert wird). Es wurde entdeckt, dass mittels der Verfahren der Erfindung normalisierte Nukleinsäurebibliotheken, deren maximale Variation der Häufigkeit der Nukleinsäuremolekülelemente nicht größer als ungefähr 2- bis ungefähr 10-fach ist, hergestellt werden können. Darüber hinaus stellen die Verfahren der Erfindung normalisierte Bibliotheken bereit, die einen wesentlich reduzierten Background aufweisen. Somit stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäurebibliotheken, insbesondere von cDNA-Bibliotheken, bereit, deren jedes Nukleinsäuremolekülelement unabhängig von seiner Anzahl an Kopien in der ursprünglichen Bibliothek mit annähernd gleicher Wahrscheinlichkeit isoliert werden kann.
  • Quellen von Nukleinsäurebibliotheken
  • Unter Verwendung der Verfahren der Erfindung können aus einer Vielzahl von Nukleinsäurebibliotheken normalisierte Nukleinsäurebibliotheken, insbesondere normalisierte cDNA-Bibliotheken, hergestellt werden. Solche zu normalisierende Bibliotheken können unter Verwendung von standardmäßigen Techniken hergestellt werden oder im Handel erhältlich sein (Life Technologies, Inc., Rockville, MD). Bei der vorliegenden Erfindung verwendbare Nukleinsäurebibliotheken schließen jene Bibliotheken ein, die Populationen von einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen oder bevorzugt Populationen von einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNA-Molekülen umfassen. Bevorzugtere, erfindungsgemäß zu normalisierende Nukleinsäurebibliotheken schließen jene ein, die komplementäre DNA(cDNA)-Bibliotheken umfassen. Solche cDNA-Bibliotheken (doppelsträngig oder einzelsträngig) können unter Verwendung gut bekannter Techniken, die Messenger-RNA oder PolyA+ RNA verwenden, hergestellt werden oder im Handel beispielsweise von Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland) erworben werden, oder weitere, kommerzielle, dem Durchschnittsfachmann vertraute Quellen sein. Erfindungsgemäß verwendete cDNA-Bibliotheken werden bevorzugt mit reverser Transkriptase mit im Wesentlichen reduzierter RNase H-Aktivität (siehe unten) hergestellt. Bei der Konstruktion von Bibliotheken werden die pCMVSPORT-Vektoren bevorzugt und cDNA-Bibliotheken von Life Technologies, Inc. (Rockville, MD) befinden sich in diesen Vektoren. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung können die Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek in einem oder mehreren Vektoren wie etwa Plasmiden, Cosmiden oder Phagen, enthalten sein.
  • Die Nukleinsäurebibliotheken können erfindungsgemäß aus Populationen von aus natürlichen Quellen gewonnenen Nukleinsäuremolekülen, wie etwa einer Vielzahl von Zellen, Geweben, Organen oder Organismen, hergestellt werden. Als Quellen für Nukleinsäuremoleküle verwendbare Zellen können prokaryotische (bakterielle Zellen, einschließlich jener der Gattungsarten Escherichia, Bacillus, Serratia, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Chlamydia, Neisseria, Treponema, Mycoplasma, Borrelia, Legionella, Pseudomonas, Mycobacterium, Helicobacter, Erwinia, Agrobacterium, Rhizobium und Streptomyces) oder eukaryotische Zellen (einschließlich Pilzen, insbesondere Hefen), Zellen von Pflanzen, Einzellern und weiteren Parasiten und Tieren, einschließlich Insekten (insbesondere Zellen von Drosophila spp.), Fadenwürmern (insbesondere Zellen des Caenorhabditis elegans) und Säugetieren (insbesondere humane Zellen) stammen.
  • Somatische Säugetierzellen, die als Quellen von Populationen oder Bibliotheken von Nukleinsäuren verwendet werden können, schließen Blutkörperchen (Retikulozyten und Leukozyten), Endothelzellen, Epithelzellen, neuronale Zellen (aus dem zentralen oder peripheren Nervensystem), Muskelzellen (einschließlich Myozyten und Myoblasten aus Skelett- und Herzmuskeln und glatten Muskeln), Bindegewebszellen (einschließlich Fibroblasten, Adipozyten, Chondrozyten, Chondroblasten, Osteozyten und Osteoblasten) und weiteren Stromazellen (z.B. Makrophagen, dentritische Zellen, Schwannsche Zellen) ein. Keimzellen von Säugetieren (Spermatozyten oder Oozyten) können ebenfalls als Quellen für erfindungsgemäß verwendbare Nukleinsäuren oder Bibliotheken verwendet werden, wie auch Progenitor-, Vorläufer- und Stammzellen, aus denen die oben genannten somatischen Zellen und Keimzellen hervorgehen. Für die Verwendung als Nukleinsäurequellen ebenfalls geeignet sind Gewebe oder Organe von Säugetieren, sowohl jene, die aus Quellen aus Gehirn, Nieren, Leber, Bauchspeicheldrüse, Blut, Knochenmark, Muskeln, Nerven, Hauturogenitalen stammen oder aus zirkulatorischen, lymphartigen, gastrointestinalen und Bindegewebsquellen, als auch jene, die aus einem Embryo oder Fötus von Säugetieren (einschließlich Mensch) stammen.
  • Alle oben genannten prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, Gewebe oder Organe können normal, erkrankt, transformiert, etabliert, Progenitoren, Vorläufer, fötal oder embryonal sein. Erkrankte Zellen können beispielsweise jene einschließen, die in Infektionskrankheiten (durch Bakterien, Pilze oder Hefe, Viren (einschließlich HIV) oder Parasiten hervorgerufen), genetischen oder biochemischen Pathologien (z.B. zystische Fibrose, Hämophilie, Morbus Alzheimer, Muskeldystrophie oder Multiple Sklerose) oder in krebsartigen Prozessen involviert sind. Transformierte oder etablierte Tierzelllinien können beispielsweise COS-Zellen, CHO-Zellen, VERO-Zellen, BHK-Zellen, HeLa-Zellen, HepG2-Zellen, K562-Zellen, F9-Zellen und dergleichen einschließen. Dem Durchschnittsfachmann werden weitere Zellen, Zelllinien, Gewebe, Organe und Organismen, die als Quellen von Nukleinsäuren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, ersichtlich sein. Diese Zellen, Gewebe, Organe und Organismen können aus ihren natürlichen Quellen stammen oder im Handel von Quellen wie etwa American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) und weiteren, dem Fachmann bekannten Quellen erhältlich sein.
  • Nach Erhalt der Ausgangszellen, -gewebe, -organe und weiterer Ausgangsproben können Nukleinsäuremoleküle (wie etwa mRNA oder PolyA+ RNA) isoliert werden und davon ausgehend können Nukleinsäurebibliotheken (wie etwa cDNA-Bibliotheken) mittels im Stand der Technik gut bekannter Verfahren hergestellt werden (Siehe, z.B., Maniatis, T., et al., Cell 15: 687–701 (1978); Okayama, H., und Berg, P., Mol. Cell. Biol. 2: 161–170 (1982); Gubler, U., und Hoffman, B.J., Gene 25: 263–269 (1983)). Wie oben angemerkt, enthalten auf diese Art und Weise hergestellte Nukleinsäurebibliotheken abhängig von der Zell-, Gewebs- oder Organismusquelle und dem Entwicklungsstadium oder dem Zellzyklus der Quelle üblicherweise einen breiten Bereich von Häufigkeiten der Nukleinsäuremolekülelemente. Dann können die Verfahren der Erfindung zwecks Normalisierung oder Schmälerung oder Reduktion der relativen Häufigkeiten von Nukleinsäuremolekülen in der Nukleinsäurebibliothek verwendet werden.
  • Herstellung von normalisierten Nukleinsäurebibliotheken
  • Bei der praktischen Umsetzung der Erfindung werden Nukleinsäurebibliotheken normalisiert, um durch Verfahren, die einen oder mehr als einen Schritt umfassen können, normalisierte Nukleinsäurebibliotheken herzustellen. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung kann beispielsweise folgendes umfassen:
    • (a) Synthetisieren von einem oder mehr als einem Nukleinsäuremolekül, die zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek komplementär sind, wobei die synthetisierten Nukleinsäuremoleküle zumindest ein Hapten umfassen, wodurch haptenylierte Nukleinsäuremoleküle hergestellt werden (z.B. Driver).
    • (b) Inkubieren einer Nukleinsäurebibliothek, um durch die haptenylierten Nukleinsäuremoleküle unter Bedingungen, die die Hybridisierung der zahlreicheren Moleküle in der Bibliothek mit den haptenylierten Nukleinsäuremolekülen begünstigen, normalisiert zu werden; und
    • (c) Entfernen der hybridisierten Moleküle, wodurch eine normalisierte Bibliothek hergestellt wird.
  • Haptenylierte, zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek komplementäre Nukleinsäuremoleküle können erfindungsgemäß beispielsweise durch Inkubieren der Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek mit zumindest einem Polypeptid mit Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität und mit zumindest einem, zumindest ein Hapten umfassenden Nukleotid hergestellt werden. Wenn ein oder mehr als ein Primer für die Synthese verwendet werden, können die Primer zwecks Herstellung der haptenylierten Nukleinsäuremoleküle ein oder mehr als ein Hapten umfassen (ohne oder mit der Verwendung haptenylierter Nukleotide während der Synthese). Gemäß diesem Aspekt der Erfindung verwendbare, bevorzugte Polypeptide mit Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität schließen jene ein, die reverse Transkriptase-Aktivität aufweisen, und jene, die DNA-Polymerase- oder RNA-Polymerase-Aktivität aufweisen.
