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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung bei der
in vitro-Evolution von molekularen Bibliotheken. Insbesondere betrifft
die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erhöhung der Konzentration von Nukleinsäuren, die
Genprodukte codieren, wobei die Nukleinsäure und die Aktivität des codierten
Genprodukts durch Kompartimentierung verknüpft sind.
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Die
Evolution erfordert die Erzeugung von genetischer Diversität (Diversität bei der
Nukleinsäure),
gefolgt von der Selektion jener Nukleinsäuren, welche zu nützlichen
Eigenschaften führen.
Da die Nukleinsäure und
die Aktivität
des codierten Genprodukts eines Organismus körperlich verknüpft sind
(wobei die Nukleinsäuren
innerhalb der Zellen eingeschlossen sind, welche diese codieren),
können
mehrere Runden von Mutation und Selektion zu dem zunehmenden Überleben
von Organismen mit steigender Fitness führen. Systeme zur schnellen
Evolution von Nukleinsäuren
oder Proteinen in vitro müssen
diesen Prozess auf dem molekularen Niveau darin nachahmen, dass
die Nukleinsäure
und die Aktivität
des codierten Genprodukts verknüpft sein
müssen
und die Aktivität
des Genprodukts selektierbar sein muss.
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Jüngere Fortschritte
in der Molekularbiologie haben ermöglicht, dass einige Moleküle entsprechend
ihren Eigenschaften zusammen mit den Nukleinsäuren, die diese codieren, koselektiert
werden können.
Die selektierten Nukleinsäuren
können
anschließend
zur weiteren Analyse oder Verwendung kloniert werden oder zusätzlichen
Runden von Mutation und Selektion unterzogen werden.
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Diesen
Verfahren gemein ist die Schaffung großer Bibliotheken von Nukleinsäuren. Moleküle mit den gewünschten
Eigenschaften (Aktivität)
können
durch Selektionsregimes, die im Hinblick auf die gewünschte Aktivität des codierten
Genprodukts, wie z.B. eine gewünschte
biochemische oder biologische Aktivität, z.B. Bindungsaktivität, selektieren,
isoliert werden.
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Die
Phagen-Display-Technologie war sehr erfolgreich, da diese ein Vehikel
bereit stellt, welches die Selektion eines präsentierten Proteins erlaubt,
indem sie die essentielle Verknüpfung
zwischen der Nukleinsäure
und der Aktivität
des codierten Genprodukts liefert (Smith, 1985; Bass et al., 1990;
McCafferty et al., 1990; für
einen Überblick
siehe Clack son und Wells, 1994). Filamentöse Phagenpartikel wirken als
genetische Präsentationspakete
mit Proteinen auf der Außenseite
und den genetischen Elementen, welche diese codieren, auf der Innenseite.
Die enge Verknüpfung
zwischen der Nukleinsäure
und der Aktivität
des codierten Genprodukts ist ein Ergebnis des Zusammenbaus des
Phagen innerhalb von Bakterien. Da einzelne Bakterien selten mehrfach
infiziert sind, werden in den meisten Fällen all die Phagen, die von
einem einzelnen Bakterium produziert werden, dasselbe genetische
Element tragen und dasselbe Protein präsentieren.
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Jedoch
beruht der Phagen-Display auf der Erzeugung von Nukleinsäurebibliotheken
in vivo in Bakterien. Somit liegt die praktische Grenze für die Größe der Bibliothek,
die von der Phagen-Display-Technologie erlaubt wird, in der Größenordnung
von 107 bis 1011.
selbst wenn man den Vorteil von λ-Phagen-Vektoren
mit herausschneidbaren filamentösen
Phagenreplikons nutzt. Die Technik ist vorwiegend auf die Selektion
von Molekülen
mit Bindungsaktivität
angewandt worden. Eine kleine Anzahl von Proteinen mit katalytischer
Aktivität
ist ebenfalls unter Verwendung dieser Technik isoliert worden, jedoch
war in keinem Fall die Selektion direkt auf die gewünschte katalytische
Aktivität
gerichtet, sondern entweder auf die Bindung an ein Analogon des Übergangszustands
(Widersten und Mannervik, 1995) oder eine Reaktion mit einem Selbstmord-Inhibitor (Soumillion
et al., 1994; Janda et al., 1997).
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Spezifische
Peptidliganden sind im Hinblick auf die Bindung an Rezeptoren durch
Affinitätsselektion unter
Verwendung großer
Bibliotheken von Peptiden, die mit dem C-Terminus des lac-Repressors
Lacl verknüpft
waren, selektiert worden (Cull et al., 1992). Wenn es in E. coli
exprimiert wird, verknüpft
das Repressorprotein körperlich
den Liganden mit dem codierenden Plasmid, indem es an eine lac-Operatorsequenz
auf dem Plasmid bindet.
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Von
einem vollkommenen in vitro-Polysomen-Display-System wurde ebenfalls
berichtet (Mattheakis et al., 1994), bei welchem naszierende Peptide
körperlich über das
Ribosom an der RNA befestigt werden, welche diese codiert.
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Jedoch
ist der Umfang der obigen Systeme auf die Selektion von Proteinen
beschränkt
und erlaubt darüber
hinaus nicht die direkte Selektion im Hinblick auf Aktivitäten außer einer
Bindung, z.B. katalytische oder regulatorische Aktivität.
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Die
RNA-Selektion und Evolution in vitro (Ellington und Szostak, 1990),
welche manchmal als SELEX (systematische Evolution von Liganden
durch exponentielle Anreicherung) bezeichnet wird (Tuerk und Gold, 1990),
erlaubt eine Selektion im Hinblick auf sowohl Bindung als auch chemische
Aktivität,
aber nur für
Nukleinsäuren.
Wenn die Selektion im Hinblick auf die Bindung erfolgt, wird ein
Pool von Nukleinsäuren
mit immobilisiertem Substrat inkubiert. Nicht bindende werden weggewaschen,
dann werden die bindenden freigesetzt, amplifiziert, und der gesamte
Prozess wird in iterativen Schritten wiederholt, um im Hinblick
auf bessere Bindungssequenzen anzureichern. Dieses Verfahren kann
ebenfalls angepasst werden, um eine Isolation von katalytischer
RNA und DNA zu erlauben (Green und Szostak, 1992; für Übersichten
siehe Chapman und Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al., 1995;
Moore, 1995).
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Jedoch
ist die Selektion im Hinblick auf „katalytische" oder Bindungsaktivität unter
Verwendung von SELEX nur möglich,
da dasselbe Molekül
die duale Rolle spielt, die genetische Information zu tragen und
der Katalysator oder das bindende Molekül (Aptamer) zu sein. Wenn die
Selektion im Hinblick auf „Autokatalyse" stattfindet, muss
dasselbe Molekül
ebenfalls die dritte Rolle spielen, ein Substrat zu sein. Da das
genetische Element sowohl die Rolle des Substrats als auch des Katalysators
spielen muss, ist eine Selektion nur für Ereignisse mit einer einzigen
Umsetzung möglich.
Da der „Katalysator" bei diesem Prozess
selbst modifiziert wird, ist er definitionsgemäß kein richtiger Katalysator.
Zusätzlich
können
Proteine nicht unter Verwendung des SELEX-Vorgangs selektiert werden.
Der Bereich von Katalysatoren, Substraten und Reaktionen, welche
selektiert werden können,
ist daher eng beschränkt.
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Jene
der obigen Verfahren, die iterative Runden von Mutation und Selektion
erlauben, ahmen in vitro-Mechanismen nach, die gewöhnlich dem
Prozess der Evolution zugeschrieben werden: iterative Variation, fortlaufende
Selektion auf eine gewünschte
Aktivität
und Replikation. Jedoch hat keines der bisher entwickelten Verfahren
Moleküle
mit vergleichbarer Diversität
und funktionaler Effizienz wie bei denen, die in der Natur gefunden
werden, bereit gestellt. Zusätzlich
gibt es keine von Menschen geschaffenen „Evolutions"-Systeme, welche sowohl Nukleinsäuren als
auch Proteine entstehen lassen können,
um den vollen Bereich an biochemischen und biologischen Aktivitäten zu verwirklichen
(z.B. Bindungs-, katalytische und regulatorische Aktivitäten), und
welche mehrere Prozesse kombinieren können, die zu einem gewünschten
Produkt oder einer gewünschten
Aktivität
führen.
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Es
gibt somit einen großen
Bedarf für
ein in vitro-System, welches die oben diskutierten Beschränkungen überwindet.
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Oberholzer
et al (1995), Chemistry and Biology, Curent Biology, London, GB,
Bd. 2 (10), Seiten 677-682 berichten von einer DNA-Synthese in Liposomen
unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion.
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Oberholzer,
Thomas, et al. (1995), Biochemical and Biophysical Research Communications,
Bd. 207(1), Seiten 250-257 offenbaren eine enzymatische RNA-Replikation
in selbst-reproduzierenden Vesikeln.
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Walde
et al. (1994), Journal of the American Chemical Society, Bd. 116(17),
Seiten 7541-7547
offenbaren die enzymatische Synthese von Poly(adenylsäure) in
Mizellen und selbst-reproduzierenden Vesikeln.
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Die
WO 93/03151 offenbart ein
Verfahren zur Behandlung einer heterogenen Population von Zellen, um
Kopien von zwei oder mehreren Nukleinsäuresequenzen aus wenigstens
einigen der Zellen miteinander zu verknüpfen, wobei die Anordnung derart
ist, dass Kopien der DNA-Sequenzen aus einer einzelnen Zelle vorzugsweise
in der Nähe
der Nukleinsäure,
von welcher die Kopien abgeleitet sind, verknüpft werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
UND DER OFFENBARUNG
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Erhöhung
der Konzentration eines Nukleinsäuremoleküls bereit
gestellt, wobei das Verfahren umfasst:
- (a)
Bilden von wässrigen
Mikrokapseln in einer Wasser-in-Öl-Emulsion,
wobei die Mikrokapseln eine wässrige
innere Phase umfassen, die als diskrete Tröpfchen in einer hydrophoben äußeren Phase
suspendiert ist, und wobei eine Mehrzahl der Mikrokapseln ein Nukleinsäuremolekül und eine
wässrige
Lösung
beinhaltet, die Komponenten umfasst, die für eine Nukleinsäureamplifikation
in der wässrigen
inneren Phase notwendig sind;
- (b) Amplifizieren des Nukleinsäuremoleküls in den Mikrokapseln, um
weitere amplifizierte Kopien des Nukleinsäuremoleküls zu bilden; und
- (c) Anreichern im Hinblick auf die Nukleinsäure unter Verwendung einer
Markierung, die mit der Nukleinsäure
verknüpft
ist.
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Ebenfalls
wird als ein erster Aspekt der Offenbarung ein Verfahren zum Isolieren
eines oder mehrerer genetischer Elemente, die ein Genprodukt mit
einer gewünschten
Aktivität
codieren, bereit gestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Kompartimentieren von genetischen Elementen
in Mikrokapseln;
- (b) Exprimieren der genetischen Elemente, um deren entsprechende
Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu erzeugen;
- (c) Sortieren der genetischen Elemente, welche das Genprodukt
(die Genprodukte) mit der gewünschten Aktivität erzeugen.
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Die
Mikrokapseln gemäß der vorliegenden
Erfindung kompartimentieren genetische Elemente und Genprodukte
in der Art, dass diese körperlich
miteinander verknüpft
bleiben. Überraschenderweise
bleibt die Nukleinsäureexpression
innerhalb der künstlichen
Mikrokapseln möglich,
was die Isolation der Nukleinsäure auf
der Grundlage der Aktivität
des Genprodukts, welches diese codiert, erlaubt.
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Wie
hierin verwendet ist ein genetisches Element ein Molekül oder molekulares
Konstrukt, welches eine Nukleinsäure
umfasst. Die genetischen Elemente der vorliegenden Erfindung können irgendeine
Nukleinsäure
(z.B. DNA, RNA oder irgendein künstliches
oder natürliches
Analogon von diesen) umfassen. Die Nukleinsäurekomponente des genetischen
Elements kann darüber
hinaus kovalent oder nicht kovalent mit einem oder mehreren Molekülen oder
Strukturen, einschließlich
Proteinen, chemischen Einheiten und Gruppen, Festphasenträgern wie
z.B. magnetischen Kügelchen
und dergleichen verknüpft
sein. Diese Strukturen oder Moleküle können gestaltet werden, um bei
der Sortierung und/oder Isolation des genetischen Elements, das
ein Genprodukt mit der gewünschten
Aktivität
codiert, zu helfen.
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Expression,
wie hierin verwendet, wird in ihrer breitesten Bedeutung verwendet,
so dass diese bedeutet, dass eine Nukleinsäure, die in dem genetischen
Element enthalten ist, in ihr Genprodukt umgewandelt wird. Somit
bezieht sich, wenn die Nukleinsäure
DNA ist, die Expression auf die Transkription der DNA in RNA; wenn
diese RNA für
ein Protein codiert, kann sich Expression ebenfalls auf die Translation
der RNA in Protein beziehen. Wenn die Nukleinsäure RNA ist, kann sich Expression
auf die Replikation dieser RNA zu weiteren RNA-Kopien, die reverse
Transkription der RNA in DNA und gegebenenfalls die Translation
irgendeiner der erzeugten RNA-Spezies in Protein beziehen. Vorzugsweise
wird daher die Expression durch einen oder mehrere Prozesse durchgeführt, die
ausgewählt
sind aus der Gruppe, bestehend aus Transkription, reverser Transkription,
Replikation und Translation.
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Die
Expression des genetischen Elements kann somit entweder zu DNA,
RNA oder Protein oder einer Nukleinsäure oder einem Protein, das
nicht natürliche
Basen oder Aminosäuren
enthält
(dem Genprodukt), innerhalb der Mikrokapsel der Erfindung führen, so
dass das Genprodukt innerhalb derselben Mikrokapsel eingeschlossen
ist wie das genetische Element.
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Das
genetische Element und das Genprodukt, welches dadurch codiert wird,
sind verknüpft,
indem jedes genetische Element und das entsprechende Genprodukt,
das von dem genetischen Element codiert wird, innerhalb derselben
Mikrokapsel einschlossen sind. Auf diese Weise kann das Genprodukt
in einer Mikrokapsel keine Änderung
in irgendwelchen anderen Mikrokapseln verursachen.
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Der
Ausdruck „Mikrokapsel" wird hierin entsprechend
der Bedeutung verwendet, die diesem im Stand der Technik normalerweise
zukommt und die nachstehend weiter beschrieben wird. Im Wesentlichen
ist jedoch eine Mikrokapsel ein künstliches Kompartiment, dessen
abgrenzende Ränder
den Austausch der Komponenten der molekularen Mechanismen, die hierin
beschrieben werden, welche die Sortierung von genetischen Elementen
gemäß der Funktion
der Genprodukte, welche diese codieren, erlauben, beschränken.
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Vorzugsweise
sind die Mikrokapseln, welche in dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, in der Lage, in sehr großer Anzahl
erzeugt zu werden und dadurch eine Bibliothek genetischer Elemente,
welche ein Repertoire von Genprodukten codiert, zu kompartimentieren.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
des ersten Aspekts der vorliegenden Offenbarung kann die Sortierung
von genetischen Elementen in einer von im Wesentlichen vier Techniken
durchgeführt
werden.
- (I) Bei einer ersten Ausführungsform
werden die Mikrokapseln entsprechend einer Aktivität des Genprodukts
oder eines Derivats von diesem sortiert, welche die Mikrokapseln
als Ganzes detektierbar macht. Dementsprechend stellt die Offenbarung
ein Verfahren bereit, bei welchem ein Genprodukt mit der gewünschten
Aktivität
eine Änderung
in der Mikrokapsel oder eine Modifikation von einem oder mehreren
Molekülen
innerhalb der Mikrokapsel induziert, welche es ermöglicht,
dass die Mikrokapsel, welche das Genprodukt und das genetische Element,
welches dieses codiert, enthält,
sortiert werden. Bei dieser Ausführungsform
werden daher die Mikrokapseln entsprechend der Aktivität des Genprodukts
(der Genprodukte), das (die) von dem (den) darin enthaltenen genetischen
Element(en) exprimiert wird (werden), voneinander physikalisch sortiert,
was es möglich
macht, selektiv auf Mikrokapseln, die Genprodukte mit der gewünschten
Aktivität
enthalten, anzureichern.
- (II) Bei einer zweiten Ausführungsform
werden die genetischen Elemente nach dem Poolen der Mikrokapseln
in einem oder mehreren gemeinsamen Kompartimenten sortiert. Bei
dieser Ausführungsform
modifiziert ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität das genetische
Element, welches dieses codiert (und welches in derselben Mikrokapsel
vorliegt), in einer solchen Weise, dass dieses in einem nachfolgenden Schritt
selektierbar gemacht wird. Die Reaktionen werden gestoppt, und die
Mikrokapseln werden dann aufgebrochen, so dass der gesamte Inhalt
der einzelnen Mikrokapseln gepoolt wird. Die Selektion auf die modifizierten
genetischen Elemente ermöglicht
die Anreicherung der genetischen Elemente, welche das Genprodukt
(die Genprodukte) mit der gewünschten
Aktivität
codieren. Dementsprechend liefert die vorliegende Offenbarung ein
Verfahren, bei welchem in Schritt (b) das Genprodukt mit der gewünschten
Aktivität
das genetische Element, welches dieses codiert, modifiziert, um
die Isolation des genetischen Elements zu ermöglichen. Man muss natürlich verstehen,
dass die Modifikation direkt sein kann, indem diese durch die direkte
Wirkung des Genprodukts auf das genetische Element verursacht wird,
oder indirekt, wobei eine Reihe von Reaktionen, von denen das Genprodukt
mit der gewünschten
Aktivität
an einer oder mehreren beteiligt ist, zu einer Modifikation des
genetischen Elements führt.
- (III) Bei einer dritten Ausführungsform
werden die genetischen Elemente nach dem Poolen der Mikrokapseln
in einem oder mehreren gemeinsamen Kompartimenten sortiert. Bei
dieser Ausführungsform
induziert ein Gen mit einer gewünschten
Aktivität
eine Veränderung
bei der Mikrokapsel, welche das Genprodukt und das genetische Element,
welches dieses codiert, enthält.
Diese Veränderung
löst, wenn
sie detektiert wird, die Modifikation des Gens innerhalb des Kompartiments
aus. Die Reaktionen werden gestoppt, und die Mikrokapseln werden
dann aufgebrochen, so dass der gesamte Inhalt der einzelnen Mikrokapseln
gepoolt wird. Die Selektion auf die modifizierten genetischen Elemente
ermöglicht
die Anreicherung der genetischen Elemente, die das Genprodukt (die
Genprodukte) mit der gewünschten
Aktivität
codieren. Dementsprechend liefert die Offenbarung ein Verfahren,
wo in Schritt (b) das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität eine Veränderung
in dem Kompartiment induziert, welche detektiert wird und die Modifikation
des genetischen Elements innerhalb des Kompartiments auslöst, so dass
dessen Isolation ermöglicht
wird. Man muss verstehen, dass die detektierte Veränderung
in dem Kompartiment durch die direkte Wirkung des Genprodukts oder
durch eine indirekte Wirkung verursacht werden kann, wobei eine
Reihe von Reaktionen, von denen das Genprodukt mit der gewünschten
Aktivität
an einer oder mehreren beteiligt ist, zu der nachgewiesenen Veränderung
führt.
- (IV) Bei einer vierten Ausführungsform
können
die genetischen Elemente über
ein Mehrschrittverfahren, welches beispielsweise wenigstens zwei
Schritte beinhaltet, sortiert werden, um die Exposition der genetischen
Elemente an Bedingungen zu erlauben, welche zulassen, dass wenigstens
zwei separate Reaktionen stattfinden. Wie Fachleuten auf dem Gebiet
klar sein wird, muss der erste Mikroeinkapselungsschritt zu Bedingungen
führen,
welche die Expression der genetischen Elemente erlauben – sei es
Transkription, Transkription und/oder Translation, Replikation oder
dergleichen. Unter diesen Bedingungen kann es nicht möglich sein,
im Hinblick auf eine bestimmte Aktivität des Genprodukts zu selektieren,
da beispielsweise das Genprodukt unter diesen Bedingungen nicht
aktiv ist oder da das Expressionssystem eine störende Aktivität enthält. Die
Offenbarung liefert daher ein Verfahren, bei welchem Schritt (b)
das Exprimieren der genetischen Elemente, um deren entsprechende
Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu erzeugen, das Verknüpfen der
Genprodukte mit den genetischen Elementen, welche diese codieren,
und das Isolieren der dadurch gebildeten Komplexe umfasst. Dieses
ermöglicht,
dass die genetischen Elemente und deren assoziierte Genprodukte
aus den Kapseln isoliert wer den, bevor eine Sortierung entsprechend
der Aktivität des
Genprodukts stattfindet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Komplexe vor dem Isolieren der genetischen Elemente,
welche ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität codieren,
einem weiteren Kompartimentierungsschritt unterzogen. Dieser weitere
Kompartimentierungsschritt, welcher vorteilhaft in Mikrokapseln
stattfindet, erlaubt die Durchführung
von weiteren Reaktionen, unter anderen Bedingungen, in einer Umgebung,
wo die genetischen Elemente und ihre entsprechenden Genprodukte
körperlich
verknüpft
sind. Eine eventuelle Sortierung der genetischen Elemente kann gemäß Ausführungsform
(I), (II) oder (III) oben durchgeführt werden.
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Die „sekundäre Einkapselung" kann ebenfalls mit
genetischen Elementen durchgeführt
werden, die durch andere Mittel, wie z.B. durch Phagendisplay, Polysomendisplay,
RNA-Peptid-Fusion
oder lac-Repressor-Peptid-Fusion, mit Genprodukten verknüpft sind.
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Das
selektierte genetische Element(e) kann ebenfalls nachfolgenden,
möglicherweise
stringenteren Runden der Sortierung in iterativ wiederholten Schritten
unterzogen werden, wobei das Verfahren der Offenbarung entweder
insgesamt oder nur mit ausgewählten
Schritten erneut angewendet wird. Durch geeignetes Maßschneidern
der Bedingungen können
genetische Elemente, die Genprodukte codieren, welche eine besser
optimierte Aktivität
haben, nach jeder Selektionsrunde isoliert werden.
