DE69837453T2

DE69837453T2 - Ein in vitro Sortierverfahren

Info

Publication number: DE69837453T2
Application number: DE69837453T
Authority: DE
Inventors: Andrew MRC Laborato Griffiths; Dan MRC Laborato Tawfik
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1997-07-07
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2018-06-30
Also published as: DE69826697T2; CY1111537T1; DE69841997D1; EP1482036A2; EP1496120A3; US7582446B2; JP4299255B2; JP4156009B2; PT1496120E; EP1801214B1; US20070077579A1; ATE278013T1; US20070259374A1; DE69826697D1; DK1801214T3; ES2294427T3; ES2402516T3; ATE358177T1; CA2295324A1; ATE374815T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für die Anwendung bei der in vitro-Entwicklung von Molekülbibliotheken. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Selektion von Nukleinsäuren, die Genprodukte codieren, wobei die Nukleinsäure und die Aktivität des codierten Genprodukts durch Abteilung miteinander verknüpft sind.
Evolution erfordert die Erzeugung von genetischer Vielfalt (Vielfalt in der Nukleinsäure), gefolgt von der Selektion solcher Nukleinsäuren, welche zu vorteilhaften Eigenschaften führen. Weil die Nukleinsäure und die Aktivität des codierten Genprodukts eines Organismus physisch miteinander verknüpft sind (die Nukleinsäuren sind innerhalb der Zellen, welche diese codieren, abgegrenzt), können mehrere Durchgänge von Mutation und Selektion zu dem fortschreitenden Überleben von Organismen mit zunehmender Tauglichkeit führen. Systeme für eine schnelle Evolution von Nukleinsäuren oder Proteinen in vitro müssen diesen Prozeß auf dem molekularen Niveau dahingehend nachahmen, daß die Nukleinsäure und die Aktivität des codierten Genprodukts miteinander verknüpft sind, und die Aktivität des Genprodukts muß selektierbar sein.
Jüngere Fortschritte in der Molekularbiologie haben es ermöglicht, daß einige Moleküle anhand ihrer Eigenschaften zusammen mit den Nukleinsäuren, welche diese codieren, gemeinsam selektiert werden. Die selektierten Nukleinsäuren können anschließend für eine weitere Analyse oder Verwendung kloniert oder zusätzlichen Runden der Mutation und Selektion unterzogen werden.
Diesen Verfahren ist die Etablierung großer Bibliotheken von Nukleinsäuren gemeinsam. Moleküle, welche die gewünschten Eigenschaften (Aktivität) besitzen, können durch Selektionsvorschriften isoliert werden, welche hinsichtlich der gewünschten Aktivität des codierten Genprodukts selektieren, wie z.B. hinsichtlich einer gewünschten biochemischen oder biologischen Aktivität, z.B. Bindungsaktivität.
Phagenpräsentations- bzw. Phage-Display-Technologie war sehr erfolgreich bei der Bereitstellung eines Vehikels, das die Selektion eines präsentierten Proteins durch Bereitstellung der wichtigen Verknüpfung zwischen Nukleinsäure und der Aktivität des codierten Genprodukts erlaubt (Smith, 1985: Bass et al., 1990; McCafferty et al., 1990; für eine Übersicht siehe Clackson und Wells, 1994). Partikel von filamentösem Phagen dienen als Verpackungen für genetische Präsentation mit Proteinen auf der Außenseite und den genetischen Elementen, welche diese auf der Innenseite codieren. Die enge Verknüpfung zwischen Nukleinsäure und der Aktivität des codierten Genprodukts ist ein Ergebnis der Zusammenfügung des Phagen in Bakterien. Da einzelne Bakterien selten mehrfach infiziert sind, werden in den meisten Fällen alle Phagen, die von einem einzelnen Bakterium produziert werden, das gleiche genetische Element tragen und das gleiche Protein präsentieren.
Jedoch beruht Phage-Display auf der Erzeugung von Nukleinsäurebibliotheken in vivo in Bakterien. Daher liegt die praktische Beschränkung der Bibliotheksgröße, die durch Phage-Display-Technologie möglich ist, in der Größenordnung von 10⁷ bis 10¹¹, auch wenn man den Vorteil von λ-Phagenvektoren mit ausschneidbaren Replikons von filamentösem Phagen nutzt. Die Technik wurde hauptsächlich auf die Selektion von Molekülen mit Bindungsaktivität angewendet. Eine geringe Anzahl von Proteinen mit katalytischer Aktivität wurde ebenfalls unter Verwendung dieser Technik isoliert, jedoch gab es in keinem Fall eine Selektion direkt hinsichtlich der gewünschten katalytischen Aktivität, sondern entweder hinsichtlich einer Bindung an ein Analoges eines Übergangszustands (Widersten und Mannervik, 1995) oder einer Reaktion mit einem Selbstmordhemmer (Soumillion et al., 1994; Janda et al., 1997).
Spezifische Peptidliganden wurden hinsichtlich Bindung an Rezeptoren durch Affinitätsselektion unter Verwendung großer Bibliotheken von Peptiden, die mit dem C-Terminus des lac-Repressors LacI verknüpft waren, selektiert (Cull et al., 1992). Wenn es in E. coli exprimiert wird, verknüpft das Repressorprotein physisch den Liganden mit dem codierenden Plasmid durch Bindung an eine lac-Operatorsequenz an dem Plasmid.
Es wurde auch ein vollständiges in vitro-Polysompräsentationssystem beschrieben (Mattheakis et al., 1994), in welchem entstehende Peptide physisch über das Ribosom an die RNA, welche diese codiert, angeheftet werden.
Jedoch ist der Umfang des oben genannten Systems auf die Selektion von Proteinen beschränkt und erlaubt darüber hinaus keine direkte Selektion hinsichtlich anderer Aktivitäten als Bindung, z.B. von katalytischer oder regulatorischer Aktivität.
In vitro-RNA-Selektion und -Evolution (Ellington und Szostak, 1990), was manchmal als SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) bezeichnet wird (Tuerk und Gold, 1990), erlauben eine Selektion hinsichtlich sowohl Bindung als auch chemischer Aktivität, aber nur für Nukleinsäuren. Wenn Selektion hinsichtlich Bindung durchgeführt wird, wird ein Pool von Nukleinsäuren mit immobilisiertem Substrat inkubiert. Nicht bindende Bestandteile werden weggewaschen, anschließend werden die bindenden Bestandteile freigesetzt, vervielfältigt, und der gesamte Prozeß wird in schrittweisen Stufen wiederholt, um eine Anreicherung hinsichtlich besser bindender Sequenzen zu erreichen. Dieses Verfahren kann auch so angepaßt werden, daß es eine Isolierung von katalytischer RNA und DNA ermöglicht (Green und Szostak, 1992; für Übersichten siehe Chapman und Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al., 1995; Moore, 1995).
Jedoch ist eine Selektion hinsichtlich "katalytischer" oder Bindungsaktivität unter Verwendung von SELEX nur möglich, weil das gleiche Molekül die doppelte Rolle erfüllt, daß es die genetische Information trägt und der Katalysator oder das bindende Molekül (Aptamer) ist. Wenn eine Selektion hinsichtlich "Autokatalyse" durchgeführt wird, muß das gleiche Molekül auch die dritte Rolle erfüllen, nämlich, daß es ein Substrat darstellt. Da das genetische Element die Rolle sowohl des Substrats als auch des Katalysators spielen muß, ist eine Selektion nur hinsichtlich einzelner Umsetzungsereignisse möglich. Weil der "Katalysator" bei diesem Prozeß selbst modifiziert wird, ist er per Definition kein echter Katalysator. Darüber hinaus können unter Verwendung des SELEX-Verfahrens keine Proteine selektiert werden. Der Bereich an Katalysatoren, Substraten und Reaktionen, welche selektiert werden können, ist daher stark beschränkt.
Diejenigen der oben genannten Verfahren, welche schrittweise Runden der Mutation und Selektion erlauben, ahmen in vitro Mechanismen nach, die normalerweise dem Prozeß der Evolution zugeschrieben werden: schrittweise Veränderung, fortschreitende Selektion hinsichtlich einer gewünschten Aktivität und Replikation. Jedoch lieferte keines der Verfahren bislang Moleküle mit vergleichbarer Vielfalt und funktionaler Wirksamkeit wie solche, die man natürlich findet. Darüber hinaus gibt es keine künstlich geschaffenen "Evolutions"-Systeme, welche sowohl Nukleinsäuren als auch Proteine hervorbringen können, um den vollständigen Bereich biochemischer und biologischer Aktivitäten zu bewirken (z.B. Bindungs-, katalytische und regulatorische Aktivitäten) und die mehrere Prozesse, welche zu einem gewünschten Produkt oder einer Aktivität führen, vereinigen können.
Walde, Peter et al., J. Am Chem. Soc. 116, 17 (1994), S. 7541–7547, beschreiben die enzymatische Polymerisation von ADP in einer reversen Mizelle.
Hanes und Plückthun, P.N.A.S. 94 (1997), S. 4937–4942, beschreiben ein in vitro-Verfahren zur Selektion und Entwicklung von funktionellen Proteinen unter Verwendung von Ribosomen-Display.
Die DE 196 46 372 C beschreibt eine Verbindung, umfassend strukturelle Einheit A (Genotyp) und strukturelle Einheit B (Phänotyp), wobei der Genotyp und der Phänotyp permanent aneinander gebunden sind.
Es besteht daher ein großer Bedarf nach einem in vitro-System, welches die oben diskutierten Beschränkungen überwindet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Isolierung eines oder mehrerer genetischer Elemente, die ein Genprodukt mit einer gewünschten Aktivität codieren, mit den Stufen, in denen man

(a) die genetischen Elemente exprimiert, um ihre jeweiligen Genprodukte zu erzeugen, so daß die Genprodukte mit den sie codierenden Genen verknüpft sind,
(b) die genetischen Elemente in Mikrokapseln abteilt,
(c) die genetischen Elemente, die ein Genprodukt (Genprodukte) mit der gewünschten Aktivität erzeugen, ausliest.

Die Mikrokapseln teilen genetische Elemente und Genprodukte ab, so daß sie physisch miteinander verbunden bleiben. Überraschenderweise bleibt die Expression von Nukleinsäure innerhalb der künstlichen Mikrokapseln möglich, was eine Isolierung von Nukleinsäure auf der Grundlage der Aktivität des Genprodukts, welches sie codiert, erlaubt.
Wie es hierin verwendet wird, ist ein genetisches Element ein Molekül oder ein molekulares Konstrukt, welches eine Nukleinsäure umfaßt. Die genetischen Elemente können jede Nukleinsäure umfassen (z.B. DNA, RNA oder irgendein natürliches oder künstliches Analoges davon). Die Nukleinsäurekomponente des genetischen Elements kann darüber hinaus kovalent oder nicht-kovalent mit einem oder mehreren Molekülen oder Strukturen, einschließlich Proteinen, chemischen Resten und Gruppen, Festphasenträgern, wie magnetischen Perlen, und ähnlichem verknüpft sein. Bei dem Verfahren der Erfindung können diese Strukturen oder Moleküle so ausgestaltet sein, daß sie das Auslesen und/oder die Isolierung des genetischen Elements, welches ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität codiert, unterstützen.
Expression, wie hierin verwendet, wird in ihrer breitesten Bedeutung benutzt, um zu bezeichnen, daß eine Nukleinsäure, die in dem genetischen Element enthalten ist, in ihr Genprodukt überführt wird. Somit bezeichnet Expression, wenn die Nukleinsäure DNA ist, die Transkription der DNA in RNA; wenn diese RNA Protein codiert, kann Expression auch die Translation der RNA in Protein bezeichnen. Wenn die Nukleinsäure RNA ist, kann Expression die Replikation dieser RNA zu weiteren RNA-Kopien, die reverse Transkription der RNA zu DNA und optional die Transkription dieser DNA zu weiteren RNA-Molekül(en) sowie optional die Translation irgendeiner der produzierten RNA-Spezies zu Protein bezeichnen. Vorzugsweise wird Expression daher von einem oder mehreren Vorgängen durchgeführt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Transkription, reverser Transkription, Replikation und Translation.
Expression des genetischen Elements kann somit auf entweder DNA, RNA oder Protein oder eine Nukleinsäure oder Protein enthaltende nicht natürliche Basen oder Aminosäuren (das Genprodukt) innerhalb der Mikrokapsel gerichtet sein, so daß das Genprodukt innerhalb der gleichen Mikrokapsel wie das genetische Element enthalten ist.
Das genetische Element und das davon codierte Genprodukt sind dadurch miteinander verknüpft, daß jedes genetische Element und das entsprechende Genprodukt, das von dem genetischen Element codiert wird, innerhalb der gleichen Mikrokapsel enthalten sind. Auf diese Weise kann das Genprodukt in einer Mikrokapsel nicht eine Veränderung in irgendwelchen anderen Mikrokapseln verursachen.
Der Begriff "Mikrokapsel" wird hierin mit der Bedeutung, die man ihm auf dem Gebiet normalerweise zuschreibt und die hierin nachfolgend weiter beschrieben wird, verwendet. Im wesentlichen ist eine Mikrokapsel jedoch ein künstliches Kompartiment, dessen begrenzende Einfassungen den Austausch der Komponenten der hierin beschriebenen molekularen Mechanismen beschränken, welche das Auslesen von genetischen Elementen hinsichtlich der Funktion der Genprodukte, welche sie codieren, erlauben.
Vorzugsweise können die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikrokapseln in sehr großen Zahlen hergestellt werden und dabei eine Bibliothek von genetischen Elementen, welche ein Repertoire an Genprodukten codieren, abteilen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung kann das Auslesen von genetischen Elementen nach einer von im wesentlichen vier Techniken durchgeführt werden.

(I) In einer ersten Ausführungsform werden die Mikrokapseln hinsichtlich einer Aktivität des Genprodukts oder eines Derivats davon, welches die Mikrokapsel als Ganzes feststellbar macht, ausgelesen. Dementsprechend liefert die Erfindung ein Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, wobei ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität eine Veränderung in der Mikrokapsel oder eine Veränderung von einem oder mehreren Molekülen innerhalb der Mikrokapsel auslöst, welche es ermöglicht, daß die Mikrokapsel, die das Genprodukt und das genetische Element, welches dieses codiert, enthält, ausgelesen wird. In dieser Ausführungsform werden die Mikrokapseln daher hinsichtlich der Aktivität des/der Genprodukts/Genprodukte, die von dem/den darin enthaltenen genetischen Element(en) exprimiert wird/werden, voneinander ausgelesen, was es ermöglicht, eine Anreicherung hinsichtlich Mikrokapseln vorzunehmen, die das Genprodukt der gewünschten Aktivität enthalten.
(II) In einer zweiten Ausführungsform werden die genetischen Elemente nach Vereinigung der Mikrokapseln in ein oder mehrere gemeinsame Kompartimente ausgelesen. In dieser Ausführungsform modifiziert ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität das genetische Element, welches dieses codiert (und welches in der gleichen Mikrokapsel vorhanden ist), in solch einer Weise, daß es in einer nachfolgenden Stufe selektierbar ist. Die Reaktionen werden gestoppt, und die Mikrokapseln werden dann aufgebrochen, so daß die gesamten Inhalte der einzelnen Mikrokapseln vereinigt werden. Eine Selektion hinsichtlich der modifizierten genetischen Elemente erlaubt eine Anreicherung der genetischen Elemente, welche das/die Genprodukt(e) mit der gewünschten Aktivität codieren. Dementsprechend liefert die Erfindung ein Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, wobei in Stufe (b) das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität das genetische Element, welches dieses codiert, modifiziert, um die Isolierung des genetischen Elements zu ermöglichen. Es ist natürlich klar, daß eine Modifikation dahingehend direkt sein kann, daß sie durch die direkte Wirkung des Genprodukts auf das genetische Element verursacht wird, oder indirekt, wobei eine Reihe von Reaktionen, von denen eine oder mehrere das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität umfassen, zu einer Modifikation des genetischen Elements führt.
(III) In einer dritten Ausführungsform werden die genetischen Elemente nach Vereinigen der Mikrokapseln in ein oder mehrere gemeinsame Kompartimente ausgelesen. In dieser Ausführungsform löst ein Gen mit einer gewünschten Aktivität eine Veränderung in der Mikrokapsel, die das Genprodukt und das genetische Element, welches dieses codiert, enthält, aus. Diese Veränderung löst, wenn sie festgestellt wird, die Modifikation des Gens in dem Kompartiment aus. Die Reaktionen werden gestoppt, und die Mikrokapseln werden dann aufgebrochen, so daß die gesamten Inhalte der einzelnen Mikrokapseln vereinigt werden. Eine Selektion hinsichtlich der modifizierten genetischen Elemente erlaubt eine Anreicherung der genetischen Elemente, welche das/die Genprodukt(e) mit der gewünschten Aktivität codieren. Dementsprechend liefert die Erfindung ein Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, wobei in Stufe (b) das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität eine Veränderung in dem Kompartiment auslöst, welche festgestellt wird und die Modifikation des genetischen Elements in dem Kompartiment auslöst, so daß dessen Isolierung möglich ist. Es ist klar, daß die festgestellte Veränderung in dem Kompartiment durch die direkte Wirkung des Genprodukts verursacht sein kann oder durch indirekte Wirkung, wobei eine Reihe von Reaktionen, von denen eine oder mehrere das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität umfassen, zu der festgestellten Veränderung führt.
(IV) In einer vierten Ausführungsform können die genetischen Elemente durch ein mehrstufiges Verfahren ausgelesen werden, welches wenigstens zwei Stufen umfaßt, z.B. um das Aussetzen der genetischen Elemente an Bedingungen zu ermöglichen, welche es erlauben, daß zwei separate Reaktionen stattfinden. Es wird einem Fachmann auf dem Gebiet klar sein, daß die erste Mikroverkapselungsstufe der Erfindung zu Bedingungen führen muß, welche die Expression der genetischen Elemente erlauben – sei es Transkription, Transkription und/oder Translation, Replikation oder ähnliches. Unter diesen Bedingungen kann es nicht möglich sein, hinsichtlich einer bestimmten Genproduktaktivität zu selektieren, z.B. weil das Genprodukt unter diesen Bedingungen nicht aktiv sein könnte oder weil das Expressionssystem eine störende Aktivität enthält. Es wird daher ein Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben, wobei Stufe (b) umfaßt, daß man die genetischen Elemente unter Herstellung ihrer entsprechenden Genprodukte in den Mikrokapseln exprimiert, die Genprodukte mit den genetischen Elementen, welche diese codieren, verknüpft und die dabei gebildeten Komplexe isoliert. Dies ermöglicht, daß die genetischen Elemente und ihre zugehörigen Genprodukte von den Kapseln isoliert werden, bevor ein Auslesen hinsichtlich der Genproduktaktivität stattfindet. Die Komplexe können einer weiteren Abteilungsstufe vor der Isolierung der genetischen Elemente, die ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität codieren, unterzogen werden. Diese weitere Abteilungsstufe, welche vorteilhafterweise in Mikrokapseln stattfindet, erlaubt die Durchführung weiterer Reaktionen unter verschiedenen Bedingungen in einer Umgebung, wo die genetischen Elemente und ihre entsprechenden Genprodukte physisch miteinander verknüpft sind. Letztendliches Auslesen von genetischen Elementen kann gemäß oben genannter Ausführungsform (I), (II) oder (III) durchgeführt werden.

Die "zweite Verkapselung" kann auch mit genetischen Elementen, die mit Genprodukten verknüpft sind, durch andere Mittel durchgeführt werden, wie durch Phagenpräsentation, Polysompräsentation, RNA-Peptid-Fusion oder lac-Repressor-Peptid-Fusion.
Das/die selektierte(n) genetische(n) Element(e) kann/können auch anschließenden, möglicherweise stärker stringenten Runden der Auslese in schrittweisen wiederholten Stufen unterzogen werden, wobei das Verfahren der Erfindung entweder in seiner Gesamtheit oder nur in ausgewählten Stufen erneut angewendet wird. Durch geeignetes Konfektionieren der Bedingungen können genetische Elemente, die Genprodukte mit einer besser optimierten Aktivität codieren, nach jeder Runde der Selektion isoliert werden.
Darüber hinaus können die genetischen Elemente, die nach einer ersten Runde der Auslese isoliert werden, Mutagenese unterzogen werden, bevor die Auslese durch schrittweise Wiederholung der Stufen des Verfahrens der Erfindung wiederholt wird, wie es oben angegeben ist. Nach jeder Runde der Mutagenese werden einige genetische Elemente in solch einer Weise modifiziert worden sein, daß die Aktivität der Genprodukte verbessert ist.
Darüber hinaus können die selektierten genetischen Elemente in einen Expressionsvektor kloniert werden, um eine weitere Charakterisierung der genetischen Elemente und ihrer Produkte zu ermöglichen.
Es wird auch ein Produkt beschrieben, welches gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung selektiert wurde. Wie es in diesem Zusammenhang verwendet wird, kann sich ein "Produkt" auf ein Genprodukt beziehen, das gemäß der Erfindung selektierbar ist, oder auf das genetische Element (oder genetische Information, die darin enthalten ist).
In einem dritten Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts mit den Stufen, in denen man:

(a) ein genetisches Element herstellt, welches das Genprodukt codiert,
(b) die genetischen Elemente unter Herstellung ihrer entsprechenden Genprodukte exprimiert, so daß die Genprodukte mit den sie codierenden genetischen Elementen verknüpft sind,
(c) genetische Elemente in Mikrokapseln abteilt,
(d) die genetischen Elemente, welche das/die Genprodukt(e) mit der gewünschten Aktivität herstellen, ausliest und
(e) das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität exprimiert.