  • Bevorzugte Polypeptide mit reverser Transkriptase-Aktivität (d. h. jene Polypeptide, die die Synthese eines DNA-Moleküls von einem RNA-Templat katalysieren können) schließen Moloney's Murine Leukamia Virus (M-MLV) Reverse Transkriptase, Rous Sarcoma Virus (RSV) Reverse Transkriptase, Avian Myeloblastosis Virus (AMV) Reverse Transkriptase, Rous associated Virus (RAV) Reverse Transkriptase, Myeloblastosis associated Virus (MAV) Reverse Transkriptase, Humanes Immundefizienz Virus (HIV) Reverse Transkriptase, retrovirale reverse Transkriptase, Retrotransposon Reverse Transkriptase, Hepatitis B Reverse Transkriptase, Blumenkohl-Mosaik-Virus Reverse Transkriptase und bakterielle reverse Transkriptase ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Insbesondere bevorzugt sind jene Polypeptide mit reverser Transkriptase-Aktivität, deren RNase H-Aktivität (d. h. „RNASE H"-Polypeptide) ebenfalls im Wesentlichen reduziert ist. Unter einem Polypeptid, das „im Wesentlichen reduzierte RNASE H-Aktivität" aufweist, versteht man, dass das Polypeptid weniger als ungefähr 20 %, bevorzugter weniger als ungefähr 15 %, 10 % oder 5 % und am bevorzugtesten weniger als ungefähr 2 % der RNASE H-Aktivität eines Wildtyp- oder RNASE H+-Enzyms wie etwa Wildtyp-M-MuLV Reverse Transkriptase aufweist. Die RNASE H-Aktivität kann durch eine Vielzahl von Assays bestimmt werden, wie jene, die beispielsweise im U.S. Patent Nr. 5,244,797, in Kotewicz, M.L., et al., Nucl. Acids Res. 16: 265 (1988) und in Gerard, G.F., et al., FOCUS 14 (5): 91 (1992), deren aller Offenbarungen durch Bezugnahme hierin vollständig inkorporiert sind, beschrieben werden. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete RNASE H-Polypeptide schließen M-MLV H Reverse Transkriptase, RSV H Reverse Transkriptase, AMV H Reverse Transkriptase, RAV H Reverse Transkriptase, MAV H Reverse Transkriptase, HIV H Reverse Transkriptase und SUPERSCRIPTTM I Reverse Transkriptase und SUPERSCRIPTTM II Reverse Transkriptase, die im Handel beispielsweise von Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland) erhältlich sind, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Weitere, für die Verwendung in den vorliegenden Verfahren geeignete Polypeptide mit Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität schließen DNA-Polymerasen, wie etwa DNA-Polymerase I, DNA-Polymerase III, Klenow-Fragment, T7-Polymerase und T5-Polymerase, und wärmebeständige DNA-Polymerasen einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Thermus thermophilus (Tth) DNA-Polymerase, Thermus aquaticus (Taq) DNA-Polymerase, Thermotoga neopolitana (Tne) DNA-Polymerase, Thermotoga maritima (Tma) DNA-Polymerase, Thermococcus litoralis (Tli oder VENT®) DNA-Polymerase, Pyrococcus furiosus (Pfu oder DEEPVENT®) DNA-Polymerase, Pyrococcus woosii (Pwo) DNA-Polymerase, Bacillus sterothermophilus (Bst) DNA-Polymerase, Sulfolobus acidocaldarius (Sac) DNA-Polymerase, Thermoplasma acidophilum (Tac) DNA-Polymerase, Thermus flavus (Tfl/Tub) DNA-Polymerase, Thermus ruber (Tru) DNA-Polymerase, Thermus brockianus (DYNAZYME®) DNA-Polymerase, Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth) DNA-Polymerase, und Mutanten, Varianten und Derivate davon ein.
  • Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugte RNA-Polymerasen können SP6 RNA-Polymerase, T7 RNA-Polymerase, T3 RNA-Polymerase und dergleichen einschließen. Bei der Verwendung von RNA-Polymerasen werden üblicherweise ein oder mehr als ein Promotor (z.B. SP6-Promotor, T7-Promotor, etc.) verwendet. Beispielsweise werden doppelsträngige DNA-Moleküle (oder doppelsträngige Bibliothek), die einen oder mehr als einen Promotor enthalten, in Kombination mit einer oder mehr als einer RNA-Polymerase verwendet, um haptenylierte, zu der gesamten oder Teilen des doppelsträngigen Bibliothekstemplats komplementäre RNA-Moleküle herzustellen. Bevorzugt sind solche RNA-Moleküle im Vergleich zu den Templaten in großem molarem Überschuss vorhanden. Solche Promotoren können erfindungsgemäß von dem Vektor, in dem die Bibliotheksmoleküle kloniert werden, oder von den den Bibliotheksmolekülen hinzugefügten Adaptormolekülen (z.B. doppelsträngige Oligonukleotide) bereitgestellt werden. Bei Verwendung solcher Adaptormoleküle werden den Bibliotheksmolekülen die Adaptoren (die bevorzugt einen oder mehr als einen Promotor umfassen) hinzugefügt. Bevorzugt sind die Bibliotheksmoleküle doppelsträngige, lineare Moleküle (z.B. doppelsträngige, lineare, nach erster und zweiter Synthese hergestellte cDNA) und die Adaptoren können unter Verwendung von standardmäßigen Techniken (z.B. Ligase) einem oder beiden Enden solcher Moleküle hinzugefügt werden.
  • Bei der Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugte Nukleotide schließen Ribonukleosidtriphosphate wie etwa ATP, UTP, CTP, GTP und Derivate davon und Desoxyribonukleosidtriphosphate wie etwa dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP oder Derivate davon ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Solche Derivate schließen [αS] dATP, 7-Deaza-dGTP und 7-Deaza-dATP oder die entsprechenden Ribonukleosidtriphosphate ein, in denen Desoxyribose durch Ribose ersetzt wurde. Die Nukleotide oder Derivate davon umfassen erfindungsgemäß bevorzugt ein oder mehr als ein kovalent an diese gebundenes Haptenmolekül.
  • Bei der Verwendung bei diesen Verfahren bevorzugte Haptenmoleküle schließen ohne Einschränkung folgendes ein: (i) Biotin; (ii) einen Antikörper; (iii) ein Enzym; (iv) Lipopolysaccharid; (v) Apotransferrin; (vi) Ferrotransferrin; (vii) Insulin; (viii) Zytokine (Wachstumsfaktoren, Interleukine oder koloniestimulierende Faktoren); (ix) gp-120; (x) β-Aktin; (xi) LFA-1; (xii) Mac-1; (xiii) Glycophorin; (xiv) Laminin; (xv) Kollagen; (xvi) Fibronektin; (xvii) Vitronektin; (xviii) Integrine αvβ1 und αvβ3; (xix) Integrine α3β1, α4β1, α4β7, α5β1, αvβ1, αTTbβ3, αvβ3 und αvβ6; (xx) Integrine α1β1, α2β1, α3β1, und αvβ3; (xxi) Integrine α1β1, α2β1, α3β1, α6β1, α7β1 und α6β5; (xxii) Ankyrin; (xxiii) C3bi, Fibrinogen oder Faktor X; (xxiv) ICAM-1 oder ICAM-2; (xxv) Spektrin oder Fodrin; (xxvi) CD4; (xxvii) einen Cytokin-Rezeptor (z.B. Wachstumsfaktor, Interleukin oder koloniestimulierender Faktor); (xxviii) einen Insulin-Rezeptor; (xxix) einen Transferrin-Rezeptor; (xxx) Fe3+; (xxxi) Polymyxin B oder Endotoxin-neutralisierendes Protein (ENP); (xxxii) ein enzymspezifisches Substrat; (xxxiii) Protein A, Protein G, einen Zelloberflächen-Fc-Rezeptor oder ein antikörperspezifisches Antigen; (xxxiv) Avidin und Streptavidin; und Kombinationen davon. Ein bei der Verwendung in den Verfahren der Erfindung besonders bevorzugtes Hapten ist Biotin. Unter Verwendung herkömmlicher, organischer, dem Durchschnittsfachmann vertrauter Syntheseverfahren können die haptenylierten Nukleinsäuremoleküle, worin ein oder mehr als ein Haptenmolekül an ein oder mehr als ein Nukleotid der Nukleinsäuremoleküle gebunden (bevorzugt kovalent) ist/sind, hergestellt werden. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise an dem 5'-Ende biotinyliert werden, indem zuerst 5'-Amino-(NH2)-Gruppen produziert werden und dann Cab-NHS-Ester hinzugefügt wird (Langer, P.R., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 78: 6 633 (1981)). Gemäß einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein haptenyliertes Nukleinsäuremolekül hergestellt, das ein RNA-Molekül oder ein DNA-Molekül sein kann und ein oder mehr als ein, zwei oder mehr als zwei, drei oder mehr als drei oder vier oder mehr als vier Haptenmoleküle, am bevorzugtesten Biotinmoleküle, umfasst.
