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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung liegt im Gebiet der Molekularbiologie und
der Genetik. Die Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Verfahren
zur Herstellung normalisierter Nukleinsäurebibliotheken, sodass die
Variation der Häufigkeit
der einzelnen Nukleinsäuremoleküle in der
Bibliothek im Wesentlichen reduziert ist (z.B. nicht mehr als ungefähr zwei
Größenordnungen).
Die Erfindung bezieht sich ebenso auf normalisierte, mittels dieser
Verfahren hergestellte Bibliotheken, auf aus diesen Bibliotheken
isolierte Nukleinsäuremoleküle, auf
genetische Konstrukte (z.B. Vektoren), die diese Nukleinsäuremoleküle umfassen,
und auf solche normalisierte Bibliotheken umfassende Wirtszellen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Darstellung des Mechanismus, der das normale Funktionieren lebender
Zellen steuert, erfordert ein detailliertes Verständnis der
in allen Genen (wofür
hierin ebenfalls das Genom als Synonym verwendet wird) codierten
Information. Zwecks Kartierung und Sequenzierung der in den Genomen
verschiedener Organismen enthaltenen Gene werden normalerweise Messenger-RNA
(mRNA)-Sequenzen, die für
die Gene oder Genome repräsentativ
sind, zur Evaluierung des genetischen Aufbaus der bestimmten Zelle
oder des Organismus von Interesse verwendet. Allerdings werden die
mRNAs (im Menschen auf 100 000 geschätzt) innerhalb verschiedener
Zelltypen bei verschiedenen Niveaus und verschiedenen Entwicklungsstadien
hergestellt (z.B. ist von einigen mRNAs weniger als eine Kopie pro
Zelle vorhanden, während
von anderen mRNAs Millionen von Kopien vorhanden sind). Diese mRNAs,
ihre entwicklungs- und zelltypspezifische regulierte Expression
und ihre Translation in Protein machen den einzigartigen Charakter
eines bestimmten Zelltyps aus. Beispielsweise produzieren adulte
Muskelzellen mehr Myoglobin-mRNA, während reife, rote Blutkörperchen
viel Hämoglobin
enthalten. Im Fötus
wird Hämoglobin
von der Leber produziert; nach der Geburt allerdings ändern sich
sowohl der Typ des produzierten Hämoglobins als auch die Gewebsquelle
aufgrund von Änderungen
in der Genexpression.
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Ein
Verständnis
der molekularen Details der normalen Funktionsweise von Zellen ist
ausschlaggebend, um Erbkrankheiten, bei denen die Regulation und
Expression von einem oder mehr als einem Genen verändert wurde,
verstehen und behandeln zu können.
Diesem Zweck entspricht die Herstellung von Bibliotheken klonierter Nukleinsäuren, von
denen alle oder im Wesentlichen alle Elemente der Bibliotheken mit
annähernd
gleicher Wahrscheinlichkeit isoliert werden können.
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Eine
normalisierte Bibliothek mit relativen Konzentrationen ihrer Elemente
in einem niedrigeren Bereich, zum Beispiel ungefähr um das 2–4 fache niedriger, hat den
Vorteil, im Wesentlichen alle mRNAs für die Isolierung und anschließende Analyse
verfügbar
zu machen. Diese Art von Bibliothek fördert das Verständnis der
normalen Funktionsweise einzelner Gene und des Genoms im Allgemeinen.
Allerdings führte
keines der vordem berichteten Verfahren zur Herstellung von normalisierten
Nukleinsäurebibliotheken,
in denen im Wesentlichen alle Nukleinsäuremoleküle oder in einem bestimmten
Zell- oder Gewebetyp exprimierten Gene vertreten sind und mit hoher
Wahrscheinlichkeit isoliert werden können. Obgleich einige Forscher
Normalisierungsversuche (d. h. die Variation der relativen Häufigkeit
der Komponenten der Population von Nukleinsäuremolekülen reduzieren) unternommen
haben, ist es nicht gelungen, die relative Häufigkeit der Gesamtpopulation
auf einen Bereich von zwei Größenordnungen
einzuschränken
(Bonaldo, M., Lennon, G., Soares, M.B., Genome Res. 6: 791–866 (1996);
Ko, M.S.H., Nucl. Acids Res. 18: 5705–5711 (1990); Pantanjali, S.R.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1943–1947 (1991); Soares, M.B.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9228–9232 (1994)). Die daraus hervorgehenden, „normalisierten" Bibliotheken konnten
keine Menge neuartiger, zum Verständnis der Expression der meisten
Gene notwendiger Informationen bereitstellen. Somit besteht ein
Bedarf an Verfahren zur Herstellung normalisierter Nukleinsäurebibliotheken
und an mittels solcher Verfahren hergestellter Nukleinsäurebibliotheken.
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WO
95/08647 beschreibt ein Verfahren zur Konstruktion von normalisierten
cDNA-Bibliotheken
und Verwendungen derselben.
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Bonaldo
Fatina de M et al., Genome Research, Vol. 6, Nr. 9, 1. September
1996, Seiten 791–806,
beschreibt „Normalisierung" und „Subtraktion" – zwei Ansätze zur Erleichterung von Genentdeckungen.
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Ko,
Nucleic Acids Research, Vol. 18, Nr. 19, 1990, Seiten 5705–5711, beschreibt
eine „äquilibrierte
cDNA-Bibliothek" durch
Reassoziieren kurzer, doppelsträngiger
cDNAs.
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WO
95/11986 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer subtrahierten
cDNA-Bibliothek
und Verwendungen der Bibliothek.
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Hongping
Jiang et al., Molecular and Celluar Differentiation, Vol. 1, Nr.
3, 1993, Seiten 285–299,
beschreibt die Verwendung eines empfindlichen und effizienten Subtraktions-Hybridisierungs-Protokolls
zur Identifizierung von unterschiedlich regulierten Genen während der
Induktion von Differenzierung in humanen Melanomzellen.
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Sankhavaram
et al., P.N.A.S. (USA), Vol. 88, Nr. 5, 1. März 1991, Seiten 1943–1947, beschreibt
die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek mit uniformer Häufigkeit
(normalisiert).
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Normalisierung einer
Nukleinsäurebibliothek
bereit, das folgendes umfasst:
- (a) Inkubieren
einer Nukleinsäurebibliothek,
zur Normalisierung mit synthetischen, haptenylierten Nukleinsäuremolekülen, die
zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle dieser Bibliothek komplementär sind,
unter Bedingungen, die die Hybridisierung der zahlreicheren Moleküle dieser
Bibliothek mit diesen haptenylierten Nukleinsäuremolekülen begünstigen; und
- (b) Entfernen dieser hybridisierten Moleküle durch Hapten-Ligand-Wechselwirkungen,
wodurch eine normalisierte Bibliothek hergestellt wird.
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Die
vorliegende Erfindung erfüllt
somit diesem Bedarf durch Bereitstellen von Verfahren zur Herstellung
normalisierter Nukleinsäurebibliotheken
(d. h. Bibliotheken klonierter Nukleinsäuremoleküle, von denen jedes Nukleinsäuremolekülelement
mit annähernd
gleicher Wahrscheinlichkeit isoliert werden kann). Insbesondere
bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Normalisierung einer
Nukleinsäurebibliothek,
die wie in den Ansprüchen
dargestellt eine einzelsträngige
oder doppelsträngige
cDNA-Bibliothek
sein kann.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der Erfindung liegt die relative Konzentration
aller Elemente der normalisierten Bibliothek innerhalb einer oder
zwei Größenordnungen.
Gemäß einem
weiteren bevorzugten Aspekt ermöglicht
die Erfindung das Entfernen oder Eliminieren kontaminierender Nukleinsäuremoleküle aus der
normalisierten Bibliothek. Eine solche Kontamination kann Vektoren
innerhalb der Bibliothek einschließen, die keine Inserts enthalten
(z.B. Background). Auf diese Art und Weise umfasst die gesamte oder
ein wesentlicher Teil der normalisierten Bibliothek Vektoren mit
integrierten Nukleinsäuremolekülen der
Bibliothek.
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Die
Erfindung bezieht sich ebenso auf solche Verfahren, bei denen die
Bedingungen, die die Hybridisierung der zahlreicheren Moleküle der Bibliothek
mit den haptenylierten Molekülen,
begünstigen,
ausgewählt werden
aus der Gruppe, die folgendes enthält: (a) einen Cot-Wert gleich
oder größer 25;
(b) einen Cot-Wert gleich oder größer 50; (c) einen Cot-Wert
gleich oder größer 100;
(d) einen Cot-Wert gleich oder größer 1 000; (e) einen Cot-Wert
gleich oder größer 2 000;
(f) einen Cot-Wert
gleich oder größer 5 000;
(g) einen Cot-Wert von ungefähr
10 bis 10 000; (h) einen Cot-Wert von ungefähr 25 bis 10 000; (i) einen
Cot-Wert von ungefähr 50
bis 10 000; (j) einen Cot-Wert von ungefähr 1 000 bis 10 000; (k) einen
Cot-Wert von ungefähr
5 000 bis 10 000; (I) einen Cot-Wert von ungefähr 500 bis 5 000; (m) einen
Cot-Wert von ungefähr
100 bis 1 000; und (n) einen Cot-Wert kleiner 10 000.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der Erfindung wird eine Population von mRNA unter
ausreichenden Bedingungen, um eine Population von cDNA-Molekülen herzustellen,
die zu allen oder einem Teil dieser mRNA-Moleküle komplementär sind,
inkubiert. Bevorzugt wird eine solche Population von cDNA-Molekülen (z.B.
einzelsträngige
cDNA) durch Mischen der Population von mRNA-Molekülen (Templatmoleküle) mit
einem oder mehr als einem Polypeptiden mit reverser Transkriptase-Aktivität und Inkubieren
dieser Mischung unter ausreichenden Bedingungen, um eine Population
von einzelsträngigen
cDNA-Molekülen,
die zu allen oder einem Teil dieser mRNA-Moleküle komplementär sind,
herzustellen, hergestellt. Die einzelsträngigen cDNA-Moleküle können dann
als Templatmoleküle
zur Herstellung doppelsträngiger
cDNA-Moleküle
durch Inkubieren der Mischung unter geeigneten Bedingungen bei Vorhandensein
von einer oder mehr als einer DNA-Polymerase verwendet werden. Die
daraus hervorgehende Population von doppelsträngigen oder einzelsträngigen cDNA-Bibliotheken
kann erfindungsgemäß normalisiert
werden. Bevorzugt werden solche cDNA-Bibliotheken vor der Normalisierung
in einen oder mehr als einen Vektor inseriert. Alternativ können die
cDNA-Bibliotheken vor der Insertion in einen oder mehr als einen
Vektoren normalisiert werden und nach der Normalisierung können sie
in einen oder mehrere Vektoren kloniert werden.
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Gemäß einem
besonders bevorzugten Aspekts der Erfindung ist die zu normalisierende
Bibliothek in einem oder mehr als einem Vektor, die ein Plasmid,
ein Cosmid, ein Phagemid und dergleichen sein können, enthalten (inseriert).
Solche Vektoren umfassen bevorzugt einen oder mehr als einen Promotor,
der/die die Synthese von zumindest einem RNA-Molekül aller
oder eines Teils der Nukleinsäuremoleküle (bevorzugt
cDNA-Moleküle),
die in den Vektor inseriert sind, ermöglicht/ermöglichen. Somit können durch
die Verwendung der Promotoren erfindungsgemäß zu allen oder einem Teil
der Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek
komplementäre,
haptenylierte RNA-Moleküle
hergestellt und erfindungsgemäße für die Normalisierung
der Bibliothek verwendet werden. Solche synthetisierten RNA-Moleküle (die
haptenyliert wurden) sind zu allen oder einem Teil der Vektor-Inserts
der Bibliothek komplementär.
Zahlreichere Moleküle
in der Bibliothek können
dann bevorzugt durch Hybridisieren der haptenylierten RNA-Moleküle zu der
Bibliothek entfernt werden, wodurch die normalisierte Bibliothek
der Erfindung hergestellt wird. Die synthetisierten RNA-Moleküle sollen
ohne Einschränkung
für die
Bibliothek repräsentativ
sein; das bedeutet, zahlreichere Substanzen in der Bibliothek führen unter
Verwendung des obigen Verfahrens zu zahlreicherer, haptenylierter
RNA. Die relative Häufigkeit
der Moleküle
innerhalb der Bibliothek und folglich innerhalb der haptenylierten
RNA bestimmt die Entfernungsgeschwindigkeit bestimmter Substanzen
aus der Bibliothek; wenn die Häufigkeit
einer bestimmten Substanz hoch ist, kann eine solch häufige Substanz
einfacher entfernt werden, während
weniger häufige
Substanzen weniger mühelos
aus der Population entfernt werden. Die Normalisierung durch diesen
Vorgang ermöglicht
somit die wesentliche Äquilibration
der Niveaus jeder Substanz in der Bibliothek.
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Gemäß einem
weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung ist es nicht notwendig,
die zu normalisierende Bibliothek vor der Normalisierung in einen
oder mehrere Vektoren zu inserieren. Gemäß einem solchen Aspekt der
Erfindung können
die Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek
unter Verwendung gut bekannter Techniken zur Synthese haptenylierter
Nukleinsäuremoleküle verwendet
werden. Beispielsweise können
haptenylierte Nukleinsäuremoleküle bei Vorhandensein
von einer oder mehr als einer DNA-Polymerase, von einem/einer oder
mehr als einem/einer geeigneten Primer oder Sonde oder von einem
oder mehr als einem Nukleotid synthetisiert werden (die Nukleotide
und/oder Primer oder Sonden können
haptenyliert sein). Auf diese Art und Weise werden erfindungsgemäß haptenylierte
DNA-Moleküle
hergestellt und können
für die
erfindungsgemäße Normalisierung
der Bibliothek verwendet werden. Alternativ können ein oder mehr als ein
Promotor den Bibliotheksmolekülen
hinzugefügt
(oder an diese ligiert werden) werden, wodurch die Synthese der
haptenylierten RNA-Moleküle
zwecks erfindungsgemäßer Verwendung
zur Normalisierung der Bibliothek ermöglicht wird. Beispielsweise
werden Adaptoren, die einen oder mehr als einen Promotor enthalten,
einem oder mehreren Enden der doppelsträngigen Bibliotheksmoleküle hinzugefügt (z.B.
aus einer Population von RNA-Molekülen hergestellte cDNA-Bibliothek).