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Zusätzlich können die
genetischen Elemente, die nach einer ersten Runde der Sortierung
isoliert wurden, einer Mutagenese unterzogen werden, bevor die Sortierung
durch iterative Wiederholung der Schritte des Verfahrens der Offenbarung
wie oben ausgeführt
wiederholt wird. Nach jeder Runde der Mutagenese werden einige genetische
Elemente in einer solchen Weise modifiziert worden sein, dass die
Aktivität
der Genprodukte erhöht
wurde.
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Darüber hinaus
können
die ausgewählten
genetische Elemente in einen Expressionsvektor kloniert werden,
um eine weitere Charakterisierung der genetischen Elemente und deren
Produkte zu erlauben.
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Unter
einem zweiten Aspekt stellt die Offenbarung ein Produkt bereit,
wenn es entsprechend dem ersten Aspekt der Offenbarung selektiert
wurde. Wie in diesem Zusammenhang verwendet, kann sich ein „Produkt
auf ein Genprodukt, das nach der vorliegenden Offenbarung selektierbar
ist, oder das genetische Element (oder die genetische Information,
die darin enthalten ist) beziehen.
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Unter
einem dritten Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Herstellung
eines Genprodukts bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Herstellen eines genetischen Elements,
welches das Genprodukt codiert;
- (b) Kompartimentieren von genetischen Elementen in Mikrokapseln;
- (c) Exprimieren der genetischen Elemente, um deren entsprechende
Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu erzeugen;
- (d) Sortieren der genetischen Elemente, welche das Genprodukt(e)
mit der gewünschten
Aktivität
erzeugen; und
- (e) Exprimieren des Genprodukts mit der gewünschten Aktivität.
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Gemäß dem dritten
Aspekt umfasst Schritt (a) vorzugsweise die Herstellung eines Repertoires
von genetischen Elementen, wobei jedes genetische Element ein potentiell
verschiedenes Genprodukt codiert. Repertoires können durch herkömmliche
Techniken erzeugt werden wie z.B. jene, die für die Erzeugung von Bibliotheken
eingesetzt werden, die für
eine Selektion durch Verfahren wie z.B. Phagendisplay gedacht sind. Genprodukte
mit der gewünschten
Aktivität
können
aus dem Repertoire gemäß der vorliegenden
Offenbarung selektiert werden.
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Unter
einem vierten Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Screenen
einer Verbindung oder von Verbindungen, die in der Lage sind, die
Aktivität
eines Genprodukts zu modulieren, bereit, welches die folgenden Schritte
umfasst:
- (a) Herstellen eines Repertoires genetischer
Elemente, die ein Genprodukt codieren;
- (b) Kompartimentieren der genetischen Elemente in Mikrokapseln;
- (c) Exprimieren der genetischen Elemente, um deren entsprechende
Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu erzeugen;
- (d) Sortieren der genetischen Elemente, welche das Genprodukt(e)
mit der gewünschten
Aktivität
erzeugen; und
- (e) Kontaktieren eines Genprodukts mit der gewünschten
Aktivität
mit der Verbindung oder den Verbindungen und Überwachen der Modulation einer
Aktivität
des Genprodukts durch die Verbindung oder Verbindungen.
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Vorteihafterweise
umfasst das Verfahren weiterhin den folgenden Schritt:
- (f) Identifizieren der Verbindung oder Verbindungen, die in
der Lage sind, die Aktivität
des Genprodukts zu modulieren, und Synthetisieren der Verbindung
oder Verbindungen.
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Dieses
Selektionssystem kann so konfiguriert werden, dass auf RNA, DNA
oder Proteinmoleküle
mit katalytischer, regulatorischer oder Bindungsaktivität selektiert
wird.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1
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Genselektion durch Kompartimentierung.
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- a Schematische Darstellung der Selektionsprozedur.
In Schritt 1 wird eine in vitro-Transkriptions/Translationsreaktionsmischung,
welche eine Bibliothek von genetischen Elementen enthält, die
mit einem Substrat für
die Reaktion, die selektiert wird, verknüpft sind, dispergiert, um eine
Wasser-in-Öl-Emulsion
zu bilden, wobei typischerweise ein genetisches Element pro wässrigem
Kompartiment vorliegt. Die genetischen Elemente werden innerhalb
ihrer Kompartimente transkribiert und translatiert (Schritt 2).
Anschließend
(Schritt 3) wandeln Proteine (oder RNAs) mit enzymatischen Aktivitäten das
Substrat in ein Produkt um, das mit dem genetischen Element verknüpft bleibt.
Eine Kompartimentierung verhindert die Modifikation von genetischen
Elementen in anderen Kompartimenten. Als nächstes (Schritt 4) wird die
Emulsion aufgebrochen, alle Reaktionen werden gestoppt und die wässrigen
Kompartimente vereinigt. Genetische Elemente, welche mit dem Produkt
verknüpft
sind, werden selektiv angereichert, dann amplifiziert und entweder
charakterisiert (Schritt 5) oder mit dem Substrat verknüpft und
für weitere
Selektionsrunden kompartimentiert (Schritt 6).
- b Selektion im Hinblick auf targetspezifische DNA-Methylierung
durch HaeIII-Methylase. Das Substrat ist ein DNA-Segment, das HaeIII-Restriktions/Modifikations-(R/M)-Stellen enthält. Genetische
Elemente werden durch Bindung an Streptavidin-beschichtete magnetische
Kügelchen
isoliert und mit dem zugehörigen Restriktionsenzym
HaeIII behandelt. Nur Nukleinsäuren
mit methylierten R/M-Stellen sind resistent gegen eine Spaltung
und werden anschließend
durch PCR amplifiziert.
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2a
-
Tröpfchengrößenverteilung
und Aktivitäten
von DHFR und HaeIII-Methylase in Emulsionen: Größenverteilung der wässrigen
Kompartimente in einer Emulsion, bestimmt durch Laserbeugung. In
vitro-Transkriptions/Translationsreaktionsmischungen, welche DNA
und Natriumdeoxycholat enthalten, werden durch Rühren oder Rühren gefolgt von einer Homogenisierung
bei 6 k, 9,5 k oder 13,5 k Upm emulgiert. Die Größenverteilung der wässrigen
Partikel wird durch den Prozentsatz des gesamten wässrigen
Volumens gezeigt.
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2b
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Die
Aktivität
von DHFR, die in situ durch Transkription und Translation ihres
Gens gebildet wurde (1b), in wässrigen
Kompartimenten einer Emulsion. Die Konzentration des verwendeten
folA-Gens (2,5 nM) ergibt einen Durchschnitt von einem Gen pro Tröpfchen bei
den feinsten Emulsionen (homogenisiert bei 13,5 k Upm). Der mittlere
Durchmesser, der aus den Größenverteilungsdaten
(in 2a) berechnet wurde, wird als
eine Funktion der Geschwindigkeit der Homogenisierung dargestellt
(0 k Upm bezieht sich auf die Emulsion, die durch Rühren ohne
eine weitere Homogenisierung hergestellt wurde). Die Aktivität ist als
Prozentsatz der Aktivität
dargestellt, die bei der nicht emulgierten in vitro-Reaktionsmischung
unter denselben Bedingungen beobachtet wurde.
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Die
Aktivität
von HaeIII-Methylase, die in situ durch Transkription und Translation
ihres Gens gebildet wurde (1b), in
wässrigen
Kompartimenten einer Emulsion. Die Kon zentrierung des verwendeten
M.HaeIII-Gens (2,5 nM) ergibt einen Durchschnitt von einem Gen pro
Tröpfchen
bei den feinsten Emulsionen (homogenisiert bei 13,5 k Upm). Der
mittlere Durchmesser, der aus den Größenverteilungsdaten (in 2a) berechnet wurde, wird als eine Funktion
der Geschwindigkeit der Homogenisierung dargestellt (0 k Upm bezieht
sich auf die Emulsion, die durch Rühren ohne eine weitere Homogenisierung
hergestellt wurde). Die Aktivität
ist als Prozentsatz der Aktivität
dargestellt, die bei der nicht emulgierten in vitro-Reaktionsmischung
unter denselben Bedingungen beobachtet wurde.
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3
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Selektionen im Hinblick auf HaeIII-DNA-Methylase.
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- a Selektieren von M.HaeIII-Genen aus einem
1000fachen Überschuss
von folA-Genen.
Die Reaktionen wurden angesetzt mit 0,2 nM DIG-folA-3s-Biotin-DNA
(entsprechend einem Durchschnitt von einem Gen pro Kompartiment),
versetzt mit 0,2 pM DIG25542-M.HaeIII-3s-Biotin.
Die Reaktionsmischungen wurden entweder durch Rühren emulgiert oder in Lösung belassen.
Die DNA aus diesen Reaktionen wurde gewonnen, mit HaeIII (oder mit
HhaI) verdaut und durch PCR amplifiziert. Diese DNA wurde weiter
durch geschachtelte (nested) PCR mit den Primern LMB2-Nest und LMB3-Nest
amplifiziert, und fünf
Mikroliter von jeder geschachtelten PCR wurden auf einem 1,5% Agarosegel,
das Ethidiumbromid enthielt, einer Elektrophorese unterzogen. Marker, ϕX174-HaeIII-Verdau;
minus T7, keine T7-RNA-Polymerase; minus NadCh, kein Natriumdeoxycholat.
- b Selektionen über
zwei Runden. Reaktionen, die ein Molverhältnis von 1:104 bis
1:107 DIG-M.HaeIII-3s-Biotin:DIG-folA-3s-Biotin
(bei 500 pM) enthalten, werden durch Rühren emulgiert. Die DNA aus
diesen Reaktionen wird mit HaeIII verdaut und durch PCR mit den
Primern LMB2-Biotin (SEQ ID NO: 9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO: 10)
amplifiziert. Die amplifizierte DNA aus der ersten Selektionsrunde
mit den Verhältnissen 1:104 und 1:105 (bei
20 pM) und den Verhältnissen
1:106 und 1:107 (bei
500 pM) wird in eine zweite Selektionsrunde gegeben. Diese DNA wird
weiter durch geschachtelte PCR mit den Primern LMB2-Nest und LMB3-Nest
amplifiziert, und fünf
Mikroliter der geschachtelten PCR aus jeder Selektionsrunde werden durch
Gelelektrophorese wie oben analysiert (oberes Feld). Dieselbe DNA
wurde in vitro translatiert, und die resultie rende Methylaseaktivität wurde
gemessen. Die Ergebnisse werden als der Prozentsatz der methylierten
Substrat-DNA angegeben (unteres Feld).
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG UND DER OFFENBARUNG
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(A) ALLGEMEINE BESCHREIBUNG
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Die
Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung benötigen geeignete physikalische
Eigenschaften, um die Durchführung
der Erfindung zu erlauben.
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Um
sicher zu stellen, dass die genetischen Elemente und Genprodukte
nicht zwischen den Mikrokapseln diffundieren können, muss zuerst der Inhalt
jeder Mikrokapsel von dem Inhalt der umgebenden Mikrokapseln isoliert
werden, so dass es über
die Zeitskala des Experiments hinweg keinen oder einen geringen
Austausch der genetischen Elemente und Genprodukte zwischen den
Mikrokapseln gibt.
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Zweitens
erfordert das Verfahren der vorliegenden Offenbarung, dass es nur
eine begrenzte Anzahl von genetischen Elementen pro Mikrokapsel
gibt. Dieses stellt sicher, dass das Genprodukt eines einzelnen genetischen
Elements von anderen genetischen Elementen isoliert wird. Somit
wird die Kopplung zwischen genetischem Element und Genprodukt in
hohem Maße
spezifisch sein. Der Anreicherungsfaktor ist am größten mit
im Durchschnitt einem oder weniger genetischen Elementen pro Mikrokapsel,
wobei die Verknüpfung zwischen
Nukleinsäure
und der Aktivität
des codierten Genprodukts so eng wie möglich ist, da das Genprodukt eines
einzelnen genetischen Elements von den Produkten aller anderen genetischen
Elemente isoliert sein wird. Jedoch kann sich, selbst wenn die theoretisch
optimale Situation von im Durchschnitt einem einzigen genetischen
Element oder weniger pro Mikrokapsel nicht verwendet wird, ein Verhältnis von
5, 10, 50, 100 oder 1000 oder mehr genetischen Elementen pro Mikrokapsel
beim Sortieren einer großen
Bibliothek als nützlich erweisen.
Anschließende
Runden der Sortierung, einschließlich erneuter Einkapselung
mit anderer Verteilung der genetischen Elemente, wird eine stringentere
Sortierung der genetischen Elemente erlauben. Vorzugsweise gibt
es ein einziges genetisches Element oder weniger pro Mikrokapsel.
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Drittens
dürfen
die Bildung und die Zusammensetzung der Mikrokapseln die Funktion
der Maschinerie der Expression der genetischen Elemente und die
Aktivität
der Genprodukte nicht verbieten.
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Folglich
muss jedes verwendete System zur Mikroeinkapselung diese Anforderungen
erfüllen.
Das geeignete System(e) kann in Abhängigkeit von der genauen Art
der Anforderungen bei jeder Anwendung der Offenbarung variieren,
wie dem Fachmann klar sein wird.
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Eine
große
Vielzahl von Mikroeinkapselungsverfahren ist verfügbar (siehe
Benita, 1996) und kann verwendet werden, um die Mikrokapseln, die
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, zu erzeugen. In der Tat sind mehr als
200 Mikroeinkapselungsverfahren in der Literatur festgestellt worden
(Finch, 1993).
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Diese
beinhalten membranumhüllte
wässrige
Vesikel wie z.B. Lipidvesikel (Liposomen) (New, 1990) und nicht
ionische Tensidvesikel (van Hal et al., 1996). Dieses sind geschlossene
membranöse
Kapseln von einzelnen oder mehrfachen Doppelschichten von nicht
kovalent zusammengesetzten Molekülen,
wobei jede Doppelschicht durch ein wässriges Kompartiment von ihrem
Nachbarn getrennt ist. In dem Fall von Liposomen ist die Membran
aus Lipidmolekülen
zusammengesetzt; diese sind gewöhnlich
Phospholipide, aber Sterole wie z.B. Cholesterin können ebenfalls
in die Membranen eingebaut werden (New, 1990). Eine Vielzahl von
enzymkatalysierten biochemischen Reaktionen, einschließlich RNA-
und DNA-Polymerisation, können
innerhalb von Liposomen durchgeführt
werden (Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer
et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick & Luisi, 1996).
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Bei
einem membranumhüllten
Vesikelsystem liegt ein großer
Teil der wässrigen
Phase außerhalb
der Vesikel und ist daher nicht kompartimentiert. Diese kontinuierliche,
wässrige
Phase sollte entfernt werden oder die biologischen Systeme in ihr
inhibiert oder zerstört
werden (beispielsweise durch Verdau von Nukleinsäuren mit DNase oder RNase),
damit die Reaktionen auf die Mikrokapseln beschränkt werden (Luisi et al., 1987).
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Enzymkatalysierte
biochemische Reaktionen wurden ebenfalls in Mikrokapseln, die durch
eine Vielzahl von anderen Verfahren erzeugt wurden, nachgewiesen.
Viele Enzyme sind in inversen mizellaren Lösungen aktiv (Bru & Walde, 1991;
Bru & Walde,
1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993; Kumar et al., 1989; Luisi & B., 1987; Mao & Walde, 1991;
Mao et al., 1992; Perez et al., 1992; Walde et al., 1994; Walde
et al., 1993; Walde et al., 1988), wie z.B. das AOT-Isooctan-Wasser-System
(Menger & Yamada,
1979).
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Mikrokapseln
können
ebenfalls durch Grenzflächenpolymerisation
und Grenzflächenkomplexierung erzeugt
werden (Whateley, 1996). Mikrokapseln von dieser Sorte haben starre,
nicht permeable Membranen oder semipermeable Membranen. Semipermeable
Mikrokapseln, die von Cellulosenitratmembranen, Polyamidmembranen
und Lipid-Polyamidmembranen begrenzt sind, können allesamt biochemische
Reaktionen, die Multienzymsysteme beinhalten, unterstützen (Chang,
1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Alginat/Polylysin-Mikrokapseln (Lim & Sun, 1980), welche
unter sehr milden Bedingungen gebildet werden können, haben sich ebenfalls
als sehr biokompatibel erwiesen, indem sie beispielsweise ein effektives
Verfahren zur Einkapselung lebender Zellen und Gewebe bereitstellen
(Chang, 1992; Sun et al., 1992).
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Nicht
membranöse
Mikroeinkapselungssysteme, die auf einer Phasentrennung einer wässrigen
Umgebung in einem kolloidalen System basieren, wie z.B. eine Emulsion,
können
ebenfalls verwendet werden.
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Vorzugsweise
werden die Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung aus Emulsionen,
heterogenen Systemen von zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen
gebildet, wobei eine der Phasen in der anderen als Tröpfchen von
mikroskopischer oder kolloidaler Größe dispergiert ist (Becher,
1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
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Emulsionen
können
aus irgendeiner geeigneten Kombination von nicht mischbaren Flüssigkeiten
erzeugt werden. Vorzugsweise weist die Emulsion der vorliegenden
Erfindung Wasser (enthaltend die biochemischen Komponenten) als
die Phase, die in der Form von fein verteilten Tröpfchen vorliegt
(die disperse, innere oder diskontinuierliche Phase), und eine hydrophobe,
nicht mischbare Flüssigkeit
(ein „Öl") als die Matrix
auf, in welcher diese Tröpfchen
suspendiert sind (die nicht disperse, kontinuierliche oder äußere Phase).
Solche Emulsionen werden „Wasser-in-Öl" (W/O) genannt. Dieses
hat den Vorteil, dass die gesamte wässrige Phase, welche die biochemischen
Komponenten enthält,
in diskrete Tröpfchen
(die innere Phase) kompartimentiert ist. Die äußere Phase, welche ein hydrophobes Öl ist, enthält im Allgemeinen
keine der biochemischen Komponenten und ist daher inert.
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Die
Emulsion kann durch die Zugabe von einem oder mehreren oberflächenaktiven
Mitteln (Tensiden) stabilisiert werden. Diese Tenside werden Emulgiermittel
genannt und wirken an der Wasser/Öl-Grenzfläche, um eine Trennung der Phasen
zu verhindern (oder wenigsten zu verzögern). Viele Öle und viele
Emulgatoren können
für die
Erzeugung von Wasser-in-Öl-Emulsionen
verwendet werden; eine neuere Zusammenstellung listete über 16.000
Tenside auf, von denen viele als Emulgiermittel verwendet werden
(Ash und Ash, 1993). Geeignete Öle
beinhalten leichtes weißes
Mineralöl
und nicht ionische Tenside (Schick, 1966) wie z.B. Sorbitanmonooleat
(SpanTM80; ICI) und Polyoxyethylensorbitanmonooleat
(TweenTM80; ICI).
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Die
Verwendung anionischer Tenside kann ebenfalls nützlich sein. Geeignete Tenside
beinhalten Natriumcholat und Natriumtaurocholat. Besonders bevorzugt
ist Natriumdeoxycholat, vorzugsweise in einer Konzentration von
0,5% w/v oder niedriger. Die Aufnahme solcher Tenside kann in manchen
Fällen
die Expression der genetischen Elemente und/oder die Aktivität der Genprodukte
erhöhen.
Die Zugabe einiger anionischen Tenside zu einer nicht emulgierten
Reaktionsmischung verhindert vollständig die Translation. Während der Emulgierung
wird jedoch das Tensid von der wässrigen
Phase in die Grenzfläche überführt, und
die Aktivität wird
wieder hergestellt. Die Zugabe eines anionischen Tensids zu den
Mischungen, die emulgiert werden sollen, stellt sicher, dass die
Reaktionen nur nach einer Kompartimentierung ablaufen.
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Die
Erzeugung einer Emulsion erfordert im Allgemeinen die Anwendung
von mechanischer Energie, um die Phasen zusammen zu erzwingen. Es
gibt eine Vielzahl von Wegen, dieses zu tun, welche eine Vielzahl von
mechanischen Vorrichtungen, einschließlich Rührern (wie z.B. magnetische
Rührstäbchen, Propeller-
und Turbinenrührer,
Schaufelvorrichtungen und Wischer), Homogenisatoren (einschließlich Rotor-Stator-Homogenisatoren,
Hochdruckventilhomogenisatoren und Strahlhomogenisatoren), Kolloidmühlen, Ultraschall-
und „Membranemulgier"-Vorrichtungen, benutzen
(Becher, 1957; Dickinson, 1994).
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Wässrige Mikrokapseln,
die in Wasser-in-Öl-Emulsionen
gebildet werden, sind im Allgemeinen stabil, bei einem geringfügigen, wenn überhaupt,
Austausch von genetischen Elementen oder Genprodukte zwischen den
Mikrokapseln. Zusätzlich
haben wir gezeigt, dass mehrere biochemische Reaktionen in Emulsionsmikrokapseln
ablaufen. Darüber
hinaus sind komplizierte biochemische Prozesse, namentlich Gentranskription
und Translation, ebenfalls in Emulsionsmikrokapseln aktiv. Es existiert
die Technologie, Emulsionen mit Volumina bis hin zu industriellen
Maßstäben von
Tausenden von Litern zu erzeugen (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant,
1974; Lissant, 1984).
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Die
bevorzugte Mikrokapselgröße wird
abhängig
von den genauen Anforderungen irgendeines individuellen Selektionsprozesses,
der gemäß der vorliegenden
Erfindung durchgeführt
werden soll, variieren. In allen Fällen wird es ein optimales
Gleichgewicht zwischen der Größe der Genbibliothek,
der benötigten
Anreicherung und der benötigten
Konzentration der Komponenten in den einzelnen Mikrokapseln geben,
um eine effiziente Expression und Reaktivität der Genprodukte zu erreichen.
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Die
Prozesse der Expression müssen
innerhalb von jeder einzelnen Mikrokapsel stattfinden, die von der
vorliegenden Offenbarung bereit gestellt wird. Sowohl die in vitro-Transkription als
auch die gekoppelte Transkription-Translation werden bei sub-nanomolaren
DNA-Konzentrationen weniger effizient. Aufgrund der Anforderung,
dass nur eine begrenzte Anzahl von DNA-Molekülen in jeder Mikrokapsel vorliegt,
setzt dieses daher eine praktische Obergrenze für die mögliche Mikrokapselgröße. Vorzugsweise
beträgt
das mittlere Volumen der Mikrokapseln weniger als 5,2 × 10–16 m3 (entsprechend einer kugelförmigen Mikrokapsel
mit einem Durchmesser von weniger als 10 μm), insbesondere weniger als
6,5 × 10–17 m3 (5 μm),
noch bevorzugter ca. 4,2 × 10–18 m3 (2 μm)
und Idealerweise ca. 9 × 10–18 m3 (2,6 μm).