  • Nachdem die haptenylierten, zu den Nukleinsäuremolekülen der Bibliothek komplementären Nukleinsäuremoleküle hergestellt wurden, werden sie zur Normalisierung der Nukleinsäurebibliothek durch Hybridisierung verwendet. Im Speziellen wird die zu normalisierende Nukleinsäurebibliothek bevorzugt mit einem molaren Überschuss der Population von haptenylierten Nukleinsäuremolekülen (z.B. größer oder gleich dem 10-fachen oder bevorzugt größer als oder gleich dem 20-fachen molaren Überschuss) inkubiert, wie oben beschrieben unter Bedingungen, welche die schnellere Hybridisierung der haptenylierten Nukleinsäuremoleküle zu den zahlreicheren Nukleinsäuremolekülen und die langsamere Hybridisierung zu den weniger zahlreichen, in der Bibliothek vorhandenen Nukleinsäuremoleküle begünstigen, hergestellt. Solche, die Hybridisierung begünstigenden Bedingungen können beispielweise das Inkubieren der Bibliothek zwecks Normalisierung mit den haptenylierten Nukleinsäuremolekülen bei einem Bereich von Cot-Werten umfassen. Der Cot-Wert ist das Produkt der Ausgangskonzentration an Nukleinsäure (Mol Nukleotide pro Liter, Co) und Zeit (Sekunden, t). Der Cot-Wert ergibt sich aus dem Konvertieren der Konzentration der reagierenden Nukleotide und der Zeit der Hybridisierung in Standardeinheiten (Mol·Sekunde·L–1 oder M·Sekunde). Wie unten in den Beispielen im Detail beschrieben, schließen die bei der Verwendung in den vorliegenden Verfahren besonders bevorzugten Cot-Werte, ohne darauf beschränkt zu sein, ein: einen Cot-Wert gleich oder größer 25; einen Cot-Wert gleich oder größer 50; einen Cot-Wert gleich oder größer 100, einen Cot-Wert gleich oder größer 200; einen Cot-Wert gleich oder größer 250; einen Cot-Wert gleich oder größer 500; einen Cot-Wert gleich oder kleiner 1 000; und einen Cot-Wert kleiner als ungefähr 10 000. Alternativ können Hybridisierungsbedingungen verwendet werden, die aus einem Bereich an Cot-Werten bestehen, der einen Cot-Wert von ungefähr 10 bis ungefähr 10 000; einen Cot-Wert von ungefähr 25 bis ungefähr 10 000; einen Cot-Wert von ungefähr 50 bis ungefähr 10 000; einen Cot-Wert von ungefähr 100 bis ungefähr 10 000; einen Cot-Wert von ungefähr 200 bis ungefähr 10 000; einen Cot-Wert von ungefähr 250 bis ungefähr 10 000; und einen Cot-Wert von ungefähr 500 bis ungefähr 10 000 einschließt. Dem Durchschnittsfachmann sind weitere, für die Verwendung in den vorliegenden Verfahren geeignete Hybridisierungsbedingungen ersichtlich und können lediglich mit routinemäßigen Versuchen bestimmt werden.
  • Unter diesen Bedingungen hybridisieren die haptenylierten Nukleinsäuremoleküle schneller an die zahlreicheren, in der Bibliothek vorhandenen Nukleinsäuremoleküle und langsamer an die weniger zahlreichen Elemente. Die zwischen der Bibliothek und den haptenylierten Nukleinsäuremolekülen gebildeten Hybridisierungskomplexe können dann mittels einer Vielzahl von Verfahren entfernt werden, was in der Reduktion der Anzahl an Kopien der zahlreicheren Nukleinsäuremoleküle in der Bibliothek resultiert und wodurch somit eine normalisierte Nukleinsäurebibliothek hergestellt wird.
  • Das Entfernen der Komplexe durch Ligand-Hapten-Wechselwirkungen wird erfindungsgemäß unter Verwendung eines Liganden, der im Speziellen an das an die haptenylierten Nukleinsäuremoleküle gebundene Hapten bindet, ausgeführt. Bei einem bevorzugten Verfahren kann der Ligand bevorzugt kovalent an einen festen Träger, wie etwa Nitrozellulose, Diazozellulose, Glas, Polystyrol (einschließlich Mikrotiterplatten), Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Sepharose, Agar, Stärke, Nylon oder Kügelchen, bei denen es sich um Latexkügelchen, magnetische Kügelchen, paramagnetische Kügelchen, superparamagnetische Kügelchen oder Glaskügelchen handeln kann, gebunden werden. Insbesondere bevorzugte feste Träger sind die magnetischen Kügelchen, paramagnetischen Kügelchen und superparamagnetischen Kügelchen, die im Handel beispielsweise von Life Technologies, Inc. (Rockville, MD), Dynal A.S. (Oslo, Norwegen) oder Sigma (St. Louis, Missouri) erhältlich sind.
  • An diese festen Träger kann jeder beliebige Ligand, der an das zwecks Haptenylieren der Nukleinsäuremoleküle verwendete Hapten binden kann, gebunden sein. Beispiele für bei der Verwendung in den vorliegenden Verfahren geeignete Liganden (die der Ordnung nach der oben angeführten Haptenmoleküle entsprechen) schließen ohne Einschränkung ein: (i) Avidin und Streptavidin; (ii) Protein A, Protein G, einen Zelloberflächen-Fc-Rezeptor oder ein Antikörperspezifisches Antigen; (iii) ein enzymspezifisches Substrat; (iv) Polymyxin B oder Endotoxin-neutralisierendes Protein (ENP); (v) Fe3+; (vi) einen Transferrin-Rezeptor; (vii) einen Insulin-Rezeptor; (viii) einen Zytokinrezeptor (z.B. Wachstumsfaktor, Interleukin oder koloniestimulierender Faktor); (ix) CD4; (x) Spektrin oder Fodrin; (xi) ICAM-1 oder ICAM-2; (xii) C3bi, Fibrinogen oder Faktor X; (xiii) Ankyrin; (xiv) Integrine α1β1, α2β1, α3β1, α6β1, α7β1 und α6β5; (xv) Integrine α1β1, α2β1, α3β1, und αvβ3; (xvi) Integrine α3β1, α4β1, α4β7, α5β1, αvβ1, απbβ3, αvβ3, und αvβ6; (xvii) Integrine αvβ1, und αvβ3,; (xviii) Vitronektin; (xix) Fibronektin; (xx) Kollagen; (xxi) Laminin; (xxii) Glycophorin; (xxiii) Mac-1; (xxiv) LFA-1; (xxv) β-Aktin; (xxvi) gp-120; (xxvii) Zytokine (Wachstumsfaktoren, Interleukine oder koloniestimulierende Faktoren); (xxviii) Insulin; (xxix) Ferrotransferrin; (xxx) Apotransferrin; (xxxi) Lipopolysaccharid; (xxxii) ein Enzym; (xxxiii) einen Antikörper; (xxxiv) Biotin; und Kombinationen davon. Bevorzugte Liganden schließen Avidin und Streptavidin ein. Selbstverständlich hängt die Wahl des Liganden von der Wahl des zur Herstellung der haptenylierten Nukleinsäuremoleküle verwendeten Haptens ab; dem Durchschnittsfachmann sind somit für die Verwendung in den Verfahren der Erfindung geeignete Liganden ersichtlich. Die Bindung des/der Ligandenmoleküls/Ligandenmoleküle an den festen Träger kann durch jedes beliebige, dem Durchschnittsfachmann bekannte Verfahren zur Ligandenbindung wie etwa kovalente, hydrophobe oder ionische Bindung (einschließlich Beschichten) ausgeführt werden. Beispielsweise kann gemäß einem Aspekt der Erfindung, bei dem die haptenylierten Nukleinsäuremoleküle Biotin umfassen, ein Biotin-bindender Ligand wie etwa Avidin oder Streptavidin an den festen Träger gebunden sein. Gemäß einem solchen, besonders bevorzugten Aspekt werden an Avidin oder Streptavidin gebundene, magnetische, paramagnetische oder superparamagnetische Kügelchen als feste Träger verwendet.
  • Üblicherweise schließen die die Ligand-Hapten-Wechselwirkungen begünstigenden Bedingungen das Inkubieren in einer gepufferten Salzlösung, bevorzugt eine TRIS-, Phosphat-, HEPES- oder Kohlenstoffgepufferte Natriumchloridlösung, bevorzugter eine TRIS-gepufferte Natriumchloridlösung, noch bevorzugter eine ungefähr 10–100 mM TRIS-HCl und ungefähr 300–2000 mM NaCl umfassende Lösung und am bevorzugtesten eine ungefähr 10 mM TRIS-HCl und ungefähr 1 M NaCl umfassende Lösung bei einem pH von ungefähr 6–9, bevorzugter bei einem pH von ungefähr 7–8, noch bevorzugter bei einem pH von ungefähr 7,2–7,6 und am bevorzugtesten bei einem pH von ungefähr 7,5 ein. Das Inkubieren wird bevorzugt bei 0 °C bis ungefähr 25 °C und am bevorzugtesten bei ungefähr 25 °C für ungefähr 30–120 Minuten, bevorzugt ungefähr 45–90 Minuten und am bevorzugtesten ungefähr 60 Minuten ausgeführt, um das Binden der haptenylierten Nukleinsäuremoleküle (und somit der komplementären Bibliotheks-Nukleinsäuremoleküle, zu denen sie hybridisiert werden) an den Ligandengebundenen festen Träger zu ermöglichen.
