DE69838521T2

DE69838521T2 - Methode zur Erhöhung der Konzentration von Nucleinsäuremolekülen

Info

Publication number: DE69838521T2
Application number: DE69838521T
Authority: DE
Inventors: Andrew MRC Laborato Griffiths; Dan Tawfik
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1997-07-07
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2018-06-30
Also published as: ATE278013T1; EP1496120A3; US6489103B1; CA2792122A1; ES2294427T3; JP4156009B2; EP2258846A3; EP1482036B1; US7252943B2; ATE374815T1; DE69826697T2; EP1801214A3; US20130190189A1; DK1496120T3; JP2005192572A; CA2295324A1; EP1496120B1; AU8123198A; EP1482036A3; CA2584453A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung bei der in vitro-Evolution von molekularen Bibliotheken. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erhöhung der Konzentration von Nukleinsäuren, die Genprodukte codieren, wobei die Nukleinsäure und die Aktivität des codierten Genprodukts durch Kompartimentierung verknüpft sind.
Die Evolution erfordert die Erzeugung von genetischer Diversität (Diversität bei der Nukleinsäure), gefolgt von der Selektion jener Nukleinsäuren, welche zu nützlichen Eigenschaften führen. Da die Nukleinsäure und die Aktivität des codierten Genprodukts eines Organismus körperlich verknüpft sind (wobei die Nukleinsäuren innerhalb der Zellen eingeschlossen sind, welche diese codieren), können mehrere Runden von Mutation und Selektion zu dem zunehmenden Überleben von Organismen mit steigender Fitness führen. Systeme zur schnellen Evolution von Nukleinsäuren oder Proteinen in vitro müssen diesen Prozess auf dem molekularen Niveau darin nachahmen, dass die Nukleinsäure und die Aktivität des codierten Genprodukts verknüpft sein müssen und die Aktivität des Genprodukts selektierbar sein muss.
Jüngere Fortschritte in der Molekularbiologie haben ermöglicht, dass einige Moleküle entsprechend ihren Eigenschaften zusammen mit den Nukleinsäuren, die diese codieren, koselektiert werden können. Die selektierten Nukleinsäuren können anschließend zur weiteren Analyse oder Verwendung kloniert werden oder zusätzlichen Runden von Mutation und Selektion unterzogen werden.
Diesen Verfahren gemein ist die Schaffung großer Bibliotheken von Nukleinsäuren. Moleküle mit den gewünschten Eigenschaften (Aktivität) können durch Selektionsregimes, die im Hinblick auf die gewünschte Aktivität des codierten Genprodukts, wie z.B. eine gewünschte biochemische oder biologische Aktivität, z.B. Bindungsaktivität, selektieren, isoliert werden.
Die Phagen-Display-Technologie war sehr erfolgreich, da diese ein Vehikel bereit stellt, welches die Selektion eines präsentierten Proteins erlaubt, indem sie die essentielle Verknüpfung zwischen der Nukleinsäure und der Aktivität des codierten Genprodukts liefert (Smith, 1985; Bass et al., 1990; McCafferty et al., 1990; für einen Überblick siehe Clack son und Wells, 1994). Filamentöse Phagenpartikel wirken als genetische Präsentationspakete mit Proteinen auf der Außenseite und den genetischen Elementen, welche diese codieren, auf der Innenseite. Die enge Verknüpfung zwischen der Nukleinsäure und der Aktivität des codierten Genprodukts ist ein Ergebnis des Zusammenbaus des Phagen innerhalb von Bakterien. Da einzelne Bakterien selten mehrfach infiziert sind, werden in den meisten Fällen all die Phagen, die von einem einzelnen Bakterium produziert werden, dasselbe genetische Element tragen und dasselbe Protein präsentieren.
Jedoch beruht der Phagen-Display auf der Erzeugung von Nukleinsäurebibliotheken in vivo in Bakterien. Somit liegt die praktische Grenze für die Größe der Bibliothek, die von der Phagen-Display-Technologie erlaubt wird, in der Größenordnung von 10⁷ bis 10¹¹. selbst wenn man den Vorteil von λ-Phagen-Vektoren mit herausschneidbaren filamentösen Phagenreplikons nutzt. Die Technik ist vorwiegend auf die Selektion von Molekülen mit Bindungsaktivität angewandt worden. Eine kleine Anzahl von Proteinen mit katalytischer Aktivität ist ebenfalls unter Verwendung dieser Technik isoliert worden, jedoch war in keinem Fall die Selektion direkt auf die gewünschte katalytische Aktivität gerichtet, sondern entweder auf die Bindung an ein Analogon des Übergangszustands (Widersten und Mannervik, 1995) oder eine Reaktion mit einem Selbstmord-Inhibitor (Soumillion et al., 1994; Janda et al., 1997).
Spezifische Peptidliganden sind im Hinblick auf die Bindung an Rezeptoren durch Affinitätsselektion unter Verwendung großer Bibliotheken von Peptiden, die mit dem C-Terminus des lac-Repressors Lacl verknüpft waren, selektiert worden (Cull et al., 1992). Wenn es in E. coli exprimiert wird, verknüpft das Repressorprotein körperlich den Liganden mit dem codierenden Plasmid, indem es an eine lac-Operatorsequenz auf dem Plasmid bindet.
Von einem vollkommenen in vitro-Polysomen-Display-System wurde ebenfalls berichtet (Mattheakis et al., 1994), bei welchem naszierende Peptide körperlich über das Ribosom an der RNA befestigt werden, welche diese codiert.
Jedoch ist der Umfang der obigen Systeme auf die Selektion von Proteinen beschränkt und erlaubt darüber hinaus nicht die direkte Selektion im Hinblick auf Aktivitäten außer einer Bindung, z.B. katalytische oder regulatorische Aktivität.
Die RNA-Selektion und Evolution in vitro (Ellington und Szostak, 1990), welche manchmal als SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) bezeichnet wird (Tuerk und Gold, 1990), erlaubt eine Selektion im Hinblick auf sowohl Bindung als auch chemische Aktivität, aber nur für Nukleinsäuren. Wenn die Selektion im Hinblick auf die Bindung erfolgt, wird ein Pool von Nukleinsäuren mit immobilisiertem Substrat inkubiert. Nicht bindende werden weggewaschen, dann werden die bindenden freigesetzt, amplifiziert, und der gesamte Prozess wird in iterativen Schritten wiederholt, um im Hinblick auf bessere Bindungssequenzen anzureichern. Dieses Verfahren kann ebenfalls angepasst werden, um eine Isolation von katalytischer RNA und DNA zu erlauben (Green und Szostak, 1992; für Übersichten siehe Chapman und Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al., 1995; Moore, 1995).
Jedoch ist die Selektion im Hinblick auf „katalytische" oder Bindungsaktivität unter Verwendung von SELEX nur möglich, da dasselbe Molekül die duale Rolle spielt, die genetische Information zu tragen und der Katalysator oder das bindende Molekül (Aptamer) zu sein. Wenn die Selektion im Hinblick auf „Autokatalyse" stattfindet, muss dasselbe Molekül ebenfalls die dritte Rolle spielen, ein Substrat zu sein. Da das genetische Element sowohl die Rolle des Substrats als auch des Katalysators spielen muss, ist eine Selektion nur für Ereignisse mit einer einzigen Umsetzung möglich. Da der „Katalysator" bei diesem Prozess selbst modifiziert wird, ist er definitionsgemäß kein richtiger Katalysator. Zusätzlich können Proteine nicht unter Verwendung des SELEX-Vorgangs selektiert werden. Der Bereich von Katalysatoren, Substraten und Reaktionen, welche selektiert werden können, ist daher eng beschränkt.
Jene der obigen Verfahren, die iterative Runden von Mutation und Selektion erlauben, ahmen in vitro-Mechanismen nach, die gewöhnlich dem Prozess der Evolution zugeschrieben werden: iterative Variation, fortlaufende Selektion auf eine gewünschte Aktivität und Replikation. Jedoch hat keines der bisher entwickelten Verfahren Moleküle mit vergleichbarer Diversität und funktionaler Effizienz wie bei denen, die in der Natur gefunden werden, bereit gestellt. Zusätzlich gibt es keine von Menschen geschaffenen „Evolutions"-Systeme, welche sowohl Nukleinsäuren als auch Proteine entstehen lassen können, um den vollen Bereich an biochemischen und biologischen Aktivitäten zu verwirklichen (z.B. Bindungs-, katalytische und regulatorische Aktivitäten), und welche mehrere Prozesse kombinieren können, die zu einem gewünschten Produkt oder einer gewünschten Aktivität führen.
Es gibt somit einen großen Bedarf für ein in vitro-System, welches die oben diskutierten Beschränkungen überwindet.
Oberholzer et al (1995), Chemistry and Biology, Curent Biology, London, GB, Bd. 2 (10), Seiten 677-682 berichten von einer DNA-Synthese in Liposomen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion.
Oberholzer, Thomas, et al. (1995), Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 207(1), Seiten 250-257 offenbaren eine enzymatische RNA-Replikation in selbst-reproduzierenden Vesikeln.
Walde et al. (1994), Journal of the American Chemical Society, Bd. 116(17), Seiten 7541-7547 offenbaren die enzymatische Synthese von Poly(adenylsäure) in Mizellen und selbst-reproduzierenden Vesikeln.
Die WO 93/03151 offenbart ein Verfahren zur Behandlung einer heterogenen Population von Zellen, um Kopien von zwei oder mehreren Nukleinsäuresequenzen aus wenigstens einigen der Zellen miteinander zu verknüpfen, wobei die Anordnung derart ist, dass Kopien der DNA-Sequenzen aus einer einzelnen Zelle vorzugsweise in der Nähe der Nukleinsäure, von welcher die Kopien abgeleitet sind, verknüpft werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND DER OFFENBARUNG
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung der Konzentration eines Nukleinsäuremoleküls bereit gestellt, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bilden von wässrigen Mikrokapseln in einer Wasser-in-Öl-Emulsion, wobei die Mikrokapseln eine wässrige innere Phase umfassen, die als diskrete Tröpfchen in einer hydrophoben äußeren Phase suspendiert ist, und wobei eine Mehrzahl der Mikrokapseln ein Nukleinsäuremolekül und eine wässrige Lösung beinhaltet, die Komponenten umfasst, die für eine Nukleinsäureamplifikation in der wässrigen inneren Phase notwendig sind;
(b) Amplifizieren des Nukleinsäuremoleküls in den Mikrokapseln, um weitere amplifizierte Kopien des Nukleinsäuremoleküls zu bilden; und
(c) Anreichern im Hinblick auf die Nukleinsäure unter Verwendung einer Markierung, die mit der Nukleinsäure verknüpft ist.