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Die
effektive DNA- oder RNA-Konzentration in den Mikrokapseln kann durch
verschiedene Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt
sind, künstlich
erhöht
werden. Diese beinhalten z.B. die Zugabe von volumenausschließenden Chemikalien
wie z.B. Polyethylenglycolen (PEG) und eine Vielzahl von Genamplifizierungstechniken,
einschließlich
einer Transkription unter Verwendung von RNA-Polymerasen einschließlich denen
von beispielsweise Bakterien wie z.B. E. coli (Roberts, 1969; Blattner
und Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975),
Eukaryoten (Weil et al., 1979; Manley et al., 1983) und einem Bakteriophagen
wie z.B. T7, T3 und SP6 (Melton et al., 1984); der Polymerasekettenreaktion
(PCR) (Saiki et al., 1988); Qβ-Replicase-Amplifikation
(Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin und Spirin,
1995; Katanaev et al., 1995); der Ligasekettenreaktion (LCR) (Landegren
et al., 1988; Barany, 1991); und eines selbst unterhaltenden Sequenzreplikationssystems
(Fahy et al., 1991) und der Strangaustauschamplifikation (Walker et
al., 1992). Selbst Genamplifikationstechniken, die ein Thermocycling
erfordern, wie z.B. PCR und LCR, könnten verwendet werden, wenn
die Emulsionen und die in vitro-Transkriptions- oder gekoppelten
Transkriptions-Translationssysteme thermostabil sind (beispielsweise
könnten
die gekoppelten Transkriptions-Translationssysteme
aus einem thermostabilen Organismus wie z.B. Thermus aquaticus erzeugt
werden).
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Ein
Erhöhen
der effektiven lokalen Nukleinsäurekonzentration
ermöglicht,
dass größere Mikrokapseln effektiv
verwendet werden. Dieses erlaubt eine bevorzugte praktische Obergrenze
für das
Mikrokapselvolumen von ca. 5,2 × 10–16 m3 (entsprechend einer Kugel mit einem Durchmesser
von 10 μm).
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Die
Mikrokapselgröße muss
hinreichend groß sein,
um all die erforderlichen Komponenten der biochemischen Reaktionen,
die innerhalb der Mikrokapsel auftreten müssen, aufzunehmen. Beispielsweise
erfordern in vitro sowohl die Transkriptionsreaktionen als auch
die gekoppelten Transkriptions-Translationsreaktionen eine Nukleosidtriphosphat-Gesamtkonzentration
von ca. 2 mM.
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Um
beispielsweise ein Gen zu einem einzelnen kurzen RNA-Molekül von 500
Basen in der Länge
zu transkribieren, würde
dieses ein Minimum von 500 Molekülen
Nukleosidtriphosphat pro Mikrokapsel (8,33 × 10–22 Mole)
erfordern. Um eine 2 mM Lösung
zu bilden, muss diese Anzahl von Molekülen innerhalb einer Mikrokapsel
mit einem Volumen von 4,17 × 10–19 Liter
(4,17 × 10–22 m3, welche, wenn sie kugelförmig wäre, einen Durchmesser
von 93 nm hätte)
enthalten sein.
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Weiterhin
muss insbesondere in dem Fall von Reaktionen, die eine Translation
beinhalten, darauf geachtet werden, dass die Ribosomen, die nötig sind,
damit die Translation stattfindet, selbst ungefähr 20 nm im Durchmesser aufweisen.
Daher ist die bevorzugte Untergrenze für Mikrokapseln ein Durchmesser
von ungefähr
0,1 μm (100
nm).
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Daher
liegt das Volumen der Mikrokapseln vorzugsweise in der Größenordnung
zwischen 5,2 × 10–22 m3 und 5,2 × 10–16 m3, was einer Kugel mit einem Durchmesser
zwischen 0,1 μm
und 10 μm
entspricht, insbesondere zwischen ca. 5,2 × 10–19 m3 und 6,5 × 10–17 m3 (1 μm
und 5 μm).
Kugeldurchmesser von ca. 2,6 μm sind
am vorteilhaftesten.
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Es
ist kein bloßer
Zufall, dass die bevorzugten Abmessungen der Kompartimente (Tröpfchen von
2,6 μm mittlerem
Durchmesser) genau denen von Bakterien ähneln; z.B. sind Escherichia
Stäbchen
mit 1,1-1,5 × 2,0-6,0 μm, und Azotobacter
sind ovale Zellen mit 1,5-2,0 μm
Durchmesser. In ihrer einfachsten Form basiert die Darwinsche Evolution
auf einem „ein
Genotyp ein Phänotyp"-Mechanismus. Die
Konzentration eines einzelnen kompartimentierten Gen oder Genoms
fällt von
0,4 nM in einem Kompartiment von 2 μm Durchmesser auf 25 pM in einem
Kompartiment von 5 μm
Durchmesser. Die prokaryotische Transkriptions/Translationsmaschinerie
hat sich in der Evolution entwickelt, um in Kompartimenten von ~1-2 μm Durchmesser
zu arbeiten, wo einzelne Gene in ungefähr nanomolaren Konzentrationen
vorliegen. Ein einzelnes Gen in einem Kompartiment von 2,6 μm Durchmesser
liegt in einer Konzentration von 0,2 nM vor. Diese Genkonzentration
ist hoch genug für
eine effiziente Translation. Eine Kompartimentierung in einem solchen
Volumen stellt ebenfalls sicher, dass selbst wenn nur ein einzelnes
Molekül
des Genprodukts gebildet wird, dieses mit ca. 0,2 nM vorliegt, was
wichtig ist, wenn das Genprodukt eine modifizierende Aktivität für das genetische
Element selbst haben soll. Das Volumen der Mikrokapsel sollte somit
ausgewählt
werden, indem man nicht nur die Anforderungen für die Transkription und Translation
des genetischen Elements berücksichtigt,
sondern ebenfalls die modifizierende Aktivität, die für das Genprodukt in dem Verfahren
der Offenbarung benötigt
wird.
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Die
Größe der Emulsionsmikrokapseln
kann einfach variiert werden, indem die Emulgierbedingungen, die
verwendet werden, um die Emulsion gemäß den Anforderungen des Selektionssystems
zu bilden, maßgeschneidert
werden. Je größer die
Größe der Mikrokapsel,
desto größer ist
das Volumen, das benötigt
wird, um eine vorgegebene Bibliothek genetischer Elemente einzukapseln,
da der letztendlich begrenzende Faktor die Größe der Mikrokapsel und somit
die Anzahl von Mikrokapseln, die pro Einheitsvolumen möglich ist,
sein wird.
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Die
Größe der Mikrokapseln
wird nicht nur in Bezug auf die Anforderungen des Transkripitions/Translationssystems,
sondern ebenfalls die des Selektionssystems, das für das genetische
Element eingesetzt wird, ausgewählt.
Somit können
die Komponenten des Selektionssystems wie z.B. eines chemischen
Modifikationssystems Reaktionsvolumina und/oder Reagenzienkonzentrationen
erfordern, die für
die Transkription/Translation nicht optimal sind. Wie hierin ausgeführt können solche
Erfordernisse durch einen sekundären
Wiedereinkapselungsschritt erfüllt
werden; darüber
hinaus können
sie erfüllt
werden, indem die Größe der Mikrokapsel ausgewählt wird,
um die Transkription/Translation und Selektion als Ganzes zu maximieren.
Eine empirische Bestimmung des optimalen Mikrokapselvolumens und
der Reagenzienkonzentration, beispielsweise wie hierin ausgeführt, ist
bevorzugt.
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Ein „genetisches
Element" gemäß der vorliegenden
Erfindung ist so, wie es oben beschrieben ist. Vorzugsweise ist
ein genetisches Element ein Molekül oder Konstrukt, das ausgewählt wird
aus der Gruppe, bestehend aus einem DNA-Molekül, einem RNA-Molekül, einem
teilweise oder vollständig
künstlichen
Nukleinsäuremolekül, das aus
ausschließlich
synthetischen oder einer Mischung von natürlich vorkommenden und synthetischen
Basen besteht, irgendeinem der vorstehenden, verknüpft mit
einem Polypeptid, und irgendeinem der vorstehenden, verknüpft mit
irgendeiner anderen Molekülgruppe
oder einem Konstrukt. Vorteilhafterweise können die andere Molekülgruppe
oder das Konstrukt ausgewählt
werden aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäuren, polymeren Substanzen,
insbesondere Kügelchen,
z.B. Polystyrolkügelchen,
magnetischen Substanzen wie z.B. magnetischen Kügelchen, Markierungen wie z.B.
Fluorophoren oder Isotopmarkierungen, chemischen Reagenzien, Bindungsmitteln
wie z.B. Makrozyklen und dergleichen.
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Der
Nukleinsäureanteil
des genetischen Elements kann geeignete regulatorische Sequenzen
wie z.B. jene, die zur effizienten Expression des Genprodukts benötigt werden,
z.B. Promotoren, Verstärker,
Translationsstartsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Spleißstellen
und dergleichen umfassen.
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Wie
aus dem Folgenden deutlich wird, ist in vielen Fällen das Polypeptid oder die
andere Molekülgruppe
oder das Konstrukt ein Ligand oder ein Substrat, welches direkt
oder indirekt an das Genprodukt bindet oder damit reagiert, um das
genetische Element zu markieren. Dieses erlaubt die Sortierung des
genetischen Elements auf der Basis der Aktivität des Genprodukts.
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Der
Ligand oder das Substrat kann mit der Nukleinsäure durch eine Vielzahl von
Mitteln verbunden werden, die für
die Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein werden (siehe z.B.
Hermanson, 1996). Jede Markierung wird ausreichen, welche die anschließende Selektion
des genetischen Elements erlaubt. Die Sortierung kann durch irgendein
Verfahren erfolgen, welches eine bevorzugte Abtrennung, Amplifikation
oder ein Überleben
des markierten genetischen Elements erlaubt. Beispiele beinhalten
eine Selektion durch Bin dung (einschließlich Techniken, die auf magnetischer
Trennung basieren, z.B. unter Verwendung von DynabeadsTM) und
durch eine Resistenz gegenüber
einem Abbau (beispielsweise durch Nukleasen, einschließlich Restriktionsendonukleasen).
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Ein
Weg, auf welchem das Nukleinsäuremolekül mit einem
Liganden oder Substrat verknüpft
werden kann, ist durch Biotinylierung. Diese kann durch PCR-Amplifikation
mit einem 5'-Biotinylierungsprimer
durchgeführt
werden, so dass das Biotin und die Nukleinsäure kovalent verknüpft werden.
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Der
Ligand oder das Substrat, die selektiert werden sollen, können durch
eine Vielzahl von Mitteln, die für
die Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sind, an der modifizierten
Nukleinsäure
befestigt werden. Eine biotinylierte Nukleinsäure kann an ein Polystyrol-Mikrokügelchen
(0,035 bis 0,2 μm
im Durchmesser) gekoppelt werden, das mit Avidin oder Streptavidin
beschichtet ist, das daher mit sehr hoher Affinität die Nukleinsäure binden
wird. Dieses Kügelchen
kann durch irgendein geeignetes Verfahren wie z.B. durch Zugeben
des biotinylierten Substrats oder durch kovalente Kopplung mit Substrat
oder Ligand derivatisiert werden.
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Alternativ
kann eine biotinylierte Nukleinsäure
an Avidin oder Streptavidin gekoppelt werden, das mit einem großen Proteinmolekül wie z.B.
Thyroglobulin (669 Kd) oder Ferritin (440 Kd) komplexiert ist. Dieser Komplex
kann mit Substrat oder Ligand, z.B. durch kovalente Kopplung an
die ε-Aminogruppe
von Lysinen oder durch eine nicht kovalente Wechselwirkung wie z.B.
Biotin-Avidin, derivatisiert werden. Das Substrat kann in einer
Form vorliegen, die nicht mit dem genetischen Element verknüpft ist,
aber eine inaktive „Markierung" enthält, die
einen weiteren Schritt wie z.B. eine Photoaktivierung erfordert,
um diese zu aktivieren (z.B. ein Biotinanaloges „im Käfig" (Sundberg et al., 1995; Pirrung und
Huang, 1996)). Der Katalysator, der ausgewählt werden muss, wandelt dann
das Substrat in Produkt um. Die „Markierung" könnte dann
aktiviert werden und das „markierte" Substrat und/oder
Produkt durch ein markierungsbindendes Molekül (z.B. Avidin oder Streptavidin),
das mit der Nukleinsäure
komplexiert ist, gebunden werden. Das Verhältnis von Substrat zu Produkt, das
an der Nukleinsäure über die „Markierung" befestigt ist, wird
daher das Verhältnis
des Substrats und Produkts in Lösung
widerspiegeln.
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Eine
Alternative ist es, die Nukleinsäure
an einen produktspezifischen Antikörper (oder ein anderes produktspezifisches
Molekül)
zu koppeln. Bei diesem Szenario liegt das Substrat (oder eines der
Substrate) in jeder Mikrokapsel unverknüpft mit dem genetischen Element
vor, weist aber eine molekulare „Markierung" auf (beispielsweise
Biotin, DIG oder DNP). Wenn der Katalysator, der selektiert werden
soll, das Substrat in Produkt umwandelt, behält das Produkt die „Markierung" bei und wird dann
in der Mikrokapsel durch den produktspezifischen Antikörper eingefangen.
Auf diesem Weg wird das genetische Element nur mit der „Markierung" assoziiert, wenn
es ein Enzym codiert oder erzeugt, das in der Lage ist, Substrat
in Produkt umzuwandeln.
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Wenn
alle Reaktionen gestoppt werden und die Mikrokapseln vereinigt werden,
können
die genetischen Elemente, die aktive Enzyme codieren, angereichert
werden, indem ein Antikörper
oder ein anderes Molekül,
welches spezifisch an die „Markierung" bindet oder damit
reagiert, verwendet wird. Auch wenn sowohl Substrate als auch Produkt
die molekulare Markierung aufweisen, werden nur die genetischen
Elemente, die aktives Genprodukt codieren, mit gereinigt.
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Die
Ausdrücke „Isolieren", „Sortieren" und „Selektieren" wie auch Variationen
von diesen werden hierin verwendet. Isolation bezieht sich gemäß der vorliegenden
Offenbarung auf den Prozess der Abtrennung einer Einheit von einer
heterogenen Population, beispielsweise einer Mischung, so dass sie
frei von wenigstens einer Substanz ist, mit welcher sie vor dem
Isolationsprozess assoziiert war. In einer bevorzugten Ausführungsform
bezieht sich Isolation auf die Reinigung einer Einheit im Wesentlichen
bis zur Homogenität.
Sortieren einer Einheit bezieht sich auf den Prozess des bevorzugten
Isolierens gewünschter
Einheiten gegenüber
unerwünschten
Einheiten. Insoweit wie dieses die Isolation der gewünschten
Einheiten betrifft, sind die Ausdrücke „Isolieren" und „Sortieren" äquivalent.
Das Verfahren der vorliegenden Offenbarung erlaubt das Sortieren
von gewünschten
genetischen Elementen aus Pools (Bibliotheken oder Repertoires)
von genetischen Elementen, welche das gewünschte genetische Element enthalten.
Selektieren wird verwendet, um sich auf den Prozess (einschließlich des
Sortierprozesses) des Isolierens einer Einheit gemäß einer
bestimmten Eigenschaft von dieser zu beziehen.
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Bei
einer in hohem Maße
bevorzugten Anwendung ist das Verfahren der vorliegenden Offenbarung nützlich,
um Bibliotheken genetischer Elemente zu sortieren. Die Offenbarung
stellt demgemäß ein Verfahren gemäß vorhergehenden
Aspekten der Offenbarung bereit, worin die genetischen Elemente
aus einer Bibliothek von genetischen Elementen, die ein Repertoire
von Genprodukten codieren, isoliert werden. Hierin werden die Ausdrü cke „Bibliothek", „Repertoire" und „Pool" entsprechend ihrer
gewöhnlichen
Bedeutung auf dem Gebiet der Technik verwendet, so dass eine Bibliothek
von genetischen Elementen ein Repertoire von Genprodukten codiert.
Im Allgemeinen werden Bibliotheken aus Pools von genetischen Elementen
konstruiert und weisen Eigenschaften auf, die ein Sortieren erleichtern.
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Die
anfängliche
Selektion eines genetischen Elements aus einer Bibliothek genetischer
Elemente unter Verwendung der vorliegenden Offenbarung wird in den
meisten Fällen
das Screenen einer großen
Anzahl von Varianten genetischer Elemente erfordern. Bibliotheken
genetischer Elemente können
auf einer Vielzahl von verschiedenen Wegen, einschließlich der
folgenden, erzeugt werden.
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Pools
von natürlich
vorkommenden genetischen Elementen können aus genomischer DNA oder
cDNA kloniert werden (Sambrook et al., 1989); z.B. haben sich Phagen-Antikörper-Bibliotheken,
die durch PCR-Amplifikation von Repertoires von Antikörpergenen
aus immunisierten oder nicht immunisierten Spendern erzeugt wurden,
als sehr erfolgreiche Quellen für
funktionale Antikörperfragmente
erwiesen (Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997). Bibliotheken von
Genen können
ebenfalls erzeugt werden, indem alle (siehe z.B. Smith, 1985; Parmley
und Smith, 1988) oder ein Teil der Gene (siehe z.B. Lowman et al.,
1991) oder Pools der Gene (siehe z.B. Nissim et al., 1994) durch
ein randomisiertes oder dotiertes synthetisches Oligonukleotid codiert werden.
Bibliotheken können
ebenfalls erzeugt werden, indem Mutationen in ein genetisches Element
oder einen Pool genetischer Elemente „zufällig" durch eine Vielzahl von Techniken in
vivo eingeführt
werden, einschließlich
der Verwendung von „Mutatorstämmem" von Bakterien wie
z.B. E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et al., 1990; Low
et al., 1996); unter Verwendung des Antikörper-Hypermutationssystems
von B-Lymphozyten (Yelamos et al., 1995). Zufällige Mutationen können ebenfalls
sowohl in vivo als auch in vitro durch chemische Mutagene und ionisierende
oder UV-Strahlung (siehe Friedberg et al., 1995) oder Einbau von mutagenen
Basenanaloga (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996) eingeführt werden. „Zufällige" Mutationen können ebenfalls
in vitro während
der Polymerisation beispielsweise durch Verwendung von fehleranfälligen Polymerasen,
in Gene eingeführt
werden (Leung et al., 1989).
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Eine
weitere Diversifizierung kann eingeführt werden, indem eine homologe
Rekombination entweder in vivo (siehe Kowalczykowski et al., 1994)
oder in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b) verwendet wird.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung wird daher ein Verfahren
der in vitro-Evolution bereit gestellt, welches die folgenden Schritte
umfasst:
- (a) Selektieren von einem oder mehreren
genetischen Elementen aus einer Bibliothek genetischer Elemente
gemäß der vorliegenden
Offenbarung;
- (b) Mutieren des (der) selektierten genetischen Elements (Elemente),
um eine weitere Bibliothek genetischer Elemente zu erzeugen, welche
ein Repertoire an Genprodukten codiert; und
- (c) iteratives Wiederholen der Schritte (a) und (b), um ein
Genprodukt mit einer verstärkten
Aktivität
zu erhalten.
-
Mutationen
können
wie oben ausgeführt
in das genetische Element (die genetischen Elemente) eingeführt werden.
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Die
genetischen Elemente gemäß der Offenbarung
codieren vorteilhafterweise Enzyme, vorzugsweise von pharmakologischem
oder industriellem Interesse, Aktivatoren oder Inhibitoren, insbesondere
von biologischen Systemen, wie z.B. zellulären Signaltransduktionsmechanismen,
Antikörper
und Fragmente von diesen, andere Bindungsmittel, die für diagnostische
und therapeutische Anwendungen geeignet sind. Unter einem bevorzugten
Aspekt erlaubt daher die Offenbarung die Identifikation und Isolation
von klinisch oder industriell nützlichen
Produkten. Unter einem weiteren Aspekt der Offenbarung wird ein
Produkt bereit gestellt, wenn es durch das Verfahren der Offenbarung
isoliert wird.
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Die
Auswahl von geeigneten Einkapselungsbedingungen ist wünschenswert.
Abhängig
von der Komplexität
und Größe der Bibliothek,
die gescreent werden soll, kann es nützlich sein, die Einkapselungsprozedur so
anzusetzen, dass 1 oder weniger als 1 genetisches Element pro Mikrokapsel
eingekapselt wird. Dieses wird das größte Auflösungsvermögen liefern. Wenn die Bibliothek
größer und/oder
komplexer ist, kann dieses jedoch unpraktikabel sein; es kann bevorzugt
sein, mehrere genetische Elemente zusammen einzukap seln und auf
die wiederholte Anwendung des Verfahrens der Offenbarung zu vertrauen,
um eine Sortierung der gewünschten
Aktivität
zu erreichen. Eine Kombination von Einkapselungsprozeduren kann
verwendet werden, um die gewünschte
Anreicherung zu erhalten.
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Theoretische
Studien zeigen, dass es, je größer die
Anzahl an Varianten von genetischen Elementen ist, die erzeugt wird,
umso wahrscheinlicher ist, dass ein Molekül mit den gewünschten
Eigenschaften erzeugt wird (siehe Perelson und Oster, 1979, für eine Beschreibung
darüber,
wie dieses auf Repertoires von Antikörpern zutrifft). Vor kurzem
wurde ebenfalls praktisch bestätigt,
dass größere Phagen-Antikörper-Repertoires
tatsächlich
mehr Antikörper
mit besseren Bindungsaffinitäten
als kleinere Repertoires hervorrufen (Griffiths et al., 1994). Um
sicher zu stellen, dass seltene Varianten erzeugt werden und somit
selektiert werden können,
ist eine große
Größe der Bibliothek
wünschenswert.
Somit ist die Verwendung von optimal kleinen Mikrokapseln vorteilhaft.
-
Das
größte Repertoire,
das bis heute unter Verwendung von Methoden erzeugt wurde, die einen
in vivo-Schritt erfordern (Phagen-Display- und LacI-Systeme), war
eine Phagen-Peptid-Bibliothek
mit 1,6 × 1011 Klonen, was die Fermentation von 15 Litern
Bakterien erforderte (Fisch et al., 1996). SELEX-Experimente werden
oft mit sehr großen
Zahlen von Varianten durchgeführt
(bis zu 1015).