  • Nachdem die haptenylierten Komplexe an den Festphasenträger gebunden wurden, kann die normalisierte Nukleinsäurebibliothek, die Nukleinsäuremoleküle bei niedrigerer Häufigkeit als die Eingabebibliothek umfasst, von den Überständen oder Eluaten (d. h. die ungebundenen Materialien in Lösung) gesammelt werden. Gemäß einem bevorzugten Aspekt, bei dem die biotinylierten Nukleinsäuremoleküle an Avidin oder Streptavidin oder an eine an Avidin oder Streptavidin gebundene Festphase gebunden sind, können beispielsweise die Nukleinsäuremoleküle, die die normalisierte Nukleinsäurebibliothek wie etwa eine normalisierte cDNA-Bibliothek umfassen, durch leichtes Ansaugen und Sammeln der Überstände erhalten werden. Gemäß einem besonders bevorzugten Aspekt, bei dem an Avidin oder Streptavidin gebundene, magnetische, paramagnetische oder superparamagnetische Kügelchen als feste Träger verwendet werden, können die biotinylierte Nukleinsäureenthaltenden Kügelchen unter Verwendung eines Magnets (wie etwa eines Magna Sep Magnetpartikel Separator; Life Technologies, Inc.) von den Überständen getrennt werden und die Überstände können mittels Pipette entnommen werden. Das Entfernen der haptenylierten Komplexe wird bevorzugt durch Extrahieren mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. Phenol, Chloroform, etc.) ausgeführt. Die oben beschriebenen Ansätze führen zur Herstellung einer normalisierten Nukleinsäurebibliothek, die einzelsträngig oder doppelsträngig sein und erfindungsgemäß oder mittels in der Literatur gut bekannter Techniken (siehe z.B. Gubler, U., und Hoffman, B.J., Gene 25: 263–269 (1983); Krug, M.S., und Berger, S.L., Meth. Enzymol. 152: 316–325 (1987); Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Seiten 8.60–8.63 (1987)) und weiterer, dem Durchschnittsfachmann vertrauter Techniken umgehend verwendet, bis zur Verwendung gelagert oder verarbeitet und weiter gereinigt werden kann.
  • Reduzieren oder Eliminieren von Background
  • Die Erfindung sieht ebenso Verfahren zur Herstellung einer selektierten, normalisierten Nukleinsäurebibliothek mit sehr niedrigem, nicht-rekombinanten und neu arrangiertem Klonierungs-Background vor. Wie hierin verwendet, ist eine selektierte, normalisierte Bibliothek eine Bibliothek, bei der ein oder als ein spezifisches Nukleinsäuremolekül oder Set an Nukleinsäuremolekülen in der normalisierten Bibliothek angereichert und weitere Nukleinsäuremoleküle von geringerem Interesse durch einen der hierin beschriebenen Ansätze entfernt wurden. Somit bezieht sich die Erfindung ferner auf das Entfernen von kontaminierenden oder Background-Nukleinsäuremolekülen aus der normalisierten Bibliothek. Ein solches Entfernen oder Eliminieren der kontaminierenden Nukleinsäuren kann erfindungsgemäß vor oder nach der Normalisierung durchgeführt werden. Übliche, kontaminierende Nukleinsäuremoleküle in einer Bibliothek sind Vektormoleküle, die keine Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek enthalten (wobei der Vektor kein Insert erhalten konnte oder der Vektor durch Deletion während der Vermehrung der Quellenbibliothek den Insert verloren hat).
  • Zielspezifische Sonden (z.B. oligodA-NotI) können erfindungsgemäß bei einer Anzahl an Verfahren zur Reduktion oder Entfernung kontaminierender Nukleinsäuren aus der Bibliothek von Interesse verwendet werden. Solche Sonden sind deshalb zielspezifisch, da sie Moleküle erkennen und Moleküle zu den Bibliotheksmolekülen, nicht aber zu kontaminierenden Nukleinsäuresequenzen hybridisieren (wie etwa Vektoren ohne Bibliotheks-Inserts). Ein solches Mittel impliziert die Verwendung von einer oder mehr als einer haptenylierten, zielspezifischen Sonde zum Einfangen oder Isolieren der Bibliothek von Interesse. Bei solchen Verfahren ist die normalisierte Bibliothek bevorzugt einzelsträngig (oder, falls doppelsträngig, wird sie durch hierin beschriebene Verfahren einzelsträngig gemacht). Durch Hybridisieren der haptenylierten Sonden zu der normalisierten Bibliothek kann die hybridisierte, normalisierte Bibliothek unter Verwendung von beispielsweise Hapten-Ligand-Wechselwirkungen oder Extraktion von kontaminierenden Nukleinsäuren ausselektiert werden. Die daraus hervorgehende, einzelsträngige, selektierte, normalisierte Bibliothek wird dann durch Inkubieren der Bibliothek mit einem oder mehr als einem Polypeptid mit Polymerase-Aktivität unter ausreichenden Bedingungen, um die doppelsträngige, selektierte, normalisierte Bibliothek zu synthetisieren, doppelsträngig gemacht.
  • Alternativ wird die normalisierte Bibliothek an einen zielspezifischen, haptenylierten Primer hybridisiert und die Moleküle können dann durch Inkubieren mit einem oder mehr als einem Polypeptid mit Polymerase-Aktivität unter ausreichenden Bedingungen, um die doppelsträngige, normalisierte Bibliothek zu synthetisieren, doppelsträngig gemacht werden. Um solche Moleküle doppelsträngig zu machen, können ein oder mehr nukleaseresistente Nukleotide verwendet werden. Die doppelsträngigen Moleküle können dann unter Verwendung von beispielsweise Hapten-Ligand-Wechselwirkungen oder Extrahieren von den kontaminierenden Nukleinsäuremolekülen ausselektiert werden.
  • In beiden Fällen kann die daraus hervorgehende, doppelsträngige, selektierte, normalisierte Bibliothek der Erfindung in einem weiteren Selektionsschritt in ein oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden. Die einzelsträngigen Moleküle werden erfindungsgemäß bei einer sehr geringen Frequenz transformiert, während doppelsträngige Moleküle bei einer sehr hohen Frequenz transformiert werden. Somit ermöglicht die Transformation einem zusätzlichen Selektionsschritt, bei dem einzelsträngige, kontaminierende Moleküle eliminiert oder entfernt werden. Beispielsweise, wenn eine zielspezifische Sonde oder ein zielspezifischer Primer in dem doppelsträngigen Syntheseschritt verwendet wird, werden die nicht-spezifischen Nukleinsäuren nicht hybridisiert und somit nicht doppelsträngig gemacht und nicht in der selektierten, normalisierten Bibliothek vorhanden sein.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die einzelsträngige, selektierte, normalisierte Bibliothek mit den haptenylierten Sonden mit Primern (bevorzugt zielspezifischen Primer) und einem oder mehr als einem Nukleotid, der/die den synthetisierten, doppelsträngigen Molekülen Nukleaseresistenz verleiht/verleihen, doppelsträngig gemacht. Der Verdau mit solch einer Nuklease ermöglicht das Entfernen einzelsträngiger Moleküle, die nicht durch Primer doppelsträngig gemacht wurden. Als ein zusätzlicher Selektionsschritt können solch doppelsträngige Moleküle dann in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt kann die selektierte, normalisierte Bibliothek durch Inkubieren der einzelsträngigen, normalisierten Bibliothek mit einem oder mehrer als einem zielspezifischen, nicht-haptenylierten Primer in Kombination mit einem oder mehr als einem Nukleotid, der/die Nukleaseresistenz verleiht/verleihen, hergestellt werden. Der Verdau der Mischung stellt die Selektion der erwünschten Nukleinsäuremoleküle bereit und wie in einem zusätzlichen Selektionsschritt können die daraus hervorgehenden, doppelsträngigen Moleküle in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden.
  • Einzelsträngige Moleküle können erfindungsgemäß durch Behandlung doppelsträngiger Moleküle unter ausreichenden Bedingungen, um sie einzelsträngig zu machen, aus doppelsträngigen Molekülen hergestellt werden. Solche Bedingungen können beispielsweise den Abbau eines Stranges der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle in der Bibliothek wie etwa unter Verwendung einer Endonuklease, einer Exonuklease und dergleichen und bevorzugt unter Verwendung von Gen II Protein und Exonuklase III (erhältlich von Life Technologies, Inc., Rockville, MD) einschließen. Alternativ können solche Bedingungen das Denaturieren der doppelsträngigen Moleküle durch Wärme, unter ionischen Bedingungen, pH (z.B. Base) und dergleichen einschließen.
  • Erfindungsgemäß verwendete Nukleotide, die Nukleaseresistenz verleihen, sind bevorzugt Nukleotidanaloga. Solche Nukleotidanaloga schließen methylierte Nukleotide wie etwa 5-Methyldesoxycytosin, 3-Methyldesoxyadenosin, 7-Methylguanin und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Fachmann kann weitere Nukleotidanaloga, die Exonukleasen oder Restriktions-Endonukleasen (Nukleasen) hemmen oder blockieren, erkennen. Ebenso sind im Stand der Technik erfindungsgemäß verwendete Kombinationen aus Nukleotidanaloga und geeigneten Enzymen bekannt (siehe Life Technologies 1997-1998 Catalog and Reference Guide, Kapitel 6).
  • Kits
  • Die vorliegende Erfindung sieht ebenso Kits zur Herstellung und Isolierung normalisierter und selektierter, normalisierter Bibliotheken vor. Diesem Aspekt der Erfindung entsprechende Kits umfassen ein Trägermittel, wie etwa einen Schachtel, einen Karton, eine Röhre und dergleichen, in denen ein oder mehr Behälter eingeschlossen sind wie etwa Phiolen, Röhrchen, Ampullen, Flaschen und dergleichen. Das erfindungsgemäße Kit kann den Driver zur Normalisierung einer Bibliothek oder die zur Herstellung des zur Normalisierung verwendeten Drivers benötigten Komponenten umfassen (beispielsweise eine oder mehr als eine Polymerase, einen oder mehr als einen, Promotoren umfassenden Adaptor, einen oder mehr als einen, Promotoren umfassenden Vektor, ein oder mehr als ein haptenyliertes Nukleotid und/oder einen oder mehr als einen haptenylierten Primer oder eine oder mehr als eine haptenylierte Sonde). Solche Kits können eine oder mehr als eine zielspezifische Sonde oder einen oder mehr als einen zielspezifischen Primer (die haptenyliert sein können oder nicht). Gemäß zusätzlichen Aspekten kann das erfindungsgemäße Kit ein oder mehr als ein Nukleotid (z.B. Nukleotide, die Nukleaseresistenz verleihen, und/oder eine oder mehr als eine Endonuklease, Exonuklease oder Restriktionsenzyme wie etwa Gen II Protein oder Exonuklease III oder HhaI, die für den Verdau der Nukleinsäuremoleküle verwendet werden) umfassen.