Somit können
solche Promotoren dann verwendet werden, um die haptenylierten,
zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek komplementären RNA-Moleküle herzustellen.
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Die
Bibliothek kann dann erfindungsgemäß normalisiert und, falls erwünscht, in
einen oder mehrere Vektoren inseriert werden.
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Obgleich
bei der Normalisierung von Bibliotheken haptenylierte RNA bevorzugt
wird, können
weitere erfindungsgemäße, haptenylierte
Nukleinsäuremoleküle verwendet
werden. Beispielsweise kann haptenylierte DNA erfindungsgemäß aus der
Bibliothek synthetisiert und verwendet werden.
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Für die Verwendung
bei den Verfahren der Erfindung geeignete Haptene schließen Avidin,
Streptavidin, Protein A, Protein G, einen Zelloberflächen-Fc-Rezeptor,
ein antikörperspezifisches
Antigen, ein enzymspezifisches Substrat, Polymyxin B, Endotoxin-neutralisierendes
Protein (ENP), Fe3+, einen Transferrin-Rezeptor,
einen Insulin-Rezeptor, einen Cytokin-Rezeptor, CD4, Spektrin, Fodrin,
ICAM-1, ICAM-2, C3bi, Fibrinogen, Faktor X, Ankyrin, ein Integrin,
Vitronektin, Fibronektin, Kollagen, Laminin, Glycophorin, Mac-1,
LFA-1, β-Aktin,
gp-120, ein Cytokin, Insulin, Ferrotransferrin, Apotransferrin,
Lipopolysaccharid, ein Enzym, einen Antikörper, Biotin und Kombinationen
hiervon ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Ein besonders bevorzugtes Hapten
ist Biotin.
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Mittels
der oben beschriebenen Verfahren hergestellte hybridisierte Moleküle können erfindungsgemäß isoliert
werden, beispielsweise durch Extraktion oder durch Hapten-Ligand-Wechselwirkungen.
Bevorzugt werden Extraktionsverfahren (z.B. Verwendung organischer
Lösungsmittel)
verwendet. Das Isolieren durch Hapten-Ligand-Wechselwirkungen kann durch Inkubieren
der haptenylierten Moleküle
mit einem festen, zumindest einen haptenbindenden Liganden umfassenden
Träger
ausgeführt
werden. Für
die Verwendung bei solchen Isolierungsverfahren bevorzugte Liganden
entsprechen dem bestimmten, verwendeten Hapten und schließen Biotin,
einen Antikörper,
ein Enzym, Lipopolysaccharid, Apotransferrin, Ferrotransferrin,
Insulin, ein Cytokin, gp-120, β-Aktin,
LFA-1, Mac-1, Glycophorin, Laminin, Kollagen, Fibronektin, Vitronektin,
ein Integrin, Ankyrin, C3bi, Fibrinogen, Faktor X, ICAM-1, ICAM-2,
Spektrin, Fodrin, CD4, einen Zytokinrezeptor, einen Insulin-Rezeptor,
einen Transferrin-Rezeptor, Fe3+, Polymyxin
B, Endotoxin-neutralisierendes Protein (ENP), ein enzymspezifisches
Substrat, Protein A, Protein G, einen Zelloberflächen-Fc-Rezeptor, ein antikörperspezifisches Antigen, Avidin,
Streptavidin oder Kombinationen hiervon ein, sind aber nicht darauf
beschränkt.
Der bei diesen Isolierungsverfahren verwendete feste Träger kann
Nitrozellulose, Diazozellulose, Glas, Polystyrol, Polyvinylchlorid,
Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Sepharose, Agar, Stärke, Nylon,
ein Latex-Kügelchen,
ein magnetisches Kügelchen,
ein paramagnetisches Kügelchen,
ein superparamagnetisches Kügelchen
oder eine Mikrotiterplatte sein.
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Bevorzugte
feste Träger
sind magnetische Kügelchen,
paramagnetische Kügelchen
und superparamagnetische Kügelchen
und insbesondere bevorzugt sind solche Kügelchen, die ein oder mehr
als ein Streptavidin- oder Avidinmolekül umfassen.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung werden normalisierte Bibliotheken
weiteren Isolierungs- oder Selektionsschritten ausgesetzt, die das
Entfernen von ungewollter Kontamination oder ungewolltem Background
ermöglichen.
Solche Kontamination oder solcher Background können unerwünschte Nukleinsäuren einschließen. Beispielsweise
bei der Konstruktion einer zu normalisierenden Bibliothek in einen
oder mehr als einen Vektor kann ein geringer Prozentsatz an Vektoren
(ohne Inserts) in der Bibliothek vorhanden sein. Nach der Normalisierung
können
solche wenig häufigen
Moleküle
(z.B. Vektor-Background) aufgrund des Normalisierungsvorgangs als
Bestandteil an Bedeutung gewinnen. Das bedeutet, dass das relative
Niveau eines solch wenig häufigen
Backgrounds als Teil des Normalisierungsvorgangs angehoben werden
kann.
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Das
Entfernen solcher kontaminierender Nukleinsäuren kann durch Inkubieren
einer normalisierten Bibliothek mit einer oder mehr als einer haptenylierten,
für die
Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek
spezifischen Sonde (z.B. zielspezifische Sonden) ausgeführt werden.
Prinzipiell kann das Entfernen der kontaminierenden Sequenzen durch
Selektion der die Sequenz von Interesse aufweisenden Nukleinsäuren oder
durch Eliminieren jener Moleküle,
die keine Sequenzen von Interesse enthalten, ausgeführt werden.
Das Entfernen der kontaminierenden Nukleinsäuremoleküle kann erfindungsgemäß auf jeder
beliebigen, normalisierten Bibliothek ausgeführt werden (unabhängig davon,
ob die Bibliothek kann in einen Vektor konstruiert ist oder nicht).
Somit können
die Sonden so gestaltet werden, dass sie kontaminierende Nukleinsäuren nicht
erkennen oder an diese hybridisieren (wie in der bevorzugten, die
oligodA-NotI-3'-Biotin-Sonde
verwendenden Ausführungsform). Nach
der Hybridisierung der haptenylierten Sonde mit Nukleinsäuremolekülen der
Bibliothek binden die haptenylierten Sonden an selektierte, erwünschte Sequenzen
innerhalb der normalisierten Bibliothek an und lassen die kontaminierenden
Nukleinsäuremolekülen zurück, was
zu einer selektierten, normalisierten Bibliothek führt. Dann
kann die selektierte, normalisierte Bibliothek isoliert werden.
Gemäß einem
bevorzugten Aspekt sind solch isolierte, selektierte, normalisierte
Bibliotheken einzelsträngig
und können
nach der Selektion durch Inkubieren der einzelsträngigen Bibliothek
unter ausreichenden Bedingungen, um die Nukleinsäuremoleküle doppelsträngig zu
machen, doppelsträngig
gemacht werden. Die doppelsträngigen
Moleküle
werden dann in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen. Alternativ
kann die normalisierte Bibliothek unter Verwendung der haptenylierten
Sonde oder des haptenylierten Primers (bevorzugt zielspezifisch)
doppelsträngig
gemacht werden und dann durch Extraktion oder Ligand-Hapten-Wechselwirkungen
selektiert werden. Solche doppelsträngigen Moleküle können dann
in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung können
die kontaminierenden Nukleinsäuren
durch Inkubieren der normalisierten Bibliothek bei Vorhandensein
von einem oder mehr als einem für
Bibliothekssequenzen spezifischen Primer reduziert oder eliminiert
werden (spezifisch für
Klone, die Inserts enthalten, z.B. oligodA-NotI). Dieser Aspekt
der Erfindung kann das Inkubieren der einzelsträngigen, normalisierten Bibliothek mit
einem oder mehr als einem Nukleotid (bevorzugt Nukleotide, die den
synthetisierten Nukleinsäuremolekülen Nukleaseresistenz
verleihen) und mit einem oder mehr als einem Polypeptid mit Polymerase-Aktivität bei ausreichenden
Bedingungen, um die Nukleinsäuremoleküle doppelsträngig zu
machen, umfassen. Die daraus hervorgehenden, doppelsträngigen Moleküle können dann
in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden. Alternativ
können
die daraus hervorgehenden, doppelsträngigen Moleküle, die
Nukleaseresistenz verleihende Nukleotide enthalten, mit solch einer
Nuklease verdaut oder in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen
werden.
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Gemäß noch einem
weiteren Aspekt kann das Eliminieren oder Entfernen der kontaminierenden
Nukleinsäure
vor der Normalisierung der Bibliothek ausgeführt werden, was zu der selektierten,
normalisierten Bibliothek der Erfindung führt. Bei einem solchen Verfahren
kann die zu normalisierende Bibliothek jedem beliebigen, hierin
beschriebenen Verfahren zum Entfernen ungewollter Nukleinsäuremoleküle ausgesetzt
werden und die Bibliothek kann dann mittels des erfindungsgemäßen Vorgangs
zwecks Bereitstellen selektierter, normalisierter Bibliotheken der
Erfindung normalisiert werden.
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Doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle werden
erfindungsgemäß bevorzugt
vor der Hybridisierung einzelsträngig
gemacht. Somit können
die Verfahren der Erfindung ferner die Behandlung der oben beschriebenen
doppelsträngigen
Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek
unter ausreichenden Bedingungen, um die Nukleinsäuremoleküle einzelsträngig zu
machen, umfassen. Solche Bedingungen können den Abbau eines Stranges
der doppelsträngigen
Nukleinsäuremoleküle (bevorzugt
unter Verwendung von Gen II Protein und Exonuklease III) oder Denaturieren
der doppelsträngigen
Nukleinsäuremoleküle unter
Verwendung von Wärme,
Lauge und dergleichen umfassen.
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Die
Erfindung bezieht sich ebenso auf normalisierte Nukleinsäurebibliotheken,
auf selektierte, normalisierte Nukleinsäurebibliotheken und auf transformierte
Wirtszellen, die mittels der oben beschriebenen Verfahren hergestellt
wurden.
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1 ist
ein Schema des Phagemids, der zur Konstruktion einer direktional
klonierten cDNA-Bibliothek verwendet wurde.
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2 ist
ein schematisches Diagramm der Herstellung von normalisierten Phagemid-Bibliotheken
unter Verwendung von subtraktiver Hybridisierung mit einer biotinylierten
Gesamtbibliotheks-Driver-RNA, auf die unter dem Synonym haptenylierte
Nukleinsäuremoleküle Bezug
genommen wird.
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3 ist
ein Diagramm, das zeigt, wie 3'-biotinylierte,
zielspezifische Sonden zur Herstellung von normalisierten Phagemid-Bibliotheken
mit niedrigem Background, die hierin auch als selektierte, normalisierte
Bibliotheken bezeichnet werden, verwendet werden können.
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4 ist
ein Diagramm, das zeigt, wie eine 5'-biotinylierte, zielspezifische Sonde
zur Reduktion von Background von normalisierten Phagemid-Bibliotheken, die
hierin auch als selektierte, normalisierte Bibliotheken bezeichnet
werden, verwendet werden kann.
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5 ist
ein Diagramm, das zeigt, wie nukleaseresistente Nukleotide und eine
Nuklease zu normalisierten Phagemid-Bibliotheken mit niedrigem Background,
die hierin auch als selektierte, normalisierte Bibliotheken bezeichnet
werden, führen.
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6 ist
eine Fotografie eines Ethidiumbromid-gefärbten Gels der Anreicherung
zahlreicher TGFβ cDNAs,
die in einer nicht-normalisierten cDNA-Bibliothek bei gewichtig
unterschiedlichen Häufigkeiten
oder in einer normalisierten Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn
bei verschiedenen Cot-Werten der Subtraktion vorhanden sind, bei
denen zwei unterschiedliche Verfahren zum Eliminieren von Background
angewandt wurden.
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7 ist
eine schematische Darstellung der Normalisierung einer Bibliothek
unter Verwendung von Adaptoren, die Promotoren umfassen. Nach der
Normalisierung kann die Bibliothek in einen Vektor kloniert werden.
Bei diesem Verfahren kann das Entfernen der kontaminierenden Vektorsequenzen
unnötig
sein, da die Selektion der Background-Sequenzen vor dem Klonieren
ausgeführt
werden kann.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Definitionen
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In
der nachfolgenden Beschreibung wird eine Reihe von im Bereich der
rekombinanten DNA-Technologie verwendeter Begriffe ausführlich verwendet.
Zwecks eines besseren und einheitlichen Verständnisses der Beschreibung und
der Ansprüche,
einschließlich
dem solchen Begriffen zu verleihendem Umfang, werden die folgenden
Definitionen bereitgestellt.
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Bibliothek.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Bibliothek" oder „Nukleinsäurebibliothek" ein Set von Nukleinsäuremolekülen (ringförmig oder
linear), die alle oder einen Teil des DNA-Inhalts eines Organismus
repräsentieren
(eine „Genom-Bibliothek"), oder ein Set von
Nukleinsäuremolekülen, die
alle oder einen signifikanten Teil der exprimierten Gene in einer
Zelle, einem Gewebe, einem Organ oder einem Organismus repräsentieren (eine „cDNA-Bibliothek"). Solche Bibliotheken
können
in einem oder mehr als einem Vektor enthalten sein oder nicht.