Gemäß dem dritten Aspekt umfaßt Stufe (a) vorzugsweise die Herstellung eines Repertoires an genetischen Elementen, wobei jedes genetische Element ein potentiell verschiedenes Genprodukt codiert. Repertoires können durch herkömmliche Techniken erzeugt werden, wie durch solche, die für die Herstellung von Bibliotheken verwendet werden, welche für eine Selektion nach Verfahren, wie Phagenpräsentation, vorgesehen sind. Genprodukte mit der gewünschten Aktivität können erfindungsgemäß von dem Repertoire selektiert werden.
In einem vierten Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Durchmusterung einer Verbindung oder von Verbindungen, die zur Modulation der Aktivität eines Genprodukts in der Lage ist/sind, mit den Stufen, in denen man

(a) ein Repertoire an genetischen Elementen, die ein Genprodukt codieren, herstellt,
(b) die genetischen Elemente unter Herstellung ihrer entsprechenden Genprodukte exprimiert und die Genprodukte mit den sie codierenden genetischen Elementen verknüpft,
(c) genetische Elemente in Mikrokapseln abteilt,
(d) die genetischen Elemente, welche das/die Genprodukt(e) mit der gewünschten Aktivität herstellen, ausliest und
(e) ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität mit der Verbindung oder den Verbindungen in Kontakt bringt und die Modulation einer Aktivität des Genprodukts durch die Verbindung oder die Verbindungen aufzeichnet.

In vorteilhafter Weise umfaßt das Verfahren weiterhin die Stufe, bei der man

(f) die Verbindung oder die Verbindungen, die die Aktivität des Genprodukts modulieren kann bzw. können, identifiziert und diese Verbindung oder Verbindungen synthetisiert.

Dieses Selektionssystem kann zur Selektion hinsichtlich RNA, DNA oder Proteinmolekülen mit katalytischer, regulatorischer oder Bindungsaktivität konfiguriert werden.
In einem fünften Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Verbindung oder von Verbindungen, welches die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Bereitstellen eines Syntheseprotokolls, wobei wenigstens eine Stufe durch ein Polypeptid katalysiert wird,
(b) Herstellen genetischer Elemente, die Varianten des Polypeptids, welches diese Stufe vereinfacht, codieren,
(c) Exprimieren der genetischen Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte zu erzeugen, so daß die Genprodukte mit den sie codierenden genetischen Elementen verknüpft sind,
(d) Kompartimentieren der genetischen Elemente in Mikrokapseln,
(e) Sortieren der genetischen Elemente, die ein Polypeptidgenprodukt (Polypeptidgenprodukte) mit der gewünschten Aktivität erzeugen, und
(f) Herstellen der Verbindung oder Verbindungen unter Verwendung des in (e) identifizierten Polypeptidgenprodukts, um die relevante Stufe der Synthese zu vereinfachen.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1
Genselektion durch Abteilung

a Schematische Darstellung des Selektionsverfahrens. In Stufe 1 wird ein in vitro-Transkriptions/Translations-Reaktionsgemisch, das eine Bibliothek von genetischen Elementen enthält, die mit einem Substrat für die ausgewählte Reaktion verknüpft sind, unter Ausbildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion mit typischerweise einem genetischen Element pro wäßrigem Kompartiment dispergiert. Die genetischen Elemente werden in ihren Kompartimenten transkribiert und translatiert (Stufe 2). Anschließend (Stufe 3) wandeln Proteine (oder RNAs) mit enzymatischen Aktivitäten das Substrat in ein Produkt um, welches mit dem genetischen Element verknüpft bleibt. Abteilung verhindert die Modifikation von genetischen Elementen in anderen Kompartimenten. Als nächstes (Stufe 4) wird die Emulsion aufgebrochen, alle Reaktionen werden gestoppt und die wäßrigen Kompartimente vereinigt. Genetische Elemente, welche mit dem Produkt verknüpft sind, werden selektiv angereichert, anschließend vervielfältigt und entweder charakterisiert (Stufe 5) oder mit dem Substrat verknüpft und für weitere Runden der Selektion abgeteilt (Stufe 6).
b Selektion hinsichtlich zielspezifischer DNA-Methylierung durch HaeIII-Methylase. Das Substrat ist ein Abschnitt von DNA, welcher HaeIII-Restriktions/Modifikations-(R/M-)Stellen enthält. Genetische Elemente werden durch Bindung an mit Streptavidin beschichtete magnetische Perlen isoliert und mit dem spezifischen Restriktionsenzym HaeIII behandelt. Nur Nukleinsäuren mit methylierten R/M-Stellen sind gegen eine Spaltung beständig und werden anschließend durch PCR vervielfältigt.

2a
Tröpfchengrößenverteilung und Aktivitäten von DHFR und HaeIII-Methylase in Emulsionen: Größenverteilung der wäßrigen Kompartimente in einer Emulsion, bestimmt durch Laserdiffraktion. In vitro-Transkriptions/Translations-Reaktionsgemische, die DNA und Natriumdesoxycholat enthalten, werden durch Rühren oder durch Rühren mit anschließender Homogenisierung bei 8000, 9500 oder 13500 U.p.M. emulgiert. Die Größenverteilung der wäßrigen Teilchen ist als Prozentsatz des gesamten wäßrigen Volumens gezeigt.
2b
Die Aktivität von DHFR, die in situ durch Transkription und Translation von ihren Gen (1b) in wäßrigen Kompartimenten einer Emulsion gebildet wird. Die Konzentration des verwendeten folA-Gens (2,5 nM) liefert einen Mittelwert von einem Gen pro Tröpfchen in den feinsten Emulsionen (homogenisiert bei 13500 U.p.M.). Der von den Größenverteilungsdaten (in 2) berechnete mittlere Durchmesser ist als eine Funktion der Homogenisierungsgeschwindigkeit wiedergegeben (0 U.p.M. bezeichnet die Emulsion, die durch Rühren ohne weitere Homogenisierung hergestellt ist). Aktivität ist als Prozentsatz der Aktivität, die in dem nicht emulgierten in vitro-Reaktionsgemisch unter den gleichen Bedingungen beobachtet wird.
Die Aktivität von HaeIII-Methylase, die in situ durch Transkription und Translation von ihren Gen (1b) in wäßrigen Kompartimenten einer Emulsion gebildet wird. Die verwendete Konzentration des M.HaeIII-Gens (2,5 nM) liefert einen Mittelwert von einem Gen pro Tröpfchen in den feinsten Emulsionen (homogenisiert bei 13500 U.p.M.). Der von den Größenverteilungsdaten (in 2a) berechnete mittlere Durchmesser ist als eine Funktion der Homogenisierungsgeschwindigkeit angegeben (0 U.p.M. bezeichnet die Emulsion, die durch Rühren ohne weitere Homogenisierung hergestellt ist). Aktivität ist als Prozentsatz der Aktivität angegeben, die in dem nicht emulgierten in vitro-Reaktionsgemisch unter den gleichen Bedingungen beobachtet wird.
3
Selektionen hinsichtlich HaeIII-DNA-Methylase

a Selektion von M.HaeIII-Genen aus einem 1000-fachen Überschuß von folA-Genen. Reaktionen wurden mit 0,2 nM DIG-folA-3s-Biotin-DNA (entsprechend einem Durchschnitt von einem Gen pro Kompartiment), versetzt mit 0,2 pM DIG-M.HaeIII-3s-Biotin, angesetzt. Die Reaktionsgemische wurden entweder durch Rühren emulgiert oder in Lösung belassen. Die DNA von diesen Reaktionen wurde eingefangen, mit HaeIII (oder mit HhaI) verdaut und durch PCR vervielfältigt. Diese DNA wurde durch verschachtelte PCR mit Primern LMB2-Nest und LMB3-Nest weiter vervielfältigt, und 5 Mikroliter von jeder verschachtelten PCR wurden auf einem 1,5%-igen Agarosegel, das Ethidiumbromid enthielt, Elektroforese unterzogen. Marker, φX174-HaeIII-Verdau; minus T7, keine T7-RNA-Polymerase; minus NadCh, kein Natriumdesoxycholat.
b Zwei-Runden-Selektionen. Reaktionen, die ein molares Verhältnis von DIG-M.HaeIII-3s-Biotin: DIG-folA-3s-Biotin (500 pM) von 1:10⁴ bis 1:10⁷ enthalten, werden durch Rühren emulgiert. Die DNA von diesen Reaktionen wird mit HaeIII verdaut und durch PCR mit Primern LMB2-Biotin (SEQ ID NO:9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO:10) vervielfältigt. Die vervielfältigte DNA aus der ersten Runde der Selektion von Verhältnissen von 1:10⁴ und 1:10⁵ (bei 20 pM) und den Verhältnissen von 1:10⁶ und 1:10⁷ (bei 500 pM) wird in eine zweite Runde der Selektion gegeben. Diese DNA wurde durch verschachtelte PCR mit Primern LMB2-Nest und LMB3-Nest weiter vervielfältigt, und fünf Mikroliter verschachtelte PCR von jeder Runde der Selektion werden durch Gelelektroforese analysiert, wie es oben angegeben ist (oberes Feld). Die gleiche DNA wurde in vitro translatiert, und die resultierende Methylaseaktivität wurde gemessen. Ergebnisse sind als der Prozentsatz an methylierter Substrat-DNA angegeben (unteres Feld).

