DE69838417T2

DE69838417T2 - An caml bindender lymphozyteoberflächenrezeptor, nukleinsäuren die dafür kodieren und verfahren zur verwendung

Info

Publication number: DE69838417T2
Application number: DE69838417T
Authority: DE
Inventors: Richard J. Memphis BRAM; Gotz Von Bulow
Original assignee: St Jude Childrens Research Hospital
Current assignee: St Jude Childrens Research Hospital
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2018-03-04
Also published as: PT964874E; EP0964874B1; US6316222B1; EP1632500A3; US6500428B1; JP2001518080A; US20090226473A1; WO1998039361A1; CA2284078C; EP0964874A1; AU6685498A; DE69838417D1; JP3594975B2; US20060101529A1; ES2552095T3; EP2292654A2; ATE373012T1; ES2292201T3; US5969102A; US20050183148A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen die Regulation der Transkription in Lymphozyten, Proteine, welche darin einbezogen sind, Antikörper davon, Nukleinsäuren, welche die Proteine kodieren, und Verwendungen der Nukleinsäuren, Antikörper und Proteine.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Forscher beginnen erst, die Mechanismen zu enträtseln, welche die zelluläre Antwort auf extrinsische Faktoren steuern. Ein Grundmerkmal von vielen solchen Mechanismen ist die anfängliche Bindung eines extrinsischen Faktors, z.B. eines Liganden, an ein Zelloberflächenmembranprotein, d. h. einen Rezeptor. Die Bindung eines Liganden an seinen Rezeptor bewirkt normalerweise eine zelluläre Veränderung durch eine Kaskade von Ereignissen. Diese Ereignisse beziehen normalerweise andere Proteine, wie Proteinkinasen, Proteinphosphatasen, JAK-Proteine, Stat-Proteine und/oder G-Proteine, ein. Zusätzlich besteht im Allgemeinen ein Erfordernis für einen Transkriptionsfaktor, an eine spezifische regulatorische DNA-Sequenz im Kern der Zelle zu binden und dabei die Transkription von einem oder mehr besonderen Genen zu initiieren.
Andere Faktoren sind oft einbezogen. Bei Antigen-stimulierter Lymphozytenaktivierung ist zum Beispiel Calcium (Ca² ⁺)-Zufluss auch für die letztliche Initiierung der DNA-Transkription notwendig. Die erhöhte Cytoplasma-Calciumkonzentration kann einen externen Zufluss oder eine Freisetzung von internen Vorräten verursachen. Eine erhöhte Calciumkonzentration, welche die Calcium-abhängige Proteinphosphatase Calcineurin aktiviert, wirkt in Verbindung mit anderen Mitteln, um die Signale der Initiierung der Transkription zu vermitteln. Es ist klar, dass der Weg, der den Calciumzufluss einbezieht, für eine Anzahl von Vorgängen wesentlich ist, welche in die Aktivierung und Proliferation von Zellen einbezogen sind.
Intrazelluläre Calciumlevels spielen in einer Anzahl von unterschiedlichen Zelltypen eine Hauptfunktion, wobei sie in eine Anzahl von unterschiedlichen Aktivitäten einbezogen sind. Zusätzlich zu der Induzierung der Gentranskription durch Calciumzufluss bieten viele andere Calcium-abhängige Ereignisse, wie jene, welche während Muskelkontraktion (sowohl Herz als auch Skelett), Vesikeldegranulation (wie bei der Antwort von Neutrophilen und Makrophagen auf Infektion, oder Basophilantwort auf Antigenstimulation, oder Freisetzung von Acetylcholin durch Neuronen) und dem Schließen von intrazellulären Lückenübergängen auftreten, Möglichkeiten zur zellulären Regulation. Der Zellzyklus kann auch Flüsse von Calcium einbeziehen. Intrazelluläre Chelatoren, welche Veränderungen bei der intrazellulären Calciumkonzentration blockieren, können das Ablaufen des Zellzyklus blockieren, wobei die Zellteilung gestoppt wird. [Rabinovich et al., J of Immunol., 137:952-961 (1986)]. Deshalb kann die Regulation von Calcium bei der Modulierung der Zellteilung in normalen und erkrankten Zellen wirksam sein.
Lymphozyten sind eine primäre Komponente des zellulären Arms des Immunsystems. Eine Aktivierung eines besonderen Typs von Lymphozyten, einer T-Zelle, kann durch die Stimulierung eines T-Zellen-Rezeptors durch z.B. das Binden eines T-Zellen-Rezeptors (TCR) an ein Antigen, welches durch eine Antigen-präsentierende Zelle präsentiert wird, resultieren. Diese Stimulierung resultiert in der Aktivierung einer Ca² ⁺-abhängigen Phosphatase, Calcineurin. Aktiviertes Calcineurin aktiviert seinerseits NF-AT, einen Lymphozyten-spezifischen Transkriptionsfaktor, der zusammen mit einem begleitenden Transkriptionsfaktor, AP-1, die Expression des induzierbaren T-Zellen-Wachstumsfaktors, Interleukin-2 (IL-2), bewirkt. Die Aktivierung von AP-1 ist ein Calcium-unabhängiger Vorgang, der Proteinkinase C einbezieht, und kann experimentell mit der Zugabe von Phorbolmyristatacetat (PMA) erreicht werden. Der immunsuppressive Arzneistoff Cyclosporin A (CsA) bindet an und inhibiert die Prolylisomeraseaktivität von Cyclophilin und der resultierende Arzneistoff-Isomerase-Komplex inaktiviert Calcineurin durch eine direkte Wechselwirkung nahe der aktiven Stelle des Enzyms. [Liu et al., Cell, 66:807-15 (1991)]; [Clipstone und Crabtree, Nature, 357:695-7 (1992)]; [O'Keefe et al., Nature, 357:692-4 (1992)]. NF-KB ist der dritte Schlüssel-Transkriptionsfaktor, welcher bei der Aktivierung von Lymphozyten wichtig ist und welcher nach der Stimulierung des T-Zellen- oder B-Zellen-Antigenrezeptors aktiviert wird.
Ein anderes Protein, welches mit dem Calciumsignalweg in Lymphozyten in Zusammenhang steht, ist der vor kurzem identifizierte Calciumsignal-modulierende Cyclophilinligand (CAML) [Bram, R.J. und Crabtree, G.R., DNA Encoding Calcium-Signal Modulating Cyclophilin Ligand, U.S. Patent Nr. 5,523,227 , veröffentlicht am 04. Juni 1996, und WO 95/35501 . Siehe auch Von Bülow und Bram, Science 199, 278 (5335): 138-141; und Von Bülow und Bram, Blood 1997, 90(10): 246A-247. CAML bindet Cyclophilin B mit einer vernünftigen Spezifität, d. h. CAML bindet nicht Cyclophilin A oder C. Im Gegensatz zum Cyclosporin A-Cyclophilin-Komplex bindet der CAML-Cyclophilin B-Komplex jedoch nicht direkt an Calcineurin. So scheint es, dass CAML Calcineurin durch seine Regulation des Ca²⁺-Zuflusses beeinflusst. Wie erwartet, kann CsA indirekt die Aktivierungswirkung von CAML auf die Transkription durch Inhibierung von Calcineurin blockieren. Zusätzlich scheint es, dass CAML keine Wirkung auf die Aktivierung von AP-1 hat, und so erfordert die CAML-abhängige Aktivierung von NF-AT experimentell die Zugabe von PMA.
CAML wirkt einem extrinsischen Signal nachgelagert, aber vorgelagert in Bezug auf Calcineurin. Der Ort von CAML in Cytoplasmavesikeln weist daraufhin, dass er den Ca²⁺-Zufluss durch Modulieren der intrazellulären Ca²⁺-Freisetzung regulieren kann. Jedoch bleibt ein Bedarf für die Bestimmung des natürlichen Faktors (oder Faktoren), der das externe Signal zum zellulären CAML kommuniziert. Ferner besteht ein Bedarf, zu verstehen, wie CAML mit diesem Faktor wechselwirkt, um zu lernen, wie die wichtigen zellulären Vorgänge, dass CAML die Regulierung unterstützt, besser gesteuert werden können. Eine unterschiedliche Signalmolekülklasse ist die TNFR-Familie von Zelloberflächenrezeptoren [Smith et al., Cell 76:959-62 (1994)]. Diese Rezeptoren initiieren intrazelluläre Signale, welche zum Einsetzen von Zellwachstum, -tod oder Gewinn von Effektorfunktion führen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz bereit, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

a) einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Identität mit den Nukleotiden 14 bis 895 von SEQ ID Nr. 1, wobei die Nukleotidsequenz ein Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Protein kodiert;
b) einer Nukleotidsequenz, umfassend mindestens 18 Nukleotide einer Nukleotidsequenz, welche ein Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Protein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 2, umfassend eine konservative Substitution davon, besteht, wobei die Nukleotidsequenz ein N-terminales Fragment des TACI-Proteins kodiert, welches die regulatorische extrazelluläre Domäne ist; und
c) einer Nuldeotidsequenz, welche ein C-terminales Fragment des TACI-Proteins kodiert, wobei das C-terminale Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 4, umfassend eine konservative Substitution davon, besteht, und wobei das C-terminale Fragment ausreichend ist, um an die N-terminalen 146 Aminosäuren von CAML zu binden;

Ein neuer Lymphozytrezeptor, seine DNA-Sequenz und seine Rolle im Calciumaktivierungsweg werden offenbart. Das Protein oder genetisch-technologisch aufgebaute Konstrukte, welche es kodieren, können zum Erhöhen der Lymphozytenantwort oder zum Identifizieren von Liganden des Proteinrezeptors verwendet werden. Die lösliche, extrazelluläre Domäne kann zum Inhibieren der zellulären Aktivierung verwendet werden. Antikörper zu dem Protein können für diagnostische und therapeutische Verwendungen erzeugt werden. Das Protein und die DNA können auch für diagnostische Zwecke und zum Identifizieren von Mitteln zum Modulieren des durch Calcium induzierten Aktivierungsweges verwendet werden. Die Kenntnis der Kodiersequenz ermöglicht eine Manipulation von Zellen, um die Mechanismen, von welchen CAML ein Teil ist, aufzuklären.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie eine Lymphozytenaktivierung eines Rezeptors, der an allen B-Zellen gefunden wird, aber nur an einer Untermenge von T-Zellen, bereitstellt. Folglich kann der Rezeptor als ein Target verwendet werden, um spezifisch B-Zellen-Antworten zu regulieren, ohne die Aktivität von reifen T-Zellen zu beeinflussen. Eine solche Targetspezifität ist immer vorteilhaft, insbesondere wobei ein Anstieg oder eine Abnahme der Antikörperherstellung unabhängig von den zellulären Immunantworten gewünscht ist, z.B. während einer Infektion (Anstieg), oder um Immunkomplexablagerungskomplikationen (rheumatoide Arthritis, Glomerulonephritis und andere Autoimmunzustände) zu vermeiden.
Das Vernetzen des neuen Zelloberflächenrezeptors der vorliegenden Erfindung aktiviert B-Zellen und einige Populationen von T-Zellen. Eine Aktivierung dieser Zellen erhöht die Immunsystemaktivität. Auf der anderen Seite kann ein Blockieren oder Inhibieren des neuen Zelloberflächenrezeptors der vorliegenden Erfindung in Immunsuppression resultieren. Abhängig vom endogenen Level der Aktivierung des Rezeptors, welcher unter Verwendung der Antikörper oder Nukleinsäuren der Erfindung bewertet werden kann, kann die Rezeptoraktivität gesteigert oder supprimiert werden, um ein gewünschtes Ergebnis zu erreichen. Entweder Aktivieren oder Inhibieren der Funktion des neuen Zelloberflächenrezeptors der vorliegenden Erfindung kann zur Behandlung von Krebs von T- und B-Zellen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung schließt ein isoliertes Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Protein ein, welches als ein Zelloberflächensignalprotein fungiert und eine extrazelluläre Domäne, ein die Membran durchspannendes Segment und eine Cytoplasmadomäne umfasst. In einer Ausführungsform ist das TACI-Protein ein Plasmamembranrezeptor, in welchem die extrazelluläre Domäne im N-terminalen Teil des Proteins liegt und die Cytoplasmadomäne im C-terminalen Teil des Proteins liegt. Der N-terminale Teil des TACI-Proteins fungiert als eine Bindungsstelle für einen Liganden, der die Aktivierung der Zelle durch Induzierung der Bindung des C-terminalen Teils des TACI-Proteins an die N-terminale Domäne von CAML stimuliert. Da CAML ein integrales Membranprotein ist, welches an Cytoplasmavesikeln lokalisiert ist, ist das TACI-Protein ein Plasmamembranrezeptor, der direkt mit einer intrazellulären Organelle in Lymphozyten wechselwirkt.
In einer Ausführungsform besteht die monomere Form des isolierten TACI-Proteins aus etwa 295 Aminosäuren. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die monomere Form eines Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Proteins 280 bis 310 Aminosäuren. In stärker bevorzugten Ausführungsformen enthält die monomere Form eines TACI-Proteins 290 bis 296 Aminosäuren. In einer speziellen Ausführungsform, welche nachstehend beispielhaft dargestellt wird, enthält die monomere Form eines TACI-Proteins 293 Aminosäuren.
Eine Ausführungsform des isolierten TACI-Proteins enthält zwei Cystein-reiche TNFR-Superfamilien-Wiederholungen [Bairoch, Nucl. Acids Res., 21:3097-3103 (1993)]. In einer bevorzugten Ausführungsform initiiert ein TACI-Protein, welches in geeigneter Weise stimu liert ist, in situ, wie durch einen Liganden oder einen anti-TACI-Antikörper, die Aktivierung eines Transkriptionsfaktors durch die Kombination eines Ca²⁺-abhängigen Weges und eines Ca²⁺-unabhängigen Weges.
Die vorliegende Erfindung schließt eine isolierte Nukleinsäure ein, welche aus mindestens 18 Nukleotiden einer Nukleotidsequenz besteht, die mindestens 60 % Identität mit SEQ ID Nr. 1 oder alternativ mindestens 60 % Identität mit der Kodiersequenz von SEQ ID Nr. 1 aufweist. Die Nuldeotidsequenz kodiert ein TACI-Protein, welches eine Bindungsaffinität für CAML aufweist. In einer solchen Ausführungsform kodiert die isolierte Nukleinsäure ein TACI-Protein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Nukleotidsequenz mindestens 75 % Identität mit SEQ ID Nr. 1 auf oder weist mindestens 75 % Identität mit der Kodiersequenz von SEQ ID Nr. 1 auf. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform weist die Nukleotidsequenz mindestens 90 % Identität mit SEQ ID Nr. 1 auf oder weist mindestens 90 % Identität mit der Kodiersequenz von SEQ ID Nr. 1 auf. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform weist die Nukleotidsequenz zwischen 95 und 98 % Identität mit SEQ ID Nr. 1 auf oder weist zwischen 95 bis 98 % Identität mit der Kodiersequenz von SEQ ID Nr. 1 auf. In einer besonderen Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1. In einer verwandten Ausführungsform besteht die Nukleotidsequenz aus der Kodiersequenz von SEQ ID Nr. 1. In einer speziellen Ausführungsform, welche nachstehend beispielhaft darstellt wird, weist die isolierte Nukleinsäure die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 auf. In einer verwandten Ausführungsform besteht die isolierte Nukleinsäure aus der Kodiersequenz von SEQ ID Nr. 1.
In einer anderen verwandten Ausführungsform schließt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure ein, welche mindestens 18 Nukleotide einer Nukleotidsequenz enthält, welche ein Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Protein kodiert, und mit SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, und stärker besonders mit der Kodiersequenz von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert. In einer solchen Ausführungsform wird die Hybridisierung unter moderater Strenge durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform wird die Hybridisierung unter Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt. In noch einer dritten Ausführungsform wird die Hybridisierung unter strengen Hybridisierungsbedingungen durchgeführt.
In noch einer anderen verwandten Ausführungsform schließt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure ein, welche mindestens 18 Nukleotide einer Nukleotidsequenz enthält, die ein TACI-Protein mit einer Aminosäuresequenz von entweder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 2 mit einer oder mehr konservativen Substitutionen kodiert. In einer solchen Ausführungsform dieses Typs kodiert die isolierte Nukleinsäure ein N-terminales Fragment des TACI-Proteins, welches der extrazellulären Domäne entspricht. In einer anderen Ausführungsform kodiert die isolierte Nukleinsäure ein C-terminales Fragment des TACI-Proteins, welches ausreichend ist, um an die N-terminalen 146 Aminosäuren von CAML zu binden. In noch einer anderen Ausführungsform kodiert die isolierte Nukleinsäure den Transmembranteil des TACI-Proteins. In noch einer anderen Ausführungsform kodiert die isolierte Nukleinsäure das TACI-Protein in voller Länge.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die isolierte Nukleinsäure aus mindestens 24 Nukleotiden. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform besteht die isolierte Nukleinsäure aus mindestens 30 Nukleotiden. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform besteht die isolierte Nukleinsäure aus mindestens 36 Nukleotiden. Oligonukleotide der Erfindung können als Nukleinsäuresonden, PCR-Primer, Antisense-Nukleinsäuren und dergleichen, für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert eine isolierte Nukleinsäure ein C-terminales Fragment des TACI-Proteins, welche zum Binden an die N-terminalen 146 Aminosäuren von CAML ausreichend ist. In einer besonderen Ausführungsform dieses Typs enthält das C-terminale Fragment etwa 126 Aminosäuren. In einer anderen Ausführungsform dieses Typs weist das C-terminale Fragment eine Aminosäuresequenz von entweder SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 4 mit einer oder mehr konservativen Substitutionen auf.
In einer anderen Ausführungsform kodiert die isolierte Nukleinsäure ein N-terminales Fragment des CAML-bindenden Proteins, welches der extrazellulären Domäne entspricht. In einer besonderen Ausführungsform dieses Typs weist das N-terminale Fragment eine Aminosäuresequenz von entweder SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 6 mit einer oder mehr konservativen Substitutionen auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die isolierte Nukleinsäure ein TACI-Protein, welches eine Bindungsaffinität für CAML aufweist. Wenn ein solches TACI-Protein in geeigneter Weise stimuliert wird, in situ, initiiert es die Aktivierung eines Transkriptionsfaktors durch die Kombination eines Ca²⁺-abhängigen Weges und eines Ca²⁺-unabhängigen Weges. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform kodiert die isolierte Nukleinsäure ein TACI-Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein DNA-Konstrukt ein, welches eine isolierte Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung umfasst, die eine rekombinante DNA ist, welche operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist. Die Expressionskontrollsequenz kann aus der Gruppe ausgewählt sein, welche aus den Früh- oder Spätpromotoren von SV40 oder Adenvirus, dem lac-System, dem trp-System, dem TAC-System, dem TRC-System, den Hauptoperator- und Promotorregionen von Phage λ, den Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, dem Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase, den Promotoren von Säurephosphatase und den Promotoren der Hefe-α-Paarungsfaktoren besteht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Expressionskontrollsequenz entweder ein tetinduzierbarer Standardpromotor, ein Metallothionein-Promotor oder ein Ecdyson-Promotor. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Expressionskontrollsequenz der SR_α-Promotor.
Die vorliegende Erfindung schließt auch einen einzelligen Wirt, der mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert wurde, ein. In einer Ausführungsform ist der einzellige Wirt ein Prokaryot. In einer anderen Ausführungsform ist der einzellige Wirt ein Eukaryot. Bevorzugt ist der eukaryotische Wirt eine Säugerzelle, zum Beispiel eine COS-, CHO- oder Jurkat-T-Zelle, welche zum Bewerten der Aktivität des TACI-Proteins oder zum Identifizieren von modulierenden Mitteln nützlich sein können.
Die vorliegende Erfindung schließt die isolierten Polypeptide, welche durch die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung kodiert werden, Fragmente davon und Fusionsproteine davon ein. In einer Ausführungsform besteht das Polypeptidfragment aus einem N-terminalen Fragment des TACI-Proteins, welches der regulatorischen extrazellulären Domäne entspricht. In einer besonderen Ausführungsform weist das N-terminale Fragment eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 6 mit einer oder mehr konservativen Substitutionen auf.
In einer anderen Ausführungsform besteht das Polypeptidfragment aus einem C-terminalen Fragment des TACI-Proteins, welches zum Binden an die N-terminalen 146 Aminosäuren von CAML ausreichend ist. In einer solchen Ausführungsform enthält das C-terminale Fragment 95 bis 130 Aminosäuren. In einer speziellen Ausführungsform enthält das C-terminale Fragment die C-terminalen 126 Aminosäuren von SEQ ID Nr. 2. In einer alternativen Ausführungsform enthält das C-terminale Fragment des TACI-Proteins etwa 110 Aminosäuren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Typs enthält das C-terminale Fragment 107 Aminosäuren und weist eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4 auf.
Die vorliegende Erfindung schließt auch die Herstellung einer rekombinanten Form des extrazellulären Teils eines TACI-Proteins ein, wobei ein dominant-negatives oder blockierendes Reagenz erzeugt wird. Diese Komponente fängt die normalen endogenen Liganden ab, welche zum Vernetzen und Aktivieren des TACI-Proteins dienen. Wenn verwendet, wirkt ein solches Polypeptid durch Supprimieren des Immunsystems. Eine solche Verwendung ist bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Autoimmunerkrankung oder Transplantatabstoßung oder Transplantat-Wirt-Reaktion nach einer Transplantation nützlich.
Ein chimäres TACI-Protein der Erfindung kann ein Protein sein, welches durch Verbinden der extrazellulären Domäne eines anderen Rezeptormoleküls mit einer Transmembrandomäne und der intrazellulären Domäne eines TACI-Proteins erzeugt wird. In einer anderen Ausführungsform kann die extrazelluläre Domäne eines TACI-Proteins mit einer Transmembrandomäne und einer intrazellulären Domäne eines anderen Rezeptormoleküls verbunden werden. Die Transmembrandomäne kann die Transmembrandomäne eines TACI-Proteins, die Transmembrandomäne des anderen Rezeptors oder eine unterschiedliche Transmembrandomäne sein. Bevorzugt stammt die Transmembrandomäne von der gleichen Proteinkomponente der Chimäre wie die extrazelluläre Domäne.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein TACI-Protein, welches durch eine Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung kodiert wird, die eine Bindungsaffinität für CAML aufweist und, wenn in geeigneter Weise stimuliert, in situ, die Aktivierung eines Transkriptionsfaktors durch die Kombination eines Ca²⁺-abhängigen Weges und eines Ca²⁺-unabhängigen Weges initiiert.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Antisense-Nukleinsäuren ein, welche unter physiologischen Bedingungen mit den mRNAs hybridisieren, welche die TACI-Proteine der vorliegenden Erfindung kodieren. Solche Antisense-Nukleinsäuren können von einem Antisense-Gen transkribierte RNA oder exogen hergestellte (entweder durch Expression oder chemische Synthese) RNA oder DNA sein. Bevorzugt wird eine synthetische Antisense-Nukleinsäure mit nicht natürlich vorkommenden Bindungen hergestellt, um ihre schnelle Hydrolyse zu verhindern und so ihre wirksame Halbwertszeit zu erhöhen.
Eine Knockout-Maus ist auch Teil der vorliegenden Erfindung. Die Knockout-Maus umfasst ein erstes und zweites Allel, welche jeweils von Natur aus funktionelles TACI-Protein kodieren und exprimieren, aber in welcher mindestens eines der zwei Allele fehlerbehaftet ist und dabei verhindert, dass die Maus eine geeignete Menge des TACI-Proteins exprimiert. In einer Ausführungsform dieses Typs enthält das erste Allel einen Fehler, der verhindert, dass die Maus irgendein funktionelles TACI-Protein exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält eine Knockout-Maus sowohl ein fehlerbehaftetes erstes Allel und ein fehlerbehaftetes zweites Allel. Diese fehlerbehafteten Allele verhindern, dass das Tier funktionelles TACI-Protein exprimiert.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Antikörper für alle Nukleinsäuren und Polypeptide der vorliegenden Erfindung ein. In einer speziellen Ausführungsform wird der Antikörper gegen das TACI-Protein mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 oder ein antigenes Fragment davon hergestellt. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können entweder monoklonale Antikörper oder polyklonale Antikörper sein. In einer Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, welcher ein chimärer Antikörper ist.
Eine immortale Zelllinie, welche einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung hergestellt, ist auch Teil der vorliegenden Erfindung. In einer speziellen Ausführungsform dieser immortalen Zelllinie wird der monoklonale Antikörper gegen das TACI-Protein mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 oder ein antigenes Fragment davon hergestellt.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein N-terminales Fragment von CAML ein, welches zur Bindung an das C-terminale 126 Aminosäure-Fragment von TACI-1 ausreichend ist. In einer solchen Ausführungsform enthält das N-terminale Fragment von CAML 146 Aminosäu ren. Dieses N-terminale Fragment von CAML kann als ein Inhibitor der TACI-CAML-Bindung dienen.
Die vorliegende Erfindung schließt Verfahren zur Herstellung von TACI-Proteinen, Fragmenten davon und Fusionsproteinen davon ein. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Einbringen eines Expressionsvektors, welcher eine Nukleinsäure umfasst, die ein Polypeptid, welches ein TACI-Protein ist, oder ein Fragment davon oder ein Fusionsprotein davon kodiert, in eine Wirtzelle und das Exprimieren des kodierten Polypeptids. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das exprimierte Polypeptid eine Bindungsaffinität für CAML auf. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform initiiert das Polypeptid, wenn in geeigneter Weise stimuliert, in situ, die Aktivierung eines Transkriptionsfaktors durch die Kombination eines Ca²⁺-abhängigen und eines Ca²⁺-unabhängigen Weges. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform dieses Typs ist das exprimierte Polypeptid ein TACI-Protein mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2.
Verfahren zum Reinigen der exprimierten Polypeptide, welche TACI-Proteine, Fragmente davon und Fusionsproteine davon kodieren, sind auch Teil der vorliegenden Erfindung, genauso wie die gereinigten exprimierten Polypeptide selbst.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Verfahren zum Identifizieren eines Liganden für ein TACI-Protein ein. Eine Ausführungsform eines solchen Verfahrens umfasst das Inkontaktbringen des N-terminalen extrazellulären Polypeptids eines TACI-Proteins mit einem Testmolekül und das Nachweisen der Bindung des N-terminalen extrazellulären Polypeptids mit dem Testmolekül. Die Bindung des N-terminalen extrazellulären Polypeptids mit dem Testmolekül zeigt, dass das Testmolekül ein Ligand ist.