  • Zusätzliche, von der Erfindung vorgesehene Kits umfassen einen oder mehr als einen Behälter, die eine oder mehr als eine der zuvor beschriebenen, normalisierten Nukleinsäurebibliotheken oder selektierten, normalisierten Nukleinsäurebibliotheken der Erfindung enthalten. Die Bibliotheken dieser erfindungsgemäßen Kits können einzelsträngig oder doppelsträngig sein und sind bevorzugt cDNA-Bibliotheken.
  • Die von diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfassten Kits können ferner ein oder mehr als ein zusätzliches Reagenz (z.B. geeignete Puffer) und eine oder mehr als eine zusätzliche Verbindung umfassen, die bei der Verwendung der normalisierten Bibliotheken und der selektierten, normalisierten Bibliotheken der Erfindung notwendig sind.
  • Verwendungen
  • Die vorliegende Erfindung kann bei einer Vielzahl von Anwendungen, die rasche Herstellung und Isolierung von normalisierten und selektierten, normalisierten Nukleinsäurebibliotheken, insbesondere cDNA-Bibliotheken, erfordern, verwendet werden. Die vordergründige Verwendung solcher Bibliotheken dient der Entdeckung von Genen und der Herstellung von Gen-Datenbanken. Mittels der Verfahren der Erfindung hergestellte Bibliotheken können zwecks Amplifikationsreaktionen (wie etwa via PCR) als Quellen von Templat-Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, um Nukleinsäuremoleküle mit niedriger Kopienanzahl rasch zu identifizieren und/oder zu klonieren und um mittels gentechnischer Methoden Polypeptide herzustellen.
  • Ebenso richtet sich die Erfindung somit an Verfahren zur Amplifikation eines Nukleinsäuremoleküls und auf mittels dieser Verfahren amplifizierte Nukleinsäuremoleküle. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann ein Nukleinsäuremolekül durch Amplifizieren eines Nukleinsäuremoleküls (z.B. ein cDNA-Molekül), das in einer normalisierten Bibliothek oder einer selektierten, normalisierten Bibliothek der Erfindung enthalten ist, gemäß jedes beliebigen, im Stand der Technik bekannten Amplifikationsverfahrens amplifiziert werden (d. h. zusätzliche Kopien der hergestellten Nukleinsäuremoleküle). Gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Amplifikationsverfahren schließen PCR (U.S. Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202), Strand Displacement Amplification (SDA; U.S. Patent Nr. 5,455,166; EP 0 684 315 ) und Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA, U.S. Patent Nr. 5,409,818; EP 0 329 822 ) ein. Am bevorzugtesten sind jene Verfahren, die eine oder mehr als eine PCR-Amplifikation umfassen.
  • Die Erfindung richtet sich ebenso an Verfahren, die zur Herstellung von Vektoren, die normalisierte oder selektierte, normalisierte Bibliotheken der vorliegenden Erfindung umfassen, an Wirtszellen, die diese Vektoren umfassen, an Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids unter Verwendung dieser Vektoren und Wirtszellen und an rekombinante, mittels dieser Verfahren hergestellte Polypeptide. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid hergestellt werden, indem eine beliebige der oben genannten, rekombinanten Wirtszellen unter Bedingungen, die die Herstellung eines Polypeptids daraus und die Isolierung des Polypeptids begünstigen, kultiviert wird. Verfahren zur Kultivierung rekombinanter Wirtszellen und zur Herstellung und Isolierung von Polypeptiden aus diesen sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
  • Vektoren werden erfindungsgemäß unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren durch Insertion von einem oder mehr als einem der Nukleinsäuremoleküle von Interesse in einen Vektor hergestellt. Der gemäß diesem Aspekt der Erfindung verwendete Vektor kann beispielsweise ein Plasmid, ein Cosmid oder eine Phage sein. Bevorzugt sind Vektoren, die cis-agierende Kontrollbereiche für die Nukleinsäure, die das Polypeptid von Interesse codiert, umfassen. Geeignete trans-agierende Faktoren können von dem Wirt, von einem komplementierenden Vektor oder dem Vektor selbst nach Einbringen in den Wirt bereitgestellt werden.
  • Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen sind die Vektoren Expressionsvektoren, die spezifische Expression der in den normalisierten Bibliotheken oder den selektierten, normalisierten Bibliotheken der Erfindung enthaltenen Nukleinsäuremoleküle bereitstellen, wobei die Vektoren induzierbar und/oder zelltypspezifisch sein können. Bei solchen Vektoren sind insbesondere jene bevorzugt, die durch leicht zu manipulierende Umweltfaktoren wie etwa Temperatur und Nahrungszusatzstoffe induzierbar sind.
  • Bei der vorliegenden Erfindung zweckmäßige Expressionsvektoren schließen chromosomale, episomale und aus Viren gewonnene Vektoren ein, z.B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden oder Bakteriophagen gewonnen werden, und Vektoren, die aus Kombinationen davon wie etwa Cosmiden und Phagemiden gewonnen werden, und schließen zwecks Kultivierung in einer bakteriellen Wirtszelle bevorzugt zumindest einen selektierbaren Marker wie etwa ein Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenzgen ein. Vor der Insertion in solch einen Expressionsvektor können die in den Bibliotheken der Erfindung enthaltenen Nukleinsäuremoleküle an einen geeigneten Promotor, wie etwa der Lambda-Phage PL-Promotor oder die E.coli lac, trp und tac-Promotoren, gebunden werden. Weitere geeignete Promotoren sind dem Fachmann gut bekannt. Weitere, für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung bevorzugte Vektoren schließen pQE70, pQE60 und pQE-9, erhältlich von Qiagen; pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, erhältlich von Stratagene; pcDNA3 erhältlich von Invitrogen; pGEX, pTrxfus, pTrc99a, pET-5, pET-9, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS, erhältlich von Pharmacia; und pSPORT1, pSPORT2, pCMVSPORT 2.0 und pSVSPORT1, erhältlich von Life Technologies, Inc., ein. Weitere geeignete Vektoren sind dem Fachmann leicht ersichtlich.
  • Repräsentative, erfindungsgemäß verwendbare Wirtszellen schließen bakterielle Zellen, Hefezellen, pflanzliche Zellen und tierische Zellen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugte bakterielle Wirtszellen schließen Escherichia spp.-Zellen (insbesondere E.coli-Zellen und vor allem E.coli-Stränge DH10B und Stbl2), Bacillus spp.-Zellen (insbesondere B. subtilis- und B. megaterium-Zellen), Streptomyces spp.-Zellen, Erwinia spp.-Zellen, Klebsiella spp.-Zellen und Salmonella spp. (insbesondere S. typhimurium-Zellen) ein. Bevorzugte tierische Wirtszellen schließen Insektenzellen (insbesonderst Zellen von Spodoptera frugiperda Sf9 und Sf21 und Trichoplusa High Five-Zellen) und Säugetierzellen (insbesonderst CHO-, COS-, VERO-, BHK-Zellen und humane Zellen) ein. Diese und weitere geeignete Wirtszellen sind im Handel erhältlich, beispielsweise von Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland), American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) und Invitrogen (San Diego, Kalifornien).
  • Beispiele
  • Beispiel 1. Herstellung von normalisierten cDNA-Bibliotheken aus direktional klonierten cDNA-Bibliotheken
  • In diesem Beispiel (1 und 2) wird der Vorgang der Konstruktion einer normalisierten cDNA-Bibliothek in dem pCMVSPORT 2.0-Vektor beschrieben (1 und 2). Dieser Vorgang besteht aus i) Isolieren der Phagemid-DNA aus einer direktional klonierten cDNA-Bibliothek, ii) Konvertieren der doppelsträngigen (ds), ringförmigen cDNA-Bibliotheks-DNA in a) ein lineares ds Templat zwecks RNA-Polymeraseherstellung aus biotinyliertem Driver und b) einzelsträngige (ss), ringförmige DNA unter Verwendung von Gen II und Exonuklease III, iii) Kombinieren des Drivers und ringförmiger, ss Bibliotheks-DNA mit zwei blockierenden Oligonukleotiden in einer Subtraktionshybridisierung, iv) Reparieren der nicht-subtrahierten, ringförmigen ss-DNA und v) Transformieren derselben in E.coli-Zellen, um somit eine erste, normalisierte cDNA-Bibliothek herzustellen.