Ebenfalls wird als ein erster Aspekt der Offenbarung ein Verfahren zum Isolieren eines oder mehrerer genetischer Elemente, die ein Genprodukt mit einer gewünschten Aktivität codieren, bereit gestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Kompartimentieren von genetischen Elementen in Mikrokapseln;
(b) Exprimieren der genetischen Elemente, um deren entsprechende Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu erzeugen;
(c) Sortieren der genetischen Elemente, welche das Genprodukt (die Genprodukte) mit der gewünschten Aktivität erzeugen.

Die Mikrokapseln gemäß der vorliegenden Erfindung kompartimentieren genetische Elemente und Genprodukte in der Art, dass diese körperlich miteinander verknüpft bleiben. Überraschenderweise bleibt die Nukleinsäureexpression innerhalb der künstlichen Mikrokapseln möglich, was die Isolation der Nukleinsäure auf der Grundlage der Aktivität des Genprodukts, welches diese codiert, erlaubt.
Wie hierin verwendet ist ein genetisches Element ein Molekül oder molekulares Konstrukt, welches eine Nukleinsäure umfasst. Die genetischen Elemente der vorliegenden Erfindung können irgendeine Nukleinsäure (z.B. DNA, RNA oder irgendein künstliches oder natürliches Analogon von diesen) umfassen. Die Nukleinsäurekomponente des genetischen Elements kann darüber hinaus kovalent oder nicht kovalent mit einem oder mehreren Molekülen oder Strukturen, einschließlich Proteinen, chemischen Einheiten und Gruppen, Festphasenträgern wie z.B. magnetischen Kügelchen und dergleichen verknüpft sein. Diese Strukturen oder Moleküle können gestaltet werden, um bei der Sortierung und/oder Isolation des genetischen Elements, das ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität codiert, zu helfen.
Expression, wie hierin verwendet, wird in ihrer breitesten Bedeutung verwendet, so dass diese bedeutet, dass eine Nukleinsäure, die in dem genetischen Element enthalten ist, in ihr Genprodukt umgewandelt wird. Somit bezieht sich, wenn die Nukleinsäure DNA ist, die Expression auf die Transkription der DNA in RNA; wenn diese RNA für ein Protein codiert, kann sich Expression ebenfalls auf die Translation der RNA in Protein beziehen. Wenn die Nukleinsäure RNA ist, kann sich Expression auf die Replikation dieser RNA zu weiteren RNA-Kopien, die reverse Transkription der RNA in DNA und gegebenenfalls die Translation irgendeiner der erzeugten RNA-Spezies in Protein beziehen. Vorzugsweise wird daher die Expression durch einen oder mehrere Prozesse durchgeführt, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Transkription, reverser Transkription, Replikation und Translation.
Die Expression des genetischen Elements kann somit entweder zu DNA, RNA oder Protein oder einer Nukleinsäure oder einem Protein, das nicht natürliche Basen oder Aminosäuren enthält (dem Genprodukt), innerhalb der Mikrokapsel der Erfindung führen, so dass das Genprodukt innerhalb derselben Mikrokapsel eingeschlossen ist wie das genetische Element.
Das genetische Element und das Genprodukt, welches dadurch codiert wird, sind verknüpft, indem jedes genetische Element und das entsprechende Genprodukt, das von dem genetischen Element codiert wird, innerhalb derselben Mikrokapsel einschlossen sind. Auf diese Weise kann das Genprodukt in einer Mikrokapsel keine Änderung in irgendwelchen anderen Mikrokapseln verursachen.
Der Ausdruck „Mikrokapsel" wird hierin entsprechend der Bedeutung verwendet, die diesem im Stand der Technik normalerweise zukommt und die nachstehend weiter beschrieben wird. Im Wesentlichen ist jedoch eine Mikrokapsel ein künstliches Kompartiment, dessen abgrenzende Ränder den Austausch der Komponenten der molekularen Mechanismen, die hierin beschrieben werden, welche die Sortierung von genetischen Elementen gemäß der Funktion der Genprodukte, welche diese codieren, erlauben, beschränken.
Vorzugsweise sind die Mikrokapseln, welche in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, in der Lage, in sehr großer Anzahl erzeugt zu werden und dadurch eine Bibliothek genetischer Elemente, welche ein Repertoire von Genprodukten codiert, zu kompartimentieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der vorliegenden Offenbarung kann die Sortierung von genetischen Elementen in einer von im Wesentlichen vier Techniken durchgeführt werden.

(I) Bei einer ersten Ausführungsform werden die Mikrokapseln entsprechend einer Aktivität des Genprodukts oder eines Derivats von diesem sortiert, welche die Mikrokapseln als Ganzes detektierbar macht. Dementsprechend stellt die Offenbarung ein Verfahren bereit, bei welchem ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität eine Änderung in der Mikrokapsel oder eine Modifikation von einem oder mehreren Molekülen innerhalb der Mikrokapsel induziert, welche es ermöglicht, dass die Mikrokapsel, welche das Genprodukt und das genetische Element, welches dieses codiert, enthält, sortiert werden. Bei dieser Ausführungsform werden daher die Mikrokapseln entsprechend der Aktivität des Genprodukts (der Genprodukte), das (die) von dem (den) darin enthaltenen genetischen Element(en) exprimiert wird (werden), voneinander physikalisch sortiert, was es möglich macht, selektiv auf Mikrokapseln, die Genprodukte mit der gewünschten Aktivität enthalten, anzureichern.
(II) Bei einer zweiten Ausführungsform werden die genetischen Elemente nach dem Poolen der Mikrokapseln in einem oder mehreren gemeinsamen Kompartimenten sortiert. Bei dieser Ausführungsform modifiziert ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität das genetische Element, welches dieses codiert (und welches in derselben Mikrokapsel vorliegt), in einer solchen Weise, dass dieses in einem nachfolgenden Schritt selektierbar gemacht wird. Die Reaktionen werden gestoppt, und die Mikrokapseln werden dann aufgebrochen, so dass der gesamte Inhalt der einzelnen Mikrokapseln gepoolt wird. Die Selektion auf die modifizierten genetischen Elemente ermöglicht die Anreicherung der genetischen Elemente, welche das Genprodukt (die Genprodukte) mit der gewünschten Aktivität codieren. Dementsprechend liefert die vorliegende Offenbarung ein Verfahren, bei welchem in Schritt (b) das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität das genetische Element, welches dieses codiert, modifiziert, um die Isolation des genetischen Elements zu ermöglichen. Man muss natürlich verstehen, dass die Modifikation direkt sein kann, indem diese durch die direkte Wirkung des Genprodukts auf das genetische Element verursacht wird, oder indirekt, wobei eine Reihe von Reaktionen, von denen das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität an einer oder mehreren beteiligt ist, zu einer Modifikation des genetischen Elements führt.
(III) Bei einer dritten Ausführungsform werden die genetischen Elemente nach dem Poolen der Mikrokapseln in einem oder mehreren gemeinsamen Kompartimenten sortiert. Bei dieser Ausführungsform induziert ein Gen mit einer gewünschten Aktivität eine Veränderung bei der Mikrokapsel, welche das Genprodukt und das genetische Element, welches dieses codiert, enthält. Diese Veränderung löst, wenn sie detektiert wird, die Modifikation des Gens innerhalb des Kompartiments aus. Die Reaktionen werden gestoppt, und die Mikrokapseln werden dann aufgebrochen, so dass der gesamte Inhalt der einzelnen Mikrokapseln gepoolt wird. Die Selektion auf die modifizierten genetischen Elemente ermöglicht die Anreicherung der genetischen Elemente, die das Genprodukt (die Genprodukte) mit der gewünschten Aktivität codieren. Dementsprechend liefert die Offenbarung ein Verfahren, wo in Schritt (b) das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität eine Veränderung in dem Kompartiment induziert, welche detektiert wird und die Modifikation des genetischen Elements innerhalb des Kompartiments auslöst, so dass dessen Isolation ermöglicht wird. Man muss verstehen, dass die detektierte Veränderung in dem Kompartiment durch die direkte Wirkung des Genprodukts oder durch eine indirekte Wirkung verursacht werden kann, wobei eine Reihe von Reaktionen, von denen das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität an einer oder mehreren beteiligt ist, zu der nachgewiesenen Veränderung führt.
(IV) Bei einer vierten Ausführungsform können die genetischen Elemente über ein Mehrschrittverfahren, welches beispielsweise wenigstens zwei Schritte beinhaltet, sortiert werden, um die Exposition der genetischen Elemente an Bedingungen zu erlauben, welche zulassen, dass wenigstens zwei separate Reaktionen stattfinden. Wie Fachleuten auf dem Gebiet klar sein wird, muss der erste Mikroeinkapselungsschritt zu Bedingungen führen, welche die Expression der genetischen Elemente erlauben – sei es Transkription, Transkription und/oder Translation, Replikation oder dergleichen. Unter diesen Bedingungen kann es nicht möglich sein, im Hinblick auf eine bestimmte Aktivität des Genprodukts zu selektieren, da beispielsweise das Genprodukt unter diesen Bedingungen nicht aktiv ist oder da das Expressionssystem eine störende Aktivität enthält. Die Offenbarung liefert daher ein Verfahren, bei welchem Schritt (b) das Exprimieren der genetischen Elemente, um deren entsprechende Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu erzeugen, das Verknüpfen der Genprodukte mit den genetischen Elementen, welche diese codieren, und das Isolieren der dadurch gebildeten Komplexe umfasst. Dieses ermöglicht, dass die genetischen Elemente und deren assoziierte Genprodukte aus den Kapseln isoliert wer den, bevor eine Sortierung entsprechend der Aktivität des Genprodukts stattfindet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Komplexe vor dem Isolieren der genetischen Elemente, welche ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität codieren, einem weiteren Kompartimentierungsschritt unterzogen. Dieser weitere Kompartimentierungsschritt, welcher vorteilhaft in Mikrokapseln stattfindet, erlaubt die Durchführung von weiteren Reaktionen, unter anderen Bedingungen, in einer Umgebung, wo die genetischen Elemente und ihre entsprechenden Genprodukte körperlich verknüpft sind. Eine eventuelle Sortierung der genetischen Elemente kann gemäß Ausführungsform (I), (II) oder (III) oben durchgeführt werden.