In einem alternativen Verfahren zum Identifizieren eines Liganden für ein TACI-Protein wird ein funktionelles TACI-Protein verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen dieses Typs ist das funktionelle TACI-Protein TACI-1. Die Bindung des funktionellen TACI-Proteins mit dem Testmolekül zeigt, dass das Testmolekül ein Ligand ist. In einer solchen Ausführungsform wird die Bindung des Testmoleküls an das funktionelle TACI-Protein durch Nachweisen der zellulären Aktivierung als eine Funktion des Levels der Aktivierung des AP-1-Weges bestimmt. In einer anderen Ausführungsform wird die Bindung des Testmoleküls an das funk tionelle TACI-Protein durch Nachweisen der zellulären Aktivierung als eine Funktion des Levels der Aktivierung des CAML-Weges bestimmt.
In einer anderen Ausführungsform wird das Binden des Testmoleküls an das funktionelle TACI-Protein durch Nachweisen der zellulären Aktivierung als eine Funktion des Levels der Konzentration des NF-AT-Transkriptionsfaktors bestimmt. In noch einer anderen Ausführungsform wird das Binden des Testmoleküls an das funktionelle TACI-Protein durch Nachweisen der zellulären Aktivierung als eine Funktion des Levels der Aktivierung des NF-KB-Weges bestimmt. In noch einer anderen Ausführungsform wird das Binden des Testmoleküls an dem funktionellen TACI-Protein durch Nachweisen der zellulären Aktivierung als eine Funktion des Levels der Aktivierung von NF-AT bestimmt. In diesem Fall kann der Level der Aktivierung von NF-AT durch Verfahren, welche das Zeigen der Translokation von NF-AT vom Cytoplasma zum Kern einschließen; die relative Dephosphorylierung von NF-AT; und/oder durch NF-AT-abhängige Transkription nachgewiesen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen werden mehr als eine der vorstehenden Bestimmungen der zellulären Aktivität durchgeführt und das Testmolekül wird als ein Ligand identifiziert, wenn alle Bestimmungen die Bindung des Testmoleküls an dem TACI-Protein zeigen. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform werden alle vorstehenden Bestimmungen von zellulärer Aktivierung durchgeführt und das Testmolekül wird als ein Ligand identifiziert, wenn alle diese Bestimmungen zeigen, dass das Testmolekül an das TACI-Protein bindet.
Verfahren zur Identifizierung eines Liganden für ein TACI-Protein können in einer großen Anzahl von Expressionssystemen, in welchen das TACI-Protein exprimiert werden kann, durchgeführt werden. Eine Ausführungsform verwendet die Verwendung eines Hefe-Zwei-Hybrid-Expressionssystems unter Verwendung des TACI-Proteins als „Köder". In einer anderen Ausführungsform kann Wechselwirkungsklonieren von E. coli-Expressionsbibliotheken verwendet werden. In noch einer anderen Ausführungsform kann funktionelles Expressionsklonieren des TACI-Proteins in Säugerzellen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Säugerzellen von B-Zellen abgeleitete Linien, wie Burkitt-Lymphome, EBV-immortalisierte Zelllinien oder multiple Myelomzelllinien. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform dieses Typs wird das TACI-Protein in Jurkat-T-Zellen exprimiert, welche ein Reportergen unter der Kontrolle eines NF-AT-Promotors enthalten. In einer solchen Aus führungsform kodiert das Reportergen sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) als den Marker.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Verfahren zum Screenen nach einem immunsuppressiven Arzneistoff, welcher die Aktivierung von B-Zellen in einem höheren Ausmaß inhibiert als er die Aktivierung von reifen T-Zellen inhibiert, ein. In bevorzugten Ausführungsformen dieses Typs inhibiert der immunsuppressive Arzneistoff die Aktivierung von B-Zellen, inhibiert aber die Aktivierung von reifen T-Zellen nicht. Solche Verfahren können in transformierten T-Zellen, wie einer Jurkat-T-Zelle, welche genetisch manipuliert werden kann, um das TACI-Protein zu exprimieren; oder in B-Zellen, welche von Natur aus das TACI-Protein exprimieren, durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung schließt Verfahren zum Identifizieren eines immunsuppressiven Arzneistoffes, welcher selektiv die Wirkung von B-Lymphozyten blockiert, ohne reife T-Lymphozyten zu beeinflussen, ein. Eine solche Ausführungsform umfasst das Inkontaktbringen eines ersten Lymphozyten mit einem möglichen Arzneistoff, wobei der erste Lymphozyt ein TACI-Protein und ein erstes Markerprotein enthält. Das erste Markerprotein wird transkribiert, wenn das TACI-Protein in der Abwesenheit eines Testarzneistoffes stimuliert wird. Das TACI-Protein wird stimuliert und das erste Markerprotein wird nachgewiesen unter Bedingungen, bei welchen, wenn es transkribiert wird, nachgewiesen werden kann. Ein möglicher Arzneistoff wird als ein Testarzneistoff ausgewählt, wenn das erste Markerprotein nicht nachgewiesen werden kann. Als nächstes wird ein zweiter Lymphozyt mit dem Testarzneistoff in Kontakt gebracht, wobei der zweite Lymphozyt einen T-Zellen-Rezeptor und ein zweites Markerprotein, welches transkribiert wird, wenn der T-Zellen-Rezeptor entweder in der Abwesenheit oder der Gegenwart des immunsuppressiven Arzneistoffes stimuliert wird, enthält. Der T-Zellen-Rezeptor wird stimuliert und das zweite Markerprotein wird nachgewiesen unter Bedingungen, bei welchen, wenn es transkribiert wird, nachgewiesen werden kann. Ein Testarzneistoff wird als ein immunsuppressiver Arzneistoff identifiziert, wenn das zweite Markerprotein nachgewiesen wird, da der immunsuppressive Arzneistoff den Weg beeinflusst (oder einen Aspekt davon), der das TACI-Protein einbezieht, aber nicht den Weg (oder einen Aspekt davon), der den T-Zellen-Rezeptor einbezieht.
In einer Ausführungsform sind die ersten und zweiten Lymphozyten Jurkat-T-Zellen, welche modifiziert wurden, damit sie ein TACI-Protein exprimieren. In einer solchen besonderen Ausführungsform umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen einer ersten Jurkat-T-Zelle mit einem möglichen Arzneistoff, wobei die erste Jurkat-T-Zelle genetisch-technologisch derart aufgebaut wurde, dass sie ein TACI-Protein und ein erstes Reportergen exprimiert. Das erste Reportergen wird durch einen NF-AT-Promotor kontrolliert und kodiert ein erstes Markerprotein. Das TACI-Protein wird aktiviert und der Umfang der Expression des ersten Markerproteins wird quantifiziert. Ein möglicher Arzneistoff wird als ein Testarzneistoff ausgewählt, wenn die Menge des ersten Markerproteins, welche in der Gegenwart des Testarzneistoffes exprimiert wird, relativ zur Menge, welche in der Abwesenheit des Testarzneistoffes exprimiert wird, erniedrigt ist. Der Testarzneistoff wird dann mit einer zweiten Jurkat-T-Zelle in Kontakt gebracht, welche einen T-Zellen-Rezeptor und ein zweites Reportergen enthält. Das zweite Reportergen wird durch einen NF-AT-Promotor kontrolliert und kodiert ein zweites Markerprotein. Der T-Zellen-Rezeptor wird aktiviert und der Umfang der Expression des zweiten Markerproteins wird quantifiziert und dann mit der Menge des zweiten Markerproteins, welche in der Abwesenheit des Testarzneistoffes exprimiert wird, verglichen. Ein Testarzneistoff wird als ein immunsuppressiver Arzneistoff identifiziert, wenn es entweder keine Abnahme beim Umfang der Expression des zweiten Markerproteins in der Gegenwart des Testarzneistoffes gibt oder wenn die Abnahme bei der Expression des zweiten Markerproteins messbar niedriger als die entsprechende Abnahme bei der Expression des ersten Markerproteins in der Gegenwart des Testarzneistoffes ist.
Jedwedes der hier beschriebenen Markerproteine kann für diese Ausführungsform der Erfindung verwendet werden, einschließlich SEAP, LacZ oder Luziferase. Das erste und zweite Markerprotein können das gleiche Protein oder zwei unterschiedliche Proteine sein. Das TACI-Protein kann aktiviert werden mit einem Antikörper, der sich gegen ein TACI-Protein richtet, oder ein aktives Fragment davon oder ein Fusionsprotein davon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das TACI-Protein TACI-1. Mehrere Promotoren können zum Kontrollieren des Reportergens verwendet werden, einschließlich der vorstehend erwähnte NF-AT-Promotor und der AP-1-Promotor. Mögliche Arzneistoffe können aus jedweder der momentan verfügbaren Arzneistoffbibliotheken und aus den hier beschriebenen chemischen und Phagebibliotheken erhalten werden.
Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden durch Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen und detaillierte Beschreibung besser ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Die Gewebeverteilung, Proteinsequenz und andere herausragende Merkmale von TACI-1. 1 zeigt einen Northern-Blot der gezeigten Gewebe, wobei mit TACI-1-cDNA als Sonde untersucht wurde. Andere untersuchten Gewebe schließen das Herz, das Gehirn, die Plazenta, die Lunge, die Leber, den Skelettmuskel, die Niere und die Bauchspeicheldrüse ein, wobei keines davon irgendeine TACI-1-mRNA-Expression zeigte.
2a zeigt die Aminosäuresequenz von TACI-1. Die vorgeschlagene Transmembrandomäne ist durch Boxdruck gezeigt und die Prosit-TNFR_NGFR-Motive sind unterstrichen. 2b zeigt eine Aufzeichnung der Kyte-Doolittle-Hydrophobizität und ein schematisches Diagramm von TACI-1, das die Positionen der vermeintlichen Transmembrandomäne (schwarz ausgefüllt) und die TNFR_NGRF-Motive (gepunktet) zeigt. 2c zeigt die Cysteinreste des TACI-Proteins und anderer TNFR-Familienmitglieder.
3. TACI-1 ist ein Zelloberflächenprotein. 3a zeigt die Durchflusszytometrie von TAg-Jurkat-T-Zellen, welche transient mit einem TACI-1-Expressionsplasmid und dem Transfektionsmarker pHook (Invitrogen) oder dem Transfektionsmarker pHook alleine transfiziert wurden. Die Zelloberflächenexpression von TACI-1 und des Transfektionsmarkerproteins HA-Hook wurden durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung des durch Immunaffinität gereinigten polyklonalen anti-TACI-1-Antikörpers und des monoklonalen 12CA5-Antikörpers nachgewiesen. Die gezeigten Daten stellen eine TACI-1-Anfärbung von Zellen, wobei der Austrittsspalt auf den Transfektionsmarker eingestellt wurde, dar. 3b zeigt eine Mikrofotografie, welche die Oberfläche der Anfärbung von Cos-7-Zellen zeigt, welche transient N-terminales FLAG-markiertes TACI-1 exprimieren, wobei mit M2 (anti-FLAG)-Antikörpern und fluoreszenten anti-Maus-IgG-Antikörpern angefärbt wurde [Bram & Crabtree, Nature, 371:355-358 (1994)]. Eine Oberflächenanfärbung war vorhanden, ob die Zellen mit Detergenz permeabilisiert wurden oder nicht.
4. TACI-1 ist ein Signalprotein, welches eine Funktion bei der Aktivierung von NF-AT-spezifischer Transkription aufweist. 4a zeigt die Aktivierung eines NF-AT-getriebenen sekretierten alkalischen Phosphatasereporters. TAg-Jurkat-T-Zellen, welche mit dem SXNFAT-Reporter [Bram et al., Mol. Cell. Biol., 13:4760-4769 (1993)] und dem Expressionsplasmid pBJ5 [Takebe, Y., et al., Mol. Cell. Biol., 8:466-472 (1988)] cotransfiziert wurden, welche entweder TACI-1-kodierende cDNA (ausgefüllte Dreiecke) oder Nichts (Kreise) enthielten, wurden mit 50 ng/ml PMA und den gezeigten Mengen an Ionomycin in der Gegenwart (geschlossene Symbole) und Abwesenheit (offene Symbole) von magnetischen Kügelchen, welche mit durch Immunaffinität gereinigten polyklonalen anti-TACI-1-Antikörpern überzogen waren, behandelt. 4b zeigt die Aktivierung von NF-AT durch Antikörper-vernetztes TACI-1, welches mit Cyclosporin A (CsA) oder FK506 blockiert wird. Die NF-AT-Aktivierung wurde in TAg-Jurkat-T-Zellen, welche mit SXNFAT und pBJ5 (– TACI-1, links) oder pBJ5-TACI-1 (+ TACI-1, rechts) cotransfiziert wurden und mit den gezeigten Kombinationen von PMA (50 ng/ml), Ionomycin (2 μM), CsA (100 ng/ml) und FK506 (500 pg/ml) in der Gegenwart von mit anti-TACI-1-Antikörper überzogenen Kügelchen (,NS', nicht stimuliert) behandelt wurden, bestimmt. 4c zeigt, dass eine NF-AT-Aktivierung durch Antikörper-vernetztes TACI-1 extrazelluläres Calcium erfordert. Die NF-AT-Aktivierung wurde in der Gegenwart von EGTA in Jurkat-T-Zellen, welche TACI-1 überexprimieren, gemessen. Die Behandlungen schlossen vernetztes anti-TACI-1 (Kreise), Transfektion mit einer C-terminalen trunkierten, Calcium-unabhängigen Calcineurin A-Untereinheit (Dreiecke) oder Aktivierung mit dem TCR-stimulierenden Antikörper OKT3 (Quadrate) ein. Alle Zellen wurden durch die Zugabe von PMA in 50 ng/ml costimuliert. 4d zeigt die Aktivierung eines AP-1-getriebenen sekretierten alkalischen Phosphatasereporters. Die AP-1-Aktivierung wurde in TAg-Jurkat-T-Zellen, welche mit einem Maus-Metallothionein-AP-1-SEAP-Reporter [Bram et al., 1991, vorstehend] und pBJ5, welches keine Einbringung (– TACI-1, links) oder TACI-1-cDNA (+ TACI-1, rechts) enthielt, cotransfiziert wurden, gemessen. Die Zellen wurden in der Abwesenheit oder mit in Reihe ansteigenden Mengen von vernetzten anti-TACI-1-Antikörpern inkubiert. Zur Kontrolle der Transfektionswirksamkeit wurde ein Plasmid eingeschlossen, welches einen konstitutiven Promotor enthielt, der die Expression von Luziferase (EF-Luc) antreibt.
5. Eine TACI-1-Wechselwirkung mit CAML ist für Ca²⁺-Signalvermittlung kritisch. 5a zeigt die Hefe-2-Hybrid-Wechselwirkung. cDNAs in voller Länge und die gezeigten Deletionsmutanten von TACI-1 und CAML wurden in die Hefeexpressionsplasmide pACT und/oder pAS1 kloniert und die gezeigten Kombinationen wurden auf Wechselwirkung mit dem Hefe-2-Hybrid-System getestet (,+', positive Wechselwirkung;,–', keine Wechselwirkung;,ND', nicht durchgeführt). 5b zeigt die Coimmunpräzipitation von CAML mit TACI-1. 293T-Zellen wurden mit den gezeigten Kombinationen des Expressionsplasmids pBJ5, welche cDNAs für CAML, TACI-1 mit einer N-terminalen FLAG-Markierung, die N-terminalen 146 Aminosäuren von CAML (CLX91) oder keine Einbringung enthielten, transfiziert. Nach einer Inkubation für 48 Stunden wurden die Zellen lysiert (1 % Dodecylmaltosid, 20 mM HEPES, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 10 % Glycerol, 2 mM MgSO₄, 1 mM CaCl₂, 1 mM PMSF) und das Lysat wurde durch Zentrifugation geklärt. FLAG-markiertes TACI-1 und in Zusammenhang stehende Proteine wurden mit Agarose-Kügelchen, an welche monoklonaler anti-FLAG-Antikörper konjugiert war, immunpräzipitiert und einem Westerntransfer unter Verwendung von Standardprotokollen unterworfen. Der Western-Blot wurde mit den Sonden durch Immunaffinität gereinigte polyklonale anti-CAML-Antikörper, gefolgt von Chemilumineszenznachweis (Amersham) untersucht. Parallele Western-Blots, welche für jede Probe durchgeführt wurden, bestätigten die erwartete Expression von TACI-1, CAML oder der trunkierten CAML-Mutante in allen Transfektionen. 5 zeigt, dass die Überexpression der N-terminalen Hälfte von CAML eine dominante negative Wirkung auf die TACI-1-induzierte NF-AT-Aktivierung hat. NF-AT-Aktivierung wurde in TAg-Jurkat-Zellen bestimmt, welche mit pBJ5 alleine, pBJ5-TACI-1 plus das Kontrollplasmid oder pBJ5-TACI-1 mit einer äquivalenten Menge an CLX91 transfiziert wurden, gefolgt von einer Behandlung mit TACI-1-spezifischen Antikörpern (oben). Die TACI-1-Expression in diesen Transfektionen wurde durch Western-Blot unter Verwendung von polyklonalen anti-TACI-1-Antikörpern bestimmt (unten). 5d zeigt ein schematisches Diagramm, welches das TACI-1/CAML-Signaltransduktionsmodell (,SOC', Calciumkanal, der mit Vorräten arbeitet) zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt in ihrer breitesten Ausführungsform einen neuen Zelloberflächenrezeptor, der normalerweise in B-Lymphozyten und in einem viel geringeren Ausmaß in unreifen T-Lymphozyten vorhanden ist, bereit. Die Rolle des Zelloberflächenrezeptors, des Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Proteins, ist die Teilhabe an alternativen oder costimulierenden Wegen zur Aktivierung oder Kontrolle der Lymphozytenfunktion. Diese Funktionen können die Antwort von Lymphozyten auf fremde Antigene bei Infektion oder gegen Krebs, bei der Transplantatabstoßung und Transplantat-Wirt-Reaktion einschließen. Zusätzlich spielt die Aktivierung der Lymphozytensignalvermittlung eine Schlüsselrolle während der Lymphozytenentwicklung, wodurch die positive Selektion von funktionellen Lymphozyten und die negative Selektion gegen selbstreaktive Klone ermöglicht werden. Wenn aktiviert, stimuliert das TACI-Protein den Zufluss von Calcium in Lymphozyten. Ein solcher Calciumzufluss kann unter speziellen Umständen zum Einsetzen des programmierten Zelltods (Apoptose) führen.
Die Ausdrücke „Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs"-Protein oder „TACI" oder „TACI-Protein" werden hier austauschbar mit „CAML-bindendes Transmembranprotein" oder „TCB" oder „TCB-Protein" verwendet und betreffen ein proteinartiges Material, welches einzelne oder multiple Proteine einschließt, die als ein neuer Zelloberflächenrezeptor wirken, der normalerweise in B-Lymphozyten vorhanden ist. Dieser Zelloberflächenrezeptor weist das hier dargelegte Aktivitätsprofil auf. Demgemäß werden ebenso Proteine, welche eine im Wesentlichen äquivalente oder veränderte Aktivität zeigen, in Betracht gezogen. Diese Modifizierungen können beabsichtigt, zum Beispiel wie Modifizierungen, welche durch auf eine Stelle gerichtete Mutagenese erhalten werden, oder unbeabsichtigt, wie jene, welche durch Mutationen in Wirten erhalten werden, welche Hersteller des Proteins sind, sein. Eingeschlossen innerhalb des Umfangs dieser Ausdrücke sind Proteine, welche speziell hier erwähnt werden, sowie alle im Wesentlichen homologen Analoga und Allelvariationen.
In einer Ausführungsform ist das Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungsprotein TACI-1, das humane Homolog. Wie im Beispiel nachstehend gezeigt, initiiert TACI-1 einen vorher nicht nachgewiesenen Signaltransduktionsmechanismus, welcher direkt Zelloberflächenstimuli mit dem intrazellulären Signalmolekül CAML verbindet. Deshalb ist TACI-1 ein Mitglied einer neuen Klasse von Lymphozyten-spezifischen Zelloberflächenrezeptoren, welche die Immunantwort modulieren und so als ein Werkzeug zur Regulierung des Immunsystems in entweder einer positiven oder einer negativen Richtung verwendet werden können. In einer speziellen Ausführungsform weist TACI-1 die in SEQ ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz auf.
Wie hier verwendet, bedeutet, wenn gesagt wird, dass eine besondere Nukleinsäure ein Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, dass der Teil der besonderen Nukleinsäure, der aus der Kodiersequenz für dieses Protein oder Polypeptid besteht, identifiziert ist. Zum Beispiel erstreckt sich die Kodierregion von SEQ ID Nr. 1 von Nuldeotid 14 bis Nukleotid 895, einschließlich des 3 Nukleotid-Translationsstoppcodons am 3/-Terminus.
Für viele Zwecke besteht ein wesentliches Interesse, in der Lage zu sein, selektiv die Aktivierung von Lymphozyten zu verhindern, oder in der Alternative, selektiv ihre Aktivierung zu steigern. Zum Beispiel für Lymphozyten-vermittelte Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungssyndrom und Transplantat-Wirt-Erkrankung ist die Inhibierung der Aktivierung der einbezogenen Lymphozyten eine mögliche oder notwendige Behandlung für die Erkrankung. Zudem besteht im Falle von Myeloma, Lymphomen und Leukämien, insbesondere von B-Zellen oder unreifen T-Zellen, ein Interesse zur Verlangsamung der Proliferation der Krebszellen, was Therapien ermöglichen kann, welche für den Wirt nicht so schädlich wie Therapien von heutzutage sind. Auf der anderen Seite wäre es für Infektionen oder Antitumorimmunantworten von Interesse, in der Lage zu sein, Lymphozyten zu aktivieren, um schneller auf das Pathogen zu antworten. So ermöglicht die vorliegende Erfindung die Auswahl von nützlichen Mitteln, z.B. synthetischen organischen Verbindungen, welche Lymphozyten durch Bereitstellen einer früher unbekannten Schlüsselkomponente im Lymphozytenaktivierungsweg aktivieren und/oder deaktivieren können.
Zusätzlich, wenn man den Aktivierungsweg vollständiger versteht, ist man in der Lage, den Weg wirksamer zu modulieren, wie durch Bereitstellen von Mitteln, welche selektiv für eine besondere Gruppe oder Untergruppe einer zellulären Population sind. Da in vielen Fällen die Aktivierung eine Costimulation erfordert, kann das in der Lage sein, Mittel, welche für die Zelle verfügbar sind, zu manipulieren, eine solche zelluläre Aktivität ermöglichen. In diesem Zusammenhang würde die Identifizierung eines Targetproteins, welches zur Entwicklung von Arzneistoffen, die einen besonderen Weg, wie den CAML-vermittelten Aktivierungsweg, modulieren, verwendet werden kann, ermöglichen, dass Ärzte insbesondere bestimmte Immunzustände behandeln, ohne Überstimulierung oder Übersuppression von anderen heiklen Aspekten des Immunsystems, welche ansonsten gut funktionieren. Eine solche zielgerichtete Stimulierung kann zur spezifischen Amplifizierung der Wirkungen von Immunstimulatoren, wie IL-2, verwendet werden, wodurch die Verwendung von niedrigeren Dosen des Immunstimulators und die Verringerung von Nebenwirkungen ermöglicht wird.
Darüber hinaus ist die Erfindung ein wichtiger Fortschritt beim Verständnis des CAML-vermittelten Aktivierungsweges, indem eine selektive Bewertung und Kontrolle über die Gegenwart oder die Abwesenheit eines besonderen Zwischenprodukts in dem Weg erlaubt wird. Dies kann mit einem Knockout-Tier unter Verwendung von homologer Rekombination, Integration von Genen, welche Antisense-Sequenzen bereitstellen, Einbringung von Expressionskonstrukten, welche induzierbare Promotoren einbeziehen, und dergleichen erreicht werden. Es besteht auch ein Interesse, in der Lage zu sein, zu bestimmen, wann ein besonderes Gen exprimiert wird oder abgeschaltet ist, die Natur der Zellen zu bestimmen, in welchen das Protein exprimiert wird, und dergleichen. Deshalb besteht ein wesentliches Interesse an der Identifizierung von speziellen Komponenten der zellulären Wege, welche das Verständnis eines Aktivierungsweges, das selektive Modulieren dieses Weges und das Entwickeln von Arzneistoffen, welche beim Binden an das Targetprotein aktiv sein können, ermöglichen. In dieser Weise können Arzneistoffe auf die Inhibierung von solchen spezifischen Wegen gescreent werden.
Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt einen Arzneistoff-Screen ein, welcher TACI als ein Werkzeug zum Entwickeln von immunsuppressiven Arzneistoffen, welche spezifisch für B-Lymphozyten sind, verwendet. Solche immunsuppressiven Arzneistoffe würden selektiv die Wirkung von B-Lymphozyten blockieren, während T-Zellen intakt gelassen werden, um Patienten vor Viruspathogenen zu schützen. Diese Arzneistoffe wären bei der Behandlung von Erkrankungen wie systemischer Lupus erythematodes, eine Erkrankung aufgrund einer Überaktivierung der B-Lymphozyten-Antwort, oder Multiples Myelom (z.B. Bence-Jones-Myelom) nützlich.
Das Vernetzen des TACI-Proteins aktiviert den Calciumzufluss und möglicherweise andere Sekundärbotenstoffe. Seine Wirkungsweise kann durch CAML vermittelt werden. Im Gegensatz zu bekannten Zelloberflächensignalmolekülen, welche spezifisch für B-Zellen oder T-Zellen sind, wie CD4, CD8, TCR und CD3, wechselwirkt der neue Zelloberflächenrezeptor der vorliegenden Erfindung physikalisch mit CAML. Zudem besteht keine Sequenzhomologie zwischen dem neuen Zelloberflächenrezeptor der vorliegenden Erfindung und jedwedem dieser bekannten Lymphozytzelloberflächensignalmoleküle oder jedweden anderen Zelloberflächensignalmolekülen.
TACI-Proteine und -Polypeptide
In einer breiten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung TACI-Proteine bereit. Solche Proteine schließen eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine Cytoplasmadomäne ein. Die extrazelluläre Domäne bindet einen Liganden. Über die Ligandbindung bindet die Cytoplasmadomäne CAML, wodurch ein Ca²⁺-abhängiger Aktivierungsweg initiiert wird. Rezeptoroligomerisierung, z.B. durch Bindung eines Liganden oder mit einem anti-Rezeptorantikörper, initiiert auch einen nicht Ca²⁺-abhängigen Aktivierungsweg.
Die monomere Form eines TACI-Proteins enthält etwa 295 Aminosäuren. Wie hier verwendet, bedeutet „etwa 295 Aminosäuren" zwischen 265 bis 325 Aminosäuren, d. h. grob plus oder minus 10 %.