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Normalisiert.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet der Begriff „normalisiert" oder "normalisierte Bibliothek" eine Nukleinsäurebibliothek,
die bevorzugt unter Verwendung der Verfahren der Erfindung manipuliert
wurde, um die relative Variation der Häufigkeit der Nukleinsäuremolekülelemente
in der Bibliothek auf einen Bereich von nicht größer als ungefähr 25-fach,
nicht größer als
ungefähr
20-fach, nicht größer als
ungefähr
15-fach, nicht größer als
ungefähr
10-fach, nicht größer als
ungefähr
7-fach, nicht größer als
ungefähr
6-fach, nicht größer als
ungefähr
5-fach, nicht größer als
ungefähr
4-fach, nicht größer als
ungefähr
3-fach oder nicht größer als
ungefähr 2-fach,
zu reduzieren.
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Driver.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Driver" auf eine Population von Nukleinsäuremolekülen (bevorzugt
RNA), die zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle einer Bibliothek komplementär sind. Ein
solcher Driver umfasst bevorzugt ein oder mehr als ein Hapten und
ist bevorzugt im Vergleich zu der Bibliothek von Interesse in molarem Überschuss
(größer als
10-fach, bevorzugt größer als
20-fach). Der Driver wird erfindungsgemäß bevorzugt aus der zu normalisierenden
Bibliothek synthetisiert und dann zur Normalisierung dieser Bibliothek
verwendet.
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Background.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich Background auf kontaminierende Nukleinsäuremoleküle, die
in einer konstruierten Bibliothek vorhanden sein können. Übliche kontaminierende
Nukleinsäuremoleküle sind
Vektoren, in denen die Bibliothek konstruiert wurde, die aber das
inserierte Nukleinsäuremolekül (durch
Deletion oder auf andere Weise) verloren haben oder die keine Nukleinsäure-Inserts
enthalten. Die hierin beschriebenen, zielspezifischen Sonden oder
Primer werden nicht zu kontaminierenden oder Background-Sequenzen
hybridisieren.
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Vektor.
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Wie
hierin verwendet, ist ein „Vektor" ein Plasmid, Cosmid,
Phagemid oder eine DNA-Phage oder ein weiteres DNA-Molekül, der zur
autonomen Replikation in einer Wirtszelle fähig ist und der sich durch
eine oder eine geringe Anzahl von Erkennungsstellen für Restriktionsendonuklease
charakterisiert, an der/denen solche DNA-Sequenzen in einer vorbestimmten
Art und Weise ohne Verlust einer wesentlichen, biologischen Funktion
des Vektors geschnitten werden können
und in den zwecks Replikation und Klonierung DNA-Sequenzen inseriert
werden kann. Der Vektor kann ferner ein für die Verwendung bei der Identifizierung
von mit dem Vektor transformierten Zellen geeigneter Marker sein.
Marker schließen
beispielsweise Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz ein,
sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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Primer.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich „Primer" auf ein einzelsträngiges Oligonukleotid, das
durch kovalente Bindung des Nukleotid-Monomers während der Amplifikation oder
Polymerisation eines DNA-Moleküls verlängert wird.
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Sonde.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich „Sonde" auf ein einzelsträngiges Oligonukleotid, das
zur Hybridisierung und/oder Isolierung von einem oder mehr als einem
Nukleinsäuremolekül von Interesse
verwendet werden kann. Solche Sonden können ein oder mehr als ein
Hapten umfassen oder nicht.
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Templat.
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Der
Begriff „Templat" bezieht sich wie
hierin verwendet auf doppelsträngige
oder einzelsträngige
Nukleinsäuremoleküle, die
amplifiziert, synthetisiert oder sequenziert werden sollen. Bei
einem doppelsträngigen Molekül wird das
Denaturieren seiner Stränge
zur Bildung eines ersten und eines zweiten Stranges bevorzugt vor
der Amplifikation, Synthese oder Sequenzierung dieser Moleküle ausgeführt oder
das doppelsträngige
Molekül
kann direkt als ein Templat verwendet werden. Bei einzelsträngigen Templaten
wird ein zu einem Teil des Templats komplementärer Primer unter geeigneten
Bedingungen hybridisiert und eine oder mehr als eine Polymerase
können
dann ein zu dem gesamten oder einem Teil dieses Templats komplementäres Nukleinsäuremolekül synthetisieren.
Alternativ können
bei doppelsträngigen
Templaten ein oder mehr als ein Promotor (z.B. Promotor) in Kombination
mit einer oder mehreren Polymerasen zur Bildung von zu dem gesamten
oder einem Teil des Templats komplementären Nukleinsäuremolekülen verwendet
werden. Die Länge
der neu synthetisierten Moleküle
kann erfindungsgemäß gleich
der Länge
oder kleiner als die Länge
des ursprünglichen
Templats sein.
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Inkorporieren.
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Der
Begriff „Inkorporieren" wie hierin verwendet
bedeutet das Teilwerden eines DNA- und/oder RNA-Moleküls oder
Primers.
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Amplifikation.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich „Amplifikation" auf jedes beliebige
in vitro Verfahren zur Erhöhung der
Anzahl an Kopien einer Nukleotidsequenz durch die Verwendung einer
Polymerase. Nukleinsäure-Amplifikation
führt zum
Inkorporieren von Nukleotiden in ein DNA- und/oder RNA-Molekül oder einen
Primer, wodurch ein neues, zu einem Templat komplementäres Molekül gebildet
wird. Das gebildete Nukleinsäuremolekül und sein
Templat können
als Template zur Synthese zusätzlicher
Nukleinsäuremoleküle verwendet
werden. Wie hierin verwendet, kann eine Amplifikationsreaktion aus
mehreren Replikationsrunden bestehen. DNA-Amplifikationsreaktionen
schließen
beispielsweise Polymerase-Kettenreaktionen
(PCR) ein. Eine PCR-Reaktion kann aus 5 bis 100 Synthese- und Denaturierungs-„Zyklen" eines DNA-Moleküls bestehen.
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Oligonukleotid.
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„Oligonukleotid" bezieht sich auf
ein synthetisches oder natürliches
Molekül,
das eine kovalent gebundene Nukleotidsequenz, die mittels einer
Phosphodiester-Bindung zwischen der 3'-Position der Desoxyribose oder Ribose
von einem Nukleotid und der 5'-Position
der Desoxyribose oder Ribose des darunterliegenden Nukleotids verbunden
sind. Ein blockierendes Oligonukleotid bezieht sich auf Oligonukleotide,
die verwendet werden, um die Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen (z.B.
eine Sonde oder ein Primer) an ungewollten oder unerwünschten
Moleküle
zu vermeiden. Beispielsweise kann das blockierende Oligonukleotid
vermeiden, dass die 5'-
und in einigen Fällen
die 3'-Endsequenzen
der Driver-Komponenten an den Bibliotheksvektor hybridisieren.
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Nukleotid.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich „Nukleotid" auf eine Kombination aus Base, Zucker
und Phosphat. Nukleotide sind monomere Einheiten einer Nukleinsäuresequenz
(DNA und RNA). Der Begriff Nukleotid schließt Ribonukleosidtriphosphat
ATP, UTP, CTP, GTP und Desoxyribonukleosidtriphosphat wie etwa dATP, dCTP,
dITP, dUTP, dGTP, dTTP und Derivate davon ein. Solche Derivate schließen beispielsweise
[αS]dATP, 7-Deaza-dGTP
und 7-Deaza-dATP und Nukleotidderivate, die den diese enthaltenden
Nukleinsäuremolekülen Nukleaseresistenz
verleihen, ein. Der Begriff Nukleotid bezieht sich wie hierin verwendet
ebenfalls auf Didesoxyribosenukleosidtriphosphate (ddNTPs) und ihre
Derivate. Beispiele von Didesoxyribosenukleosidtriphosphaten schließen ddATP,
ddCTP, ddGTP, ddITP und ddTTP ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Ein „Nukleotid" kann erfindungsgemäß unmarkiert
oder durch gut bekannte Techniken detektierbar markiert sein. Detektierbare
Marker schließen
beispielsweise radioaktive Isotope, fluoreszierende Marker, chemilumineszierende
Marker, biolumineszierende Marker und Enzymmarker ein.
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Hybridisierung.
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Die
Begriffe „Hybridisierung" und „Hybridisieren" beziehen sich auf
eine Basenpaarung von zwei komplementären, einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen (RNA
und/oder DNA), um ein doppelsträngiges
Molekül
zu ergeben. Wie hierin verwendet, können zwei Nukleinsäuremoleküle hybridisiert
werden, obwohl die Basenpaarung nicht vollständig komplementär ist. Dementsprechend
verhindern Mismatch-Basen die Hybridisierung von zwei Nukleinsäuremolekülen nicht,
unter der Voraussetzung, dass geeignete, im Stand der Technik gut
bekannte Bedingungen verwendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung
bezieht sich der Begriff „Hybridisierung" insbesondere auf
die Hybridisierung eines Drivers an eine zu normalisierende Bibliothek.
Weitere, im Bereich der rekombinanten DNA-Technologie und Molekular-
und Zellbiologie verwendete Begriffe sind wie hierin für einen
Durchschnittsfachmann in der angewandten Technik verständlich.
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Überblick
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren zur Herstellung
von normalisierten Nukleinsäurebibliotheken
und auf mittels dieser Verfahren hergestellte normalisierte Bibliotheken.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die hergestellte normalisierte Bibliothek eine
cDNA-Bibliothek, die einzelsträngig
oder doppelsträngig
sein kann. Die Normalisierung einer Nukleinsäurebibliothek wird erfindungsgemäß unter
Verwendung haptenylierter Nukleinsäuremoleküle (d. h. Nukleinsäuremoleküle, die über ein
oder mehr als ein, hieran gebundenes Haptenmolekül verfügen, wie bei den unten beschriebenen),
die die zahlreicheren Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek
schneller hybridisieren, ausgeführt.
Solche haptenylierten Nukleinsäuremoleküle werden
auch als Driver bezeichnet. Diese Hybridisierung bildet Komplexe
aus Nukleinsäuremolekülen, die
dann bevorzugt mittels Ligand-Hapten-Wechselwirkungen oder mittels
Extraktionstechniken entfernt werden können (wodurch die Häufigkeit
der gebundenen Nukleinsäuremoleküle in der
Bibliothek reduziert wird). Es wurde entdeckt, dass mittels der
Verfahren der Erfindung normalisierte Nukleinsäurebibliotheken, deren maximale
Variation der Häufigkeit
der Nukleinsäuremolekülelemente
nicht größer als
ungefähr 2-
bis ungefähr
10-fach ist, hergestellt werden können. Darüber hinaus stellen die Verfahren
der Erfindung normalisierte Bibliotheken bereit, die einen wesentlich
reduzierten Background aufweisen. Somit stellt die Erfindung Verfahren
zur Herstellung von Nukleinsäurebibliotheken,
insbesondere von cDNA-Bibliotheken, bereit, deren jedes Nukleinsäuremolekülelement
unabhängig
von seiner Anzahl an Kopien in der ursprünglichen Bibliothek mit annähernd gleicher
Wahrscheinlichkeit isoliert werden kann.
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Quellen von
Nukleinsäurebibliotheken
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Unter
Verwendung der Verfahren der Erfindung können aus einer Vielzahl von
Nukleinsäurebibliotheken
normalisierte Nukleinsäurebibliotheken,
insbesondere normalisierte cDNA-Bibliotheken, hergestellt werden.
Solche zu normalisierende Bibliotheken können unter Verwendung von standardmäßigen Techniken
hergestellt werden oder im Handel erhältlich sein (Life Technologies,
Inc., Rockville, MD). Bei der vorliegenden Erfindung verwendbare
Nukleinsäurebibliotheken
schließen
jene Bibliotheken ein, die Populationen von einzelsträngigen oder
doppelsträngigen
Nukleinsäuremolekülen oder
bevorzugt Populationen von einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNA-Molekülen umfassen.
Bevorzugtere, erfindungsgemäß zu normalisierende Nukleinsäurebibliotheken
schließen
jene ein, die komplementäre
DNA(cDNA)-Bibliotheken umfassen. Solche cDNA-Bibliotheken (doppelsträngig oder
einzelsträngig)
können
unter Verwendung gut bekannter Techniken, die Messenger-RNA oder PolyA+ RNA
verwenden, hergestellt werden oder im Handel beispielsweise von
Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland) erworben werden, oder
weitere, kommerzielle, dem Durchschnittsfachmann vertraute Quellen
sein. Erfindungsgemäß verwendete
cDNA-Bibliotheken werden bevorzugt mit reverser Transkriptase mit
im Wesentlichen reduzierter RNase H-Aktivität (siehe unten) hergestellt.
Bei der Konstruktion von Bibliotheken werden die pCMVSPORT-Vektoren
bevorzugt und cDNA-Bibliotheken von Life Technologies, Inc. (Rockville,
MD) befinden sich in diesen Vektoren. Gemäß einem bevorzugten Aspekt
der Erfindung können
die Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek
in einem oder mehreren Vektoren wie etwa Plasmiden, Cosmiden oder
Phagen, enthalten sein.