Die „sekundäre Einkapselung" kann ebenfalls mit genetischen Elementen durchgeführt werden, die durch andere Mittel, wie z.B. durch Phagendisplay, Polysomendisplay, RNA-Peptid-Fusion oder lac-Repressor-Peptid-Fusion, mit Genprodukten verknüpft sind.
Das selektierte genetische Element(e) kann ebenfalls nachfolgenden, möglicherweise stringenteren Runden der Sortierung in iterativ wiederholten Schritten unterzogen werden, wobei das Verfahren der Offenbarung entweder insgesamt oder nur mit ausgewählten Schritten erneut angewendet wird. Durch geeignetes Maßschneidern der Bedingungen können genetische Elemente, die Genprodukte codieren, welche eine besser optimierte Aktivität haben, nach jeder Selektionsrunde isoliert werden.
Zusätzlich können die genetischen Elemente, die nach einer ersten Runde der Sortierung isoliert wurden, einer Mutagenese unterzogen werden, bevor die Sortierung durch iterative Wiederholung der Schritte des Verfahrens der Offenbarung wie oben ausgeführt wiederholt wird. Nach jeder Runde der Mutagenese werden einige genetische Elemente in einer solchen Weise modifiziert worden sein, dass die Aktivität der Genprodukte erhöht wurde.
Darüber hinaus können die ausgewählten genetische Elemente in einen Expressionsvektor kloniert werden, um eine weitere Charakterisierung der genetischen Elemente und deren Produkte zu erlauben.
Unter einem zweiten Aspekt stellt die Offenbarung ein Produkt bereit, wenn es entsprechend dem ersten Aspekt der Offenbarung selektiert wurde. Wie in diesem Zusammenhang verwendet, kann sich ein „Produkt auf ein Genprodukt, das nach der vorliegenden Offenbarung selektierbar ist, oder das genetische Element (oder die genetische Information, die darin enthalten ist) beziehen.
Unter einem dritten Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Herstellen eines genetischen Elements, welches das Genprodukt codiert;
(b) Kompartimentieren von genetischen Elementen in Mikrokapseln;
(c) Exprimieren der genetischen Elemente, um deren entsprechende Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu erzeugen;
(d) Sortieren der genetischen Elemente, welche das Genprodukt(e) mit der gewünschten Aktivität erzeugen; und
(e) Exprimieren des Genprodukts mit der gewünschten Aktivität.

Gemäß dem dritten Aspekt umfasst Schritt (a) vorzugsweise die Herstellung eines Repertoires von genetischen Elementen, wobei jedes genetische Element ein potentiell verschiedenes Genprodukt codiert. Repertoires können durch herkömmliche Techniken erzeugt werden wie z.B. jene, die für die Erzeugung von Bibliotheken eingesetzt werden, die für eine Selektion durch Verfahren wie z.B. Phagendisplay gedacht sind. Genprodukte mit der gewünschten Aktivität können aus dem Repertoire gemäß der vorliegenden Offenbarung selektiert werden.
Unter einem vierten Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder von Verbindungen, die in der Lage sind, die Aktivität eines Genprodukts zu modulieren, bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Herstellen eines Repertoires genetischer Elemente, die ein Genprodukt codieren;
(b) Kompartimentieren der genetischen Elemente in Mikrokapseln;
(c) Exprimieren der genetischen Elemente, um deren entsprechende Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu erzeugen;
(d) Sortieren der genetischen Elemente, welche das Genprodukt(e) mit der gewünschten Aktivität erzeugen; und
(e) Kontaktieren eines Genprodukts mit der gewünschten Aktivität mit der Verbindung oder den Verbindungen und Überwachen der Modulation einer Aktivität des Genprodukts durch die Verbindung oder Verbindungen.

Vorteihafterweise umfasst das Verfahren weiterhin den folgenden Schritt:

(f) Identifizieren der Verbindung oder Verbindungen, die in der Lage sind, die Aktivität des Genprodukts zu modulieren, und Synthetisieren der Verbindung oder Verbindungen.

Dieses Selektionssystem kann so konfiguriert werden, dass auf RNA, DNA oder Proteinmoleküle mit katalytischer, regulatorischer oder Bindungsaktivität selektiert wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1
Genselektion durch Kompartimentierung.

a Schematische Darstellung der Selektionsprozedur. In Schritt 1 wird eine in vitro-Transkriptions/Translationsreaktionsmischung, welche eine Bibliothek von genetischen Elementen enthält, die mit einem Substrat für die Reaktion, die selektiert wird, verknüpft sind, dispergiert, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion zu bilden, wobei typischerweise ein genetisches Element pro wässrigem Kompartiment vorliegt. Die genetischen Elemente werden innerhalb ihrer Kompartimente transkribiert und translatiert (Schritt 2). Anschließend (Schritt 3) wandeln Proteine (oder RNAs) mit enzymatischen Aktivitäten das Substrat in ein Produkt um, das mit dem genetischen Element verknüpft bleibt. Eine Kompartimentierung verhindert die Modifikation von genetischen Elementen in anderen Kompartimenten. Als nächstes (Schritt 4) wird die Emulsion aufgebrochen, alle Reaktionen werden gestoppt und die wässrigen Kompartimente vereinigt. Genetische Elemente, welche mit dem Produkt verknüpft sind, werden selektiv angereichert, dann amplifiziert und entweder charakterisiert (Schritt 5) oder mit dem Substrat verknüpft und für weitere Selektionsrunden kompartimentiert (Schritt 6).
b Selektion im Hinblick auf targetspezifische DNA-Methylierung durch HaeIII-Methylase. Das Substrat ist ein DNA-Segment, das HaeIII-Restriktions/Modifikations-(R/M)-Stellen enthält. Genetische Elemente werden durch Bindung an Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen isoliert und mit dem zugehörigen Restriktionsenzym HaeIII behandelt. Nur Nukleinsäuren mit methylierten R/M-Stellen sind resistent gegen eine Spaltung und werden anschließend durch PCR amplifiziert.

2a
Tröpfchengrößenverteilung und Aktivitäten von DHFR und HaeIII-Methylase in Emulsionen: Größenverteilung der wässrigen Kompartimente in einer Emulsion, bestimmt durch Laserbeugung. In vitro-Transkriptions/Translationsreaktionsmischungen, welche DNA und Natriumdeoxycholat enthalten, werden durch Rühren oder Rühren gefolgt von einer Homogenisierung bei 6 k, 9,5 k oder 13,5 k Upm emulgiert. Die Größenverteilung der wässrigen Partikel wird durch den Prozentsatz des gesamten wässrigen Volumens gezeigt.
2b
Die Aktivität von DHFR, die in situ durch Transkription und Translation ihres Gens gebildet wurde (1b), in wässrigen Kompartimenten einer Emulsion. Die Konzentration des verwendeten folA-Gens (2,5 nM) ergibt einen Durchschnitt von einem Gen pro Tröpfchen bei den feinsten Emulsionen (homogenisiert bei 13,5 k Upm). Der mittlere Durchmesser, der aus den Größenverteilungsdaten (in 2a) berechnet wurde, wird als eine Funktion der Geschwindigkeit der Homogenisierung dargestellt (0 k Upm bezieht sich auf die Emulsion, die durch Rühren ohne eine weitere Homogenisierung hergestellt wurde). Die Aktivität ist als Prozentsatz der Aktivität dargestellt, die bei der nicht emulgierten in vitro-Reaktionsmischung unter denselben Bedingungen beobachtet wurde.
Die Aktivität von HaeIII-Methylase, die in situ durch Transkription und Translation ihres Gens gebildet wurde (1b), in wässrigen Kompartimenten einer Emulsion. Die Kon zentrierung des verwendeten M.HaeIII-Gens (2,5 nM) ergibt einen Durchschnitt von einem Gen pro Tröpfchen bei den feinsten Emulsionen (homogenisiert bei 13,5 k Upm). Der mittlere Durchmesser, der aus den Größenverteilungsdaten (in 2a) berechnet wurde, wird als eine Funktion der Geschwindigkeit der Homogenisierung dargestellt (0 k Upm bezieht sich auf die Emulsion, die durch Rühren ohne eine weitere Homogenisierung hergestellt wurde). Die Aktivität ist als Prozentsatz der Aktivität dargestellt, die bei der nicht emulgierten in vitro-Reaktionsmischung unter denselben Bedingungen beobachtet wurde.
3
Selektionen im Hinblick auf HaeIII-DNA-Methylase.