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Unter
Verwendung der vorliegenden Offenbarung kann bei einem bevorzugten
Mikrokapseldurchmesser von 2,6 μm
eine Repertoiregröße von wenigstens
1011 selektiert werden, indem eine wässrige Phase
von 1 ml in einer Emulsion von 20 ml verwendet wird.
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Zusätzlich zu
den oben beschriebenen genetischen Elementen werden die Mikrokapseln
gemäß der Offenbarung
weitere Komponenten umfassen, die benötigt werden, damit der Sortierprozess
stattfinden kann. Andere Komponenten des Systems werden beispielsweise
jene umfassen, die zur Transkription und/oder Translation des genetischen
Elements nötig
sind. Diese werden für
die Bedürfnisse
eines spezifischen Systems aus den folgenden ausgewählt: einem
geeigneten Puffer, einem in vitro-Transkriptions/Translationssystem
und/oder einem in vitro-Translationssystem, enthaltend alle nötigen Bestandteile,
Enzyme und Kofaktoren, RNA-Polymerase, Nukleotide, Nukleinsäuren (natürlich oder
synthetisch), Transfer-RNAs, Ribosomen und Aminosäuren und
die Sub strate der Reaktion von Interesse, um die Selektion des modifizierten
Genprodukts zu erlauben.
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Ein
geeigneter Puffer wird ein solcher sein, in welchem all die gewünschten
Komponenten des biologischen Systems aktiv sind, und wird daher
von den Bedürfnissen
jedes spezifischen Reaktionssystems abhängen. Puffer, die für biologische
und/oder chemische Reaktionen geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt
und Rezepte werden in verschiedenen Laborbüchern wie z.B. Sambrook et
al., 1989 bereit gestellt.
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Das
in vitro-Translationssystem wird gewöhnlich einen Zellextrakt, typischerweise
aus Bakterien (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley,
1995), Kaninchenretikulozyten (Pelham und Jackson, 1976) oder Weizenkeim
(Anderson et al., 1983), umfassen. Viele geeignete Systeme sind
im Handel erhältlich (beispielsweise
von Promega), einschließlich
einiger, welche eine gekoppelte Transkription/Translation erlauben
(alle bakteriellen Systeme und die Retikulozyten- und Weizenkeim-TNTTM-Extraktsysteme von Promega). Die Mischung
der verwendeten Aminosäuren
kann, wenn gewünscht,
synthetische Aminosäuren
beinhalten, um die mögliche
Anzahl oder Varietät
von Proteinen, die in der Bibliothek erzeugen werden, zu erhöhen. Dieses
kann erreicht werden, indem tRNAs mit künstlichen Aminosäuren beladen
werden und diese tRNAs für
die in vitro-Translation der Proteine, die selektiert werden sollen,
verwendet werden (Ellman et al., 1991; Renner, 1994; Mendel et al.,
1995).
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Nach
jeder Selektionsrunde kann die Anreicherung des Pools von genetischen
Elementen im Hinblick auf jene, welche die Moleküle von Interesse codieren,
durch nicht kompartimentierte in vitro-Transkription/Replikation
oder gekoppelte Transkriptions/Translationsreaktionen getestet werden.
Der selektierte Pool wird in einen geeigneten Plasmidvektor kloniert,
und RNA oder rekombinantes Protein wird aus den einzelnen Klonen für eine weitere
Reinigung und zum Testen erzeugt.
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Die
Offenbarung betrifft darüber
hinaus ein Verfahren zur Erzeugung eines Genprodukts, sobald ein genetisches
Element, welches das Genprodukt codiert, durch das Verfahren der
Offenbarung sortiert wurde. Natürlich
kann das genetische Element selbst direkt durch herkömmliche
Mittel exprimiert werden, um das Genprodukt zu erzeugen. Jedoch
können
alternative Techniken eingesetzt werden, wie sie für die Fachleute auf
dem Gebiet der Technik offensichtlich sein werden. Beispielsweise
kann die genetische Information, die in das Genprodukt eingebaut
ist, in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden und
daraus exprimiert werden.
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Die
Offenbarung beschreibt ebenfalls die Verwendung von herkömmlichen
Screeningtechniken, um Verbindungen zu identifizieren, die in der
Lage sind, mit den Genprodukten wechselzuwirken, die durch den ersten
Aspekt der Offenbarung identifiziert wurden. Bei bevorzugten Ausführungsformen
wird eine ein Genprodukt codierende Nukleinsäure in einen Vektor eingebaut
und in geeignete Wirtszellen eingeführt, um transformierte Zelllinien
zu erzeugen, die das Genprodukt exprimieren. Die resultierenden
Zelllinien können
dann für eine
reproduzierbare qualitative und/oder quantitative Analyse der Wirkung(en)
möglicher
Arzneimittel, welche die Funktion des Genprodukts beeinflussen,
erzeugt werden. So können
das Genprodukt exprimierende Zellen zur Identifizierung von Verbindungen,
insbesondere Verbindungen mit kleinem Molekulargewicht, eingesetzt werden,
welche die Funktion des Genprodukts modulieren. Somit sind Wirtszellen,
welche das Genprodukt exprimieren, nützlich zum Screenen von Arzneimitteln,
und es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen bereitzustellen, welche
die Aktivität
des Genprodukts modulieren, wobei das Verfahren das Exponieren von
Zellen, die heterologe DNA, die ein Genprodukt codiert, enthalten,
wobei die Zellen ein funktionales Genprodukt erzeugen, an wenigstens
eine Verbindung oder eine Mischung von Verbindungen oder ein Signal,
dessen Fähigkeit,
die Aktivität
des Genprodukts zu modulieren, bestimmt werden soll, und danach
das Überwachen
der Zellen im Hinblick auf Veränderungen,
die durch die Modulation verursacht werden, umfasst. Ein solcher
Test ermöglicht
die Identifikation von Modulatoren wie z.B. Agonisten, Antagonisten
und allosterischen Modulatoren des Genprodukts. Wie hierin verwendet bezieht
sich eine Verbindung oder ein Signal, welches die die Aktivität eines
Genprodukts moduliert, auf eine Verbindung, welche die Aktivität des Genprodukts
in einer solchen Weise verändert,
dass die Aktivität
des Genprodukts in der Gegenwart der Verbindung oder des Signals
verschieden ist (im Vergleich zu der Abwesenheit der Verbindung
oder des Signals).
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Auf
Zellen basierende Screeningtests können entworfen werden, indem
Zelllinien konstruiert werden, bei welchen die Expression eines
Reporterproteins, d.h. eines leicht zu testenden Proteins wie z.B.
b-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) oder Luziferase,
von dem Genprodukt abhängt.
Ein solcher Test ermöglicht
den Nachweis von Verbindungen, welche die Funktion des Genprodukts
direkt modulieren, wie z.B. Ver bindungen, welche dem Genprodukt
entgegenwirken, oder Verbindungen, die andere zelluläre Funktionen,
die für
die Aktivität
des Genprodukts benötigt
werden, inhibieren oder potenzieren.
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Die
vorliegende Offenbarung stellt ebenfalls ein Verfahren bereit, um
von dem Genprodukt abhängige Prozesse,
die in Zellen auftreten, exogen zu beeinflussen. Ein rekombinantes
Genprodukt erzeugende Wirtszellen, z.B. Säugetierzellen, können mit
einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden, und die modulierende
Wirkung(en) von dieser können
dann ausgewertet werden, indem die von dem Genprodukt vermittelte
Antwort in der Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung verglichen
wird oder indem die von dem Genprodukt vermittelte Antwort von Testzellen
oder Kontrollzellen (d.h. Zellen, die das Genprodukt nicht exprimieren) mit
dem Vorliegen der Verbindung in Bezug gesetzt wird.
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Unter
einem weiteren Aspekt betrifft die Offenbarung ein Verfahren zum
Optimieren eines Produktionsprozesses, an welchem wenigstens ein
Schritt beteiligt ist, der durch ein Polypeptid erleichtert wird.
Beispielsweise kann der Schritt ein katalytischer Schritt sein,
welcher durch ein Enzym erleichtert wird. Somit stellt die Offenbarung
ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung oder von Verbindungen
bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:
- (a)
Bereitstellen einer Synthesevorschrift, in welcher wenigstens ein
Schritt durch ein Polypeptid erleichtert wird;
- (b) Herstellen von genetischen Elementen, welche Varianten des
Polypeptids, welches diesen Schritt erleichtert, codieren;
- (c) Kompartimentieren der genetischen Elemente in Mikrokapseln;
- (d) Exprimieren der genetischen Elemente, um deren entsprechende
Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu erzeugen;
- (e) Sortieren der genetischen Elemente, welche ein Polypeptid-Genprodukt(e)
mit der gewünschten
Aktivität
erzeugen; und
- (f) Herstellen der Verbindung oder Verbindungen unter Verwendung
des Polypeptidgenprodukts, das in (e) identifiziert wurde, um den
relevanten Schritt der Synthese zu erleichtern.
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Mittels
der Offenbarung können
Enzyme, die an der Herstellung einer Verbindung beteiligt sind,
durch Selektion im Hinblick auf eine optimale Aktivität optimiert
werden. Die Prozedur beinhaltet die Herstellung von Varianten des
zu screenenden Polypeptids, welche einer Bibliothek von Polypeptiden
wie einer solchen, auf welche hierin Bezug genommen wird, gleichen.
Die Varianten können
auf dieselbe Weise hergestellt werden wie die Bibliotheken, die
an anderer Stelle hierin diskutiert wurden.
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(B) SELEKTIONSPROZEDUREN
-
Das
System kann konfiguriert werden, um auf RNA, DNA oder Proteingenproduktmoleküle mit katalytischer,
regulatorischer oder Bindungsaktivität zu selektieren.
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(i) AFFINITÄTSSELEKTION
-
Im
Fall einer Selektion auf ein Genprodukt mit Affinität für einen
spezifischen Liganden kann das genetische Element in der Mikrokapsel über den
Liganden mit dem Genprodukt verknüpft werden. Nur Genprodukte
mit Affinität
für den
Liganden werden daher an das genetische Element selbst binden, und
daher werden nur genetische Elemente, die aktives Produkt produzieren,
in dem Selektionsschritt zurückgehalten
werden. Bei dieser Ausführungsform
wird das genetische Element somit eine Nukleinsäure, die das Genprodukt codiert,
verknüpft
mit einem Liganden für
das Genprodukt umfassen.
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Bei
dieser Ausführungsform
enthalten alle Genprodukte, die selektiert werden sollen, eine mutmaßliche Bindungsdomäne, auf
welche selektiert werden soll, und ein gemeinsames Merkmal – eine Markierung. Das
genetische Element in jeder Mikrokapsel ist körperlich mit dem Liganden verknüpft. Wenn
das Genprodukt, das von dem genetischen Element erzeugt wird, Affinität für den Liganden
aufweist, wird es an diesen binden und körperlich mit demselben genetischen
Element, das dieses codiert, verknüpft werden, was dazu führt, dass
das genetische Element „markiert" wird. Am Ende der
Reaktion werden alle Mikrokapseln vereinigt, und alle genetischen
Elemente und Genprodukte werden in einer Umgebung zusammen gepoolt.
Die genetischen Elemente, die Genprodukte codieren, welche die gewünschte Bindung
zeigen, können
durch Affinitätsreinigung
unter Verwendung eines Moleküls,
das spezifisch an die „Markierung" bindet oder damit
spezifisch reagiert, selektiert werden.
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Bei
einer alternativen Ausführungsform
können
genetische Elemente auf der Basis sortiert werden, dass das Genprodukt,
welches an den Liganden bindet, den Liganden vor beispielsweise
weiteren Bindungspartnern lediglich versteckt. Bei dieser Möglichkeit
kann das genetische Element, statt dass es während eines Affinitätsreinigungsschrittes
zurückgehalten
wird, selektiv eluiert werden, während
andere genetische Elemente gebunden werden.
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Bei
einer alternativen Ausführungsform
stellt die Offenbarung ein Verfahren bereit, wobei in Schritt (b) die
Genprodukte an genetische Elemente, welche diese codieren, binden.
Die Genprodukte zusammen mit den befestigten genetischen Elementen
werden dann als eine Folge der Bindung eines Liganden an Genprodukte
mit der gewünschten
Aktivität
sortiert. Beispielsweise können
alle Genprodukte einen unveränderlichen Bereich,
welcher kovalent oder nicht kovalent an das genetische Element bindet,
und einen zweiten Bereich, welcher diversifiziert ist, um so die
gewünschte
Bindungsaktivität
zu erzeugen, enthalten.
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Die
Sortierung durch Affinität
ist abhängig
von dem Vorliegen von zwei Mitgliedern eines Bindungspaares unter
solchen Bedingungen, dass eine Bindung stattfinden kann. Jegliches
Bindungspaar kann zu diesem Zweck verwendet werden. Wie hierin verwendet
bezieht sich der Ausdruck Bindungspaar auf jegliches Paar von Molekülen, die
in der Lage sind, aneinander zu binden. Beispiele für Bindungspaare,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten
ein Antigen und einen Antikörper
oder ein Fragment von diesem, die in der Lage sind, das Antigen
zu binden, das Paar Biotin-Avidin/Streptavidin
(Savage et al., 1994), ein Calcium-abhängiges bindendes Polypeptid
und einen Liganden dafür
(z.B. Calmodulin und ein Calmodulin bindendes Peptid (Stofko et
al., 1992; Montigiani et al., 1996)), Paare von Polypeptiden, die
sich unter Bildung eines Leucin-Zippers zusammensetzen (Tripet et
al., 1996), Histidine (typischerweise Hexahistidinpeptide) und chelatgebundenes
Cu2+, Zn2+ und Ni2+ (z.B. Ni-NTA; Hochuli et al., 1987), RNA
bindende und DNA bindende Proteine (Klug, 1995) einschließlich jener,
die Zinkfingermotive enthalten (Klug und Schwabe, 1995), und DNA-Methyltransferasen
(Anderson, 1993) und deren Nukleinsäurebindungsstellen.
-
(ii) KATALYSE
-
Wenn
eine Selektion im Hinblick auf die Katalyse stattfindet, kann das
genetische Element in jeder Mikrokapsel das Substrat der Reaktion
umfassen. Wenn das genetische Element ein Genprodukt codiert, das
in der Lage ist, als ein Katalysator zu wirken, wird das Genprodukt
die Umwandlung des Substrats in das Produkt katalysieren. Daher
ist am Ende der Reaktion das genetische Element körperlich
mit dem Produkt der katalysierten Reaktion verknüpft. Wenn die Mikrokapseln
vereinigt werden und die Reaktanden gepoolt werden, können genetische
Elemente, die katalytische Moleküle
codieren, durch Selektieren auf irgendeine Eigenschaft, die für das Produkt
spezifisch ist, angereichert werden (1).
-
Beispielsweise
kann die Anreicherung durch Affinitätsreinigung erfolgen, indem
ein Molekül
(z.B. ein Antikörper)
verwendet wird, der spezifisch an das Produkt bindet. In gleicher
Weise kann das Genprodukt die Wirkung haben, eine Nukleinsäurekomponente
des genetischen Elements, z.B. durch Methylierung (oder Demethylierung)
oder Mutation der Nukleinsäure,
zu modifizieren, was diese resistent gegen oder anfällig für einen
Angriff durch Nukleasen wie z.B. Restriktionsendonukleasen macht.
-
Alternativ
kann die Selektion indirekt durchgeführt werden, indem eine erste
Reaktion mit nachfolgenden Reaktionen gekoppelt wird, die in derselben
Mikrokapsel stattfinden. Es gibt zwei allgemeine Wege, auf welchen
dieses durchgeführt
werden kann. Erstens könnte
das Produkt der ersten Reaktion mit einem Molekül umgesetzt werden oder von
diesem gebunden werden, welches nicht mit dem Substrat der ersten
Reaktion reagiert. Eine zweite, gekoppelte Reaktion wird nur in
der Gegenwart des Produkts der ersten Reaktion ablaufen. Ein aktives
genetisches Element kann dann durch Selektion auf die Eigenschaften
des Produkts der zweiten Reaktion gereinigt werden.
-
Alternativ
kann das Produkt der Reaktion, die selektiert wird, das Substrat
oder ein Kofaktor für
eine zweite enzymkatalysierte Reaktion sein. Das Enzym, um die zweite
Reaktion zu katalysieren, kann entweder in situ in den Mikrokapseln
translatiert werden oder vor der Mikroeinkapselung in die Reaktionsmischung
eingebaut werden. Nur wenn die erste Reaktion abläuft, wird
das gekoppelte Enzym ein selektierbares Produkt erzeugen.
-
Dieses
Konzept der Kopplung kann vervollkommnet werden, um multiple Enzyme
einzubauen, von denen jedes als ein Substrat das Produkt der vorhergehenden
Reaktion verwendet. Dieses erlaubt eine Selektion von Enzymen, die
nicht mit einem immobilisierten Substrat reagieren werden. Es kann
ebenfalls so gestaltet werden, dass es durch Signalamplifikation
eine erhöhte
Empfindlichkeit ergibt, wenn ein Produkt von einer Reaktion ein
Katalysator oder ein Kofaktor für
eine zweite Reaktion oder eine Reihe von Reaktionen ist, die zu einem
selektierbaren Produkt führen
(als Beispiel siehe Johannsson und Bates, 1988; Johannsson, 1991). Weiterhin
kann ein Enzymkaskadensystem auf der Produktion eines Aktivators
für ein
Enzym oder der Zerstörung
eines Enzyminhibitors basieren (siehe Mize et al., 1989). Die Kopplung
hat ebenfalls den Vorteil, dass ein gemeinsames Selektionssystem
für eine
ganze Gruppe von Enzymen, welche dasselbe Produkt erzeugen, verwendet
werden kann und die Selektion von komplizierten chemischen Transformationen,
die nicht in einem einzigen Schritt durchgeführt werden können, erlaubt.
-
Ein
solches Verfahren der Kopplung ermöglicht somit die Entwicklung
neuer "metabolischer
Stoffwechselwege" in
vitro in einer schrittweisen Art, wobei zunächst ein Schritt und dann der
nächste
selektiert und verbessert wird. Die Selektionsstrategie basiert
auf dem Endprodukt des Stoffwechselwegs, so dass alle früheren Schritte
unabhängig
oder nacheinander entwickelt werden können, ohne für jeden
Schritt der Reaktion ein neues Selektionssystem einzurichten.
-
Ausgedrückt in einer
alternativen Weise wird ein Verfahren zum Isolieren eines oder mehrerer
genetischer Elemente, die ein Genprodukt mit einer gewünschten
katalytischen Aktivität
codieren, bereit gestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:
- (1) Exprimieren genetischer Elemente, um deren
entsprechende Genprodukte zu ergeben;
- (2) Ermöglichen,
dass die Genprodukte die Umwandlung eines Substrats in ein Produkt
katalysieren, welches entsprechend der gewünschten Aktivität direkt
selektierbar sein kann oder nicht;
- (3) gegebenenfalls Koppeln der ersten Reaktion an eine oder
mehrere nachfolgende Reaktionen, wobei jede Reaktion durch das Produkt
der vorhergehenden Reaktionen moduliert wird und zu der Erzeugung
eines letzten, selektierbaren Produkts führt;
- (4) Verknüpfen
des selektierbaren Produkts der Katalyse mit den genetischen Elementen,
entweder durch:
a) Koppeln eines Substrats an die genetischen
Elemente in einer solchen Weise, dass das Produkt mit den genetischen
Elementen assoziiert bleibt, oder
b) Umsetzen oder Binden des
selektierbaren Produkts mit den/an die genetischen Elemente(n) mittels
einer geeigneten molekularen „Markierung", die an dem Substrat
befestigt ist, welche an dem Produkt verbleibt, oder
c) Koppeln
des selektierbaren Produkts (nicht aber des Substrats) an die genetischen
Elemente mittels einer produktsspezifischen Reaktion oder Wechselwirkung
mit dem Produkt; und
- (5) Selektieren des Produkts der Katalyse, zusammen mit dem
genetischen Element, an welches dieses gebunden ist, entweder mittels
einer spezifischen Reaktion oder Wechselwirkung mit dem Produkt
oder durch Affinitätsreinigung
unter Verwendung einer geeigneten molekularen „Markierung", die an dem Produkt
der Katalyse befestigt ist, wobei in den Schritten (1) bis (4) jedes
genetische Element und das entsprechende Genprodukt innerhalb einer
Mikrokapsel enthalten sind.
-
(iii) REGULATION
-
Ein ähnliches
System kann verwendet werden, um auf regulatorische Eigenschaften
von Enzymen zu selektieren.
-
In
dem Fall einer Selektion auf ein Regulatormolekül, welches als ein Aktivator
oder Inhibitor eines biochemischen Prozesses wirkt, können die
Komponenten des biochemischen Prozesses entweder in situ in jeder
Mikrokapsel translatiert werden oder können vor der Mikroeinkapselung
in die Reaktionsmischung eingebaut werden. Wenn das genetische Element,
das selektiert wird, dazu dient, einen Aktivator zu codieren, kann die
Selektion auf das Produkt der regulierten Reaktion wie oben in Verbindung
mit der Katalyse beschrieben durchgeführt werden. Wenn ein Inhibitor
gewünscht
wird, kann die Selektion im Hinblick auf eine chemische Eigenschaft
erfolgen, die für
das Substrat der regulierten Reaktion spezifisch ist.