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
(A) ALLGEMEINE BESCHREIBUNG
Die Mikrokapseln erfordern geeignete physikalische Eigenschaften, um die Durchführung der Erfindung zu ermöglichen.
Erstens, um sicherzustellen, daß die genetischen Elemente und Genprodukte nicht zwischen Mikrokapseln diffundieren können, müssen die Inhalte jeder Mikrokapsel von den Inhalten der umgebenden Mikrokapseln isoliert sein, so daß es keinen oder wenig Austausch der genetischen Elemente und Genprodukte zwischen den Mikrokapseln über den zeitlichen Verlauf des Experiments gibt.
Zweitens, das Verfahren der vorliegenden Erfindung erfordert, daß nur eine begrenzte Anzahl von genetischen Elementen pro Mikrokapsel vorliegt. Dies stellt sicher, daß das Genprodukt eines individuellen genetischen Elements von anderen genetischen Elementen isoliert sein wird. Daher wird die Kopplung zwischen genetischem Element und Genprodukt hochgradig spezifisch sein. Der Anreicherungsfaktor ist am höchsten mit einem Durchschnitt von einem oder weniger genetischen Elementen pro Mikrokapsel, wobei die Verknüpfung zwischen der Nukleinsäure und der Aktivität des codierten Genprodukts so eng wie möglich ist, da das Genprodukt eines individuellen genetischen Elements von den Produkten aller anderer genetischer Elemente isoliert sein wird. Auch wenn die theoretisch optimale Situation von im Durchschnitt einem einzelnen genetischen Element oder weniger pro Mikrokapsel nicht verwendet wird, kann jedoch ein Verhältnis von 5, 10, 50, 100 oder 1000 oder mehr genetischen Elementen pro Mikrokapsel sich als vorteilhaft beim Auslesen einer großen Bibliothek erweisen. Anschließende Runden der Auslese, einschließlich erneute Verkapselung mit einer anderen Genverteilung der genetischen Elemente, werden eine stärker stringente Auslese der genetischen Elemente erlauben. Vorzugsweise liegt ein einzelnes genetisches Element oder weniger pro Mikrokapsel vor.
Drittens, die Ausbildung und Zusammensetzung der Mikrokapseln darf nicht die Funktion der Expressionsmaschinerie der genetischen Elemente und die Aktivität der Genprodukte beseitigen.
Folglich muß jedes verwendete Mikroverkapselungssystem diese drei Anforderungen erfüllen. Das/die geeignete(n) System(e) kann/können in Abhängigkeit von der genauen Art der Erfordernisse in jeder Anwendung der Erfindung variieren, was dem Fachmann auf dem Gebiet klar sein wird.
Eine breite Vielfalt von Mikroverkapselungsverfahren steht zur Verfügung (siehe Benita, 1996) und kann zur Erzeugung der Mikrokapseln, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, eingesetzt werden. Tatsächlich wurden mehr als 200 Mikroverkapselungsverfahren in der Literatur nachgewiesen (Finch, 1993).
Diese umfassen membranverhüllte wäßrige Vesikel, wie Lipidvesikel (Liposome) (New, 1990) und nicht-ionische Detergensvesikel (van Hal et al., 1996). Diese sind Kapseln mit geschlossenen Membranen aus einzelnen oder mehreren Doppellagen von nicht-kovalent zusammengesetzten Molekülen, wobei jede Doppellage von ihrem Nachbarn durch ein wäßriges Kompartiment getrennt ist. Im Falle von Liposomen ist die Membran aus Lipidmolekülen zusammengesetzt; diese sind üblicherweise Phospholipide, aber es können auch Sterole, wie Cholesterol, in die Membrane aufgenommen sein (New, 1990). Eine Vielfalt an enzymkatalysierten biochemischen Reaktionen, einschließlich RNA- und DNA-Polymerisation, können in Liposomen durchge führt werden (Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick & Luisi, 1996).
Bei einem membranverhüllten Vesikelsystem befindet sich viel der wäßrigen Phase außerhalb der Vesikel und ist daher nicht abgeteilt. Diese zusammenhängende, wäßrige Phase sollte entfernt oder die biologischen Systeme darin gehemmt oder zerstört (z.B. durch Verdau von Nukleinsäuren mit DNase oder RNase) werden, damit die Reaktionen auf die Mikrokapseln beschränkt sind (Luisi et al., 1987).
Enzymkatalysierte biochemische Reaktionen wurden auch in Mikrokapseln gezeigt, die nach einer Vielzahl anderer Verfahren erzeugt wurden. Viele Enzyme sind in umgekehrten Mizellenlösungen aktiv (Bru & Walde, 1991; Bru & Walde, 1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993; Kumar et al., 1989; Luisi & B., 1987; Mao & Walde, 1991; Mao et al., 1992; Perez et al., 1992; Walde et al., 1994; Walde et al., 1993; Walde et al., 1988), wie z.B. dem AOT-Isooktan-Wasser-System (Menger & Yamada, 1979).
Mikrokapseln können auch durch Grenzflächenpolymerisation und Grenzflächenkomplexierung erzeugt werden (Whateley, 1996). Mikrokapseln dieser Art können steife, nicht-permeable Membrane oder semipermeable Membrane haben. Semipermeable Mikrokapseln, die durch Zellulosenitratmembrane, Polyamidmembrane und Lipid-Polyamidmembrane begrenzt sind, können alle biochemische Reaktionen unterstützen, einschließlich Multienzymsysteme (Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Alginat/Polylysin-Mikrokapseln (Lim & Sun, 1980), welche unter sehr milden Bedingungen ausgebildet werden können, haben sich ebenfalls als sehr biokompatibel erwiesen und stellen z.B. ein Verfahren zur Verkapselung von lebenden Zellen und Geweben bereit (Chang, 1992; Sun et al., 1992).
Nicht-membranartige Mikroverkapselungssysteme auf der Grundlage von Phasenaufteilung einer wäßrigen Umgebung in einem kolloidalen System, wie einer Emulsion, können ebenfalls verwendet werden.
Vorzugsweise werden die Mikrokapseln von Emulsionen gebildet; heterogene Systeme aus zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen, wobei eine der Phasen in der anderen als Tröpfchen von mikroskopischer oder kolloidaler Größe dispergiert ist (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Emulsionen können aus jeder geeigneten Kombination von nicht mischbaren Flüssigkeiten hergestellt werden. Vorzugsweise weist die Emulsion Wasser (welches die biochemischen Komponenten enthält) als die Phase auf, die in der Form von fein verteilten Tröpfchen vorhanden ist (die disperse, innere oder diskontinuierliche Phase), und eine hydrophobe, nicht mischbare Flüssigkeit (ein "Öl") als die Matrix, in der diese Tröpfchen suspendiert sind (die nicht-disperse, kontinuierliche oder äußere Phase). Solche Emulsionen werden als "Wasser-in-Öl" (W/O) bezeichnet. Dies hat den Vorteil, daß die gesamte wäßrige Phase, welche die biochemischen Komponenten enthält, in diskreten Tröpfchen abgeteilt ist (die innere Phase). Die äußere Phase, welche ein hydrophobes Öl ist, enthält im allgemeinen nichts von den biochemischen Komponenten und ist daher inert.
Die Emulsion kann durch Zugabe von einem oder mehreren oberflächenaktiven Mitteln (Detergenzien) stabilisiert werden. Diese Detergenzien bezeichnet man als Emulgiermittel und sie wirken an der Wasser/Öl-Grenzfläche zur Verhinderung (oder wenigstens Verzögerung) einer Trennung der Phasen. Viele Öle und viele Emulgiermittel können zur Erzeugung von Wasser-in-Öl-Emulsionen verwendet werden; eine jüngere Zusammenstellung listete über 16000 Detergenzien auf, von denen viele als Emulgiermittel verwendet werden (Ash und Ash, 1993). Geeignete Öle umfassen leichtes, weißes Mineralöl und nicht-ionische Detergenzien (Schick, 1966), wie Sorbitanmonooleat (Span^TM80; ICI) und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween^TM80; ICI).
Die Verwendung anionischer Detergenzien kann ebenfalls vorteilhaft sein. Geeignete Detergenzien umfassen Natriumcholat und Natriumtaurocholat. Besonders bevorzugt ist Natriumdesoxycholat, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5% w/v oder darunter. Die Einbeziehung solcher Detergenzien kann in einigen Fällen die Expression der genetischen Elemente und/oder die Aktivität der Genprodukte erhöhen. Die Zugabe einiger anionischer Detergenzien zu einem nicht-emulgierten Reaktionsgemisch hebt die Translation vollständig auf. Während des Emulgierens wird das Detergens jedoch aus der wäßrigen Phase in die Grenzfläche überführt, und die Aktivität wird wiederhergestellt. Die Zugabe eines anionischen Detergens zu den zu emulgierenden Gemischen stellt sicher, daß Reaktionen nur nach einer Abteilung ablaufen.
Die Erzeugung einer Emulsion erfordert im allgemeinen die Anwendung von mechanischer Energie, um die Phasen zusammenzubringen. Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um dies zu bewerkstelligen, welche eine Vielzahl mechanischer Vorrichtungen verwenden, einschließlich Rührern (wie Magnetrührer, Propeller- und Turbinenrührer, Schaufeleinrichtungen und Schläger), Homogenisierer (einschließlich Rotor-Stator-Homogenisierer, Hochdruckventilhomogenisierer und Strahlhomogenisierer), Kolloidmühlen, Ultraschall und "Membranemulgier"-Einrichtungen (Becher, 1957; Dickinson, 1994).
Wäßrige Mikrokapseln, die in Wasser-in-Öl-Emulsionen ausgebildet sind, sind im allgemeinen stabil mit wenig, wenn überhaupt, Austausch von genetischen Elementen oder Genprodukten zwischen Mikrokapseln. Darüber hinaus haben wir gezeigt, daß mehrere biochemische Reaktio nen in Emulsionsmikrokapseln ablaufen. Darüber hinaus sind komplizierte biochemische Prozesse, besonders Gentranskription und -translation, ebenfalls in Emulsionsmikrokapseln aktiv. Die Technologie zur Erzeugung von Emulsionen mit Volumen bis hoch zu industriellen Maßstäben von Tausenden von Litern ist vorhanden (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Die bevorzugte Mikrokapselgröße wird in Abhängigkeit von den genauen Anforderungen jedes individuellen Selektionsprozesses, der gemäß der vorliegenden Erfindung durchzuführen ist, variieren. In allen Fällen wird es eine optimale Balance zwischen Genbibliotheksgröße, der erforderlichen Anreicherung und der erforderlichen Konzentration an Komponenten in den einzelnen Mikrokapseln zum Erzielen von effizienter Expression und Reaktivität der Genprodukte geben.
Die Expressionsprozesse können in jeder einzelnen Mikrokapsel stattfinden. Sowohl in vitro-Transkription als auch gekoppelte Transkription-Translation werden bei subnanomolaren DNA-Konzentrationen weniger effizient. Aufgrund des Erfordernisses, daß nur eine begrenzte Anzahl an DNA-Molekülen in jeder Mikrokapsel vorhanden ist, setzt dies daher eine praktische Obergrenze für die mögliche Mikrokapselgröße. Vorzugsweise ist das mittlere Volumen der Mikrokapseln geringer als 5,2 × 10^–16 m³ (entsprechend einer kugelförmigen Mikrokapsel mit einem Durchmesser von weniger als 10 μm), besonders bevorzugt weniger als 6,5 × 10^–17 m³ (5 μm), ganz besonders bevorzugt etwa 4,2 × 10^–18 m³ (2 μm) und idealerweise etwa 9 × 10^–18 m³ (2,6 μm).
Die wirksame DNA- oder RNA-Konzentration in den Mikrokapseln kann durch verschiedene Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sein werden, künstlich erhöht werden. Diese umfassen z.B. die Hinzufügung von volumenausschließenden Chemikalien, wie Polyethylenglycolen (PEG) und eine Vielzahl von Genvervielfältigungstechniken, einschließlich Transkription unter Verwendung von RNA-Polymerasen, einschließlich solchen von Bakterien wie E. coli (Roberts, 1969; Blattner und Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975), Eukaryonten (Weil et al., 1979; Manley et al., 1983) und Bakteriophagen, wie T7, T3 und SP6 (Melton et al., 1984); die Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki et al., 1988), Qβ-Replikasevervielfältigung (Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin und Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); die Ligasekettenreaktion (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991) und selbsterhaltendes Sequenzreplikationssystem (Fahy et al., 1991) und Strangverdrängungsvervielfältigung (Walker et al., 1992). Auch Genvervielfältigungstechniken, die thermische Zyklen erfordern, wie PCR und LCR, könnten verwendet werden, wenn die Emulsionen und die in vitro-Transkriptions- oder die gekoppelten Transkription-Translations-Systeme thermostabil sind (z.B. könnten die gekoppelten Transkription-Translations-Systeme aus einem thermostabilen Organismus, wie Thermus aquaticus, hergestellt werden).
Eine Erhöhung der effektiven lokalen Nukleinsäurekonzentration erlaubt es, daß größere Mikrokapseln effektiv eingesetzt werden. Dies erlaubt eine bevorzugte praktische Obergrenze für das Mikrokapselvolumen von etwa 5,2 × 10^–16 m³ (entsprechend einer Kugel mit einem Durchmesser von 10 μm).
Die Mikrokapselgröße muß ausreichend groß sein, um alle erforderlichen Komponenten der biochemischen Reaktionen, die in der Mikrokapsel stattfinden müssen, aufzunehmen. Zum Beispiel erfordern in vitro sowohl Transkriptionsreaktionen als auch gekoppelte Transkriptions-Translations-Reaktionen eine Nukleosidtriphosphatgesamtkonzentration von etwa 2 mM.
Um z.B. ein Gen zu einem einzelnen kurzen RNA-Molekül von 500 Basen Länge zu transkribieren, würde dies ein Minimum von 500 Molekülen Nukleosidtriphosphat pro Mikrokapsel (8,33 × 10^–22 mol) erfordern. Um eine 2 mM Lösung zusammenzusetzen, muß diese Anzahl an Molekülen in einer Mikrokapsel mit einem Volumen von 4,17 × 10^–19 Litern (4,17 × 10^–22 m³) enthalten sein, welche, wenn sie kugelförmig wäre, einen Durchmesser von 93 nm hätte.
Darüber hinaus ist anzumerken, daß, insbesondere im Falle von Reaktionen, die Translation umfassen, die Ribosome, die notwendig sind, daß die Translation stattfindet, selbst etwa einen Durchmesser von 20 nm haben. Daher ist die bevorzugte Untergrenze für Mikrokapseln ein Durchmesser von etwa 0,1 μm (100 nm).
Daher liegt das Mikrokapselvolumen vorzugsweise in der Größenordnung zwischen 5,2 × 10^–22 m³ und 5,2 × 10^–16 m³, was einer Kugel mit einem Durchmesser zwischen 0,1 μm und 10 μm entspricht, besonders bevorzugt zwischen etwa 5,2 × 10^–19 m³ und 6,5 × 10^–17 m³ (1 μm und 5 μm). Kugeldurchmesser von etwa 2,6 μm sind ganz besonders vorteilhaft.
Es ist kein Zufall, daß die bevorzugten Abmessungen der Kompartimente (Tröpfchen mit 2,6 μm mittlerem Durchmesser) eng denjenigen von Bakterien gleichen, z.B. sind Escherichia Stäbchen mit 1,1–1,5 × 2,0–6,0 μm und Azotobacter sind eiförmige Zellen mit 1,5–2,0 μm Durchmesser. In ihrer einfachsten Form basiert die Darwin'sche Evolution auf einem "ein-Genotyp-ein-Phänotyp"-Mechanismus. Die Konzentration eines einzelnen abgeteilten Gens oder Genoms bildet einen Tropfen von 0,4 nM in einem Kompartiment mit 2 μm Durchmesser bis zu 25 pM in einem Kompartiment von 5 μm Durchmesser. Die prokaryontische Transkriptions/Translationsmaschinerie hat sich so entwickelt, daß sie in Kompartimenten mit ~1–2 μm Durchmesser arbeitet, wo einzelne Gene in ungefähr nanomolaren Konzentrationen vorliegen. Ein einzelnes Gen in einem Kompartiment von 2,6 μm Durchmesser liegt in einer Konzentration von 0,2 nm vor. Diese Genkonzentration ist hoch genug für eine effiziente Translation. Eine Abteilung in solch einem Volumen stellt auch sicher, daß, auch wenn nur ein einzelnes Molekül des Genprodukts gebildet wird, es mit etwa 0,2 nM vorliegt, was wichtig ist, wenn das Genprodukt eine modifizierende Aktivität des genetischen Elements selbst haben soll. Das Volumen der Mikrokapsel sollte daher nicht nur unter Berücksichtigung der Anforderungen für Transkription und Translation des genetischen Elements ausgewählt werden, sondern auch hinsichtlich der modifizierenden Aktivität, die von dem Genprodukt bei dem Verfahren der Erfindung gefordert wird.
Die Größe von Emulsionsmikrokapseln kann einfach durch Konditionieren der Emulsionsbedingungen, die zur Ausbildung der Emulsion verwendet werden, gemäß den Anforderungen des Selektionssystems variiert werden. Je größer die Mikrokapselgröße ist, desto größer ist das Volumen, das erforderlich sein wird, um eine gegebene Bibliothek von genetischen Elementen zu verkapseln, da der letztendlich begrenzende Faktor die Größe der Mikrokapsel und somit die Anzahl an pro Einheitsvolumen möglichen Mikrokapseln sein wird.
Die Größe der Mikrokapseln wird nicht nur in Bezug auf die Anforderungen des Transkriptions/Translations-Systems ausgewählt, sondern auch hinsichtlich derjenigen des für das genetische Element verwendeten Selektionssystems. Somit können die Komponenten des Selektionssystems, wie eines chemischen Modifikationssystems, Reaktionsvolumen und/oder Reagenzienkonzentrationen erfordern, die für Transkription/Translation nicht optimal sind. Wie es hierin beschrieben ist, können diese Anforderungen durch eine zweite Stufe der erneuten Verkapselung angepaßt werden; darüber hinaus können sie durch Auswählen der Mikrokapselgröße angepaßt werden, um Transkription/Translation und Selektion als Ganzes zu maximieren. Eine empirische Bestimmung des optimalen Mikrokapselvolumens und der Reagenzienkonzentration, beispielsweise wie es hierin beschrieben ist, ist bevorzugt.
Ein "genetisches Element" gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein solches, wie es oben beschrieben ist. Vorzugsweise ist ein genetisches Element ein Molekül oder Konstrukt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem DNA-Molekül, einem RNA-Molekül, einem teilweise oder vollständig künstlichen Nukleinsäuremolekül, das aus ausschließlich synthetischen oder einem Gemisch aus natürlich vorkommenden und synthetischen Basen besteht, einem der vorgenannten, verknüpft mit einem Polypeptid, und einem der vorgenannten, verknüpft mit irgendeiner anderen molekularen Gruppe oder einem Konstrukt. Vorteilhafterweise kann die andere molekulare Gruppe oder das Konstrukt aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus Nukleinsäuren, polymeren Substanzen, insbesondere Perlen, z.B. Polystyrolperlen, magnetischen Substanzen, wie magnetischen Perlen, Markierungen, wie Fluorophoren oder isotopen Markierungen, chemischen Reagenzien, Bindungsmitteln, wie Makrozyklen und ähnlichem.
Der Nukleinsäureanteil des genetischen Elements kann geeignete regulatorische Sequenzen umfassen, wie solche, die für eine effiziente Expression des Genprodukts erforderlich sind, z.B. Promotoren, Verstärker, Translationsinitiationssequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Spleißstellen und ähnliches.
Wie es aus dem folgenden deutlich werden wird, ist das Polypeptid oder die andere molekulare Gruppe oder das Konstrukt in vielen Fällen ein Ligand oder ein Substrat, welcher/welches direkt oder indirekt an das Genprodukt bindet oder mit diesem reagiert, um das genetische Element zu markieren. Dies erlaubt das Auslesen des genetischen Elements auf der Grundlage der Aktivität des Genprodukts.
Der Ligand oder das Substrat kann mit der Nukleinsäure durch eine Vielzahl von Mitteln verbunden sein, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind (siehe z.B. Hermanson, 1996). Es wird jede Markierung genügen, welche die anschließende Selektion des genetischen Elements erlaubt. Die Auslese kann durch jedes Verfahren erfolgen, welches die bevorzugte Abtrennung, Vervielfältigung oder das Überleben des markierten genetischen Elements erlaubt. Beispiele umfassen Selektion durch Bindung (einschließlich Techniken, die auf magnetischer Abtrennung beruhen, z.B. die Verwendung von Dynabeads^TM) und durch Beständigkeit gegen Abbau (z.B. durch Nukleasen, einschließlich Restriktionsendonukleasen).
Ein Weg, auf welchem das Nukleinsäuremolekül mit einem Liganden oder einem Substrat verknüpft werden kann, ist durch Biotinylierung. Dies kann durch PCR-Vervielfältigung mit einem 5'-Biotinylierungsprimer durchgeführt werden, so daß das Biotin und die Nukleinsäure kovalent verknüpft werden.
Der Ligand oder das Substrat, der/das auszuwählen ist, kann an die modifizierte Nukleinsäure durch eine Vielzahl von Mitteln, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, angeheftet werden. Eine biotinylierte Nukleinsäure kann an eine Polystyrolmikroperle (mit einem Durchmesser von 0,035–0,2 μm), welche mit Avidin oder Streptavidin beschichtet ist und welche die Nukleinsäure daher mit sehr hoher Affinität binden wird, gekoppelt werden. Diese Perle kann mit Substrat oder Ligand nach jedem geeigneten Verfahren, wie durch Zugabe von biotinyliertem Substrat oder durch kovalente Kopplung, derivatisiert werden.
Alternativ kann eine biotinylierte Nukleinsäure an Avidin oder Streptavidin, welches mit einem großen Proteinmolekül komplexiert ist, wie Thyroglobulin (669 kD) oder Ferritin (440 kD), gekoppelt werden. Dieser Komplex kann mit Substrat oder Ligand z.B. durch kovalente Kopplung an die ε-Aminogruppe von Lysinen oder durch nicht-kovalente Wechselwirkung, wie Biotin-Avidin, derivatisiert werden. Das Substrat kann in einer Form vorliegen, die mit dem genetischen Ele ment nicht verknüpft ist, die aber eine inaktive "Markierung" enthält, welche eine weitere Stufe erfordert, um sie zu aktivieren, wie z.B. Photoaktivierung (z.B. eines "gefangenen" Biotinanalogen (Sundberg et al., 1995; Pirrung und Huang, 1996)). Der auszuwählende Katalysator wandelt dann das Substrat in Produkt um. Die "Markierung" könnte dann aktiviert und das "markierte" Substrat und/oder Produkt von einem die Markierung bindenden Molekül (z.B. Avidin oder Streptavidin), das mit der Nukleinsäure komplexiert ist, gebunden werden. Das Verhältnis von Substrat zu Produkt, welches über die "Markierung" an die Nukleinsäure gebunden ist, wird daher das Verhältnis von Substrat und Produkt in Lösung widerspiegeln.
Eine Alternative besteht darin, die Nukleinsäure an einen produktspezifischen Antikörper (oder ein anderes produktspezifisches Molekül) zu koppeln. In diesem Szenario ist das Substrat (oder eines der Substrate) in jeder Mikrokapsel unverknüpft mit dem genetischen Element vorhanden, besitzt aber eine molekulare "Markierung" (z.B. Biotin, DIG oder DNP). Wenn der auszuwählende Katalysator das Substrat zu Produkt umwandelt, behält das Produkt die "Markierung" und wird dann von dem produktspezifischen Antikörper in der Mikrokapsel gefangen. Auf diese Weise wird das genetische Element mit der "Markierung" nur verbunden, wenn es ein Enzym codiert oder produziert, welches in der Lage ist, Substrat zu Produkt umzuwandeln.
Wenn alle Reaktionen gestoppt und die Mikrokapseln vereinigt sind, können die genetischen Elemente, welche aktive Enzyme codieren, unter Verwendung eines Antikörpers oder eines anderen Moleküls, welches spezifisch mit der "Markierung" bindet oder reagiert, angereichert werden. Obwohl Substrate als auch Produkt die molekulare Markierung aufweisen, werden nur die genetischen Elemente, welche aktives Genprodukt codieren, gemeinsam aufgereinigt werden.
Die Begriffe "isolieren", "auslesen" und "selektieren" sowie Variationen davon werden hierin verwendet. Isolierung gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet das Verfahren der Trennung eines Gegenstands von einer heterogenen Population, z.B. einem Gemisch, so daß er von wenigstens einer Substanz, mit welcher er vor dem Isolierungsverfahren vereinigt war, frei ist. In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich Isolierung auf die Reinigung eines Gegenstands im wesentlichen bis zur Homogenität. Auslese eines Gegenstands bezeichnet das Verfahren der bevorzugten Isolierung von gewünschten Gegenständen gegenüber unerwünschten Gegenständen. Insoweit sich dies auf die Isolierung der gewünschten Gegenstände bezieht, sind die Begriffe "Isolierung" und "Auslese" äquivalent. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die Auslese von gewünschten genetischen Elementen von Pools (Bibliotheken oder Repertoires) von genetischen Elementen, welche das gewünschte genetische Element enthalten. Selektieren wird dazu verwendet, den Prozeß (einschließlich des Ausleseprozesses) der Isolierung eines Gegenstands anhand einer bestimmten Eigenschaft davon zu bezeichnen.
In einer besonders bevorzugten Anwendung ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Auslese von Bibliotheken genetischer Elemente geeignet. Die Erfindung liefert dementsprechend ein Verfahren gemäß den vorangegangenen Aspekten der Erfindung, wobei die genetischen Elemente aus einer Bibliothek von genetischen Elementen, die ein Repertoire von Genprodukten codieren, isoliert werden. Hierin werden die Begriffe "Bibliothek", "Repertoire" und "Pool" gemäß ihrer ursprünglichen Bedeutung auf dem Gebiet verwendet, nämlich, daß eine Bibliothek von genetischen Elementen ein Repertoire von Genprodukten codiert. Im allgemeinen werden Bibliotheken aus Pools von genetischen Elementen erstellt und besitzen Eigenschaften, welche das Auslesen erleichtern.
Die anfängliche Selektion eines genetischen Elements aus einer Bibliothek von genetischen Elementen unter Verwendung der vorliegenden Erfindung wird in den meisten Fällen die Durchmusterung einer großen Anzahl verschiedener genetischer Elemente erfordern. Bibliotheken von genetischen Elementen können auf eine Vielzahl verschiedener Wege, einschließlich dem folgenden, erzeugt werden.
Pools von natürlich vorkommenden genetischen Elementen können aus genomischer DNA oder cDNA kloniert werden (Sambrook et al., 1989); z.B. haben sich Phagen-Antikörper-Bibliotheken, die durch PCR-Vervielfältigung von Repertoires von Antikörpergenen von immunisierten oder nicht-immunisierten Spendern hergestellt wurden, als sehr effektive Quellen von funktionalen Antikörperfragmenten erwiesen (Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997). Bibliotheken von Genen können auch durch Codieren aller (siehe z.B. Smith, 1985; Parmley und Smith, 1988) oder eines Teils von Genen (siehe z.B. Lowman et al., 1991) oder von Pools von Genen (siehe z.B. Nissim et al., 1994) mittels eines randomisierten oder dotierten synthetischen Oligonukleotids hergestellt werden. Bibliotheken können auch durch Einführen von Mutationen in ein genetisches Element oder einen Pool von genetischen Elementen "auf zufällige Weise" durch eine Vielzahl von Techniken in vivo hergestellt werden, einschließlich der Verwendung von "Mutatorstämmen" von Bakterien, wie E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996), der Verwendung des Antikörper-Hypermutationssystems von B-Lymphozyten (Yelamos et al., 1995). Zufällige Mutationen können auch sowohl in vivo als auch in vitro durch chemische Mutagene und ionisierende oder UV-Strahlung (siehe Friedberg et at., 1995) oder durch Einbau von mutagenen Basenanalogen (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996) eingebracht werden. "Zufällige" Mutationen können auch in vitro während der Polymerisation z.B. durch Verwendung von fehleranfälligen Polymerasen in Gene eingebracht werden (Leung et al., 1989).
Weitere Diversifikation kann unter Anwendung von homologer Rekombination entweder in vivo (siehe Kowalczykowski et al., 1994) oder in vitro (Stemmer, 1994; Stemmer, 1994b) eingebracht werden.
Mutationen können in das/die genetische(n) Element(e) eingebracht werden, wie es oben beschrieben ist.
Die genetischen Elemente codieren vorteilhafterweise Enzyme, vorzugsweise von pharmakologischem oder industriellem Interesse, Aktivatoren oder Inhibitoren, insbesondere für biologische Systeme, wie zelluläre Signalübertragungsmechanismen, Antikörper und Fragmente davon und andere Bindungsmittel, die für diagnostische oder therapeutische Anwendungen geeignet sind. Klinisch oder industriell geeignete Produkte können daher identifiziert und isoliert werden.
Die Auswahl von geeigneten Verkapselungsbedingungen ist erwünscht. Abhängig von der Komplexität und Größe der zu durchmusternden Bibliothek kann es vorteilhaft sein, das Verkapselungsverfahren so einzustellen, daß 1 oder weniger als 1 genetisches Element pro Mikrokapsel verkapselt wird. Dies wird die größte Auflösung liefern. Wenn die Bibliothek größer und/oder komplexer ist, kann dies jedoch unpraktikabel sein; es kann bevorzugt sein, mehrere genetische Elemente zusammen zu verkapseln und sich auf wiederholte Anwendung des Verfahrens der Erfindung zu verlassen, um eine Auslese der gewünschten Aktivität zu erzielen. Eine Kombination von Verkapselungsverfahren kann dazu verwendet werden, die gewünschte Anreicherung zu erreichen.
Theoretische Studien zeigen, je größer die Anzahl an erzeugten Varianten von genetischen Elementen ist, desto wahrscheinlicher ist es, daß ein Molekül mit den gewünschten Eigenschaften erzeugt wird (siehe Perelson und Oster, 1979 für eine Beschreibung, wie dies auf Repertoires von Antikörpern anwendbar ist). Kürzlich wurde auch praktisch bestätigt, daß größere Phagen-Antikörper-Repertoires tatsächlich mehr Antikörper mit besseren Bindungsaffinitäten hervorbringen als kleinere Repertoires (Griffith et al., 1994). Um sicherzustellen, daß seltene Varianten erzeugt werden und somit selektiert werden können, ist eine große Bibliotheksgröße wünschenswert. Daher ist die Verwendung von optimal kleinen Mikrokapseln vorteilhaft.
Das größte Repertoire, das bislang unter Verwendung von Verfahren, die eine in vivo-Stufe erfordern, erzeugt wurde (Phagenpräsentations- und LacI-Systeme), war eine Phagenpeptidbibliothek mit 1,6 × 10¹¹ Klonen, welche die Fermentation von 15 Litern Bakterien erforderte (Fisch et al., 1996). SELEX-Experimente werden häufig mit sehr großen Anzahlen von Varianten (bis zu 10¹⁵) durchgeführt.
Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung bei einem bevorzugten Mikrokapseldurchmesser von 2,6 μm kann eine Repertoiregröße von wenigstens 10¹¹ unter Verwendung von 1 ml wäßriger Phase in einer 20 ml Emulsion selektiert werden.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen genetischen Elementen werden die Mikrokapseln weitere Bestandteile umfassen, die dafür erforderlich sind, daß der Ausleseprozeß stattfindet. Andere Komponenten des Systems können z.B. solche umfassen, die für Transkription und/oder Translation des genetischen Elements notwendig sind. Diese werden hinsichtlich der Erfordernisse eines speziellen Systems unter den folgenden ausgewählt, einem geeigneten Puffer, einem in vitro-Transkriptions/Replikationssystem und/oder einem in vitro-Translationssystem, das alle notwendigen Bestandteile enthält, Enzymen und Cofaktoren, RNA-Polymerase, Nukleotiden, Nukleinsäuren (natürlichen oder synthetischen), Transfer-RNAs, Ribosomen und Aminosäuren und den Substraten der interessierenden Reaktion, um eine Selektion des modifizierten Genprodukts zu erlauben.
Ein geeigneter Puffer wird ein solcher sein, bei dem sämtliche der gewünschten Komponenten des biologischen Systems aktiv sind, und er wird daher von den Anforderungen jedes speziellen Reaktionssystems abhängen. Puffer, die für biologische und/oder chemische Reaktionen geeignet sind, sind auf dem Gebiet bekannt, und Rezepte werden in verschiedenen Labortexten, wie bei Sambrook et al., 1989, bereitgestellt.
Das in vitro-Translationssystem wird üblicherweise einen Zellextrakt enthalten, typischerweise von Bakterien (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), von Kaninchenreticulozyten (Pelham und Jackson, 1976) oder von Weizenkeim (Anderson et al., 1983). Viele geeignete Systeme sind handelsüblich erhältlich (z.B. von Promega), einschließlich einigen, welche gekoppelte Transkription/Translation erlauben (sämtliche der bakteriellen Systeme und die Reticulozyten- und Weizenkeim-TNT^TM-Extrakt-Systeme von Promega). Das verwendete Gemisch von Aminosäuren kann, wenn es erwünscht ist, synthetische Aminosäuren umfassen, um die mögliche Anzahl oder Vielfalt an Proteinen, die in der Bibliothek produziert werden, zu erhöhen. Dies kann durch Beladen von tRNAs mit künstlichen Aminosäuren und Verwenden dieser tRNAs für die in vitro-Translation der zu selektierenden Proteine erreicht werden (Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995).
Nach jeder Runde der Selektion kann die Anreicherung des Pools an genetischen Elementen hinsichtlich solcher, die das interessierende Molekül codieren, durch nicht-abgeteilte Transkriptions/Replikations- oder gekoppelte Transkriptions-Translations-Reaktionen in vitro untersucht werden. Der selektierte Pool wird in einen geeigneten Plasmidvektor kloniert, und RNA oder rekombinantes Protein wird von den einzelnen Klonen für eine weitere Reinigung und Untersuchung hergestellt.
Des weiteren wird ein Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts, wenn ein genetisches Element, welches das Genprodukt codiert, erst einmal nach dem Verfahren der Erfindung ausgelesen wurde, beschrieben. Natürlich kann das genetische Element selbst direkt durch herkömmliche Mittel zur Herstellung des Genprodukts exprimiert werden. Jedoch können auch alternative Techniken verwendet werden, was dem Fachmann auf dem Gebiet klar ist. Zum Beispiel kann die in dem Genprodukt enthaltene genetische Information in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht und davon exprimiert werden.
Es wird auch die Verwendung herkömmlicher Durchmusterungstechniken zur Identifizierung von Verbindungen, welche in der Lage sind, mit den nach dem ersten Aspekt der Erfindung identifizierten Genprodukten in Wechselwirkung zu treten, beschrieben. Eine ein Genprodukt codierende Nukleinsäure kann in einen Vektor aufgenommen und in geeignete Wirtszellen eingebracht werden, um transformierte Zellinien herzustellen, die das Genprodukt exprimieren. Die resultierenden Zellinien können dann für eine reproduzierbare qualitative und/oder quantitative Analyse der Wirkung(en) von potentiellen Wirkstoffen, welche die Funktion des Genprodukts beeinflussen, analysiert werden. Somit können Zellen, die ein Genprodukt exprimieren, für die Identifizierung von Verbindungen, insbesondere Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, verwendet werden, welche die Funktion eines Genprodukts modulieren. Daher sind Wirtszellen, die ein Genprodukt exprimieren, für eine Wirkstoffdurchmusterung geeignet. Es wird auch ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität des Genprodukts modulieren, beschrieben, wobei das Verfahren umfaßt, daß man Zellen, die heterologe DNA enthalten, welche ein Genprodukt codiert, wobei die Zellen funktionales Genprodukt herstellen, an wenigstens eine Verbindung oder ein Gemisch von Verbindungen oder ein Signal, dessen Fähigkeit, die Aktivität des Genprodukts, die man bestimmen will, zu modulieren, aussetzt und anschließend die Zellen hinsichtlich Veränderungen, die durch diese Modulation verursacht werden, beobachtet. Solch ein Test erlaubt die Identifizierung von Modulatoren, wie Agonisten, Antagonisten und allosterischen Modulatoren des Genprodukts. Wie es hierin verwendet wird, bezeichnet eine Verbindung oder ein Signal, das die Aktivität von Genprodukt moduliert, eine Verbindung, welche die Aktivität von Genprodukt in solch einer Weise verändert, daß die Aktivität des Genprodukts in der Gegenwart der Verbindung oder des Signals (im Vergleich zu der Abwesenheit der Verbindung oder des Signals) verändert ist.
Auf Zellen basierende Durchmusterungstests können ausgestaltet werden, indem man Zellinien konstruiert, in welchen die Expression eines Reporterproteins, d.h. eines einfach feststellbaren Proteins, wie b-Galaktosidase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) oder Luciferase, von einem Genprodukt abhängig ist. Solch ein Test erlaubt die Detektion von Verbindungen, die direkt eine Genproduktfunktion modulieren, wie Verbindungen, die einem Genprodukt entgegen wirken, oder Verbindungen, die andere zelluläre Funktionen, die für die Aktivität des Genprodukts erforderlich sind, hemmen oder verstärken.
Ein Verfahren zur exogenen Beeinflussung von genproduktabhängigen Prozessen, die in Zellen stattfinden, wird ebenfalls beschrieben. Rekombinantes Genprodukt herstellende Wirtszellen, z.B. Säugerzellen, können mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden, und die modulierende(n) Wirkung(en) davon kann/können dann durch Vergleich der durch das Genprodukt vermittelten Reaktion in der Gegenwart oder Abwesenheit von Testverbindung oder indem man die durch Genprodukt vermittelte Reaktion von Testzellen oder Kontrollzellen (d.h. Zellen, die kein Genprodukt exprimieren) zu dem Vorhandensein der Verbindung in ein Verhältnis setzt, bestimmt werden.
Des weiteren wird ein Verfahren zur Optimierung eines Herstellungsprozesses beschrieben, welches wenigstens eine Stufe umfaßt, die durch ein Polypeptid erleichtert wird. Zum Beispiel kann die Stufe eine katalytische Stufe sein, die durch ein Enzym erleichtert wird. Somit liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung oder von Verbindungen mit den Stufen, in denen man