a Selektieren von M.HaeIII-Genen aus einem 1000fachen Überschuss von folA-Genen. Die Reaktionen wurden angesetzt mit 0,2 nM DIG-folA-3s-Biotin-DNA (entsprechend einem Durchschnitt von einem Gen pro Kompartiment), versetzt mit 0,2 pM DIG25542-M.HaeIII-3s-Biotin. Die Reaktionsmischungen wurden entweder durch Rühren emulgiert oder in Lösung belassen. Die DNA aus diesen Reaktionen wurde gewonnen, mit HaeIII (oder mit HhaI) verdaut und durch PCR amplifiziert. Diese DNA wurde weiter durch geschachtelte (nested) PCR mit den Primern LMB2-Nest und LMB3-Nest amplifiziert, und fünf Mikroliter von jeder geschachtelten PCR wurden auf einem 1,5% Agarosegel, das Ethidiumbromid enthielt, einer Elektrophorese unterzogen. Marker, ϕX174-HaeIII-Verdau; minus T7, keine T7-RNA-Polymerase; minus NadCh, kein Natriumdeoxycholat.
b Selektionen über zwei Runden. Reaktionen, die ein Molverhältnis von 1:10⁴ bis 1:10⁷ DIG-M.HaeIII-3s-Biotin:DIG-folA-3s-Biotin (bei 500 pM) enthalten, werden durch Rühren emulgiert. Die DNA aus diesen Reaktionen wird mit HaeIII verdaut und durch PCR mit den Primern LMB2-Biotin (SEQ ID NO: 9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO: 10) amplifiziert. Die amplifizierte DNA aus der ersten Selektionsrunde mit den Verhältnissen 1:10⁴ und 1:10⁵ (bei 20 pM) und den Verhältnissen 1:10⁶ und 1:10⁷ (bei 500 pM) wird in eine zweite Selektionsrunde gegeben. Diese DNA wird weiter durch geschachtelte PCR mit den Primern LMB2-Nest und LMB3-Nest amplifiziert, und fünf Mikroliter der geschachtelten PCR aus jeder Selektionsrunde werden durch Gelelektrophorese wie oben analysiert (oberes Feld). Dieselbe DNA wurde in vitro translatiert, und die resultie rende Methylaseaktivität wurde gemessen. Die Ergebnisse werden als der Prozentsatz der methylierten Substrat-DNA angegeben (unteres Feld).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND DER OFFENBARUNG
(A) ALLGEMEINE BESCHREIBUNG
Die Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung benötigen geeignete physikalische Eigenschaften, um die Durchführung der Erfindung zu erlauben.
Um sicher zu stellen, dass die genetischen Elemente und Genprodukte nicht zwischen den Mikrokapseln diffundieren können, muss zuerst der Inhalt jeder Mikrokapsel von dem Inhalt der umgebenden Mikrokapseln isoliert werden, so dass es über die Zeitskala des Experiments hinweg keinen oder einen geringen Austausch der genetischen Elemente und Genprodukte zwischen den Mikrokapseln gibt.
Zweitens erfordert das Verfahren der vorliegenden Offenbarung, dass es nur eine begrenzte Anzahl von genetischen Elementen pro Mikrokapsel gibt. Dieses stellt sicher, dass das Genprodukt eines einzelnen genetischen Elements von anderen genetischen Elementen isoliert wird. Somit wird die Kopplung zwischen genetischem Element und Genprodukt in hohem Maße spezifisch sein. Der Anreicherungsfaktor ist am größten mit im Durchschnitt einem oder weniger genetischen Elementen pro Mikrokapsel, wobei die Verknüpfung zwischen Nukleinsäure und der Aktivität des codierten Genprodukts so eng wie möglich ist, da das Genprodukt eines einzelnen genetischen Elements von den Produkten aller anderen genetischen Elemente isoliert sein wird. Jedoch kann sich, selbst wenn die theoretisch optimale Situation von im Durchschnitt einem einzigen genetischen Element oder weniger pro Mikrokapsel nicht verwendet wird, ein Verhältnis von 5, 10, 50, 100 oder 1000 oder mehr genetischen Elementen pro Mikrokapsel beim Sortieren einer großen Bibliothek als nützlich erweisen. Anschließende Runden der Sortierung, einschließlich erneuter Einkapselung mit anderer Verteilung der genetischen Elemente, wird eine stringentere Sortierung der genetischen Elemente erlauben. Vorzugsweise gibt es ein einziges genetisches Element oder weniger pro Mikrokapsel.
Drittens dürfen die Bildung und die Zusammensetzung der Mikrokapseln die Funktion der Maschinerie der Expression der genetischen Elemente und die Aktivität der Genprodukte nicht verbieten.
Folglich muss jedes verwendete System zur Mikroeinkapselung diese Anforderungen erfüllen. Das geeignete System(e) kann in Abhängigkeit von der genauen Art der Anforderungen bei jeder Anwendung der Offenbarung variieren, wie dem Fachmann klar sein wird.
Eine große Vielzahl von Mikroeinkapselungsverfahren ist verfügbar (siehe Benita, 1996) und kann verwendet werden, um die Mikrokapseln, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zu erzeugen. In der Tat sind mehr als 200 Mikroeinkapselungsverfahren in der Literatur festgestellt worden (Finch, 1993).
Diese beinhalten membranumhüllte wässrige Vesikel wie z.B. Lipidvesikel (Liposomen) (New, 1990) und nicht ionische Tensidvesikel (van Hal et al., 1996). Dieses sind geschlossene membranöse Kapseln von einzelnen oder mehrfachen Doppelschichten von nicht kovalent zusammengesetzten Molekülen, wobei jede Doppelschicht durch ein wässriges Kompartiment von ihrem Nachbarn getrennt ist. In dem Fall von Liposomen ist die Membran aus Lipidmolekülen zusammengesetzt; diese sind gewöhnlich Phospholipide, aber Sterole wie z.B. Cholesterin können ebenfalls in die Membranen eingebaut werden (New, 1990). Eine Vielzahl von enzymkatalysierten biochemischen Reaktionen, einschließlich RNA- und DNA-Polymerisation, können innerhalb von Liposomen durchgeführt werden (Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick & Luisi, 1996).
Bei einem membranumhüllten Vesikelsystem liegt ein großer Teil der wässrigen Phase außerhalb der Vesikel und ist daher nicht kompartimentiert. Diese kontinuierliche, wässrige Phase sollte entfernt werden oder die biologischen Systeme in ihr inhibiert oder zerstört werden (beispielsweise durch Verdau von Nukleinsäuren mit DNase oder RNase), damit die Reaktionen auf die Mikrokapseln beschränkt werden (Luisi et al., 1987).
Enzymkatalysierte biochemische Reaktionen wurden ebenfalls in Mikrokapseln, die durch eine Vielzahl von anderen Verfahren erzeugt wurden, nachgewiesen. Viele Enzyme sind in inversen mizellaren Lösungen aktiv (Bru & Walde, 1991; Bru & Walde, 1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993; Kumar et al., 1989; Luisi & B., 1987; Mao & Walde, 1991; Mao et al., 1992; Perez et al., 1992; Walde et al., 1994; Walde et al., 1993; Walde et al., 1988), wie z.B. das AOT-Isooctan-Wasser-System (Menger & Yamada, 1979).
Mikrokapseln können ebenfalls durch Grenzflächenpolymerisation und Grenzflächenkomplexierung erzeugt werden (Whateley, 1996). Mikrokapseln von dieser Sorte haben starre, nicht permeable Membranen oder semipermeable Membranen. Semipermeable Mikrokapseln, die von Cellulosenitratmembranen, Polyamidmembranen und Lipid-Polyamidmembranen begrenzt sind, können allesamt biochemische Reaktionen, die Multienzymsysteme beinhalten, unterstützen (Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Alginat/Polylysin-Mikrokapseln (Lim & Sun, 1980), welche unter sehr milden Bedingungen gebildet werden können, haben sich ebenfalls als sehr biokompatibel erwiesen, indem sie beispielsweise ein effektives Verfahren zur Einkapselung lebender Zellen und Gewebe bereitstellen (Chang, 1992; Sun et al., 1992).
Nicht membranöse Mikroeinkapselungssysteme, die auf einer Phasentrennung einer wässrigen Umgebung in einem kolloidalen System basieren, wie z.B. eine Emulsion, können ebenfalls verwendet werden.
Vorzugsweise werden die Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung aus Emulsionen, heterogenen Systemen von zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen gebildet, wobei eine der Phasen in der anderen als Tröpfchen von mikroskopischer oder kolloidaler Größe dispergiert ist (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Emulsionen können aus irgendeiner geeigneten Kombination von nicht mischbaren Flüssigkeiten erzeugt werden. Vorzugsweise weist die Emulsion der vorliegenden Erfindung Wasser (enthaltend die biochemischen Komponenten) als die Phase, die in der Form von fein verteilten Tröpfchen vorliegt (die disperse, innere oder diskontinuierliche Phase), und eine hydrophobe, nicht mischbare Flüssigkeit (ein „Öl") als die Matrix auf, in welcher diese Tröpfchen suspendiert sind (die nicht disperse, kontinuierliche oder äußere Phase). Solche Emulsionen werden „Wasser-in-Öl" (W/O) genannt. Dieses hat den Vorteil, dass die gesamte wässrige Phase, welche die biochemischen Komponenten enthält, in diskrete Tröpfchen (die innere Phase) kompartimentiert ist. Die äußere Phase, welche ein hydrophobes Öl ist, enthält im Allgemeinen keine der biochemischen Komponenten und ist daher inert.
Die Emulsion kann durch die Zugabe von einem oder mehreren oberflächenaktiven Mitteln (Tensiden) stabilisiert werden. Diese Tenside werden Emulgiermittel genannt und wirken an der Wasser/Öl-Grenzfläche, um eine Trennung der Phasen zu verhindern (oder wenigsten zu verzögern). Viele Öle und viele Emulgatoren können für die Erzeugung von Wasser-in-Öl-Emulsionen verwendet werden; eine neuere Zusammenstellung listete über 16.000 Tenside auf, von denen viele als Emulgiermittel verwendet werden (Ash und Ash, 1993). Geeignete Öle beinhalten leichtes weißes Mineralöl und nicht ionische Tenside (Schick, 1966) wie z.B. Sorbitanmonooleat (Span^TM80; ICI) und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween^TM80; ICI).
Die Verwendung anionischer Tenside kann ebenfalls nützlich sein. Geeignete Tenside beinhalten Natriumcholat und Natriumtaurocholat. Besonders bevorzugt ist Natriumdeoxycholat, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5% w/v oder niedriger. Die Aufnahme solcher Tenside kann in manchen Fällen die Expression der genetischen Elemente und/oder die Aktivität der Genprodukte erhöhen. Die Zugabe einiger anionischen Tenside zu einer nicht emulgierten Reaktionsmischung verhindert vollständig die Translation. Während der Emulgierung wird jedoch das Tensid von der wässrigen Phase in die Grenzfläche überführt, und die Aktivität wird wieder hergestellt. Die Zugabe eines anionischen Tensids zu den Mischungen, die emulgiert werden sollen, stellt sicher, dass die Reaktionen nur nach einer Kompartimentierung ablaufen.