-
Es
wird daher ein Verfahren zum Sortieren eines oder mehrerer genetischer
Elemente, die für
ein Genprodukt codieren, das eine gewünschte regulatorische Aktivität zeigt,
bereit gestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:
- (1) Exprimieren genetischer Elemente, um deren
entsprechende Genprodukte zu ergeben;
- (2) Ermöglichen,
dass die Genprodukte eine biochemische Reaktion oder eine Folge
von gekoppelten Reaktionen entsprechend der gewünschten Aktivität aktivieren
oder inhibieren, in einer solchen Weise, dass die Erzeugung oder
das Überleben
eines selektierbaren Moleküls
ermöglicht
wird;
- (3) Verknüpfen
des selektierbaren Moleküls
mit den genetischen Elementen durch entweder:
a) Befestigen
des selektierbaren Moleküls
oder des Substrats, von dem dieses abgeleitet ist, an den genetischen
Elementen oder
b) Umsetzen oder Binden des selektierbaren Produkts
mit den/an die genetischen Elemente(n) mittels einer geeigneten
molekularen „Markierung", die an dem Substrat
befestigt ist, welche an dem Produkt verbleibt oder
c) Koppeln
des Produkts der Katalyse (nicht aber des Substrats) an die genetischen
Elemente, mittels einer produktspezifischen Reaktion oder Wechselwirkung
mit dem Produkt;
- (4) Selektieren des selektierbaren Produkts, zusammen mit dem
genetischen Element, an welches dieses gebunden ist, entweder mittels
einer spezifischen Reaktion oder Wechselwirkung mit dem selektierbaren Produkt
oder durch Affinitätsreinigung
unter Verwendung einer geeigneten molekularen „Markierung", die an dem Produkt
der Katalyse befes tigt ist, wobei in den Schritten (1) bis (4) jedes
genetische Element und das entsprechende Genprodukt innerhalb einer
Mikrokapsel enthalten sind.
-
(iv) MIKROKAPSELSORTIERUNG
-
Die
Offenbarung sorgt für
die Sortierung von intakten Mikrokapseln, wo dieses durch die Sortierungstechniken,
die eingesetzt werden, ermöglicht
wird. Mikrokapseln können
als solche sortiert werden, wenn die Veränderung, die durch das gewünschte Genprodukt
hervorgerufen wird, entweder an der Oberfläche der Mikrokapsel stattfindet
oder sich dort manifestiert oder außerhalb der Mikrokapsel nachweisbar
ist. Die Veränderung
kann durch die direkte Wirkung des Genprodukts oder indirekt hervorgerufen
werden, wobei eine Reihe von Reaktionen, von denen das Genprodukt
mit der gewünschten
Aktivität
an einer oder mehreren beteiligt ist, zu der Veränderung führt. Beispielsweise kann die
Mikrokapsel so konfiguriert sein, dass das Genprodukt an ihrer Oberfläche zur
Schau gestellt wird und somit für
Reagenzien zugänglich
ist. Wenn die Mikrokapsel eine membranöse Mikrokapsel ist, kann das
Genprodukt auf die Membran der Mikrokapsel abzielen oder kann das Abzielen
(targeting) eines Moleküls
auf diese hervorrufen. Dieses kann beispielsweise erreicht werden,
indem eine Membranlokalisationssequenz, wie jene, die von Membranproteinen
abgeleitet sind, eingesetzt wird, welche den Einbau eines fusionierten
oder verknüpften
Moleküls
in die Membran der Mikrokapsel begünstigen wird. Wo alternativ
die Mikrokapsel durch Phasenaufteilung wie z.B. bei Wasser-in-Öl-Emulsionen
gebildet wird, wird ein Molekül
mit Teilen, welche in der extrakapsulären Phase besser löslich sind,
diese derart anordnen, dass sie an der Grenze der Mikrokapsel vorliegen.
-
Bei
einem bevorzugten Aspekt der Offenbarung wird jedoch die Mikrokapselsortierung
auf Sortierungssysteme angewendet, welche auf einer Änderung
bei den optischen Eigenschaften der Mikrokapsel, z.B. Absorptions-
oder Emissionscharakteristika von dieser, z.B. einer Änderung
bei den optischen Eigenschaften der Mikrokapsel, die aus einer Reaktion
resultiert, die zu Veränderungen
bei der Extinktion, Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz
führt,
die mit der Mikrokapsel assoziiert ist, beruhen. Alle solche Eigenschaften
sind von dem Begriff „optisch" umfasst. In einem
solchen Fall können
Mikrokapseln durch Lumineszenz-, Fluoreszenz- oder Phosphoreszenz-aktivierte
Sortierung sortiert werden. Bei einer in hohem Maße bevorzugten
Ausführungsform
wird eine durch Fluoreszenz aktivierte Sortierung eingesetzt, um
Mikrokapseln zu sortieren, in welchen die Produktion eines Genprodukts
mit einer gewünschten
Aktivität
von der Produktion eines fluoreszierenden Moleküls in der Zelle begleitet wird.
Beispielsweise kann das Genprodukt selbst fluoreszierend, z.B. ein
fluoreszierendes Protein wie z.B. GFP, sein. Alternativ kann das
Genprodukt die Fluoreszenz eines anderen Moleküls induzieren oder modifizieren,
indem es beispielsweise an dieses bindet oder damit reagiert.
-
(v) MIKROKAPSELIDENTIFIKATION
-
Mikrokapseln
können
mit Hilfe einer Veränderung
identifiziert werden, die durch das gewünschte Genprodukt hervorgerufen
wird, welche entweder an der Oberfläche der Mikrokapsel auftritt
oder sich dort manifestiert oder von außerhalb nachweisbar ist, wie
in Abschnitt iii (Mikrokapselsortierung) beschrieben wird. Diese Änderung
wird, wenn sie identifiziert wurde, verwendet, um die Modifikation
des Gens innerhalb des Kompartiments auszulösen. Unter einem bevorzugten
Aspekt der Offenbarung beruht die Identifikation der Mikrokapsel
auf einer Veränderung
bei den optischen Eigenschaften der Mikrokapsel, die aus einer Reaktion
resultiert, die zu Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz
innerhalb der Mikrokapsel führt.
Die Modifikation des Gens innerhalb der Mikrokapseln würde durch
die Identifikation der Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz
ausgelöst.
Beispielsweise kann die Identifikation der Lumineszenz, Phosphoreszenz
oder Fluoreszenz den Beschuss des Kompartiments mit Photonen (oder
anderen Partikeln oder Wellen) auslösen, was zu einer Modifikation
des genetischen Elements führt.
Eine ähnliche
Prozedur wurde vorher für
die schnelle Sortierung von Zellen beschrieben (Keij et al., 1994).
Eine Modifikation des genetischen Elements kann beispielsweise aus
der Kopplung einer molekularen „Markierung", die von einem Käfig einer
photolabilen Schutzgruppe umgeben ist, an die genetischen Elemente
folgen: der Beschuss mit Photonen einer geeigneten Wellenlänge führt zu der
Entfernung des Käfigs.
Danach werden alle Mikrokapseln vereinigt und die genetischen Elemente
in einer Umgebung zusammen gepoolt. Genetische Elemente, die Genprodukte
codieren, welche die gewünschte
Aktivität
zeigen, können
durch Affinitätsreinigung
unter Verwendung eines Moleküls,
das spezifisch an die „Markierung" bindet oder spezifisch
damit reagiert, selektiert werden.
-
(vi) MEHRSCHRITTPROZEDUR
-
Es
wird ebenfalls anerkannt werden, dass es gemäß der vorliegenden Offenbarung
nicht für
alle Prozesse der Transkription/Replikation und/oder Translation
und Selektion nötig
ist, in einem einzigen Schritt abzulaufen, wo alle Reaktionen in
einer Mikrokapsel stattfin den. Die Selektionsprozedur kann zwei
oder mehr Schritte umfassen. Zuerst kann die Transkription/Replikation
und/oder Translation jedes genetischen Elements einer Bibliothek
genetischer Elemente in einer ersten Mikrokapsel stattfinden. Jedes
Genprodukt wird dann mit dem genetischen Element verknüpft, welches
es codierte (welches in derselben Mikrokapsel vorliegt). Die Mikrokapseln
werden dann aufgebrochen, und die genetischen Elemente, die an ihren
entsprechenden Genprodukten befestigt sind, gegebenenfalls gereinigt.
Alternativ können
die genetischen Elemente an ihren entsprechenden Genprodukten befestigt
werden, indem Verfahren verwendet werden, die nicht auf einer Einkapselung
beruhen. Beispiele sind Phagen-Display (Smith, G.P., 1985), Polysomen-Display
(Mattheakkis et al., 1994), RNA-Peptid-Fusion (Roberts und Szostak,
1997) oder lac-Repressor-Peptid-Fusion
(Cull, et al., 1992).
-
In
dem zweiten Schritt der Prozedur wird jedes gereinigte genetische
Element, das an seinem Genprodukt befestigt ist, in eine zweite
Mikrokapsel gegeben, die Komponenten der Reaktion, die selektiert
werden soll, enthält.
Diese Reaktion wird dann initiiert. Nach Abschluss der Reaktionen
werden die Mikrokapseln wieder aufgebrochen, und die modifizierten
genetischen Elemente werden selektiert. In dem Fall komplizierter mehrstufiger
Reaktionen, an welchen viele einzelne Komponenten und Reaktionsschritte
beteiligt sind, können einer
oder mehrere dazwischen liegende Schritte zwischen dem anfänglichen
Schritt der Erzeugung und Verknüpfung
des Genprodukts mit dem genetischen Element und dem letzten Schritt
der Erzeugung der selektierbaren Veränderung bei dem genetischen
Element durchgeführt
werden.
-
(vii) SELEKTION DURCH AKTIVIERUNG DER
REPORTERGENEXPRESSION IN SITU
-
Das
System kann so konfiguriert werden, dass die gewünschte Bindungs-, katalytische
oder regulatorische Aktivität,
die von einem genetischen Element codiert wird, direkt oder indirekt
zu der Aktivierung der Expression eines „Reportergens" führt, das
in allen Mikrokapseln vorliegt. Nur Genprodukte mit der gewünschten Aktivität aktivieren
die Expression des Reportergens. Die Aktivität, die aus der Expression des
Reportergens resultiert, erlaubt die Selektion des genetischen Elements
(oder des Kompartiments, das dieses enthält) durch irgendeines der hierin
beschriebenen Verfahren.
-
Beispielsweise
kann die Aktivierung des Reportergens das Ergebnis einer Bindungsaktivität des Genprodukts
in einer Weise, die analog ist zu dem „Zweihybrid-System" (Fields und Song,
1989), sein. Die Aktivierung kann ebenfalls aus dem Produkt einer
Reaktion resultieren, die durch ein gewünschtes Genprodukt katalysiert
wird. Beispielsweise könnte
das Reaktionsprodukt ein transkriptionaler Inducer des Reportergens sein.
Beispielsweise könnte
Arabinose verwendet werden, um eine Transkription ausgehend von
dem araBAD-Promoter
zu induzieren. Die Aktivität
des wünschenswerten
Genprodukts könnte
ebenfalls zu der Modifikation eines Transkriptionsfaktors führen, was
zu der Expression des Reportergens führt. Wenn beispielsweise das
gewünschte
Genprodukt eine Kinase oder Phosphatase ist, kann die Phosphorylierung
oder Dephosphorylierung eines Transkriptionsfaktors zu der Aktivierung
der Expression des Reportergens führen.
-
(viii) AMPLIFIKATION
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung umfasst das Verfahren
den weiteren Schritt des Amplifizierens der genetischen Elemente.
Die selektive Amplifikation kann als ein Mittel verwendet werden,
um im Hinblick auf genetische Elemente, die das gewünschte Genprodukt
codieren, anzureichern.
-
Bei
all den obigen Konfigurationen kann das genetische Material, das
in den genetischen Elementen enthalten ist, amplifiziert werden
und der Prozess in iterativen Schritten wiederholt werden. Die Amplifikation kann
durch die Polymerasekettenreaktion (Saiki et al., 1988) oder durch
Verwendung einer Vielzahl von anderen Genamplifikationstechniken,
einschließlich
Qβ-Replicase-Amplifikation
(Cahill, Foster und Mahan, 1991; Chetverin und Spirin, 1995; Katanaev,
Kumasov und Spirin, 1995); der Ligase-Kettenreaktion (LCR) (Landegren
et al., 1988; Barany, 1991); des selbst unterhaltenden Sequenzreplikationssystems
(Fahy, Kwoh und Gingeras, 1991) und der Strangaustausch-Amplifikation
(Walker et al., 1992) erfolgen.
-
(ix) KOMPARTIMENTIERUNG
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung wird ein Verfahren
zur Kompartimentierung eines genetischen Elements und Exprimierung
des genetischen Elements, um sein Genprodukt innerhalb des Kompartiments
zu bilden, bereit gestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Bilden einer wässrigen Lösung, welche das genetische
Element und die Komponenten, die nötig sind, um dieses zu exprimieren,
um sein Genprodukt zu bilden, umfasst;
- (b) Mikroeinkapseln der Lösung,
um so eine diskrete Mikrokapsel zu bilden, die das genetische Element umfasst;
und
- (c) Exponieren der Mikrokapsel an Bedingungen, die geeignet
sind, damit die Expression des genetischen Elements, um sein Genprodukt
zu bilden, ablaufen kann.
-
Geeignete
Mikroeinkapselungstechniken werden im Detail in der vorstehenden
allgemeinen Beschreibung beschrieben.
-
Vorzugsweise
wird eine Bibliothek von genetischen Elementen, die ein Repertoire
von Genprodukten codieren, gemäß der Erfindung
durch das oben beschriebene Verfahren eingekapselt und die genetischen
Elemente exprimiert, um ihre entsprechenden Genprodukte zu erzeugen.
Bei einer in hohem Maße
bevorzugten Ausführungsform
wird eine Mikroeinkapselung erreicht, indem eine Wasser-in-Öl-Emulsion
der wässrigen
Lösung,
welche die genetischen Elemente umfasst, gebildet wird.
-
Die
Offenbarung stellt demgemäß ebenfalls
eine Mikrokapsel bereit, die durch das oben angegebene Verfahren
erhältlich
ist.
-
Verschiedene
Aspekte und Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung und der vorliegenden Offenbarung werden
in den folgenden Beispielen dargestellt.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1.
-
Die Produktion von wässrigen Mikrokapseln mit ungefähr 2 μm in einem
Wasser-in-Öl-Emulsionssystem.
-
Mikrokapseln
innerhalb des bevorzugten Größenbereichs
der vorliegenden Erfindung können
unter Verwendung eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems erzeugt
werden.
-
Leichtes
weißes
Mineralöl
(Sigma; M-3516) wird hierin als die kontinuierliche Phase verwendet,
und die Emulsion wird durch die Emulgatoren Sorbitanmonooleat (Span
80, Fluka; 85548) und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80,
Sigma Ultra; P-8074) und in manchen Fällen ebenfalls mit 0,5% w/v
Natriumdeoxycholat (Fluka; 30970) stabilisiert.
-
Die Ölphase wird
frisch hergestellt, indem 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka) in Mineralöl (Sigma,
#M-5904) gelöst
werden, gefolgt von 0,5% (v/v) Tween 80 (SigmaUltra; #P-8074). Eisgekühlte in
vitro-Reaktionsmischungen (50 μl)
werden schrittweise (in 5 Aliquots von 10 μl über ~2 Minuten) zu 0,95 ml
eisgekühlter Ölphase in
einem 5 ml-Costar Biofreeze Vial (#2051) zugegeben, während mit
einem Magnetstäbchen
gerührt
wird (8 × 3
mm mit einem Mittelring; Scientific Industries International, Loughborough,
UK). Das Rühren
(bei 1150 Upm) wird für
1 zusätzliche
Minute auf Eis fortgesetzt. Bei einigen Emulsionen wird die wässrige Phase
mit einem anionischen Tensid ergänzt – z.B. Natriumdeoxycholat,
Natriumcholat, Natriumglycocholat und Natriumtaurocholat, typischerweise
bis auf 0,5% (w/v).
-
Wenn
angegeben, wird die Emulsion weiter homogenisiert, indem ein Ultra-Turrax
T25-Dispergierer (IKA),
welcher mit einem Dispergierwerkzeug mit 8 mm Durchmesser ausgerüstet ist,
für 1 Minute
bei 8 k, 9 k oder 13,5 k Upm oder für 1 oder 5 Minuten bei 20 k
Upm auf Eis verwendet wird. Dieses verringert die Mikrokapselgröße.
-
Die
Reaktionen können
gequencht werden und die Emulsion kann aufgebrochen werden wie in
den einzelnen Beispielen angegeben ist, indem bei 3.000 g für 5 Minuten
abzentrifugiert wird und die Ölphase
entfernt wird, was die konzentrierte Emulsion am Boden des Vials
zurücklässt. Quenchpuffer
(typischerweise 0,2 ml 25 μg/ml
Hefe-RNA in W+B-Puffer: 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4)
und 2 ml wassergesättigter
Diethylether werden zugegeben und die Mischung wird gevortext, kurz
zentrifugiert und die Etherphase entfernt. Die wässrige Phase wird mit Ether
gewaschen und getrocknet (5 Minuten in einer Speedvac bei Umgebungstemperatur).
-
Die
Größenverteilung
der wässrigen
Tröpfchen
in den Emulsionen wurde durch Laserbeugung bestimmt, indem ein Coulter
LS230-Partikelgrößenanalysator
verwendet wurde. Ein Aliquot der Emulsion, frisch verdünnt (1:10)
in Mineralöl,
wird zu der Mikrovolumenkammer, die gerührtes Mineralöl enthält, zugegeben. Die
Ergebnisse werden analysiert mit dem in das Instrument eingebauten
optischen Mie-Modell, wobei Brechungsindizes von 1,468 für Mineralöl und 1,350
für die
wässrige
Phase verwendet werden. Die Größenverteilung
der wässrigen
Tröpfchen
in der Emulsion ist in 2 gezeigt. Die Zugabe von Natriumdeoxycholat
verändert
die Größenverteilung
nicht signifikant.
-
Beispiel 2.
-
Effiziente in vitro-Transkriptionsreaktionen,
durchgeführt
in den wässrigen
Mikrokapseln einer Wasser-in-Öl-Emulsion.
-
Um
innerhalb jeder Mikrokapsel RNA ausgehend von DNA zu erzeugen, muss
das einzige Molekül
an DNA, das innerhalb jeder wässrigen
Mikrokapsel des Systems vorliegt, effizient transkribiert werden.
Hierin wird eine in vitro-Transkription innerhalb von Mikrokapseln
demonstriert.
-
Der
katalytische Kern des selbstspleißenden Tetrahymena-Introns
ist ein viel untersuchtes Ribozym, welches eine Vielzahl von Phosphoestertransferreaktionen
katalysieren kann (Sag et al., 1986; Sag und Czech, 1986; Sag und
Czech, 1986). Beispielsweise kann ein modifiziertes Tetrahymena-Intron,
welchem der P1 Stem-loop von dem 5'-Ende fehlt und dem die 3'-Stem-loops P9.1
und P9.2 fehlen, als eine RNA-Ligase fungieren, welche effizient
zwei oder mehrere Oligonukleotide, die an einem Matrizenstrang ausgerichtet
(aligned) sind, zusammen spleißt
(Green und Szostak, 1992).
-
DNA,
welche das oben beschriebene Tetrahymena-Ribozym codiert, wird PCR-amplifiziert,
indem die Primer P2T7Ba (welcher sich an die P2-Loop-Region anlagert
und einen T7-RNA-Polymerasepromoter anhängt) und P9Fo (welcher sich
an die P9-Loop-Region anlagert) verwendet werden. Dieses erzeugt
ein DNA-Fragment mit 331 Basenpaaren, das den T7-RNA-Polymerasepromoter
trägt.
Dieses Fragment wird direkt gereinigt, indem Wizard PCR Preps (Promega)
verwendet werden, und als die Matrize für eine in vitro-Transkriptionsreaktion
unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase verwendet.
-
Die
in vitro-Transkription wird über
eine Anfangsperiode von 10 Minuten getestet, während welcher die Reaktionsgeschwindigkeit
im Wesentlichen linear ist (Chamberlin und Ring, 1973). Die Reaktionsbedingungen für die Transkription
sind wie von Wyatt et al., 1991 beschrieben.
-
Der
Einbau von [γ–32P]-UTP
wird verwendet, um das Fortschreiten der Reaktion zu testen.
-
Eine
Transkriptionsreaktion wird in einem Volumen von 200 μl angesetzt
und in 2 Aliquots unterteilt, die jeweils 3 × 1011 Moleküle DNA (5
nM) enthalten. Ein 100 μl-Aliquot
wird zu 2 ml leichtem Mineralöl
von Sigma, das 4,5% Span 80 und 0,5% Tween 80 enthält, zugegeben
und für
5 Minuten mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 20.000 Upm
wie in Beispiel 1 homogenisiert. Auf der Basis des mittleren Mikrokapselvolumens
bei diesen Emulsionen (2,8 × 10–19 m3 für
einen Mikrokapseldurchmesser von 0,81 μm) würde die 100 μl-Reaktion
in 3,6 × 1011 Mikrokapseln unterteilt. Damit sollte
es im Durchschnitt 1 Molekül
DNA pro Mikrokapsel geben.
-
Beide
Aliquots werden in einem Wasserbad mit 37°C inkubiert. 0,5 ml-Proben der
Emulsion werden sowohl vor dem Start der Inkubation als auch nach
10 Minuten entnommen und auf Eis gestellt. Ähnliche 25 μl-Proben werden zur selben Zeit
aus den nicht emulgierten Kontrollreaktionen entnommen. Die Emulsionen werden
aufgebrochen und die Reaktionen mit 0,5 ml EDTA (50 mM) und 2 ml
wassergesättigtem
Diethylether wie in Beispiel 1 beschrieben gestoppt. Dann werden
100 μl Lachssperma-DNA
(500 μg/ml)
in 20 mM EDTA zugegeben. Drei 100 μl-Aliquots werden dann sowohl
aus den Emulsionen als auch den Kontrollen entnommen, und markierte
RNA wird durch TCA-Fällung
und Szintillationszählung
getestet.
-
Die
Geschwindigkeit der Transkription wird als die Zunahme bei den in
Säure wahrnehmbaren
cpm über
die 10 Minuten Inkubation bei 37°C
genommen. In der nicht emulgierten Kontrollreaktion gibt es 442.000 cpm
in Säure
wahrnehmbares Material im Vergleich zu 147.000 cpm in der Emulsion.
Damit beträgt
die Geschwindigkeit der Transkription in der Emulsion 33% von der,
die in der nicht emulgierten Kontrollreaktion gefunden wird.
-
Diese
Prozedur zeigt daher, dass RNA effizient durch T7-RNA-Polymerase
in den wässrigen
Mikrokapseln einer Wasser-in-Öl-Emulsion
synthetisiert werden kann.
-
Beispiel 3.
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Effizient gekoppelte in vitro-Transkriptions/Translationsreaktionen,
durchgeführt
in den wässrigen
Mikrokapseln einer Wasser-in-Öl-Emulsion.