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Die
Nukleinsäurebibliotheken
können
erfindungsgemäß aus Populationen
von aus natürlichen
Quellen gewonnenen Nukleinsäuremolekülen, wie
etwa einer Vielzahl von Zellen, Geweben, Organen oder Organismen,
hergestellt werden. Als Quellen für Nukleinsäuremoleküle verwendbare Zellen können prokaryotische (bakterielle
Zellen, einschließlich
jener der Gattungsarten Escherichia, Bacillus, Serratia, Salmonella,
Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Chlamydia, Neisseria,
Treponema, Mycoplasma, Borrelia, Legionella, Pseudomonas, Mycobacterium,
Helicobacter, Erwinia, Agrobacterium, Rhizobium und Streptomyces)
oder eukaryotische Zellen (einschließlich Pilzen, insbesondere
Hefen), Zellen von Pflanzen, Einzellern und weiteren Parasiten und
Tieren, einschließlich
Insekten (insbesondere Zellen von Drosophila spp.), Fadenwürmern (insbesondere
Zellen des Caenorhabditis elegans) und Säugetieren (insbesondere humane
Zellen) stammen.
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Somatische
Säugetierzellen,
die als Quellen von Populationen oder Bibliotheken von Nukleinsäuren verwendet
werden können,
schließen
Blutkörperchen
(Retikulozyten und Leukozyten), Endothelzellen, Epithelzellen, neuronale
Zellen (aus dem zentralen oder peripheren Nervensystem), Muskelzellen
(einschließlich Myozyten
und Myoblasten aus Skelett- und Herzmuskeln und glatten Muskeln),
Bindegewebszellen (einschließlich
Fibroblasten, Adipozyten, Chondrozyten, Chondroblasten, Osteozyten
und Osteoblasten) und weiteren Stromazellen (z.B. Makrophagen, dentritische
Zellen, Schwannsche Zellen) ein. Keimzellen von Säugetieren
(Spermatozyten oder Oozyten) können
ebenfalls als Quellen für
erfindungsgemäß verwendbare
Nukleinsäuren
oder Bibliotheken verwendet werden, wie auch Progenitor-, Vorläufer- und Stammzellen,
aus denen die oben genannten somatischen Zellen und Keimzellen hervorgehen.
Für die
Verwendung als Nukleinsäurequellen
ebenfalls geeignet sind Gewebe oder Organe von Säugetieren, sowohl jene, die
aus Quellen aus Gehirn, Nieren, Leber, Bauchspeicheldrüse, Blut,
Knochenmark, Muskeln, Nerven, Hauturogenitalen stammen oder aus
zirkulatorischen, lymphartigen, gastrointestinalen und Bindegewebsquellen,
als auch jene, die aus einem Embryo oder Fötus von Säugetieren (einschließlich Mensch)
stammen.
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Alle
oben genannten prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, Gewebe
oder Organe können
normal, erkrankt, transformiert, etabliert, Progenitoren, Vorläufer, fötal oder
embryonal sein. Erkrankte Zellen können beispielsweise jene einschließen, die
in Infektionskrankheiten (durch Bakterien, Pilze oder Hefe, Viren (einschließlich HIV)
oder Parasiten hervorgerufen), genetischen oder biochemischen Pathologien
(z.B. zystische Fibrose, Hämophilie,
Morbus Alzheimer, Muskeldystrophie oder Multiple Sklerose) oder
in krebsartigen Prozessen involviert sind. Transformierte oder etablierte
Tierzelllinien können
beispielsweise COS-Zellen, CHO-Zellen, VERO-Zellen, BHK-Zellen, HeLa-Zellen, HepG2-Zellen,
K562-Zellen, F9-Zellen und dergleichen einschließen. Dem Durchschnittsfachmann
werden weitere Zellen, Zelllinien, Gewebe, Organe und Organismen,
die als Quellen von Nukleinsäuren
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, ersichtlich
sein. Diese Zellen, Gewebe, Organe und Organismen können aus
ihren natürlichen
Quellen stammen oder im Handel von Quellen wie etwa American Type
Culture Collection (Rockville, Maryland) und weiteren, dem Fachmann
bekannten Quellen erhältlich
sein.
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Nach
Erhalt der Ausgangszellen, -gewebe, -organe und weiterer Ausgangsproben
können
Nukleinsäuremoleküle (wie
etwa mRNA oder PolyA+ RNA) isoliert werden und davon ausgehend können Nukleinsäurebibliotheken
(wie etwa cDNA-Bibliotheken)
mittels im Stand der Technik gut bekannter Verfahren hergestellt werden
(Siehe, z.B., Maniatis, T., et al., Cell 15: 687–701 (1978); Okayama, H., und
Berg, P., Mol. Cell. Biol. 2: 161–170 (1982); Gubler, U., und
Hoffman, B.J., Gene 25: 263–269
(1983)). Wie oben angemerkt, enthalten auf diese Art und Weise hergestellte
Nukleinsäurebibliotheken
abhängig
von der Zell-, Gewebs- oder Organismusquelle und dem Entwicklungsstadium
oder dem Zellzyklus der Quelle üblicherweise
einen breiten Bereich von Häufigkeiten
der Nukleinsäuremolekülelemente.
Dann können
die Verfahren der Erfindung zwecks Normalisierung oder Schmälerung oder
Reduktion der relativen Häufigkeiten
von Nukleinsäuremolekülen in der
Nukleinsäurebibliothek
verwendet werden.
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Herstellung
von normalisierten Nukleinsäurebibliotheken
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Bei
der praktischen Umsetzung der Erfindung werden Nukleinsäurebibliotheken
normalisiert, um durch Verfahren, die einen oder mehr als einen
Schritt umfassen können,
normalisierte Nukleinsäurebibliotheken
herzustellen. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung kann
beispielsweise folgendes umfassen:
- (a) Synthetisieren
von einem oder mehr als einem Nukleinsäuremolekül, die zu allen oder einem
Teil der Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek
komplementär
sind, wobei die synthetisierten Nukleinsäuremoleküle zumindest ein Hapten umfassen,
wodurch haptenylierte Nukleinsäuremoleküle hergestellt
werden (z.B. Driver).
- (b) Inkubieren einer Nukleinsäurebibliothek, um durch die
haptenylierten Nukleinsäuremoleküle unter
Bedingungen, die die Hybridisierung der zahlreicheren Moleküle in der
Bibliothek mit den haptenylierten Nukleinsäuremolekülen begünstigen, normalisiert zu werden;
und
- (c) Entfernen der hybridisierten Moleküle, wodurch eine normalisierte
Bibliothek hergestellt wird.
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Haptenylierte,
zu allen oder einem Teil der Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek komplementäre Nukleinsäuremoleküle können erfindungsgemäß beispielsweise
durch Inkubieren der Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek
mit zumindest einem Polypeptid mit Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität und mit
zumindest einem, zumindest ein Hapten umfassenden Nukleotid hergestellt
werden. Wenn ein oder mehr als ein Primer für die Synthese verwendet werden,
können
die Primer zwecks Herstellung der haptenylierten Nukleinsäuremoleküle ein oder
mehr als ein Hapten umfassen (ohne oder mit der Verwendung haptenylierter
Nukleotide während
der Synthese). Gemäß diesem
Aspekt der Erfindung verwendbare, bevorzugte Polypeptide mit Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität schließen jene
ein, die reverse Transkriptase-Aktivität aufweisen, und jene, die
DNA-Polymerase- oder RNA-Polymerase-Aktivität aufweisen.
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Bevorzugte
Polypeptide mit reverser Transkriptase-Aktivität (d. h. jene Polypeptide,
die die Synthese eines DNA-Moleküls
von einem RNA-Templat katalysieren können) schließen Moloney's Murine Leukamia
Virus (M-MLV) Reverse Transkriptase, Rous Sarcoma Virus (RSV) Reverse
Transkriptase, Avian Myeloblastosis Virus (AMV) Reverse Transkriptase,
Rous associated Virus (RAV) Reverse Transkriptase, Myeloblastosis
associated Virus (MAV) Reverse Transkriptase, Humanes Immundefizienz
Virus (HIV) Reverse Transkriptase, retrovirale reverse Transkriptase,
Retrotransposon Reverse Transkriptase, Hepatitis B Reverse Transkriptase, Blumenkohl-Mosaik-Virus
Reverse Transkriptase und bakterielle reverse Transkriptase ein,
sind aber nicht darauf beschränkt.
Insbesondere bevorzugt sind jene Polypeptide mit reverser Transkriptase-Aktivität, deren RNase
H-Aktivität
(d. h. „RNASE
H–"-Polypeptide) ebenfalls
im Wesentlichen reduziert ist. Unter einem Polypeptid, das „im Wesentlichen
reduzierte RNASE H-Aktivität" aufweist, versteht
man, dass das Polypeptid weniger als ungefähr 20 %, bevorzugter weniger
als ungefähr
15 %, 10 % oder 5 % und am bevorzugtesten weniger als ungefähr 2 % der
RNASE H-Aktivität
eines Wildtyp- oder RNASE H+-Enzyms wie
etwa Wildtyp-M-MuLV
Reverse Transkriptase aufweist. Die RNASE H-Aktivität kann durch
eine Vielzahl von Assays bestimmt werden, wie jene, die beispielsweise
im U.S. Patent Nr. 5,244,797, in Kotewicz, M.L., et al., Nucl. Acids Res.
16: 265 (1988) und in Gerard, G.F., et al., FOCUS 14 (5): 91 (1992),
deren aller Offenbarungen durch Bezugnahme hierin vollständig inkorporiert
sind, beschrieben werden. Für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete RNASE H–-Polypeptide
schließen
M-MLV H– Reverse
Transkriptase, RSV H– Reverse Transkriptase,
AMV H– Reverse
Transkriptase, RAV H– Reverse Transkriptase,
MAV H– Reverse
Transkriptase, HIV H– Reverse Transkriptase
und SUPERSCRIPTTM I Reverse Transkriptase
und SUPERSCRIPTTM II Reverse Transkriptase,
die im Handel beispielsweise von Life Technologies, Inc. (Rockville,
Maryland) erhältlich sind,
ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Weitere,
für die
Verwendung in den vorliegenden Verfahren geeignete Polypeptide mit
Nukleinsäure-Polymerase-Aktivität schließen DNA-Polymerasen,
wie etwa DNA-Polymerase
I, DNA-Polymerase III, Klenow-Fragment, T7-Polymerase und T5-Polymerase, und wärmebeständige DNA-Polymerasen
einschließlich, aber
nicht darauf beschränkt,
Thermus thermophilus (Tth) DNA-Polymerase, Thermus aquaticus (Taq) DNA-Polymerase,
Thermotoga neopolitana (Tne) DNA-Polymerase, Thermotoga maritima
(Tma) DNA-Polymerase, Thermococcus litoralis (Tli oder VENT®)
DNA-Polymerase, Pyrococcus furiosus (Pfu oder DEEPVENT®) DNA-Polymerase, Pyrococcus
woosii (Pwo) DNA-Polymerase, Bacillus sterothermophilus (Bst) DNA-Polymerase,
Sulfolobus acidocaldarius (Sac) DNA-Polymerase, Thermoplasma acidophilum
(Tac) DNA-Polymerase, Thermus flavus (Tfl/Tub) DNA-Polymerase, Thermus
ruber (Tru) DNA-Polymerase, Thermus brockianus (DYNAZYME®)
DNA-Polymerase, Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth) DNA-Polymerase,
und Mutanten, Varianten und Derivate davon ein.
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Bei
der erfindungsgemäßen Verwendung
bevorzugte RNA-Polymerasen können
SP6 RNA-Polymerase, T7 RNA-Polymerase, T3 RNA-Polymerase und dergleichen
einschließen.
Bei der Verwendung von RNA-Polymerasen werden üblicherweise ein oder mehr
als ein Promotor (z.B. SP6-Promotor, T7-Promotor, etc.) verwendet.
Beispielsweise werden doppelsträngige
DNA-Moleküle
(oder doppelsträngige
Bibliothek), die einen oder mehr als einen Promotor enthalten, in
Kombination mit einer oder mehr als einer RNA-Polymerase verwendet,
um haptenylierte, zu der gesamten oder Teilen des doppelsträngigen Bibliothekstemplats
komplementäre
RNA-Moleküle
herzustellen. Bevorzugt sind solche RNA-Moleküle im Vergleich zu den Templaten
in großem
molarem Überschuss
vorhanden. Solche Promotoren können
erfindungsgemäß von dem
Vektor, in dem die Bibliotheksmoleküle kloniert werden, oder von
den den Bibliotheksmolekülen
hinzugefügten
Adaptormolekülen
(z.B. doppelsträngige
Oligonukleotide) bereitgestellt werden. Bei Verwendung solcher Adaptormoleküle werden
den Bibliotheksmolekülen
die Adaptoren (die bevorzugt einen oder mehr als einen Promotor
umfassen) hinzugefügt.
Bevorzugt sind die Bibliotheksmoleküle doppelsträngige, lineare
Moleküle
(z.B. doppelsträngige,
lineare, nach erster und zweiter Synthese hergestellte cDNA) und die
Adaptoren können
unter Verwendung von standardmäßigen Techniken
(z.B. Ligase) einem oder beiden Enden solcher Moleküle hinzugefügt werden.
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Bei
der Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugte Nukleotide
schließen
Ribonukleosidtriphosphate wie etwa ATP, UTP, CTP, GTP und Derivate
davon und Desoxyribonukleosidtriphosphate wie etwa dATP, dCTP, dITP,
dUTP, dGTP, dTTP oder Derivate davon ein, sind aber nicht darauf
beschränkt.
Solche Derivate schließen
[αS] dATP,
7-Deaza-dGTP und 7-Deaza-dATP oder die entsprechenden Ribonukleosidtriphosphate
ein, in denen Desoxyribose durch Ribose ersetzt wurde. Die Nukleotide
oder Derivate davon umfassen erfindungsgemäß bevorzugt ein oder mehr als
ein kovalent an diese gebundenes Haptenmolekül.