  • Die Herstellung von ringförmiger ss-DNA aus ringförmiger ds-cDNA-Bibliotheks-DNA wird wie folgt ausgeführt: Verdau von 10 μg ringförmiger ds-cDNA in 1X Gen II Puffer 20 mM Tris·HCl (pH = 8), 80 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 2 mM β-Mercaptoethanol. 5 % Glycerol, 5 mg/ml BSA mit 8 μl Gen II bei 30 °C 40 Minuten lang in einem Endvolumen von 200 μl. Abschließen der Reaktion durch Inkubieren bei 65 °C für 5 Minuten. Hinzufügen von 12 μl Exonuklease III und Inkubieren bei 37 °C für 30 Minuten. Hinzufügen von 8 μl (10 E/μl) NotI und Inkubieren der Mischung für 1 Stunde bei 37 °C. Hinzufügen von 2 μl Exonuklease III und weiteres Inkubieren für 1 Stunde bei 37 °C. Zweimalige Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und Ethanolfällung. Resuspendieren der ringförmigen ss-cDNA in 10 μl RNASE-freiem TE. Durch diesen Vorgang wurde die Bibliothek von cDNA aus fötalem Gehirn (Life Technologies, Inc. Rockville, MD) einzelsträngig gemacht.
  • Die Herstellung von linearisierter ds-cDNA aus ringförmiger ds-cDNA läuft wie folgt ab:
    Verdau von 50 μg ringförmiger ds-cDNA mit 200 Einheiten NotI (LTI) in 300 μl 1X Reaktionspuffer [5 mM Tris·HCl, pH = 8,0; 1 mM MgCl2; 10 mM NaCl] für einen Zeitraum von 3 Stunden bei 37 °C. Hinzufügen von 100 Einheiten NotI und Inkubieren für weitere 3 Stunden bei 37 °C. Zweimalige Extraktion mit Phenol /Chloroform /Isoamylalkohol (25:24:1 v/v) und Ethanolfällung. Resuspendieren der linearisierten ds-cDNA in 30 μl RNASE-freiem TE-Puffer. Auf diese Art und Weise wurde die Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn (Life Technologies, Inc. Rockville, MD) linearisiert.
  • Die Herstellung von biotinylierter Driver-RNA aus ringförmiger ds-cDNA-Bibliotheks-DNA wird in der folgenden Art und Weise ausgeführt. Herstellung einer Mischung aus den folgenden Komponenten: 1,214 ml mit DEPC behandeltes Wasser, 400 μl 5X Transkriptionspuffer [200 mM Tris-HCl (pH 7,9), 30 mM MgCl2, 10 mM Spermidin-(HCl)3], 200 μl rNTP-Mischung (jeweils 10 μM von ATP, GTP und UTP, 5 μM CTP, 20 μM Biotin-14-CTP), 16 μl (20 μg) linearisierte ds-cDNA aus einer Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn (siehe oben), 100 μl 0,1 M DTT und 70 μl SP6 RNA-Polymerase (350 Einheiten/μl). Die Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) wurde in einem pCMV·SPORT-Vektor konstruiert, der zwecks Driver-RNA-Synthese einen CMV-Promotor, einen SP6- und einen T7-Polymerase-Promotor enthält, die die Multiple Cloning-Sites (MCS) flankieren. Mischen und Inkubieren für 13 Stunden bei 37 °C. Hinzufügen von 1 ml 7,5 M Ammoniumacetat und 8 ml Ethanol. 30-minütiges Kühlen auf trockenem Eis, Mikrozentrifugieren bei 4 °C für 25 Minuten und Resuspension des Pellets in 1 ml TE. Erhitzen der Lösung auf 65 °C und erneutes Ausfällen. Waschen des Pellets in 70 %igem Ethanol, Trocknen und Resuspension in 1,92 ml Wasser, 40 μl 1 M Tris-HCl [ph 7,5], zwecks Resuspension auf 65 °C erwärmen. Hinzufügen von 20 μl 1 M MgCl2, 20 μl DNaseI (2,660 Einheiten) zu der resuspendierten RNA und Inkubieren für 1 Stunde bei 37 °C. Die behandelte RNA auf ein frisches Röhrchen übertragen und 40 μl 0,5 M EDTA hinzufügen, Inkubieren für 10 Minuten bei 65 °C und Ausfällen mit 1 ml von 7,5 M Ammoniumacetat plus 8 ml Ethanol. Resuspension des Pellets in 300 μl TE, Erwärmen auf 65 °C zur Unterstützung der Resuspension und Laden auf eine 1 cm × 18 cm Säule (Sephadex G-50) und Sammeln des ersten durch UV-Absorbanz bei 260 nm detektierten Peaks. Ausfällen des gesammelten Materials (~4 ml) mit 2 ml 7,5 M Ammoniumacetat und 16 ml Ethanol. Resuspension des Pellets in 120 μl TE, Waschen des Röhrchens mit 20 μl TE und Vereinen der beiden Proben. Durch diesen Vorgang wird der bei der Normalisierung der Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn verwendete, haptenylierte Driver der Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn bereit gestellt.
  • Die Subtraktive Hybridisierung wird unter Verwendung des folgenden Vorgangs ausgeführt. Denaturierung einer Mischung aus den folgenden Komponenten für einen Zeitraum von 1 Minute bei 80°C: 1 μg ringförmige, ss-cDNA-Bibliothek (siehe oben), 0,5 μg oligodA Oligonukleotid 5'(A)40 3'(oligodA), 3 μg SP6 SalI-Promotor Sense-Oligonukleotid 5'GAA GGT ACG CCT GCA GGT ACC GGT CCG GAA TTC CCG GGT CGA CCC ACG 3' (SEQ ID NO: 1) (SP6-SalI), 0,25 M NaCl in 22 μl von 1X Hybridisierungspuffer [50 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA und 0,1% SDS]. Nach dem Denaturieren erfolgt die Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
  • Für den Cot-Wert = 500 denaturieren 85 μg der biotinylierten Driver-RNA (siehe oben) in 22 μl von 1X Hybridisierungspuffer 2 Minuten lang bei 90 °C, werden auf Eis 1 Minute lang abgekühlt und 1 μl von 5 M NaCl wird hinzugefügt. Die vorhybridisierte, ringförmige ss-DNA wird zu der biotinylierten Driver-RNA übertragen und 24 Stunden lang bei 42 °C inkubiert. Für die Bibliothek mit Cot-Wert = 5 werden 10,5 μg der Driver-RNA 2 Stunden lang hybridisiert; für die Bibliothek mit dem Cot-Wert = 50 werden 41 μg der Driver-RNA 5 Stunden lang hybridisiert; für die Bibliothek mit dem Cot-Wert = 0 wird keine Driver-RNA hinzugefügt und die Mischung 24 Stunden lang inkubiert.
  • Nach der Inkubation wird die Mischung auf ein frisches Röhrchen übertragen, 25 μg Streptavidin werden hinzugefügt und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert. Die Lösung wird mit einer gleichen Menge von PCIA (Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, 25:24:1) extrahiert. Die organische Phase wird mit 15 μl TE enthaltend 1 M NaCl rückextrahiert und die wässrigen Extraktionen vereint. Die Streptavidin-Bindung und PCIA-Extraktion wird zwei Mal wiederholt. Die wässrige Phase wird mit 0,3 M Natriumacetat und Ethanol ausgefällt. Das Pellet wird in 15 μl TE resuspendiert und 30 Minuten lang gegen TE dialysiert (10 mM : 0,5 mM). Die DNA wird auf ein frisches Röhrchen übertragen und das Volumen gemessen. Die daraus hervorgehende cDNA ist eine einzelsträngige, normalisierte cDNA-Bibliothek.
  • Die Analyse der Klone nach erfolgter Subtraktion wird in der folgenden Art und Weise ausgeführt. Wenn die nach der Subtraktion verbleibende, ringförmige ss-cDNA unter Verwendung eines oligodA-NotI-Primers, dNTPs und einer Reparaturpolymerase in ds-cDNA konvertiert und in E.coli-Zellen transformiert wird, enthält ein großer Teil der Transformanten Plasmide, die keine Inserts enthalten (Tabelle 1).
  • Tabelle 1. Rekombinante cDNA-Klone in Prozent und durchschnittliche Insert-Größe nach der Subtraktion der Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn.
    Figure 00320001
  • Nach der Analyse der Klone, die keine Inserts enthalten, wurde festgestellt, dass sie in der ursprünglichen Bibliothek in einer Häufigkeit von weniger als 1 % vorhanden waren, sie jedoch nach der Subtraktion angereichert wurden, da sie keine entsprechenden Driver-Moleküle zur Subtraktion aufwiesen (2). Um diese Form von Background zu entfernen, wurden zwei Ansätze entwickelt und in den Beispielen 2 und 3 beschrieben.
  • Beispiel 2. Entfernen von Background einer normalisierten cDNA-Bibliothek unter Verwendung der Selektion mit einer zielspezifischen, biotinylierten OligodA-NotI-Sonde
  • Als ein Ergebnis des in Beispiel 1 beschriebenen Vorgangs besteht ein Trend zu erhöhtem Background, was direkt von dem Cot-Wert des Subtraktionsschrittes abhängt (Tabelle 1). Da ein Gesamtbibliotheksdriver verwendet wird, werden Klone, die kein Gegenstück in dem Driver enthalten, angereichert. Dies wurde in dem in Beispiel 1 beschriebenen Vorgang beobachtet (2). Zur Lösung dieses Problems wurden zwei Verfahren entwickelt und ein drittes Verfahren zum praktischen Entfernen von Background wird beschrieben. In dem ersten, in diesem Beispiel beschriebenen Fall wurde die Selektion rekombinanter Klone unter Verwendung einer biotinylierten OligodA-NotI-Sonde wie folgt verwendet (3).
  • Nach erfolgter Subtraktion, Reparatur und Transformation waren 45 % der von dem Cot-Wert = 500-Protokoll gewonnenen Klone rekombinant (Tabelle 1), bei Verwendung der Selektion der Sonde mit einem biotinylierten OligodA-NotI-Primer ((5'(A)15GGG CGG CCG C 3') (SEQ ID NO: 2) allerdings wurden die rekombinanten Klone von den nicht-rekombinanten Klonen getrennt, was die Konstruktion einer normalisierten cDNA-Bibliothek ohne wesentliche Änderungen der durchschnittlichen Insert-Größe und das praktische Eliminieren nicht-rekombinanter Klone ermöglichte (Tabelle 2).