Die Erzeugung einer Emulsion erfordert im Allgemeinen die Anwendung von mechanischer Energie, um die Phasen zusammen zu erzwingen. Es gibt eine Vielzahl von Wegen, dieses zu tun, welche eine Vielzahl von mechanischen Vorrichtungen, einschließlich Rührern (wie z.B. magnetische Rührstäbchen, Propeller- und Turbinenrührer, Schaufelvorrichtungen und Wischer), Homogenisatoren (einschließlich Rotor-Stator-Homogenisatoren, Hochdruckventilhomogenisatoren und Strahlhomogenisatoren), Kolloidmühlen, Ultraschall- und „Membranemulgier"-Vorrichtungen, benutzen (Becher, 1957; Dickinson, 1994).
Wässrige Mikrokapseln, die in Wasser-in-Öl-Emulsionen gebildet werden, sind im Allgemeinen stabil, bei einem geringfügigen, wenn überhaupt, Austausch von genetischen Elementen oder Genprodukte zwischen den Mikrokapseln. Zusätzlich haben wir gezeigt, dass mehrere biochemische Reaktionen in Emulsionsmikrokapseln ablaufen. Darüber hinaus sind komplizierte biochemische Prozesse, namentlich Gentranskription und Translation, ebenfalls in Emulsionsmikrokapseln aktiv. Es existiert die Technologie, Emulsionen mit Volumina bis hin zu industriellen Maßstäben von Tausenden von Litern zu erzeugen (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Die bevorzugte Mikrokapselgröße wird abhängig von den genauen Anforderungen irgendeines individuellen Selektionsprozesses, der gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden soll, variieren. In allen Fällen wird es ein optimales Gleichgewicht zwischen der Größe der Genbibliothek, der benötigten Anreicherung und der benötigten Konzentration der Komponenten in den einzelnen Mikrokapseln geben, um eine effiziente Expression und Reaktivität der Genprodukte zu erreichen.
Die Prozesse der Expression müssen innerhalb von jeder einzelnen Mikrokapsel stattfinden, die von der vorliegenden Offenbarung bereit gestellt wird. Sowohl die in vitro-Transkription als auch die gekoppelte Transkription-Translation werden bei sub-nanomolaren DNA-Konzentrationen weniger effizient. Aufgrund der Anforderung, dass nur eine begrenzte Anzahl von DNA-Molekülen in jeder Mikrokapsel vorliegt, setzt dieses daher eine praktische Obergrenze für die mögliche Mikrokapselgröße. Vorzugsweise beträgt das mittlere Volumen der Mikrokapseln weniger als 5,2 × 10^–16 m³ (entsprechend einer kugelförmigen Mikrokapsel mit einem Durchmesser von weniger als 10 μm), insbesondere weniger als 6,5 × 10^–17 m³ (5 μm), noch bevorzugter ca. 4,2 × 10^–18 m³ (2 μm) und Idealerweise ca. 9 × 10^–18 m³ (2,6 μm).
Die effektive DNA- oder RNA-Konzentration in den Mikrokapseln kann durch verschiedene Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, künstlich erhöht werden. Diese beinhalten z.B. die Zugabe von volumenausschließenden Chemikalien wie z.B. Polyethylenglycolen (PEG) und eine Vielzahl von Genamplifizierungstechniken, einschließlich einer Transkription unter Verwendung von RNA-Polymerasen einschließlich denen von beispielsweise Bakterien wie z.B. E. coli (Roberts, 1969; Blattner und Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975), Eukaryoten (Weil et al., 1979; Manley et al., 1983) und einem Bakteriophagen wie z.B. T7, T3 und SP6 (Melton et al., 1984); der Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki et al., 1988); Qβ-Replicase-Amplifikation (Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin und Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); der Ligasekettenreaktion (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); und eines selbst unterhaltenden Sequenzreplikationssystems (Fahy et al., 1991) und der Strangaustauschamplifikation (Walker et al., 1992). Selbst Genamplifikationstechniken, die ein Thermocycling erfordern, wie z.B. PCR und LCR, könnten verwendet werden, wenn die Emulsionen und die in vitro-Transkriptions- oder gekoppelten Transkriptions-Translationssysteme thermostabil sind (beispielsweise könnten die gekoppelten Transkriptions-Translationssysteme aus einem thermostabilen Organismus wie z.B. Thermus aquaticus erzeugt werden).
Ein Erhöhen der effektiven lokalen Nukleinsäurekonzentration ermöglicht, dass größere Mikrokapseln effektiv verwendet werden. Dieses erlaubt eine bevorzugte praktische Obergrenze für das Mikrokapselvolumen von ca. 5,2 × 10^–16 m³ (entsprechend einer Kugel mit einem Durchmesser von 10 μm).
Die Mikrokapselgröße muss hinreichend groß sein, um all die erforderlichen Komponenten der biochemischen Reaktionen, die innerhalb der Mikrokapsel auftreten müssen, aufzunehmen. Beispielsweise erfordern in vitro sowohl die Transkriptionsreaktionen als auch die gekoppelten Transkriptions-Translationsreaktionen eine Nukleosidtriphosphat-Gesamtkonzentration von ca. 2 mM.
Um beispielsweise ein Gen zu einem einzelnen kurzen RNA-Molekül von 500 Basen in der Länge zu transkribieren, würde dieses ein Minimum von 500 Molekülen Nukleosidtriphosphat pro Mikrokapsel (8,33 × 10^–22 Mole) erfordern. Um eine 2 mM Lösung zu bilden, muss diese Anzahl von Molekülen innerhalb einer Mikrokapsel mit einem Volumen von 4,17 × 10^–19 Liter (4,17 × 10^–22 m³, welche, wenn sie kugelförmig wäre, einen Durchmesser von 93 nm hätte) enthalten sein.
Weiterhin muss insbesondere in dem Fall von Reaktionen, die eine Translation beinhalten, darauf geachtet werden, dass die Ribosomen, die nötig sind, damit die Translation stattfindet, selbst ungefähr 20 nm im Durchmesser aufweisen. Daher ist die bevorzugte Untergrenze für Mikrokapseln ein Durchmesser von ungefähr 0,1 μm (100 nm).
Daher liegt das Volumen der Mikrokapseln vorzugsweise in der Größenordnung zwischen 5,2 × 10^–22 m³ und 5,2 × 10^–16 m³, was einer Kugel mit einem Durchmesser zwischen 0,1 μm und 10 μm entspricht, insbesondere zwischen ca. 5,2 × 10^–19 m³ und 6,5 × 10^–17 m³ (1 μm und 5 μm). Kugeldurchmesser von ca. 2,6 μm sind am vorteilhaftesten.
Es ist kein bloßer Zufall, dass die bevorzugten Abmessungen der Kompartimente (Tröpfchen von 2,6 μm mittlerem Durchmesser) genau denen von Bakterien ähneln; z.B. sind Escherichia Stäbchen mit 1,1-1,5 × 2,0-6,0 μm, und Azotobacter sind ovale Zellen mit 1,5-2,0 μm Durchmesser. In ihrer einfachsten Form basiert die Darwinsche Evolution auf einem „ein Genotyp ein Phänotyp"-Mechanismus. Die Konzentration eines einzelnen kompartimentierten Gen oder Genoms fällt von 0,4 nM in einem Kompartiment von 2 μm Durchmesser auf 25 pM in einem Kompartiment von 5 μm Durchmesser. Die prokaryotische Transkriptions/Translationsmaschinerie hat sich in der Evolution entwickelt, um in Kompartimenten von ~1-2 μm Durchmesser zu arbeiten, wo einzelne Gene in ungefähr nanomolaren Konzentrationen vorliegen. Ein einzelnes Gen in einem Kompartiment von 2,6 μm Durchmesser liegt in einer Konzentration von 0,2 nM vor. Diese Genkonzentration ist hoch genug für eine effiziente Translation. Eine Kompartimentierung in einem solchen Volumen stellt ebenfalls sicher, dass selbst wenn nur ein einzelnes Molekül des Genprodukts gebildet wird, dieses mit ca. 0,2 nM vorliegt, was wichtig ist, wenn das Genprodukt eine modifizierende Aktivität für das genetische Element selbst haben soll. Das Volumen der Mikrokapsel sollte somit ausgewählt werden, indem man nicht nur die Anforderungen für die Transkription und Translation des genetischen Elements berücksichtigt, sondern ebenfalls die modifizierende Aktivität, die für das Genprodukt in dem Verfahren der Offenbarung benötigt wird.
Die Größe der Emulsionsmikrokapseln kann einfach variiert werden, indem die Emulgierbedingungen, die verwendet werden, um die Emulsion gemäß den Anforderungen des Selektionssystems zu bilden, maßgeschneidert werden. Je größer die Größe der Mikrokapsel, desto größer ist das Volumen, das benötigt wird, um eine vorgegebene Bibliothek genetischer Elemente einzukapseln, da der letztendlich begrenzende Faktor die Größe der Mikrokapsel und somit die Anzahl von Mikrokapseln, die pro Einheitsvolumen möglich ist, sein wird.
Die Größe der Mikrokapseln wird nicht nur in Bezug auf die Anforderungen des Transkripitions/Translationssystems, sondern ebenfalls die des Selektionssystems, das für das genetische Element eingesetzt wird, ausgewählt. Somit können die Komponenten des Selektionssystems wie z.B. eines chemischen Modifikationssystems Reaktionsvolumina und/oder Reagenzienkonzentrationen erfordern, die für die Transkription/Translation nicht optimal sind. Wie hierin ausgeführt können solche Erfordernisse durch einen sekundären Wiedereinkapselungsschritt erfüllt werden; darüber hinaus können sie erfüllt werden, indem die Größe der Mikrokapsel ausgewählt wird, um die Transkription/Translation und Selektion als Ganzes zu maximieren. Eine empirische Bestimmung des optimalen Mikrokapselvolumens und der Reagenzienkonzentration, beispielsweise wie hierin ausgeführt, ist bevorzugt.
Ein „genetisches Element" gemäß der vorliegenden Erfindung ist so, wie es oben beschrieben ist. Vorzugsweise ist ein genetisches Element ein Molekül oder Konstrukt, das ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem DNA-Molekül, einem RNA-Molekül, einem teilweise oder vollständig künstlichen Nukleinsäuremolekül, das aus ausschließlich synthetischen oder einer Mischung von natürlich vorkommenden und synthetischen Basen besteht, irgendeinem der vorstehenden, verknüpft mit einem Polypeptid, und irgendeinem der vorstehenden, verknüpft mit irgendeiner anderen Molekülgruppe oder einem Konstrukt. Vorteilhafterweise können die andere Molekülgruppe oder das Konstrukt ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäuren, polymeren Substanzen, insbesondere Kügelchen, z.B. Polystyrolkügelchen, magnetischen Substanzen wie z.B. magnetischen Kügelchen, Markierungen wie z.B. Fluorophoren oder Isotopmarkierungen, chemischen Reagenzien, Bindungsmitteln wie z.B. Makrozyklen und dergleichen.