(a) ein Syntheseprotokoll bereitstellt, bei dem wenigstens eine Stufe durch ein Polypeptid katalysiert wird,
(b) genetische Elemente herstellt, die Varianten des Polypeptids, welches dieses Stufe erleichtert, codieren,
(c) die genetischen Elemente unter Herstellung von deren jeweiligen Genprodukten exprimiert, so daß die Genprodukte mit den sie codierenden genetischen Elementen verknüpft sind,
(d) die genetischen Elemente in Mikrokapseln abteilt,
(e) die genetischen Elemente, welche Polypeptidgenprodukt(e) mit der gewünschten Aktivität herstellen, ausliest und
(f) die Verbindung oder Verbindungen unter Verwendung des bei (e) angegebenen Polypeptidgenprodukts zur Erleichterung der relevanten Stufe der Synthese herstellt.

Mittels der Erfindung können Enzyme, die an der Herstellung einer Verbindung beteiligt sind, durch Selektion hinsichtlich optimaler Aktivität optimiert werden. Das Verfahren umfaßt die Herstellung von Varianten des zu durchmusternden Polypeptids, welche einer Bibliothek von Polypeptiden gleichgestellt sind, wie es hierin angegeben ist. Die Varianten können auf die gleiche Weise hergestellt werden, wie die an anderer Stelle hierin diskutierten Bibliotheken.
(B) SELEKTIONSVERFAHREN
Das System kann zur Selektion hinsichtlich RNA, DNA oder Proteingenproduktmolekülen mit katalytischer, regulatorischer oder Bindungsaktivität konfiguriert werden.
(i) AFFINITÄTSSELEKTION
Im Falle der Selektion hinsichtlich eines Genprodukts mit Affinität für einen speziellen Liganden kann das genetische Element mit dem Genprodukt in der Mikrokapsel über den Liganden verknüpft sein. Nur Genprodukte mit Affinität für den Liganden werden daher an das genetische Element selbst binden, und daher werden nur genetische Elemente, die aktives Produkt herstellen, in der Selektionsstufe zurückgehalten werden. In dieser Ausführungsform wird das genetische Element somit eine Nukleinsäure umfassen, die das Genprodukt codiert, das mit einem Liganden für das Genprodukt verknüpft ist.
In dieser Ausführungsform enthalten alle der zu selektierenden Genprodukte eine mutmaßliche Bindungsdomäne, hinsichtlich der selektiert werden soll, und ein gemeinsames Merkmal – eine Markierung. Das genetische Element in jeder Mikrokapsel ist physisch mit dem Liganden verknüpft. Wenn das von dem genetischen Element hergestellte Genprodukt Affinität für den Liganden besitzt, wird es an diesen binden und mit dem gleichen genetischen Element, welches es codiert, physisch verknüpft werden, was dazu führt, daß das genetische Element "markiert" wird. Am Ende der Reaktion werden alle Mikrokapseln vereinigt und alle genetischen Elemente und Genprodukte in einer Umgebung miteinander gepoolt. Genetische Elemente, die Genprodukte codieren, welche die gewünschte Bindung aufweisen, können durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Moleküls, das spezifisch an die "Markierung" bindet oder spezifisch mit dieser reagiert, selektiert werden.
In einer alternativen Ausführungsform können genetische Elemente auf der Grundlage, daß das Genprodukt, welches an den Liganden bindet, den Liganden vor z.B. weiteren Bindungspartnern verbirgt, ausgelesen werden. In diesem Fall kann das genetische Element eher selektiv eluiert werden als daß es in einer Affinitätsreinigungsstufe zurückgehalten wird, während andere genetische Elemente gebunden werden.
Die Genprodukte werden zusammen mit den anhängenden genetischen Elementen infolge der Bindung eines Liganden an Genprodukte mit der gewünschten Aktivität ausgelesen. Zum Beispiel können alle Genprodukte einen invarianten Bereich enthalten, welcher kovalent oder nicht-kovalent an das genetische Element bindet, und einen zweiten Bereich, welcher so diversifiziert ist, daß er die gewünschte Bindungsaktivität erzeugt.
Auslese durch Affinität ist von dem Vorhandensein von zwei Mitgliedern eines Bindungspaares unter solchen Bedingungen, daß Bindung stattfinden kann, abhängig. Jedes Bindungspaar kann für diesen Zweck verwendet werden. Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff Bindungspaar jedes Paar von Molekülen, das in der Lage ist, aneinander zu binden. Beispiele für Bindungspaare, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen ein Antigen und einen Antikörper oder ein Fragment davon, welcher/welches in der Lage ist, das Antigen zu binden, das Biotin-Avidin/Streptavidin-Paar (Savage et al., 1994), ein Polypeptid mit calcium-abhängiger Bindung und einen Liganden davon (z.B. Calmodulin und ein Calmodulin bindendes Peptid (Stofko et al., 1992; Montigiani et al., 1996)), Paare von Polypeptiden, welche sich unter Ausbildung eines Leucin-Reißverschlusses zusammenfügen (Tripet et al., 1996), Histidine (typischerweise Hexahistidinpeptide) und cheliertes Cu²⁺, Zn²⁺ und Ni²⁺ (z.B. Ni-NTA; Hochuli et al., 1987), RNA-bindende und DNA-bindende Proteine (Klug, 1995), einschließlich solchen, die Zinkfingermotive enthalten (Klug und Schwabe, 1995), und DNA-Methyltransferasen (Anderson, 1993) und deren Nukleinsäurebindungsstellen.
(ii) KATALYSE
Wenn Selektion hinsichtlich Katalyse durchgeführt wird, kann das genetische Element in jeder Mikrokapsel das Substrat der Reaktion umfassen. Wenn das genetische Element ein Genprodukt codiert, das in der Lage ist, als ein Katalysator zu wirken, dann wird das Genprodukt die Umwandlung des Substrats in das Produkt katalysieren. Daher ist am Ende der Reaktion das genetische Element physisch mit dem Produkt der katalysierten Reaktion verknüpft. Wenn die Mikrokapseln vereinigt und die Reaktanten gepoolt werden, können genetische Elemente, welche katalytische Moleküle codieren, durch Selektieren hinsichtlich jeder Eigenschaft, die für das Produkt spezifisch ist, angereichert werden (1).
Zum Beispiel kann eine Anreicherung durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Moleküls (z.B. eines Antikörpers), das spezifisch an das Produkt bindet, durchgeführt werden. In gleicher Weise kann das Genprodukt die Wirkung haben, daß es eine Nukleinsäurekomponente des genetischen Elements z.B. durch Methylierung (oder Demethylierung) oder Mutation der Nukleinsäure modifiziert, was sie gegen einen Angriff durch Nukleasen, wie Restriktionsendonukleasen, beständig oder dafür empfänglich macht.
Alternativ kann eine Selektion indirekt durch Kopplung einer ersten Reaktion mit anschließenden Reaktionen, die in der gleichen Mikrokapsel stattfinden, durchgeführt werden. Es gibt zwei allgemeine Wege, auf welchen dieses durchgeführt werden kann. Erstens, das Produkt der ersten Reaktion könnte mit einem Molekül umgesetzt oder davon gebunden werden, welches nicht mit dem Substrat der ersten Reaktion reagiert. Eine zweite, gekoppelte Reaktion wird nur in der Gegenwart des Produkts der ersten Reaktion ablaufen. Ein aktives genetisches Element kann dann durch Selektion hinsichtlich der Eigenschaften des Produkts der zweiten Reaktion gereinigt werden.
Alternativ kann das Produkt der Reaktion, welches selektiert wird, das Substrat oder ein Cofaktor für eine zweite enzymkatalysierte Reaktion sein. Das Enzym zur Katalyse der zweiten Reaktion kann entweder in situ in den Mikrokapseln translatiert oder vor der Mikroverkapselung in das Reaktionsgemisch aufgenommen werden. Nur wenn die erste Reaktion abläuft, wird das gekoppelte Enzym ein selektierbares Produkt erzeugen.
Dieses Konzept der Kopplung kann so ausgeführt werden, daß es mehrere Enzyme umfaßt, wobei jedes das Produkt der vorangegangenen Reaktion als ein Substrat verwendet. Dies erlaubt eine Selektion von Enzymen, die nicht mit einem immobilisierten Substrat reagieren werden. Es kann auch so ausgestaltet sein, daß es eine erhöhte Empfindlichkeit durch Signalvervielfältigung liefert, wenn ein Produkt einer Reaktion ein Katalysator oder ein Cofaktor für eine zweite Reaktion oder eine Reihe von Reaktionen, die zu einem selektierbaren Produkt führen, ist (siehe z.B. Johansson und Bates, 1988; Johansson, 1991). Darüber hinaus kann ein Enzymkaskadensystem auf der Herstellung eines Aktivators für ein Enzym oder auf der Zerstörung eines Enzyminhibitors basieren (siehe Mize et al., 1989). Kopplung hat auch den Vorteil, daß ein gemeinsames Selektionssystem für eine ganze Gruppe von Enzymen, welche das gleiche Produkt erzeugen, verwendet werden kann und ermöglicht die Selektion von komplizierten chemischen Umwandlungen, welche nicht in einer einzelnen Stufe durchgeführt werden können.
Solch ein Verfahren der Kopplung ermöglicht somit die Entwicklung neuer "Stoffwechselwege" in vitro in einer stufenweisen Art und Weise, wobei zuerst eine Stufe selektiert und verbessert wird und dann die nächste. Die Selektionsstrategie beruht auf dem Endprodukt des Weges, so daß alle früheren Stufen unabhängig voneinander oder aufeinanderfolgend entwickelt werden können, ohne daß für jede Stufe der Reaktion ein neues Selektionssystem aufgestellt werden muß.
In einer alternativen Art und Weise ausgedrückt, wird ein Verfahren zur Isolierung eines oder mehrerer genetischer Elemente, die ein Genprodukt mit einer gewünschten katalytischen Aktivität codieren, beschrieben, mit den Stufen, bei denen man

(1) genetische Elemente unter Erhalt ihrer entsprechenden Genprodukte exprimiert,
(2) zuläßt, daß die Genprodukte die Umwandlung eines Substrats zu einem Produkt katalysieren, welches anhand der gewünschten Aktivität direkt selektierbar sein kann oder auch nicht,
(3) optional die erste Reaktion mit einer oder mehreren anschließenden Reaktionen koppelt, wobei jede Reaktion von dem Produkt der vorangegangenen Reaktionen moduliert wird und zur Erzeugung eines selektierbaren Endprodukts führt,
(4) das selektierbare Produkt der Katalyse mit den genetischen Elementen verknüpft, indem man entweder a) ein Substrat mit den genetischen Elementen in solch einer Art und Weise koppelt, daß das Produkt mit den genetischen Elementen verbunden bleibt, oder b) das selektierbare Produkt mit den genetischen Elementen mittels einer geeigneten molekularen "Markierung", die an das Substrat gebunden ist, welches an dem Produkt verbleibt, umsetzt oder bindet oder c) das selektierbare Produkt (aber nicht das Substrat) an die genetischen Elemente mittels einer produktspezifischen Reaktion oder Wechselwirkung mit dem Produkt koppelt und
(5) das Produkt der Katalyse zusammen mit dem genetischen Element, an welches es gebunden ist, entweder mittels einer spezifischen Reaktion oder Wechselwirkung mit dem Produkt oder durch Affinitätsreinigung unter Verwendung einer geeigneten molekularen "Markierung", die an das Produkt der Katalyse gebunden ist, selektiert, wobei in den Stufen (1) bis (4) jedes genetische Element und jedes entsprechende Genprodukt in einer Mikrokapsel enthalten ist.

(iii) REGULATION
Ein ähnliches System kann zum Selektieren hinsichtlich regulatorischer Eigenschaften von Enzymen verwendet werden.
In dem Fall der Selektion hinsichtlich eines Regulatormoleküls, welches als ein Aktivator oder Inhibitor eines biochemischen Prozesses wirkt, können die Komponenten des biochemischen Prozesses entweder in situ in jeder Mikrokapsel translatiert oder vor der Mikroverkapselung in das Reaktionsgemisch aufgenommen werden. Wenn das genetische Element, welches selektiert wird, einen Aktivator codieren soll, kann die Selektion hinsichtlich des Produkts der regulierten Reaktion durchgeführt werden, wie es oben in Verbindung mit Katalyse beschrieben ist. Wenn ein Inhibitor gewünscht wird, kann die Selektion hinsichtlich einer chemischen Eigenschaft erfolgen, die für das Substrat der regulierten Reaktion spezifisch ist.
Es wird daher ein Verfahren der Auslese eines oder mehrerer genetischer Elemente, die ein Genprodukt codieren, welches eine gewünschte regulatorische Aktivität aufweist, beschrieben, mit den Stufen, in denen man

(1) genetische Elemente unter Erhalt ihrer entsprechenden Genprodukte exprimiert,
(2) zuläßt, daß die Genprodukte eine biochemische Reaktion oder eine Abfolge gekoppelter Reaktionen gemäß der gewünschten Aktivität in solch einer Weise aktivieren oder hemmen, daß die Erzeugung oder das Überleben eines selektierbaren Moleküls ermöglicht wird,
(3) das selektierbare Molekül mit den genetischen Elementen verknüpft entweder indem man a) das selektierbare Molekül oder das Substrat, von welchem es sich ableitet, an die genetischen Elemente binden läßt oder b) das selektierbare Produkt mit den genetischen Elementen mittels einer geeigneten molekularen "Markierung", die an das Substrat gebunden ist, welches an dem Produkt verbleibt, umsetzt oder bindet, oder c) das Produkt der Katalyse (aber nicht das Substrat) an die genetischen Elemente mittels einer produktspezifischen Reaktion oder Wechselwirkung mit dem Produkt koppelt,
(4) das selektierbare Produkt zusammen mit dem genetischen Element, an welches es gebunden ist, entweder mittels einer spezifischen Reaktion oder Wechselwirkung mit dem selektierbaren Produkt oder durch Affinitätsreinigung unter Verwendung einer geeigneten molekularen "Markierung", die an das Produkt der Katalyse gebunden ist, selektiert, wobei bei den Stufen (1) bis (4) jedes genetische Element und entsprechende Genprodukt in einer Mikrokapsel enthalten ist.