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Bei
der Verwendung bei diesen Verfahren bevorzugte Haptenmoleküle schließen ohne
Einschränkung folgendes
ein: (i) Biotin; (ii) einen Antikörper; (iii) ein Enzym; (iv)
Lipopolysaccharid; (v) Apotransferrin; (vi) Ferrotransferrin; (vii)
Insulin; (viii) Zytokine (Wachstumsfaktoren, Interleukine oder koloniestimulierende
Faktoren); (ix) gp-120; (x) β-Aktin;
(xi) LFA-1; (xii) Mac-1; (xiii) Glycophorin; (xiv) Laminin; (xv)
Kollagen; (xvi) Fibronektin; (xvii) Vitronektin; (xviii) Integrine αvβ1 und αvβ3;
(xix) Integrine α3β1, α4β1, α4β7, α5β1, αvβ1, αTTbβ3, αvβ3 und αvβ6; (xx) Integrine α1β1, α2β1, α3β1,
und αvβ3; (xxi) Integrine α1β1, α2β1, α3β1, α6β1, α7β1 und α6β5;
(xxii) Ankyrin; (xxiii) C3bi, Fibrinogen oder Faktor X; (xxiv) ICAM-1
oder ICAM-2; (xxv) Spektrin oder Fodrin; (xxvi) CD4; (xxvii) einen
Cytokin-Rezeptor (z.B. Wachstumsfaktor, Interleukin oder koloniestimulierender
Faktor); (xxviii) einen Insulin-Rezeptor; (xxix) einen Transferrin-Rezeptor; (xxx) Fe3+; (xxxi) Polymyxin B oder Endotoxin-neutralisierendes
Protein (ENP); (xxxii) ein enzymspezifisches Substrat; (xxxiii)
Protein A, Protein G, einen Zelloberflächen-Fc-Rezeptor oder ein antikörperspezifisches
Antigen; (xxxiv) Avidin und Streptavidin; und Kombinationen davon.
Ein bei der Verwendung in den Verfahren der Erfindung besonders
bevorzugtes Hapten ist Biotin. Unter Verwendung herkömmlicher,
organischer, dem Durchschnittsfachmann vertrauter Syntheseverfahren
können die
haptenylierten Nukleinsäuremoleküle, worin
ein oder mehr als ein Haptenmolekül an ein oder mehr als ein Nukleotid
der Nukleinsäuremoleküle gebunden
(bevorzugt kovalent) ist/sind, hergestellt werden. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise
an dem 5'-Ende biotinyliert
werden, indem zuerst 5'-Amino-(NH2)-Gruppen produziert werden und dann Cab-NHS-Ester
hinzugefügt
wird (Langer, P.R., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 78: 6 633
(1981)). Gemäß einem
besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein haptenyliertes
Nukleinsäuremolekül hergestellt,
das ein RNA-Molekül
oder ein DNA-Molekül
sein kann und ein oder mehr als ein, zwei oder mehr als zwei, drei
oder mehr als drei oder vier oder mehr als vier Haptenmoleküle, am bevorzugtesten
Biotinmoleküle,
umfasst.
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Nachdem
die haptenylierten, zu den Nukleinsäuremolekülen der Bibliothek komplementären Nukleinsäuremoleküle hergestellt
wurden, werden sie zur Normalisierung der Nukleinsäurebibliothek
durch Hybridisierung verwendet. Im Speziellen wird die zu normalisierende
Nukleinsäurebibliothek
bevorzugt mit einem molaren Überschuss
der Population von haptenylierten Nukleinsäuremolekülen (z.B. größer oder
gleich dem 10-fachen oder bevorzugt größer als oder gleich dem 20-fachen molaren Überschuss)
inkubiert, wie oben beschrieben unter Bedingungen, welche die schnellere
Hybridisierung der haptenylierten Nukleinsäuremoleküle zu den zahlreicheren Nukleinsäuremolekülen und
die langsamere Hybridisierung zu den weniger zahlreichen, in der Bibliothek
vorhandenen Nukleinsäuremoleküle begünstigen,
hergestellt. Solche, die Hybridisierung begünstigenden Bedingungen können beispielweise
das Inkubieren der Bibliothek zwecks Normalisierung mit den haptenylierten
Nukleinsäuremolekülen bei
einem Bereich von Cot-Werten umfassen. Der Cot-Wert ist das Produkt der
Ausgangskonzentration an Nukleinsäure (Mol Nukleotide pro Liter,
Co) und Zeit (Sekunden, t). Der Cot-Wert ergibt sich aus dem Konvertieren
der Konzentration der reagierenden Nukleotide und der Zeit der Hybridisierung
in Standardeinheiten (Mol·Sekunde·L–1 oder
M·Sekunde).
Wie unten in den Beispielen im Detail beschrieben, schließen die
bei der Verwendung in den vorliegenden Verfahren besonders bevorzugten Cot-Werte,
ohne darauf beschränkt
zu sein, ein: einen Cot-Wert gleich oder größer 25; einen Cot-Wert gleich oder
größer 50;
einen Cot-Wert gleich oder größer 100,
einen Cot-Wert gleich oder größer 200;
einen Cot-Wert gleich oder größer 250;
einen Cot-Wert gleich oder größer 500;
einen Cot-Wert gleich oder kleiner 1 000; und einen Cot-Wert kleiner
als ungefähr
10 000. Alternativ können
Hybridisierungsbedingungen verwendet werden, die aus einem Bereich
an Cot-Werten bestehen, der einen Cot-Wert von ungefähr 10 bis
ungefähr
10 000; einen Cot-Wert von ungefähr
25 bis ungefähr
10 000; einen Cot-Wert von ungefähr
50 bis ungefähr
10 000; einen Cot-Wert von ungefähr
100 bis ungefähr
10 000; einen Cot-Wert von ungefähr
200 bis ungefähr
10 000; einen Cot-Wert von ungefähr
250 bis ungefähr
10 000; und einen Cot-Wert von ungefähr 500 bis ungefähr 10 000
einschließt.
Dem Durchschnittsfachmann sind weitere, für die Verwendung in den vorliegenden
Verfahren geeignete Hybridisierungsbedingungen ersichtlich und können lediglich
mit routinemäßigen Versuchen
bestimmt werden.
-
Unter
diesen Bedingungen hybridisieren die haptenylierten Nukleinsäuremoleküle schneller
an die zahlreicheren, in der Bibliothek vorhandenen Nukleinsäuremoleküle und langsamer
an die weniger zahlreichen Elemente. Die zwischen der Bibliothek
und den haptenylierten Nukleinsäuremolekülen gebildeten
Hybridisierungskomplexe können
dann mittels einer Vielzahl von Verfahren entfernt werden, was in
der Reduktion der Anzahl an Kopien der zahlreicheren Nukleinsäuremoleküle in der
Bibliothek resultiert und wodurch somit eine normalisierte Nukleinsäurebibliothek
hergestellt wird.
-
Das
Entfernen der Komplexe durch Ligand-Hapten-Wechselwirkungen wird
erfindungsgemäß unter Verwendung
eines Liganden, der im Speziellen an das an die haptenylierten Nukleinsäuremoleküle gebundene
Hapten bindet, ausgeführt.
Bei einem bevorzugten Verfahren kann der Ligand bevorzugt kovalent
an einen festen Träger,
wie etwa Nitrozellulose, Diazozellulose, Glas, Polystyrol (einschließlich Mikrotiterplatten),
Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Sepharose,
Agar, Stärke,
Nylon oder Kügelchen,
bei denen es sich um Latexkügelchen,
magnetische Kügelchen,
paramagnetische Kügelchen,
superparamagnetische Kügelchen
oder Glaskügelchen
handeln kann, gebunden werden. Insbesondere bevorzugte feste Träger sind die
magnetischen Kügelchen,
paramagnetischen Kügelchen
und superparamagnetischen Kügelchen,
die im Handel beispielsweise von Life Technologies, Inc. (Rockville,
MD), Dynal A.S. (Oslo, Norwegen) oder Sigma (St. Louis, Missouri)
erhältlich
sind.
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An
diese festen Träger
kann jeder beliebige Ligand, der an das zwecks Haptenylieren der
Nukleinsäuremoleküle verwendete
Hapten binden kann, gebunden sein. Beispiele für bei der Verwendung in den
vorliegenden Verfahren geeignete Liganden (die der Ordnung nach
der oben angeführten
Haptenmoleküle
entsprechen) schließen
ohne Einschränkung
ein: (i) Avidin und Streptavidin; (ii) Protein A, Protein G, einen
Zelloberflächen-Fc-Rezeptor
oder ein Antikörperspezifisches
Antigen; (iii) ein enzymspezifisches Substrat; (iv) Polymyxin B
oder Endotoxin-neutralisierendes Protein (ENP); (v) Fe3+;
(vi) einen Transferrin-Rezeptor;
(vii) einen Insulin-Rezeptor; (viii) einen Zytokinrezeptor (z.B.
Wachstumsfaktor, Interleukin oder koloniestimulierender Faktor);
(ix) CD4; (x) Spektrin oder Fodrin; (xi) ICAM-1 oder ICAM-2; (xii)
C3bi, Fibrinogen oder Faktor X; (xiii) Ankyrin; (xiv) Integrine α1β1, α2β1, α3β1, α6β1, α7β1 und α6β5;
(xv) Integrine α1β1, α2β1, α3β1, und αvβ3; (xvi) Integrine α3β1, α4β1, α4β7, α5β1, αvβ1, απbβ3, αvβ3,
und αvβ6; (xvii) Integrine αvβ1,
und αvβ3,; (xviii) Vitronektin; (xix) Fibronektin;
(xx) Kollagen; (xxi) Laminin; (xxii) Glycophorin; (xxiii) Mac-1;
(xxiv) LFA-1; (xxv) β-Aktin;
(xxvi) gp-120; (xxvii) Zytokine (Wachstumsfaktoren, Interleukine
oder koloniestimulierende Faktoren); (xxviii) Insulin; (xxix) Ferrotransferrin;
(xxx) Apotransferrin; (xxxi) Lipopolysaccharid; (xxxii) ein Enzym;
(xxxiii) einen Antikörper;
(xxxiv) Biotin; und Kombinationen davon. Bevorzugte Liganden schließen Avidin
und Streptavidin ein. Selbstverständlich hängt die Wahl des Liganden von
der Wahl des zur Herstellung der haptenylierten Nukleinsäuremoleküle verwendeten
Haptens ab; dem Durchschnittsfachmann sind somit für die Verwendung
in den Verfahren der Erfindung geeignete Liganden ersichtlich. Die
Bindung des/der Ligandenmoleküls/Ligandenmoleküle an den
festen Träger
kann durch jedes beliebige, dem Durchschnittsfachmann bekannte Verfahren
zur Ligandenbindung wie etwa kovalente, hydrophobe oder ionische
Bindung (einschließlich
Beschichten) ausgeführt
werden. Beispielsweise kann gemäß einem
Aspekt der Erfindung, bei dem die haptenylierten Nukleinsäuremoleküle Biotin
umfassen, ein Biotin-bindender Ligand wie etwa Avidin oder Streptavidin
an den festen Träger
gebunden sein. Gemäß einem
solchen, besonders bevorzugten Aspekt werden an Avidin oder Streptavidin gebundene,
magnetische, paramagnetische oder superparamagnetische Kügelchen
als feste Träger
verwendet.
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Üblicherweise
schließen
die die Ligand-Hapten-Wechselwirkungen begünstigenden Bedingungen das Inkubieren
in einer gepufferten Salzlösung,
bevorzugt eine TRIS-, Phosphat-, HEPES- oder Kohlenstoffgepufferte
Natriumchloridlösung,
bevorzugter eine TRIS-gepufferte Natriumchloridlösung, noch bevorzugter eine ungefähr 10–100 mM
TRIS-HCl und ungefähr
300–2000
mM NaCl umfassende Lösung
und am bevorzugtesten eine ungefähr
10 mM TRIS-HCl und ungefähr
1 M NaCl umfassende Lösung
bei einem pH von ungefähr 6–9, bevorzugter
bei einem pH von ungefähr
7–8, noch
bevorzugter bei einem pH von ungefähr 7,2–7,6 und am bevorzugtesten
bei einem pH von ungefähr
7,5 ein. Das Inkubieren wird bevorzugt bei 0 °C bis ungefähr 25 °C und am bevorzugtesten bei
ungefähr
25 °C für ungefähr 30–120 Minuten,
bevorzugt ungefähr
45–90
Minuten und am bevorzugtesten ungefähr 60 Minuten ausgeführt, um
das Binden der haptenylierten Nukleinsäuremoleküle (und somit der komplementären Bibliotheks-Nukleinsäuremoleküle, zu denen
sie hybridisiert werden) an den Ligandengebundenen festen Träger zu ermöglichen.