Die Erfindung betrifft ferner funktionell aktive Polypeptidkomponenten von TACI. In einer Ausführungsform ist eine funktionell aktive Komponente von TACI ein antigenes Fragment, z.B. ein Peptid, welches mit anti-TACI-Antikörpern reaktiv ist, oder welches, wenn an einen Träger konjugiert, zur Erzeugung von anti-TACI-Antikörpern verwendet werden kann. Ein anderes funktionell aktives Fragment schließt die extrazelluläre Domäne, welche den Liganden bindet, ein. Die extrazelluläre Domäne entspricht dem N-terminalen Fragment von TACI, z.B. vom ersten Aminosäurerest des reifen TACI bis zur Transmembrandomäne. In einer speziellen Ausführungsform weist die extrazelluläre Domäne die Aminosäuresequenz auf, welche etwa Rest 1 bis etwa Rest 166 von SEQ ID Nr. 6 entspricht. Die Ligandbindungsregion von TACI ist ein Unterfragment des N-terminalen Fragments, welches der extrazellulären Domäne entspricht.
Noch ein anderes funktionell aktives Fragment ist die Cytoplasmadomäne, z.B. vom C-terminalen Ende der Transmembrandomäne bis zum C-Terminus von TACI. Die Cytoplasmadomäne von TACI vermittelt die Signaltransduktion über Ca²⁺-abhängige und Ca²⁺-unabhängige Mechanismen. Die Cytoplasmadomäne schließt die CAML-Bindungsregion von TACI ein. Insbesondere bindet diese Domäne ein Polypeptid, welches den N-terminalen 146 Aminosäureresten von CAML entspricht. In einer speziellen Ausführungsform entspricht die Cytoplasmadomäne von etwa Aminosäurerest 187 bis etwa Aminosäurerest 293 von SEQ ID Nr. 2.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung proteolytische Fragmente eines TACI-Proteins bereit. Solche Fragmente können durch enzymatische Verdauung, z.B. mit Saureus-Polypeptiden V8 in Papaintrypsin, Chymotrypsin, Cathepsin, Collagenase, Enteropeptidase, Thrombin oder fibrinolytischen oder Gerinnungsenzymen; durch chemische Spaltung, z.B. mit Cyanogenbromid oder Natriumborhydrid; usw. hergestellt werden.
In einer speziellen Ausführungsform ist das TACI-Protein ein Rezeptorprotein mit der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz von Rest 1 bis Rest 293. Die vorliegende Erfindung zieht Allelvarianten von TACI, homologe TACI-Proteine von anderen Spezies und TACI-Analoga, z.B. welche durch Durchführen von konservativen Aminosäuresubstitutionen entweder durch genetisch-technologisches Aufbauen oder durch chemische Synthese hergestellt werden, in Betracht. Ein TACI-Analogon der Erfindung schließt auch antigene TACI-Fragmente ein, welche z.B. einen terminalen Cysteinrest enthalten, um ein Vernetzen mit einem Trägerprotein zu ermöglichen.
Es gibt keine veröffentlichten DNA-Sequenzen, welche mit der von TACI-1 nahe verwandt sind. Eine Suche nach Prosit-Motiven in TACI-1 enthüllt ein TNFR_NGFR-Muster, welches aus C-x(4,6)-[FYH]-x(5,10)-C-x(0,2)-C-x(2,3)-C-x(7,11)-C-x(4,6)-[DNEQSKP]-x(2)-C in der N-terminalen Hälfte des Proteins besteht (wobei z.B. C-x(4,6)-[FYH] eine Aminosäuresequenz zeigt, welche mit Cystein beginnt, gefolgt von entweder 4, 5 oder 6 unspezifischen Aminosäuren, ferner gefolgt von entweder einem Phenylalanin, einem Tyrosin oder einem Histidin). Dieses Motiv wird in einer Anzahl von Proteinen gefunden, wobei die meisten Rezeptoren für Wachstumsfaktoren sind. Einige dieser Proteine weisen eine Kopie dieses Motivs auf. Ein Vergleich der TACI-1-Proteinsequenz mit sich selbst enthüllt eine signifikante Wiederholung zwischen dem TNFR_NGFR-Motiv bei den Resten 33 bis 66 und den Resten 70 bis 104. Diese Analyse zog die Aufmerksamkeit auf das Vorhandensein von zwei Cysteinreichen Domänen des TNFR-Typs, welche diese Regionen umfassen, was zeigt, dass TACI-1 ein Mitglied der Superfamilie der TNFR-Rezeptoren ist.
Synthetische TACI-Polypeptide. Der Ausdruck „Polypeptid" wird in seinem breitesten Sinne verwendet, um sich auf eine Verbindung mit zwei oder mehr Aminosäure-, Aminosäureanaloga- oder Peptidmimetikauntereinheiten zu beziehen. Die Untereinheiten können durch Peptidbindungen verbunden sein. In einer anderen Ausführungsform kann die Untereinheit durch andere Bindungen, z.B. Ester, Ether, usw., verbunden sein. Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Aminosäure" entweder natürliche und/oder nicht-natürliche oder synthetische Aminosäuren, einschließlich Glycin und beide optischen D- oder L-Isomere und Aminosäurenaloga und Peptidmimetika. Ein Peptid aus drei oder mehr Aminosäuren wird im Allgemeinen ein Oligopeptid genannt, wenn die Peptidkette kurz ist. Wenn die Peptidkette lang ist, wird das Peptid im Allgemeinen ein Polypeptid oder ein Protein genannt. Gemäß der Erfindung können TACI-Fragmente, wie antigene Fragmente, oder möglicherweise sogar TACI in voller Länge synthetisch hergestellt werden.
Synthetische Polypeptide, welche unter Verwendung der bekannten Techniken von Festphase, Flüssigphase oder von Peptidkondensationstechniken oder jedweder Kombination davon hergestellt werden, können natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren einschließen. Aminosäuren, welche für die Peptidsynthese verwendet werden, können Boc-(N^α-Aminogeschütztes N^α-t-Butyloxycarbonyl)-Aminosäurestandardharz mit den Entschützungs-, Neutralisations-, Kupplungs- und Waschstandardprotokollen des Originalfestphasenverfahrens von Merrifield V. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)] oder die basenlabilen N^α-Amino-geschützten 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc)-Aminosäuren, welche zuerst von Carpino und Han [J. Org. Chem., 37:3403-3409 (1972)] beschrieben wurden, sein. Sowohl Fmoc- als auch Boc-N^α-Amino-geschützte Aminosäuren können von Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem oder Peninsula Labs oder anderen Chemiefirmen, welche dem Fachmann vertraut sind, erhalten werden. Zusätzlich kann das Verfahren der Erfindung mit anderen N^α-Schutzgruppen, welche dem Fachmann vertraut sind, verwendet werden. Festphasenpeptidsynthese kann durch Techniken, welche dem Fachmann vertraut sind und zum Beispiel in Stewart und Young, 1984, Solid Phase Synthesis, 2. Ausgabe, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Fields und Noble, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214 bereitgestellt werden, oder unter Verwendung von automatisierten Synthesevorrichtungen, wie sie von ABS verkauft werden, erreicht werden. So können Polypeptide der Erfindung D-Aminosäuren, eine Kombination aus D- und L-Aminosäuren und verschiedene „Designer"-Aminosäuren (z. B. β-Methylaminosäuren, Cα-Methylaminosäuren und Nα-Methylaminosäuren, usw.) umfassen, um spezielle Eigenschaften zu übertragen. Synthetische Aminosäuren schließen Ornithin für Lysin, Fluorphenylalanin für Phenylalanin und Norleucin für Leucin oder Isoleucin ein. Zusätzlich können durch Zuordnen von speziellen Aminosäuren in speziellen Kupplungsschritten α-Helices, β-Turns, β-Faltblätter, γ-Turns und cyclische Peptide erzeugt werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden Untereinheiten von Peptiden, welche nützliche chemische und Struktureigenschaften verleihen, gewählt. Zum Beispiel Peptide, welche D-Aminosäuren umfassen, werden in vivo gegen L-Aminosäure-spezifische Proteasen resistent sein. Zusätzlich zieht die vorliegende Erfindung die Herstellung von Peptiden, welche besser definierte Struktureigenschaften aufweisen, und die Verwendung von Peptidmimetika und peptidmimetischen Bindungen, wie Esterbindungen, um Peptide mit neuen Eigenschaften herzustellen, in Betracht. In einer anderen Ausführungsform kann ein Peptid erzeugt werden, welches eine verringerte Peptidbindung, d. h. R₁-CH₂-NH-R₂, wobei R₁ und R₂ Aminosäurereste oder -sequenzen sind, beinhaltet. Eine verringerte Peptidbindung kann als eine Dipeptiduntereinheit eingebracht werden. Ein solches Molekül wäre gegen Peptidbindungshydrolyse, z.B. Proteaseaktivität, resistent. Solche Peptide würden Liganden mit einzigartiger Funktion und Aktivität, wie verlängerte Halbwertszeiten in vivo aufgrund der Resistenz gegen einen metabolischen Abbau oder Proteaseaktivität, bereitstellen. Darüber hinaus ist bekannt, dass in bestimmten Systemen eingeschränkte Peptide eine gesteigerte funktionelle Aktivität zeigen [Hruby, Life Sciences, 31:189-199 (1982)]; [Hruby et al., Biochem J., 268:249-262 (1990)]; wobei die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines eingeschränkten Peptids, welches an allen anderen Positionen statistische Sequenzen beinhaltet, bereitstellt.
Nicht-klassische Aminosäuren, welche Konformationseinschränkungen induzieren:
Die folgenden nicht-klassischen Aminosäuren können in das Peptid eingebracht werden, um besondere Konformationsmotive einzubringen: 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carboxylat [Kazmierski et al., J. Am. Chem. Soc., 113:2275-2283 (1q991)]; (2S,3S)-Methylphenylalanin, (2S,3R)-Methylphenylalanin, (2R,3S)-Methylphenylalanin und (2R,3R)-Methylphenylalanin [Kazmierski und Hruby, Tetrahedron Lett., (1991)]; 2-Aminotetrahydronaphthalin-2-carbonsäure [Landis, Ph.D. Thesis, University of Arizona, (1989)]; Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carboxylat [Miyake et al., J. Takeda Res. Labs., 43:53-76 (1989)]; β-Carbolin (D und L) [Kazmierski, Ph.D. Thesis, University of Arizona, (1988)]; HIC (Histidin- Isochinolincarbonsäure) [Zechel et al., Int. J. Pep. Protein Res., 43 (1991)]; und HIC (Histidin-cyclischer Harnstoff) (Dharanipragada).
Die folgenden Aminosäureanaloga und Peptidmimetika können in ein Peptid eingebracht werden, um spezielle Sekundärstrukturen zu induzieren oder zu begünstigen: LL-Acp (LL-3-Amino-2-propenidon-6-carbonsäure), einen β-Turn induzierendes Dipeptidanalogon (Kemp et al., J. Org. Chem., 50:5834-5838 (1985)]; β-Faltblatt induzierende Analoga [Kemp et al., Tetrahedron Lett., 29:5081-5082 (1988)]; β-Turn induzierende Analoga [Kemp et alqq., Tetrahedron Lett., 29:5057-5060 (1988)]; α-Helix induzierende Analoga [Kemp et al., Tetrahedron Lett., 29:4935-4938 (1988)]; γ-Turn induzierende Analoga [Kemp et al., J. Org. Chem., 54:109-115 (1989)]; und Analoga, welche in den folgenden Druckschriften bereitgestellt werden: Nagai und Sato, Tetrahedron Lett., 26:647-650 (1985); DiMaio et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., S. 1687 (1989); auch ein Gly-Ala-Turn-Analogon [Kahn et al., Tetrahedron Lett., 30:2317 (1989)]; Amidbindungsisoster [Jones et al., Tetrahedron Lett., 29:3853-3856 (1988)]; Tretrazol [Zabrocki et al., J. Am. Chem. Soc., 110:5875-5880 (1988)]; DTC [Samanen et al., Int. J. Protein Pep. Res. 35:501-509 (1990)]; und Analoga, welche in Olson et al., J. Am. Chem. Sci., 112:323-333 (1990) und Garvey et al., J. Org. Chem., 56:436 (1990) gelehrt werden. In der Konformation eingeschränkte Mimetika von beta-Turns und beta-Ausbauchungen und Peptide, welche sie enthalten, werden im U.S. Patent Nr. 5,440,013 , veröffentlicht am 08. August 1995, von Kahn beschrieben.
Proteinderivate. Es gibt zwei Hauptklassen von Peptid-Kohlenhydrat-Verknüpfungen zu Proteinen. Erstens, Etherbindungen binden das Serin- oder Threoninhydroxyl an ein Hydroxyl des Zuckers. Zweitens, Amidbindungen binden Glutamat- oder Aspartatcarboxylgruppen an eine Aminogruppe an dem Zucker. Acetal- und Ketalbindungen können auch ein Kohlenhydrat an ein Peptid binden.
Im Allgemeinen können das TACI-Protein oder ein Fragment davon, wie das N-terminale extrazelluläre Domänenfragment oder das C-terminale CAML-bindende Cytoplasmadomänenfragment, durch das Anbinden von einer oder mehr chemischen Einheiten an die Proteineinheit derivatisiert werden. Eine chemische Modifizierung einer biologisch aktiven Komponente oder Komponenten kann zusätzliche Vorteile unter bestimmten Umständen, wie Erhöhen der Stabilität und der Zeit im Blutkreislauf der Komponente oder Komponenten und Erniedrigen der Immunogenität, bereitstellen. Siehe U.S. Patent Nr. 4,179,337 , Davis et al., ver öffentlicht am 18. Dezember 1979. Für einen Überblick siehe Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs [J.S. Holcerberg und J. Roberts, Herausg., S. 367-383 (1981)]. Ein Übersichtsartikel, der Proteinmodifizierung und Fusionsproteine beschreibt, ist Francis, Focus an Growth Factors, 3:4-10 (1992), Mediscript: Mountview Court, Friere Barnet Lane, London N20, OLD, UK.
Die chemischen Einheiten, welche für Derivatisierung geeignet sind, können unter wasserlöslichen und wasserunlöslichen Polymeren ausgewählt werden, wobei wasserlösliche Polymere bevorzugt sind. Das ausgewählte Polymer sollte bevorzugt wasserlöslich sein, so dass die Komponente, an welche es angebunden wird, in einer wässrigen Umgebung, wie einer physiologischen Umgebung, nicht ausfällt. Bevorzugt wird für eine therapeutische Verwendung der Endproduktzubereitung das Polymer pharmazeutisch verträglich sein. Ein Fachmann wird in der Lage sein, das gewünschte Polymer auszuwählen, bezogen auf solche Erwägungen wie, ob das Polymer-/Komponentenkonjugat therapeutisch verwendet wird, und, falls ja, die gewünschte Dosierung, die Zeit im Blutkreislauf, die Resistenz gegen Proteolyse und andere Erwägungen. Für die vorliegende Komponente oder Komponenten kann dies unter Verwendung der hier bereitgestellten Tests ermittelt werden.
Markierte TACI-Proteine. Das TACI-Protein der vorliegenden Erfindung und Fragmente davon können markiert werden. Geeignete Markierungen schließen Enzyme, Fluorophore (z.B. Fluoreszenzisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Texasrot (TR), Rhodamin, freie oder Chelat-gebundene Salze der Lanthanidreihe, insbesondere Eu³⁺, um einige Fluorophore zu nennen), Chromophore, Radioisotope, Chelat-bildende Mittel, Farbstoffe, kolloidales Gold, Latexteilchen, Liganden (z.B. Biotin) und chemilumineszente Mittel ein. Wenn ein Kontrollmarker verwendet wird, können gleiche oder unterschiedliche Markierungen für die Testprobe und den Kontrollmarker verwendet werden.
In dem Falle, in welchem eine radioaktive Markierung, wie die Isotope ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I und ¹⁸⁶Re, verwendet wird, können bekannte momentan verfügbare Zählverfahren verwendet werden. In dem Falle, in welchem die Markierung ein Enzym ist, kann das Nachweisen durch jedwede der momentan verwendeten kalorimetrischen, spektrofotometrischen, fluorspektrofotometrischen, amperometrischen oder gasometrischen Techniken, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, erreicht werden.
Direkte Markierungen sind ein Beispiel von Markierungen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Eine direkte Markierung wurde als eine Einheit definiert, welche in ihrem natürlichen Zustand leicht sichtbar ist, entweder mit bloßem Auge oder mit der Hilfe eines optischen Filters und/oder verwendeter Stimulation, z.B. UV-Licht, um Fluoreszenz zu fördern. Unter Beispielen von gefärbten Markierungen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind metallische Solteilchen, zum Beispiel Goldsolteilchen, wie jene, welche von Leuvering beschrieben werden ( U.S. Patent 4,313,734 ); Farbstoffsolteilchen, wie jene, welche von Gribnau et al. ( U.S. Patent 4,373,932 ) und May et al. ( WO 88/08534 ) beschrieben werden; gefärbtes Latex, wie von May, vorstehend, Snyder ( EP-A 0 280 559 und 0 281 327 ) beschrieben; oder Farbstoffe, welche in Liposome eingekapselt sind, wie von Campbell et al. beschrieben ( U.S. Patent 4,703,017 ), eingeschlossen. Andere direkte Markierungen schließen ein Radionukleotid, eine fluoreszente Einheit oder eine lumineszente Einheit ein. Zusätzlich zu diesen direkten Markierungseinrichtungen können auch indirekte Markierungen, welche Enzyme umfassen, gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Verschiedene Typen von Immuntests mit gebundenen Enzymen sind auf dem Fachgebiet bekannt, zum Beispiel alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase, Lysozym, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Urease, wobei diese und andere im Detail von Eva Engvall in Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT in Methods in Enzymology, 70:419-439 (1980) und im U.S. Patent 4,857,453 erörtert werden.
Geeignete Enzyme schließen alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Andere Markierungen zur Verwendung in der Erfindung schließen magnetische Kügelchen oder bildgebende Markierungen aufgrund von magnetischer Resonanz ein.
In einer anderen Ausführungsform kann eine Phosphorylierungsstelle an einem Antikörper der Erfindung zum Markieren mit ³²P erzeugt werden, z. B. wie im Europäischen Patent Nr. 0 372 707 (Anmeldenr. 89311108.8 ) von Pestka oder U.S. Patent Nr. 5,459,240 , veröffentlicht am 17. Oktober 1995, von Foxwell et al. beschrieben.
Wie hier beispielhaft angegeben, können Proteine, welche Antikörper einschließen, durch metabolisches Markieren markiert werden. Metabolisches Markieren findet während in vitro-Inkubation der Zellen statt, welche das Protein in der Gegenwart von Kulturmedium, welches mit einer metabolischen Markierung, wie [³⁵S]-Methionin oder [³²P]-Orthophosphat, ergänzt wurde, exprimieren. Zusätzlich zu metabolischem (oder biosynthetischem) Markieren mit [³⁵S]-Methionin zieht die Erfindung ferner das Markieren mit [¹⁴C]-Aminosäuren und [³H]-Aminosäuren (wobei das Tritium an nicht labilen Positionen substituiert wird) in Betracht.
Chimäre TACI-Proteine
Ein chimäres TACI-Protein der Erfindung kann ein Protein sein, welches durch Verbinden einer funktionellen Domäne eines TACI-Proteins, wie die Ligand-bindende Domäne oder die CAML-bindende Domäne, mit der komplementären Domäne eines anderen Proteins, z. B. eines alternativen Rezeptors, erzeugt wird. Chimäre Konstrukte können auch mit einem funktionell aktiven Fragment eines TACI-Proteins und einem anderen funktionell aktiven Molekül hergestellt werden. Zum Beispiel kann die extrazelluläre Domäne eines TACI-Proteins an die Fc-Domäne eines Immunglobulins gebunden werden. Alternativ kann die Cytoplasmadomäne eines TACI-Proteins an einen Rezeptorliganden, wie Transferrin oder ein Hormon, für intrazelluläres Zielrichten gebunden werden. In noch einer anderen Ausführungsform kann eine TACI-Domäne mit einem anderen Targetmolekül, wie die schwere Kette oder leichte Kette eines anti-Immunglobulinmoleküls (z. B. ein Fv-Teil eines Antikörpers), um speziell auf B-Zellen abzuzielen, verbunden werden. In noch einer anderen Ausführungsform kann das funktionell aktive Fragment eines TACI-Proteins, bevorzugt die N-terminale extrazelluläre Domäne, mit einem Glycosylphospholipid, wie Glycosylphosphoinositol, eine Ankersignalsequenz, welche bevorzugt am C-Terminus des TACI-Fragment lokalisiert ist, so dass ein Glycolipidverankertes Protein erzeugt wird, verbunden werden [Cross, Annu. Rev. Cell Biol., 6:1-39 (1990); Low, Biochem. J., 244:1-13 (1987)].
Ein chimärer TACI-Rezeptor kann durch Verbinden der extrazellulären Domäne eines anderen Rezeptormoleküls mit einer Transmembrandomäne und der intrazellulären Domäne eines TACI-Proteins hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform kann die extrazelluläre Domäne von TACI mit einer Transmembrandomäne und einer intrazellulären Domäne eines anderen Rezeptormoleküls verbunden werden. Die Transmembrandomäne kann die Transmembrandomäne eines TACI-Proteins, die Transmembrandomäne des anderen Rezeptors oder eine unterschiedliche Transmembrandomäne sein. Bevorzugt stammt die Transmembrandomäne von der gleichen Proteinkomponente der Chimäre wie die extrazelluläre Domäne. Chimäre Rezeptoren wurden beschrieben [Internationale Patentveröffentlichungen WO 96/23814 ; WO 96/23881 und WO 96/24671 ]. Chimäre Antigenrezeptoren wurden beschrieben [Capon et al., U.S. Patent Nr. 5,359,046 , veröffentlicht am 25. Oktober 1994], einschließlich funktionelle Antigen-spezifische Rezeptoren, welche in B-Zellen [Sanchez et al., J. Exp. Med., 178:1049-1055 (1993)] und T-Zellen [Burkhardt et al., Mol. Cell. Biol., 14:1095-1103 (1994)] durch Fusion der Igα- und Igβ-Signaltransduktionsketten mit IgM erzeugt wurden. Verschiedene Cytokinrezeptoren vom Typ I und Typ II, einschließlich Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-6, Interleukin-8, Interleukin-10, Interleukin-12, Erythropoietin, Granulozyt-Makrophage-Kolonie stimulierender Faktor (CSF), Granulozyt-CSF, Makrophage-CSF, α-Chemokinrezeptoren und β-Chemokinrezeptoren, können komplementäre Komponenten in einem chimären Rezeptor, welcher ein funktionell aktives Fragment eines TACI-Proteins umfasst, bereitstellen.
Wie der Fachmann erkennen kann, sind Transmembrandomänen im Allgemeinen funktionell äquivalent für das Verankern eines Proteins in einer Membran. Jedoch kann die Gegenwart von speziellen Aminosäureresten in einer Transmembrandomäne eine Rezeptorwechselwirkung mit, z.B. Dimerisierung, oder eine Assoziation mit anderen integralen Membranproteinen, wie bei einem Multiproteinrezeptorkomplex, beeinflussen. So hängt die Wahl einer Transmembrandomäne davon ab, ob regulatorische Funktionen, welche durch die Transmembrandomäne durchgeführt werden, erwünscht oder notwendig sind.
Nukleinsäuren, welche TACI-Proteine kodieren
Die vorliegende Erfindung zieht die Isolierung eines Gens, welches ein TACI-Protein, einschließlich eine vollständige Länge, oder eine natürlich vorkommende Form eines TACI-Proteins und jedwede antigenen Fragmente davon von jedweder tierischen, insbesondere Säuger- und stärker besonders menschlichen Quelle kodiert, in Betracht. Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Gen" eine Ansammlung von Nukleotiden, welche ein Polypeptid kodieren, und schließt cDNA- und Genom-DNA-Nukleinsäuren ein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können herkömmliche Molekularbiologie-, Mikrobiologie- und rekombinante DNA-Techniken innerhalb dem Fachwissen verwendet werden. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erklärt. Siehe z.B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor Labo ratory Press, Cold Spring Harbor, New York (hier "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Bände I und II (D.N. Glover, Aut. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Aut. (1984)]; Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins, Aut. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, Aut. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, Aut. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (Aut.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Deshalb sollen die folgenden Ausdrücke, wenn sie hier erscheinen, die nachstehend dargelegten Definitionen aufweisen.
Ein „Vektor" ist ein Replikon, wie Plasmid, Phage oder Cosmid, an welches ein anderes DNA-Segment angefügt werden kann, um so die Replikation des angefügten Segments zu bewirken. Ein „Replikon" ist jedwedes genetische Element (z.B. Plasmid, Chromosom, Virus), welches als eine autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo fungiert, d. h. zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle fähig ist.
Eine „Kassette" betrifft ein Segment einer DNA, welches in einen Vektor an speziellen Restriktionsstellen eingebracht werden kann. Das Segment der DNA kodiert ein Polypeptid von Interesse und die Kassette und die Restriktionsstellen sind derart designed, dass eine Einbringung der Kassette in den geeigneten Leserahmen für Transkription und Translation sichergestellt wird.
Eine Zelle wurde mit einer exogenen oder heterologen DNA „transfiziert", wenn eine solche DNA in die Zelle eingebracht wurde. Eine Zelle wurde mit einer exogenen oder heterologen DNA „transformiert", wenn die transfizierte DNA eine Phänotypveränderung bewirkt. Bevorzugt sollte die transformierende DNA in Chromosomen-DNA, welche das Genom der Zelle darstellt, integriert (kovalent gebunden) sein.
„Heterologe" DNA betrifft DNA, welche von Natur aus nicht in der Zelle oder in einer Chromosomenstelle der Zelle vorhanden ist. Bevorzugt schließt die heterologe DNA ein Gen, welches für die Zelle fremd ist, ein.
Ein „Nukleinsäuremolekül" betrifft die polymere Phosphatesterform von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin; „RNA-Moleküle") oder Deoxyribonukleosiden (Deoxyadenosin, Deoxyguanosin, Deoxythymidin oder Deoxycytidin; „DNA-Moleküle") und jedwede Phosphoresteranaloga davon, wie Phosphorthioate und Thioester, in sowohl Einzelstrangform als auch einer Doppelstranghelix. Doppelsträngige DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helices sind möglich. Der Ausdruck Nukleinsäuremolekül und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül betreffen nur die primäre und sekundäre Struktur des Moleküls und schränken es nicht auf irgendwelche besonderen tertiären Formen ein. So schließt dieser Ausdruck doppelsträngige DNA ein, welche unter anderem in linearen oder ringförmigen DNA-Molekülen (z.B. Restriktionsfragmenten), Plasmiden und Chromosomen gefunden wird. Bei der Erörterung der Struktur der besonderen doppelsträngigen DNA-Moleküle können Sequenzen hier gemäß der normalen Konvention beschrieben werden, wobei die Sequenz nur entlang der Richtung von 5' zu 3' des nicht transkribierten DNA-Strangs angegeben wird (d. h. der Strang mit einer Sequenz, welche homolog zur mRNA ist). Ein „rekombinantes DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül, welches einer molekularbiologischen Manipulation unterworfen wurde.