(iv) MIKROKAPSELAUSLESE
Die Erfindung liefert die Auslese intakter Mikrokapseln, wobei dies durch die verwendete Auslesetechnik ermöglicht wird. Mikrokapseln können als solche ausgelesen werden, wenn die durch das erwünschte Genprodukt ausgelöste Veränderung entweder an der Oberfläche der Mikrokapsel auftritt oder sich selbst manifestiert oder von außerhalb der Mikrokapsel feststellbar ist. Die Veränderung kann durch die direkte Wirkung des Genprodukts verursacht werden oder indirekt, wobei eine Reihe von Reaktionen, von denen eine oder mehrere das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität einbeziehen, zu der Veränderung führt. Zum Beispiel kann die Mikrokapsel so ausgestaltet sein, daß das Genprodukt an ihrer Oberfläche dargeboten wird und somit für Reagenzien zugänglich ist. Wenn die Mikrokapsel eine membranartige Mikrokapsel ist, kann das Genprodukt angesteuert werden oder die Ansteuerung eines Moleküls auf die Membran der Mikrokapsel verursachen. Dies kann z.B. dadurch erzielt werden, daß man eine Membranlokalisationssequenz verwendet, wie solche, die von Membranproteinen abgeleitet sind, welche die Aufnahme eines fusionierten oder verknüpften Moleküls in die Mikrokapselmembran fördert. Alternativ wird, wenn die Mikrokapsel durch Phasentrennung gebildet ist, wie bei Wasser-in-Öl-Emulsionen, ein Molekül, welches Teile aufweist, die in der Phase außerhalb der Kapsel besser löslich sind, sich selbst so anordnen, daß es an der Grenze der Mikrokapsel vorhanden ist.
Nach einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird die Mikrokapselauslese auf Auslesesysteme angewendet, welche auf einer Veränderung der optischen Eigenschaften der Mikrokapsel beruhen, z.B. Absorptions- oder Emissionseigenschaften davon, z.B. Veränderung der optischen Eigenschaften der Mikrokapsel, die aus einer Reaktion resultieren, die zu Veränderungen in der Absorption, Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz, welche mit der Mikrokapsel einhergehen, führt. All diese Eigenschaften sind in dem Begriff "optisch" enthalten. In solch einem Fall können Mikrokapseln durch lumineszenz-, fluoreszenz- oder phosphoreszenzaktivierte Auslese ausgelesen werden. Bei einer sehr bevorzugten Ausführungsform wird fluoreszenzaktivierte Auslese dazu verwendet, Mikrokapseln auszulesen, in welchen die Produktion eines Genprodukts mit einer gewünschten Eigenschaft mit der Produktion eines Fluoreszenzmoleküls in der Zelle einhergeht. Zum Beispiel kann das Genprodukt selbst fluoreszent sein, z.B. ein Fluoreszenzprotein wie GFP. Alternativ kann das Genprodukt die Fluoreszenz eines anderen Moleküls, wie beispielsweise indem es daran bindet oder mit ihm reagiert, auslösen oder modifizieren.
(v) MIKROKAPSELIDENTIFIZIERUNG
Mikrokapseln können anhand einer Veränderung, die durch das gewünschte Genprodukt induziert wird, welches entweder an der Oberfläche der Mikrokapsel auftritt oder sich selbst manifestiert oder von außen feststellbar ist, wie es in Abschnitt iii (Mikrokapselauslese) beschrieben ist, identifiziert werden. Diese Veränderung wird, wenn sie identifiziert wird, dazu verwendet, die Modifikation des Gens in dem Kompartiment auszulösen. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung beruht die Mikrokapselidentifizierung auf einer Veränderung in den optischen Eigenschaften der Mikrokapsel, welche von einer Reaktion herrühren, die zu Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz in der Mikrokapsel führt. Eine Modifikation des Gens in den Mikrokapseln würde durch Identifizierung von Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz ausgelöst werden. Zum Beispiel können Identifizierung von Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz ein Bombardement des Kompartiments mit Photonen (oder anderen Partikeln oder Wellen), welche zu einer Modifikation des genetischen Elements führt, auslösen. Ein ähnliches Verfahren wurde zuvor für die schnelle Auslese von Zellen beschrieben (Keij et al., 1994). Eine Modifikation des genetischen Elements kann z.B. von der Kopplung einer molekularen "Markierung" herrühren, welche durch eine photolabile Schutzgruppe an dem genetischen Element gefangen ist; ein Bombardement mit Photonen einer geeigneten Wellenlänge führt zu der Entfernung des Käfigs. Anschließend werden alle Mikrokapseln vereinigt und die genetischen Elemente zusammen in einer Umgebung gepoolt. Genetische Elemente, die Genprodukte codieren, welche die gewünschte Eigenschaft aufweisen, können durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Moleküls, das spezifisch an die "Markierung" bindet oder mit dieser spezifisch reagiert, selektiert werden.
(vi) MEHRSTUFIGES VERFAHREN
Es ist auch klar, daß es gemäß der vorliegenden Erfindung nicht für alle Prozesse der Transkription/Replikation und/oder Translation und Selektion erforderlich ist, daß sie in einer einzelnen Stufe ablaufen, wobei alle Reaktionen in einer Mikrokapsel stattfinden. Das Selektionsverfahren kann zwei oder mehr Stufen umfassen. Zuerst kann Transkription/Replikation und/oder Translation jedes genetischen Elements einer Bibliothek von genetischen Elementen in einer ersten Mikrokapsel stattfinden. Jedes Genprodukt wird dann mit dem genetischen Element verknüpft, welches dieses codiert (welches in der gleichen Mikrokapsel sitzt). Die Mikrokapseln werden dann aufgebrochen und die genetischen Elemente, die an ihre jeweiligen Genprodukte gebunden sind, optional gereinigt. Alternativ können die genetischen Elemente unter Verwendung von Verfahren, die nicht auf Verkapselung beruhen, an ihre jeweiligen Genprodukte gebunden werden. Zum Beispiel Phagenpräsentation (Smith, G.P., 1985), Polysompräsentation (Mattheakkis et al., 1994), RNA-Peptid-Fusion (Roberts und Szostak, 1997) oder lac-Repressorpeptidfusion (Cull et al., 1992).
In der zweiten Stufe des Verfahrens wird jedes gereinigte genetische Element, das an sein Genprodukt gebunden ist, in eine zweite Mikrokapsel gebracht, welche Komponenten der zu selektierenden Reaktion enthält. Diese Reaktion wird dann eingeleitet. Nach Abschluß der Reaktionen werden die Mikrokapseln wieder aufgebrochen und die modifizierten genetischen Elemente selektiert. Im Falle von komplizierten mehrstufigen Reaktionen, in welchen viele einzelne Komponenten und Reaktionsstufen beteiligt sind, kann einer oder können mehrere Zwischenstufen zwischen der anfänglichen Stufe der Erzeugung und Verknüpfung des Genprodukts mit dem genetischen Element und der abschließenden Stufe der Erzeugung der selektierbaren Veränderung in dem genetischen Element durchgeführt werden.
(vii) SELEKTION DURCH AKTIVIERUNG VON REPORTERGENEXPRESSION IN SITU
Das System kann so konfiguriert werden, daß die gewünschte Bindungs-, katalytische oder regulatorische Aktivität, die von einem genetischen Element codiert wird, direkt oder indirekt zu der Aktivierung der Expression eines "Reportergens", das in allen Mikrokapseln vorhanden ist, führt. Nur Genprodukte mit der gewünschten Aktivität aktivieren die Expression des Reportergens. Die aus der Reportergenexpression resultierende Aktivität erlaubt die Selektion des genetischen Elements (oder des Kompartiments, welches dieses enthält) nach irgendeinem der hierin beschriebenen Verfahren.
Zum Beispiel kann eine Aktivierung des Reportergens die Folge einer Bindungsaktivität des Genprodukts in einer zu dem "Zwei-Hybrid-System" (Fields und Song, 1989) analogen Art und Weise sein. Aktivierung könnte auch aus dem Produkt einer Reaktion, die von einem gewünschten Genprodukt katalysiert wird, resultieren. Zum Beispiel könnte das Reaktionsprodukt ein Transkriptionsauslöser des Reportergens sein. Zum Beispiel könnte Arabinose dazu verwendet werden, Transkription von dem araBAD-Promotor zu induzieren. Die Aktivität des gewünschten Genprodukts könnte auch zu der Modifikation eines Transkriptionsfaktors führen, was in einer Expression des Reportergens resultiert. Zum Beispiel, wenn das gewünschte Genprodukt eine Kinase oder Phosphatase ist, kann die Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines Transkriptionsfaktors zur Aktivierung von Reportergenexpression führen.
(viii) VERVIELFÄLTIGUNG
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt das Verfahren die weitere Stufe der Vervielfältigung der genetischen Elemente. Selektive Vervielfältigung kann als ein Mittel zur Anreicherung von genetischen Elementen, welche das gewünschte Genprodukt codieren, verwendet werden.
In allen der oben genannten Konfigurationen kann genetisches Material, das in den genetischen Elementen enthalten ist, vervielfältigt und das Verfahren in aufeinanderfolgenden Stufen wiederholt werden. Vervielfältigung kann durch die Polymerasekettenreaktion (Saiki et al., 1988) durchgeführt werden oder unter Verwendung einer aus einer Vielzahl anderer Genvervielfältigungstechniken, einschließlich Qβ-Replikase-Vervielfältigung (Cahill, Foster und Mahan, 1991; Chetverin und Spirin, 1995; Katanaev, Kurnasov und Spirin, 1995), der Ligasekettenreaktion (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991), dem selbsttragenden Sequenzreplikationssystem (Fahy, Kwoh und Gingeras, 1991) und der Strangverdrängungsvervielfältigung (Walker et al., 1992).
(ix) ABTEILUNG
Es wird auch ein Verfahren zur Abteilung eines genetischen Elements und zur Expression des genetischen Elements unter Herstellung von dessen Genprodukt in dem Kompartiment beschrieben, mit den Stufen, in denen man

(a) eine wäßrige Lösung herstellt, die das genetische Element und die Komponenten, die zur Expression desselben zur Herstellung von dessen Genprodukt notwendig sind, enthält,
(b) die Lösung unter Ausbildung einer diskreten Mikrokapsel, welche das genetische Element enthält, mikroverkapselt und
(c) die Mikrokapsel Bedingungen aussetzt, die geeignet sind, daß die Expression des genetischen Elements unter Herstellung von dessen Genprodukt abläuft.