-
Nachdem
die haptenylierten Komplexe an den Festphasenträger gebunden wurden, kann die
normalisierte Nukleinsäurebibliothek,
die Nukleinsäuremoleküle bei niedrigerer
Häufigkeit
als die Eingabebibliothek umfasst, von den Überständen oder Eluaten (d. h. die
ungebundenen Materialien in Lösung)
gesammelt werden. Gemäß einem
bevorzugten Aspekt, bei dem die biotinylierten Nukleinsäuremoleküle an Avidin
oder Streptavidin oder an eine an Avidin oder Streptavidin gebundene
Festphase gebunden sind, können
beispielsweise die Nukleinsäuremoleküle, die
die normalisierte Nukleinsäurebibliothek
wie etwa eine normalisierte cDNA-Bibliothek umfassen, durch leichtes
Ansaugen und Sammeln der Überstände erhalten
werden. Gemäß einem besonders
bevorzugten Aspekt, bei dem an Avidin oder Streptavidin gebundene,
magnetische, paramagnetische oder superparamagnetische Kügelchen als
feste Träger
verwendet werden, können
die biotinylierte Nukleinsäureenthaltenden
Kügelchen
unter Verwendung eines Magnets (wie etwa eines Magna Sep Magnetpartikel
Separator; Life Technologies, Inc.) von den Überständen getrennt werden und die Überstände können mittels
Pipette entnommen werden. Das Entfernen der haptenylierten Komplexe
wird bevorzugt durch Extrahieren mit einem organischen Lösungsmittel
(z.B. Phenol, Chloroform, etc.) ausgeführt. Die oben beschriebenen
Ansätze
führen
zur Herstellung einer normalisierten Nukleinsäurebibliothek, die einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein und erfindungsgemäß oder mittels
in der Literatur gut bekannter Techniken (siehe z.B. Gubler, U.,
und Hoffman, B.J., Gene 25: 263–269
(1983); Krug, M.S., und Berger, S.L., Meth. Enzymol. 152: 316–325 (1987); Sambrook,
J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage.,
Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Seiten
8.60–8.63
(1987)) und weiterer, dem Durchschnittsfachmann vertrauter Techniken
umgehend verwendet, bis zur Verwendung gelagert oder verarbeitet
und weiter gereinigt werden kann.
-
Reduzieren
oder Eliminieren von Background
-
Die
Erfindung sieht ebenso Verfahren zur Herstellung einer selektierten,
normalisierten Nukleinsäurebibliothek
mit sehr niedrigem, nicht-rekombinanten und neu arrangiertem Klonierungs-Background
vor. Wie hierin verwendet, ist eine selektierte, normalisierte Bibliothek
eine Bibliothek, bei der ein oder als ein spezifisches Nukleinsäuremolekül oder Set
an Nukleinsäuremolekülen in der
normalisierten Bibliothek angereichert und weitere Nukleinsäuremoleküle von geringerem
Interesse durch einen der hierin beschriebenen Ansätze entfernt
wurden. Somit bezieht sich die Erfindung ferner auf das Entfernen
von kontaminierenden oder Background-Nukleinsäuremolekülen aus der normalisierten
Bibliothek. Ein solches Entfernen oder Eliminieren der kontaminierenden
Nukleinsäuren
kann erfindungsgemäß vor oder
nach der Normalisierung durchgeführt
werden. Übliche,
kontaminierende Nukleinsäuremoleküle in einer
Bibliothek sind Vektormoleküle,
die keine Nukleinsäuremoleküle der Bibliothek
enthalten (wobei der Vektor kein Insert erhalten konnte oder der
Vektor durch Deletion während
der Vermehrung der Quellenbibliothek den Insert verloren hat).
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Zielspezifische
Sonden (z.B. oligodA-NotI) können
erfindungsgemäß bei einer
Anzahl an Verfahren zur Reduktion oder Entfernung kontaminierender
Nukleinsäuren
aus der Bibliothek von Interesse verwendet werden. Solche Sonden
sind deshalb zielspezifisch, da sie Moleküle erkennen und Moleküle zu den
Bibliotheksmolekülen,
nicht aber zu kontaminierenden Nukleinsäuresequenzen hybridisieren
(wie etwa Vektoren ohne Bibliotheks-Inserts). Ein solches Mittel
impliziert die Verwendung von einer oder mehr als einer haptenylierten,
zielspezifischen Sonde zum Einfangen oder Isolieren der Bibliothek
von Interesse. Bei solchen Verfahren ist die normalisierte Bibliothek
bevorzugt einzelsträngig
(oder, falls doppelsträngig,
wird sie durch hierin beschriebene Verfahren einzelsträngig gemacht).
Durch Hybridisieren der haptenylierten Sonden zu der normalisierten
Bibliothek kann die hybridisierte, normalisierte Bibliothek unter
Verwendung von beispielsweise Hapten-Ligand-Wechselwirkungen oder Extraktion von
kontaminierenden Nukleinsäuren
ausselektiert werden. Die daraus hervorgehende, einzelsträngige, selektierte,
normalisierte Bibliothek wird dann durch Inkubieren der Bibliothek
mit einem oder mehr als einem Polypeptid mit Polymerase-Aktivität unter
ausreichenden Bedingungen, um die doppelsträngige, selektierte, normalisierte
Bibliothek zu synthetisieren, doppelsträngig gemacht.
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Alternativ
wird die normalisierte Bibliothek an einen zielspezifischen, haptenylierten
Primer hybridisiert und die Moleküle können dann durch Inkubieren
mit einem oder mehr als einem Polypeptid mit Polymerase-Aktivität unter
ausreichenden Bedingungen, um die doppelsträngige, normalisierte Bibliothek
zu synthetisieren, doppelsträngig
gemacht werden. Um solche Moleküle
doppelsträngig
zu machen, können
ein oder mehr nukleaseresistente Nukleotide verwendet werden. Die
doppelsträngigen
Moleküle
können
dann unter Verwendung von beispielsweise Hapten-Ligand-Wechselwirkungen
oder Extrahieren von den kontaminierenden Nukleinsäuremolekülen ausselektiert
werden.
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In
beiden Fällen
kann die daraus hervorgehende, doppelsträngige, selektierte, normalisierte
Bibliothek der Erfindung in einem weiteren Selektionsschritt in
ein oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden. Die einzelsträngigen Moleküle werden
erfindungsgemäß bei einer
sehr geringen Frequenz transformiert, während doppelsträngige Moleküle bei einer
sehr hohen Frequenz transformiert werden. Somit ermöglicht die Transformation
einem zusätzlichen
Selektionsschritt, bei dem einzelsträngige, kontaminierende Moleküle eliminiert
oder entfernt werden. Beispielsweise, wenn eine zielspezifische
Sonde oder ein zielspezifischer Primer in dem doppelsträngigen Syntheseschritt
verwendet wird, werden die nicht-spezifischen Nukleinsäuren nicht hybridisiert
und somit nicht doppelsträngig
gemacht und nicht in der selektierten, normalisierten Bibliothek
vorhanden sein.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird die einzelsträngige, selektierte, normalisierte
Bibliothek mit den haptenylierten Sonden mit Primern (bevorzugt
zielspezifischen Primer) und einem oder mehr als einem Nukleotid,
der/die den synthetisierten, doppelsträngigen Molekülen Nukleaseresistenz
verleiht/verleihen, doppelsträngig
gemacht. Der Verdau mit solch einer Nuklease ermöglicht das Entfernen einzelsträngiger Moleküle, die
nicht durch Primer doppelsträngig
gemacht wurden. Als ein zusätzlicher
Selektionsschritt können solch
doppelsträngige
Moleküle
dann in eine oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden.
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Gemäß noch einem
weiteren Aspekt kann die selektierte, normalisierte Bibliothek durch
Inkubieren der einzelsträngigen,
normalisierten Bibliothek mit einem oder mehrer als einem zielspezifischen,
nicht-haptenylierten Primer in Kombination mit einem oder mehr als
einem Nukleotid, der/die Nukleaseresistenz verleiht/verleihen, hergestellt
werden. Der Verdau der Mischung stellt die Selektion der erwünschten
Nukleinsäuremoleküle bereit
und wie in einem zusätzlichen
Selektionsschritt können
die daraus hervorgehenden, doppelsträngigen Moleküle in eine
oder mehr als eine Wirtszelle aufgenommen werden.
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Einzelsträngige Moleküle können erfindungsgemäß durch
Behandlung doppelsträngiger
Moleküle
unter ausreichenden Bedingungen, um sie einzelsträngig zu
machen, aus doppelsträngigen
Molekülen
hergestellt werden. Solche Bedingungen können beispielsweise den Abbau
eines Stranges der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle in der
Bibliothek wie etwa unter Verwendung einer Endonuklease, einer Exonuklease und
dergleichen und bevorzugt unter Verwendung von Gen II Protein und
Exonuklase III (erhältlich
von Life Technologies, Inc., Rockville, MD) einschließen. Alternativ
können
solche Bedingungen das Denaturieren der doppelsträngigen Moleküle durch
Wärme,
unter ionischen Bedingungen, pH (z.B. Base) und dergleichen einschließen.
-
Erfindungsgemäß verwendete
Nukleotide, die Nukleaseresistenz verleihen, sind bevorzugt Nukleotidanaloga.
Solche Nukleotidanaloga schließen
methylierte Nukleotide wie etwa 5-Methyldesoxycytosin, 3-Methyldesoxyadenosin,
7-Methylguanin und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Der
Fachmann kann weitere Nukleotidanaloga, die Exonukleasen oder Restriktions-Endonukleasen (Nukleasen)
hemmen oder blockieren, erkennen. Ebenso sind im Stand der Technik
erfindungsgemäß verwendete
Kombinationen aus Nukleotidanaloga und geeigneten Enzymen bekannt
(siehe Life Technologies 1997-1998
Catalog and Reference Guide, Kapitel 6).
-
Kits
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Die
vorliegende Erfindung sieht ebenso Kits zur Herstellung und Isolierung
normalisierter und selektierter, normalisierter Bibliotheken vor.
Diesem Aspekt der Erfindung entsprechende Kits umfassen ein Trägermittel,
wie etwa einen Schachtel, einen Karton, eine Röhre und dergleichen, in denen
ein oder mehr Behälter eingeschlossen
sind wie etwa Phiolen, Röhrchen,
Ampullen, Flaschen und dergleichen. Das erfindungsgemäße Kit kann
den Driver zur Normalisierung einer Bibliothek oder die zur Herstellung
des zur Normalisierung verwendeten Drivers benötigten Komponenten umfassen
(beispielsweise eine oder mehr als eine Polymerase, einen oder mehr
als einen, Promotoren umfassenden Adaptor, einen oder mehr als einen,
Promotoren umfassenden Vektor, ein oder mehr als ein haptenyliertes
Nukleotid und/oder einen oder mehr als einen haptenylierten Primer
oder eine oder mehr als eine haptenylierte Sonde). Solche Kits können eine
oder mehr als eine zielspezifische Sonde oder einen oder mehr als
einen zielspezifischen Primer (die haptenyliert sein können oder nicht).
Gemäß zusätzlichen
Aspekten kann das erfindungsgemäße Kit ein
oder mehr als ein Nukleotid (z.B. Nukleotide, die Nukleaseresistenz
verleihen, und/oder eine oder mehr als eine Endonuklease, Exonuklease oder
Restriktionsenzyme wie etwa Gen II Protein oder Exonuklease III
oder HhaI, die für
den Verdau der Nukleinsäuremoleküle verwendet
werden) umfassen.
-
Zusätzliche,
von der Erfindung vorgesehene Kits umfassen einen oder mehr als
einen Behälter,
die eine oder mehr als eine der zuvor beschriebenen, normalisierten
Nukleinsäurebibliotheken
oder selektierten, normalisierten Nukleinsäurebibliotheken der Erfindung
enthalten. Die Bibliotheken dieser erfindungsgemäßen Kits können einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein und sind bevorzugt cDNA-Bibliotheken.
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Die
von diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfassten Kits können ferner
ein oder mehr als ein zusätzliches
Reagenz (z.B. geeignete Puffer) und eine oder mehr als eine zusätzliche
Verbindung umfassen, die bei der Verwendung der normalisierten Bibliotheken
und der selektierten, normalisierten Bibliotheken der Erfindung
notwendig sind.
-
Verwendungen
-
Die
vorliegende Erfindung kann bei einer Vielzahl von Anwendungen, die
rasche Herstellung und Isolierung von normalisierten und selektierten,
normalisierten Nukleinsäurebibliotheken,
insbesondere cDNA-Bibliotheken, erfordern, verwendet werden. Die
vordergründige
Verwendung solcher Bibliotheken dient der Entdeckung von Genen und
der Herstellung von Gen-Datenbanken. Mittels der Verfahren der Erfindung
hergestellte Bibliotheken können
zwecks Amplifikationsreaktionen (wie etwa via PCR) als Quellen von
Templat-Nukleinsäuremolekülen verwendet
werden, um Nukleinsäuremoleküle mit niedriger
Kopienanzahl rasch zu identifizieren und/oder zu klonieren und um
mittels gentechnischer Methoden Polypeptide herzustellen.
-
Ebenso
richtet sich die Erfindung somit an Verfahren zur Amplifikation
eines Nukleinsäuremoleküls und auf
mittels dieser Verfahren amplifizierte Nukleinsäuremoleküle. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann
ein Nukleinsäuremolekül durch
Amplifizieren eines Nukleinsäuremoleküls (z.B.
ein cDNA-Molekül),
das in einer normalisierten Bibliothek oder einer selektierten,
normalisierten Bibliothek der Erfindung enthalten ist, gemäß jedes
beliebigen, im Stand der Technik bekannten Amplifikationsverfahrens
amplifiziert werden (d. h. zusätzliche
Kopien der hergestellten Nukleinsäuremoleküle). Gemäß diesem Aspekt der Erfindung
besonders bevorzugte Amplifikationsverfahren schließen PCR
(U.S. Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202), Strand Displacement
Amplification (SDA; U.S. Patent Nr. 5,455,166;
EP 0 684 315 ) und Nucleic Acid Sequence-Based Amplification
(NASBA, U.S. Patent Nr. 5,409,818;
EP
0 329 822 ) ein. Am bevorzugtesten sind jene Verfahren, die
eine oder mehr als eine PCR-Amplifikation umfassen.
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Die
Erfindung richtet sich ebenso an Verfahren, die zur Herstellung
von Vektoren, die normalisierte oder selektierte, normalisierte
Bibliotheken der vorliegenden Erfindung umfassen, an Wirtszellen,
die diese Vektoren umfassen, an Verfahren zur Herstellung eines
rekombinanten Polypeptids unter Verwendung dieser Vektoren und Wirtszellen
und an rekombinante, mittels dieser Verfahren hergestellte Polypeptide.