-
Um
Proteine zu synthetisieren, indem die Prozedur der vorliegenden
Offenbarung verwendet wird, muss die Translation in den wässrigen
Mikrokapseln der hierin beschriebenen Wasser-in-Öl-Emulsion aktiv sein.
-
Hier
wird gezeigt, wie ein Protein (E. coli-Dihydrofolatreduktase) effizient
aus DNA in den wässrigen Mikrokapseln
eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems
erzeugt werden kann, indem ein gekoppeltes Transkriptions/Translationssystem
verwendet wird.
-
Das
E. coli folA-Gen, welches Dihydrofolatreduktase (DHFR) codiert,
wird PCR-amplifiziert, indem die Oligonukleotide EDHFRFo und EDHFRBa
verwendet werden. Diese DNA wird dann in den pGEM-4Z-Vektor (Promega),
der mit HindIII und KpnI verdaut wurde, stromabwärts von sowohl dem lac-Promoter
als auch dem T7-RNA-Polymerase-Promoter kloniert. Das Oligonukleotid
EDHFRBa hängt
die effiziente Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle stromaufwärts des
DHFR-Startcodons an.
-
Die
DNA-Sequenzierung identifiziert einen Klon, welcher die korrekte
Nukleotidsequenz aufweist. Es wird gefunden, dass Bakterien, die
mit diesem Klon (pGEM-folA) transformiert sind, aktive DHFR überexprimieren
(angetrieben von dem lac-Promoter), wenn sie mit IPTG induziert
werden.
-
Das
pGEM-folA-Plasmid wird dann PCR-amplifiziert, indem die Primer LMB2
und LMB3 unter den oben beschriebenen Bedingungen verwendet werden,
um ein DNA-Fragment mit 649 bp zu erzeugen, das den T7-RNA-Polymerase-Promoter,
die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle
und das folA-Gen trägt.
Dieses PCR-Fragment wird direkt gereinigt, indem Wizard PCR Preps
(Promega) verwendet werden, und verwendet, um ein prokaryotisches
gekoppeltes in vitro-Transkriptions/Translationssystem zu programmieren,
das für
linear Matrizen entworfen wurde (Lesley, Brow und Burgess, 1991).
-
Eine
kommerzielle Präparation
dieses Systems wird verwendet (E. coli S30 Extract System for Linear Templates;
Promega), das mit T7-RNA-Polymerase ergänzt ist.
-
Eine
300 μl-Translationsreaktion
wird auf Eis angesetzt, die 3 × 1012 Moleküle
DNA enthält. T7-RNA-Polymerase
(104 Einheiten) wird zugegeben, um die Transkription
anzutreiben, und das translatierte Protein wird durch die Zugabe
von [35S]-Methionin markiert. Ein 150 μl-Aliquot
dieser Reaktion wird zu 2,85 ml leichtem Mineralöl von Sigma, das 4,5% Span
80 und 0,5% Tween 80 enthält,
zugegeben und für
1 Minute mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 20.000 Upm
wie in Beispiel 1 homogenisiert. Das andere Aliquot wird nicht emulgiert.
-
Auf
der Basis des mittleren Mikrokapselvolumens bei den Emulsionen (1,1 × 10–18 m3 für
eine Mikrokapsel mit einem Durchmesser von 1,29 μm) würde die 150 μl-Reaktion
in 1,3 × 1011 Mikrokapseln unterteilt. Damit sollte
es im Durchschnitt ungefähr
11 Moleküle
DNA pro Mikrokapsel geben.
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Vier
0,5 ml-Aliquots werden aus der Emulsionsreaktionsmischung entnommen.
Ein Aliquot wird unmittelbar auf Eis gestellt und die anderen drei
werden in einem Wasserbad mit 25°C
für 2 Stunden
inkubiert, bevor sie auf Eis gestellt werden. Vier 25 μl-Proben
werden ebenfalls aus der nicht emulgierten Reaktionsmischung entnommen;
eine wird unmittelbar auf Eis gestellt und die anderen drei werden
in einem Wasserbad mit 25°C für 2 Stunden
inkubiert und dann auf Eis gestellt.
-
Die
Emulsionen werden in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 Upm für 5 Minuten
bei 4°C
abzentrifugiert und das Mineralöl
entfernt, was die konzentrierte (aber immer noch intakte) Emulsion
am Boden des Röhrchens
zurücklässt. Nach
kurzem erneuten Abzentrifugieren und Entfernung von jeglichem weiteren
Mineralöl wird
die Emulsion aufgebrochen, und jegliche weitere Translation wird
gestoppt, indem 100 μl
Wasser, das 125 μg/ml
Puromycin enthält,
und 1 ml wassergesättigter
Diethylether zugegeben werden. Diese Mischung wird gevortext und
erneut in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 Upm für 1 Minute bei 4°C abzentrifugiert.
Der Ether und gelöstes
Mineralöl
werden dann durch Absaugen entfernt und die Extraktion mit einem
weiteren 1 ml Ether wiederholt. Jeglicher verbleibende Ether wird
durch Abzentrifugieren für
5 Minuten in einer Speedvac bei Raumtemperatur abgetrieben.
-
100 μl Wasser,
das 125 μg/ml
Puromycin enthält,
wird ebenfalls zu den 25 μl
nicht emulgierter Kontrollreaktionen zugegeben. 25 μl von jeder
der Proben werden dann mit Aceton ausgefällt und auf einem 20% SDS-PAGE-Gel
entsprechend den Anleitungen, die von den Herstellern des in vitro-Transkriptions/Translationssystems
(Promega) angegeben werden, laufen gelassen. Das Gel wird getrocknet
und unter Verwendung eines Phosphorlmager (Molecular Dynamics) gescannt.
Eine einzelne starke Bande wird mit dem erwarteten Molekulargewicht
von DHFR (18 kd) bei sowohl den Reaktionen, die in Emul sionen durchgeführt wurden,
als auch den Kontrollen beobachtet. Diese Bande wird genau quantifiziert.
-
Bei
den emulgierten Reaktionen beträgt
die mittlere Fläche
unter dem 18 kd-Peak 15.073 Einheiten, während die mittlere Fläche unter
demselben Peak bei den nicht emulgierten Kontrollreaktionen 18.990
Einheiten beträgt.
Damit wird bei den emulgierten Reaktionen die Menge an DHFR-Protein
auf 79% von der berechnet, die bei den nicht emulgierten Kontrollreaktionen
gefunden wird. Dieses zeigt daher, dass das Transkriptions/Translationssystem
in dem Wasser-in-Öl-Emulsionssystem
der vorliegenden Offenbarung funktionsfähig ist.
-
Beispiel 4.
-
Dihydrofolatreduktase, die unter Verwendung
der gekoppelten in vitro-Transkriptions/Translationsreaktionen erzeugt
wurde, ist aktiv.
-
Hier
wird gezeigt, dass Protein (E. coli-Dihydrofolatreduktase) effizient
in einer katalytisch aktiven Form durch gekoppelte Transkription/Translation
des folA-Gens in den wässrigen
Mikrokapseln eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems
erzeugt werden kann. In diesem Test wird eine Emulsion, die Mikrokapseln
unterhalb der optimalen Größe umfasst,
verwendet; es wird gezeigt, dass die DHFR-Aktivität bei den
größeren Mikrokapselgrößen höher ist.
-
175 μl Translationsreaktionen
(unmarkiert) werden auf Eis angesetzt, die entweder 2 × 1011, 6 × 1012 oder 1,8 × 1012 Moleküle der folA-Matrizen-DNA,
die in Beispiel 3 verwendet wurde, oder keine DNA enthalten. T7-RNA-Polymerase
(6 × 103 Einheiten) wird zu jeder Reaktion zugegeben,
um die Transkription anzutreiben.
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Ein
100 μl-Aliquot
jeder Reaktion wird zu 1,9 ml leichtem Mineralöl von Sigma, das 4,5% Span
80 und 0,5% Tween 80 enthält,
zugegeben und für
1 Minute oder 5 Minuten mit einem Ultra-Turrax T25-Homogenisator,
welcher mit einem Dispergierwerkzeug mit 8 mm Durchmesser ausgerüstet ist,
bei 20.000 Upm wie in Beispiel 1 homogenisiert. Nach Homogenisation
für 1 Minute
beträgt
der mittlere Durchmesser der Partikel (bezogen auf das Volumen)
1,30 μm
(Median 1,28 μm).
98 Volumen-% der inneren (wässrigen)
Phase liegen in Partikeln vor, die von 0,63 μm bis 2,12 μm variieren. Nach Homogenisation
für 5 Minuten
beträgt
der mittlere Durchmesser der Mikrokapseln (bezogen auf das Volumen) 0,81 μm (Median
0,79 μm)
und 98 Volumen-% der inneren (wässrigen)
Phase liegen in Partikeln vor, die von 0,41 μm bis 1,38 μm variieren.
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Auf
der Basis des mittleren Mikrokapselvolumens bei den 1 Minuten-Emulsionen
(1,1 × 10–18 m3 für eine
Mikrokapsel mit 1,299 μm
Durchmesser) würde
die 100 μl-Reaktion
in 8,7 × 1010 Mikrokapseln unterteilt werden. Damit
sollte es ungefähr
1,3, 3,9 oder 11,8 Moleküle
DNA pro Mikrokapsel geben.
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Auf
der Basis des mittleren Mikrokapselvolumens bei den 5 Minuten-Emulsionen
(2,8 × 10–19 m3 für eine
Mikrokapsel mit 0,81 μm
Durchmesser) würde
die 100 μl-Reaktion
in 3,6 × 1011 Mikrokapseln unterteilt werden. Damit
sollte es ungefähr
0,3, 1,0 oder 2,9 Moleküle
DNA pro Mikrokapsel geben.
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Die
Emulsionen und die nicht emulgierte Reaktionsmischung werden in
einem Wasserbad mit 25°C inkubiert.
0,5 ml-Proben der Emulsion werden unmittelbar vor dem Start der
Inkubation und nach 2 Stunden entnommen und auf Eis gestellt. 25 μl-Proben
werden zu denselben Zeiten aus den nicht emulgierten Kontrollreaktionen
entnommen.
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Die
Emulsionen werden in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 Upm für 5 min
bei 4°C
abzentrifugiert und das Mineralöl
durch Absaugen entfernt, was die konzentrierte (aber immer noch
intakte) Emulsion am Boden des Röhrchens
zurücklässt. Nach
kurzem erneuten Abzentrifugieren und Entfernung von jeglichem weiteren Mineralöl wird die
Emulsion aufgebrochen, und jegliche weitere Translation wird gestoppt,
indem 100 μl
Puffer A (100 mM Imidazol pH 7,0, 10 mM β-Mercaptoethanol), der 125 μg/ml Puromycin
enthält,
und 1 ml wassergesättigter
Diethylether zugegeben werden. Die Mischung wird gevortext und in
einer Mikrozentrifuge bei 13.000 Upm für 1 min bei 4°C abzentrifugiert.
Der Ether und gelöstes
Mineralöl
werden durch Absaugen entfernt, und die Extraktion wird mit einem
weiteren 1 ml Ether wiederholt. Jeglicher verbleibende Ether wird
durch Abzentrifugieren für
5 Minuten in einer Speedvac bei Raumtemperatur abgetrieben. 100 μl Puffer
A, der (125 μg/ml)
Puromycin enthält,
wird ebenfalls zu den nicht emulgierten 25 μl-Kontrollreaktionen zugegeben.
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Die
Dihydrofolatreduktaseaktivität
wird durch spektrophotometrisches Überwachen der Oxidation von NADPH
zu NADP bei 340 nm über
einen Zeitverlauf von 10 Minuten getestet, wie von Williams et al.,
1979; Ma et al., 1993 beschrieben wird. 10 μl jeder gequenchten in vitro-Translationsreaktion
werden zu 150 μl
Puffer A (100 mM Imidazol, pH 7,0, 10 mM β-Mercaptoethanol) und 20 μl 1 mM NADPH
zugegeben. 20 μl
Dihydrofolat (1 mM) (H2F) werden nach 1
Minute zugegeben und die Reaktion bei 340 nm unter Verwendung eines
ThermoMax Mikroplattenlesegeräts
(Molecular Devices) überwacht.
Die Aktivität
wird durch die Anfangsgeschwindigkeiten unter Bedingungen (νmax)
von So>>KM berechnet.
Die Hintergrundaktivität
in dem S30-Extrakt wird von allen Proben abgezogen.
-
Die
DHFR-Aktivität,
die in den Emulsionen erzeugt wird, wird aus der Differenz bei der
Aktivität,
die nach 0 Stunden und 2 Stunden Inkubation gemessen wird, entnommen.
Keine Zunahme bei der NADPH-Oxidation trat zwischen den Proben nach
0 Stunden und 2 Stunden auf, wenn 0,1 μM Methotrexat (ein spezifischer Inhibitor
der DHFR) zugegeben wurde, was zeigt, dass die gesamte Zunahme bei
der NADPH-Oxidation, die beobachtet wird, auf DHFR beruht, die in
den in vitro-Translationsreaktionen erzeugt wurde.
-
Bei
der Verwendung einer Homogenisation von 1 Minute bei 20.000 Upm
beträgt
die DHFR-Aktivität, die
in den Emulsionen mit 1,3 Molekülen
DNA pro Mikrokapsel erzeugt wurde, 31% von der, die in den nicht emulgierten
Kontrollreaktionen gefunden wurde; 45% mit 3,9 Molekülen DNA
pro Mikrokapsel; und 84% mit 11,8 Molekülen DNA pro Mikrokapsel.
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Bei
der Verwendung einer Homogenisation von 5 Minuten bei 20.000 Upm
beträgt
die DHFR-Aktivität, die
in den Emulsionen mit 0,3 Molekülen
DNA pro Mikrokapsel erzeugt wurde, 7% von der, die in den nicht emulgierten
Kontrollreaktionen gefunden wurde; 15% mit 1 Molekül DNA pro
Mikrokapsel; und 35% mit 2,9 Molekülen DNA pro Mikrokapsel, im
Durchschnitt.
-
Unter
der Annahme, dass die Wechselzahl von DHFR so ist, wie sie von Posner
et al., 1996, beschrieben wird, entspricht dieses einer Ausbeute
bei der höchsten
DNA-Konzentration von 6,3 μg
(340 pmol) DHFR pro 100 μl-Reaktion
(nicht emulgierte Kontrolle), 1,98 μg (104 pmol) DHFR pro 100 μl-Reaktion
(emulgiert für 1
min) oder 0,46 μg
(24,8 pmol) DHFR pro 100 μl-Reaktion
(emulgiert für
5 Minuten). Dieses entspricht 74 Molekülen DHFR pro Mikrokapsel bei
den 1 Minuten-Emulsionen und 44 Molekülen pro Mikrokapsel bei den
5 Minuten-Emulsionen (unter der Annahme, dass alle Mikrokapseln
von mittlerer Größe sind).
-
Die
DHFR-Aktivität,
die aus der gekoppelten Transkription/Translation der folA-Gene
resultiert, wird ebenfalls in den größeren Mikrokapseln gemessen,
welche allein durch Rühren
oder durch Rühren
gefolgt von einer weiteren Homogenisation mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer
bei 8.000 Upm, 9.000 Upm oder 13.500 Upm für 1 Minute wie in Beispiel
1 beschrieben erzeugt wurden. Die Ergebnisse sind in 2b dargestellt. Die verwendete Konzentration
der folA-Gene (2,5 nM) ergibt einen Durchschnitt von 1, 1,5 und
4,8 genetischen Elementen pro Tröpfchen
in den Emulsionen, die bei 13.500 Upm, 9.500 Upm bzw. 8.000 Upm
homogenisiert wurden, und einen Durchschnitt von 14 genetischen
Elementen pro Tröpfchen
in der Emulsion, die nur durch Rühren
hergestellt wurde. Eine Zugabe von Natriumdeoxycholat (0,5%) zu
der in vitro-Translationsreaktionsmischung beeinflusst die DHFR-Aktivität, die in
den aufgebrochenen Emulsionen beobachtet wird, nicht signifikant.
-
Beispiel 5.
-
Verknüpfung
eines immobilisierten Substrats mit einem genetischen Element über ein
Protein mit hohem Molekulargewicht.
-
Um
mehrere immobilisierte Substratmoleküle mit einem DNA-Fragment zu
verknüpfen,
welches das folA-Gen umfasst, wird das DNA-Fragment zuerst biotinyliert
und dann an einen Komplex von Avidin mit Apoferritin gekoppelt.
Apoferritin aus der Milz von Pferden ist ein großes, nahezu kugelförmiges Proteinmolekül mit 12,5
nm Durchmesser, welches daher mehrere Stellen bietet, die mit Substrat
derivatisiert werden können
(z.B. die ε-Aminogruppe
von Oberflächenlysinen).
Das pGEM-folA-Plasmid, welches DHFR von E. coli codiert, wird PCR-amplifiziert,
indem die Primer LMB3 und 5'-biotinyliertes
LMB2 (LMB2-Biotin)
verwendet werden, um ein biotinyliertes DNA-Fragment mit 649 bp
zu erzeugen, welches den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen
10-Translationsstartstelle und das folA-Gen trägt (siehe Beispiel 3). Die
DNA wird radiomarkiert, indem die 500 μl-PCR-Reaktionsmischung mit 100 μCi [α-32P]dCTP (Amersham; 3000 Ci/mmol) ergänzt wird.
Das biotinylierte PCR-Fragment wird direkt gereinigt, indem Wizard
PCR Preps (Promega) verwendet werden, und die Konzentration wird
spektrophotometrisch bestimmt. Der Prozentsatz an biotinylierter
DNA wird durch Binden an Streptavidin M-280 Dynabeads (Dynal) und
Szintillationszählung
getestet. Es wird unter Verwendung dieser Technik bestimmt, dass
83% der DNA biotinyliert sind.
-
Das
maskierte Eisen wird aus einem kommerziellen Konjugat von Avidin
und Ferritin (Avidin-Ferritin; ungefähr 1,1 Mol Ferritin pro Mol
Avidin; Sigma) durch Dialyse über
Nacht (4°C)
einer Lösung
von Avidin-Ferritin in PBS (1 mg/ml) gegen 0,12 M Thioglycolsäure, pH
4,25, gefolgt von 24 Stunden Dialyse gegen PBS (4°C) wie von
Kadir und Moore, 1990 beschrieben, entfernt. Die Entfernung von
Eisen wird durch Analyse der Extinktionsspektren überprüft (maskiertes
Fe(III) absorbiert stark bei 310-360 nm).
-
0,3
pmol radiomarkierte, biotinylierte DNA wird mit variierenden Molverhältnissen
von Avidin-Apoferritin in PBS (Gesamtvolumen 9 μl) für 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Ein 4,5 μl-Aliquot
wird entnommen und der Prozentsatz von DNA, die mit Avidin-Apoferritin komplexiert
ist, unter Verwendung des Bandenverschiebungstests auf einem 1,5%
Agarosegel wie von Berman et al., 1987 beschrieben getestet. Das
Gel wird dann getrocknet und unter Verwendung eines Phosphorlmager
(Molecular Dynamics) gescannt. Der Prozentsatz an DNA, die nicht
verschoben wird (d.h. nicht mit Avidin-Apoferritin komplexiert ist),
beträgt
17% (1:1 Molverhältnis
Avidin-Apoferritin:DNA), 15% (5:1 Molverhältnis Avidin-Apoferritin:DNA)
oder 14% (25:1 Molverhältnis
Avidin-Apoferritin:DNA). Dieses bedeutet, dass selbst bei einem
Verhältnis
von 1:1 von Avidin-Apoferritin:DNA praktisch die gesamte biotinylierte
DNA gebunden ist. Keine Verschiebung der Banden wird beobachtet,
wenn biotinylierte DNA mit Apoferritin gemischt wird oder wenn nicht
biotinylierte DNA mit Avidin-Apoferritin gemischt wird.
-
Die
verbleibenden 4,5 μl
DNA, die mit Avidin-Apoferritin komplexiert sind, werden als die
Matrize für eine
25 μl-in
vitro-Transkriptions/Translationsreaktion verwendet (E. coli S30
Extract System for Linear Templates; Promega). Nach 2 Stunden bei
25°C wird
die Reaktion gestoppt, indem 100 μl
Puffer A, der Puromycin (125 μg/ml)
enthält,
zugegeben werden. Die Dihydrofolatreduktaseaktivität wird wie
oben getestet, indem spektrophotometrisch die Oxidation von NADPH
zu NADP bei 340 nm über
einen Zeitverlauf von 10 Minuten überwacht wird.
-
10 μl von jeder
in vitro-Translationsreaktion werden zu 150 μl Puffer A und 20 μl NADPH (1
mM) zugegeben. 20 μl
Dihydrofolat (1 mM) (die Emulsionen wurden aufgebrochen und die
Reaktionen wurden mit 0,5 ml EDTA (50 mM) und 2 ml wassergesättigtem
Diethylether wie in Beispiel 1 beschrieben gestoppt) werden nach
1 Minute zugegeben und die Reaktion bei 340 nm unter Verwendung
eines ThermoMax-Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices) überwacht.
Es wird selbst bei dem höchsten
Verhältnis
Avidin-Apoferritin: DNA im Vergleich zu einer Kontrolle ohne zugegebenes
Avidin-Apoferritin keine Differenz bei der DHFR-Aktivität gefunden.
Dieses zeigt, dass die überwiegende
Mehrheit der DNA komplexiert werden kann, ohne die Effizienz der
in vitro-Translation zu beeinträchtigen.
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Beispiel 6.
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Sowohl die in vitro-Transkription-Translation
als auch die DHFR-Aktivität
sind in demselben System vereinbar.
-
Um
auf die Aktivität
von DHFR zu selektieren, die in situ durch gekoppelte Transkription-Translation erzeugt
wurde, müssen
sowohl die Transkriptions-Translationsreaktion als auch die DHFR
in demselben Puffersystem aktiv sein.
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Ein
direkter Test auf DHFR-Aktivität
in einem vollständigen
E. coli in vitro-Translationssystem, der auf der spektrophotometrischen Überwachung
der Oxidation von NADPH zu NADP bei 340 nm basiert, ist aufgrund
der Trübung
der S30-Extrakte nicht praktikabel.
-
Jedoch
ist es möglich,
sicherzustellen, dass DHFR in demselben Puffersystem aktiv ist wie
die in vitro-Translation. E. coli-DHFR wird durch IPTG-Induktion
von Bakterien, welche das Plasmid pGEM-folA enthalten, erhalten
und auf einer Methotrexat-Sepharose-Säule
affinitätsgereinigt
(Baccanari et al., 1977).