Geeignete Mikroverkapselungstechniken sind in der vorangegangenen allgemeinen Beschreibung ausführlich beschrieben.
Erfindungsgemäß können eine Bibliothek von genetischen Elementen, die ein Repertoire von Genprodukten codieren, nach dem oben beschriebenen Verfahren verkapselt und die genetischen Elemente unter Herstellung ihrer jeweiligen Genprodukte exprimiert werden. Mikroverkapselung kann durch Ausbildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion der wäßrigen Lösung, welche das genetische Element enthält, erreicht werden.
Verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den nachfolgenden Beispielen erläutert. Es versteht sich, daß Modifikationen an Details vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
BEISPIELE
Beispiel 1.
Die Herstellung von wäßrigen Mikrokapseln von etwa 2 μm in einem Wasser-in-Öl-Emulsionssystem.
Mikrokapseln innerhalb des bevorzugten Größenbereichs der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems erzeugt werden.
Leichtes, weißes Mineralöl (Sigma; M-3516) wird hierin als die kontinuierliche Phase verwendet, und die Emulsion wird durch die Emulgiermittel Sorbitanmonooleat (Span 80, Fluka; 85548) und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80, Sigma Ultra; P-8074) und in einigen Fällen auch mit 0,5% w/v Natriumdesoxycholat (Fluka; 30970) stabilisiert.
Die Ölphase wird frisch hergestellt, indem man 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka) in Mineralöl (Sigma, #M-5904) löst, gefolgt von 0,5% (v/v) Tween 80 (Sigma Ultra; #P-8074). Eisgekühlte in vitro-Reaktionsgemische (50 μl) werden stufenweise (in 5 aliquoten Teilen von 10 μl über ~2 Minuten) zu 0,95 ml eisgekühlter Ölphase in einem 5 ml Costar Biofreeze-Gefäß (#2051) unter Rühren mit einem Magnetrührer (8 × 3 mm mit einem Kolbenring; Scientific Industries International, Loughborough, UK) hinzugefügt. Rühren (bei 1150 U.p.M.) wird für eine weitere Minute auf Eis fortgesetzt. In einigen Emulsionen wird die wäßrige Phase mit einem anionischen Detergens, z.B. Natriumdesoxycholat, Natriumcholat, Natriumglycocholat und Natriumtaurocholat, typischerweise bis 0,5% (w/v), versetzt.
Wenn es angegeben ist, wird die Emulsion weiter unter Verwendung eines Ultra-Turrax T25-Dispergierers (IKA), der mit einem Dispergierwerkzeug mit 8 mm Durchmesser ausgestattet ist, bei 8000, 9000 oder 13500 U.p.M. für 1 Minute oder bei 20000 U.p.M. für 1 oder 5 Minuten auf Eis homogenisiert. Dies reduziert die Mikrokapselgröße.
Die Reaktion kann abgeschreckt und die Emulsion, wie es in einzelnen Beispielen angegeben ist, durch Zentrifugieren bei 3000 g für 5 Minuten und Entfernen der Ölphase gebrochen werden, wobei die konzentrierte Emulsion am Boden des Reaktionsgefäßes zurückbleibt. Abschreckpuffer (typischerweise 0,2 ml 25 μg/ml Hefe-RNA in W+B-Puffer: 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) und 2 ml wassergesättigter Diethylether werden hinzugefügt und das Gemisch Vortexmischen unterzogen, kurz zentrifugiert und die Etherphase entfernt. Die wäßrige Phase wird mit Ether gewaschen und getrocknet (5 Minuten in einer Speedvac bei Umgebungstemperatur).
Die Größenverteilung der wäßrigen Tröpfchen in den Emulsionen wurde durch Laserdiffraktion unter Verwendung eines Coulter LS230-Teilchengrößenanalysierers bestimmt. Ein in Mineralöl frisch verdünnter (1:10) aliquoter Teil von Emulsion wird zu der Mikrovolumenkammer, welche gerührtes Mineralöl enthält, hinzugefügt. Die Ergebnisse werden mit dem in dem Instrument eingebauten Mie-Optikmodell unter Verwendung von Brechungsindizes von 1,468 für Mineralöl und 1,350 für die wäßrige Phase analysiert. Die Größenverteilung der wäßrigen Tröpfchen in der Emulsion ist in 2 gezeigt. Eine Zugabe von Natriumdesoxycholat verändert die Größenverteilung nicht signifikant.
Beispiel 2.
Effiziente in vitro-Transkriptionsreaktionen, die in den wäßrigen Mikrokapseln einer Wasser-in-Öl-Emulsion durchgeführt werden.
Um RNA von DNA in jeder Mikrokapsel herzustellen, muß das einzelne DNA-Molekül, das in jeder wäßrigen Mikrokapsel des Systems vorhanden ist, effizient transkribiert werden. Hierin wird in vitro-Transkription in Mikrokapseln gezeigt.
Der katalytische Kern des selbstspleißenden Introns von Tetrahymena ist ein vieluntersuchtes Ribozym, welches eine Vielzahl von Phosphorestertransferreaktionen katalysieren kann (Sag et al., 1986; Sag und Czech, 1986; Sag und Czech, 1986). Zum Beispiel kann ein modifiziertes Tetrahymena-Intron, dem die P1-Stammschleife von dem 5'-Ende und die 3'-Stammschleifen P9.1 und P9.2 fehlen, als eine RNA-Ligase wirken, welche effizient zwei oder mehr Oligonukleotide, die an einem Matrizenstrang angeordnet sind, zusammenspleißen (Green und Szostak, 1992).
DNA, welche das oben beschriebene Tetrahymena-Ribozym codiert, wird mittels PCR unter Verwendung von Primern P2T7Ba (welcher an den P2-Schleifenbereich annealt und einen T7-RNA-Polymerasepromotor anhängt) und P9Fo (welcher an den P9-Schleifenbereich annealt) vervielfältigt. Dies erzeugt ein DNA-Fragment von 331 Basenpaaren, welches den T7-RNA-Polymerasepromotor trägt. Dieses Fragment wird direkt unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt und als die Matrize für eine in vitro-Transkriptionsreaktion unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase verwendet.
In vitro-Transkription wird über einen anfänglichen Zeitraum von 10 Minuten untersucht, während dessen die Reaktionsrate im wesentlichen linear ist (Chamberlin und Ring, 1973). Reaktionsbedingungen für die Transkription sind bei Wyatt et al., 1991, beschrieben.
Einbau von [γ³²P]-UTP wird dazu verwendet, das Voranschreiten der Reaktion zu untersuchen.
Eine Transkriptionsreaktion wird in einem Volumen von 200 μl angesetzt und in 2 aliquote Teile aufgeteilt, von denen jeder 3 × 10¹¹ DNA-Moleküle (5 nM) enthält. Ein aliquoter Teil von 100 μl wird zu 2 ml leichtem Mineralöl von Sigma, welches 4,5% Span 80 und 0,5% Tween 80 enthält, hinzugefügt und für 5 Minuten mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 20000 U.p.M. wie in Beispiel 1 homogenisiert. Auf der Grundlage des mittleren Mikrokapselvolumens in diesen Emulsionen (2,8 × 10^–19 m³ für eine Mikrokapsel mit 0,81 μm Durchmesser) würde die Reaktion von 100 μl auf 3,6 × 10¹¹ Mikrokapseln aufgeteilt werden. Daher sollte durchschnittlich ein Molekül DNA pro Mikrokapsel vorhanden sein.
Beide aliquoten Teile werden in einem Wasserbad mit 37°C inkubiert. Proben von 0,5 ml der Emulsion werden sowohl vor dem Start der Inkubation als auch nach 10 Minuten abgenommen und auf Eis gestellt. In gleicher Weise werden Proben von 25 μl von den nicht-emulgierten Kontrollreaktionen zur gleichen Zeit abgenommen. Die Emulsionen werden gebrochen und die Reaktionen mit 0,5 ml EDTA (50 mM) und 2 ml mit Wasser gesättigtem Diethylether gestoppt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. 100 μl Lachssperma-DNA (500 μg/ml) in 20 mM EDTA werden dann hinzugefügt. Drei aliquote Teile von 100 μl werden dann von beiden Emulsionen und den Kontrollen abgenommen, und markierte RNA wird mittels TCA-Präzipitation und Szintillationszählung untersucht.
Die Transkriptionsrate wird als die Zunahme an säurewahrnehmbaren cpm über die 10-minütige Inkubation bei 37°C angesehen. In der nicht-emulgierten Kontrollreaktion sind 442000 cpm säurewahrnehmbares Material im Vergleich zu 147000 cpm in der Emulsion. Daher beträgt die Transkriptionsrate in der Emulsion 33% von derjenigen, die man in der nicht-emulgierten Kontrollreaktion findet.
Dieses Verfahren zeigt daher, daß RNA mittels T7-RNA-Polymerase in den wäßrigen Mikrokapseln einer Wasser-in-Öl-Emulsion effizient synthetisiert werden kann.
Beispiel 3.
Effizient gekoppelte in vitro-Transkriptions/Translations-Reaktionen, die in den wäßrigen Mikrokapseln einer Wasser-in-Öl-Emulsion durchgeführt werden.
Um Proteine unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zu synthetisieren, muß die Translation in den wäßrigen Mikrokapseln der hierin beschriebenen Wasser-in-Öl-Emulsion aktiv sein.
Hierin wird gezeigt, wie ein Protein (E. coli-Dihydrofolatreduktase) effizient von DNA in den wäßrigen Mikrokapseln eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems unter Verwendung eines gekoppelten Transkriptions/Translations-Systems hergestellt werden kann.
Das E. coli folA-Gen, welches Dihydrofolatreduktase (DHFR) codiert, wird mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide EDHFRFo und EDHFRBa vervielfältigt. Diese DNA wird dann in den Vektor pGEM-4Z (Promega), der mit HindIII und KpnI verdaut wurde, abstromig zu sowohl dem lac-Promotor als auch dem T7-RNA-Polymerase-Promotor kloniert. Das Oligonukleotid EDHFRBa hängt die effiziente Translationsstartstelle des Gens 10 des Phagen T7 aufstromig zu dem DHFR-Startcodon an.
DNA-Sequenzierung identifiziert einen Klon, welcher die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Von Bakterien, die mit diesem Klon (pGEM-folA) transformiert sind, wurde gefunden, daß sie aktive DHFR (gesteuert von dem lac-Promotor) überexprimieren, wenn sie mit IPTG induziert werden.
Das pGEM-folA-Plasmid wird dann mittels PCR unter Verwendung der Primer LMB2 und LMB3 unter den oben beschriebenen Bedingungen unter Erzeugung eines 649bp DNA-Fragmentes, welches den T7-RNA-Polymerase-Promotor, die Translationsstartstelle des Gens 10 des Phagen T7 und das folA-Gen trägt, vervielfältigt. Dieses PCR-Fragment wird direkt unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt und dazu verwendet, ein prokaryontisches gekoppeltes Transkriptions/Translationssystem in vitro, das für lineare Matrizen ausgelegt ist, zu codieren (Lesley, Brow und Burgess, 1991).
Es wird eine handelsübliche Präparation dieses Systems (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega) verwendet, das mit T7-RNA-Polymerase versetzt ist.
Eine Translationsreaktion von 300 μl, welche 3 × 10¹² Moleküle DNA enthält, wird auf Eis angesetzt. T7-RNA-Polymerase (10⁴ Einheiten) wird hinzugefügt, um die Transkription voranzutreiben, und das translatierte Protein wird durch die Zugabe von [³⁵S]-Methionin markiert. Ein aliquoter Teil von 150 μl dieser Reaktion wird zu 2,85 ml leichtem Mineralöl von Sigma, das 4,5% Span 80 und 0,5% Tween 80 enthält, hinzugefügt und für 1 Minute mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 20000 U.p.M. wie in Beispiel 1 homogenisiert. Die anderen aliquoten Teile werden nicht emulgiert.
Auf der Grundlage des mittleren Mikrokapselvolumens in den Emulsionen (1,1 × 10^–18 m³ für eine Mikrokapsel mit 1,29 μm Durchmesser) würde die Reaktion von 150 μl auf 1,3 × 10¹¹ Mikrokapseln aufgeteilt werden. Daher sollten ungefähr 11 Moleküle DNA pro Mikrokapsel vorliegen.
Vier aliquote Teile von 0,5 ml werden von dem Emulsionsreaktionsgemisch abgenommen. Ein aliquoter Teil wird unmittelbar auf Eis gestellt und die anderen drei werden in einem Wasserbad bei 25°C für 2 Stunden inkubiert, bevor sie auf Eis gestellt werden. Vier Proben von 25 μl werden auch von dem nicht-emulgierten Reaktionsgemisch abgenommen; eine wird unmittelbar auf Eis gestellt und die anderen drei werden in einem Wasserbad bei 25°C für 2 Stunden inkubiert und dann auf Eis gestellt.
Die Emulsionen werden in einer Mikrozentrifuge bei 13000 U.p.M. für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert und das Mineralöl abgenommen, wobei die konzentrierte (aber nach wie vor intakte) Emulsion am Boden des Röhrchens zurückbleibt. Nach kurzem erneutem Zentrifugieren und Abnehmen jedes weiteren Mineralöls wird die Emulsion gebrochen und jede weitere Translation durch Zugabe von 100 μl Wasser, welches 125 μg/ml Puromycin enthält, und 1 ml mit Wasser gesättigtem Diethylether gestoppt. Dieses Gemisch wird Vortexmischen unterzogen und erneut in einer Mikrozentrifuge für 1 Minute bei 13000 U.p.M. bei 4°C zentrifugiert. Der Ether und das gelöste Mineralöl werden dann durch Absaugen entfernt und die Extraktion mit einem weiteren 1 ml Ether wiederholt. Jeglicher zurückbleibender Ether wird durch Zentrifugieren für 5 Minuten in einer Speedvac bei Raumtemperatur ausgetrieben.
100 μl Wasser, welche 125 μg/ml Puromycin enthalten, werden auch zu den 25 μl nicht-emulgierten Kontrollreaktionen hinzugefügt. 25 μl jeder der Proben werden dann mit Aceton präzipitiert und auf einem 20%-igen SDS-PAGE-Gel nach den von den Herstellern des in vitro-Transkriptions/Translations-Systems (Promega) angegebenen Anleitungen laufen gelassen. Das Gel wird getrocknet und unter Verwendung eines PhosphorImager (Molecular Dynamics) abgetastet. Man sieht eine einzelne starke Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht von DHFR (18 kD) sowohl in den Reaktionen, die in Emulsionen durchgeführt wurden, als auch in den Kontrollen. Diese Bande wird genau quantifiziert.
In den emulgierten Reaktionen beträgt die mittlere Fläche unter dem 18 kD Peak 15073 Einheiten, wogegen die mittlere Fläche unter dem gleichen Peak in den nicht-emulgierten Kontrollreaktionen 18990 Einheiten beträgt. Daher wird in den emulgierten Reaktionen die Menge an DHFR-Protein mit 79% von derjenigen, die man in den nicht-emulgierten Kontrollreaktionen findet, berechnet. Dies zeigt daher, daß das Transkriptions/Translations-System in dem Wasser-in-Öl-Emulsionssystem der vorliegenden Erfindung wirksam ist.
Beispiel 4.
Dihydrofolatreduktase, die unter Verwendung der gekoppelten in vitro-Transkriptions/Translations-Reaktionen hergestellt wird, ist aktiv.
Hier wird gezeigt, daß Protein (E. coli Dihydrofolatreduktase) effizient in einer katalytisch aktiven Form durch gekoppelte Transkription/Translation des folA-Gens in den wäßrigen Mikrokapseln eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems hergestellt werden kann. In diesem Test wird eine Emulsion verwendet, die Mikrokapseln unterhalb der optimalen Größe enthält; von DHFR-Aktivität wird gezeigt, daß sie in den größeren Mikrokapselgrößen höher ist.
Es werden Translationsreaktionen von 175 μl (unmarkiert), welche entweder 2 × 10¹¹, 6 × 10¹² oder 1,8 × 10¹² Moleküle der folA-Matrizen-DNA, welche in Beispiel 3 verwendet wurde, oder keine DNA enthalten, auf Eis angesetzt. T7-RNA-Polymerase (6 × 10³ Einheiten) werden zu jeder Reaktion hinzugefügt, um die Transkription voranzutreiben.
Ein aliquoter Teil von 100 μl von jeder Reaktion wird zu 1,9 ml leichtem Mineralöl von Sigma, welches 4,5% Span 80 und 0,5% Tween 80 enthält, hinzugefügt und für 1 Minute oder 5 Minuten mit einem Ultra-Turrax T25-Homogenisierer, der mit einem Dispergierwerkzeug mit 8 mm Durchmesser ausgestattet ist, bei 20000 U.p.M. wie in Beispiel 1 homogenisiert. Nach Homogenisierung für 1 Minute ist der mittlere Durchmesser der Teilchen (bezogen auf das Volumen) 1,30 μm (Mittelwert 1,28 μm). 98 Volumen-% der inneren (wäßrigen) Phase ist in Teilchen vorhanden, die von 0,63 μm bis 2,12 μm variieren. Nach Homogenisierung für 5 Minuten beträgt der mittlere Durchmesser der Kapseln (bezogen auf das Volumen) 0,81 μm (Mittelwert 0,79 μm), und 98 Volumen-% der inneren (wäßrigen) Phase ist in Teilchen vorhanden, die von 0,41 μm bis 1,38 μm variieren.
Auf der Grundlage des mittleren Mikrokapselvolumens in den Emulsionen von 1 Minute (1,1 × 10^–18 m³ für eine Mikrokapsel mit 1,299 μm Durchmesser) würde die Reaktion von 100 μl auf 8,7 × 10¹⁰ Mikrokapseln aufgeteilt werden. Daher sollten pro Mikrokapsel etwa 1,3, 3,9 oder 11,8 Moleküle DNA vorhanden sein.
Auf der Grundlage des mittleren Mikrokapselvolumens in den Emulsionen von 5 Minuten (2,8 × 10^–19 m³ für eine Mikrokapsel mit einem Durchmesser von 0,81 μm) würden die Reaktionen von 100 μl auf 3,6 × 10¹¹ Mikrokapseln aufgeteilt werden. Daher sollten pro Mikrokapsel etwa 0,3, 1,0 oder 2,9 Moleküle DNA vorhanden sein.
Die Emulsionen und das nicht-emulgierte Reaktionsgemisch werden in einem Wasserbad bei 25°C inkubiert. Proben von 0,5 ml der Emulsion werden unmittelbar vor dem Start der Inkubation und nach 2 Stunden abgenommen und auf Eis gestellt. Proben von 25 μl werden von den nicht-emulgierten Kontrollreaktionen zu den gleichen Zeiten abgenommen.
Die Emulsionen werden in einer Mikrozentrifuge bei 13000 U.p.M. für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert und das Mineralöl durch Absaugen entfernt, wobei die konzentrierte (aber nach wie vor intakte) Emulsion am Boden des Röhrchens zurückbleibt. Nach kurzem erneutem Zentrifugieren und Entfernen jedes weiteren Mineralöls wird die Emulsion gebrochen und jede weitere Translation durch Zugabe von 100 μl Puffer A (100 mM Imidazol, pH 7,0, 10 mM β-Mercaptoethanol), welcher 125 μg/ml Puromycin enthält, und 1 ml mit Wasser gesättigten Diethylether gestoppt. Das Gemisch wird Vortexmischen unterzogen und in einer Mikrozentrifuge bei 13000 U.p.M. für 1 Minute bei 4°C zentrifugiert. Der Ether und gelöstes Mineralöl werden durch Absaugen entfernt und die Reaktion mit einem weiteren 1 ml Ether wiederholt. Jeglicher zurückbleibender Ether wird durch Zentrifugieren für 5 Minuten in einer Speedvac bei Raumtemperatur ausgetrieben. 100 μl Puffer A, welcher (125 μg/ml) Puromycin enthält, wird auch zu den nicht-emulgierten Kontrollreaktionen von 25 μl hinzugefügt.
Dihydrofolatreduktaseaktivität wird beispielsweise durch spektrophotometrische Aufzeichnung der Oxidation von NADPH zu NADP bei 340 nm über einen zeitlichen Verlauf von 10 Minuten untersucht, wie es von Williams et al., 1979; Ma et al., 1993, beschrieben ist. 10 μl jeder abgeschreckten in vitro-Translationsreaktion werden zu 150 μl Puffer A (100 mM Imidazol, pH 7,0, 10 mM β-Mercaptoethanol) und 20 μl 1 mM NADPH hinzugefügt. 20 μl Dihydrofolat (1 mM) (H₂F) werden nach 1 Minute hinzugefügt und die Reaktion bei 340 nm unter Verwendung eines ThermoMax-Mikroplattenlesers (Molecular Devices) aufgezeichnet. Die Aktivität wird durch die anfänglichen Geschwindigkeiten unter Bedingungen von So»K_M (v_max) berechnet. Die Hintergrundaktivität in dem S30-Extrakt wird von allen Proben abgezogen.
DHFR-Aktivität, die in den Emulsionen erzeugt wird, wird von dem Unterschied in der Aktivität, die bei 0 Stunden und 2 Stunden der Inkubation gemessen wird, genommen. Es fand keine Zu nahme der NADPH-Oxidation zwischen den Proben bei 0 Stunden und 2 Stunden statt, wenn 0,1 μM Methotrexat (ein spezifischer Inhibitor von DHFR) zugegeben wurden, was zeigt, daß die gesamte Zunahme der beobachteten NADPH-Oxidation auf die in den in vitro-Translationsreaktionen produzierte DHFR zurückzuführen ist.
Bei Anwendung von 1 Minute Homogenisierung bei 20000 U.p.M. beträgt die in den Emulsionen erzeugte DHFR-Aktivität 31% von derjenigen, die man in den nicht-emulgierten Kontrollreaktionen findet bei 1,3 Molekülen DNA pro Mikrokapsel, 45% bei 3,9 Molekülen DNA pro Mikrokapsel und 84% bei 11,8 Molekülen DNA pro Mikrokapsel.
Bei Anwendung von 5 Minuten Homogenisierung bei 20000 U.p.M. beträgt die in den Emulsionen erzeugte DHFR-Aktivität 7% von derjenigen, die man in den nicht-emulgierten Kontrollreaktionen findet bei 0,3 Molekülen DNA pro Mikrokapsel, 15% bei 1 Molekül DNA pro Mikrokapsel und 35% bei 2,9 Molekülen DNA pro Mikrokapsel im Durchschnitt.
Legt man zugrunde, daß die Umsatzrate von DHFR so ist, wie sie von Posner et al., 1996, beschrieben ist, entspricht dies einer Ausbeute bei der höchsten DNA-Konzentration von 6,3 μg (340 pmol) DHFR pro 100 μl Reaktion (nicht-emulgierte Kontrolle), 1,98 μg (104 pmol) DHFR pro 100 μl Reaktion (emulgiert für 1 Minute) oder 0,46 μg (24,8 pmol) pro 100 μl Reaktion (emulgiert für 5 Minuten). Dies entspricht 74 Molekülen DHFR pro Mikrokapsel in den einminütigen Emulsionen und 44 Molekülen pro Mikrokapsel in den 5-minütigen Emulsionen (unter der Annahme, daß alle Mikrokapseln die mittlere Größe besitzen).
Die DHFR-Aktivität, die aus gekoppelter Transkription/Translation von folA-Genen resultiert, wird auch in den größeren Mikrokapseln, die durch Rühren alleine oder durch Rühren, gefolgt von weiterer Homogenisierung mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 8000 U.p.M., 9000 U.p.M. oder 13500 U.p.M. für 1 Minute hergestellt wurden, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, gemessen. Die Ergebnisse sind in 2b wiedergegeben. Die Konzentration der verwendeten folA-Gene (2,5 nM) liefert einen Durchschnitt von 1, 1,5 und 4,8 genetischen Elementen pro Tröpfchen in den Emulsionen, die bei 13500 U.p.M., 9500 U.p.M. bzw. 8000 U.p.M. homogenisiert wurden, und einen Durchschnitt von 14 genetischen Elementen pro Tröpfchen in der Emulsion, die nur durch Rühren hergestellt wurde. Die Zugabe von Natriumdesoxycholat (0,5%) zu dem in vitro-Translationsreaktionsgemisch beeinflußt die in den gebrochenen Emulsionen beobachtete DHFR-Aktivität nicht signifikant.
Beispiel 5.
Verknüpfung eines immobilisierten Substrats mit einem genetischen Element über ein Protein mit hohem Molekulargewicht.
Um mehrere immobilisierte Substratmoleküle mit einem DNA-Fragment, welches das folA-Gen umfaßt, zu verknüpfen, wird das DNA-Fragment zuerst biotinyliert und anschließend an einen Komplex von Avidin mit Apoferritin gekoppelt. Pferdemilzapoferritin ist ein großes, nahezu kugelförmiges Proteinmolekül mit einem Durchmesser von 12,5 nm, welches daher mehrere Stellen bereitstellt, die mit Substrat derivatisiert werden können (z.B. die ε-Aminogruppe von Oberflächenlysinen). Das pGEM-folA-Plasmid, welches E. coli-DHFR codiert, wird mittels PCR unter Verwendung der Primer LMB3 und 5'-biotinyliertem LMB2 (LMB2-Biotin) unter Erzeugung eines biotinylierten DNA-Fragments mit 649bp, welches den T7-RNA-Polymerase-Promotor, die Translationsstartstelle des Gens 10 des Phagen T7 und das folA-Gen trägt, vervielfältigt (siehe Beispiel 3). Die DNA wird radioaktiv markiert, indem das 500 μl PCR-Reaktionsgemisch mit 100 μCi [α-³²P] dCTP (Amersham; 3000 Ci/mmol) versetzt wird. Das biotinylierte PCR-Fragment wird direkt unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt und die Konzentration spektrophotometrisch bestimmt. Der Prozentsatz an biotinylierter DNA wird durch Bindung an Streptavidin-M-280-Dynabeads (Dynal) und Szintillationszählung untersucht. Es wurde bestimmt, daß 83% der DNA unter Verwendung dieser Technik biotinyliert wird.
Das sequestrierte Eisen wird aus einem handelsüblichen Konjugat von Avidin und Ferritin (Avidin-Ferritin; ungefähr 1,1 mol Ferritin pro mol Avidin; Sigma) durch Dialyse über Nacht (4°C) einer Lösung von Avidin-Ferritin in PBS (1 mg/ml) gegen 0,12 M Thioglycolsäure, pH 4,25, gefolgt von 24 Stunden Dialyse gegen PBS (4°C), wie von Kadir und Moore, 1990, beschrieben, entfernt. Die Entfernung von Eisen wird durch Analyse der Absorptionsspektren überprüft (sequestriertes Fe(III) absorbiert stark bei 310–360 nm).
0,3 pmol radioaktiv markierte, biotinylierte DNA werden mit variierenden molaren Verhältnissen an Avidin-Apoferritin in PBS (Gesamtvolumen 9 μl) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ein aliquoter Teil von 4,5 μl wird abgenommen und der Prozentsatz an DNA, die mit Avidin-Apoferritin komplexiert ist, unter Verwendung eines Bandenverschiebungstests auf einem 1,5%igen Agarosegel untersucht, wie es von Berman et al., 1987, beschrieben ist. Das Gel wird dann getrocknet und unter Verwendung eines PhosphorImager (Molecular Dynamics) abgetastet. Der Prozentsatz an unverschoben verbleibender DNA (d.h. nicht komplexiert mit Avidin-Apoferritin) beträgt 17% (1:1 molares Verhältnis Avidin-Apoferritin:DNA), 15% (5:1 molares Verhältnis Avidin-Apoferritin:DNA) oder 14% (25:1 molares Verhältnis Avidin-Apoferritin:DNA). Dies bedeutet, daß auch bei einem Verhältnis von Avidin-Apoferritin:DNA von 1:1 im wesentlichen die gesamte biotinylierte DNA gebunden wird. Keine Bandenverschiebung wird beobachtet, wenn biotinylierte DNA mit Apoferritin gemischt wird oder wenn nicht-biotinylierte DNA mit Avidin-Apoferritin gemischt wird.