Gemäß diesem
Aspekt der Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid hergestellt
werden, indem eine beliebige der oben genannten, rekombinanten Wirtszellen
unter Bedingungen, die die Herstellung eines Polypeptids daraus und
die Isolierung des Polypeptids begünstigen, kultiviert wird. Verfahren
zur Kultivierung rekombinanter Wirtszellen und zur Herstellung und
Isolierung von Polypeptiden aus diesen sind dem Durchschnittsfachmann
gut bekannt.
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Vektoren
werden erfindungsgemäß unter
Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren durch
Insertion von einem oder mehr als einem der Nukleinsäuremoleküle von Interesse
in einen Vektor hergestellt. Der gemäß diesem Aspekt der Erfindung
verwendete Vektor kann beispielsweise ein Plasmid, ein Cosmid oder
eine Phage sein. Bevorzugt sind Vektoren, die cis-agierende Kontrollbereiche
für die
Nukleinsäure,
die das Polypeptid von Interesse codiert, umfassen. Geeignete trans-agierende
Faktoren können
von dem Wirt, von einem komplementierenden Vektor oder dem Vektor
selbst nach Einbringen in den Wirt bereitgestellt werden.
-
Bei
einigen bevorzugten Ausführungsformen
sind die Vektoren Expressionsvektoren, die spezifische Expression
der in den normalisierten Bibliotheken oder den selektierten, normalisierten
Bibliotheken der Erfindung enthaltenen Nukleinsäuremoleküle bereitstellen, wobei die
Vektoren induzierbar und/oder zelltypspezifisch sein können. Bei
solchen Vektoren sind insbesondere jene bevorzugt, die durch leicht
zu manipulierende Umweltfaktoren wie etwa Temperatur und Nahrungszusatzstoffe
induzierbar sind.
-
Bei
der vorliegenden Erfindung zweckmäßige Expressionsvektoren schließen chromosomale,
episomale und aus Viren gewonnene Vektoren ein, z.B. Vektoren, die
aus bakteriellen Plasmiden oder Bakteriophagen gewonnen werden,
und Vektoren, die aus Kombinationen davon wie etwa Cosmiden und
Phagemiden gewonnen werden, und schließen zwecks Kultivierung in
einer bakteriellen Wirtszelle bevorzugt zumindest einen selektierbaren
Marker wie etwa ein Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenzgen ein.
Vor der Insertion in solch einen Expressionsvektor können die
in den Bibliotheken der Erfindung enthaltenen Nukleinsäuremoleküle an einen
geeigneten Promotor, wie etwa der Lambda-Phage PL-Promotor oder
die E.coli lac, trp und tac-Promotoren, gebunden werden. Weitere
geeignete Promotoren sind dem Fachmann gut bekannt. Weitere, für die Verwendung
bei der vorliegenden Erfindung bevorzugte Vektoren schließen pQE70,
pQE60 und pQE-9, erhältlich von
Qiagen; pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren,
pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, erhältlich von Stratagene; pcDNA3
erhältlich
von Invitrogen; pGEX, pTrxfus, pTrc99a, pET-5, pET-9, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRITS, erhältlich
von Pharmacia; und pSPORT1, pSPORT2, pCMVSPORT 2.0 und pSVSPORT1,
erhältlich
von Life Technologies, Inc., ein. Weitere geeignete Vektoren sind
dem Fachmann leicht ersichtlich.
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Repräsentative,
erfindungsgemäß verwendbare
Wirtszellen schließen
bakterielle Zellen, Hefezellen, pflanzliche Zellen und tierische
Zellen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugte bakterielle
Wirtszellen schließen
Escherichia spp.-Zellen (insbesondere E.coli-Zellen und vor allem
E.coli-Stränge
DH10B und Stbl2), Bacillus spp.-Zellen (insbesondere B. subtilis-
und B. megaterium-Zellen), Streptomyces spp.-Zellen, Erwinia spp.-Zellen,
Klebsiella spp.-Zellen und Salmonella spp. (insbesondere S. typhimurium-Zellen)
ein. Bevorzugte tierische Wirtszellen schließen Insektenzellen (insbesonderst
Zellen von Spodoptera frugiperda Sf9 und Sf21 und Trichoplusa High
Five-Zellen) und Säugetierzellen
(insbesonderst CHO-, COS-, VERO-, BHK-Zellen und humane Zellen)
ein. Diese und weitere geeignete Wirtszellen sind im Handel erhältlich,
beispielsweise von Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland),
American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) und Invitrogen
(San Diego, Kalifornien).
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Beispiele
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Beispiel 1. Herstellung
von normalisierten cDNA-Bibliotheken aus direktional klonierten
cDNA-Bibliotheken
-
In
diesem Beispiel (1 und 2) wird
der Vorgang der Konstruktion einer normalisierten cDNA-Bibliothek
in dem pCMVSPORT 2.0-Vektor beschrieben (1 und 2).
Dieser Vorgang besteht aus i) Isolieren der Phagemid-DNA aus einer
direktional klonierten cDNA-Bibliothek, ii) Konvertieren der doppelsträngigen (ds),
ringförmigen
cDNA-Bibliotheks-DNA in a) ein lineares ds Templat zwecks RNA-Polymeraseherstellung
aus biotinyliertem Driver und b) einzelsträngige (ss), ringförmige DNA
unter Verwendung von Gen II und Exonuklease III, iii) Kombinieren
des Drivers und ringförmiger,
ss Bibliotheks-DNA mit zwei blockierenden Oligonukleotiden in einer
Subtraktionshybridisierung, iv) Reparieren der nicht-subtrahierten, ringförmigen ss-DNA und
v) Transformieren derselben in E.coli-Zellen, um somit eine erste,
normalisierte cDNA-Bibliothek herzustellen.
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Die
Herstellung von ringförmiger
ss-DNA aus ringförmiger
ds-cDNA-Bibliotheks-DNA
wird wie folgt ausgeführt:
Verdau von 10 μg
ringförmiger
ds-cDNA in 1X Gen II Puffer 20 mM Tris·HCl (pH = 8), 80 mM NaCl, 25
mM MgCl2, 2 mM β-Mercaptoethanol. 5 % Glycerol, 5 mg/ml
BSA mit 8 μl
Gen II bei 30 °C
40 Minuten lang in einem Endvolumen von 200 μl. Abschließen der Reaktion durch Inkubieren
bei 65 °C
für 5 Minuten.
Hinzufügen
von 12 μl
Exonuklease III und Inkubieren bei 37 °C für 30 Minuten. Hinzufügen von
8 μl (10
E/μl) NotI und
Inkubieren der Mischung für
1 Stunde bei 37 °C.
Hinzufügen
von 2 μl
Exonuklease III und weiteres Inkubieren für 1 Stunde bei 37 °C. Zweimalige
Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und Ethanolfällung. Resuspendieren
der ringförmigen
ss-cDNA in 10 μl
RNASE-freiem TE. Durch diesen Vorgang wurde die Bibliothek von cDNA
aus fötalem
Gehirn (Life Technologies, Inc. Rockville, MD) einzelsträngig gemacht.
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Die
Herstellung von linearisierter ds-cDNA aus ringförmiger ds-cDNA läuft wie
folgt ab:
Verdau von 50 μg
ringförmiger
ds-cDNA mit 200 Einheiten NotI (LTI) in 300 μl 1X Reaktionspuffer [5 mM Tris·HCl, pH
= 8,0; 1 mM MgCl2; 10 mM NaCl] für einen
Zeitraum von 3 Stunden bei 37 °C.
Hinzufügen
von 100 Einheiten NotI und Inkubieren für weitere 3 Stunden bei 37 °C. Zweimalige
Extraktion mit Phenol /Chloroform /Isoamylalkohol (25:24:1 v/v)
und Ethanolfällung.
Resuspendieren der linearisierten ds-cDNA in 30 μl RNASE-freiem TE-Puffer. Auf
diese Art und Weise wurde die Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn
(Life Technologies, Inc. Rockville, MD) linearisiert.
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Die
Herstellung von biotinylierter Driver-RNA aus ringförmiger ds-cDNA-Bibliotheks-DNA wird
in der folgenden Art und Weise ausgeführt. Herstellung einer Mischung
aus den folgenden Komponenten: 1,214 ml mit DEPC behandeltes Wasser,
400 μl 5X
Transkriptionspuffer [200 mM Tris-HCl (pH 7,9), 30 mM MgCl2, 10 mM Spermidin-(HCl)3],
200 μl rNTP-Mischung
(jeweils 10 μM
von ATP, GTP und UTP, 5 μM
CTP, 20 μM
Biotin-14-CTP), 16 μl
(20 μg)
linearisierte ds-cDNA aus einer Bibliothek von cDNA aus humanem,
fötalem
Gehirn (siehe oben), 100 μl
0,1 M DTT und 70 μl
SP6 RNA-Polymerase (350 Einheiten/μl). Die Bibliothek von cDNA aus
humanem, fötalem
Gehirn (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) wurde in einem pCMV·SPORT-Vektor konstruiert,
der zwecks Driver-RNA-Synthese einen CMV-Promotor, einen SP6- und einen T7-Polymerase-Promotor
enthält,
die die Multiple Cloning-Sites (MCS) flankieren. Mischen und Inkubieren
für 13
Stunden bei 37 °C.
Hinzufügen
von 1 ml 7,5 M Ammoniumacetat und 8 ml Ethanol. 30-minütiges Kühlen auf
trockenem Eis, Mikrozentrifugieren bei 4 °C für 25 Minuten und Resuspension
des Pellets in 1 ml TE. Erhitzen der Lösung auf 65 °C und erneutes
Ausfällen.
Waschen des Pellets in 70 %igem Ethanol, Trocknen und Resuspension
in 1,92 ml Wasser, 40 μl
1 M Tris-HCl [ph 7,5], zwecks Resuspension auf 65 °C erwärmen. Hinzufügen von
20 μl 1
M MgCl2, 20 μl DNaseI (2,660 Einheiten) zu
der resuspendierten RNA und Inkubieren für 1 Stunde bei 37 °C. Die behandelte
RNA auf ein frisches Röhrchen übertragen
und 40 μl
0,5 M EDTA hinzufügen,
Inkubieren für 10
Minuten bei 65 °C
und Ausfällen
mit 1 ml von 7,5 M Ammoniumacetat plus 8 ml Ethanol. Resuspension
des Pellets in 300 μl
TE, Erwärmen
auf 65 °C
zur Unterstützung
der Resuspension und Laden auf eine 1 cm × 18 cm Säule (Sephadex G-50) und Sammeln
des ersten durch UV-Absorbanz bei 260 nm detektierten Peaks. Ausfällen des
gesammelten Materials (~4 ml) mit 2 ml 7,5 M Ammoniumacetat und
16 ml Ethanol. Resuspension des Pellets in 120 μl TE, Waschen des Röhrchens
mit 20 μl
TE und Vereinen der beiden Proben. Durch diesen Vorgang wird der
bei der Normalisierung der Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn
verwendete, haptenylierte Driver der Bibliothek von cDNA aus humanem,
fötalem
Gehirn bereit gestellt.
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Die
Subtraktive Hybridisierung wird unter Verwendung des folgenden Vorgangs
ausgeführt.
Denaturierung einer Mischung aus den folgenden Komponenten für einen
Zeitraum von 1 Minute bei 80°C:
1 μg ringförmige, ss-cDNA-Bibliothek
(siehe oben), 0,5 μg
oligodA Oligonukleotid 5'(A)40 3'(oligodA),
3 μg SP6
SalI-Promotor Sense-Oligonukleotid 5'GAA GGT ACG CCT GCA GGT ACC GGT CCG
GAA TTC CCG GGT CGA CCC ACG 3' (SEQ
ID NO: 1) (SP6-SalI), 0,25 M NaCl in 22 μl von 1X Hybridisierungspuffer
[50 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA und 0,1% SDS]. Nach dem Denaturieren
erfolgt die Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
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Für den Cot-Wert
= 500 denaturieren 85 μg
der biotinylierten Driver-RNA (siehe oben) in 22 μl von 1X Hybridisierungspuffer
2 Minuten lang bei 90 °C,
werden auf Eis 1 Minute lang abgekühlt und 1 μl von 5 M NaCl wird hinzugefügt. Die
vorhybridisierte, ringförmige
ss-DNA wird zu der biotinylierten Driver-RNA übertragen und 24 Stunden lang
bei 42 °C
inkubiert. Für
die Bibliothek mit Cot-Wert = 5 werden 10,5 μg der Driver-RNA 2 Stunden lang
hybridisiert; für
die Bibliothek mit dem Cot-Wert = 50 werden 41 μg der Driver-RNA 5 Stunden lang
hybridisiert; für
die Bibliothek mit dem Cot-Wert = 0 wird keine Driver-RNA hinzugefügt und die
Mischung 24 Stunden lang inkubiert.
-
Nach
der Inkubation wird die Mischung auf ein frisches Röhrchen übertragen,
25 μg Streptavidin
werden hinzugefügt
und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert. Die Lösung wird
mit einer gleichen Menge von PCIA (Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol,
25:24:1) extrahiert. Die organische Phase wird mit 15 μl TE enthaltend
1 M NaCl rückextrahiert
und die wässrigen
Extraktionen vereint. Die Streptavidin-Bindung und PCIA-Extraktion
wird zwei Mal wiederholt. Die wässrige
Phase wird mit 0,3 M Natriumacetat und Ethanol ausgefällt. Das
Pellet wird in 15 μl
TE resuspendiert und 30 Minuten lang gegen TE dialysiert (10 mM
: 0,5 mM). Die DNA wird auf ein frisches Röhrchen übertragen und das Volumen gemessen.