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Die
DHFR-Aktivität
wird in Puffer A wie oben oder in einer in vitro-Translationsmischung
verglichen, die vollständig
ist, außer
dass der S30-Dialysepuffer (Lesley 1995) (10 mM Tris-Acetat pH 8,0,
14 mM Magnesiumacetat, 60 mM Kaliumacetat, 1 mM DTT) die S30-Fraktion ersetzt.
In jedem Fall beträgt
das gesamte Reaktionsvolumen 200 μl,
und die Konzentration von NADPH [und die Emulsionen wurden aufgebrochen
und die Reaktionen wurden gestoppt mit 0,5 ml EDTA (50 mM) und 2
ml wassergesättigtem
Diethylether wie in Beispiel 1 beschrieben] jeweils 0,1 mM. Die
Reaktionen werden spektrophotometrisch bei 340 nm überwacht.
Die Zugabe von 1,75 pmol (1,3 m Einheiten) E. coli-DHFR ergibt Anfangsraten
von –25,77
mOD/min (in Puffer A) und –11,24
mOD/min (in Translationspuffer); somit ist die Reaktion zu 44% so
effizient in dem Translationspuffer wie in einem optimierten Puffer
(Puffer A).
-
Weiterhin
verursacht das Vorliegen der Substrate von DHFR (NADPH und H2F) in einer Konzentration von 0,1 mM (entweder
allein oder in Kombination) keinerlei Inhibition der Erzeugung von
aktiver DHFR aus einer 2stündigen
gekoppelten Transkriptions-Translationsreaktion.
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Beispiel 7.
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Die Aktivität von DHFR auf einem genetischen
Element, das ein immobilisiertes Dihydrofolatsubstrat enthält, führt zu der
Bildung eines Tetrahydrofolatprodukts, das mit der Nukleinsäure, die
DHFR codiert, verknüpft
ist.
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Es
wird ein Peptid synthetisiert, welches drei Glutaminsäuren, die über ihre γ-Carboxylate
(unter Verwendung von N-Fluorenylmethoxycarbonyl-Glutaminsäure-α-Benzylester
als einem Ausgangsmaterial) mit einem Lysin an dem Carboxyterminus
verknüpft
sind, und Biotin, das mit seiner ε-Aminogruppe
verknüpft
ist, indem veröffentlichte
Verfahren (Krumdiek et al., 1980) modifiziert wurden, umfasst. Folsäure wird
mit dem Aminoterminus verknüpft
und die Benzyl- und Trifluoracetamid-Schutzgruppen durch alkalische
Hydrolyse wie vorher beschrieben entfernt. Das Peptid wird durch
Umkehrphasen-HPLC gereinigt und durch Massen- und UV-Spektroskopie
charakterisiert. Dieses Folsäurepeptid
wird chemisch zu dem entsprechenden Dihydrofolsäurepeptid (indem Dithionat
und Ascorbinsäure
verwendet werden) und dann zu dem entsprechenden Tetrahydrofolsäurepeptid
reduziert (indem Natriumborhydrid verwendet wird), wobei veröffentlichte
Verfahren (Zakrzewski et al., 1980) verwendet werden. Diese Transformationen
werden durch UV-Spektroskopie
charakterisiert.
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Ein
genetisches Element wird konstruiert, indem im Durchschnitt zwei
bis drei Moleküle
des Folsäurepeptids
mit Avidin (oder Streptavidin) zusammen mit einem Molekül der DHFR-codierenden,
PCR-amplifizierten DNA aus dem Plasmid pGEM-folA verknüpft werden,
indem die Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO: 9) und LMB3 verwendet werden
(siehe Beispiel 3). Die immobilisierte Folsäure wird chemisch zu Dihydrofolat
reduziert, indem Dithionat und Ascorbinsäure verwendet werden, und durch
Dialyse gegen Puffer A gereinigt. E. coli-DHFR wird durch IPTG-Induktion
von Bakterien, die das Plasmid pGEM-folA enthalten, erhalten und
auf einer Methotrexat-Sepharose-Säule affinitätsgereinigt. Es wird gezeigt,
dass E. coli-DHFR mit der Dihydrofolsäure, die an diesem genetischen
Element immobilisiert ist, reagiert, indem die Oxidation von NADPH
zu NADP spektrophotometrisch überwacht
wird, wobei 0-10 μM
des Avidin-verknüpften
Dihydrofolsäurepeptids und
0-50 μM
NADPH verwendet werden. Damit ist am Ende dieser Reaktion das Produkt Tetrahydrofolat
mit dem folA-Gen, welches für
das Enzym (d.h. DHFR) codiert, das dessen Bildung katalysiert, verknüpft.
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Um
jene Gene zu isolieren, die an dem Tetrahydrofolatprodukt befestigt
sind, gibt es zwei Ansätze.
Der erste beinhaltet die Erzeugung von Phagen-Display-Antikörpern, die
für Tetrahydrofolat
spezifisch sind (Hoogenboom, 1997). Der zweite Ansatz basiert auf
der Verwendung eines markierten Reagenzes, welches spezifisch mit
dem immobilisierten Produkt, nicht aber mit dem Substrat, reagiert.
Wir haben ein Molekül
synthetisiert, welches aus einer Dinitrophenyl(DNP)-Markierung besteht,
die über
einem Spacer mit 14 Atomen mit Benzaldehyd verknüpft ist. Die Aldehydgruppe
reagiert spezifisch mit Tetrahydrofolat, um ein kovalentes Addukt
zu bilden (Kallen und Jencks, 1966), und eine Affinitätsreinigung
kann durchgeführt
werden, indem ein anti-DNP-Antikörper
verwendet wird.
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Beispiel 8.
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Ein alternatives Verfahren zur Selektion
auf DHFR-Aktivität
-
Auf
die DHFR-katalysierte Reaktion kann durch eine in situ-Kopplung
mit einer zweiten Reaktion, die durch Hefealdehyddehydrogenase katalysiert
wird, mit einem „markierten" Substrat selektiert
werden.
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Anstelle
des Selektierens im Hinblick auf Gene, die mit einem der Produkte
der DHFR-Reaktion (5,6,7,8-Tetrahydrofolat
oder NADP+) verbunden sind, wird die DHFR-Reaktion
mit einer zweiten Reaktion gekoppelt. Die Selektion wird in diesem
Fall durch die Bildung des zweiten Produkts der DHFR-katalysierten
Reaktion-Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP+)
vermittelt.
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Die
Reaktion, die wir zur Kopplung ausgewählt haben, wird durch Hefealdehyddehydrogenase
(YAD; EC 1.2.1.5) katalysiert. Dieses Enzym verwendet entweder NAD+ oder NADP+ bei
der Oxidation eines weiten Bereichs von aliphatischen und aromatischen
Aldehyden zu ihren entsprechenden Carbonsäuren, was NADH oder NADPH in
dem Prozess erzeugt. Die Reaktion hat den großen Vorteil, dass sie im Wesentlichen
irreversibel ist – Dehydrogenasen
(einschließlich
DHFR und YAD) katalysieren nämlich
nicht die Reduktion der Säure zurück zu dem
Aldehyd. Da eine große
Anzahl von Enzymen, die Redoxreaktionen katalysieren, NAD+ oder NADP+ erzeugen,
kann die YAD-Reaktion ebenfalls bei der Selektion dieser Enzyme
verwendet werden und ist nicht nur auf die Selektion auf Dihydrofolatreduktase
beschränkt.
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Ein
Pentaaldehydsubstrat wird synthetisiert und mit einer DNP (Dinitrophenyl)-Markierung über einen C20-Linker verknüpft (im Folgenden DNP-PA).
Die Oxidation von DNP-PA zu der entsprechenden Säure (DNP-PC) wird durch HPLC
verfolgt (Umkehrphasen-C18-Säule; H2O/CH3CN-Gradient + 0,1% Trifluoressigsäure; Retentionszeiten:
DNP-PA, 5,0 min; DNP-PC, 4,26 min). Die Umwandlung von DNP-PA zu
DNP-PC wird nur in Gegenwart von sowohl YAD als auch NADP+ beobachtet. Die Reaktionen werden ebenfalls
spektrophotometrisch verfolgt; die Zunahme der Extinktion bei 340
nm zeigte, dass NADP+ gleichzeitig zu NADPH umgewandelt
wird.
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Die
gekoppelte DHFR-YAD-Reaktion wird verfolgt, indem derselbe HPLC-Test
verwendet wird. Die anfängliche
Reaktionsmischung enthielt die Substrate für DHFR – NADPH (50 μM) und 7,8-Dihydrofolat
(H2F; 50 μM),
YAD (Sigma, 0,5 Einheiten) und DNP-PA (50 μM) in Puffer pH 7,7 (100 mM
Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol
und 25 mM KCl). Eine Umwandlung von DNP-PA zu DNP-PC wird beobachtet,
wenn DHFR zu der obigen Reaktionsmischung zugegeben wird (DHFR 5
nM, 83 %; 1,25 nM, 14,5 % nach 32 min).
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Die
Konzentration von DHFR, die bei der kompartimentierten in vitro-Translation
erhalten wird, ist in der Tat viel höher als 5 nM (siehe Beispiel
4). Die Umwandlung von DNP-PA zu DNP-PC ist vernachlässigbar in
Abwesenheit von DHFR oder wenn Methotrexat (MTX) – ein potenter
Inhibitor des Enzyms – vorliegt
(10 μM).
So ist die Bildung des sekundären
Produkts, DNP-PC, daher mit dem Vorliegen der DHFR verknüpft.
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Unter
Verwendung dieser gekoppelten Reaktion können Proteine, die DHFR-Aktivität verleihen,
selektiert werden durch: i) Verknüpfen der Gene mit Antikörpern, die
spezifisch das Carboxylprodukt von DNP-PA binden, und ii) Isolieren
dieser Gene durch Affinitätsreinigung
unter Verwendung eines anti-DNP-Antikörpers.
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Dieser
Ansatz wird durch einen routinemäßigen Immunoassay
demonstriert, welcher auf dem catELISA (Tawfik et al., 1993) basiert.
Mikrotiterplatten werden mit anti-Kaninchen-Immunglobulinen (Sigma, 10 μg/Vertiefung)
beschichtet, worauf polyklonales Kaninchenserum folgt, das spezifisch
Glutarsäurederivate
bindet (Tawfik et al., 1993), verdünnt 1:500 in Phosphatsalzpuffer
+ 1 mg/ml BSA). Die Platten werden gespült und mit BSA blockiert. Die
oben beschriebenen gekoppelten Reaktionsmischungen werden in Tris/BSA-Puffer (50
mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, 10 mg/ml BSA, pH 7,4) verdünnt und
für 1 h
inkubiert. Die Platte wird gespült,
und ein anti-DNP-Antikörper
(monoklonaler Maus-SPE21.11), der in demselben Puffer verdünnt ist (1:10.000),
wird zugegeben und für
eine Stunde inkubiert. Die Platte wird gespült und Peroxidase-markierter anti-Maus-Antikörper (Jackson)
wird zugegeben, worauf ein Peroxidasesubstrat (BM Blue; Boehringer
Mannheim) folgt. Ein spezifisches Signal wird nur in den Proben
der gekoppelten Reaktionen, die DHFR (zusätzlich zu H2F,
NADPH, YAD und DNP-PA) enthielten, beobachtet.
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In
hohem Maße
spezifische anti-Carbonsäure-Antikörper (Tawfik
et al., 1993) werden zur Selektion in zwei Formaten verwendet.
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Bei
dem ersten wird der anti-Carbonsäure-Antikörper chemisch
an einen Avidin (oder Streptavidin) mit höherem Molekulargewicht enthaltenden
Komplex, wie z.B. der in Beispiel 5 beschriebene, gekoppelt. Biotinylierte
DNA, welche DHFR codiert, wird über
die Avidin-Biotin-Wechselwirkung wie in Beispiel 5 beschrieben an diesen
Komplex gekoppelt. Dieser Komplex wird dann in einem kompartimentierten
gekoppelten Transkriptions/Translationssystem verwendet, welches
ebenfalls YAD und ein markiertes YAD-Substrat wie z.B. DNP-PA enthält. Wenn
es DHFR-Aktivität
in dem Kompartiment gibt, wird das DNP-PA in DNP-PC umgewandelt.
Die anti-Carbonsäure-Antikörper, gekoppelt
an die DNA über
den Komplex mit hohem Molekulargewicht, werden nur DNP-PC-Moleküle und keine
Aldehydmoleküle
einfangen. DNA aus jenen Kompartimenten, die aktive DHFR enthalten
(und damit aktive DHFR codieren, wenn es nur ein Molekül DNA pro
Kompartiment gibt), werden dann affinitätsgereinigt, indem anti-DNP-Antikörper verwendet
werden.
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Bei
dem zweiten Format werden mehrere Streptavidinmoleküle in einem
Komplex mit hohem Molekulargewicht zusammen gekoppelt, welcher leicht
an biotinylierte DNA, die DHFR codiert, gekoppelt werden kann (siehe
Beispiel 5). Dieser Komplex wird in einem kompartimentierten gekoppelten
Transkriptions/Translationssystem verwendet, welches ebenfalls YAD
und ein YAD-Substrat wie z.B. MeNPOC-Biotin-Benzaldehyd enthält. Die
Biotingruppe in MeNPOC-Biotin-Benzaldehyd ist „in einem Käfig eingeschlossen" („caged") (Sundberg et al.,
1995; Pirrung und Huang, 1996), d.h., sie kann nicht durch Avidin
oder Streptavidin gebunden werden, bis durch Bestrahlung mit Licht
eine durch Licht entfernbare Nitrobenzylgruppe abgespalten wurde.
Wenn es DHFR-Aktivität
in dem Kompartiment gibt, wird der MeNPOC-Biotin-Benzaldehyd in
MeNPOC-Biotin-Benzoesäure
umgewandelt. Nachdem die kompartimentierte Reaktion eine Weile gelaufen
ist, wird die Reaktion mit Licht bestrahlt und die Nitrobenzylgruppe
entfernt, und die Verbindung wird an den Streptavidin-DNA-Komplex
binden. DNA in jenen Kompartimenten, die aktive DHFR enthalten (und
somit aktive DHFR codieren, wenn es nur ein Molekül DNA pro
Kompartiment gibt), wird mit Biotin-Benzoesäure (anstelle von Biotin-Benzaldehyd)
komplexiert und kann affinitätsgereinigt
werden, indem immobilisierte anti-Benzoesäure-Antikörper verwendet werden.
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Das
Vorliegen von anderen Enzymen, welche die Oxidation von NAD+ oder NADP+ zu NADH
oder NADPH in dem in vitro-Transkriptions/Translationssystem katalysieren
können,
kann es unter gewissen Umständen
schwierig machen, dieses YAD-System zur Selektion direkt in dem
kompartimentierten in vitro-Transkriptions/Translationssystem zu
verwenden. In diesem Fall wird die Selektion durchgeführt, indem
das früher beschriebene
Zweischritt-Kompartimentierungssystem verwendet wird. Das heißt, die
DHFR wird zuerst in Kompartimenten translatiert und dann mit der
DNA in demselben Kompartiment mit Hilfe einer geeigneten Affinitätsmarkierung
verknüpft.
Die Emulsion wird aufgebrochen, der Inhalt der Kompartimente gepoolt
und die DNA von den anderen Komponenten des Transkriptions/Translationssystems
(einschließlich
kontaminierender Oxidoreduktasen) weg affinitätsgereinigt, indem Antikörper verwendet
werden, die für
eine Digoxigenin„Markierung" spezifisch sind,
die an einem Ende des DNA-Moleküls
befestigt ist. Die gereinigten DNA-Moleküle, zusammen mit dem befestigten
DHFR-Protein, werden dann in eine Reaktionsmischung gegeben, welche
die Substrate für
DHFR – NADPH
(50 μM)
und 7,8-Dihydrofolat (H2F; 50 μM), YAD (Sigma,
0,5 Einheiten) und DNP-PA (50 μM)
in Puffer pH 7,7 (100 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol und 25 mM KCl)
enthält, und
die Reaktion wird erneut durch Emulgierung kompartimentiert, um
nur eins oder höchstens
einige Moleküle
DNA pro Kompartiment zu ergeben. Anti-Carbonsäure-Antikörper (Tawfik et al., 1993)
werden zur Selektion in jedem der zwei oben beschriebenen Formate
verwendet.
-
Beispiel 9.
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Methylierung der genetischen Elemente
durch Genprodukte
-
DNA-Methyltransferasen,
die durch in vitro-Transkription/Translation in den wässrigen
Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion
erzeugt wurden, methylieren die DNA-Moleküle, welche diese codieren,
in den Kompartimenten.
-
Das
Selektieren von Proteinen mit Bindungs- oder katalytischen Aktivitäten unter
Verwendung des hier beschriebenen Kompartimentierungssystems stellt
zwei grundlegende Anforderungen: i) ein einzelnes Molekül an DNA
(oder höchstens
einige wenige Moleküle),
welches die zu selektierenden Proteine codiert, wird in einer biologisch
aktiven Form durch ein gekoppeltes Transkriptions/Translationssystem
in den wässrigen
Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion
exprimiert; und ii) das zu selektierende Protein muss in der Lage sein,
das genetische Element, das dieses codierte, in einer solchen Weise
zu modifizieren, dass es in einem nachfolgenden Schritt selektierbar
gemacht wird. In diesem Beispiel beschreiben wir eine Gruppe von
Proteinen – DNA-Methyltransferasen
(Typ II) – die
effizient in den wässrigen
Kompartimenten eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems
erzeugt werden, indem ein gekoppeltes Transkriptions/Translationssystem
verwendet wird. Weiterhin modifizieren die in vitro translatierten
DNA-Methyltransferasen die DNA-Moleküle, welche diese codieren,
effizient in situ in den wässrigen
Kompartimenten, so dass sie selektiert und amplifiziert werden können. Die
Targetstellen auf den DNA-Molekülen werden
durch Methylierung eines Cytosins an der C5-Position modifiziert,
was die Stellen resistent gegen eine Spaltung durch die zugehörige Restriktionsendonuklease
macht (d.h. HhaI für
M.HhaI, und HaeIII für
M.HaeIII). Somit ist methylierte DNA gegenüber nicht methylierter DNA
mittels ihrer Resistenz gegenüber
einer Spaltung durch die Restriktionsendonuklease selektierbar.
-
Das
Gen, welches M.HhaI codiert, wird durch PCR unter Verwendung der
Oligonukleotide HhaI-Fo2S und HhaI-Bc direkt aus Haemophilus parahaemolyticus
(ATCC 10014) amplifiziert. Das Gen, welches M.HaeIII codiert, wird
durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide HaeIII-Fo2s und HaeIII-Bc
(SEQ ID NO: 4) direkt aus Haemophilus influenzae (Biogruppe aegyptius)
(ATCC 11116) amplifiziert. Beide PCR-Fragmente werden in den Vektor
pGEM-4Z (Promega), welcher mit HindIII und KpnI verdaut wurde, stromabwärts des lac-Promoters
und des T7-RNA-Polymerase-Promoters kloniert. Die Oligonukleotide
HhaI-Bc und HaeIII-Bc (SEQ ID NO: 4) hängen die effiziente Phage T7-Gen
10-Translationsstartstelle stromaufwärts des Methyltransferasegen-Startcodons
an. Das Oligonukleotid HhaI-Fo hängt
eine HhaI-Methylierungs/Restriktionsstelle (M/R) und eine HaeIII
(INotI)-Stelle an,
welche als Substrate für
M.HhaI bzw. M.HaeIII fungieren sollen. Das Oligo nukleotid HaeIII-Fo
hängt eine
NotI/HaeIII M/R-Stelle an, welche als ein Substrat für M.HaeIII
fungiert (das M.HaeIII-Gen enthält
bereits zwei innere HhaI M/R-Stellen). Eine DNA-Sequenzierung identifiziert
Klone mit der korrekten Nukleotidsequenz.
-
Die
oben beschriebenen Plasmide pGEM-M.HhaI und pGEM-M.HaeIII werden
durch PCR amplifiziert, indem wie oben die Primer LMB2-Biotin (SEQ
ID NO: 9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO: 10) verwendet werden, um entweder
DIG-M.HhaI-Biotin mit 1167 Basenpaaren oder ein DIG-M.HaeIII-Biotin
DNA-Fragment mit 1171 Basenpaaren zu erzeugen, die an einem Ende
durch Biotin und dem anderen Ende durch Digoxigenin markiert sind
und welche den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle,
das Methyltransferasegen und M/R-Stellen von HaeIII und HhaI tragen.
Die PCR-Fragmente werden jeweils unter Verwendung von Wizard PCR
Preps (Promega) direkt gereinigt.
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Die
Gene, die für
die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation von M.EcoRI und
M.EcoRV benötigt werden,
werden durch PCR amplifiziert, indem die Plasmide pMB1 (Betlach
et al., 1976) bzw. pLB1 (Bougueleret et al., 1984) als Matrizen,
ein Rückwartsprimer,
welcher die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle und LMB3 stromaufwärts der
Methyltransferasegen-Ribosomenbindungsstelle (EcoRI-Bc oder EcoRV-Bc)
anhängt,
und ein Vorwärtsprimer
(EcoRI-Fo oder EcoRI-Fo), welcher LMB2 anhängt, verwendet werden. Diese Fragmente
werden weiter durch PCR amplifiziert, indem die Primer LMB2-Biotin
(SEQ ID NO: 9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO: 10) wie oben beschrieben
verwendet werden, um die DNA-Fragmente DIG-M.EcoRI-Biotin and DIG-M.EcoRV-Biotin
zu erzeugen, welche den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen
10-Translationsstartstelle, das Methyltransferasegen und M/R-Stellen
von EcoRI und EcoRV tragen. Diese PCR-Fragmente werden jeweils direkt
unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt.
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Die
oben beschriebenen PCR-amplifizierten DNA-Methylasegene werden in
einem prokaryotischen gekoppelten in vitro-Transkriptions/Translationssystem,
das für
lineare Matrizen entwickelt wurde (Lesley et al., 1991), exprimiert.
Eine kommerzielle Präparation
dieses Systems wird verwendet (E. coli S30 Extract System for Linear
Templates; Promega), das mit T7-RNA-Polymerase und S-Adenosylmethionin
(SAM) in einer Konzentration von 80 μM ergänzt ist.