Die verbleibenden 4,5 μl DNA, die mit Avidin-Apoferritin komplexiert sind, werden als die Matrize für eine in vitro-Transkriptions/Translations-Reaktion von 25 μl (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega) verwendet. Nach 2 Stunden bei 25°C wird die Reaktion durch Zugabe von 100 μl Puffer A, welcher Puromycin (125 μg/ml) enthält, gestoppt. Dihydrofolatreduktase-Aktivität wird wie oben durch spektrophotometrische Aufzeichnung der Oxidation von NADPH zu NADP bei 340 nm über einen zeitlichen Verlauf von 10 Minuten untersucht.
10 μl jeder in vitro-Translationsreaktion werden zu 150 μl Puffer A und 20 μl NADPH (1 mM) hinzugefügt. 20 μl Dihydrofolat (1 mM) (die Emulsionen wurden gebrochen und die Reaktionen mit 0,5 ml EDTA (50 mM) und 2 ml mit Wasser gesättigtem Diethylether gestoppt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist) werden nach 1 Minute hinzugefügt und die Reaktion bei 340 nm unter Verwendung eines ThermoMax-Mikroplattenlesers (Molecular Devices) aufgezeichnet. Man findet auch bei dem höchsten Verhältnis von Avidin-Apoferritin:DNA im Vergleich zu einer Kontrolle ohne hinzugefügtes Avidin-Apoferritin keinen Unterschied in der DHFR-Aktivität. Dies zeigt, daß der große Hauptanteil an DNA komplexiert werden kann, ohne die Effizienz der in vitro-Translation zu beeinträchtigen.
Beispiel 6.
Sowohl in vitro-Transkription-Translation als auch DHFR-Aktivität sind in dem gleichen System kompatibel.
Um hinsichtlich der Aktivität von DHFR, die in situ durch gekoppelte Transkription-Translation hergestellt wird, zu selektieren, müssen sowohl die Transkriptions-Translations-Reaktion als auch DHFR in dem gleichen Puffersystem aktiv sein.
Ein direkter Test hinsichtlich DHFR-Aktivität in einem vollständigen E. coli-in vitro-Translationssystem auf der Grundlage der spektrophotometrischen Aufzeichnung der Oxidation von NADPH zu NADP bei 340 nm ist aufgrund der Trübung des S30-Extrakts nicht praktikabel.
Es ist jedoch möglich zu bestimmen, daß DHFR in dem gleichen Puffersystem wie die in vitro-Translation aktiv ist. E. coli-DHFR wird durch IPTG-Induktion von Bakterien, die das Plasmid pGEM-folA enthalten, erhalten und Affinitätsreinigung an einer Methotrexat-Sepharose-Säule unterzogen (Baccanari et al., 1977).
DHFR-Aktivität wird in Puffer A wie oben oder in einem in vitro-Translationsgemisch, das mit der Ausnahme der Substitution von S30-Dialysepuffer (Lesley 1995) (10 mM Tris-Acetat, pH 8,0, 14 mM Magnesiumacetat, 60 mM Kaliumacetat, 1 mM DTT) gegen die S30-Fraktion vollständig ist, verglichen. In jedem Fall beträgt das Gesamtreaktionsvolumen 200 μl, und die Konzentration von NADPH war jeweils 0,1 mM, und Emulsionen wurden gebrochen und Reaktionen mit 0,5 ml EDTA (50 mM) und 2 ml mit Wasser gesättigtem Diethylether gestoppt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Reaktionen wurden spektrophotometrisch bei 340 nm aufgezeichnet. Die Zugabe von 1,75 pmol (1,3 Millieinheiten) E. coli-DHFR liefert anfängliche Raten von –25,77 mOD/min (in Puffer A) und –11,24 mOD/min (in Translationspuffer), weshalb die Reaktion in dem Translationspuffer 44% so effizient ist wie in einem optimierten Puffer (Puffer A).
Darüber hinaus verursacht die Gegenwart des Substrates von DHFR (NADPH und H₂F) bei einer Konzentration von 0,1 mM (entweder alleine oder in Kombination) keine Hemmung der Produktion von aktivem DHFR aus einer zweistündigen gekoppelten Transkriptions-Translations-Reaktion.
Beispiel 7.
Die Aktivität von DHFR auf ein genetisches Element, das ein immobilisiertes Dihydrofolatsubstrat enthält, führt zu der Bindung eines Tetrahydrofolatprodukts, das mit Nukleinsäure, welche DHFR codiert, verknüpft ist.
Es wird ein Peptid synthetisiert, welches drei Glutaminsäuren umfaßt, die über ihre γ-Carboxylate (unter Verwendung von N-Fluorenylmethoxycarbonyl-glutaminsäure-α-benzylester als ein Ausgangsmaterial) mit einem Lysin an dem Carboxylterminus verknüpft sind und wobei Biotin mit deren ε-Aminogruppe verknüpft ist durch Modifizieren von veröffentlichten Verfahren (Krumdiek et al., 1980). Folsäure wird an den Aminoterminus gebunden und die Benzyl- und Trifluoracetamid-Schutzgruppen werden durch alkalische Hydrolyse entfernt, wie es zuvor beschrieben wurde. Das Peptid wird durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und durch Massen- und UV-Spektroskopie charakterisiert. Dieses Folsäurepeptid wird chemisch zu dem entsprechenden Dihydrofolsäurepeptid (unter Verwendung von Dithionat und Ascorbinsäure) und anschließend zu dem entsprechenden Tetrahydrofolsäurepeptid (unter Verwendung von Natriumborhydrid) durch Anwendung veröffentlichter Verfahren (Zakrzewski et al., 1980) reduziert. Diese Umwandlungen werden durch UV-Spektroskopie charakterisiert.
Ein genetisches Element wird konstruiert, indem man durchschnittlich zwei bis drei Moleküle des Folsäurepeptids an Avidin (oder Streptavidin) zusammen mit einem Molekül der DHFR-codierenden, durch PCR vervielfältigten DNA aus dem Plasmid pGEM-folA unter Verwendung der Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO:9) und LMB3 (siehe Beispiel 3) bindet. Die immobilisierte Folsäure wird chemisch zu Dihydrofolat unter Verwendung von Dithionat und Ascorbinsäure reduziert und durch Dialyse gegen Puffer A gereinigt. E. coli-DHFR wird durch IPTG-Induktion von Bakterien, die das Plasmid pGEM-folA enthalten, erhalten und an einer Methotrexat-Sepharose-Säule gereinigt. Durch spektrophotometrische Aufzeichnung der Oxidation von NADPH zu NADP unter Verwendung von 0–10 μM des mit Avidin verknüpften Dihydrofolsäurepeptids und 0–50 μM NADPH wird gezeigt, daß E. coli-DHFR mit der an diesem genetischen Element immobilisierten Dihydrofolsäure reagiert. Somit ist am Ende dieser Reaktion das Produkt Tetrahydrofolat mit dem folA-Gen verknüpft, welches das Enzym (d.h. DHFR) codiert, welches seine Bildung katalysiert.
Um diejenigen Gene zu isolieren, die an das Tetrahydrofolatprodukt gebunden sind, gibt es zwei Ansätze. Der erste beinhaltet die Erzeugung von Phagenpräsentationsantikörpern, die für Tetrahydrofolat spezifisch sind (Hoogenboom, 1997). Der zweite Ansatz beruht auf der Verwendung eines markierten Reagens, welches spezifisch mit dem immobilisierten Produkt, aber nicht mit dem Substrat reagiert. Wir haben ein Molekül synthetisiert, das aus einer Dinitrophenyl-(DNP-)Markierung besteht, die über einen Abstandshalter von 14 Atomen mit Benzaldehyd verknüpft ist. Die Aldehydgruppe reagiert spezifisch mit Tetrahydrofolat unter Bildung eines kovalenten Adukts (Kallen und Jencks, 1966), und Affinitätsreinigung kann unter Verwendung eines Anti-DNP-Antikörpers durchgeführt werden.
Beispiel 8.
Ein alternatives Verfahren zur Selektion hinsichtlich DHFR-Aktivität.
Hinsichtlich der von DHFR katalysierten Reaktion kann durch in situ-Kopplung an eine zweite Reaktion, die von Hefe-Aldehyddehydrogenase katalysiert wird, mit einem "markierten" Substrat selektiert werden.
Anstatt hinsichtlich Genen zu selektieren, die mit einem der Produkte der DHFR-Reaktion verbunden sind (5,6,7,8-Tetrahydrofolat oder NADP⁺), wird die DHFR-Reaktion mit einer zweiten Reaktion gekoppelt. Die Selektion wird in diesem Fall von der Bildung des zweiten Produkts der von DHFR katalysierten Reaktion vermittelt – Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP⁺).
Die Reaktion, die wir für die Kopplung gewählt haben, wird von Hefe-Aldehyddehydrogenase (YAD; EC 1.2.1.5) katalysiert. Dieses Enzym verwendet entweder NAD⁺ oder NADP⁺ bei der Oxidation eines breiten Bereiches an aliphatischen und aromatischen Aldehyden zu ihren entsprechenden Carbonsäuren, wobei in dem Verfahren NADH oder NADPH erzeugt wird. Die Reaktion hat den großen Vorteil, daß sie im wesentlichen irreversibel ist – nämlich Dehydrogenasen (einschließlich DHFR und YAD) katalysieren nicht die Reduktion der Säure zurück zu dem Aldehyd. Da eine große Anzahl an Enzymen, welche Redoxreaktionen katalysieren, NAD⁺ oder NADP⁺ erzeugen, kann die YAD-Reaktion auch bei der Selektion dieser Enzyme verwendet werden und ist nicht alleine auf eine Selektion hinsichtlich Dihydrofolatreduktase beschränkt.
Ein Pentaldehydsubstrat wird synthetisiert und über einen C₂₀-Abstandshalter mit einer DNP-(Dinitrophenyl-)Markierung verknüpft (nachfolgend DNP-PA). Der Oxidation von DNP-PA zu der entsprechenden Säure (DNP-PC) folgt HPLC (Umkehrphasen-C₁₈-Säule; H₂O/CH₃CN-Gradient + 0,1% Trifluoressigsäure; Rückhaltezeiten: DNP-PA, 5,0 Minuten, DNP-PC, 4,26 Minuten). Umwandlung von DNP-PA zu DNP-PC wird nur in der Gegenwart von sowohl YAD als auch NADP+ beobachtet. Die Reaktionen werden auch spektrophotometrisch verfolgt; die Zunahme der Absorption bei 340 nm zeigte, daß NADP+ gleichzeitig in NADPH umgewandelt wird.
Die gekoppelte DHFR-YAD-Reaktion wird unter Verwendung des gleichen HPLC-Tests verfolgt. Das anfängliche Reaktionsgemisch enthielt die Substrate für DHFR – NADPH (50 μm) und 7-8-Dihydrofolat (H₂F; 50 μM), YAD (Sigma, 0,5 Einheiten) und DNP-PA (50 μM) in Puffer mit pH 7,7 (100 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol und 25 mM KCl). Umwandlung von DNP-PA zu DNP-PC wird beobachtet, wenn DHFR zu dem oben genannten Reaktionsgemisch hinzugefügt wird (DHFR 5 nM, 83%; 1,25 nM, 14,5% nach 32 Minuten).
Die Konzentration von DHFR, die in der abgeteilten in vitro-Translation erhalten wird, ist tatsächlich viel höher als 5 nM (siehe Beispiel 4). Die Umwandlung von DNP-PA zu DNP-PC ist in der Abwesenheit von DHFR oder wenn Methotrexat (MTX) – ein starker Inhibitor des Enzyms – vorhanden ist (10 μM), vernachlässigbar. Daher ist die Bildung des zweiten Produkts, DNP-PC, mit der Gegenwart der DHFR verbunden.
Unter Verwendung dieser gekoppelten Reaktion können Proteine, die DHFR-Aktivität verleihen, selektiert werden durch i) Verknüpfen der Gene mit Antikörpern, die spezifisch das Carboxylprodukt von DNP-PA binden, und ii) Isolieren dieser Gene durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-DNP-Antikörpers.
Dieser Ansatz wird mittels eines Routineimmuntests auf der Grundlage des catELISA demonstriert (Tawfik et al., 1993). Mikrotiterplatten werden mit Anti-Kaninchen-Immunglobulinen (Sigma, 10 μg/Napf) beschichtet, gefolgt von polyklonalem Kaninchenserum, das spezifisch Glutarsäurederivate bindet (Tawfik et al., 1993), 1:500 in Phosphatsalzpuffer + 1 mg/ml BSA verdünnt. Die Platten werden gespült und mit BSA blockiert. Die oben beschriebenen Gemische der gekoppelten Reaktion werden in Tris/BSA-Puffer verdünnt (50 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, 10 mg/ml BSA, pH 7,4) und für 1 Stunde inkubiert. Die Platte wird gespült, und ein Anti-DNP-Antikörper (monoklonaler Antikörper der Maus SPE21.11), der in dem gleichen Puffer verdünnt ist (1:10000), wird hinzugefügt und für 1 Stunde inkubiert. Die Platte wird gespült und mit Peroxida se markierter Maus-Antikörper (Jackson) hinzugefügt, gefolgt von einem Peroxidasesubstrat (BM Blue, Boehringer Mannheim). Ein spezifisches Signal wird nur in den Proben der gekoppelten Reaktionen, die DHFR enthielten (zusätzlich zu H₂F, NADPH, YAD und DNP-PA), beobachtet.
Hochspezifische Anti-Carbonsäure-Antikörper (Tawfik et al., 1993) werden für eine Selektion in zwei Formaten verwendet.
In dem ersten wird der Anti-Carbonsäure-Antikörper chemisch an einen Avidin (oder Streptavidin) enthaltenden Komplex mit hohem Molekulargewicht, wie demjenigen, der in Beispiel 5 beschrieben ist, gekoppelt. Biotinylierte DNA, welche DHFR codiert, wird über die Avidin-Biotin-Wechselwirkung gekoppelt, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist. Dieser Komplex wird dann in einem abgeteilten System der gekoppelten Transkription/Translation, welches auch YAD und ein markiertes YAD-Substrat, wie DNP-PA, enthält, eingesetzt. Wenn DHFR-Aktivität in dem Kompartiment vorhanden ist, wird DNP-PA zu DNP-PC umgewandelt. Die an die DNA über den Komplex mit hohem Molekulargewicht gekoppelten Anti-Carbonsäure-Antikörper werden nur DNP-PC-Moleküle und nicht Aldehydmoleküle einfangen. DNA aus solchen Kompartimenten, welche aktive DHFR enthalten (und daher aktive DHFR codieren, wenn nur ein Molekül DNA pro Kompartiment vorhanden ist), werden dann Affinitätsreinigung unter Verwendung von Anti-DNP-Antikörpern unterzogen.
In dem zweiten Format werden mehrere Streptavidinmoleküle zusammen in einem Komplex mit hohem Molekulargewicht gekoppelt, welcher einfach an biotinylierte DNA, die DHFR codiert, gekoppelt werden kann (siehe Beispiel 5). Dieser Komplex wird in einem abgeteilten System gekoppelter Transkription/Translation eingesetzt, welches auch YAD und ein YAD-Substrat, wie MeNPOC-Biotin-Benzaldehyd, enthält. Die Biotingruppe MeNPOC-Biotin-Benzaldehyd wird "eingesperrt" (Sundberg et al., 1995; Pirrung und Huang, 1996), d.h. sie kann von Avidin oder Streptavidin nicht gebunden werden, bis eine photoentfernbare Nitrobenzylgruppe durch Bestrahlung mit Licht abgespalten wurde. Wenn DHFR-Aktivität in dem Kompartiment vorhanden ist, wird der MeNPOC-Biotin-Benzaldehyd zu MeNPOC-Biotin-Benzoesäure umgewandelt. Nachdem die abgeteilte Reaktion für eine Weile abgelaufen ist, wird die Reaktion mit Licht bestrahlt und die Nitrobenzylgruppe entfernt, und die Verbindung wird an den Streptavidin-DNA-Komplex binden. DNA in solchen Kompartimenten, welche aktive DHFR enthalten (und daher aktive DHFR codieren, wenn nur ein Molekül DNA pro Kompartiment vorhanden ist), wird mit Biotin-Benzoesäure (anstelle von Biotin-Benzaldehyd) komplexiert und kann unter Verwendung von immobilisierten Anti-Benzoesäure-Antikörpern Affinitätsreinigung unterzogen werden.
Die Gegenwart anderer Enzyme, welche die Oxidation von NAD⁺ oder NADP⁺ zu NADH oder NADPH katalysieren können, in dem in vitro-Transkriptions/Translations-System kann es unter Umständen erschweren, dieses YAD-System für eine Selektion direkt in dem abgeteilten in vitro-Transkriptions/Translations-System zu verwenden. In diesem Fall wird die Selektion unter Verwendung des früher beschriebenen Zwei-Stufen-Abteilungssystems durchgeführt. Das heißt, die DHFR wird zuerst in Kompartimenten translatiert und anschließend in dem gleichen Kompartiment mittels einer geeigneten Affinitätsmarkierung mit der DNA verknüpft. Die Emulsion wird gebrochen, die Inhalte der Kompartimente gepoolt und die DNA durch Affinität weg von den anderen Bestandteilen des Transkriptions/Translations-Systems (einschließlich verunreinigenden Oxidoreduktasen) durch Verwendung von Antikörpern, die für eine Digoxigenin-„Markierung" spezifisch sind, welche an ein Ende des DNA-Moleküls gebunden ist, gereinigt. Die gereinigten DNA-Moleküle werden dann zusammen mit dem anhaftenden DHFR-Protein in ein Reaktionsgemisch gegeben, welches die Substrate für DHFR enthält – NADPH (50 μM) und 7-8-Dihydrofolat (H₂F; 50 μM), YAD (Sigma, 0,5 Einheiten) und DNP-PA (50 μM) in Puffer mit pH 7,7 (100 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol und 25 mM KCl), und die Reaktion wird erneut durch Emulgieren abgeteilt, um nur ein oder höchstens wenige Moleküle DNA pro Kompartiment zu erhalten. Anti-Carbonsäure-Antikörper (Tawfik et al., 1993) werden für die Selektion in jedem der zwei oben beschriebenen Formate eingesetzt.
Beispiel 9.
Methylierung von genetischen Elementen durch Genprodukte.
DNA-Methyltransferasen, die durch in vitro-Transkription/Translation in den wäßrigen Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt werden, methylieren die DNA-Moleküle, welche sie in den Kompartimenten codieren.
Die Selektion von Proteinen mit Bindungs- oder katalytischen Aktivitäten unter Verwendung des hier beschriebenen Abteilungssystems weisen zwei grundlegende Anforderungen auf: i) Ein einzelnes Molekül von DNA (oder höchstens wenige Moleküle), welches die zu selektierenden Proteine codiert, wird in einer biologisch aktiven Form mittels eines gekoppelten Transkriptions/Translations-Systems in den wäßrigen Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion exprimiert, und ii) das zu selektierende Protein muß in der Lage sein, das genetische Element, welches es in solch einer Weise codiert, daß es selektierbar ist, in einer anschließenden Stufe zu modifizieren. In diesem Beispiel beschreiben wir eine Gruppe von Proteinen – DNA-Methyltransferasen (Typ II)-, die in den wäßrigen Abteilungen eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems unter Verwendung eines gekoppelten Transkriptions/Translations-Systems effizient produziert werden. Darüber hinaus modifizieren die in vitro translatierten DNA-Methyltransferasen effizient die DNA-Moleküle, welche diese in situ in den wäßrigen Kompartimenten codieren, so daß sie selektiert und vervielfältigt werden können. Die Zielstellen an den DNA-Molekülen werden durch Methylierung eines Cytosins an der C5-Position modifiziert, was die Stellen beständig gegen eine Spaltung durch die verwandte Restriktionsendonuklease macht (d.h. HhaI für M.HhaI und HaeIII für M.HaeIII). Daher ist methylierte DNA gegenüber nicht-methylierter DNA aufgrund ihrer Beständigkeit gegen Restriktionsendonukleasenspaltung selektierbar.
Das Gen, welches M.HhaI codiert, wird mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide HhaI-Fo2S und HhaI-Bc direkt von Haemophilus parahaemolyticus (ATCC 10014) vervielfältigt. Das Gen, welches M.HaeIII codiert, wird mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide HaeIII-Fo2S und HaeIII-Bc (SEQ ID NO:4) direkt von Haemophilus influenzae (biologische Gruppe aegyptius) (ATCC 11116) vervielfältigt. Beide PCR-Fragmente werden in den Vektor pGEM-4Z (Promega), der mit HindIII und KpnI verdaut ist, abstromig zu dem lac-Promotor und dem T7-RNA-Polymerase-Promotor kloniert. Die Oligonukleotide HhaI-Bc und HaeIII-Bc (SEQ ID NO:4) fügen aufstromig zu dem Startcodon des Methyltransferasegens die effiziente Translationsstartstelle des Gens 10 des Phagen T7 an. Das Oligonukleotid HhaI-Fo hängt eine HhaI-Methylierungs/Restriktionsstelle (M/R) und eine HaeIII-(/NotI-)Stelle für die Funktion als Substrate für M.HhaI bzw. M.HaeIII an. Das Oligonukleotid HaeIII-Fo hängt eine NotI/HaeIII-M/R-Stelle an, welche als ein Substrat für M.HaeIII wirkt (das M.HaeIII-Gen enthält bereits zwei interne HhaI-M/R-Stellen). DNA-Sequenzierung identifiziert Klone mit der korrekten Nukleotidsequenz.
Die oben beschriebenen pGEM-M.HhaI- und pGEM-M.HaeIII-Plasmide werden mittels PCR unter Verwendung der Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO:9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO:10) wie oben unter Erzeugung von entweder einem 1167 Basenpaare langen DIG-M.HhaI-Biotin- oder einem 1171 Basenpaare langen DIG-M.HaeIII-Biotin-DNA-Fragment, welche an einem Ende mit Biotin und an dem anderen Ende mit Digoxigenin markiert sind und welche den T7-RNA-Polymerase-Promotor, die Translationsstartstelle des Gens 10 des Phagen T7, das Methyltransferasegen und M/R-Stellen von HaeIII und HhaI tragen, vervielfältigt. Die PCR-Fragmente werden jeweils direkt unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt.
Die Gene, die für die gekoppelte in vitro-Transkription/Translation von M.EcoRI und M.EcoRV erforderlich sind, werden durch PCR unter Verwendung der Plasmide pMB1 (Betlach et al., 1976) bzw. pLB1 (Bougueleret et al., 1984) als Matrizen, eines Rückwärtsprimers, der die Translationsstartstelle des Gens 10 des Phagen T7 und LMB3 aufstromig zu der Methyltransferasegen-Ribosomenbindungsstelle (EcoRI-Bc oder EcoRV-Bc) anhängt, und eines Vorwärtsprimers (EcoRI-Fo oder EcoRI-Fo), welcher LMB2 anhängt, vervielfältigt. Diese Fragmente werden weiter durch PCR unter Verwendung der Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO:9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO:10), wie sie oben beschrieben sind, zur Erzeugung der DIG-M.EcoRI-Biotin- und DIG-M.EcoRV-Biotin-DNA-Fragmente, welche den T7-RNA-Polymerase-Promotor, die Translationsstartstelle des Gens 10 des Phagen T7, das Methyltransferasegen und M/R-Stellen von EcoRI und EcoRV tragen, vervielfältigt. Diese PCR-Fragmente werden jeweils direkt unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt.
Die oben beschriebenen mittels PCR vervielfältigten DNA-Methylasegene werden in einem prokaryontischen in vitro-System der gekoppelten Transkription/Translation, das für lineare Matrizen ausgelegt ist (Lesley et al., 1991), exprimiert. Es wird eine handelsübliche Präparation dieses Systems verwendet (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega), welches mit T7-RNA-Polymerase und S-Adenosylmethionin (SAM) in einer Konzentration von 80 μM versetzt ist.
Methylierung wird durch Messen der Beständigkeit der mit DIG und Biotin markierten DNA-Fragmente gegenüber Spaltung durch das verwandte Restriktionsenzym unter Verwendung des DIG-Biotin-ELISA von Boehringer Mannheim oder mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten und mit Streptavidin beschichteten magnetischen Perlen untersucht. In vitro-Reaktionsgemische, welche mit DIG-Biotin markierte Fragmente enthalten, die in situ durch gekoppelte in vitro-Transkription/Translation umgesetzt wurden, wie es unten beschrieben ist, werden in 1 × W&B-Puffer (1 M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4) + 0,1% Tween-20 verdünnt (die Konzentration der mit DIG/Biotin markierten DNA in dem Test liegt im Bereich von 0–250 pM) und in mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten (hohe Kapazität) für 30–60 Minuten inkubiert. Die Platte wird gespült (3mal mit 2 × W&B und abschließend mit 50 mM Tris, pH 7,4 + 5 mM MgCl₂), und die Restriktionsenzyme (NEB) werden hinzugefügt (10–50 Einheiten Enzym in 0,2 ml des entsprechenden Puffers) und bei 37°C für 3–12 Stunden inkubiert. Die Platte wird gespült, und mit Peroxidase verknüpfte Anti-DIG-Antikörper (verdünnt 1:1500 in PBS + 0,1% Tween-20 + 2 mg/ml BSA) werden für 40–60 Minuten hinzugefügt, gefolgt von dem Peroxidasesubstrat (BM Blue; 70 μl/Napf). Die Absorption (bei 450 minus 650 nm) wird nach Abschrecken mit 0,5 M H₂SO₄ (130 μl/Napf) gemessen.
Für den radioaktiven Test werden die oben beschriebenen Plasmide und PCR-Fragmente mittels PCR unter Verwendung der Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO:9) und LMB3 und α-P³²-CTP unter Erhalt von P³²-markierten DNA-Fragmenten vervielfältigt, welche an einem Ende mit Biotin markiert sind und welche den T7-RNA-Polymerase-Promotor, die Translationsstartstelle des Gens 10 des Phagen T7, das Methyltransferasegen und die relevanten M/R-Stellen tragen. Diese PCR-Fragmente werden direkt unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt. Reaktionsgemische mit der Biotin-P³²-markierten DNA, welche in situ durch gekoppelte in vitro-Transkription-Translation umgesetzt war, wurde in 1 × W&B-Puffer + 0,1% Tween-20 verdünnt und mit Streptavidin beschichteten magnetischen Perlen (Dynal, M-280; 1–5 × 10⁶ Perlen) für 30–60 Minuten inkubiert. Die Perlen werden abgetrennt und gespült (3mal mit 2 × W&B + 0,1% Tween-20 + 3% BSA und abschließend mit 50 mM Tris, pH 7,4 + 5 mM MgCl₂). Die Restriktionsenzyme (NEB) werden hinzugefügt (10–50 Einheiten Enzym in 50–150 μl des entsprechenden Puffers) und bei 37°C für 5–20 Stunden inkubiert. Der Überstand wird abgenommen und die Perlen gespült und in 100 μl Wasser resuspendiert. Die Menge an radioaktiv markierter DNA an den Perlen und in den Überständen wird mittels Szintillation bestimmt.