  • Tabelle 2. Rekombinante cDNA-Klone in Prozent und durchschnittliche Insert-Größe nach vollständiger Subtraktion der Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn und GENETRAPPERTM Selektion mit einer biotinylierten OligodA-NotI-Sonde.
    Figure 00330001
  • Mehr als 98 % der zufällig ausgewählten Klone enthalten Inserts, die im Durchschnitt so groß wie die nicht-normalisierte cDNA-Bibliothek, aus der sie gewonnen wurden, sind. Zusätzlich zeigt die PCR-Analyse von seltenen und häufigen TGF-β-Amplikonen, dass die wesentliche Normalisierung ausgeführt wurde (6). Es ist zu beachten, dass das TGF-β1 PCR-Produkt in den nicht normalisierten Bibliotheken mit niedrigen Cot-Werten nicht, in den Bibliotheken mit höheren Cot-Werten sehr wohl detektierbar ist.
  • Die normalisierte, ringförmige ss-cDNA aus Beispiel 1 wurde 1 Minute lang auf 70 °C erwärmt und 1 Minute lang auf Eis abgekühlt. 200 ng des biotinylierten OligodA-NotI-Primers (siehe oben) wurde 1 Stunde lang bei 37 °C hybridisiert. Die Hybridisierungsmischung wurde mit 80 μg magnetischer Streptavidin-Kügelchen inkubiert. Die Kügelchen wurden drei Mal mit 100 μl Waschpuffer markiert (10 mM Tris·HCl [pH 7,5], 1 mM EDTA). Die Kügelchen wurden in 20 μl 1X Elutionspuffer 10 mM Glycin resuspendiert und das Eluat wurde aufgefangen. Der Elutionsschritt wurde mit 15 μl 1X Elutionspuffer wiederholt und die Eluate wurden vereint. Dieses Protokoll wurde drei Mal wiederholt und die Eluate.
  • Die eingefangene, einzelsträngige cDNA wurde wie folgt repariert: Herstellen eines Reparaturmischung durch Kombinieren von 4 μl 10X Reparaturpuffer [100 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25 °C), 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, 1 % Triton X-100], 1 μl 10 mM dNTP, 1 μl Reparaturenzym Dynazyme (2 m/μl) (Thermus brockianus von Finnzymes) und 34 μl Wasser. Diese Mischung wurde vermischt und auf nassem Eis gelagert. Durch Hinzufügen der folgenden Substanzen zu einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen wurde eine DNA-Primer-Mischung hergestellt: 4 μl 10X Reparaturpuffer, 35 μl eingefangene DNA aus dem vorhergehenden Schritt und 1 μl (50 ng) von nicht-biotinyliertem OligodA-NotI-Primer. Die Primermischung wurde bei Raumtemperatur 2 Sekunden lang bei 14 000 × g zentrifugiert und 1 Minute lang bei 95 °C inkubiert. Gleichzeitig wurde die Reparaturmischung bei 70 °C inkubiert. Die DNA-Primer-Mischung wurde in ein 70 °C-Bad übertragen und 1 Minute lang inkubiert. 40 μl vorgewärmte Reparaturmischung wurden dem die DNA-Primer-Mischung enthaltenden Röhrchen hinzugefügt. Die Inhalte wurden durch Pipettieren vermischt und die Mischung wurde dann bei 70 °C 15 Minuten lang inkubiert, um die Primerextension zu ermöglichen (Synthese der doppelsträngigen cDNA). Die Röhrchen wurden aus dem Wasserbad entfernt und bei Raumtemperatur 2 Sekunden lang bei 14 000 × g zentrifugiert. Durch Hinzufügen von 1 μl Glycogen, 41 μl 7,5 M Ammoniumacetat und 320 μl –20°C kaltem Ethanol zu jedem Röhrchen wurde die reparierte DNA ausgefällt. Die Röhrchen wurden verwirbelt und 10 Minuten lang in Eis platziert oder über Nacht bei 4 °C gelagert. Die Röhrchen wurden dann 30 Minuten lang bei 4 °C bei 14 000 × g zentrifugiert. Das Ethanol wurde vorsichtig aus dem kleinen Pellet entfernt und mit 100 μl 70 %igem Ethanol (–20 °C) beschichtet. Die Röhrchen wurden 2 Minuten lang bei 4 °C bei 14 000 × g zentrifugiert und das gesamte Ethanol wurde entfernt und die Pellets wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten lang oder so lange, bis sie trocken waren, getrocknet. Die Pellets wurden in 10 μl TE-Puffer aufgelöst und bei 4 °C gelagert. 2 μl Aliquoten der reparierten DNA wurden pro 20 μl Aliquoten kompetenter E.coli-Zellen von DH10B ElectroMAX elektroporiert.
  • Beispiel 3. Entfernen von Background einer normalisierten cDNA-Bibliothek unter Verwendung der OligodA-NotI-Reparatursynthese mit Nukleotidanaloga, die Nukleaseresistenz verleihen.
  • Wird der Ansatz aus Beispiel 2 zum Entfernen von Background verwendet, so erfordert die Konstruktion einer normalisierten cDNA-Bibliothek mit mehr als 1 × 106 primären Klonen wenigstens drei unabhängige Selektionen und 15 Elektroporationen (Tabelle 3).
  • Tabelle 3. Vergleich der zahlreichen Verfahren zum Entfernen von Background
    Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Zur Lösung dieses Problems wurde ein alternativer Ansatz zur Reduktion von Background in normalisierten Bibliotheken entwickelt. Bei diesem, als nukleaseresistente Reparatursynthese bezeichneten Verfahren werden dieselben wie in Beispiel 2 beschriebenen Sonden verwendet, OligodA-NotI, doch in diesem Fall ist die Sonde nicht biotinyliert (5). Allerdings können die wie in Beispiel 2 verwendeten, biotinylierten Sonden verwendet werden, um den zusätzlichen Selektionsschritt aus Beispiel 2 zu einzuschließen.
  • Im Vergleich zu dem Selektionsverfahren aus Beispiel 2, kann eine Bibliothek konstruiert werden, die vier Mal komplexer ist und nur ein Drittel an Elektroporationen erfordert (Tabelle 3). Zusätzlich wird der Bibliotheks-Background praktisch eliminiert und die Insert-Größe der Bibliothek bleibt unverändert (Tabelle 4). Als schließlich zahlreiche Gene mittels Koloniehybridisierung untersucht wurden, war ihre Häufigkeit um das 15- bis 18-fache vermindert (Tabelle 5) und die Häufigkeit der seltenen Gene war wesentlich erhöht (6).
  • Tabelle 4. Rekombinante cDNA-Klone in Prozent und durchschnittliche Insert-Größe nach vollständiger Subtraktion der Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn und Behandlung mit 5-Methylcytosin/HhaI.
    Figure 00350002
  • Tabelle 5. Analyse einer normalisierten cDNA-Bibliothek: Depletion der zahlreichen cDNAs ist direkt abhängig direkt von dem Ausmaß der Subtraktion
    Figure 00350003
  • Die durch Subtraktion erzeugte einzelsträngige, normalisierte cDNA-Bibliothek (siehe Beispiel 1) wurde wie folgt repariert: Durch Kombinieren von 3 μl 10X Reparaturpuffer [100 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25 °C), 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, 1 % Triton x-100], 1 μl 10 mM dNTP (10 mM 5-Methyl-dCTP enthaltend), 1 μl Reparaturenzym Dynazyme (2 E/μl) (Thermus brockianus von Finnzymes) und 25 μl Wasser, Vermischen und Lagerung auf nassem Eis wurde eine Reparaturmischung hergestellt. Durch Hinzufügen der folgenden Substanzen zu einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen wurde eine DNA-Primer-Mischung hergestellt: 11 μl autoklaviertes, destilliertes Wasser, 3 μl 10X Reparaturpuffer, 15 Zellen dialysierte DNA aus dem vorhergehenden Schritt und 1 μl (50 ng) nicht-biotinylierte Oligo A-NotI. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Sekunden lang bei 14 000 × g zentrifugiert. Die DNA-Primer-Mischung wurde 1 Minute lang bei 95 °C inkubiert. Gleichzeitig wurde die Reparaturmischung bei 70 °C inkubiert. Die DNA-Primer-Mischung wurde in ein 70 °C-Bad übertragen und 1 Minute lang inkubiert. 30 μl vorgewärmte Reparaturmischung wurden dem die DNA-Primer-Mischung enthaltenden Röhrchen hinzugefügt. Die Inhalte wurden durch Pipettieren vermischt und um die Primerextension zu ermöglichen 15 Minuten bei 70 °C lang inkubiert (Synthese der doppelsträngigen DNA). Die Röhrchen wurden aus dem Wasserbad entfernt und bei Raumtemperatur 2 Sekunden lang bei 14 000 × g zentrifugiert. Durch Hinzufügen von 1 μl Glycogen, 32 μl 7,5 M Ammoniumacetat und 250 μl –20°C kaltem Ethanol zu jedem Röhrchen wurde die reparierte DNA ausgefällt. Die Röhrchen wurden verwirbelt und 10 Minuten lang in Eis platziert oder über Nacht bei 4 °C gelagert. Die Röhrchen wurden dann bei 4 °C 30 Minuten lang bei 14 000 × g zentrifugiert. Das Ethanol wurde vorsichtig aus dem kleinen Pellet entfernt und mit 100 μl 70 %igem Ethanol (–20 °C) beschichtet. Die Röhrchen wurden dann bei 4 °C 2 Minuten lang bei 14 000 × g zentrifugiert. Das gesamte Ethanol wurde entfernt und die Pellets wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten lang oder so lange, bis sie trocken waren, getrocknet. Die Pellets wurden in 10 μl TE-Puffer aufgelöst und bei 4 °C gelagert. Mit 0,5 Einheiten HhaI in 20 μl 1X Puffer (5 mM TrisHCl, pH 8,0; 1 mM MgCl2; 5 mM NaCl) wurde die reparierte DNA 30 Minuten lang bei 37 °C verdaut. Die DNA war ausgefälltes Ethanol und die getrockneten Pellets wurden in 8 μl TE resuspendiert. 2 μl Aliquoten der reparierten DNA wurden pro 20 μl Aliquoten von kompetenten E.coli-Zellen von DH10B ElectroMAX elektroporiert.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00370001

Claims (46)

  1. Ein Verfahren zur Normalisierung einer Nukleinsäurebibliothek, das folgendes umfasst: (a) Inkubieren einer Nukleinsäurebibliothek, um mit synthetischen haptenylierten Nukleinsäuremolekülen, die zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle dieser Bibliothek komplementär sind, unter Bedingungen, die die Hybridisierung der zahlreicheren Moleküle dieser Bibliothek mit diesen haptenylierten Nukleinsäuremolekülen begünstigen, normalisiert zu werden; und (b) Entfernen dieser hybridisierten Moleküle durch Hapten-Ligand-Wechselwirkungen, wodurch eine normalisierte Bibliothek hergestellt wird.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei diese Nukleinsäurebibliothek eine cDNA-Bibliothek ist.