Der Nukleinsäureanteil des genetischen Elements kann geeignete regulatorische Sequenzen wie z.B. jene, die zur effizienten Expression des Genprodukts benötigt werden, z.B. Promotoren, Verstärker, Translationsstartsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Spleißstellen und dergleichen umfassen.
Wie aus dem Folgenden deutlich wird, ist in vielen Fällen das Polypeptid oder die andere Molekülgruppe oder das Konstrukt ein Ligand oder ein Substrat, welches direkt oder indirekt an das Genprodukt bindet oder damit reagiert, um das genetische Element zu markieren. Dieses erlaubt die Sortierung des genetischen Elements auf der Basis der Aktivität des Genprodukts.
Der Ligand oder das Substrat kann mit der Nukleinsäure durch eine Vielzahl von Mitteln verbunden werden, die für die Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein werden (siehe z.B. Hermanson, 1996). Jede Markierung wird ausreichen, welche die anschließende Selektion des genetischen Elements erlaubt. Die Sortierung kann durch irgendein Verfahren erfolgen, welches eine bevorzugte Abtrennung, Amplifikation oder ein Überleben des markierten genetischen Elements erlaubt. Beispiele beinhalten eine Selektion durch Bin dung (einschließlich Techniken, die auf magnetischer Trennung basieren, z.B. unter Verwendung von Dynabeads^TM) und durch eine Resistenz gegenüber einem Abbau (beispielsweise durch Nukleasen, einschließlich Restriktionsendonukleasen).
Ein Weg, auf welchem das Nukleinsäuremolekül mit einem Liganden oder Substrat verknüpft werden kann, ist durch Biotinylierung. Diese kann durch PCR-Amplifikation mit einem 5'-Biotinylierungsprimer durchgeführt werden, so dass das Biotin und die Nukleinsäure kovalent verknüpft werden.
Der Ligand oder das Substrat, die selektiert werden sollen, können durch eine Vielzahl von Mitteln, die für die Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sind, an der modifizierten Nukleinsäure befestigt werden. Eine biotinylierte Nukleinsäure kann an ein Polystyrol-Mikrokügelchen (0,035 bis 0,2 μm im Durchmesser) gekoppelt werden, das mit Avidin oder Streptavidin beschichtet ist, das daher mit sehr hoher Affinität die Nukleinsäure binden wird. Dieses Kügelchen kann durch irgendein geeignetes Verfahren wie z.B. durch Zugeben des biotinylierten Substrats oder durch kovalente Kopplung mit Substrat oder Ligand derivatisiert werden.
Alternativ kann eine biotinylierte Nukleinsäure an Avidin oder Streptavidin gekoppelt werden, das mit einem großen Proteinmolekül wie z.B. Thyroglobulin (669 Kd) oder Ferritin (440 Kd) komplexiert ist. Dieser Komplex kann mit Substrat oder Ligand, z.B. durch kovalente Kopplung an die ε-Aminogruppe von Lysinen oder durch eine nicht kovalente Wechselwirkung wie z.B. Biotin-Avidin, derivatisiert werden. Das Substrat kann in einer Form vorliegen, die nicht mit dem genetischen Element verknüpft ist, aber eine inaktive „Markierung" enthält, die einen weiteren Schritt wie z.B. eine Photoaktivierung erfordert, um diese zu aktivieren (z.B. ein Biotinanaloges „im Käfig" (Sundberg et al., 1995; Pirrung und Huang, 1996)). Der Katalysator, der ausgewählt werden muss, wandelt dann das Substrat in Produkt um. Die „Markierung" könnte dann aktiviert werden und das „markierte" Substrat und/oder Produkt durch ein markierungsbindendes Molekül (z.B. Avidin oder Streptavidin), das mit der Nukleinsäure komplexiert ist, gebunden werden. Das Verhältnis von Substrat zu Produkt, das an der Nukleinsäure über die „Markierung" befestigt ist, wird daher das Verhältnis des Substrats und Produkts in Lösung widerspiegeln.
Eine Alternative ist es, die Nukleinsäure an einen produktspezifischen Antikörper (oder ein anderes produktspezifisches Molekül) zu koppeln. Bei diesem Szenario liegt das Substrat (oder eines der Substrate) in jeder Mikrokapsel unverknüpft mit dem genetischen Element vor, weist aber eine molekulare „Markierung" auf (beispielsweise Biotin, DIG oder DNP). Wenn der Katalysator, der selektiert werden soll, das Substrat in Produkt umwandelt, behält das Produkt die „Markierung" bei und wird dann in der Mikrokapsel durch den produktspezifischen Antikörper eingefangen. Auf diesem Weg wird das genetische Element nur mit der „Markierung" assoziiert, wenn es ein Enzym codiert oder erzeugt, das in der Lage ist, Substrat in Produkt umzuwandeln.
Wenn alle Reaktionen gestoppt werden und die Mikrokapseln vereinigt werden, können die genetischen Elemente, die aktive Enzyme codieren, angereichert werden, indem ein Antikörper oder ein anderes Molekül, welches spezifisch an die „Markierung" bindet oder damit reagiert, verwendet wird. Auch wenn sowohl Substrate als auch Produkt die molekulare Markierung aufweisen, werden nur die genetischen Elemente, die aktives Genprodukt codieren, mit gereinigt.
Die Ausdrücke „Isolieren", „Sortieren" und „Selektieren" wie auch Variationen von diesen werden hierin verwendet. Isolation bezieht sich gemäß der vorliegenden Offenbarung auf den Prozess der Abtrennung einer Einheit von einer heterogenen Population, beispielsweise einer Mischung, so dass sie frei von wenigstens einer Substanz ist, mit welcher sie vor dem Isolationsprozess assoziiert war. In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich Isolation auf die Reinigung einer Einheit im Wesentlichen bis zur Homogenität. Sortieren einer Einheit bezieht sich auf den Prozess des bevorzugten Isolierens gewünschter Einheiten gegenüber unerwünschten Einheiten. Insoweit wie dieses die Isolation der gewünschten Einheiten betrifft, sind die Ausdrücke „Isolieren" und „Sortieren" äquivalent. Das Verfahren der vorliegenden Offenbarung erlaubt das Sortieren von gewünschten genetischen Elementen aus Pools (Bibliotheken oder Repertoires) von genetischen Elementen, welche das gewünschte genetische Element enthalten. Selektieren wird verwendet, um sich auf den Prozess (einschließlich des Sortierprozesses) des Isolierens einer Einheit gemäß einer bestimmten Eigenschaft von dieser zu beziehen.
Bei einer in hohem Maße bevorzugten Anwendung ist das Verfahren der vorliegenden Offenbarung nützlich, um Bibliotheken genetischer Elemente zu sortieren. Die Offenbarung stellt demgemäß ein Verfahren gemäß vorhergehenden Aspekten der Offenbarung bereit, worin die genetischen Elemente aus einer Bibliothek von genetischen Elementen, die ein Repertoire von Genprodukten codieren, isoliert werden. Hierin werden die Ausdrü cke „Bibliothek", „Repertoire" und „Pool" entsprechend ihrer gewöhnlichen Bedeutung auf dem Gebiet der Technik verwendet, so dass eine Bibliothek von genetischen Elementen ein Repertoire von Genprodukten codiert. Im Allgemeinen werden Bibliotheken aus Pools von genetischen Elementen konstruiert und weisen Eigenschaften auf, die ein Sortieren erleichtern.
Die anfängliche Selektion eines genetischen Elements aus einer Bibliothek genetischer Elemente unter Verwendung der vorliegenden Offenbarung wird in den meisten Fällen das Screenen einer großen Anzahl von Varianten genetischer Elemente erfordern. Bibliotheken genetischer Elemente können auf einer Vielzahl von verschiedenen Wegen, einschließlich der folgenden, erzeugt werden.
Pools von natürlich vorkommenden genetischen Elementen können aus genomischer DNA oder cDNA kloniert werden (Sambrook et al., 1989); z.B. haben sich Phagen-Antikörper-Bibliotheken, die durch PCR-Amplifikation von Repertoires von Antikörpergenen aus immunisierten oder nicht immunisierten Spendern erzeugt wurden, als sehr erfolgreiche Quellen für funktionale Antikörperfragmente erwiesen (Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997). Bibliotheken von Genen können ebenfalls erzeugt werden, indem alle (siehe z.B. Smith, 1985; Parmley und Smith, 1988) oder ein Teil der Gene (siehe z.B. Lowman et al., 1991) oder Pools der Gene (siehe z.B. Nissim et al., 1994) durch ein randomisiertes oder dotiertes synthetisches Oligonukleotid codiert werden. Bibliotheken können ebenfalls erzeugt werden, indem Mutationen in ein genetisches Element oder einen Pool genetischer Elemente „zufällig" durch eine Vielzahl von Techniken in vivo eingeführt werden, einschließlich der Verwendung von „Mutatorstämmem" von Bakterien wie z.B. E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996); unter Verwendung des Antikörper-Hypermutationssystems von B-Lymphozyten (Yelamos et al., 1995). Zufällige Mutationen können ebenfalls sowohl in vivo als auch in vitro durch chemische Mutagene und ionisierende oder UV-Strahlung (siehe Friedberg et al., 1995) oder Einbau von mutagenen Basenanaloga (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996) eingeführt werden. „Zufällige" Mutationen können ebenfalls in vitro während der Polymerisation beispielsweise durch Verwendung von fehleranfälligen Polymerasen, in Gene eingeführt werden (Leung et al., 1989).
Eine weitere Diversifizierung kann eingeführt werden, indem eine homologe Rekombination entweder in vivo (siehe Kowalczykowski et al., 1994) oder in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b) verwendet wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung wird daher ein Verfahren der in vitro-Evolution bereit gestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Selektieren von einem oder mehreren genetischen Elementen aus einer Bibliothek genetischer Elemente gemäß der vorliegenden Offenbarung;
(b) Mutieren des (der) selektierten genetischen Elements (Elemente), um eine weitere Bibliothek genetischer Elemente zu erzeugen, welche ein Repertoire an Genprodukten codiert; und
(c) iteratives Wiederholen der Schritte (a) und (b), um ein Genprodukt mit einer verstärkten Aktivität zu erhalten.