Ein Nukleinsäuremolekül ist mit einem anderen Nukleinsäuremolekül, wie einer cDNA, Genom-DNA oder RNA, „hybridisierbar", wenn eine einsträngige Form des Nukleinsäuremoleküls Annealing mit einem anderen Nukleinsäuremolekül unter den geeigneten Bedingungen von Temperatur und Lösungsionenstärke durchführen kann (siehe Sambrook et al., vorstehend). Die Bedingungen von Temperatur und Innenstärke bestimmen die „Strenge" der Hybridisierung. Für ein vorläufiges Screening nach homologen Nukleinsäuren können Hybridisierungsbedingungen mit niedriger Strenge, welche einer T_m von 55° entsprechen, z.B. 5x SSC, 0,1 % SDS, 0,25 % Milch und kein Formamid; oder 30 % Formamid, 5x SSC, 0,5 % SDS, verwendet werden. Hybridisierungsbedingungen mit moderater Strenge entsprechen einer höheren T_m, z.B. 40 % Formamid mit 5x oder 6x SCC. Hybridisierungsbedingungen mit hoher Strenge entsprechen der höchsten T_m, z.B. 50 % Formamid, 5x oder 6x SCC. Eine Hybridisierung erfordert, dass die zwei Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl abhängig von der Strenge der Hybridisierung Fehlstellungen zwischen Basen möglich sind. Die geeignete Strenge zum Hybridisieren von Nukleinsäuren hängt von der Länge der Nukleinsäuren und vom Komplementaritätsgrad, Variablen, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, ab. Je höher der Ähnlichkeits- oder Homologiegrad zwischen zwei Nukleotidsequenzen ist, desto höher ist der Wert von T_m für Hybride von Nukleinsäuren mit jenen Se quenzen. Die relative Stabilität (entsprechend zu einer höheren T_m) von Nukleinsäurehybridisierungen nimmt in der folgenden Reihenfolge ab: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Für Hybride mit mehr als 100 Nukleotiden in der Länge wurden Gleichungen zur Berechnung von T_m abgeleitet (siehe Sambrook et al., vorstehend, 9.50-0.51). Bei der Hybridisierung von kürzeren Nukleinsäuren, d. h. Oligonukleotiden, wird die Position von Fehlstellungen wichtiger und die Länge des Oligonukleotids bestimmt ihre Spezifität (siehe Sambrook et al., vorstehend, 11.7-11.8). Eine minimale Länge für eine hybridisierbare Nukleinsäure beträgt mindestens 10 Nuldeotide; bevorzugt mindestens 18 Nukleotide; stärker bevorzugt beträgt die Länge mindestens 24 Nukleotide und am stärksten bevorzugt mindestens 30 Nukleotide in der Länge. In einer speziellen Ausführungsform weist eine hybridisierbare Nukleinsäure der Erfindung eine Sequenz auf, welche mindestens 12 Nukleotiden, bevorzugt mindestens 18 Nukleotiden, stärker bevorzugt mindestens 24 Nukleotiden und am stärksten bevorzugt mindestens 30 Nukleotiden in der Länge von SEQ ID Nr. 1 und spezieller der Kodiersequenz von SEQ ID Nr. 1 entspricht.
In einer speziellen Ausführungsform betrifft der Ausdruck „Hybridisierungsstandardbedingungen" eine T_m von 55°C und verwendet Bedingungen, wie vorstehend dargelegt. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die T_m 60°C; in einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt die T_m 65°C.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Oligonukleotid" eine Nukleinsäure mit im Allgemeinen mindestens 18 Nukleotiden, welche mit einem Genom-DNA-Molekül, einem cDNA-Molekül oder einem mRNA-Molekül, welche ein TACI-Protein kodieren, hybridisierbar ist. Oligonuldeotide können markiert sein, z.B. mit ³²P-Nukleotiden oder Nukleotiden, an welche eine Markierung, wie Biotin, kovalent konjugiert wurde (siehe die Erörterung, vorstehend, in Bezug auf das Markieren von TACI-Polypeptiden). In einer Ausführungsform kann ein markiertes Oligonukleotid als eine Sonde verwendet werden, um die Gegenwart einer Nukleinsäure, welche ein TACI-Protein kodiert, nachzuweisen. In einer anderen Ausführungsform können Oligonukleotide (wobei eines oder beide markiert sein können) als PCR-Primer verwendet werden, entweder zum Klonieren der vollständigen Länge oder eines Fragments eines TACI-Proteins oder zum Nachweisen der Gegenwart von Nukleinsäuren, welche ein TACI-Protein kodieren. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Oligonukleotid der Erfindung eine Tripelhelix mit einem TACI-DNA-Molekül bilden. Im Allgemeinen werden Oligonukleotide synthetisch, bevorzugt mit einer Nukleinsäuresynthetisiervorrichtung hergestellt. Dem gemäß können Oligonukleotide mit nicht natürlich vorkommenden Phosphoresteranalogonbindungen, wie Thioesterbindungen, usw., hergestellt werden.
„Homologe Rekombination" betrifft die Einbringung einer fremden DNA-Sequenz eines Vektors in ein Chromosom. Bevorzugt ist der Vektor auf eine spezielle Chromosomenstelle für homologe Rekombination zielgerichtet. Für eine spezielle homologe Rekombination wird der Vektor ausreichend lange Regionen mit Homologie zu Sequenzen des Chromosoms enthalten, um ein komplementäres Binden und die Einbringung des Vektors in das Chromosom zu ermöglichen. Längere Regionen mit Homologie und höheren Graden von Sequenzähnlichkeit können die Wirksamkeit der homologen Rekombination erhöhen.
Eine DNA-„Kodiersequenz” ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, welche in einer Zelle in vitro oder in vivo in ein Polypeptid transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der Kodiersequenz werden durch ein Startcodon am 5'-(Amino)-Terminus und ein Translationsstoppcodon am 3'-(Carboxyl)-Terminus bestimmt. Eine Kodiersequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, Genom-DNA-Sequenzen von eukaryotischer (z.B. Säuger) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen einschließen, ist aber nicht darauf eingeschränkt. Wenn die Kodiersequenz für die Expression in einer eukaryotischen Zelle beabsichtigt ist, wird normalerweise ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz 3' zur Kodiersequenz lokalisiert sein. In einer speziellen Ausführungsform weist eine TACI-Kodiersequenz der Erfindung die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Nukleotidsequenz auf.
Transkription- und Translationskontrollsequenzen sind regulatorische DNA-Sequenzen, wie Promotoren, Enhancer, Terminatoren und dergleichen, welche die Expression einer Kodiersequenz in einer Wirtzelle bereitstellen. In eukaryotischen Zellen sind Polyadenylierungssignale Kontrollsequenzen.
Eine „Promotorsequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, welche zum Binden von RNA-Polymerase in einer Zelle und zum Initiieren von Transkription einer nachgelagerten (3'-Richtung) Kodiersequenz in der Lage ist. Für Definitionszwecke der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle gebunden und erstreckt sich strangaufwärts (5'-Richtung), wobei sie die minimale Anzahl von Basen oder Elementen einschließt, die zur Initiierung der Transkription in Levels, welche über dem Hintergrund nachweisbar sind, notwendig sind. Innerhalb der Promotorsequenz wird man eine Transkriptionsinitiationsstelle (welche praktischerweise zum Beispiel durch Mapping mit Nuklease S1 definiert wird) sowie Proteinbindungsdomänen (Consensus-Sequenzen), welche für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind, finden.
Eine Kodiersequenz steht „unter der Kontrolle" von Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die Kodiersequenz in mRNA transkribiert, welche dann gespleißte trans-RNA und in das Protein, welches durch die Kodiersequenz kodiert wird, translatiert wird.
Eine „Signalsequenz" kann am Anfang der Kodiersequenz eines Proteins eingeschlossen sein, wobei sie auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert wird. Diese Sequenz kodiert ein Signalpeptid, N-terminal zum reifen Polypeptid, welches die Wirtzelle zur Translokation des Polypeptids veranlasst. Der Ausdruck „Translokationssignalsequenz" wird hier verwendet, um sich auf diese Art von Signalsequenz zu beziehen.
Translokationssignalsequenzen können im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Proteinen, welche für Eukaryoten und Prokaryoten nativ sind, gefunden werden und sind oft in beiden Organismustypen funktionell. Interessanterweise wird das TACI der Erfindung derart transportiert, dass der N-Terminus in der Abwesenheit einer gespaltenen Signalsequenz extrazellulär ist. Folglich ist dieses Transmembranprotein ein Transmembranprotein vom Typ III [siehe Wilson-Rawels et al., Virology, 201:66-76 (1994)]. So kann es sein, dass bei einem Konstrukt der vorliegenden Erfindung (einschließlich einem chimären Konstrukt, wie vorstehend erörtert), wenn der N-terminale Teil des Konstrukts den N-Terminus von TACI kodiert, ein Signalpeptid nicht erforderlich ist, um die Expression des Transmembran-TACI-Proteins zu erhalten.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Sequenzhomologie" in allen seinen grammatikalischen Formen die Beziehung zwischen Proteinen, welche einen „gemeinsamen Evolutionsursprung" besitzen, einschließlich Proteine von Superfamilien (z.B. die Immunglobulinsuperfamilie) und homologe Proteine von unterschiedlichen Spezies (z.B. leichte Kette von Myosin, usw.) [Reeck et al., Cell, 50:667 (1987)]. Die vorliegende Erfindung zieht natürlich Homologe des humanen TACI-Proteins, wenn sie in dem Umfang der Erfindung fallen, in Betracht.
Demgemäß betrifft der Ausdruck „Sequenzähnlichkeit" in allen seinen grammatikalischen Formen den Identitäts- oder Entsprechungsgrad zwischen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, ob sie einen gemeinsamen Evolutionsursprung teilen oder nicht (siehe Reeck et al., vorstehend). Bei allgemeiner Verwendung kann der Ausdruck „homolog", wenn er mit einem Adverb wie „hoch" modifiziert ist, Sequenzähnlichkeit und nicht einen gemeinsamen Evolutionsursprung betreffen.
In einer speziellen Ausführungsform sind zwei DNA-Sequenzen „im Wesentlichen homolog" oder „im Wesentlichen ähnlich", wenn mindestens etwa 60 % (bevorzugt mindestens etwa 75 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 90 oder 95 %) der Nukleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen zueinander passend sind. Sequenzen, welche im Wesentlichen homolog sind, können durch Vergleichen der Sequenzen unter Verwendung von Standardsoftware, welche in Sequenzdatenbanken erhältlich ist, oder in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter zum Beispiel strengen Bedingungen, wie für dieses besondere System definiert, identifiziert werden. Die Definierung von geeigneten Hybridisierungsbedingungen liegt innerhalb des Standes der Technik. Siehe z. B. Maniatis et al., vorstehend; DNA Cloning, Bd. I & II, vorstehend; Nucleic Acid Hybridization, vorstehend. Die vorliegende Erfindung zieht Nukleotide in Betracht, welche mit SEQ ID Nr. 1 (oder ihrer komplementären Sequenz) zu 60 % identisch sind oder stärker bevorzugt zu 75 % identisch sind. Bevorzugt sind solche im Wesentlichen ähnlichen Nukleinsäuren homolog. In ähnlicher Weise sind in einer besonderen Ausführungsform zwei Aminosäuresequenzen „im Wesentlichen homolog" oder „im Wesentlichen ähnlich", wenn mehr als 30 % der Aminosäuren identisch sind oder mehr als etwa 60 % ähnlich (funktionell identisch) sind. Bevorzugt werden die ähnlichen oder homologen Sequenzen durch Ausrichtung unter Verwendung von zum Beispiel des GCG-(Genetics Computer Group, Programmbenutzerhandbuch für das GCG-Packet, Version 7, Madison, Wisconsin)-Pileup-Programms identifiziert.
Der Ausdruck „entsprechen" wird hier verwendet, um auf ähnliche oder homologe Sequenzen Bezug zu nehmen, egal ob die genaue Position identisch oder unterschiedlich zu dem Molekül ist, zu welchem die Ähnlichkeit oder Homologie gemessen wird. Folglich betrifft der Ausdruck „entsprechen" die Sequenzähnlichkeit und nicht die Nummerierung der Aminosäurereste oder Nuldeotidbasen.
Ein Gen, welches ein TACI-Protein kodiert, ob Genom-DNA oder cDNA, kann aus jedweder Quelle, insbesondere aus einer humanen cDNA- oder Genombibliothek, isoliert werden. Verfahren zum Erhalten eines TACI-Protein-Gens sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie vorstehend beschrieben (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, vorstehend).
Demgemäß kann jedwede Tierzelle möglicherweise als die Nukleinsäurequelle für das molekulare Klonieren eines TACI-Protein-Gens dienen. Die DNA kann durch Standardverfahren, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, aus klonierter DNA (z.B. einer DNA-„Bibliothek") erhalten werden und wird bevorzugt aus einer cDNA-Bibliothek, welche aus Geweben mit hohen Expressionslevels des Proteins hergestellt wurde (z.B. eine Thymus-cDNA-Bibiothek, da es scheint, dass periphere Blutzellen und insbesondere Lymphozytenzellen die höchsten Expressionslevels an TACI-Protein aufweisen), durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonierung oder durch die Klonierung von Genom-DNA oder Fragmenten davon, welche aus der gewünschten Zelle aufgereinigt wurden, erhalten (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, vorstehend; Glover, D.M. (Aut.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K., Bd. I, II). Klone, welche von Genom-DNA abgeleitet sind, können regulatorische und Intron-DNA-Regionen zusätzlich zu Kodierregionen enthalten; wobei Klone, welche von cDNA abgeleitet sind, keine Intronsequenzen enthalten werden. Was die Quelle auch immer ist, das Gen sollte durch molekulares Klonieren in einen geeigneten Vektor zur Vermehrung des Gens eingebracht werden.
Beim molekularen Klonieren des Gens aus Genom-DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, wobei einige davon das gewünschte Gen kodieren. Die DNA kann an speziellen Stellen unter Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in der Gegenwart von Mangan zur Fragmentierung der DNA verwenden oder die DNA kann physikalisch geschert werden, wie zum Beispiel durch Ultraschall. Die linearen DNA-Fragmente können dann gemäß der Größe durch Standardtechniken, welche Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese und Säulenchromatografie einschließen, aber nicht darauf eingeschränkt sind, aufgetrennt werden.
Wenn die DNA-Fragmente erzeugt wurden, kann die Identifizierung des speziellen DNA-Fragments, welches das gewünschte TACI-Protein-Gen enthält, in einer Anzahl von Wegen erreicht werden. Zum Beispiel können ein Teil eines TACI-Protein-Gens oder seine spezifische RNA oder ein Fragment davon gereinigt und markiert werden, wobei die erzeugten DNA-Fragmente dann durch Nukleinsäurehybridisierung mit der markierten Sonde gescreent werden können [Benton und Davis, Science, 196:180 (1977)]; [Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72:3961 (1975)]. Zum Beispiel kann eine Gruppe von Oligonukleotiden, welche der Teilaminosäuresequenzinformation entsprechen, die für das TACI-Protein erhalten wurde, hergestellt und als Sonden für eine DNA, welche ein TACI-Protein kodiert, oder als Primer für cDNA oder mRNA verwendet werden (z.B. in Kombination mit einem poly-T-Primer für RT-PCR). Bevorzugt wird ein Fragment ausgewählt, welche für das TACI-Protein der Erfindung in hohem Maße einzigartig ist. Jene DNA-Fragmente mit einer wesentlichen Homologie zu der Sonde werden hybridisieren. Wie vorstehend angegeben, je höher der Homologiegrad, desto strengere Hybridisierungsbedingungen können verwendet werden. In einer speziellen Ausführungsform werden strenge Hybridisierungsbedingungen verwendet, um ein homologes TACI-Protein-Gen zu identifizieren.
Eine weitere Auswahl kann auf der Basis der Eigenschaften des Gens, z.B. ob das Gen ein Proteinprodukt mit der isoelektrischen, elektrophoretischen, Aminosäurezusammensetzung oder eine Teilaminosäuresequenz des hier offenbarten TACI-Proteins kodiert, durchgeführt werden. So kann die Gegenwart des Gens durch Tests, bezogen auf die physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produkts, nachgewiesen werden. Zum Beispiel können cDNA-Klone oder DNA-Klone, welche an den geeigneten mRNAs Hybrid-selektieren, selektiert werden, welche ein Protein herstellen, das z.B. ähnliche(s) oder identische(s) elektrophoretische Migration, isoelektrisches Fokussier- oder Nichtgleichgewichts-pH-Wert-Gelelektrophorese-Verhalten, proteolytische Verdauungskarten oder antigene Eigenschaften, wie für das TACI-Protein bekannt, aufweist.
Ein TACI-Protein-Gen der Erfindung kann auch durch mRNA-Selektion, d. h. durch Nukleinsäurehybridisierung, gefolgt von in vitro-Translation, identifiziert werden. In diesem Verfahren werden Nukleotidfragmente zur Isolierung von komplementären mRNAs durch Hybridisierung verwendet. Solche DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte TACI-Protein-DNA darstellen oder können synthetische Oligonukleotide sein, welche nach der Teilaminosäuresequenzinformation designed wurden. Immunpräzipitationsanalyse oder funktionelle Tests (z.B. CAML-Bindungsaktivität) der in vitro-Translationsprodukte der Produkte der isolierten mRNAs identifizieren die mRNA und deshalb die komplementären DNA-Fragmente, welche die gewünschten Sequenzen enthalten. Zusätzlich können spezielle mRNAs durch Adsorption von Polysomen, welche aus den Zellen isoliert werden, an immobilisierten Anti körpern, welche spezifisch gegen das TACI-Protein gerichtet sind, wie der hier beschriebene polyklonale Kaninchen-anti-Mensch-TACI-Protein-Antikörper, ausgewählt werden.
Eine radiomarkierte TACI-Protein-cDNA kann unter Verwendung der ausgewählten mRNA (aus den adsorbierten Polysomen) als ein Templat synthetisiert werden. Die radiomarkierte mRNA oder cDNA können dann als eine Sonde zur Identifizierung von homologen TACI-Protein-DNA-Fragmenten unter anderen Genom-DNA-Fragmenten verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Klonieren von Vektoren, welche Gene enthalten, die Analoga und Derivate des TACI-Proteins der Erfindung kodieren, welche die gleiche oder homologe funktionelle Aktivität wie das TACI-Protein und Homologe davon von anderen Spezies aufweisen. Die Herstellung und Verwendung von Derivaten und Analoga, welche mit dem TACI-Protein verwandt sind, liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. In einer speziellen Ausführungsform sind das Derivat oder Analogon funktionell aktiv, d. h. in der Lage, eine oder mehr funktionelle Aktivitäten aufzuweisen, welche mit der vollen Länge eines Wildtyp-TACI-Proteins der Erfindung in Zusammenhang stehen. In einer anderen Ausführungsform enthält das TACI-Protein eine unterschiedliche Cytoplasmadomäne, z.B. eine, welche nicht in der Lage ist, CAML zu binden, welche aber in der Lage ist, die Aktivierung von AP-1 zu modulieren. In einer anderen Ausführungsform kann ein TACI-Protein der Erfindung mit einer Lektindomäne oder Domänen von einem anderen Protein, wie dem Mannoserezeptor von Makrophagen oder dem Phospholipaserezeptor am Muskel, hergestellt werden.
TACI-Protein-Derivate können durch Verändern der kodierenden Nukleinsäuresequenzen durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen, welche funktionell äquivalente Moleküle bereitstellen, hergestellt werden. Bevorzugt werden Derivate hergestellt, welche eine gesteigerte oder erhöhte funktionelle Aktivität, relativ zum nativen TACI-Protein, aufweisen. Alternativ können solche Derivate lösliche Fragmente der extrazellulären TACI-Protein-Domäne kodieren, welche die gleiche oder eine höhere Affinität für den natürlichen Liganden des TACI-Proteins der Erfindung aufweisen. Solche löslichen Derivate können wirksame Inhibitoren der Ligandbindung an das TACI-Protein sein.
Aufgrund des Abbaus von Nukleotidkodiersequenzen können andere DNA-Sequenzen, welche im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie ein TACI-Protein-Gen kodieren, in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese schließen Allelgene, homologe Gene von anderen Spezies und Nukleotidsequenzen, welche alle oder Teile von TACI-Protein-Genen umfassen, die durch die Substitution von unterschiedlichen Codons verändert wurden, die den gleichen Aminosäurerest in der Sequenz kodieren, wodurch eine Veränderung ohne Wirkung erzeugt wird, ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Ebenso schließen die TACI-Protein-Derivate der Erfindung jene ein, welche als eine primäre Aminosäuresequenz die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines TACI-Proteins, einschließlich veränderte Sequenzen, in welchen funktionell äquivalente Aminosäurereste für Reste in der Sequenz substituiert wurden, welche in einer konservativen Aminosäuresubstitution resultieren, enthalten, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Und so ist eine solche Substitution als eine konservative Substitution definiert.
Zum Beispiel können ein oder mehr Aminosäurereste in der Sequenz mit einer anderen Aminosäure mit einer ähnlichen Polarität, welche als ein funktionelles Äquivalent wirkt, substituiert werden, was in einer Veränderung ohne Wirkung resultiert. Ersatzreste für eine Aminosäure in der Sequenz können von anderen Bestandteilen der Klasse, zu welcher die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel schließen die nicht polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Aminosäuren, welche aromatische Ringstrukturen enthalten, sind Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. Es wird nicht erwartet, dass solche Veränderungen das scheinbare Molekulargewicht, wie durch Polyacrylamidgelelektrophorese oder isoelektrischen Punkt bestimmt, beeinflussen.
Besonders bevorzugte Substitutionen sind:

– Lys für Arg und umgekehrt, so dass eine positive Ladung erhalten werden kann;
– Glu für Asp und umgekehrt, so dass eine negative Ladung erhalten werden kann;
– Ser für Thr, so dass ein freies -OH erhalten werden kann; und
– Gln für Asn, so dass ein freies NH₂ erhalten werden kann.

Aminosäuresubstitutionen können auch eingebracht werden, um eine Aminosäure mit einer besonders bevorzugten Eigenschaft zu substituieren. Zum Beispiel kann ein Cys an einer möglichen Stelle für Disulfidbrücken mit einem anderen Cys eingebracht werden. Ein His kann als eine besonders „katalytische" Stelle eingebracht werden (d. h. His kann als eine Säure oder Base wirken und ist die gewöhnlichste Aminosäure in der biochemischen Katalyse). Pro kann wegen seiner besonders Planaren Struktur eingebracht werden, was β-Turns in der Struktur des Proteins induziert.
Die Gene, welche TACI-Protein-Derivate und -Analoga der Erfindung kodieren, können durch verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Manipulationen, welche in ihrer Herstellung resultieren, können auf dem Gen- oder Proteinlevel auftreten. Zum Beispiel kann die Sequenz eines klonierten TACI-Protein-Gens durch jedwede von zahlreichen auf dem Fachgebiet bekannten Strategien modifiziert werden (Sambrook et al., 1989, vorstehend). Die Sequenz kann an geeigneten Stellen mit Restriktionsendonuklease(n) gespalten, gefolgt von einer weiteren enzymatischen Modifizierung, falls gewünscht, isoliert und in vitro ligiert werden. Bei der Herstellung des Gens, welches ein Derivat oder Analogon des TACI-Proteins kodiert, sollte man Vorsicht walten lassen, um sicher zu stellen, dass das modifizierte Gen im selben Translationsleserahmen wie das TACI-Protein-Gen ohne Unterbrechung durch Translationsstoppsignale in der Genregion, in welcher die gewünschte Aktivität kodiert wird, bleibt.
Zusätzlich kann die TACI-Protein-kodierende Nukleinsäuresequenz in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translation-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen zu erzeugen und/oder zu zerstören oder um Variationen in Kodierregionen zu erzeugen und/oder neue Restriktionsendonukleasestellen zu bilden oder bereits existierende zu zerstören, um eine weitere in vitro-Modifizierung zu ermöglichen. Bevorzugt steigern solche Mutationen die funktionelle Aktivität des mutierten TACI-Protein-Genprodukts. Jedwede auf dem Fachgebiet bekannte Technik für Mutagenese kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, auf eine Stelle gerichtete in vitro-Mutagenese [Hutchinson, C., et al., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978)]; [Zoller und Smith, DNA, 3:479-488 (1984)]; [Oliphant et al., Gene, 44:177 (1986)]; [Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:710 (1986)], die Verwendung von TAB^®-Linkern (Pharmacia), usw. PCR-Techniken sind für auf eine Stelle gerichtete Mutagenese bevorzugt (siehe Higuchi, „Using PCR to Engineer DNA", in PCR Tech nology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, Aut., Stockton Press, Kapitel 6, S. 61-70 (1989)).
Das identifizierte und isolierte Gen kann dann in einen geeigneten Kloniervektor eingebracht werden. Eine große Anzahl von Vektor-Wirt-Systemen, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, kann verwendet werden. Mögliche Vektoren schließen Plasmide oder modifizierte Viren, wobei aber das Vektorsystem mit der verwendeten Wirtzelle kompatibel sein muss, ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Beispiele von Vektoren schließen E. coli, Bakteriophagen wie Lambda-Derivate oder Plasmide wie pBR322-Derivate oder pUC-Plasmidderivate, z.B. pGEX-Vektoren, pmal-c, pFLAG, usw. ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Die Einbringung in einen Kloniervektor kann zum Beispiel durch Ligierung des DNA-Fragments in einen Kloniervektor, welcher komplementäre kohäsive Termini aufweist, erreicht werden. Wenn jedoch die komplementären Restriktionsstellen, welche zum Fragmentieren der DNA verwendet werden, nicht im Kloniervektor vorhanden sind, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann jedwede gewünschte Stelle durch Ligieren von Nukleotidsequenzen (Linkern) an die DNA-Termini erzeugt werden; wobei diese ligierten Linker spezielle chemisch synthetisierte Oligonukleotide umfassen können, welche Restriktionsendonukleaseerkennungssequenzen kodieren. Rekombinante Moleküle können in Wirtzellen über Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. eingebracht werden, so dass viele Kopien der Gensequenz erzeugt werden. Bevorzugt ist das klonierte Gen in einem Shuttle-Vektorplasmid enthalten, welches eine Expansion in einer Klonierzelle, z. B. E. coli, und eine erleichterte Reinigung für eine anschließende Einbringung in eine geeignete Expressionszelllinie, wenn dies gewünscht ist, bereitstellt. Zum Beispiel kann ein Shuttle-Vektor, der ein Vektor ist, der in mehr als einem Organismustyp replizieren kann, zur Replikation in sowohl E. coli als auch Saccharomyces cerevisiae durch Verbinden von Sequenzen eines E. coli-Plasmids mit Sequenzen des Hefe-2μ-Plasmids hergestellt werden.