Die daraus hervorgehende cDNA ist eine einzelsträngige, normalisierte cDNA-Bibliothek.
-
Die
Analyse der Klone nach erfolgter Subtraktion wird in der folgenden
Art und Weise ausgeführt. Wenn
die nach der Subtraktion verbleibende, ringförmige ss-cDNA unter Verwendung eines oligodA-NotI-Primers,
dNTPs und einer Reparaturpolymerase in ds-cDNA konvertiert und in
E.coli-Zellen transformiert wird, enthält ein großer Teil der Transformanten
Plasmide, die keine Inserts enthalten (Tabelle 1).
-
Tabelle
1. Rekombinante cDNA-Klone in Prozent und durchschnittliche Insert-Größe nach
der Subtraktion der Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn.
-
Nach
der Analyse der Klone, die keine Inserts enthalten, wurde festgestellt,
dass sie in der ursprünglichen
Bibliothek in einer Häufigkeit
von weniger als 1 % vorhanden waren, sie jedoch nach der Subtraktion angereichert
wurden, da sie keine entsprechenden Driver-Moleküle zur Subtraktion aufwiesen
(2). Um diese Form von Background zu entfernen,
wurden zwei Ansätze
entwickelt und in den Beispielen 2 und 3 beschrieben.
-
Beispiel 2. Entfernen
von Background einer normalisierten cDNA-Bibliothek unter Verwendung
der Selektion mit einer zielspezifischen, biotinylierten OligodA-NotI-Sonde
-
Als
ein Ergebnis des in Beispiel 1 beschriebenen Vorgangs besteht ein
Trend zu erhöhtem
Background, was direkt von dem Cot-Wert des Subtraktionsschrittes
abhängt
(Tabelle 1). Da ein Gesamtbibliotheksdriver verwendet wird, werden
Klone, die kein Gegenstück
in dem Driver enthalten, angereichert. Dies wurde in dem in Beispiel
1 beschriebenen Vorgang beobachtet (2). Zur
Lösung
dieses Problems wurden zwei Verfahren entwickelt und ein drittes
Verfahren zum praktischen Entfernen von Background wird beschrieben. In
dem ersten, in diesem Beispiel beschriebenen Fall wurde die Selektion
rekombinanter Klone unter Verwendung einer biotinylierten OligodA-NotI-Sonde
wie folgt verwendet (3).
-
Nach
erfolgter Subtraktion, Reparatur und Transformation waren 45 % der
von dem Cot-Wert = 500-Protokoll gewonnenen Klone rekombinant (Tabelle
1), bei Verwendung der Selektion der Sonde mit einem biotinylierten
OligodA-NotI-Primer ((5'(A)15GGG CGG CCG C 3') (SEQ ID NO: 2) allerdings wurden die
rekombinanten Klone von den nicht-rekombinanten Klonen getrennt,
was die Konstruktion einer normalisierten cDNA-Bibliothek ohne wesentliche Änderungen
der durchschnittlichen Insert-Größe und das
praktische Eliminieren nicht-rekombinanter Klone ermöglichte
(Tabelle 2).
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Tabelle
2. Rekombinante cDNA-Klone in Prozent und durchschnittliche Insert-Größe nach
vollständiger
Subtraktion der Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn
und GENETRAPPER
TM Selektion mit einer biotinylierten
OligodA-NotI-Sonde.
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Mehr
als 98 % der zufällig
ausgewählten
Klone enthalten Inserts, die im Durchschnitt so groß wie die nicht-normalisierte
cDNA-Bibliothek, aus der sie gewonnen wurden, sind. Zusätzlich zeigt
die PCR-Analyse von seltenen und häufigen TGF-β-Amplikonen, dass die wesentliche Normalisierung
ausgeführt
wurde (6). Es ist zu beachten, dass das TGF-β1 PCR-Produkt
in den nicht normalisierten Bibliotheken mit niedrigen Cot-Werten
nicht, in den Bibliotheken mit höheren
Cot-Werten sehr wohl detektierbar ist.
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Die
normalisierte, ringförmige
ss-cDNA aus Beispiel 1 wurde 1 Minute lang auf 70 °C erwärmt und
1 Minute lang auf Eis abgekühlt.
200 ng des biotinylierten OligodA-NotI-Primers (siehe oben) wurde 1 Stunde lang
bei 37 °C
hybridisiert. Die Hybridisierungsmischung wurde mit 80 μg magnetischer
Streptavidin-Kügelchen
inkubiert. Die Kügelchen
wurden drei Mal mit 100 μl
Waschpuffer markiert (10 mM Tris·HCl [pH 7,5], 1 mM EDTA).
Die Kügelchen
wurden in 20 μl
1X Elutionspuffer 10 mM Glycin resuspendiert und das Eluat wurde aufgefangen.
Der Elutionsschritt wurde mit 15 μl
1X Elutionspuffer wiederholt und die Eluate wurden vereint. Dieses
Protokoll wurde drei Mal wiederholt und die Eluate.
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Die
eingefangene, einzelsträngige
cDNA wurde wie folgt repariert: Herstellen eines Reparaturmischung
durch Kombinieren von 4 μl
10X Reparaturpuffer [100 mM Tris-HCl
(pH 8,8 bei 25 °C),
15 mM MgCl2, 500 mM KCl, 1 % Triton X-100],
1 μl 10
mM dNTP, 1 μl
Reparaturenzym Dynazyme (2 m/μl)
(Thermus brockianus von Finnzymes) und 34 μl Wasser. Diese Mischung wurde
vermischt und auf nassem Eis gelagert. Durch Hinzufügen der
folgenden Substanzen zu einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen wurde
eine DNA-Primer-Mischung hergestellt: 4 μl 10X Reparaturpuffer, 35 μl eingefangene
DNA aus dem vorhergehenden Schritt und 1 μl (50 ng) von nicht-biotinyliertem
OligodA-NotI-Primer. Die Primermischung wurde bei Raumtemperatur 2
Sekunden lang bei 14 000 × g
zentrifugiert und 1 Minute lang bei 95 °C inkubiert. Gleichzeitig wurde
die Reparaturmischung bei 70 °C
inkubiert. Die DNA-Primer-Mischung wurde in ein 70 °C-Bad übertragen
und 1 Minute lang inkubiert. 40 μl
vorgewärmte
Reparaturmischung wurden dem die DNA-Primer-Mischung enthaltenden Röhrchen hinzugefügt. Die
Inhalte wurden durch Pipettieren vermischt und die Mischung wurde
dann bei 70 °C
15 Minuten lang inkubiert, um die Primerextension zu ermöglichen
(Synthese der doppelsträngigen
cDNA). Die Röhrchen
wurden aus dem Wasserbad entfernt und bei Raumtemperatur 2 Sekunden
lang bei 14 000 × g
zentrifugiert. Durch Hinzufügen
von 1 μl
Glycogen, 41 μl
7,5 M Ammoniumacetat und 320 μl –20°C kaltem Ethanol
zu jedem Röhrchen
wurde die reparierte DNA ausgefällt.
Die Röhrchen
wurden verwirbelt und 10 Minuten lang in Eis platziert oder über Nacht
bei 4 °C
gelagert. Die Röhrchen
wurden dann 30 Minuten lang bei 4 °C bei 14 000 × g zentrifugiert.
Das Ethanol wurde vorsichtig aus dem kleinen Pellet entfernt und
mit 100 μl 70
%igem Ethanol (–20 °C) beschichtet.
Die Röhrchen
wurden 2 Minuten lang bei 4 °C
bei 14 000 × g
zentrifugiert und das gesamte Ethanol wurde entfernt und die Pellets
wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten lang oder so lange, bis sie
trocken waren, getrocknet. Die Pellets wurden in 10 μl TE-Puffer
aufgelöst
und bei 4 °C gelagert.
2 μl Aliquoten
der reparierten DNA wurden pro 20 μl Aliquoten kompetenter E.coli-Zellen
von DH10B ElectroMAX elektroporiert.
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Beispiel 3. Entfernen
von Background einer normalisierten cDNA-Bibliothek unter Verwendung
der OligodA-NotI-Reparatursynthese mit Nukleotidanaloga, die Nukleaseresistenz
verleihen.
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Wird
der Ansatz aus Beispiel 2 zum Entfernen von Background verwendet,
so erfordert die Konstruktion einer normalisierten cDNA-Bibliothek
mit mehr als 1 × 106 primären
Klonen wenigstens drei unabhängige Selektionen
und 15 Elektroporationen (Tabelle 3).
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Tabelle
3. Vergleich der zahlreichen Verfahren zum Entfernen von Background
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Zur
Lösung
dieses Problems wurde ein alternativer Ansatz zur Reduktion von
Background in normalisierten Bibliotheken entwickelt. Bei diesem,
als nukleaseresistente Reparatursynthese bezeichneten Verfahren
werden dieselben wie in Beispiel 2 beschriebenen Sonden verwendet,
OligodA-NotI, doch in diesem Fall ist die Sonde nicht biotinyliert
(5). Allerdings können die wie in Beispiel 2
verwendeten, biotinylierten Sonden verwendet werden, um den zusätzlichen
Selektionsschritt aus Beispiel 2 zu einzuschließen.
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Im
Vergleich zu dem Selektionsverfahren aus Beispiel 2, kann eine Bibliothek
konstruiert werden, die vier Mal komplexer ist und nur ein Drittel
an Elektroporationen erfordert (Tabelle 3). Zusätzlich wird der Bibliotheks-Background
praktisch eliminiert und die Insert-Größe der Bibliothek bleibt unverändert (Tabelle
4). Als schließlich
zahlreiche Gene mittels Koloniehybridisierung untersucht wurden,
war ihre Häufigkeit
um das 15- bis 18-fache vermindert (Tabelle 5) und die Häufigkeit
der seltenen Gene war wesentlich erhöht (6).
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Tabelle
4. Rekombinante cDNA-Klone in Prozent und durchschnittliche Insert-Größe nach
vollständiger
Subtraktion der Bibliothek von cDNA aus humanem, fötalem Gehirn
und Behandlung mit 5-Methylcytosin/HhaI.
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Tabelle
5. Analyse einer normalisierten cDNA-Bibliothek: Depletion der zahlreichen
cDNAs ist direkt abhängig direkt
von dem Ausmaß der
Subtraktion
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Die
durch Subtraktion erzeugte einzelsträngige, normalisierte cDNA-Bibliothek
(siehe Beispiel 1) wurde wie folgt repariert: Durch Kombinieren
von 3 μl
10X Reparaturpuffer [100 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25 °C), 15 mM
MgCl2, 500 mM KCl, 1 % Triton x-100], 1 μl 10 mM dNTP
(10 mM 5-Methyl-dCTP enthaltend), 1 μl Reparaturenzym Dynazyme (2
E/μl) (Thermus
brockianus von Finnzymes) und 25 μl
Wasser, Vermischen und Lagerung auf nassem Eis wurde eine Reparaturmischung
hergestellt. Durch Hinzufügen
der folgenden Substanzen zu einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen wurde
eine DNA-Primer-Mischung hergestellt: 11 μl autoklaviertes, destilliertes
Wasser, 3 μl
10X Reparaturpuffer, 15 Zellen dialysierte DNA aus dem vorhergehenden Schritt
und 1 μl
(50 ng) nicht-biotinylierte Oligo A-NotI. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur
2 Sekunden lang bei 14 000 × g
zentrifugiert. Die DNA-Primer-Mischung wurde 1 Minute lang bei 95 °C inkubiert.
Gleichzeitig wurde die Reparaturmischung bei 70 °C inkubiert. Die DNA-Primer-Mischung wurde in
ein 70 °C-Bad übertragen
und 1 Minute lang inkubiert. 30 μl
vorgewärmte
Reparaturmischung wurden dem die DNA-Primer-Mischung enthaltenden
Röhrchen
hinzugefügt.
Die Inhalte wurden durch Pipettieren vermischt und um die Primerextension
zu ermöglichen
15 Minuten bei 70 °C
lang inkubiert (Synthese der doppelsträngigen DNA). Die Röhrchen wurden
aus dem Wasserbad entfernt und bei Raumtemperatur 2 Sekunden lang
bei 14 000 × g zentrifugiert.
Durch Hinzufügen
von 1 μl
Glycogen, 32 μl
7,5 M Ammoniumacetat und 250 μl –20°C kaltem Ethanol
zu jedem Röhrchen
wurde die reparierte DNA ausgefällt.
Die Röhrchen
wurden verwirbelt und 10 Minuten lang in Eis platziert oder über Nacht
bei 4 °C
gelagert. Die Röhrchen
wurden dann bei 4 °C
30 Minuten lang bei 14 000 × g
zentrifugiert. Das Ethanol wurde vorsichtig aus dem kleinen Pellet
entfernt und mit 100 μl 70
%igem Ethanol (–20 °C) beschichtet.
Die Röhrchen
wurden dann bei 4 °C
2 Minuten lang bei 14 000 × g zentrifugiert.
Das gesamte Ethanol wurde entfernt und die Pellets wurden bei Raumtemperatur
10 Minuten lang oder so lange, bis sie trocken waren, getrocknet.
Die Pellets wurden in 10 μl
TE-Puffer aufgelöst
und bei 4 °C
gelagert. Mit 0,5 Einheiten HhaI in 20 μl 1X Puffer (5 mM TrisHCl, pH
8,0; 1 mM MgCl2; 5 mM NaCl) wurde die reparierte
DNA 30 Minuten lang bei 37 °C
verdaut. Die DNA war ausgefälltes
Ethanol und die getrockneten Pellets wurden in 8 μl TE resuspendiert.
2 μl Aliquoten
der reparierten DNA wurden pro 20 μl Aliquoten von kompetenten
E.coli-Zellen von DH10B ElectroMAX elektroporiert.
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