  3. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Nukleinsäuremoleküle dieser cDNA-Bibliothek einzelsträngig sind.
  4. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Nukleinsäuremoleküle dieser cDNA-Bibliothek doppelsträngig sind.
  5. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei diese cDNA-Bibliothek durch ein Verfahren hergestellt wird, das das Inkubieren einer Population von mRMA-Molekülen unter ausreichenden Bedingungen, um aus dieser Population von mRMA-Molekülen eine cDNA-Bibliothek herzustellen, umfasst.
  6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei diese haptenylierten Nukleinsäuremoleküle RNA-Moleküle sind.
  7. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das ferner die Reduktion oder das Entfernen von kontaminierenden Nukleinsäuremolekülen aus dieser Bibliothek umfasst.
  8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei diese Reduktion oder dieses Entfernen vor oder nach der Normalisierung dieser Bibliothek ausgeführt wird.
  9. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die kontaminierenden Nukleinsäuremoleküle ein oder mehr als ein Vektor sind.
  10. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei diese Reduktion oder dieses Entfernen das Inkubieren dieser Bibliothek mit zumindest einer haptenylierten Sonde umfasst.
  11. Das Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei diese Sonde mit Nukleinsäuremolekülen dieser Bibliothek hybridisiert.
  12. Das Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei diese Sonde nicht fähig ist, mit Vektorsequenzen dieser Bibliothek zu hybridisieren.
  13. Das Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Haptene dieser haptenylierten Sonde zum Isolieren einer normalisierten Bibliothek verwendet werden, die wesentlich reduzierte kontaminierende Nukleinsäuremoleküle aufweist, wodurch eine ausgewählte normalisierte Bibliothek hergestellt wird.
  14. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die genannten Haptene ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G, einem Zelloberflächen-Fc-Rezeptoren, einem antikörperspezifischen Antigen, einem enzymspezifischen Substrat, Polymyxin B, Endotoxin-neutralisierenden Protein (ENP), Fe3+, einem Transferrin-Rezeptoren, einem Insulin-Rezeptoren, einem Cytokin-Rezeptoren, CD4, Spektrin, Fodrin, ICAM-1, ICAM-2, C3bi, Fibrinogen, Faktor X, Ankyrin, einem Integrin, Vitronektin, Fibronektin, Kollagen, Laminin, Glycophorin, Mac-1, LFA-1, β-Aktin, gp-120, einem Cytokin, Insulin, Ferrotransferrin, Apotransferrin, Lipopolysaccharid, einem Enzym, einem Antikörper, Biotin und Verbindungen hiervon.
  15. Das Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei dieses Hapten ein Biotin ist.
  16. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei diese ausgewählte normalisierte Bibliothek durch Hapten-Ligand-Wechselwirkungen und/oder Extraktion isoliert wird.
  17. Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Isolierung die Verwendung eines festen Trägers mit zumindest einem haptenbindenden Liganden umfasst.
  18. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei diese normalisierte Bibliothek einzelsträngig ist.
  19. Das Verfahren gemäß Anspruch 18, das ferner das Inkubieren dieser einzelsträngigen, ausgewählten, normalisierten Bibliothek unter ausreichenden Bedingungen, um diese Moleküle doppelsträngig zu machen, umfasst.
  20. Das Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei diese Bedingungen das Inkubieren dieser einzelsträngigen, ausgewählten, normalisierten Bibliothek mit einem oder mehr als einem Nukleotid, einem oder mehr als einem Polypeptid mit Polymerase-Aktivität und einem oder mehr als einem Primer umfassen.
  21. Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei diese ein oder mehrere Nukleotide Nukleotid-Analoga sind, die diesen doppelsträngigen Molekülen Nukleaseresistenz verleihen.
  22. Das Verfahren gemäß Anspruch 21, das ferner das Verdauen einer Probe, die diese doppelsträngigen Moleküle umfasst, mit dieser Nuklease umfasst.
  23. Das Verfahren gemäß Anspruch 22, das ferner das Aufnehmen dieser doppelsträngigen Moleküle in eine oder mehr als eine Wirtszelle umfasst.
  24. Das Verfahren gemäß Anspruch 19, das ferner die Transformation dieser doppelsträngigen Moleküle in eine oder mehr als eine Wirtszelle umfasst.
  25. Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei diese Primer zielspezifische Primer sind.
  26. Das Verfahren gemäß Anspruch 25, das ferner das Aufnehmen dieser doppelsträngigen Moleküle in eine oder mehr als eine Wirtszelle umfasst.
  27. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei diese RNA-Moleküle durch eine oder mehr als eine RNA-Polymerase hergestellt werden.
  28. Das Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei diese RNA-Polymerasen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SP6, T7 und T3-RNA-Polymerasen.
  29. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei diese RNA-Moleküle mit einem oder mehr als einem Promotoren hergestellt werden.
  30. Das Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei diese Promotoren von einem oder mehr als einem Vektor oder von einem oder mehr als einem Adaptor bereitgestellt werden.
  31. Das Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei diese Promotoren die Synthese von zumindest einem RNA-Molekül aus allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle dieser Bibliothek ermöglichen.
  32. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei diese hybridisierten Moleküle durch Hapten-Ligand-Wechselwirkungen und/oder Extraktion entfernt werden.
  33. Das Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei dieses Entfernen die Verwendung eines festen, zumindest einen Liganden umfassenden Trägers umfasst.
  34. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, das ferner die Behandlung dieser doppelsträngigen cDNA-Bibliothek unter ausreichenden Bedingungen, um diese Moleküle einzelsträngig zu machen, umfasst.
  35. Das Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei diese Bedingungen den Abbau eines Strangs dieser doppelsträngigen Moleküle umfassen.
  36. Das Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei diese Bedingungen das Denaturieren dieser doppelsträngigen Moleküle umfassen.
  37. Das Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei dieser Abbau mit Gen II und Exonuklease III durchgeführt wird.
  38. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei diese Hybridisierungsbedingungen ausgewählt werden aus der Gruppe, die folgendes umfasst: (a) einen Cot-Wert gleich oder größer 25; (b) einen Cot-Wert gleich oder größer 50; (c) einen Cot-Wert gleich oder größer 100; (d) einen Cot-Wert von ungefähr 10 bis 10 000; (e) einen Cot-Wert von ungefähr 25 bis 10 000; (f) einen Cot-Wert von ungefähr 50 bis 10 000; (g) einen Cot-Wert von ungefähr 100 bis 10 000; und (h) einen Cot-Wert kleiner als 10 000; wobei der Cot-Wert das Produkt von Ausgangskonzentration an Nukleinsäuremolekülen (Mol Nukleotide pro Liter, Co) und Zeit (t) ist.
  39. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei diese Reduktion oder dieses Entfernen das Inkubieren dieser Bibliothek mit zumindest einem Primer und zumindest einem Nukleotid, das Nukleaseresistenz verleiht, unter ausreichenden Bedingungen, um die Nukleinsäuremoleküle doppelsträngig zu machen, umfasst.
  40. Das Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei dieser Primer mit Nukleinsäuremolekülen dieser Bibliothek hybridisiert.
  41. Das Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei dieser Primer nicht fähig ist, mit Vektorsequenzen dieser Bibliothek zu hybridisieren.
  42. Das Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei dieses Nukleotid ein Nukleotid-Analogon ist.
  43. Das Verfahren gemäß Anspruch 42, wobei dieses Nukleotid ein methyliertes Nukleotid ist.
  44. Das Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei dieses Nukleotid 5-Methyldeoxycytosin ist.
  45. Das Verfahren gemäß Anspruch 39, das ferner den Verdau dieser doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle mit einer oder mehr als einer Nuklease umfasst.
  46. Das Verfahren gemäß Anspruch 45, das ferner das Aufnehmen dieser verdauten Moleküle in eine oder mehr als eine Wirtszelle umfasst.
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