In einem alternativen Verfahren kann das gewünschte Gen nach dem Einbringen in einen geeigneten Kloniervektor in einem „Schrotflinten"-Versuch identifiziert und isoliert werden. Eine Anreicherung des gewünschten Gens, zum Beispiel durch Größenfraktionierung, kann vor der Einbringung in den Kloniervektor durchgeführt werden.
Expression der Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungspolypeptide
Die Nukleotidsequenz, welche das TACI-Protein kodiert, oder ein antigenes Fragment, Derivat oder Analogon davon, oder ein funktionell aktives Derivat, einschließlich ein chimäres Protein, davon, können in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht werden, d. h. in einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der eingebrachten Protein-kodierenden Sequenz enthält. Solche Elemente werden hier als ein „Promotor" bezeichnet. Folglich steht die Nukleinsäure, welche das TACI-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, operativ mit einem Promotor in einem Expressionsvektor der Erfindung in Zusammenhang. Sowohl cDNA- als auch Genomsequenzen können unter der Kontrolle von solchen regulatorischen Sequenzen kloniert und exprimiert werden. Ein Expressionsvektor schließt auch bevorzugt einen Replikationsursprung ein.
Die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale können in einem rekombinanten Expressionsvektor bereitgestellt werden oder sie können durch ein natives Gen, welches ein TACI-Protein und/oder seine flankierenden Regionen kodiert, bereitgestellt werden.
Wie vorstehend erläutert, schließen mögliche chimäre Partner des TACI-Proteins jene mit Lektindomänen ein, entweder von natürlich vorkommenden mehrwertigen Lektinrezeptoren, wie Mannoserezeptor von Makrophagen, natürliche Lektine, oder von anderen Quellen, oder eine Ersatz-Cytoplasmadomäne, welche zum Vermitteln der Signaltransduktion oder zum Modifizieren der Endocytenverarbeitung in der Lage ist.
Mögliche Wirt-Vektor-Systeme schließen Säugerzellsysteme, welche mit Virus (z.B. Vacciniavirus, Adenovirus, usw.) infiziert wurden; Insektenzellsysteme, welche mit Virus (z. B. Baculovirus) infiziert wurden; Mikroorganismen wie Hefe, welche Hefevektoren enthalten; oder Bakterien, welche mit Bakteriophage, DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert wurden, ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Die Expressionselemente von Vektoren variieren in ihren Stärken und Spezifitäten. Abhängig vom verwendeten Wirt-Vektor-System kann jedwedes einer Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.
Ein rekombinantes TACI-Protein der Erfindung oder funktionelles Fragment, Derivat, chimäres Konstrukt oder Analogon davon können nach der Einbringung der Kodiersequenz durch Rekombination chromosomal exprimiert werden. Diesbezüglich kann jedwedes einer Anzahl von Amplifizierungssystemen verwendet werden, um hohe Levels einer stabilen Genexpression zu erreichen (siehe Sambrook et al., 1989, vorstehend).
Die Zelle, die den rekombinanten Vektor enthält, der die Nukleinsäure umfasst, welche ein TACI-Protein kodiert, wird in einem geeigneten Zellkulturmedium unter Bedingungen, welche die Expression des TACI-Proteins durch die Zelle bereitstellen, kultiviert.
Jedwedes der Verfahren, welche vorstehend für die Einbringung von DNA-Fragmenten in einen Kloniervektor beschrieben werden, kann zum Aufbau von Expressionsvektoren, welche ein Gen enthalten, das aus den geeigneten Transkriptions-/Translationskontrollsignalen und den Proteinkodiersequenzen besteht, verwendet werden. Diese Verfahren können rekombinante DNA-in vitro- und synthetische Techniken und in vivo-Rekombination (genetische Rekombination) einschließen.
Die Expression des TACI-Proteins kann durch jedwedes Promotor-/Enhancerelement, welches auf dem Fachgebiet bekannt ist, kontrolliert werden, aber diese regulatorischen Elemente müssen in dem für die Expression ausgewählten Wirt funktionell sein. Promotoren, welche zur Kontrolle der TACI-Protein-Genexpression verwendet werden können, schließen die Frühpromotorregion von SV40 [Benoist und Chambon, Nature, 290:304-310 (1981)], den Promotor, der in der langen 3'-terminalen Wiederholung des Rous sarcoma-Virus enthalten ist [Yamamoto, et al., Cell, 22:787-797 (1980)], den Herpesthymidinkinase-Promotor [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78:1441-1445 (1981)], die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens [Brinster et al., Nature, 296:39-42 (1982)]; prokaryotische Expressionsvektoren wie den β-Lactamasepromotor [Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-3731 (1978) oder den tac-Promotor [DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25 (1983)]; siehe auch „Useful Proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 242:74-94 (1980); Promotorelemente von Hefe und anderen Pilzen wie der Gal 4-Promotor, der ADC-(Alkoholdehydrogenase)-Promotor, PGK-(Phosphoglycerolkinase)-Promotor, alkalische Phosphatase-Promotor; und die Tiertranskriptionskontrollregionen, welche Gewebespezifität aufweisen und in transgenen Tieren verwendet wurden: Elastase I-Genkontrollregion, welche in azinären Pankreaszellen aktiv ist [Swift et al., Cell, 38:639-646 (1984)]; [Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409 (1986)]; [Mac-Donald, Hepatology, 7:425-515 (1987)]; Insulingenkontrollregion, welche in beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse aktiv ist [Hanahan, Nature, 315:115-122 (1985)), Immunglobulingenkontrollregion, welche in Lymphoidzellen aktiv ist [Grosschedl et al., Cell, 38:647-658 (1984)]; [Adames et al., Nature, 318:533-538 (1985)]; [Alexander et al., Mol. Cell. Biol., 7:1436-1444 (1987)], Mäusemammatumorviruskontrollregion, welche in Testis-, Brust-, Lymphoid- und Mastzellen aktiv ist [Leder et al., Cell, 45:485-495 (1986)], Albumingenkontrollregion, welche in der Leber aktiv ist [Pinkert et al., Genes and Devel., 1:268-276 (1987)], alpha-Fetoproteingenkontrollregion, welche in der Leber aktiv ist [Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol., 5:1639-1648 (1985)]; [Hammer et al., Science, 235:53-58 (1987)], alpha 1-Antitrypsingenkontrollregion, welche in der Leber aktiv ist [Kelsey et al., Genes and Devel., 1:161-171 (1987)], beta-Globingenkontrollregion, welche in Myeloidzellen aktiv ist [Mogram et al., Nature, 315:338-340 (1985)]; [Kollias et al., Cell, 46:89-94 (1986)], Myelingrundproteingenkontrollregion, welche in Oligodendrozytenzellen im Gehirn aktiv ist [Readhead et al., Cell, 48:703-712 (1987)], Genkontrollregion der leichten Kette 2 von Myosin, welche im Skelettmuskel aktiv ist [Sani, Nature, 314:283-286(1985)] und Genkontrollregion des Gonadotropinreleasinghormons, welche im Hypothalamus aktiv ist [Mason et al., Science, 234:1372-1378 (1986)] ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Expressionsvektoren, welche eine Nukleinsäure kodieren, die ein TACI-Protein der Erfindung kodiert, können durch vier allgemeine Versuche identifiziert werden: (a) PCR-Amplifizierung der gewünschten Plasmid-DNA oder speziellen mRNA, (b) Nukleinsäurehybridisierung, (c) die Gegenwart oder Abwesenheit von Selektionsmarkergenfunktionen und (d) Expression von eingebrachten Sequenzen. Im ersten Versuch können die Nukleinsäuren mit PCR amplifiziert werden, um einen Nachweis des amplifizierten Produkts bereit zu stellen. Im zweiten Versuch kann die Gegenwart eines fremden Gens, welches in einen Expressionsvektor eingebracht wurde, durch Nukleinsäurehybridisierung unter Verwendung von Sonden, welche Sequenzen umfassen, die zu einem eingebrachten Markergen homolog sind, nachgewiesen werden. In einem dritten Versuch kann das System rekombinanter Vektor/Wirt bezogen auf die Gegenwart oder Abwesenheit von bestimmten „Selektionsmarker"-Genfunktionen (z.B. β-Galactosidaseaktivität, Thymidinkinaseaktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Transformationsphänotyp, Einschlusskörperbildung in Baculovirus, usw.), welche durch die Einbringung von fremden Genen in den Vektor verursacht werden, identifiziert und selektiert werden. In einem anderen Beispiel, wenn die Nukleinsäure, welche ein TACI-Protein kodiert, in die „Selektions marker"-Gensequenz des Vektors eingebracht wird, können rekombinante Produkte, welche die TACI-Protein-Einbringung enthalten, durch die Abwesenheit der TACI-Protein-Genfunktion identifiziert werden. In einem vierten Versuch können rekombinante Expressionsvektoren durch Testen der Aktivität, biochemischen oder immunologischen Charakteristika des Genprodukts, welches durch das rekombinante Produkt exprimiert wird, mit der Maßgabe, dass das exprimierte Protein eine funktionell aktive Konformation annimmt, identifiziert werden.
Eine große Vielzahl von Wirt/Expressionsvektor-Kombinationen kann beim Exprimieren der DNA-Sequenzen dieser Erfindung verwendet werden. Nützliche Expressionsvektoren können zum Beispiel aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen. Geeignete Vektoren schließen Derivate von SV40 und bekannte Bakterienplasmide, z.B. die E. coli-Plasmide co1 E1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX [Smith et al., Gene, 67:31-40 (1988)], pMB9 und ihre Derivate, Plasmide wie RP4; Phage-DNAs, z.B. die zahlreichen Derivate von Phage λ, z.B. NM989, und andere Phage-DNA, z.B. M13 und filamentartige einzelsträngige Phage-DNA; Hefeplasmide wie das 2μ-Plasmid oder Derivate davon; Vektoren, welche in eukaryotischen Zellen nützlich sind, wie Vektoren, welche in Insekten- oder Säugerzellen nützlich sind; Vektoren, welche von Kombinationen von Plasmiden und Phage-DNAs abgeleitet sind, wie Plasmide, welche modifiziert wurden, wobei sie Phage-DNA oder andere Expressionskontrollsequenzen verwenden; und dergleichen ein.
Zum Beispiel in Baculovirus-Expressionssystemen können sowohl Nichtfusionstransfervektoren, wie pVL941 (BamH1-Klonierungsstelle; Summers), pVL1393 (BamH1-, SmaI-, XbaI-, EcoR1-, NotI-, XmaIII-, BglII- und PstI-Klonierstelle; Invitrogen), pVL1392 (BglII-, PstI-, NotI-, XmaIII-, EcoRI-, XbaI-, SmaI- und BamH1-Klonierstelle; Summers und Invitrogen) und pBlueBacIII (BamH1-, BglII-, PstI-, NcoI- und HindIII-Klonierstelle, mit möglichem rekombinanten Screening (blau/weiß); Invitrogen), welche aber nicht darauf eingeschränkt sind, als auch Fusionstransfervektoren, wie pAc700 (BamH1- und KpnI-Klonierstelle, wobei die BamH1-Erkennungsstelle mit dem Initiationscodon beginnt; Summers), pAc701 und pAc702 (gleich mit pAc700, mit unterschiedlichen Leserahmen), pAc360 (BamH1-Klonierstelle, 36 Basenpaare strangabwärts eines Polyhedrininitiationscodons; Invitrogen(195)) und pBlueBacHisA, B, C (drei unterschiedliche Leserahmen, mit BamH1-, BglII-, PstI-, NcoI- und HindIII-Klonierstelle, ein N-terminales Peptid für ProBond-Reinigung und rekombinantes Screening (blau/weiß) von Plaques; Invitrogen (220)), welche aber nicht darauf eingeschränkt sind, verwendet werden.
Säugerexpressionsvektoren, welche zur Verwendung in der Erfindung in Betracht gezogen werden, schließen Vektoren mit induzierbaren Promotoren, wie den Dihydrofolatreduktase-(DHFR)-Promotor, z.B. jeder Expressionsvektor mit einem DHFR-Expressionsvektor oder einem DHFR/Methotrexat-Coamplifizierungsvektor, wie pED (PstI-, SalI-, SbaI-, SmaI- und EcoRI-Klonierstelle, wobei der Vektor sowohl das klonierte Gen als auch DHFR exprimiert; siehe Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)), ein. Alternativ ein Glutaminsynthetase/Methioninsulfoximin-Coamplifizierungsvektor, wie pEE14 (HindIII-, XbaI-, SmaI-, SbaI-, EcoR1- und BclI-Klonierstelle, wobei der Vektor Glutaminsynthase und das klonierte Gen exprimiert; Celltech). In einer anderen Ausführungsform kann ein Vektor, welcher die episomale Expression unter der Kontrolle des Epstein-Barr-Virus (EBV) steuert, verwendet werden, wie pREP4 (BamH1-, SfiI-, XhoI-, NotI-, NheI-, HindIII-, NheI-, PvuII-, und KpnI-Klonierstelle, konstitutiver RSV-LTR-Promotor, Hygromycin-selektierbarer Marker; Invitrogen), pCEP4 (BamH1-, SfiI-, XhoI-, NotI-, NheI-, HindIII-, NheI-, PvuII- und KpnI-Klonierstelle, unmittelbares konstitutives hCMV-Frühgen, Hygromycin-selektierbarer Marker; Invitrogen), pMEP4 (KpnI-, PvuI-, NheI-, HindIII-, NotI-, XhoI-, SfiI-, BamH1-Klonierstelle, induzierbarer Metallothionein IIa-Genpromotor, Hygromycin-selektierbarer Marker; Invitrogen), pREP8 (BamH1-, XhoI-, NotI-, HindIII-, NheI- und KpnI-Klonierstelle, RSV-LTR-Promotor, Histidinol-selektierbarer Marker; Invitroen), pREP9 (KpnI-, NheI-, HindIII-, NotI-, XhoI-, SfiI- und BamHI-Klonierstelle, RSV-LTR-Promotor, G418-selektierbarer Marker, Invitrogen) und pEBVHis (RSV-LTR-Promotor, Hygromycin-selektierbarer Marker, N-terminales Peptid, welches über ProBond-Harz gereinigt werden kann und mit Enterokinase gespalten wird; Invitrogen). Selektierbare Säugerexpressionsvektoren zur Verwendung in der Erfindung schließen pRc/CMV (HindIII-, BstXI-, NotI-, SbaI- und ApaI-Klonierstelle, G418-Selektion; Invitrogen), pRc/RSV (HindIII-, SpeI-, BstXI-, NotI-, XbaI-Klonierstelle, G418-Selektion; Invitrogen) und andere ein. Vacciniavirus-Säugerexpressionsvektoren (siehe Kaufman, 1991, vorstehend) zur Verwendung gemäß der Erfindung schließen pSC11 (SmaI-Klonierstelle, TO- und β-gal-Selektion), pMJ601 (SalI-, SmaI-, AflI-, NarI-, BspMII-, BamHI-, ApaI-, NheI-, SacII-, KpnI- und HindIII-Klonierstelle; TK- und β-gal-Selektion) und pTKgptF1S (EcoRI-, PstI-, SalI-, AccI-, HindII-, SbaI-, BamHI- und Hpa-Klonierstelle, TK- oder XPRT-Selektion) ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Hefeexpressionssysteme können auch gemäß der Erfindung zur Expression des TACI-Proteins verwendet werden. Es können zum Beispiel der pYES2-Nichtfusionsvektor (XbaI-, SphI-, ShoI-, NotI-, GstXI-, EcoRI-, BstXI-, BamH1-, SacI-, Kpn1- und HindIII-Klonierstelle; Invitrogen) oder der pYESHisA, B, C (mit Fusion) (XbaI-, SphI-, ShoI-, NotI-, BstXI-, EcoRI-, BamH1-, SacI-, KpnI- und HindIII-Klonierstelle, N-terminales Peptid, welches mit ProBond-Harz gereinigt und mit Enterokinase gespalten wird; Invitrogen), um nur zwei zu nennen, gemäß der Erfindung verwendet werden.
Wenn ein besonderes rekombinantes DNA-Molekül identifiziert und isoliert wurde, können mehrere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden, um es zu vermehren. Wenn ein geeignetes Wirtsystem und Wachstumsbedingungen etabliert wurden, können rekombinante Expressionsvektoren in der Menge vermehrt und hergestellt werden. Wie vorstehend erläutert, schließen die Expressionsvektoren, welche verwendet werden können, die folgenden Vektoren oder ihre Derivate ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt: humane oder Tierviren wie Vacciniavirus oder Adenvirus; Insektenviren wie Baculovirus; Hefevektoren; Bakteriophagevektoren (z.B. Lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige zu nennen.
Zusätzlich kann ein Wirtzellstamm ausgewählt werden, der die Expression der eingebrachten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der gewünschten speziellen Weise modifiziert und verarbeitet. Unterschiedliche Wirtzellen weisen charakteristische und spezielle Mechanismen für die Translations- und Nachtranslationsverarbeitung und Modifizierung (z.B. Glycosylierung, Spaltung z.B. der Signalsequenz) von Proteinen auf. Geeignete Zelllinien oder Wirtsysteme können ausgewählt werden, um die gewünschte Modifizierung und Verarbeitung des exprimierten fremden Proteins sicher zu stellen. Zum Beispiel kann eine Expression in einem Bakteriensystem verwendet werden, um ein nicht-glycosyliertes Kernproteinprodukt herzustellen.
Die Vektoren werden in die gewünschten Wirtzellen durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren eingebracht, z.B. Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphat-Präzipitation, Lipofektion (Lysosomenfusion), Verwendung einer Genpistole oder eines DNA-Vektor-Transporters (siehe z.B. Wu et al., J. Biol. Chem., 267:963-967 (1992); Wu und Wu, J Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., Kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311 , eingereicht am 15. März 1990).
Gen-Zielrichten
Wie hier verwendet, ist „Gen-Zielrichten" ein Typ von homologer Rekombination, welcher auftritt, wenn ein Fragment einer Genom-DNA in eine Säugerzelle eingebracht wird und das Fragment endogene homologe Sequenzen ausfindig macht und damit rekombiniert.
Wie hier verwendet, ist eine „Knockout-Maus" eine Maus, welche innerhalb ihres Genoms ein spezielles Gen enthält, das durch das Verfahren des Gen-Zielrichtens inaktiviert wurde. Eine Knockout-Maus schließt sowohl die heterozygote Maus (d. h. ein fehlerbehaftetes Allel und ein Wildtyp-Allel) als auch die homozygote Mutante (d. h. zwei fehlerbehaftete Allele) ein.
Wie hier verwendet, ist ein „Markergen" ein Selektionsmarker, der die Isolierung von raren transfizierten Zellen aus der Mehrzahl von behandelten Zellen in der Population ermöglicht. Eine nicht umfassende Liste von solchen Markern schließt Neomycinphosphotransferase, Hygromycin-B-Phosphotransferase, Xanthin/Guanin-Phosphoribosyltransferase, Herpes simplex-Thymidinkinase und Diphtherietoxin ein.
Die funktionelle Aktivität des Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungsproteins kann transgen bewertet werden. In dieser Hinsicht kann ein transgenes Mäusemodell verwendet werden. Das Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungsprotein-Gen kann in Komplementationsuntersuchungen unter Verwendung einer transgenen Maus verwendet werden. Transgene Vektoren, einschließlich Virusvektoren, oder Cosmidklone (oder Phageklone), welche dem Wildtyp-Locus eines Testgens entsprechen, können unter Verwendung des isolierten TACI-Protein-Gens aufgebaut werden. Cosmide können in transgene Mäuse unter Verwendung von veröffentlichten Verfahren eingebracht werden [Jaenisch, Science, 240:1468-1474 (1988)]. In einem genetischen Sinn wirkt das Transgen als eine Suppressormutation.
Alternativ kann ein transgenes Mäusemodell hergestellt werden, in welchem die Expression des TACI-Protein-Gens unterbrochen ist. Die Genexpression ist gemäß der Erfindung unterbrochen, wenn kein funktionelles Protein exprimiert wird. Ein Standardverfahren zur Bewertung der Phänotypwirkung eines Genprodukts ist, die Knockout-Technologie zur Deletion des Gens zu verwenden. Alternativ können rekombinante Techniken zur Einbringung von Mutationen, wie Nonsense- und Amber-Mutationen, oder Mutationen, welche zur Expression eines inaktiven Proteins führen, verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform können TACI-Protein-Gene durch Untersuchen ihrer Phänotypwirkungen, wenn sie in Antisense-Orientierung in Wildtyp-Mäusen exprimiert werden, getestet werden. Bei diesem Versuch wird die Expression des Wildtyp-Allel supprimiert, was zu einem Mutant-Phänotyp führt. RNA-RNA-Duplexbildung (Antisense-Sense) verhindert eine normale Handhabung von mRNA, was in einer teilweisen oder vollständigen Beseitigung der Wildtyp-Genwirkung resultiert. Diese Technik wurde zur Inhibierung der TK-Synthese in Gewebekultur und zur Herstellung von Phänotypen der Kruppel-Mutation in Drosophila und der Shiverer-Mutation in Mäusen verwendet [Izant et al., Cell, 36:1007-1015 (1984); Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55:569-597 (1986); Katsuki et al., Science, 241:593-595 (1988)]. Ein wichtiger Vorteil dieses Versuchs ist, dass nur ein kleiner Teil des Gens für eine wirksame Inhibierung der Expression der gesamten verwandten mRNA exprimiert werden muss. Das Antisense-Transgen wird unter die Kontrolle seines eigenen Promotors oder eines anderen Promotors gestellt, welche im richtigen Zelltyp exprimiert werden und strangaufwärts der SV40-polyA-Stelle platziert sind. Dieses Transgen wird zur Herstellung von transgenen Mäusen oder durch die Verwendung von Gen-Knockout-Technologie verwendet.
Folglich erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf die Herstellung von Antisense-Nukleotiden und Ribozymen, welche zur Beeinflussung der Expression des TACI-Proteins auf dem Translationslevel verwendet werden können. Dieser Versuch verwendet Antisense-Nulkleinsäure und Ribozyme, um die Translation einer speziellen mRNA zu blockieren, entweder durch Maskieren dieser mRNA mit einer Antisense-Nukleinsäure oder durch Spalten davon mit einem Ribozym. Gene, welche TACI-mRNA-spezifische Antisense- oder Ribozym-Nukleinsäuren kodieren, können z.B. unter Verwendung der vorstehend als „Gentherapie" beschriebenen Techniken eingebracht werden. Alternativ können synthetische Antisense- oder Ribozym-Oligonukleotide hergestellt werden.
Antisense-Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, welche zu mindestens einem Teil eines speziellen mRNA-Moleküls komplementär sind [siehe Marcus-Sekura, Anal. Biochem., 172:298 (1988)]. In der Zelle hybridisieren sie mit dieser mRNA, wobei ein doppelsträngiges Molekül gebildet wird. Die Zelle translatiert eine mRNA in dieser doppelsträngigen Form nicht. Deshalb beeinflussen Antisense-Nukleinsäuren die Expression von mRNA zum Prote in. Oligomere mit etwa fünfzehn Nukleotiden und Moleküle, welche mit dem AUG-Initiationscodon hybridisieren, werden besonders effizient sein, weil sie einfach zu synthetisieren sind und es wahrscheinlich ist, dass sie weniger Probleme verursachen als größere Moleküle, wenn sie in Organzellen eingebracht werden. Antisense-Verfahren wurden zur Inhibierung der Expression von vielen Genen in vitro verwendet [Marcus-Sekura, 1988, vorstehend; Harnbor et al., I Exp. Med., 168:1237 (1988)]. Bevorzugt enthalten synthetische Antisense-Nukleotide Phosphoresteranaloga, wie Phosphorthiolate oder Thioester, als vielmehr natürliche Phosphoresterbindungen. Solche Phosphoresterbindungsanaloga sind gegen Abbau stärker resistent, erhöhen die Stabilität und deshalb die Wirksamkeit der Antisense-Nukleinsäuren.
Ribozyme sind RNA-Moleküle, welche die Fähigkeit zur spezifischen Spaltung von anderen einsträngigen RNA-Molekülen in einer Weise, welche in etwa analog zu DNA-Restriktionsendonukleasen ist, besitzen. Forscher haben zwei Typen von Ribozymen, Tetrahymena-Typ und „Hammerhai"-Typ, identifiziert. Ribozyme vom Hammerhai-Typ sind gegenüber Ribozymen vom Tetrahymena-Typ zur Inaktivierung einer speziellen mRNA-Spezies bevorzugt und Erkennungssequenzen mit 18 Basen sind gegenüber kürzeren Erkennungssequenzen bevorzugt.
Die DNA-Sequenzen, welche das TACI-Protein kodieren, welches hier beschrieben und ermöglicht wird, können so verwendet werden, um Antisense-Moleküle gegen und Ribozyme zum Spalten von mRNAs für das TACI-Protein herzustellen, wodurch die Expression des Gens inhibiert wird, welches das TACI-Protein kodiert, was den Level der Immunstimulierung durch dendritische Zellen oder den Level des klonalen Nachweisens, was durch Thymus-Epithelzellen vermittelt wird, verringern kann.
Das Gen-Zielrichten in embryonalen Mäusestammzellen ist eine relativ neue Technik, welche die genaue Manipulierung von Genen in vivo ermöglicht. Diese Technik ermöglicht die Schaffung von Mäusen mit definierten Mutationen in der Struktur von jedwedem gegebenem Gen. Diese Fähigkeit zur Erzeugung von vorher bestimmten Mutationen verleiht Forschern die Fähigkeit, die Leistung von genetischen Produkten auf das komplexe menschliche Immunsystem zu übertragen, wenn sie erfolgreich in neuronalen Systemen von solchen Organismen wie Drosophila und C. elegans verwendet wurden.
Ein Schlüssel zum Auffinden von Behandlungen für viele Störungen war die Entwicklung von geeigneten Tiermodellen. Die vorliegende Erfindung schließt eine Knockout-Maus ein, welche ein nicht-funktionelles Allel für das Gen, welches von Natur aus funktionelles TACI-Protein kodiert und exprimiert, enthält. Eingeschlossen in dieser Ausführungsform der Erfindung ist eine Knockout-Maus, welche zwei nicht-funktionelle Allele für das Gen, welches von Natur aus funktionelles TACI-Protein kodiert und exprimiert, enthält und deshalb nicht zur Expression eines funktionellen TACI-Proteins in der Lage ist.