-
Die
Methylierung wird getestet durch ein Messen der Resistenz der DNA-Fragmente,
die mit DIG und Biotin markiert sind, gegen eine Spaltung durch
das zugehörige
Restriktionsenzym, wobei der DIG-Biotin-ELISA von Boehringer-Mannheim
verwendet wird, oder mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten und
Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. In vitro-Reaktionsmischungen,
die DIG-Biotin-markierte Fragmente enthalten, die wie nachstehend
beschrieben in situ durch gekoppelte in vitro-Transkription-Translation umgesetzt
wurden, werden in 1 × W&B-Puffer (1 M
NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4) + 0,1% Tween-20 (die Konzentration
der DIG/Biotin-markierten DNA in dem Test liegt in dem Bereich von
0-250 pM) verdünnt und
in mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten (hohe Kapazität) für 30-60
min inkubiert. Die Platte wird gespült (3mal 2 × W&B und schließlich mit 50 mM Tris pH 7,4
+ 5 mM MgCl2), und die Restriktionsenzyme (NEB)
werden zugegeben (10-50 Einheiten Enzym in 0,2 ml des entsprechenden
Puffers) und bei 37°C
für 3-12
Stunden inkubiert. Die Platte wird gespült, und mit Peroxidase verknüpfte anti-DIG-Antikörper (verdünnt 1:1.500
in PBS + 0,1% Tween-20 + 2 mg/ml BSA) werden für 40-60 min zugegeben, worauf
das Peroxidasesubstrat (BM Blue; 70 μl/Vertiefung) folgt. Die Extinktion
(bei 450 minus 650 nm) wird nach Quenchen mit 0,5 M H2SO4 (130 μl/Vertiefung)
gemessen.
-
Für den radioaktiven
Test werden die oben beschriebenen Plasmide und PCR-Fragmente durch
PCR amplifiziert, indem die Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO: 9) und
LMB3 und α-P32-CTP
verwendet werden, um P32-markierte DNA-Fragmente
zu ergeben, die an einem Ende mit Biotin markiert sind und welche
den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle,
das Methyltransferasegen und die relevanten M/R-Stellen tragen. Diese PCR-Fragmente
werden unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) direkt gereinigt.
Reaktionsmischungen, welche die Biotin-P32-markierte
DNA enthalten, die in situ durch gekoppelte in vitro-Transkription-Translation
umgesetzt wurden, werden in 1 × W&B-Puffer + 0,1% Tween-20
verdünnt
und mit Streptavidinbeschichteten magnetischen Kügelchen (Dynal, M-280; 1-5 × 106 Kügelchen)
für 30-60
min inkubiert. Die Kügelchen
werden abgetrennt und gespült
(3mal 2 × W&B + 0,1% Tween-20
+ 3% BSA und schließlich
mit 50 mM Tris pH 7,4 + 5 mM MgCl2). Die
Restriktionsenzyme (NEB) werden zugegeben (10-50 Einheiten Enzym
in 50-150 μl
des entsprechenden Puffers) und bei 37° für 5-20 Stunden inkubiert. Der Überstand
wird entfernt und die Kügelchen
gespült
und in 100 μl
Wasser resuspendiert. Die Menge der radioaktiv markierten DNA auf
den Kügelchen
und in den Überständen wird
durch Szintillation bestimmt.
-
Alle
vier hier beschriebenen Methylasen – M.HaeIII, M.HhaI, M.EcoRI
und M.EcoRV – werden
bei der gekoppelten in vitro-Transkription/Translation exprimiert
und sind aktiv. Weiterhin kann die in vitro translatierte Methylase
ihr eigenes Gen methylieren, was dieses so gegen eine Spaltung durch
die zugehörige
Methylase resistent macht (Selbstmethylierung). Beide Prozesse,
die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation des Methylasegens
wie auch dessen Methylierung laufen in derselben Reaktionsmischung
effizient ab. Insbesondere werden DNA-Fragmente (in Konzentrationen
von 0,5 bis 10 nM), welche den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage
T7-Gen 10-Translationsstartstelle, ein Methyltransferasegen und
M/R-Stellen von allen vier Methylasen tragen, resistent gegen eine
Spaltung durch die zugehörige
Restriktionsendonuklease. Beispielsweise wird das DNA-Fragment,
welches M.EcoRI-Methyltransferase codiert, resistent gegen eine
Spaltung durch EcoRI (75-100% nach 20-90 Minuten bei 25°C), wenn
es mit dem E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega),
SAM (80 μM)
und T7-RNA-Polymerase inkubiert wird. Die Resistenz gegenüber einer Spaltung
als eine Folge der Methylierung ist selektiv und spezifisch: unter
denselben Bedingungen wird eine Resistenz gegenüber einer Spaltung durch HhaI
oder M.EcoRV nicht beobachtet; darüber hinaus wird eine Resistenz
gegenüber
einer Spaltung durch EcoRI nicht beobachtet, wenn die Translation
inhibiert wird (z.B. in der Gegenwart von Puromycin oder in der
Abwesenheit von T7-RNA-Polymerase). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten,
wenn das Überleben
der Gene durch DIG-Biotin-ELISA oder mit Biotin-P32-markierten
DNA-Fragmenten wie oben beschrieben getestet wird. Eine Methylierung
in trans, d.h. von DNA-Fragmenten
(außer
denen, die für
die zugehörige
Methylase codieren), die M/R-Stellen anfügen, wird ebenfalls in dem
E. coli S30 gekoppelten in vitro-Transkriptions-Translationssystem
in der Gegenwart eines Gens, das für eine Methylase codiert, beobachtet.
-
Beide
Prozesse, die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation der
Methylasegene wie auch deren Selbstmethylierung läuft effizient
in den wässrigen
Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion
ab. Insbesondere werden DNA-Fragmente (bei Konzentrationen von 0,1-10
nM), welche den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle,
das Methyltransferasegen (z.B. M.HhaI) und die M/R-Stellen von HaeIII,
HhaI und EcoRI tragen, zu dem E. coli S30 Extract System for Linear
Templates (Promega) in der Gegenwart von SAM (80 μM) und T7-RNA-Polymerase
zugegeben. Die eisgekühlten
Reaktionsmischungen werden durch Homogenisieren für 1 Minute
mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 20.000 Upm wie in Beispiel
1 beschrieben emulgiert und bei 25°-30° für 0-180 min inkubiert. Die
Reaktion wird gestoppt, und die wässrige Phase wird abgetrennt
(siehe Beispiel 1), und die Methylierung der DIG-Biotin- oder Biotin-P32-markierten DNA-Fragmente wird wie oben
beschrieben getestet. Eine Methylierung von bis zu 20% der kompartimentierten
Gene gegenüber
einer Spaltung durch HhaI wird nach 60-180 min Inkubation beobachtet. Keine
Resistenz wird beobachtet, wenn die eiskalte Emulsion aufgebrochen
wird, nachdem sie gerade hergestellt wurde, und die Reaktion durch
Etherextraktion ('0
min') gequencht
wird. Die Methylierung ist selektiv: unter denselben Bedingungen
wird eine Resistenz gegenüber
einer Spaltung durch HaeIII oder EcoRI nicht beobachtet. Darüber hinaus
hat der Test mit P32-markierten DNA-Fragmenten
gezeigt, dass die Selbstmethylierung von sowohl M.HaeIII als auch
M.HhaI bei Konzentrationen von Genen abläuft, die einem Durchschnitt
von weniger als einem Gen pro Kompartiment entsprechen (0,1-0,5
nM; siehe Beispiel 4). Somit laufen die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation
der Methylasegene wie auch deren Selbstmethylierung effizient ab, selbst
wenn nur ein einzelnes genetisches Element in den wässrigen
Kompartimenten der Wasser-in-Öl-Emulsion
vorliegt.
-
HaeIII-Methylaseaktivität, die aus
einer gekoppelten Transkription/Translation von M.HaeIII-Genen resultiert,
wird ebenfalls in den größeren Mikrokapseln
gemessen, die nur durch Rühren
und durch Rühren
gefolgt von einer weiteren Homogenisation mit einem Ultra-Turrax
T25-Dispergierer bei 8.000 Upm, 9.000 Upm oder 13.500 Upm für 1 Minute
wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt wurden. Die Ergebnisse sind
in 2b dargestellt. Die verwendete
Konzentration der M.HaeIII-Gene (2,5 nM) ergibt einen Durchschnitt
von 1, 1,5 und 4,8 genetischen Elementen pro Tröpfchen in den Emulsionen, die
bei 13.500 Upm, 9.500 Upm bzw. 8.000 Upm homogenisiert wurden, und
einen Durchschnitt von 14 genetischen Elementen pro Tröpfchen in
der Emulsion, die nur durch Rühren
hergestellt wurde. Die Zugabe eines anionischen Tensids – z.B. Natriumdeoxycholat,
typischerweise bis auf 0,5% (w/v), zu der in vitro-Translationsmischung
erhöht
signifikant den Prozentsatz der genetischen Elemente, die in den
Emulsionen methyliert sind.
-
Beispiel 10.
-
Genetische Elemente, die DNA-Methyltransferasen
codieren, können
nach deren Selbstmethylierung in den wässrigen Kompartimenten einer
Wasser-in-Öl-Emulsion
selektiert und amplifiziert werden.
-
Die
Methylierung von Genen, die für
DNA-Methylasen codieren, erlaubt, dass diese in einem nachfolgenden
Schritt isoliert und amplifiziert werden. Die methylierte DNA ist
selektierbar gegenüber
nicht methylierter DNA mittels ihrer Resistenz gegen eine Restriktionsendonukleasespaltung.
Somit können
die genetischen Elemente, die nach Behandlung mit dem zugehörigen Restriktionsenzym
intakt bleiben, durch PCR amplifiziert werden. Jedoch ist eine solche
Selektion offensichtlich nicht erreichbar, wenn andere Gene, die
dieselbe R/M-Stelle enthalten, aber nicht für die Methylase codieren, in
derselben Reaktionsmischung vorliegen. Dieses beruht darauf, dass
eine Kreuzmethylierung der nicht-Methylasegene (die in einem großen Überschuss
vorliegen) diese resistent gegen eine Spaltung durch das zugehörige Restriktionsenzym
und so durch PCR amplifizierbar machen wird. Unter diesen Bedingungen
wird die Selektion von Genen, welche die Methylase codieren, nur
möglich
werden, wenn diese kompartimentiert sind – wenn nämlich nur eines oder wenige
Gene in einem einzelnen Kompartiment vorliegen, so dass die Selbstmethylierung
der vorherrschende Prozess in diesem Kompartiment ist. Eine Kreuzmethylierung
wird vermieden, da nicht-Methylasegene, die in Kompartimenten vorliegen,
die kein Methylasegen enthalten, unmethyliert bleiben werden.
-
Die
Gene, die in dem Experiment verwendet werden, sind ein M.HaeIII-Fragment
mit 1194 Basenpaaren (DIG-M.HaeIII-3s-Biotin), das die Methylase
HaeIII codiert, und ein folA-Fragment mit 681 Basenpaaren (DIG folA-3s-Biotin),
das das Enzym Dihydrofolatreduktase (DHFR) codiert, das zusätzliche
HaeIII- und HhaI-Restriktions/Modifikationsstellen enthält (siehe 1b). Beide DNA-Fragmente sind an einem
Ende mit Digoxigenin (DIG) und an dem anderen mit Biotin markiert
und enthalten einen T7-RNA-Polymerase-Promoter (T7-Promoter) und eine T7-Gen
10-Translationsstartstelle (rbs) zur Expression in vitro.
-
pGEM-4Z-3s
wird erzeugt, indem die Oligonukleotide HaeHha-P1 und HaeHha-Mi
(SEQ ID NO: 2) (Tabelle 1) annealt werden und diese in mit HindIII
und EcoRI geschnittenes pGEM-4Z (Promega) ligiert werden. Das M.HaeIII-Gen
wird durch PCR aus Haemophilus influenzae (Biogruppe aegyptius)
(ATCC 11116) amplifiziert, indem die Oligonukleotide HaeIII-FoNC
(SEQ ID NO: 3) und HaeIII-Bc (SEQ ID NO: 4) (Tabelle 1) verwendet
werden. Das folA-Gen wird aus Escherichia coli amplifiziert, indem
die Primer EDHFR-Fo (SEQ ID NO: 5) und EDHFR-Ba (SEQ ID NO: 6) (Tabelle
1) verwendet werden. Beide amplifizierten Gene werden mit HindIII und
KpnI verdaut und in pGEM-4Z-3s kloniert, was die Expressionsvektoren
pGEM-HaeIII-3s und pGEM-folA-3s erzeugt. DIG-M.HaeIII-3s- Biotin und DIG-folA-3s-Biotin
(siehe 1b) werden aus diesen Vektoren durch
PCR mit Pfu-Polymerase amplifiziert, indem die Primer LMB2-Biotin
(SEQ ID NO: 9) und LMB3-DIG (SEQ
ID NO: 10) (20 Zyklen) verwendet werden, und unter Verwendung von
Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt. DIG-D1.3-Biotin, ein DNA-Fragment
mit 942 bp, das vier HaeIII-R/M-Stellen enthält, das als ein Substrat verwendet
wird, um auf HaeIII-Methylaseaktivität zu testen, wird wie oben
aus einem pUC19-Derivat amplifiziert, das ein D1.3-Einzelketten-Fv-Gen
enthält
(McCafferty et al., 1990). Eine Carrier-DNA mit 558 bp (g3 Carrier
DNA; ein inneres Fragment des Phage fd-Gens III, welches keinen
T7-Promoter, HaeIII- oder HhaI-R/M-Stellen aufweist) wird durch
PCR mit Taq-Polymerase aus pHEN1-DNA
(Hoogenboom et al., 1991) amplifiziert, indem die Primer G3FRAG-Fo
(SEQ ID NO: 11) und G3FRAG-Ba (SEQ ID NO: 12) (Tabelle 1) verwendet
werden, und durch Phenol-Chloroform-Extraktion
und Ethanolfällung
gereinigt. Diese DNA (bei ≥ 10
nM) wurde als ein Träger
bei der Verdünnung
der gesamten DNA, die für
die Reaktionen in diesem Beispiel verwendet wurde, verwendet.
-
3 demonstriert
die Selektion von M.HaeIII-Genen, welche die DNA-Methylase HaeIII
codieren, aus einem Überschuss
an folA-Genen (welche DHFR codieren, die DNA nicht methyliert).
An beide Gene sind dieselben HaeIII-R/M-Sequenzen angehängt, um
als ein Substrat zu wirken (1b). Nach
Translation in den wässrigen
Kompartimenten einer Emulsion werden die HaeIII-R/M-Sequenzen, die
an Methylasegenen befestigt sind, methyliert. Diese Gene werden
gegen eine Spaltung durch HaeIII-Endonuklease resistent gemacht und
werden anschließend
durch PCR amplifiziert. folA-Gene, die in anderen Kompartimenten
vorliegen, bleiben unmethyliert, werden gespalten und nicht amplifiziert.
Die PCR-Produkte werden durch Agarosegelelektrophorese analysiert,
wo eine Anreicherung im Hinblick auf die M.HaeIII-Gene durch das
Erscheinen einer Bande mit 1194 bp sichtbar gemacht werden kann
(2b).
-
Das
E. coli S30-Extraktsystem für
lineare DNA (Promega) wird verwendet, welches mit g3-Carrier-DNA
(10 nM), DNA-Fragmenten (DIG-M.HaeIII-3s-Biotin und DIG-M.folA-3s-Biotin in den unten
angegebenen Verhältnissen
und Konzentrationen), T7-RNA-Polymerase (104 Einheiten),
Natriumdeoxycholat (Fluka, 0,5% w/v; nur in emulgierten Reaktionen)
und S-Adenosylmethionin (NEB, 80 μM)
ergänzt
ist. Die Reaktionen werden angesetzt, indem die DNA-Fragmente DIG-M.HaeIII-3s-Biotin
und DIG-M.folA-3s-Biotin in einem Verhältnis von 1:103 und
bei einer Gesamtkonzentration von 200 pM (3a)
und Verhältnissen
von 1:104 bis 1:107 und
einer Gesamtkonzentration von 500 pM (3b) verwendet
werden. Fünfzig
Mikroliter-Reaktionen werden auf Eis hergestellt und nur durch Rühren wie
in Beispiel 1 beschrieben emulgiert. Die Reaktionen werden für 2 Stunden
bei 25°C
inkubiert. Um die Reaktionsmischungen zurück zu gewinnen, werden die
Emulsionen für
5 Minuten bei 3.000 g abzentrifugiert und die Ölphase entfernt, was die konzentrierte
Emulsion am Boden des Vials zurück
lässt.
Quenchpuffer (0,2 ml 25 μg/m1
Hefe-RNA in W+B-Puffer: 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4)
und 2 ml wassergesättigter
Ether werden zugegeben, und die Mischung wird gevortext, kurz zentrifugiert
und die Etherphase entfernt. Die wässrige Phase wird mit Ether
gewaschen und getrocknet (5 Minuten in einer Speedvac bei Umgebungstemperatur).
Die DNA wird auf 100 μg
M-280 Streptavidin-Dynabeads eingefangen (2 Stunden bei Umgebungstemperatur).
Die Dynabeads werden nacheinander gewaschen mit: W+B-Puffer; 2,25
M Guanidin-HCl,
25 mM Tris-HCl, pH 7,4; W+B-Puffer; und zweimal mit Restriktionspuffer.
Die Kügelchen
werden in 100 μl
Restriktionspuffer, welcher 10 Einheiten HaeIII (oder HhaI) enthält, resuspendiert
und für
5 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Kügelchen
werden dreimal mit W+B-Puffer, zweimal mit 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl,
0,1% Triton X-100, pH 9,0, gewaschen und dann in 100 μl desselben Puffers,
der mit 1,5 mM MgCl2 ergänzt ist (PCR-Puffer), resuspendiert.
Aliquots der Kügelchen
(2-20 μl)
werden durch PCR amplifiziert, indem Taq-Polymerase verwendet wird,
die bei 94°C
mit den Primern LMB2-Biotin und LMB3-DIG zugegeben wird (50 μl-Reaktionen;
32 Zyklen von 1 Minute bei 94°,
1 Minute bei 55°,
2 Minuten bei 72°).
Diese DNA wird unter Verwendung von Wizard PCR Preps gereinigt und
für die
zweite Runde der Selektion verwendet (20 pM bei den 1:104 und 1:105 Selektionen
und 500 pM bei den 1:106 und 1:10 Selektionen). Für eine Gelelektrophorese
und Aktivitätstests
wird diese DNA (verdünnt
auf ~1 pM) weiter mit den Primern LMB2-Nest und LMB3-Nest amplifiziert,
welche unmittelbar innerhalb von LMB2 bzw. LMB3 annealen (25 Zyklen
von 1 Minute bei 94°,
1 Minute bei 50°,
1,5 Minuten bei 72°),
und wie oben gereinigt. Diese DNA (bei 10 nM), an welche weder DIG
noch Biotin angehängt
ist, wird ebenfalls in vitro in der Gegenwart von 10 nM DIG-D1.3-Biotin,
einer DNA mit 942 bp, welche vier HaeIII-R/M-Stellen enthält, translatiert.
Die Methylierung des DIG-D1.3-Biotin-Substrats
wird wie in Beispiel 9 durch einen DIG-Biotin-ELISA bestimmt.
-
Eine
einzige Runde der Selektion eines 1:1000-Verhältnisses von M.HaeIII-:folA-Genen
in der Emulsion führt
zu einem endgültigen
Genverhältnis
von ungefähr
1:1 (3a). Mehrere Kontrollexperimente
zeigen, dass die Selektion nach dem oben beschriebenen Mechanismus
abläuft:
eine Bande, die dem M.HaeIII-Gen entspricht, wird nicht beobachtet,
wenn die Anfangsmischung der Gene durch PCR amplifiziert wird; noch
nach Reak tion in Lösung
(nicht emulgiert); noch, wenn in der Abwesenheit von Transkription/Translation emulgiert
wird (wenn T7-RNA-Polymerase weggelassen wird); noch wenn die umgesetzten
Gene an R/M-Stellen außer
denen von HaeIII – z.B.
nach Verdau mit HhaI – gespalten
werden. Die Ausbeute an M.HaeIII-DNA nach der Selektion beträgt weniger
als 100%, hauptsächlich
aufgrund einer unvollständigen
Verdauung durch HaeIII und nicht einer Kreuzmethylierung, wie durch
die große
folA-Bande angezeigt wird, die in der Abwesenheit von Methylaseaktivität (wenn
T7-Polymerase nicht zugegeben wird) beobachtet wird. Während des
Verdaus fällt
die Konzentration der DNA weit unter die KM von
HaeIII (6 nM), und der Verdau wird extrem ineffizient.
-
Eine
Bande, welche den M.HaeIII-Genen entspricht, wird ebenfalls nach
einer einzigen Runde der Selektion ausgehend von M.HaeIII:folA-Verhältnissen
von 1:104 bis 1:105 (3b), nicht aber bei niedrigeren Verhältnissen
sichtbar, was einen Anreicherungsfaktor von wenigstens 5000fach
zeigt. Die Selektion einer kleinen Anzahl von Genen aus einem großen Pool
(z.B. einer Genbibliothek) erfordert daher weitere Runden der Selektion.
Wenn die mit HaeIII verdaute und amplifizierte DNA aus der ersten
Runde der Selektion einer zweiten Runde der Selektion unterzogen
wird, wird eine Bande, welche M.HaeIII-Genen entsprach, ebenfalls
bei Ausgangsverhältnissen
von 1:106 und 1:107 von
M.HaeIII:folA sichtbar. Eine zweite Runde der Selektion wird ebenfalls
mit der DNA durchgeführt,
die aus den Ausgangsverhältnissen
von 1:104 bis 1:105 von
M.HaeIII:folA stammte. Dieses ergibt eine weitere Anreicherung,
bis zu einem Verhältnis
von ungefähr
3:1 zugunsten der M.HaeIII-Gene. Vor und nach jeder Selektionsrunde
werden die Gene amplifiziert, in vitro translatiert und mit einem
separaten DNA-Substrat umgesetzt, um auf HaeIII-Methylaseaktivität zu testen.
Diese Tests zeigen, dass die Anreicherung im Hinblick auf die M.HaeIII-Gene,
wie sie durch Gelelektrophorese beobachtet wird, zu einer parallelen
Zunahme bei der HaeIII-Methylaseaktivität führt (3b).
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