Alle vier hier beschriebenen Methylasen – M.HaeIII, M.HhaI, M.EcoRI und M.EcoRV – werden in der gekoppelten Transkription/Translation in vitro exprimiert und sind aktiv. Darüber hinaus kann die in vitro-translatierte Methylase ihr eigenes Gen methylieren, wodurch sie es beständig gegen eine Spaltung durch die verwandte Methylase macht (Automethylierung). Beide Prozesse, die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation des Methylasegens sowie dessen Methylierung, laufen effizient in dem gleichen Reaktionsgemisch ab. Spezieller werden DNA-Fragmente (in Konzentrationen von 0,5–10 nM), welche den T7-RNA-Polymerase-Promotor, die Translationsstartstelle des Gens 10 des Phagen T7, ein Methyltransferasegen und M/R-Stellen aller vier Methylasen tragen, gegen eine Spaltung durch die verwandte Restriktionsendonuklease beständig. Zum Beispiel wird das DNA-Fragment, welches M.EcoRI-Methyltransferase codiert, beständig gegen eine Spaltung durch EcoRI (75–100% nach 20–90 Minuten bei 25°C), wenn sie mit dem E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega), SAM (80 μM) und T7-RNA-Polymerase inkubiert wird. Die Beständigkeit gegen Spaltung als eine Folge von Methylierung ist selektiv und spezifisch; unter den gleichen Bedingungen wird Beständigkeit gegen eine Spaltung durch HhaI oder M.EcoRV nicht beobachtet; darüber hinaus wird Beständigkeit gegen eine Spaltung durch EcoRI nicht beobachtet, wenn die Translation gehemmt ist (z.B. in der Gegenwart von Puromycin oder in der Abwesenheit von T7-RNA-Polymerase). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn das Überleben der Gene mittels DIG-Biotin-ELISA oder durch mit Biotin-P³²-markierten DNA-Fragmenten untersucht wurde, wie es oben beschrieben ist. Methylierung in trans, d.h. von DNA-Fragmenten (anderen als denjenigen, welche die verwandte Methylase codieren), welche M/R-Stellen anhängen, wird ebenfalls in dem E. coli S30-System für gekoppelte in vitro-Transkription-Translation in der Gegenwart eines Gens, das eine Methylase codiert, beobachtet.
Beide Prozesse, die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation der Methylasegene sowie deren Automethylierung, laufen effizient in den wäßrigen Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion ab. Spezieller werden DNA-Fragmente (in Konzentrationen von 0,1–10 nM), welche den T7-RNA-Polymerase-Promotor, die Translationsstartstelle des Gens 10 des Phagen T7, das Methyltransferasegen (z.B. M.HhaI) und die M/R-Stellen von HaeIII, HhaI und EcoRI tragen, zu E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega) in der Gegenwart von SAM (80 μM) und T7-RNA-Polymerase hinzugefügt. Die eisgekühlten Reaktionsgemische werden durch Homogenisieren für 1 Minute mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 20000 U.p.M. emulgiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, und bei 25–30°C für 0–180 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird gestoppt und die wäßrige Phase abgetrennt (siehe Beispiel 1), und die Methylierung der mit DIG-Biotin oder Biotin-P³²-markierten DNA-Fragmente wird untersucht, wie es oben beschrieben ist.
Methylierung von bis zu 20% der abgeteilten Gene gegen Spaltung durch HhaI wird nach 60–180 Minuten der Inkubation beobachtet. Keine Beständigkeit wird beobachtet, wenn die eiskalte Emulsion unmittelbar nach ihrer Herstellung gebrochen und die Reaktion durch Etherextraktion abgeschreckt wird ("0 Minuten"). Die Methylierung ist selektiv: Unter den gleichen Bedingungen wird eine Beständigkeit gegen Spaltung durch HaeIII oder EcoRI nicht beobachtet. Darüber hinaus hat der Test der P³²-markierten DNA-Fragmente gezeigt, daß Automethylierung sowohl von M.HaeIII als auch M.HhaI bei Konzentrationen von Genen ablaufen, die einem Durchschnitt von weniger als einem Gen pro Kompartiment entsprechen (0,1–0,5 nM; siehe Beispiel 4). Somit laufen die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation der Methylasegene sowie deren Automethylierung effizient ab, auch wenn nur ein einzelnes genetisches Element in wäßrigen Kompartimenten der Wasser-in-Öl-Emulsion vorhanden ist.
HaeIII-Methylaseaktivität, die von gekoppelter Transkription/Translation von M.HaeIII-Genen resultiert, wird auch in den größeren Mikrokapseln gemessen, die durch Rühren alleine oder durch Rühren, gefolgt von weiterer Homogenisierung mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 8000 U.p.M., 9000 U.p.M. oder 13500 U.p.M. für 1 Minute hergestellt wurden, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in 2b angegeben. Die Konzentration von verwendeten M.HaeIII-Genen (2,5 nM) liefert einen Durchschnitt von 1, 1,5 bzw. 4,8 genetischen Elementen pro Tröpfchen in den Emulsionen, die bei 13500 U.p.M., 9500 U.p.M. bzw. 8000 U.p.M. homogenisiert wurden, und einen Durchschnitt von 14 genetischen Elementen pro Tröpfchen in der nur durch Rühren hergestellten Emulsion. Die Zugabe eines anionischen Detergens, z.B. Natriumdesoxycholat, typischerweise mit 0,5% (w/v), zu dem in vitro-Translationsgemisch erhöht signifikant den Prozentsatz an genetischen Elementen, die in den Emulsionen methyliert werden.
Beispiel 10.
Genetische Elemente, welche DNA-Methyltransferasen codieren, können nach deren Automethylierung in den wäßrigen Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion selektiert und vervielfältigt werden.
Die Methylierung von Genen, welche DNA-Methylasen codieren, erlaubt es, daß diese in einer anschließenden Stufe isoliert und vervielfältigt werden. Die methylierte DNA ist gegenüber nicht-methylierter DNA anhand ihrer Beständigkeit gegen Spaltung durch Restriktionsendonukleasen selektierbar. Somit können die genetischen Elemente, die nach Behandlung mit dem verwandten Restriktionsenzym intakt bleiben, mittels PCR vervielfältigt werden. Jedoch ist eine solche Selektion offensichtlich nicht erreichbar, wenn andere Gene, welche die gleiche R/M-Stelle enthalten, aber nicht die Methylase codieren, in dem gleichen Reaktionsgemisch vorhanden sind. Dies liegt daran, daß Kreuzmethylierung der Nicht-Methylase-Gene (die in einem großen Überschuß vorhanden sind) diese gegen Spaltung durch das verwandte Restriktionsenzym beständig und somit durch PCR vervielfältigbar machen. Unter diesen Bedingungen wird eine Selektion von Genen, welche die Methylase codieren, nur möglich sein, wenn sie abgeteilt sind, nämlich wenn nur ein oder wenige Gene in einem einzelnen Kompartiment vorhanden sind, so daß Automethylierung der Hauptprozeß in diesem Kompartiment ist. Kreuzmethylierung wird vermieden, da Nicht-Methylase-Gene, welche in Kompartimenten vorhanden sind, die kein Methylasegen enthalten, unmethyliert bleiben werden.
Die in dem Experiment verwendeten Gene sind ein 1194 Basenpaare langes M.HaeIII-Fragment (DIG-M.HaeIII-3s-Biotin), welches Methylase HaeIII codiert, und ein 681 Basenpaare langes folA-Fragment (DIG-folA-3s-Biotin), welches das Enzym Dihydrofolatreduktase (DHFR) codiert, das zusätzliche HaeIII- und HhaI-Restriktions/Modifikations-Stellen enthält (siehe 1 b). Beide DNA-Fragmente sind an einem Ende mit Digoxigenin (DIG) und an dem anderen mit Biotin markiert und enthalten einen T7-RNA-Polymerase-Promotor (T7-Promotor) und eine T7-Gen 10 Translationsinitiationsstelle (rbs) für eine Expression in vitro.
pGEM-4Z-3s wird erzeugt durch Annealen der Oligonukleotide HaeHha-Pl und HaeHha-Mi (SEQ ID NO:2) (Tabelle 1) und Ligieren derselben in einen mit HindIII und EcoRI geschnittenen pGEM-4Z (Promega). Das M.HaeIII-Gen wird mittels PCR von Haemophilus influenzae (biologische Gruppe aegyptius) (ATCC 11116) unter Verwendung der Oligonukleotide HaeIII-FoNC (SEQ ID NO:3) und HaeIII-Bc (SEQ ID NO:4) (Tabelle 1) vervielfältigt. Das folA-Gen wird von Escherichia coli unter Verwendung der Primer EDHFR-Fo (SEQ ID NO:5) und EDHFR-Ba (SEQ ID NO:6) (Tabelle 1) vervielfältigt. Beide vervielfältigten Gene werden mit HindIII und KpnI verdaut und in pGEM-4Z-3s kloniert, wobei die Expressionsvektoren pGEM-HaeIII-3s und pGEM-folA-3s erzeugt werden. DIG-M.HaeIII-3s-Biotin und DIG-folA-3s-Biotin (siehe 1b) werden von diesen Vektoren mittels PCR mit Pfu-Polymerase unter Verwendung der Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO:9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO:10) (20 Zyklen) vervielfältigt und unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt. DIG-D1.3-Biotin, ein 942bp langes DNA-Fragment, welches vier HaeIII-R/M-Stellen enthält und als ein Substrat zur Untersuchung von HaeIII-Methylaseaktivität verwendet wird, wird von einem pUC19-Derivat, das ein D1.3-Einzelketten-Fv-Gen (McCafferty et al., 1990) enthält, vervielfältigt, wie oben angegeben. Eine 558bp lange Träger-DNA (g3-Träger-DNA; ein internes Fragment des Gens III des Phagen fd, welches keinen T7-Promotor, HaeIII- oder HhaI-R/M-Stellen besitzt) wird mittels PCR mit Taq-Polymerase von pHEN1-DNA (Hoogenboom et al., 1991) unter Verwendung der Primer G3FRAG-Fo (SEQ ID NO:11) und G3FRAG-Ba (SEQ ID NO:12) (Tabelle 1) vervielfältigt und durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Diese DNA (mit ≥ 10 nM) wurde als ein Träger in Verdünnung der gesamten DNA, die für die Reaktionen in diesem Beispiel verwendet wurde, eingesetzt.
3 zeigt die Selektion von M.HaeIII-Genen, welche die DNA-Methylase HaeIII codieren, aus einem Überschuß von folA-Genen (die DHFR codieren, welche DNA nicht methyliert). Beide Gene haben die gleichen HaeIII-R/M-Sequenzen, die angefügt sind, um als ein Substrat zu wirken (1b). Nach Translation in den wäßrigen Kompartimenten einer Emulsion werden die mit den Methylasegenen verbundenen HaeIII-R/M-Sequenzen methyliert. Diese Gene werden gegen Spaltung durch HaeIII-Endonuklease beständig gemacht und anschließend mittels PCR vervielfältigt. folA-Gene, die in anderen Kompartimenten vorhanden sind, bleiben unmethyliert, werden gespalten und nicht vervielfältigt. Die PCR-Produkte werden durch Agarosegelelektroforese analysiert, wobei eine Anreicherung hinsichtlich der M.HaeIII-Gene durch das Auftreten einer 1194bp großen Bande sichtbar gemacht werden kann (3).
Das E. coli S30 Extraktsystem für lineare DNA (Promega) wird verwendet, versetzt mit g3-Träger-DNA (10 nM), DNA-Fragmenten (DIG-M.HaeIII-3s-Biotin und DIG-M.folA-3s-Biotin in Verhältnissen und Konzentrationen, wie sie unten angegeben sind), T7-RNA-Polymerase (10⁴ Einheiten), Natriumdesoxycholat (Fluka, 0,5% w/v; nur in emulgierten Reaktionen) und S-Adenosylmethionin (NEB, 80 μM). Die Reaktionen werden unter Verwendung der DNA-Fragmente DIG-M.HaeIII-3s-Biotin und DIG-M.folA-3s-Biotin in einem Verhältnis von 1:10³ und bei einer Gesamtkonzentration von 200 pM (3a) und Verhältnissen von 1:10⁴ bis 1:10⁷ und einer Gesamtkonzentration von 500 pM (3b) angesetzt. 50 Mikroliter der Reaktionen werden auf Eis hergestellt und nur durch Rühren emulgiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Reaktionen werden für 2 Stunden bei 25°C inkubiert. Zur Gewinnung der Reaktionsgemische werden die Emulsionen bei 3000 × g für 5 Minuten zentrifugiert und die Ölphase abgenommen, wobei die konzentrierte Emulsion am Boden des Gefäßes zurückbleibt. Abschreckpuffer (0,2 ml von 25 μg/ml Hefe-RNA in W&B-Puffer: 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) und 2 ml mit Wasser gesättigter Ether werden hinzugefügt und das Gemisch Vortexmischen unterzogen, kurz zentrifugiert und die Etherphase entfernt. Die wäßrige Phase wird mit Ether gewaschen und getrocknet (5 Minuten in einer Speedvac bei Umgebungstemperatur). DNA wird an 100 μg M-280-Streptavidin-Dynabeads (2 Stunden bei Raumtemperatur) eingefangen. Die Dynabeads werden aufeinanderfolgend mit folgendem gewaschen: W&B-Puffer; 2,25 M Guanidin-HCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7,4; W&B-Puffer; und 2mal mit Restriktionspuffer. Die Perlen werden in 100 μl Restriktionspuffer, der 10 Einheiten HaeIII (oder HhaI) enthält, resuspendiert und bei 37°C für 5 Stunden inkubiert. Die Perlen werden dreimal mit W&B-Puffer, zweimal mit 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X-100, pH 9,0, gewaschen und anschließend in 100 μl des gleichen Puffers, der mit 1,5 mM MgCl₂ versetzt ist (PCR-Puffer), resuspendiert. Aliquote Teile der Perlen (2–20 μl) werden mittels PCR vervielfältigt, wobei Taq-Polymerase verwendet wird, die bei 94°C mit den Primern LMB2-Biotin und LMB3-DIG hinzugefügt wird (50 μl Reaktionen; 32 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C, 2 Minuten bei 72°C). Diese DNA wird unter Verwendung von Wizard PCR Preps gereinigt und für die zweite Runde der Selektion verwendet (20 pM in den Selektionen bei 1:10⁴ und 1:10⁵ und 500 pM in den Selektionen bei 1:10⁶ und 1:10⁷). Für Gelelektroforese und Aktivitätstests wird diese DNA (verdünnt auf ~1 pM) weiter mit den Primern LMB2-Nest und LMB3-Nest, welche unmittelbar innerhalb von LMB2 bzw. LMB3 annealen, vervielfältigt (25 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C, 1,5 Minuten bei 72°C) und wie oben gereinigt. Diese DNA (mit 10 nM), welche weder DIG noch Biotin angehängt hat, wird auch in vitro in der Gegenwart von 10 nM DIG-D1.3-Biotin, einer 942bp langen DNA, die vier HaeIII-R/M-Stellen enthält, translatiert. Methylierung des DIG-D1.3-Biotin-Substrates wird mittels DIG-Biotin-ELISA bestimmt wie in Beispiel 9.
Eine einzelne Runde der Selektion von M.HaeIII:folA-Genen im Verhältnis von 1:1000 in der Emulsion führt zu einem ungefähren Genverhältnis am Ende von 1:1 (3a). Mehrere Kontrollexperimente zeigen, daß die Selektion nach dem oben beschriebenen Mechanismus abläuft: Eine Bande, die dem M.HaeIII-Gen entspricht, wird nicht beobachtet, wenn das anfängliche Gemisch von Genen mittels PCR vervielfältigt wird, noch nach einer Reaktion in Lösung (nicht emulgiert), noch wenn in der Abwesenheit von Transkription/Translation emulgiert wurde (wenn T7-RNA-Polymerase weggelassen wird), noch wenn die umgesetzten Gene an R/M-Stellen gespalten werden, die andere sind als solche von HaeIII, z.B. nach Verdau mit HhaI. Die Ausbeute an M.HaeIII-DNA nach der Selektion ist weniger als 100%, was in erster Linie eher auf unvollständigen Verdau durch HaeIII zurückzuführen ist als auf Kreuzmethylierung, was sich durch die große folA-Bande zeigt, die in der Abwesenheit von Methylaseaktivität (wenn T7-Polymerase nicht hinzugefügt wird) beobachtet wird. Während des Verdaus fällt die Konzentration an DNA deutlich unter den K_m von HaeIII (6 nM), und der Verdau wird äußerst ineffizient.
Eine Bande, die M.HaeIII-Genen entspricht, wird nach einer einzelnen Runde der Selektion, ausgehend von Verhältnissen von M.HaeIII:folA von 1:10⁴ bis 1:10⁵ (3b), aber nicht bei niedrigeren Verhältnissen sichtbar, was einen Anreicherungsfaktor von wenigstens 5000-fach anzeigt. Die Selektion einer geringen Anzahl an Genen von einem großen Pool (z.B. einer Genbibliothek) erfordert daher weitere Runden der Selektion. Wenn die mit HaeIII verdaute und vervielfältigte DNA aus der ersten Runde der Selektion einer zweiten Runde der Selektion unterzogen wird, wird von Ausgangsverhältnissen von M.HaeIII:folA von 1:10⁶ und 1:10⁷ auch eine Bande sichtbar, die M.HaeIII-Genen entspricht. Eine zweite Runde der Selektion wird auch an der DNA durchgeführt, die von Ausgangsverhältnissen von M.HaeIII:folA von 1:10⁴ bis 1:10⁵ hergeleitet war. Dies liefert eine weitere Anreicherung bis zu einem Verhältnis von etwa 3:1 zugunsten der M.HaeIII-Gene. Vor und nach jeder Runde der Selektion werden die Gene vervielfältigt, in vitro translatiert und mit einem separaten DNA-Substrat umgesetzt, um hinsichtlich HaeIII-Methylase-Aktivität zu testen. Diese Tests zeigen, daß Anreicherung der M.HaeIII-Gene, wie sie durch Gelelektroforeseergebnisse gezeigt wurde, zu einer parallelen Erhöhung der HaeIII-Methylase-Aktivität führt (3b).
Tabelle 1 Oligonukleotide
LMB2-Biotin besitzt ein 5'-terminales Biotin, das über einen 16 Atome langen Abstandshalterarm verbunden ist. LMB3-DIG besitzt ein 5'-terminales Digoxigenin, das über einen 12 Atome langen Abstandshalterarm verbunden ist.
Oligonukleotide, die an dem 5'-Terminus mit Biotin oder Digoxigenin markiert sind, wurden von Eurogentec bezogen.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Isolieren eines oder mehrerer genetischer Elemente, die ein Genprodukt mit einer gewünschten Aktivität codieren, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: (a) Exprimieren der genetischen Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte zu erzeugen, so daß die Genprodukte mit den sie codierenden Genen verknüpft sind, (b) Kompartimentieren der genetischen Elemente in Mikrokapseln, (c) Sortieren der genetischen Elemente, die ein Genprodukt (Genprodukte) mit der gewünschten Aktivität erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität eine Veränderung in der Mikrokapsel induziert, welche ermöglicht, daß die Mikrokapsel, die das Genprodukt und das dieses codierende genetische Element enthält, sortiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität ein oder mehrere Moleküle innerhalb der Mikrokapsel modifiziert, was ermöglicht, daß die Mikrokapsel, die das Genprodukt und das dieses codierende genetische Element enthält, sortiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität eine Veränderung der optischen Eigenschaften der Mikrokapsel induziert und die Mikrokapseln aufgrunddessen sortiert werden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Veränderung der optischen Eigenschaften eine Veränderung der Fluoreszenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die gewünschte Aktivität des Genprodukts innerhalb der Mikrokapsel direkt oder indirekt zur Modifikation des genetischen Elements, welches das Genprodukt codiert, führt, wodurch die Isolation des genetischen Elements ermöglicht wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität eine Veränderung in der Mikrokapsel induziert, die, wenn sie detektiert wird, die Modifikation des genetischen Elements in dem Kompartiment auslöst, wodurch die Isolation des genetischen Elements ermöglicht wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Veränderung in der Mikrokapsel eine Veränderung ihrer optischen Eigenschaften ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Veränderung der optischen Eigenschaften eine Veränderung der Fluoreszenz ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei ein Teil des genetischen Elements ein Substrat ist und die Aktivität des gewünschten Genprodukts innerhalb der Mikrokapsel direkt oder indirekt zur Umwandlung des Substrats in ein Produkt führt, welches ein Teil des genetischen Elements bleibt und dessen Isolation ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Aktivität des gewünschten Genprodukts innerhalb der Mikrokapsel direkt oder indirekt zur Umwandlung eines Substrats in ein Produkt führt und das genetische Element weiterhin einen Liganden umfaßt, welcher an das Produkt bindet und dessen Isolation ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das genetische Element einen Liganden umfaßt und das gewünschte Genprodukt innerhalb der Mikrokapsel an den Liganden bindet, um die Isolation des genetischen Elements zu ermöglichen.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Aktivität des Genprodukts innerhalb der Mikrokapsel zur Veränderung der Expression eines zweiten Gens innerhalb des Kompartiments führt und die Aktivität des Produkts des zweiten Gens die Isolation des genetischen Elements ermöglicht.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die genetischen Elemente aus einer Bibliothek von genetischen Elementen, die ein Repertoire von Genprodukten codieren, isoliert werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches weiterhin die folgende zusätzliche Stufe umfaßt: (d) Einbringen einer oder mehrerer Mutationen in das genetische Element (die genetischen Elemente), das bzw. die in Stufe (c) isoliert wurde(n).
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches weiterhin das iterative Wiederholen einer oder mehrerer der Stufen (a) bis (d) umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches weiterhin das Vervielfältigen der genetischen Elemente umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Einschluß in Mikrokapseln durch Bilden einer Wasser-in-Öl-Emulsion einer wäßrigen Lösung in einem auf Öl basierenden Medium erzielt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 18, wobei die genetischen Elemente durch Affinitätsreinigung sortiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 18, wobei die genetischen Elemente durch selektive Entfernung genetischer Elemente, die das gewünschte Genprodukt nicht codieren, sortiert werden.
Verfahren zum Herstellen eines Genprodukts, welches die folgenden Stufen umfaßt: (a) Herstellen eines genetischen Elements, welches das Genprodukt codiert, (b) Exprimieren der genetischen Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte zu erzeugen, so daß die Genprodukte mit den sie codierenden genetischen Elementen verknüpft sind, (c) Kompartimentieren von genetischen Elementen in Mikrokapseln, (d) Sortieren der genetischen Elemente, die das Genprodukt (die Genprodukte) mit der gewünschten Aktivität erzeugen, und (e) Exprimieren des Genprodukts mit der gewünschten Aktivität.
Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder von Verbindungen, die die Aktivität eines Genprodukts modulieren können, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: (a) Herstellen eines genetischen Elements, welches das Genprodukt codiert, (b) Exprimieren der genetischen Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte zu erzeugen, und Verknüpfen der Genprodukte mit den sie codierenden genetischen Elementen, (c) Kompartimentieren von genetischen Elementen in Mikrokapseln, (d) Sortieren der genetischen Elemente, die das Genprodukt (die Genprodukte) mit der gewünschten Aktivität erzeugen, und (e) Inkontaktbringen eines Genprodukts mit der gewünschten Aktivität mit der Verbindung oder den Verbindungen und Überwachen der Modulation einer Aktivität des Genprodukts durch die Verbindung oder Verbindungen.
Verfahren zum Herstellen einer Verbindung oder von Verbindungen, welches die folgenden Stufen umfaßt: (a) Bereitstellen eines Syntheseprotokolls, wobei wenigstens eine Stufe durch ein Polypeptid katalysiert wird, (b) Herstellen genetischer Elemente, die Varianten des Polypeptids, welches diese Stufe vereinfacht, codieren, (c) Exprimieren der genetischen Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte zu erzeugen, so daß die Genprodukte mit den sie codierenden genetischen Elementen verknüpft sind, (d) Kompartimentieren der genetischen Elemente in Mikrokapseln, (e) Sortieren der genetischen Elemente, die ein Polypeptidgenprodukt (Polypeptidgenprodukte) mit der gewünschten Aktivität erzeugen, und (f) Herstellen der Verbindung oder Verbindungen unter Verwendung des in (e) identifizierten Polypeptidgenprodukts, um die relevante Stufe der Synthese zu vereinfachen.