Nicht-funktionelle Allele können in einer Anzahl von Wegen, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind und welche alle in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, erzeugt werden. In einigen Ausführungsformen wird ein nicht-funktionelles Allel durch eine Einbringung einer fremden DNA in die Kodierregion des TACI-Protein-Allels mit einem Fehler behaftet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Einbringung im ersten Exon der Kodierregion des TACI-Protein-Gens platziert. In stärker bevorzugten Ausführungsformen enthält die Einbringung ein Signal zur Termination der Transkription vor der Transkription einer Region des Allels, welche das TACI-Protein kodiert. In diesen bevorzugten Ausführungsformen ist es noch stärker bevorzugt, einen Abschnitt der DNA am Beginn der Kodierregion für das TACI-Protein zu entfernen und ihn mit der vorstehenden Einbringung zu ersetzen.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Herstellung der Knockout-Maus der vorliegenden Erfindung ein, welches einschließt: Erhalten von Genom-DNA, welche ein TACI-Protein kodiert, Aufbauen eines Vektors, welcher die Genom-DNA und ein Markergen enthält, wobei das Markergen im Exon der Genom-DNA platziert ist. Der Vektor wird dann in eine embryonale Stammzelle durch Elektroporation eingebracht und eine embryonale Stammzelle, welche den Vektor in das Genom integriert hat, wird selektiert, wobei die selektierte Zelle das Markergen in die endogene Stelle des Gens für das TACI-Protein in dem Mausgenom integriert hat. Die Zelle wird dann in eine Mausblastozyste injiziert, welche dann in eine pseudo-schwangere weibliche Maus wieder implantiert wird, welche eine chimäre Maus zur Welt bringt, die ein fehlerbehaftetes Allel für das TACI-Protein in ihrer Keimbahn enthält. Die chimäre Maus wird dann mit einer Maus einer durch Inzucht erzeugten Standardlinie gepaart, um eine heterozygote Knockout-Maus zu erzeugen. Zwei heterozygote Mäuse ließ man dann fortpflanzen, wobei ein homozygoter Knockout-Mausabkömmling erzeugt wurde. Detaillierte Protokolle für ein erfolgreiches Gen-Zielrichten sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden zum Beispiel von Joyner, A.L. (1993) Gene Targeting: A Practical Approach. The Practical Approach Series (Rickwood, D. und Harnes, B.D., Aut.), IRL Press, Oxford beschrieben.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Auswählen eines therapeutischen Mittels zur möglichen Verwendung als ein Immunsuppressivum, welches das Verabreichen eines vermuteten therapeutischen Mittels an die Knockout-Maus der vorliegenden Erfindung und das Messen und/oder Bestimmen der vermeintlichen Wirkung des therapeutischen Mittels auf jedwedes der Phänotypcharakteristika, von welchen man annehmen kann, dass sie mit dem Immundefekt in Zusammenhang stehen, umfasst.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Ausführungsform der Erfindung schließt das Verabreichen eines vermuteten therapeutischen Mittels an die Knockout-Maus der vorliegenden Erfindung und das Messen einer Testantwort in der Knockout-Maus ein, wobei die normale Antwort der Knockout-Maus in der Abwesenheit eines therapeutischen Mittels in charakteristischer Weise unterschiedlich von der von Wildtyp-Mäusen ist. Die möglichen therapeutischen Mittel werden auf der Grundlage ausgewählt, ob eine statistische Signifikanz zwischen der Testantwort und der normalen Antwort besteht. Mögliche therapeutische Mittel, welche eine statistische signifikante Veränderung beim gemessenen/bestimmten Charakteristikum zeigen, werden ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die normale Antwort der Knockout-Maus in der Abwesenheit eines therapeutischen Mittels in charakteristischer Weise unterschiedlich, wobei sie in charakteristischer Weise niedriger ist als die der Wildtyp-Mäuse und die ausgewählten therapeutischen Mittel wirken, indem sie die Empfindlichkeit dieses Charakteristikums erhöhen.
Die vermuteten therapeutischen Mittel können aus einer Anzahl von Arzneistoff- oder Peptidbibliotheken, einschließlich jenen, welche kommerziell von chemischen Arzneistoff-Unternehmen verfügbar sind, erhalten werden.
Reinigung von TACI-Proteinen und Homologen davon
Das TACI-Protein der vorliegenden Erfindung und Homologe davon können durch eine Anzahl von Verfahren, welche eine große Vielzahl von bekannten Reinigungsschritten umfassen, gereinigt werden. Der Fachmann wird wissen, für mehr Details und Breite auf Druckschriften, wie die Reihe Methods of Enzymology, Bezug zu nehmen. Anfängliche Schritte zur Reinigung der Proteine der vorliegenden Erfindung schließen das Einsalzen oder Aussalzen, wie bei Ammoniumsulfat-Fraktionierungen; Lösungsmittelausschluss-Fraktionierungen, z.B. eine Ethanol-Präzipitation; Detergenzextraktionen, um membrangebundene Proteine unter Verwendung von solchen Detergenzen wie Triton X-100, Tween-20, usw. frei zu setzen; oder Extraktionen mit viel Salz ein. Die Löslichmachung von Proteinen kann auch unter Verwendung von aprotischen Lösungsmitteln wie Dimethylsulfoxid und Hexamethylphosphoramid erreicht werden. Zusätzlich kann Hochgeschwindigkeitsultrazentrifugation entweder alleine oder in Verbindung mit anderen Extraktionstechniken verwendet werden.
Im Allgemeinen schließen gute sekundäre Isolierungs- oder Reinigungsschritte Festphasenabsorption unter Verwendung von Calciumphosphatgel oder Hydroxyapatit; oder Festphasenbindung ein. Festphasenbindung kann durch ionische Bindung durchgeführt werden, mit entweder einem Anionenaustauscher, wie Diethylaminoethyl-(DEAE) oder Diethyl-[2-hydroxypropyl]-aminoethyl-(QAE)-Sephadex oder Cellulose; oder mit einem Kationenaustauscher, wie Carboxymethyl-(CM) oder Sulfopropyl-(SP)-Sephadex oder Cellulose. Ein alternatives Mittel zur Festphasenbindung schließt die Ausnutzung von hydrophoben Wechselwirkungen ein, z.B. die Verwendung eines festen Trägers wie phenylSepharose und eines Puffers mit viel Salz; Affinitätsbindung unter Verwendung von z.B. CAML (oder einem TACI-bindenden Fragment davon), welche an einen aktivierten Träger gebunden sind; Immunbindung unter Verwendung von z.B. eines Antikörpers gegen das TACI-Protein, welcher an einen aktivierten Träger gebunden ist; sowie andere Festphasenträger, einschließlich jene, welche spezielle Farbstoffe oder Lektine usw. enthalten. Eine weitere Festphasenträgertechnik, welche oft am Ende des Reinigungsverfahrens verwendet wird, baut auf Größenausschluss, wie Sephadex- und Sepharose-Gele, oder Druck- oder Zentrifugal-Membrantechniken unter Verwendung von Größenausschlussmembranfiltern.
Festphasenträgerauftrennungen werden im Allgemeinen chargenweise mit Zentrifugationen bei niedriger Geschwindigkeit oder durch Säulenchromatografie durchgeführt. Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC), einschließlich solcher verwandten Techniken wie FPLC, sind momentan die gewöhnlichsten Mittel zur Durchführung von Flüssigkeitschromatografie. Größenausschlusstechniken können auch mit der Hilfe von Zentrifugationen bei niedriger Geschwindigkeit erreicht werden.
Zusätzlich können Größenpermeationstechniken wie Gelelektrophoresetechniken verwendet werden. Diese Techniken werden im Allgemeinen in Röhren, Platten oder durch Kapillarelektrophorese durchgeführt.
Nahezu alle Schritte, welche Proteinreinigung einbeziehen, verwenden einen biologischen Puffer mit einem pH-Wert von nahe dem pKa-Wert des Puffers. Typische Puffer können aus den meisten biochemischen Katalogen gekauft werden und schließen die klassischen Puffer wie Tris, Pyrophosphat, Monophosphat und Diphosphat oder die Good-Puffer [Good, N.E., et al., Biochemistry, 5:467 (1966)]; [Good, N.E. und Izawa, S., Meth. Enzymol., 24, Teil B, 53 (1972)] und [Fergunson, W.J. und Good, N.E., Anal. Biochem., 104:300 (1980)] wie Mes, Hepes, Mops, Tricin und Ches ein.
Materialien zur Durchführung all dieser Techniken sind von einer Vielzahl von Quellen wie Sigma Chemical Company in St. Louis, Missouri verfügbar.
Antikörper gegen das TACI-Protein
Die vorliegende Erfindung offenbart die Proteinsequenz und Eigenschaften eines speziellen Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungsproteins, TACI, wobei die Entwicklung von Antikörperreagenzien, welche für den extrazellulären Teil des Rezeptors spezifisch sind, ermöglicht wird. Mehrwertige Antikörperreagenzien können zum Vernetzen und Aktivieren der TACI-Signalgebung in Lymphozyten wirken, ein nützliches Verfahren in Situationen, wobei eine gesteigerte Lymphozytenantwortfähigkeit vorteilhaft ist. Solche Situationen schließen zum Beispiel die Behandlung von Immundefekten, welche entweder angeboren oder erworben, z.B. AIDS, sind, ein. Zusätzlich können diese Antikörperreagenzien als eine adjuvante Behandlung bei Krebs in Fällen, wobei das Immunsystem das Ausrotten von neoplastischen Zellen unterstützen kann, verwendet werden. In ähnlicher Weise können einwertige Antikörperreagenzien wirken, indem sie den Zugang zu TACI in Lymphozyten blockieren, ein Verfahren, welches in Situationen nützlich ist, wobei eine unterdrückte Lymphozytenantwortfähigkeit vorteilhaft ist, wie während Organtransplantationen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können das TACI-Protein, welches natürlich, in rekombinanter Weise oder durch chemische Synthese hergestellt wurde, und Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon, einschließlich Fusionsproteine, als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, welche das TACI-Protein erkennen. Solche Antikörper schließen polyklonale, monoklonale, chimäre, Einzelketten-Fab-Fragmente und eine Fab-Expressionsbibliothek ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Die anti-TACI-Protein-Antikörper der Erfindung können kreuzreaktiv sein, z.B. kann es sein, dass sie das TACI-Protein von unterschiedlichen Spezies erkennen. Polyklonale Antikörper weisen eine höhere Wahrscheinlichkeit für Kreuzreaktivität auf. Alternativ kann ein Antikörper der Erfindung für eine einzelne Form des TACI-Proteins spezifisch sein. Bevorzugt ist ein solcher Antikörper für ein humanes TACI-Protein spezifisch. Antikörper der Erfindung können markiert werden, wie vorstehend für TACI-Proteine und -Polypeptide beschrieben.
Verschiedene Verfahren, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, können für die Herstellung der polyklonalen Antikörper gegen das TACI-Protein oder ein Derivat oder Analogon davon verwendet werden. Für die Herstellung des Antikörpers können verschiedene Wirttiere durch Injektion des TACI-Proteins oder eines Derivats (z.B. Fragments oder Fusionsproteins) davon immunisiert werden, welche Kaninchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen, usw. einschließen, aber nicht darauf eingeschränkt sind. In einer Ausführungsform kann das TACI-Protein oder ein Fragment davon an einen immunogenen Träger, z.B. Rinderserumalbumin (BSA) oder Schlüssellochschneckenhämocyanin (KLH), konjugiert werden. Verschiedene Adjuvansien können zum Erhöhen der Immunantwort abhängig von den Wirtspezies verwendet werden, welche das von Freund (komplett und nicht komplett), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, Pluronpolyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüssellochschneckenhämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise nützliche humane Adjuvansien wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum einschließen, aber nicht darauf eingeschränkt sind.
Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, welche gegen das TACI-Protein oder ein Fragment, Analogon oder Derivat davon gerichtet sind, kann jedwede Technik, welche die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur bereitstellt, verwendet werden. Diese schließen die Hybridomtechnik, welche ursprünglich von Kohler und Milstein [Nature, 256:495-497 (1975)] entwickelt wurde, sowie die Triomtechnik, die humane B-Zellen-Hybridomtechnik [Kozbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983)]; [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Scl. U.S.A., 80:2026-2030 (1983)] und die EBV-Hybridomtechnik zur Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern [Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96 (1985)] ein, sind aber nicht darauf einge schränkt. In einer zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren unter Verwendung von neuerer Technologie [ PCT/US90/02545 ] hergestellt werden. In der Tat können gemäß der Erfindung Techniken, welche zur Herstellung von „chimären Antikörpern" entwickelt wurden [Morrison et al., J. Bacteriol., 159:870 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314:452-454 (1985)], durch Spleißen der Gene eines Mausantikörpermoleküls, welches spezifisch für ein TACI-Protein ist, zusammen mit Genen eines humanen Antikörpermoleküls mit geeigneter biologischen Aktivität, verwendet werden; wobei solche Antikörper innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegen. Solche humanen oder humanisierten chimären Antikörper sind zur Verwendung bei der Therapie von Erkrankungen oder Störungen des Menschen (nachstehend beschrieben) bevorzugt, da es im Vergleich zu xenogenen Antikörpern viel weniger wahrscheinlich ist, dass die humanen oder humanisierten Antikörper selbst eine Immunantwort, insbesondere eine allergische Antwort, induzieren.
Gemäß der Erfindung können Techniken, welche für die Herstellung von einkettigen Antikörpern beschrieben wurden [ U.S. Patent Nr. 5,476,786 und 5,132,405 von Huston; U.S. Patent 4,946,778 ], übernommen werden, um die TACI-Protein-spezifischen einkettigen Antikörper herzustellen. Eine zusätzliche Ausführungsform der Erfindung verwendet die Techniken, welche für den Aufbau von Fab-Expressionsbibliotheken beschrieben wurden [Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)], um eine schnelle und einfache Identifizierung von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für ein TACI-Protein oder seine Derivate oder Analoga zu ermöglichen.
Antikörperfragmente, welche den Idiotyp des Antikörpermoleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente die folgenden ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt: das F(ab')₂-Fragment, welches durch Pepsin-Verdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, welche durch Reduzieren der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, welche durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können.
Bei der Herstellung von Antikörpern kann das Screening nach dem gewünschten Antikörper durch auf dem Fachgebiet bekannte Techniken, z.B. Radioimmuntest, ELISA (Immunsorbenztest mit gebundenen Enzymen), „Sandwich"-Immuntests, immunradiometrische Tests, Geldiffusionspräzipitinreaktionen, Immundiffusionstests, in situ-Immuntests (zum Beispiel unter Verwendung von kolloidalem Gold, Enzym- oder Radioisotopmarkierungen), Western-Blots, Präzipitationsreaktionen, Agglutinationstests (z. B. Gelagglutinationstests, Hämagglutinationstests), Komplementfixierungstests, Immunfluoreszenztests, Protein A-Tests und Immunelektrophoresetests, usw., erreicht werden. In einer Ausführungsform wird die Antikörperbindung durch Nachweisen einer Markierung an dem primären Antikörper nachgewiesen. In einer anderen Ausführungsform wird der primäre Antikörper durch Nachweisen einer Bindung eines sekundären Antikörpers oder Reagenzes an dem primären Antikörper nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform ist der sekundäre Antikörper markiert. Viele Mittel sind auf dem Fachgebiet zum Nachweisen einer Bindung in einem Immuntest bekannt und liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Um zum Beispiel Antikörper auszuwählen, welche ein spezielles Epitop eines TACI-Proteins erkennen, kann man erzeugte Hybridoma auf ein Produkt testen, welches an ein TACI-Proteinfragment, das ein solches Epitop enthält, bindet. Zur Selektion eines Antikörpers, welcher spezifisch für ein TACI-Protein von einer besonderen Tierspezies ist, kann man auf der Basis einer positiven Bindung an dem TACI-Protein, welches von Zellen dieser Tierspezies exprimiert wird oder davon isoliert wurde, auswählen.
Die vorstehenden Antikörper können in auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, welche die Lokalisierung und Aktivität des TACI-Proteins betreffen, verwendet werden, z.B. zum Western-Blotting, zur Bildgebung des TACI-Proteins in situ, zum Messen der Levels davon in geeigneten physiologischen Proben, usw. unter Verwendung von jedweder der vorstehend erwähnten oder auf dem Fachgebiet bekannten Nachweistechniken.
In einer speziellen Ausführungsform können Antikörper erzeugt werden, welche die Aktivität des TACI-Proteins agonisieren oder antagonisieren. Solche Antikörper können unter Verwendung der nachstehend zum Identifizieren von Liganden beschriebenen Tests getestet werden.
Liganden für das TACI-Protein
Die Identität des endogenen Liganden des TACI-Proteins ist unbekannt. Das TACI-Protein kann zum Screenen von Klonen verwendet werden, um den/die endogenen Liganden zu identifizieren. Es ist wahrscheinlich, dass dieser Ligand auch in die Regulation des Immunsystems einbezogen ist, und so ähnliche oder komplementäre Verwendungen zu denen, welche hier beschrieben werden, aufweisen sollte. Verfahren zum Screenen nach TACI-1-Liganden schließen ein: (i) die Verwendung eines Hefe-Zwei-Hybrid-Systems mit TACI-1 als „Köder", wie z.B. in Chien et al., Proc. Natl. Science, USA, 88:9578-9582 (1991) und Durfee et al., Genes Dev., 7:555-69 (1993) beschrieben; (ii) Wechselwirkungsklonierung von E. coli-Expressionsbibliotheken, wie vorstehend beschrieben; und (iii) funktionelles Expressionsklonieren in Säugerzellen, wie vorstehend beschrieben.
Die Identifizierung und Isolierung eines Gens, welches ein TACI-Protein der Erfindung kodiert, stellt die Expression des TACI-Proteins oder von Fragmenten davon in Mengen, welche größer sind, als von natürlichen Quellen isoliert werden können, oder in Zellen, welche speziell technologisch aufgebaut wurden, um durch das TACI-Protein reguliert zu werden, welches nach der Transfektion oder Transformation der Zellen exprimiert wird, bereit. Zusätzlich zum zweckmäßigen Design der Agonisten und Antagonisten, bezogen auf die Struktur des TACI-Proteins, zieht die vorliegende Erfindung demgemäß ein alternatives Verfahren zur Identifizierung von spezifischen Liganden des TACI-Proteins unter Verwendung von verschiedenen, auf dem Fachgebiet bekannten Screeningtests in Betracht.
Jedwede auf dem Fachgebiet bekannte Screeningtechnik kann zum Screenen nach TACI-Protein-Agonisten oder -Antagonisten verwendet werden. Die vorliegende Erfindung zieht Screens nach kleinen Molekülliganden oder Ligandanaloga und Mimetika sowie Screens nach dem/den natürlichen Liganden, welche an das TACI-Protein in vivo binden und es agonisieren oder antagonisieren, in Betracht. Zum Beispiel können Bibliotheken von natürlichen Produkten unter Verwendung von Tests der Erfindung auf Moleküle, welche die TACI-Protein-Aktivität agonisieren oder antagonisieren oder welche an die extrazelluläre Domäne oder Cytoplasmadomäne von TACI binden, gescreent werden.
Die Kenntnis der primären Sequenz des TACI-Proteins und der Ähnlichkeit dieser Sequenz mit Proteinen mit bekannter Funktion kann einen anfänglichen Anhaltspunkt für die Inhibitoren oder Antagonisten des Proteins bereitstellen. Die Identifizierung und das Screening nach Antagonisten werden ferner durch das Bestimmen von Strukturmerkmalen des Proteins, z.B. unter Verwendung von Röntgenkristallografie, Neutronenbeugung, magnetischer Kernresonanzspektrometrie und anderen Techniken zur Strukturbestimmung, ermöglicht. Diese Techniken stellen das zweckmäßige Design oder Identifizierung von Agonisten und Antagonisten bereit.
Ein anderer Versuch verwendet einen rekombinanten Bakteriophagen zur Herstellung von großen Bibliotheken. Unter Verwendung des „Phage-Verfahrens" [Scott und Smith, Science, 249:386-390 (1990); Cwirla, et al., Proc. Natl., Acad. Sci., 87:6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)] können sehr große Bibliotheken aufgebaut werden (10⁶ bis 10⁸ chemische Einheiten). Ein zweiter Versuch verwendet primär chemische Verfahren, von welchen das Geysen-Verfahren [Geysen et al., Molecular Immunology, 23:709-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method, 102:259-274 (1987)] und das Verfahren von Fodor et al. [Science, 251:767-773 (1991)] Beispiele sind. Furka et al. [14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstrakt FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37:487-493 (1991)], Houghton [ U.S. Patent Nr. 4,631,211 , veröffentlicht im Dezember 1986] und Rutter et al. [ U.S. Patent Nr. 5,010,175 , veröffentlicht am 23. April 1991] beschreiben Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von Peptiden, welche als Agonisten oder Antagonisten getestet werden können.
In einer anderen Ausführungsform können synthetische Bibliotheken [Needles et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10700-4 (1993); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10922-10926 (1993); Lam et al., Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/00252 ; Kocis et al., Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/28028 ] und dergleichen zum Screenen nach den TACI-Protein-Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Alternativ können Tests auf Binden eines löslichen Liganden an Zellen, welche rekombinante Formen der N-terminalen extrazellulären TACI-Domäne exprimieren, durchgeführt werden. Die löslichen Liganden können einfach als rekombinante oder synthetische Polypeptide bereitgestellt werden.
Das Screening kann mit rekombinanten Zellen, welche TACI oder ein Fragment davon exprimieren, oder alternativ unter Verwendung von gereinigtem Protein, z.B. welches in rekombinanter Weise hergestellt wurde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Fähigkeit des markierten, löslichen oder löslich-gemachten TACI-Fragments zum Binden von Ligand zum Screenen von Bibliotheken, wie in den vorstehenden Druckschriften beschrieben, verwendet werden.
Bestimmte Erkrankungen resultieren von einer Überaktivierung der B-Lymphozyten-Antwort. Ein Beispiel ist systemischer Lupus erythematodes (SLE), wobei Antikörper erzeugt werden, welche mit Antigenen (Proteinen, DNA, usw.) reagieren, welche von Natur aus im Patienten vorhanden sind. Die Antikörper bilden Komplexe mit den Antigenen und liegen im Blutkreislauf als reaktive Proteinagglomerate vor. Diese Komplexe lagern sich in unterschiedlichen Organen ab und führen zu den vielen Symptomen von SLE, einschließlich Nierenversagen, neurologische Symptome und Tod. Momentane Behandlungen schließen die Verwendung von relativ unspezifischen Immunsuppressiva wie Cyclosporin A oder Steroide, welche Antworten sowohl in T- als auch B-Zellen supprimieren, ein. Obwohl sie oft wirksam SLE und ähnliche Erkrankungen behandeln können, besteht ein signifikantes Risiko einer Immunübersuppression, wobei der Patient schwerwiegende Infektionen aufgrund eines Mangels an funktionierenden T-Zellen entwickelt. Ein neuer immunsuppressiver Arzneistoff, der selektiv die Wirkung von B-Lymphozyten blockiert, während er T-Zellen intakt lässt, um Patienten vor Viruspathogenen zu schützen, wäre für die Behandlung dieser Erkrankungen äußerst nützlich. Deshalb kann TACI-1 als ein neues Werkzeug zum Entwickeln von immunsuppressiven Arzneistoffen, welche spezifisch für B-Lymphozyten sind, verwendet werden.
Das TACI-Protein ist von Natur aus nicht in reifen T-Lymphozyten oder Jurkat-T-Zellen, eine Zelllinie, welche Phänotyp-Charakteristika von reifen T-Zellen aufweist, vorhanden. Tatsächlich liegt der höchste Expressionslevel des TACI-Proteins bei peripheren B-Lymphozyten vor, wogegen periphere T-Zellen das TACI-Protein nicht exprimieren. Jedoch können Jurkat-T-Zellen mit einem TACI-Expressionsplasmid transfiziert werden und das exprimierte TACI kann einfach durch Vernetzen mit einem TACI-spezifischen Antikörper stimuliert werden. Diese Stimulierung führt zur Aktivierung eines Paares von Wegen von sekundären Botenstoffen, welche beide zur Stimulierung des T-Zellen-Transkriptionsfrühfaktors NF-AT notwendig und ausreichend sind.
In einer besonderen Ausführungsform werden Jurkat-T-Zellen mit dem TACI-1-Expressionsplasmid und einem NF-AT-Reporterplasmid transfiziert. Jurkat-T-Zellen exprimieren von Natur aus den T-Zellen-Rezeptor (TCR). Die Zellen werden durch die Zugabe von Antikörpern gegen TACI-1, Antikörpern gegen TCR oder Antikörpern gegen beide stimuliert. Testarzneistoffe werden mit den Jurkat-T-Zellen gemischt und die Wirkung dieser Arzneistoffe wird bestimmt. Vorstehend beschriebene Phage- und chemische Bibliotheken können als Quellen für Testarzneistoffe verwendet werden.
Diese Testarzneistoffe werden dann in einem parallelen Experiment, in welchem Antikörper gegen TCR anstelle der Antikörper gegen TACI-1 verwendet werden, verwendet. Wenn der Testarzneistoff keine Wirkung auf die SEAP-Signalstimulierung aufgrund der Antikörperabhängigen Aktivierung von TCR hat, wurde identifiziert, dass der Testarzneistoff eine selektive Inhibierung der TACI-1-aktivierten Antwort aufweist. Solche ausgewählten Arzneistoffe schließen die Klasse von Arzneistoffen ein, welche selektiv die B-Zellen-(Antikörperherstellend)-Antwort inhibiert, während ermöglicht wird, dass die T-Zellen-vermittelte (zelluläre) Immunität fortbesteht. Solche ausgewählte Arzneistoffe können zur Behandlung der vorstehend beschriebenen Autoimmunerkrankungen verwendet werden. Da TACI-1 Lymphozyten durch einen neuen Mechanismus aktiviert (d. h. durch direkten Kontakt mit CAML), ist es wahrscheinlich, dass eine wesentliche Anzahl von Arzneistoffen entdeckt werden kann, welche den CAML-abhängigen Weg beeinflussen können, aber dennoch die normale Signalvermittlung durch den T-Zellen-Rezeptor intakt lassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Typs enthält das NF-AT-Reporterplasmid den SEAP-Reporter. Dieses Signal wird zum Messen des Grades der Inhibierung der Aktivierung verwendet. Der SEAP-Reporter-Test kann im Maßstab vergrößert werden, um mit einem Roboter-Screening-Gerät durchgeführt zu werden. Arzneistoffe, welche die Aktivierung von TACI-1, aber nicht TCR blockieren, wie durch den SEAP-Reporter-Test gemessen, werden als mit einer selektiven Inhibierung der TACI-1-aktivierten Antwort identifiziert.