Mutationen können wie oben ausgeführt in das genetische Element (die genetischen Elemente) eingeführt werden.
Die genetischen Elemente gemäß der Offenbarung codieren vorteilhafterweise Enzyme, vorzugsweise von pharmakologischem oder industriellem Interesse, Aktivatoren oder Inhibitoren, insbesondere von biologischen Systemen, wie z.B. zellulären Signaltransduktionsmechanismen, Antikörper und Fragmente von diesen, andere Bindungsmittel, die für diagnostische und therapeutische Anwendungen geeignet sind. Unter einem bevorzugten Aspekt erlaubt daher die Offenbarung die Identifikation und Isolation von klinisch oder industriell nützlichen Produkten. Unter einem weiteren Aspekt der Offenbarung wird ein Produkt bereit gestellt, wenn es durch das Verfahren der Offenbarung isoliert wird.
Die Auswahl von geeigneten Einkapselungsbedingungen ist wünschenswert. Abhängig von der Komplexität und Größe der Bibliothek, die gescreent werden soll, kann es nützlich sein, die Einkapselungsprozedur so anzusetzen, dass 1 oder weniger als 1 genetisches Element pro Mikrokapsel eingekapselt wird. Dieses wird das größte Auflösungsvermögen liefern. Wenn die Bibliothek größer und/oder komplexer ist, kann dieses jedoch unpraktikabel sein; es kann bevorzugt sein, mehrere genetische Elemente zusammen einzukap seln und auf die wiederholte Anwendung des Verfahrens der Offenbarung zu vertrauen, um eine Sortierung der gewünschten Aktivität zu erreichen. Eine Kombination von Einkapselungsprozeduren kann verwendet werden, um die gewünschte Anreicherung zu erhalten.
Theoretische Studien zeigen, dass es, je größer die Anzahl an Varianten von genetischen Elementen ist, die erzeugt wird, umso wahrscheinlicher ist, dass ein Molekül mit den gewünschten Eigenschaften erzeugt wird (siehe Perelson und Oster, 1979, für eine Beschreibung darüber, wie dieses auf Repertoires von Antikörpern zutrifft). Vor kurzem wurde ebenfalls praktisch bestätigt, dass größere Phagen-Antikörper-Repertoires tatsächlich mehr Antikörper mit besseren Bindungsaffinitäten als kleinere Repertoires hervorrufen (Griffiths et al., 1994). Um sicher zu stellen, dass seltene Varianten erzeugt werden und somit selektiert werden können, ist eine große Größe der Bibliothek wünschenswert. Somit ist die Verwendung von optimal kleinen Mikrokapseln vorteilhaft.
Das größte Repertoire, das bis heute unter Verwendung von Methoden erzeugt wurde, die einen in vivo-Schritt erfordern (Phagen-Display- und LacI-Systeme), war eine Phagen-Peptid-Bibliothek mit 1,6 × 10¹¹ Klonen, was die Fermentation von 15 Litern Bakterien erforderte (Fisch et al., 1996). SELEX-Experimente werden oft mit sehr großen Zahlen von Varianten durchgeführt (bis zu 10¹⁵).
Unter Verwendung der vorliegenden Offenbarung kann bei einem bevorzugten Mikrokapseldurchmesser von 2,6 μm eine Repertoiregröße von wenigstens 10¹¹ selektiert werden, indem eine wässrige Phase von 1 ml in einer Emulsion von 20 ml verwendet wird.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen genetischen Elementen werden die Mikrokapseln gemäß der Offenbarung weitere Komponenten umfassen, die benötigt werden, damit der Sortierprozess stattfinden kann. Andere Komponenten des Systems werden beispielsweise jene umfassen, die zur Transkription und/oder Translation des genetischen Elements nötig sind. Diese werden für die Bedürfnisse eines spezifischen Systems aus den folgenden ausgewählt: einem geeigneten Puffer, einem in vitro-Transkriptions/Translationssystem und/oder einem in vitro-Translationssystem, enthaltend alle nötigen Bestandteile, Enzyme und Kofaktoren, RNA-Polymerase, Nukleotide, Nukleinsäuren (natürlich oder synthetisch), Transfer-RNAs, Ribosomen und Aminosäuren und die Sub strate der Reaktion von Interesse, um die Selektion des modifizierten Genprodukts zu erlauben.
Ein geeigneter Puffer wird ein solcher sein, in welchem all die gewünschten Komponenten des biologischen Systems aktiv sind, und wird daher von den Bedürfnissen jedes spezifischen Reaktionssystems abhängen. Puffer, die für biologische und/oder chemische Reaktionen geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt und Rezepte werden in verschiedenen Laborbüchern wie z.B. Sambrook et al., 1989 bereit gestellt.
Das in vitro-Translationssystem wird gewöhnlich einen Zellextrakt, typischerweise aus Bakterien (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), Kaninchenretikulozyten (Pelham und Jackson, 1976) oder Weizenkeim (Anderson et al., 1983), umfassen. Viele geeignete Systeme sind im Handel erhältlich (beispielsweise von Promega), einschließlich einiger, welche eine gekoppelte Transkription/Translation erlauben (alle bakteriellen Systeme und die Retikulozyten- und Weizenkeim-TNT^TM-Extraktsysteme von Promega). Die Mischung der verwendeten Aminosäuren kann, wenn gewünscht, synthetische Aminosäuren beinhalten, um die mögliche Anzahl oder Varietät von Proteinen, die in der Bibliothek erzeugen werden, zu erhöhen. Dieses kann erreicht werden, indem tRNAs mit künstlichen Aminosäuren beladen werden und diese tRNAs für die in vitro-Translation der Proteine, die selektiert werden sollen, verwendet werden (Ellman et al., 1991; Renner, 1994; Mendel et al., 1995).
Nach jeder Selektionsrunde kann die Anreicherung des Pools von genetischen Elementen im Hinblick auf jene, welche die Moleküle von Interesse codieren, durch nicht kompartimentierte in vitro-Transkription/Replikation oder gekoppelte Transkriptions/Translationsreaktionen getestet werden. Der selektierte Pool wird in einen geeigneten Plasmidvektor kloniert, und RNA oder rekombinantes Protein wird aus den einzelnen Klonen für eine weitere Reinigung und zum Testen erzeugt.
Die Offenbarung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Erzeugung eines Genprodukts, sobald ein genetisches Element, welches das Genprodukt codiert, durch das Verfahren der Offenbarung sortiert wurde. Natürlich kann das genetische Element selbst direkt durch herkömmliche Mittel exprimiert werden, um das Genprodukt zu erzeugen. Jedoch können alternative Techniken eingesetzt werden, wie sie für die Fachleute auf dem Gebiet der Technik offensichtlich sein werden. Beispielsweise kann die genetische Information, die in das Genprodukt eingebaut ist, in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden und daraus exprimiert werden.
Die Offenbarung beschreibt ebenfalls die Verwendung von herkömmlichen Screeningtechniken, um Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, mit den Genprodukten wechselzuwirken, die durch den ersten Aspekt der Offenbarung identifiziert wurden. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird eine ein Genprodukt codierende Nukleinsäure in einen Vektor eingebaut und in geeignete Wirtszellen eingeführt, um transformierte Zelllinien zu erzeugen, die das Genprodukt exprimieren. Die resultierenden Zelllinien können dann für eine reproduzierbare qualitative und/oder quantitative Analyse der Wirkung(en) möglicher Arzneimittel, welche die Funktion des Genprodukts beeinflussen, erzeugt werden. So können das Genprodukt exprimierende Zellen zur Identifizierung von Verbindungen, insbesondere Verbindungen mit kleinem Molekulargewicht, eingesetzt werden, welche die Funktion des Genprodukts modulieren. Somit sind Wirtszellen, welche das Genprodukt exprimieren, nützlich zum Screenen von Arzneimitteln, und es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen bereitzustellen, welche die Aktivität des Genprodukts modulieren, wobei das Verfahren das Exponieren von Zellen, die heterologe DNA, die ein Genprodukt codiert, enthalten, wobei die Zellen ein funktionales Genprodukt erzeugen, an wenigstens eine Verbindung oder eine Mischung von Verbindungen oder ein Signal, dessen Fähigkeit, die Aktivität des Genprodukts zu modulieren, bestimmt werden soll, und danach das Überwachen der Zellen im Hinblick auf Veränderungen, die durch die Modulation verursacht werden, umfasst. Ein solcher Test ermöglicht die Identifikation von Modulatoren wie z.B. Agonisten, Antagonisten und allosterischen Modulatoren des Genprodukts. Wie hierin verwendet bezieht sich eine Verbindung oder ein Signal, welches die die Aktivität eines Genprodukts moduliert, auf eine Verbindung, welche die Aktivität des Genprodukts in einer solchen Weise verändert, dass die Aktivität des Genprodukts in der Gegenwart der Verbindung oder des Signals verschieden ist (im Vergleich zu der Abwesenheit der Verbindung oder des Signals).
Auf Zellen basierende Screeningtests können entworfen werden, indem Zelllinien konstruiert werden, bei welchen die Expression eines Reporterproteins, d.h. eines leicht zu testenden Proteins wie z.B. b-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) oder Luziferase, von dem Genprodukt abhängt. Ein solcher Test ermöglicht den Nachweis von Verbindungen, welche die Funktion des Genprodukts direkt modulieren, wie z.B. Ver bindungen, welche dem Genprodukt entgegenwirken, oder Verbindungen, die andere zelluläre Funktionen, die für die Aktivität des Genprodukts benötigt werden, inhibieren oder potenzieren.
Die vorliegende Offenbarung stellt ebenfalls ein Verfahren bereit, um von dem Genprodukt abhängige Prozesse, die in Zellen auftreten, exogen zu beeinflussen. Ein rekombinantes Genprodukt erzeugende Wirtszellen, z.B. Säugetierzellen, können mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden, und die modulierende Wirkung(en) von dieser können dann ausgewertet werden, indem die von dem Genprodukt vermittelte Antwort in der Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung verglichen wird oder indem die von dem Genprodukt vermittelte Antwort von Testzellen oder Kontrollzellen (d.h. Zellen, die das Genprodukt nicht exprimieren) mit dem Vorliegen der Verbindung in Bezug gesetzt wird.
Unter einem weiteren Aspekt betrifft die Offenbarung ein Verfahren zum Optimieren eines Produktionsprozesses, an welchem wenigstens ein Schritt beteiligt ist, der durch ein Polypeptid erleichtert wird. Beispielsweise kann der Schritt ein katalytischer Schritt sein, welcher durch ein Enzym erleichtert wird. Somit stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung oder von Verbindungen bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer Synthesevorschrift, in welcher wenigstens ein Schritt durch ein Polypeptid erleichtert wird;
(b) Herstellen von genetischen Elementen, welche Varianten des Polypeptids, welches diesen Schritt erleichtert, codieren;
(c) Kompartimentieren der genetischen Elemente in Mikrokapseln;
(d) Exprimieren der genetischen Elemente, um deren entsprechende Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu erzeugen;
(e) Sortieren der genetischen Elemente, welche ein Polypeptid-Genprodukt(e) mit der gewünschten Aktivität erzeugen; und
(f) Herstellen der Verbindung oder Verbindungen unter Verwendung des Polypeptidgenprodukts, das in (e) identifiziert wurde, um den relevanten Schritt der Synthese zu erleichtern.