Alternativ kann eine Phage-Bibliothek verwendet werden. Phage-Bibliotheken wurden aufgebaut, welche, wenn sie in den Wirt E. coli infiziert werden, statistische Peptidsequenzen mit ungefähr 10 bis 15 Aminosäuren herstellen [Parmley und Smith, Gene, 73:305-318 (1988), Scott und Smith, Science, 249:386-249 (1990)]. Speziell die Phage-Bibliothek kann in niedrigen Verdünnungen mit permissiven E. coli in LB-Agar mit niedrigem Schmelzpunkt gemischt werden, was dann auf LB-Agar-Platten gegossen wird. Nach dem Inkubieren der Platten bei 37°C für einen Zeitraum werden sich kleine klare Plaques in einem Rasen von E. coli bilden, was ein aktives Phagenwachstum und Lyse der E. coli darstellt. Ein repräsentatives Beispiel dieser Phagen kann an Nylonfiltern durch Platzieren von trockenen Filtern auf den Agar-Platten absorbiert werden. An den Filtern kann eine Markierung zur Orientierung angebracht werden, sie können entfernt und in Waschlösungen zum Blockieren von jedweden verbleibenden absorbierenden Stellen gegeben werden. Die Filter können dann in eine Lösung gegeben werden, welche zum Beispiel ein radioaktives Fragment eines TACI-Proteins, das die N-terminale extrazelluläre Domäne enthält, enthält, wobei es z.B. für humanes TACI-1 ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 6 ist. Nach einer spezifizierten Inkubationsdauer können die Filter gründlich gewaschen und für Autoradiografie entwickelt werden. Plaques, welche den Phagen enthalten, der an die radioaktive N-terminale extrazelluläre Domäne bindet, können dann identifiziert werden. Diese Phagen können weiter kloniert und dann erneut auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung der Stimulierung von TACI durch einen anti-TACI-Antikörper, während sie die entsprechende Stimulierung von TCR nicht inhibieren, wie vorstehend beschrieben, getestet werden.
Wenn die Phagen gereinigt worden sind, kann die Bindungssequenz, welche in dem Phagen enthalten ist, durch DNA-Sequenzierstandardtechniken bestimmt werden. Wenn die DNA-Sequenz bekannt ist, können synthetische Peptide, welche diese Sequenzen darstellen, erzeugt werden.
Das wirksame Peptid(e) kann in großen Mengen zum Beispiel zur Verwendung in in vivo-Modellen und eventuell in Menschen als immunsuppressive Arzneistoffe verwendet werden. Es sollte betont werden, dass die Herstellung von sythetischen Peptiden relativ wenig arbeitsintensiv ist, sie leicht hergestellt und in der Qualität kontrolliert werden können, und folglich große Mengen des gewünschten Produkts ziemlich günstig hergestellt werden können. Ähnliche Kombinationen von in Masse hergestellten synthetischen Peptiden wurden kürzlich mit großem Erfolg verwendet [Patarroyo, Vaccine, 10:175-178 (1990)].
Therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen
Das Transmembranaktivator-CAML-Wechselwirkungsprotein der vorliegenden Erfindung kann zwei Signale, welche normalerweise zur Initiierung des Zellwachstums und -teilung verwendet werden, aktivieren. Es ist wahrscheinlich, dass dieser Rezeptor in die neoplastische Transformation von T- oder B-Lymphozyten in Lumphomen oder bei Leukämie einbezogen ist. Deshalb sind dominante negative Formen von TACI-1 zur Supprimierung des Wachstums von solchen Krebszellen nützlich. Alternativ kann eine TACI-1-Überstimulierung zum programmierten Zelltod führen. Unter Inanspruchnahme des Vorteils dieser Eigenschaft können Leukämie oder Lymphome mit TACI-1-Zelloberflächenexpression induziert werden, um durch eine solche Überstimulierung abzusterben. Eine Aktivierung des TACI-Proteins mit Antikörper oder Vernetzung kann einen endogenen Weg, der zu Apoptose führt, aktivieren. Die Bindung einer monomeren Form eines Antikörpers oder eines analogen Liganden kann den mit dem TACI-Protein in Zusammenhang stehenden endogenen Weg blockieren und die Wachstumsstimulierung beeinflussen.
Therapeutische Stimulierung der TACI-Aktivität. Wie vorstehend erörtert, stellt die vorliegende Erfindung vorteilhafterweise die selektive Stimulierung des Immunsystems durch Agonisierung der TACI-Aktivität bereit. TACI-Agonisten schließen den/die entdeckten TACI-Liganden, wie vorstehend beschrieben, und Antikörper, welche den Rezeptor vernetzen, ein. Ligandagonisten oder Antikörperagonisten können wie nachstehend beschrieben bei der Behandlung von Empfängern, bei welchen eine Immunstimulierung, insbesondere von B-Zellen, gewünscht ist, verwendet werden.
B-Zellen-Antworten können beim Bekämpfen von infektiösen Erkrankungen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf bakterielle, virale, durch Protozoen verursachte und parasitäre Infektionen, besonders wichtig sein. Antikörper gegen infektiöse Mikroorganismen können die Organismen schnell durch Binden an das Antigen immobilisieren, gefolgt von einem Komplementangriff oder einem Zellen-vermittelten Angriff. So kann ein TACI-Agonist der Erfindung an einen Empfänger abgegeben werden, welcher an einer Infektion leidet, um die humoralen Immunantworten zu verstärken. TACI-Agonisten können zur Verstärkung der Immunantworten nach der Impfung, während einer Reizung mit dem infektiösen Organismus, besonders nützlich sein. So können Empfänger mit einem besonderen Risiko für infektiöse Erkrankungen, wie Influenza, eine Impfung oder eine Memory-Immunität mit einem TACI-Agonisten während der Grippesaison ergänzen. Eine vergleichbare Immunverstärkung könnte bei Empfängern verwendet werden, welche ein Gebiet mit einer endemischen Infektionskrankheit, wie Malaria, betreten oder wieder betreten.
Zusätzlich können B-Zellen-Antworten beim Amplifizieren von Immunantworten auf Tumore, welche Tumor-spezifische Antigene exprimieren, wichtig sein. So kann ein TACI-Agonist bereitgestellt werden, wo endogene anti-Tumor-Antikörper nachgewiesen werden. Tatsächlich können B-Zellen oder Plasmazellen, welche anti-Tumor-Zelloberflächenimmunglobulin exprimieren, selektiert werden, wie durch Panning, und mit TACI transduziert werden, um eine Amplifizierung ihrer Antikörperherstellung zu ermöglichen.
Zusätzlich zur Amplifizierung der vorteilhaften Immunantworten können die vorliegenden TACI-Agonisten, z. B. Liganden und Antikörper, zur Überstimulierung von Zellen, wie B-Zellen-Tumore (Multiple Myelome, Lymphome und Leukämien), unreife T-Zellen-Tumore (Leukämien und Thymome) und Autoimmun- oder entzündliche Zellen, und zur Induzierung von Apoptose in solchen Zellen verwendet werden, wobei der Krebs oder der Autoimmun-/entzündliche Zustand verringert oder beseitigt werden.
Therapien zum Verstärken von zellulären Immunantworten. Obwohl TACI in nur einer Untergruppe von unreifen T-Zellen gefunden wird, können reife T-Zellen ex vivo transfiziert oder transduziert werden, um einen funktionellen TACI-Rezeptor zu exprimieren, um die zellulären Immunantworten zu amplifizieren. Bevorzugt werden Tumor-infiltrierende Zellen für ein solches Verstärken ausgewählt und können in den Empfänger wieder eingebracht werden, um stärker gegen den Tumor anzukämpfen.
Therapeutische Verfahren durch Antagonisieren der TACI-Aktivität. Wie vorstehend erörtert, zieht die vorliegende Erfindung das Inhibieren der TACI-Aktivität durch verschiedene Mittel, welche die Verwendung der freien N-terminalen extrazellulären Domäne; die Expression einer nicht-funktionellen extrazellulären Domäne ohne eine Signaltransduktionsdomäne, z.B. GPI-gebundenes N-terminales TACI; die Verwendung von Antisense- oder Ribozym-Technologien zur Suppression der Expression von TACI; und die Vewendung von TACI-Antagonistliganden oder -Antikörpern einschließen, aber nicht darauf eingeschränkt sind, in Betracht.
Die Suppression der TACI-Aktivität ist bei der Behandlung von unerwünschten Immunantworten, einschließlich Autoimmun- und entzündliche Erkrankungen, Transplantatabstoßung und Transplantat-Wirt-Reaktion (GVH), nützlich. Autoimmun- und entzündliche Erkrankungen schließen Immunkomplex-induzierte Vaskulitis [Cochrane, Springer Seminar Immunopathol., 7:263 (1984)], Glomerulonephritis [Couser et al., Kidney Inst., 29:879 (1985)], hämolytische Anämie [Schreiber und Frank, J. Clin. Invest., 51:575 (1972)], Myasthenia gravis [Lennon, et al., J. Exp. Med., 147:973 (1978); Biesecker und Gomez, J. Immunol., 142:2654 (1989)], Typ II-Kollagen-induzierte Arthritis [Watson und Townes, J. Exp. Med., 162:1878 (1985)]; experimentelle allergische und hyperakute Transplantatabstoßung [Knechtle, et al., J Heart Transplant, 4(5):541 (1985); Guttman, Transplantation, 17:383 (1974); Adachi, et al., Trans. Proc., 19(1):1145 (1987)]; rheumatoide Arthritis und systemischen Lupus erythematodes (SLE) ein.
In einer anderen Ausführungsform, wobei ein Lymphozytenkrebs wie Myelom, Lymphom oder Leukämie TACI exprimiert und TACI zum Krebswachstum beiträgt, kann die Verwendung eines TACI-Antagonisten der Erfindung zur Suppression des Krebszellwachstums verwendet werden.
Demgemäß kann eine Komponente einer therapeutischen Zusammensetzung wie ein mehrwertiger oder einwertiger Antikörper der vorliegenden Erfindung parenteral, transmukosal, z.B. oral, nasal oder rektal oder transdermal eingebracht werden. Bevorzugt ist die Verabreichung parenteral, z. B. über intravenöse Injektion, und schließt auch intraarterielle, intramuskuläre, intradermale, subkutane, intraperitoneale, intraventrikuläre und intrakraniale Verabreichung ein, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
In einer anderen Ausführungsform kann die therapeutische Verbindung in einem Vesikel, insbesondere einem Liposom, bereitgestellt werden [siehe Langer, Science, 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein und Fidler (Aut.), Liss: New York, S. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ebenda, S. 317-327; siehe im Allgemeinen ebenda]. Zur Verringerung seiner systemischen Nebenwirkungen kann dies ein bevorzugtes Verfahren zur Einbringung von TACI sein.
In noch einer anderen Ausführungsform kann die therapeutische Verbindung in einem System mit kontrollierter Freisetzung bereitgestellt werden. Zum Beispiel kann ein Agonist oder Antagonist zu dem Transmembranbindungsprotein der vorliegenden Erfindung, wie ein Antikörper, mittels einer intravenösen Infusion, einer implantierbaren osmotischen Pumpe, eines transdermalen Pflasters, Liposomen oder anderen Verabreichungsarten verwendet werden. In einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden [siehe Langer, vorstehend; Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery, 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989)]. In einer anderen Ausführungsform können polymere Materialien verwendet werden [siehe Medical Applications of Controlled Release, Langer und Wise (Aut.), CRC Press: Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavail ability, Drug Product Design and Performance, Smolen und Ball (Aut.), Wiley: New York (1984); Ranger und Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); siehe auch Levy et al., Science, 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol., 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71:105 (1989)]. In noch einer anderen Ausführungsform kann ein System mit kontrollierter Freisetzung in der Nähe des therapeutischen Ziels, d. h. dem Gehirn, platziert werden, wodurch nur ein Teil der systemischen Dosis erforderlich ist [siehe z.B. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vorstehend, Bd. 2, S. 115-138 (1984)]. Bevorzugt wird eine Vorrichtung zur kontrollierten Freisetzung in einen Empfänger in der Nähe der Stelle einer ungeeigneten Immunaktivierung oder eines Tumors eingebracht.
Andere Systeme mit kontrollierter Freisetzung werden im Übersichtsartikel von Langer erörtert (Science, 249:1527-1533 (1990)).
In einer weiteren Ausführungsform können rekombinante Zellen, welche mit dem TACI-Protein-Gen transformiert wurden und welche hohe Levels des Polypeptids exprimieren, in einen Empfänger mit einem Bedarf für das TACI-Protein transplantiert werden. Bevorzugt werden autologe Zellen, welche mit dem TACI-Protein transformiert wurden, transplantiert, um eine Abstoßung zu vermeiden.
Die therapeutischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre oder subkutane Verabreichungswege bereitgestellt werden. Alternativ können diese Verbindungen, welche in geeigneter Weise formuliert sind, durch nasale oder orale Verabreichung verabreicht werden. Eine konstante Bereitstellung dieser therapeutischen Verbindungen kann durch Bereitstellen einer therapeutisch wirksamen Dosis (d. h. eine Dosis, welche zum Induzieren von metabolischen Veränderungen in einem Empfänger wirksam ist) in den notwendigen Intervallen, z.B. täglich, jede 12 Stunden, usw., sichergestellt werden. Diese Parameter werden von der Schwere des Erkrankungszustandes, der behandelt wird, anderen Wirkungen, wie Ernährungsmodifizierung, welche implementiert werden, dem Gewicht, Alter und Geschlecht des Empfängers und anderen Kriterien, welche einfach gemäß der guten medizinischen Standardpraxis durch den Fachmann bestimmt werden können, abhängen.
Die Verwendung dieser therapeutischen Mittel in einem wirksamen therapeutischen Schema für eine Immundefekterkrankung ist bevorzugt für einen Menschen, kann aber auch bei jedwedem Tier stattfinden. Folglich, wie der Fachmann einfach erkennen kann, sind die Verfahren und Arzneimittel der vorliegenden Erfindung besonders zur Verabreichung an jedwedes Tier, insbesondere einen Säuger, und einschließlich, aber in keiner Weise eingeschränkt auf Haustiere, wie Katzen oder Hunde als Empfänger, Tiere der Landwirtschaft, wie Rinder, Pferde, Ziegen, Schafe und Schweine als Empfänger, wobei aber nicht darauf eingeschränkt ist, Wildtiere (ob in der Wildnis oder in einem Tiergarten), Forschungstiere, wie Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schafe, Schweine, Hunde, Katzen, usw., Vogelspezies, wie Hähnchen, Truthähne, Singvögel, usw., d. h. für veterinär-medizinische Verwendung, geeignet.
Die folgenden Beispiele werden zur vollständigeren Veranschaulichung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung bereitgestellt. Sie sollen jedoch in keiner Weise als Einschränkung des breiten Umfangs der Erfindung ausgelegt werden.
BEISPIEL
CALCIUMSIGNALVERMITTLUNG DURCH EINEN DURCH CAML VERMITTELTEN LYMPHOZYTENOBERFLÄCHENREZEPTOR
Einbringung
Ca²⁺-Zufluss ist ein Schlüsselregulator der Antigen-stimulierten Lymphozytenaktivierung [Imboden et al., Immunol., 134:663-665 (1985)); [Crabtree & Clipstone, Annu. Rev. Biochem., 63:1045-1083 (1994)]; [Weiss & Littman, Cell, 76:263-274 (1994)]. Das CAML-Protein wurde als ein Regulator der Ca²⁺-Signalvermittlung identifiziert, welcher notwendig, aber nicht ausreichend für die Aktivierung des Lymphozytentranskriptionsfaktors NF-AT ist (Bram & Crabtree, 1994, vorstehend). Der Ort von CAML in Cytoplasmavesikeln ist konsistent damit, dass der Ca²⁺-Zufluss durch Modulieren der intrazellulären Ca²⁺-Freisetzung reguliert wird. Hier wird ein neuer humaner CAML-Wechselwirkungsrezeptor, der von B-Lymphozyten exprimiert wird und als ein Zelloberflächensignalmolekül wirkt, offenbart. Dieser Rezeptor, TACI (Transmembranaktivator-CAML-Wechselwirkungsprotein), initiiert die Ca²⁺-abhängige Aktivierung von NF-AT, wenn mit einem Antikörper verknüpft ist. Das Signal kann mit einer dominanten negativen Mutante von CAML blockiert werden. Wie hier gezeigt, kann das TACI-Protein auch unabhängig den AP-1-Transkriptionsfaktor aktivieren, wodurch beide Signale bereitgestellt werden, welche für Lymphozytenaktivierung erforderlich sind. Das TACI-Protein initiiert einen neuen Signaltransduktionsmechanismus, der Zelloberflächenstimuli direkt mit dem intrazellulären Signalmolekül CAML verbindet und dabei eine neue Klasse von Lymphozyten-spezifischen Zelloberflächenrezeptoren, welche die Immunantwort modulieren, definiert. Zusätzlich ist das TACI-Protein ein neues Werkzeug, welches zur Regulierung des Immunsystems in entweder einer positiven oder einer negativen Richtung verwendet werden kann. TACI-1 ist das humane Homolog von TACI, welches im vorliegenden Beispiel veranschaulicht wird.
Materialien und Verfahren
Molekulares Klonieren und Screening. Eine humane B-Lymphozyten-cDNA-Bibliothek wird durch das Zwei-Hybrid-System [Fields & Song, Nature, 340:245-246 (1989)]; Durfee et al., Genes Dev., 7:555-569 (1993)] gescreent, wobei die vollständige Kodierregion von CAML als Köder verwendet wird. Die humane CAML-cDNA wird in den Hefe-Zwei-Hybrid-Köder-Vektor pAS1 eingebracht. Dieses Konstrukt steuert die Expression einer GAL4-DNA-Bindungsdomäne, welche an die gesamte Proteinsequenz von CAML fusioniert. Eine B-Lymphozyten-Bibliothek in Plasmid pACT wird in Hefe Y153 transformiert und mögliche wechselwirkende Plasmide werden durch das Wachstum von Kolonien auf Medien, welche einen Mangel an Histidin aufweisen und 3-Aminotriazol enthalten, identifiziert.
Ein Klon (TACI-1) von acht primären positiven wurde identifiziert. Die TACI-1-cDNA wird in ein Säugerexpressionsplasmid, welches eine Epitopmarkierung an das Amino-terminale Ende des exprimierten Proteins anfügt, subkloniert. Dieses Konstrukt wird dann in die Jurkat-T-Lymphozytenzelllinie, COS-Zellen oder NIH3T3-Zellen transfiziert. In jedem Fall wird die Zelloberflächenexpression des TACI-Proteins gezeigt. Die Orientierung des Proteins ist mit dem N-Terminus zur Außenseite der Zelle, da das Epitop zur Reaktion mit einem spezifischen Antikörper sogar ohne eine Permeabilisierung der Zellmembran erreichbar ist. Dieses Ergebnis ermöglichte die hier beschriebenen funktionellen Studien.
Sekundäres Screening beruht auf einer erzwungenen Überexpression von positiven Klonen in Jurkat-T-Zellen und Testen auf NF-AT-Aktivierung (Bram et al., 1993, vorstehend). Jurkat-T-Zellen, welche mit dem markierten TACI-1-Konstrukt und einem NFAT-Reporterplasmid transient transfiziert wurden, werden in Medium, welches den monoklonalen Epitop-spezifischen Antikörper enthält, inkubiert. Um das Vernetzen von TACI-1 zu maximieren, werden die Antikörper vor der Zugabe zu den Zellsuspensionen an Kügelchen gebunden. Nach einer Inkubation von 24 Stunden wird die Aktivität des NFAT-Reporters bestimmt. Eine starke Induktion der NFAT-Reporteraktivität wird gefunden, wenn Zellen in dieser Weise stimuliert werden. Kontrolltransfektionen ohne das TACI-1-Konstrukt zeigen nach einer solchen Behandlung keine Aktivierung. Genauso aktiviert die Transfektion eines nicht verwandten Zelloberflächenmoleküls (CD8) nach der anti-CD8-Stimulierung nicht NFAT in diesen Zellen. Der Aktivierungsgrad betrug 70 bis 80 % der maximalen Stimulierung, welche in diesen Jurkat-T-Zellen durch Zugabe von Phorbolester plus Ionomycin erreicht werden konnte.
Nach dem Screening eines Northern-Blot mit mehreren Geweben (Clontech) mit TACI-1-cDNA (ausgeschnitten aus einem Hefe-Zwei-Hybrid-Vektor) wird ein unabhängiger TACI-1-Klon aus einer humanen Fötalmilz-cDNA-Bibliothek (Stratagene) erhalten. Die 5'-terminale Kodierregion wird durch schnelle Amplifizierung der cDNA-Enden (RACE) unter Verwendung einer „Marathon-fertigen" humanen Milz-cDNA-Bibliothek (Clontech), eingebunden mit TACI-1-spezifischen Primern (5'-TCTGAATTGTTTTCAACTTCTC-3' und 5'-CAGCAGAGGATCCCAGTACTGCTC-3') und Pfu-Polymerase (Stratagene), gemäß den Empfehlungen des Herstellers bestätigt.
Antiseren. cDNAs, welche die N-terminalen 146 Aminosäurereste von CAML und die N-terminalen 151 Reste von TACI-1 kodieren, werden jeweils in einen GST-Fusionsbakterienexpressionsvektor (Pharmacia) kloniert. Polyklonale Kaninchen-Antiseren werden gegen gereinigte GST-Fusionsproteine gerichtet [Smith & Johnson, Gene, 67:31-40 (1988)] und die spezifischen Antikörper werden unter Verwendung von Standardtechniken durch Immunaffmitätschromatografie über die gereinigten Proteine, welche an Agarose gekuppelt sind (Pierce), gereinigt. Vernetztes anti-TACI-1 wird durch Inkubieren von durch Immunaffinität gereinigten polygonalen anti-TACI-1-Antikörpern mit anti-Kaninchen-IgG-Antikörpergekuppelten magnetischen Kügelchen (PerSeptive Diagnostics) hergestellt.
Screening zur Identifizierung von neuen immunsuppressiven Arzneistoffen: Jurkat-T-Zellen werden mit dem TACI-1-Expressionsplasmid und einem NF-AT-Reporterplasmid transfiziert. Jurkat-T-Zellen exprimieren den T-Zellen-Rezeptor (TCR) von Natur aus. Die Zellen werden durch die Zugabe von Antikörpern zu TACI-1, Antikörpern zu TCR oder Antikörpern zu beiden stimuliert. Testarzneistoffe werden mit den Jurkat-T-Zellen gemischt und die Wirkung dieser Arzneistoffe wird bestimmt.
Das NF-AT-Reporterplasmid enthält den SEAP-Reporter. Dieses Signal wird zur Messung des Grades der Inhibierung der Aktivierung verwendet. Der SEAP-Reporter-Test wird im Maßstab vergrößert, so dass er mit einem Roboter-Screening-Gerät durchgeführt wird. Arzneistoffe, welche die Aktivierung von TACI-1, aber nicht TCR blockieren, wie durch den SEAP-Reporter-Test gemessen, werden als mit einer selektiven Inhibierung der TACI-1-aktivierten Antwort identifiziert.
Ergebnisse und Diskussion
Proteine, welche mit CAML Wechselwirken können, werden unter Verwendung eines Zwei-Hybrid-Screens (Fields & Song, 1989, vorstehend); (Durfee et al., 1993, vorstehend) mit CAML als Köder identifiziert. Um zu bestimmen, ob eines dieser identifizierten CAML-bindenden Proteine die Ca²⁺-Signalgebung in T-Zellen beeinflussen kann, wird ihr Vermögen zur Modulierung der Aktivität des Ca²⁺-abhängigen Transkriptionsfaktors NF-AT untersucht [Truneh et al., Nature, 313:318-321 (1985)]; [Verweij et al., J. Biol. Chem., 265:15788-15795 (1990)]; [Karttunen & Shastri, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3972-3976 (1991)]; [Emmel et al., Science, 246:1617-1620 (1989)]. Die erzwungene Überexpression der Zwei-Hybrid-Klone in Jurkat-T-Zellen enthüllt, dass ein Klon (der das TACI-1-Protein kodiert) das Erfordernis des Ca²⁺-Zuflusses ersetzte, was darauf hinweist, dass TACI-1 im selben Signalweg wie CAML liegt. Eine Northern-Blot-Analyse auf TACI-1-mRNA zeigt eine mRNA mit 1,4 kb, welche nur in der Milz, im Dünndarm, im Thymus und den peripheren Blutlymphozyten exprimiert wird, was auf eine eingeschränkte Expression von TACI-1 hindeutet (1). Das beobachtete Muster ist mit der Expression von TACI-1 konsistent, welche vorwiegend in peripheren Blutzellen stattfindet, da periphere Blutzellen und insbesondere Lymphozyten in all diesen Organen (einschließlich Peyer-Plaques im Dünndarm) vorhanden sein können. Darüber hinaus gibt es keinen Nachweis für eine Expression im Darm, den Hoden, den Ovarien oder der Prostata. Zusätzlich wird das TACI-1-Protein in allen normalen peripheren B- Lymphozyten unter Verwendung von spezifischem Antikörper-Anfärben nachgewiesen. Es gibt kein nachweisbares Protein, welches in peripheren T-Lymphozyten, Monozyten oder Neutrophilen exprimiert wird.
Die Bestimmung der DNA-Sequenz von beiden Strängen der isolierten DNA enthüllt einen vollständigen offenen Leserahmen von 1325 Basenpaaren, was darauf hinweist, dass ein Protein mit 293 Aminosäuren kodiert wird. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von TACI-1 ( 2a) schließt eine einzelne hydrophobe Region (Reste 167 bis 186) ein, welche Merkmale eines Membran-durchspannenden Segments aufweist (2b). Eine Analyse der Proteinsequenz durch das Verfahren von Sipos [Sipos & von Heijne, Eur. J. Blocker., 213:1333-1340 (1993)]; [Claros & von Heijne, Comput. Appl. Biosci., 10:685-686 (1994)] weist auf ein extrazelluläres Einwirken auf den N-Terminus und ein cytoplasmatisches Einwirken auf den C-Terminus hin. Obwohl TACI-1 keine N-terminale Signalsequenz aufweist, zeigt das Vorhandensein eines strangaufwärts liegenden Stoppcodons, dass der vollständige offene Leserahmen in dem Klon enthalten ist. TACI-1 weist relativ viele Cysteinreste auf, es gibt aber keine signifikante Sequenzähnlichkeit oder -homologie zu jedwedem anderen offenbarten Protein. Eine Suche nach Prosit-Motiven in TACI-1 enthüllte ein TNFR_NGFR-Motiv [Bairoch, Nucleic Acids Res., 21:3097-3103 (1993)] (Reste 33 bis 71) N-terminal zu einer vermeintlichen Transmembranregion, bestehend aus C-x(4,6)-[FYH]-x(5,10)-C-x(0,2)-C-x(2,3)-C-x(7,11)-Cx(4,6)-[DNEQSKP]-x(2)-C in der N-terminalen Hälfte des Proteins. Dieses Motiv wird in einer Anzahl von Proteinen gefunden, wobei einige davon Rezeptoren für Wachstumsfaktoren sind. Einige dieser Proteine weisen eine Kopie dieses Motivs auf. Ein Vergleich der TACI-1-Proteinsequenz mit sich selbst enthüllt eine wesentliche Wiederholung zwischen dem TNFR_NGFR-Motiv bei den Resten 33 bis 66 und den Resten 70 bis 104. Diese Analyse zog die Aufmerksamkeit auf das Vorhandensein von zwei Cystein-reichen Domänen vom TNFR-Typ, welche diese Regionen umfassen, was darauf hinweist, dass TACI-1 ein Mitglied der Superfamilie der TNFR-Rezeptoren ist (2c).
Um zu bestätigen, dass TACI-1 ein Transmembranprotein ist, wurde seine Expression in Jurkat-T-Zellen, welche mit einem TACI-1-kodierenden Plasmid transfiziert wurden, unter Verwendung von Durchflusszytometrie untersucht. Zellen, welche mit TACI-1 transfiziert wurden, zeigen ein Oberflächenanfärben mit polyklonalen Kaninchenantikörpern, welche gegen ein Fusionsprotein gerichtet sind, das den N-terminalen 12 Kilodalton-Teil von TACI-1 einschließt (3a). Ein zusätzlicher Beweis, dass TACI-1 auf der Zelloberfläche lokalisiert ist, wird von Immunfluoreszenzmikroskopie abgeleitet, wobei das Oberflächenanfärben von intakten Zellen, welche mit einem N-terminalen FLAG-Epitop-markierten TACI-1-Expressionsplasmid transfiziert wurden, beobachtet wird (3b). Da der N-Terminus von TACI-1 in der Abwesenheit einer gespaltenen Signalsequenz extrazellulär ist, ist es ein Transmembranprotein vom Typ III [Wilson-Ravels et al., Virology, 201:66-76 (1994)].
Um die Wirkung von TACI-1 auf die NF-AT-Aktivität in T-Zellen abzuschätzen, wird das Protein transient in TAg-Jurkat-T-Zellen mit einem sekretierten alkalischen Phosphatasereporter, der durch die NF-AT-Bindungssequenzen vom IL-2-Promotor gesteuert wird, exprimiert (Bram & Crabtree, 1994, vorstehend); [Fiering et al., Genes Dev., 4:1823-1834 (1990)]; (Bram et al., 1993, vorstehend). Eine TACI-1-Überexpression kann die Anforderung für Ionomycin in diesem Test teilweise ersetzen. Die Zugabe von anti-TACI-1-Antikörpern zu den Zellen erhöht die NF-AT-Aktivierung weiter (mehr als zweifach, siehe 4a), was zeigt, dass TACI-1 auf das Vernetzen auf der Zelloberfläche antwortet. Der Grad der NF-AT-Aktivierung variiert in unterschiedlichen Experimenten aufgrund der Transfektionswirksamkeit, beträgt aber typischerweise 40 bis 50 % der maximalen Antwort auf die entsprechende Behandlung der Zellen mit PMA plus Ionomycin. Die TACI-1-vermittelte NF-AT-Aktivierung hängt von Calcineurin ab, wie durch den Verlust der NF-AT-Aktivität in der Gegenwart eines immunsuppressiven Arzneistoffes, wie Cyclosporin A oder FK506, gezeigt wird [Friedman & Weissman, Cell, 66:799-806 (1991)]; (Lui et al., 1991, vorstehend) (4b).
Zur Untersuchung der Anforderung eines Ca²⁺-Zuflusses bei der TACI-1-vermittelten Aktivierung von NF-AT kann extrazelluläres Calcium durch die Zugabe von steigenden Konzentrationen von EGTA entfernt werden. Dies resultiert in der Inhibierung der TACI-1-vermittelten NF-AT-Aktivierung, wie früher für T-Zellen-Rezeptor-vermittelte Aktivierung gezeigt wurde (4c). Als eine Kontrolle wird die Wirkung der Expression einer konstitutiv aktiven, Calcium-unabhängigen Mutante von Calcineurin A in den Zellen [Hubbard & Klee, Biochemistry, 28:1868-74 (1989)]; (O'Keefe et al., 1992, vorstehend); (Clipstone & Crabtree, 1993, vorstehend) untersucht. Wie erwartet, wird in diesen Zellen NF-AT-Aktivierung gesehen, sogar in der Gegenwart von EGTA (4c). Folglich vermittelt in T-Zellen TACI-1 den Calcineurin-abhängigen Aspekt der Aktivierung von NF-AT durch Initiierung des Zuflusses von extrazellulärem Ca²⁺ (am wahrscheinlichsten durch den kapazitiven Ca²⁺-Zufluss-Weg nach der Depletion der intrazellulären Vorräte [Putney & Bird, Cell, 75:199-201 (1993)]; Hoth & Premier, Physiol., 465:359-386 (1993)]; [Zweifach & Lewis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6295-6299 (1993)]; [Premack et al., J. Immunol., 152:5226-5240 (1994)]).
Die Aktivierung von NF-AT durch CAML erfordert eine exogene Stimulierung von Proteinkinase C durch die Zugabe von Phorbolester (Bram & Crabtree, 1994, vorstehend). Antikörper-vernetztes TACI-1 ist jedoch zur Aktivierung von NF-AT in der Abwesenheit von entweder PMA oder Ionomycin in der Lage (4b, volle Säulen). Experimente, welche die Aktivierung eines AP-1-Reporters durch die Überexpression von TACI-1 untersuchen, zeigen, dass die AP-1-Aktivierung in TACI-1-transfizierten Jurkat-T-Zellen (mehr als vierfach) erhöht ist. Diese Wirkung kann mit der Zugabe von vernetzten anti-TACI-1-Antikörpern weiter gesteigert werden (4d). Deshalb initiiert TACI-1 den Ca²⁺-Zufluss, was seinerseits Calcineurin aktiviert, sowie den AP-1-Weg aktiviert, nach der Stimulierung, wobei die Erfüllung von beiden Anforderungen für die Aktivierung von NF-AT vermittelt wird.
Ferner kann eine Bestätigung, dass TACI-1 mit CAML wechselwirkt, durch ihre spezifische Wechselwirkung in einem Zwei-Hybrid-Umkehraustauschexperiment gezeigt werden (Durfee et al., 1993, vorstehend) (5a). Zur Definierung der kritischen Aminosäurereste, welche in die Wechselwirkung einbezogen sind, werden Deletionsmutanten von sowohl TACI-1 als auch CAML auf ihr Vermögen zur physikalischen Assoziation getestet (5a). Es wurde gefunden, dass die C-terminalen 126 Aminosäuren von TACI-1 zur Bindung an die N-terminalen 146 Aminosäuren von CAML ausreichend sind. Ein zusätzlicher Beweis für die in vivo-Assoziation von TACI-1 und CAML wird durch die Experimente bereitgestellt, in welchen die volle Länge von CAML und eine Mutante, welche die 146 N-terminalen Aminosäurereste von CAML umfasst, mit TACI-1 von Zelllysaten coimmunpräzipitiert werden ( 5b). Deshalb kann gefolgert werden, dass das C-terminale Cytoplasmaende von TACI-1 physikalisch mit der N-terminalen Hälfte von CAML in Assoziation stehen kann.
Um zu untersuchen, ob die TACI-1-Signalvermittlung von der Assoziation von TACI-1 mit CAML abhängt, wird die wechselwirkende Domäne von CAML (Reste 1 bis 146) getestet, um zu bestimmen, ob sie die TACI-1-induzierte NF-AT-Aktivierung in einer dominanten negativen Weise inhibieren kann. Eine Cotransfektion des mutanten CAML(1-146)-Expressionsplasmids beseitigt die TACI-1-induzierte NF-AT-Aktivierung in Jurkat-T-Zellen vollständig. Auf der anderen Seite tritt keine Inhibitorwirkung bei der PMA plus Ionomycin- induzierten NF-AT-Aktivität auf, wodurch eine nicht-spezifische toxische Wirkung ausgeschlossen wird. Die Coexpression von CAML(1-146) beeinflusst auch nicht die Akkumulation von TACI-1-Protein, wie durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen (5c). CAML(1-146) weist die hydrophoben Transmembrandomänen, welche für die Ca²⁺-Zufluss-Aktivität erforderlich sind, nicht auf [Holloway & Bram, Biol. Chem., 271:8549-8552 (1996)]. Folglich kann für die Beseitigung der NF-AT-induzierenden Aktivität in diesen Zellen das Binden des CAML(1-146)-Fragments an dem intrazellulären C-terminalen Teil von TACI-1 verantwortlich gemacht werden, wobei eine Assoziation mit der vollen Länge des endogenen CAML verhindert wird.
CAML ist ein integrales Membranprotein, welches in Cytoplasmavesikeln lokalisiert ist (Bram & Crabtree, 1994, vorstehend). Eine Analyse von Deletionsmutanten hat gezeigt, dass hydrophobe Domänen in der C-terminalen Hälfte des Proteins für die Aktivität wesentlich sind (Holloway & Bram, 1996, vorstehend) und dass die hydrophile N-terminale Hälfte des Proteins eine regulatorische Rolle spielen kann. Trypsinverdau-Experimente zeigen ferner, dass die N-terminale Hälfte des Moleküls im Cytoplasma vorliegt. Hier wird gezeigt, dass die Wechselwirkung zwischen TACI-1 und CAML zur TACI-1-vermittelten NF-AT-Aktivierung in Jurkat-T-Zellen erforderlich ist. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass eine physikalische Wechselwirkung zwischen TACI-1 in der Plasmamembran und intrazellulären CAML-enthaltenden Vesikeln ein Calciumzuflusssignal initiieren kann (5d). Diese Befunde stellen den ersten Beweis für eine direkte Kommunikation zwischen Zelloberflächenrezeptoren und intrazellulären Organellen in Lymphozyten bereit. Dieser Mechanismus kann in etwa zu dem Dihydropyridin-Ryanodin-Rezeptormodell in Muskelzellen, bei welchem eine Stimulierung von einem Molekül direkt die Aktivität des anderen modulieren kann, analog sein [Marty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2270-2274 (1994)]; [Sham et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:121-125 (1995)]; [Nakai et al., Nature, 380:72-75 (1996)].
Es wurde gezeigt, dass andere Zelloberflächenproteine die Lymphozytenfunktion, einschließlich den CD3-T-Zellen-Rezeptor, CD2, CD20 und Thy-1, aktivieren. Diese Proteine weisen keine Sequenzhomologie mit TACI-1 auf und es ist wahrscheinlich, dass sie eine unterschiedliche Rolle zueinander aufweisen, entweder bezogen auf die Antwort auf unterschiedliche extrazelluläre Signale und/oder bezogen auf die Entwicklungsstufe der Expression in Lymphozyten. TACI-1 muss auch bei der Modulierung der Funktion von Lymphozyten in alternativen und/oder costimulierenden Wegen eine Rolle spielen. Folglich ist TACI-1 zusätzlich zur Definition eines neuen Signalmechanismus ein neuer Lymphozyten-spezifischer Rezeptor, der zur Aktivierung von T-Zellen in der Lage ist.
Das Folgende ist eine Auflistung von Druckschriften, welche die vorstehende Offenbarung und insbesondere die experimentellen Verfahren und Erörterungen betreffen.

1. Imboden, J.B., Weiss, A. & Stobo, J.D., J. Immunol., 134:663-5 (1985).
2. Crabtree, G.R. & Clipstone, N.A., Annu. Rev. Biochem., 63:1045-83 (1994).
3. Weiss, A. & Littman, D.R., Cell, 76:263-74 (1994).
4. Bram, R.J. & Crabtree, G.R., Nature, 371:355-8 (1994).
5. Fields, S. & Song, O., Nature, 340:245-6 (1989).
6. Durfee, T., et al., Genes Dev., 7:555-69 (1993).
7. Truneh, A., Albert, F., Golstein, P. & Schmitt, V.A., Nature, 313:318-21 (1985).
8. Verweij, C.L., Guidos, C. & Crabtree, G.R., J. Biol. Chem., 265:15788-95 (1990).
9. Karttunen, J. & Shastri, N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3972-6 (1991).
10. Sipos, L. & von Heijne, G., Eur. J. Biochem., 213:1333-40 (1993).
11. Claros, M.G. & von Heijne, G. Comput. Appl. Biosci., 10:685-6 (1994).
12. Bairoch, A., Nucleic Acids Res., 21:3097-103 (1993).
13. Wilson-Ravels, J., Deutscher, S.L. & Wold, W.S., Virology, 201:66-76 (1994).
14. Fiering, S., et al., Genes Dev., 4:1823-34 (1990).
15. Bram, R.J., Hung, D.T., Martin, P.K., Schreiber, S.L. & Crabtree, G.R., Mol. Cell. Biol., 13:4760-9 (1993).
16. Friedman, J. & Weissman, I., Cell, 66:799-806 (1991).
17. Liu, J., et al., Cell, 66:807-15 (1991).
18. Hubbard, M.J. & Klee, C.B., Biochemistry, 28:1868-74 (1989).
19. O'Keefe, S.J., Tamura, J., Kincaid, R.L., Tocci, M.J. & O'Neill, E.A., Nature, 357:692-4 (1992).
20. Clipstone, N.A. & Crabtree, G.R., Ann. N.Y. Acad. Sci., 696:20-30 (1993).
21. Putney, J.W., Jr. & Bird, G.S., Cell, 75:199-201 (1993).
22. Hoth, M. & Prenner, R., J. Physiol. (Land.), 465:359-86 (1993).
23. Zweifach, A. & Lewis, R.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6295-9 (1993).
24. Premack, B.A., McDonald, T.V. & Gardner, P., J. Immunol., 152:5226-40 (1994).
25. Holloway, M.P. & Bram, R.J., J. Biol. Chem., 271:8549-52 (1996).
26. Marty, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2270-4 (1994).
27. Sham, J.S., Cleemann, L. & Morad, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:121-5 (1995).
28. Nakai, J., et al., Nature, 380:72-5 (1996).
29. Smith, D.B. & Johnson, K.S., Gene, 67:31-40 (1988).
30. Takebe, Y., et al., Mol. Cell. Biol., 8:466-72 (1988).
31. Emmel et al., Science, 246:1617-1620 (1989).
32. Mattila et al., Emble J, 9:4425-33 (1990).

Zusätzlich zu den unmittelbar vorstehenden werden hier verschiedene Veröffentlichungen aufgeführt. Das Aufführen von jedweder Druckschrift hier sollte nicht als ein Eingeständnis angesehen werden, dass eine solche Druckschrift als Stand der Technik für die vorliegende Erfindung zugänglich ist.
Obwohl die Erfindung hier durch Bezugnahmen auf die speziellen Ausführungsformen, verschiedenes spezielles Material, Verfahren und Beispiele beschrieben und veranschaulicht wurde, gilt es als selbstverständlich, dass die Erfindung nicht auf die besonderen Materialkombinationen des Materials und für diesen Zweck ausgewählte Verfahren eingeschränkt ist. Tatsächlich werden für den Fachmann durch die vorstehende Beschreibung und die angefügten Figuren verschiedene Modifizierungen der Erfindung zusätzlich zu denen, welche hier beschriebenen werden, ersichtlich werden. Es ist beabsichtigt, dass solche Modifizierungen in den Umfang der angefügten Patentansprüche fallen.
Es wird ferner vereinbart, dass alle Basengrößen und Aminosäuregrößen und alle Molekulargewicht- oder Molekülmassewerte, welche für Nukleinsäuren oder Polypeptide angegeben werden, Näherungen sind und zur Beschreibung bereitgestellt werden. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isolierte Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: d) einer Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Identität mit den Nukleotiden 14 bis 895 von SEQ ID Nr. 1, wobei die Nukleotidsequenz ein Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Protein kodiert; e) einer Nukleotidsequenz, umfassend mindestens 18 Nukleotide einer Nukleotidsequenz, welche ein Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Protein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 2, umfassend eine konservative Substitution davon, besteht, wobei die Nukleotidsequenz ein N-terminales Fragment des TACI-Proteins kodiert, welches die regulatorische extrazelluläre Domäne ist; und f) einer Nuldeotidsequenz, welche ein C-terminales Fragment des TACI-Proteins kodiert, wobei das C-terminale Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 4, umfassend eine konservative Substitution davon, besteht, und wobei das C-terminale Fragment ausreichend ist, um an die N-terminalen 146 Aminosäuren von CAML zu binden; wobei das TACI-Protein als ein Zelloberflächensignalprotein fungiert und durch Wechselwirkung mit CAML Signale vermittelt.
Isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz die Nukleotide 14 bis 895 von SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz, welche ein Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Protein kodiert, die SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei das N-terminale Fragment des TACI-Proteins eine Aminosäuresequenz aufweist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 6, umfassend eine konservative Substitution davon, besteht.
Isolierte Nukleinsäure gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure das TACI-Protein kodiert.
Rekombinantes DNA-Konstrukt, umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleinsäure operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist.
Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 6, wobei die Expressionskontrollsequenz der SRα-Promotor ist.
Einzelliger Wirt, transformiert mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 6 oder 7.
Einzelliger Wirt gemäß Anspruch 8, wobei der einzellige Wirt ein Prokaryot ist.
Einzelliger Wirt gemäß Anspruch 8, wobei der einzellige Wirt ein Eukaryot ist.
Isoliertes Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Protein, welches durch eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 kodiert wird, wobei das TACI-Protein eine extrazelluläre Domäne, eine die Membran durchspannende Domäne und eine Cytoplasmadomäne, welche eine Bindungsaffinität für CAML aufweist, umfasst, wobei das TACI-Protein ein Plasmamembranrezeptor ist, der direkt mit einer intrazellulären Organelle in Lymphozyten wechselwirkt.
TACI-Protein gemäß Anspruch 11, wobei das TACI-Protein ein TNFR_NGFR-Motiv umfasst, wobei das TNFR_NGFR die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 11 aufweist.
TACI-Protein nach Anspruch 11, wobei das TACI-Protein ein Monomer umfasst, welches aus etwa 295 Aminosäuren besteht.
TACI-Protein gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei das TACI-Protein zwei TNFR_NGFR-Motive umfasst, wobei jedes TNFR_NGFR-Motiv die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 11 aufweist.
TACI-Protein gemäß Anspruch 13, wobei das TACI-Protein zwei Motive, wie durch die Aminosäuren 33 bis 66 und 70 bis 104 von SEQ ID Nr. 2 dargestellt, umfasst; und wobei, wenn geeignet stimuliert, in situ, das TACI-Protein die Aktivierung eines Transkriptionsfaktors durch die Kombination eines Ca²⁺-abhängigen und eines Ca²⁺-unabhängigen Weges initiiert.
TACI-Protein gemäß Anspruch 11, wobei das TACI-Protein eine Aminosäuresequenz, welche SEQ ID Nr. 2 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, welche SEQ ID Nr. 2 mit mindestens einer konservativen Aminosäuresubstitution umfasst, aufweist.
Fragment eines TACI-Proteins, welches durch eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 kodiert wird, wobei das TACI-Protein eine extrazelluläre Domäne, ein die Membran durchspannendes Segment und eine Cytoplasmadomäne, welche eine Bindungsaffinität für CAML aufweist, umfasst, und wobei das TACI-Protein ein Plasmamembranrezeptor ist, der direkt mit einer intrazellulären Organelle in Lymphozyten wechselwirkt, wobei das Fragment aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a) einem C-terminalen Fragment des TACI-Proteins, wobei das C-terminale Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 4, umfassend eine konservative Aminosäuresubstitution davon, besteht, und wobei das C-terminale Fragment ausreichend ist, um die N-terminalen 146 Aminosäuren von CAML zu binden; und b) einem N-terminalen Fragment des TACI-Proteins, welches die regulatorische extrazelluläre Domäne ist.
Fragment gemäß Anspruch 17, wobei das TACI-Protein umfasst: a) ein Monomer, welches aus etwa 295 Aminosäuren besteht; und b) zwei TNFR_NGFR-Motive, wobei jedes TNFR_NGFR-Motiv die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 11 aufweist.
Fragment gemäß Anspruch 17 oder 18, wobei das TACI-Protein eine Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 2 mit einer konservativen Substitution davon aufweist.
Fragment gemäß Anspruch 17, wobei das N-terminale Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 6, umfassend eine konservative Aminosäuresubstitution davon, besteht.
Chimäres Protein, umfassend ein Fragment gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20.
Chimäres Protein gemäß Anspruch 21, wobei das Fragment ein N-terminales Fragment mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 oder der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 mit mindestens einer konservativen Aminosäuresubstitution ist.
Chimäres Protein gemäß Anspruch 21, wobei das Fragment ein C-terminales Fragment mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 oder der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 mit mindestens einer konservativen Aminosäuresubstitution ist.
Chimäres Protein gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, ferner umfassend die FC-Domäne eines Immunglobulins.
Antikörper, der spezifisch an ein TACI-Protein gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16 oder an ein Fragment gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20 bindet.
Antikörper gemäß Anspruch 25, wobei das Fragment aus einem N-terminalen Fragment des TACI-Proteins besteht, welches die regulatorische extrazelluläre Domäne des TACI-Proteins ist.
Antikörper gemäß Anspruch 26, wobei das Fragment die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Antikörper gemäß Anspruch 25, wobei das Fragment ein C-terminales Fragment des TACI-Proteins ist, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 umfasst, und ausreichend ist, die N-terminalen 146 Aminosäuren von CAML zu binden.
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei das TACI-Protein eine Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.
Immortale Zelllinie, welche einen monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 29 herstellt.
Antisense-Nukleinsäure, welche unter physiologischen Bedingungen mit einer mRNA hybridisiert, welche ein TACI-Protein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr.2, umfassend eine konservative Substitution davon, besteht, und die Translation der mRNA blockiert.
Knockout-Maus, umfassend ein erstes und ein zweites Allel, wobei a) das erste Allel und das zweite Allel jeweils natürlich ein funktionelles TACI-Protein kodieren und exprimieren; b) das erste Allel einen Fehler enthält; und c) der Fehler verhindert, dass das erste Allel das funktionelle TACI-Protein exprimiert.
Knockout-Maus gemäß Anspruch 34, wobei a) das zweite Allel auch den Fehler enthält; und b) der Fehler verhindert, dass das zweite Allel ein funktionelles TACI-Protein exprimiert, wobei die Knockout-Maus kein funktionelles TACI-Protein exprimiert.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 11 bis 20, umfassend das Einbringen eines Expressionsvektors, welcher eine Nukleinsäure umfasst, die das Polypeptid kodiert, in eine Wirtzelle, wobei das Polypeptid in der Wirtzelle exprimiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 36, ferner umfassend das Reinigen des Polypeptids.
Verfahren gemäß Anspruch 36 oder 37, wobei das Polypeptid ein TACI-Protein mit einer Aminosäuresequenz ist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 2, umfassend eine konservative Substitution davon, besteht.
Verfahren zum Identifizieren eines Liganden für ein Transmembranaktivator- und CAML-Wechselwirkungs-(TACI)-Protein, umfassend: a) das Inkontaktbringen eines N-terminalen extrazellulären Polypeptids eines TACI-Proteins, welches durch eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 kodiert wird, mit einem Testmolekül; und b) das Nachweisen der Bindung des N-terminalen extrazellulären Polypeptids mit dem Testmolekül, wobei die Bindung des N-terminalen extrazellulären Polypeptids mit dem Testmolekül das Testmolekül als einen Liganden identifiziert.
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei das N-terminale Fragment des TACI-Proteins eine Aminosäuresequenz aufweist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 6, umfassend eine konservative Substitution davon, besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei das N-terminale extrazelluläre Polypeptid in einem funktionellen TACI-Protein vorhanden ist, und wobei das Binden des Testmoleküls durch Nachweisen einer zellulären Aktivierung eines Vorgangs bestimmt wird, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: a) der Aktivierung des AP-1-Weges; b) der Aktivierung des CAML-Weges; c) der Aktivierung des NF-AT-Transkriptionsfaktors; d) der Aktivierung des NF-KB-Weges; und e) der Aktivierung der NF-AT-abhängigen Transkription.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei das TACI-Protein in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Screen exprimiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 41 oder 42, wobei das TACI-Protein in Jurkat-Zellen exprimiert wird, welche ein Reportergen unter der Kontrolle eines NF-AT-Promotors enthalten.
Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei das Reportergen einen Marker kodiert, welcher sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) ist.
Verfahren zum Identifizieren eines immunsuppressiven Arzneistoffes, welcher selektiv die Wirkung von B-Lymphozyten blockiert, ohne reife T-Lymphozyten zu beeinflussen, umfassend: a) das Inkontaktbringen eines ersten Lymphozyten mit einem möglichen Arzneistoff; wobei der erste Lymphozyt ein TACI-Protein, welches durch eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert wird, und ein erstes Markerprotein enthält, und wobei das erste Markerprotein transkribiert wird, wenn TACI in der Abwesenheit eines Testarzneistoffes stimuliert wird; b) das Stimulieren von TACI; c) das Nachweisen des ersten Markerproteins unter Bedingungen, bei welchen das transkribierte erste Markerprotein nachgewiesen werden kann; wobei ein möglicher Arzneistoff als ein Testarzneistoff ausgewählt wird, wenn das erste Markerprotein nicht nachgewiesen werden kann; d) das Inkontaktbringen eines zweiten Lymphozyten mit dem Testarzneistoff wobei der zweite Lymphozyt einen T-Zellen-Rezeptor und ein zweites Markerprotein enthält, und wobei das zweite Markerprotein transkribiert wird, wenn der T-Zellen-Rezeptor entweder in der Abwesenheit oder der Anwesenheit eines immunsuppressiven Arzneistoffes stimuliert wird; e) das Stimulieren des T-Zellen-Rezeptors; f) das Nachweisen des zweiten Markerproteins unter Bedingungen, bei welchen das transkribierte zweite Markerprotein nachgewiesen werden kann; wobei ein Testarzneistoff als ein immunsuppressiver Arzneistoff identifiziert wird, wenn das zweite Markerprotein nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei das Stimulieren von TACI mit einem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 25 bis 31 durchgeführt wird.