Mittels der Offenbarung können Enzyme, die an der Herstellung einer Verbindung beteiligt sind, durch Selektion im Hinblick auf eine optimale Aktivität optimiert werden. Die Prozedur beinhaltet die Herstellung von Varianten des zu screenenden Polypeptids, welche einer Bibliothek von Polypeptiden wie einer solchen, auf welche hierin Bezug genommen wird, gleichen. Die Varianten können auf dieselbe Weise hergestellt werden wie die Bibliotheken, die an anderer Stelle hierin diskutiert wurden.
(B) SELEKTIONSPROZEDUREN
Das System kann konfiguriert werden, um auf RNA, DNA oder Proteingenproduktmoleküle mit katalytischer, regulatorischer oder Bindungsaktivität zu selektieren.
(i) AFFINITÄTSSELEKTION
Im Fall einer Selektion auf ein Genprodukt mit Affinität für einen spezifischen Liganden kann das genetische Element in der Mikrokapsel über den Liganden mit dem Genprodukt verknüpft werden. Nur Genprodukte mit Affinität für den Liganden werden daher an das genetische Element selbst binden, und daher werden nur genetische Elemente, die aktives Produkt produzieren, in dem Selektionsschritt zurückgehalten werden. Bei dieser Ausführungsform wird das genetische Element somit eine Nukleinsäure, die das Genprodukt codiert, verknüpft mit einem Liganden für das Genprodukt umfassen.
Bei dieser Ausführungsform enthalten alle Genprodukte, die selektiert werden sollen, eine mutmaßliche Bindungsdomäne, auf welche selektiert werden soll, und ein gemeinsames Merkmal – eine Markierung. Das genetische Element in jeder Mikrokapsel ist körperlich mit dem Liganden verknüpft. Wenn das Genprodukt, das von dem genetischen Element erzeugt wird, Affinität für den Liganden aufweist, wird es an diesen binden und körperlich mit demselben genetischen Element, das dieses codiert, verknüpft werden, was dazu führt, dass das genetische Element „markiert" wird. Am Ende der Reaktion werden alle Mikrokapseln vereinigt, und alle genetischen Elemente und Genprodukte werden in einer Umgebung zusammen gepoolt. Die genetischen Elemente, die Genprodukte codieren, welche die gewünschte Bindung zeigen, können durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Moleküls, das spezifisch an die „Markierung" bindet oder damit spezifisch reagiert, selektiert werden.
Bei einer alternativen Ausführungsform können genetische Elemente auf der Basis sortiert werden, dass das Genprodukt, welches an den Liganden bindet, den Liganden vor beispielsweise weiteren Bindungspartnern lediglich versteckt. Bei dieser Möglichkeit kann das genetische Element, statt dass es während eines Affinitätsreinigungsschrittes zurückgehalten wird, selektiv eluiert werden, während andere genetische Elemente gebunden werden.
Bei einer alternativen Ausführungsform stellt die Offenbarung ein Verfahren bereit, wobei in Schritt (b) die Genprodukte an genetische Elemente, welche diese codieren, binden. Die Genprodukte zusammen mit den befestigten genetischen Elementen werden dann als eine Folge der Bindung eines Liganden an Genprodukte mit der gewünschten Aktivität sortiert. Beispielsweise können alle Genprodukte einen unveränderlichen Bereich, welcher kovalent oder nicht kovalent an das genetische Element bindet, und einen zweiten Bereich, welcher diversifiziert ist, um so die gewünschte Bindungsaktivität zu erzeugen, enthalten.
Die Sortierung durch Affinität ist abhängig von dem Vorliegen von zwei Mitgliedern eines Bindungspaares unter solchen Bedingungen, dass eine Bindung stattfinden kann. Jegliches Bindungspaar kann zu diesem Zweck verwendet werden. Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck Bindungspaar auf jegliches Paar von Molekülen, die in der Lage sind, aneinander zu binden. Beispiele für Bindungspaare, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten ein Antigen und einen Antikörper oder ein Fragment von diesem, die in der Lage sind, das Antigen zu binden, das Paar Biotin-Avidin/Streptavidin (Savage et al., 1994), ein Calcium-abhängiges bindendes Polypeptid und einen Liganden dafür (z.B. Calmodulin und ein Calmodulin bindendes Peptid (Stofko et al., 1992; Montigiani et al., 1996)), Paare von Polypeptiden, die sich unter Bildung eines Leucin-Zippers zusammensetzen (Tripet et al., 1996), Histidine (typischerweise Hexahistidinpeptide) und chelatgebundenes Cu²⁺, Zn²⁺ und Ni²⁺ (z.B. Ni-NTA; Hochuli et al., 1987), RNA bindende und DNA bindende Proteine (Klug, 1995) einschließlich jener, die Zinkfingermotive enthalten (Klug und Schwabe, 1995), und DNA-Methyltransferasen (Anderson, 1993) und deren Nukleinsäurebindungsstellen.
(ii) KATALYSE
Wenn eine Selektion im Hinblick auf die Katalyse stattfindet, kann das genetische Element in jeder Mikrokapsel das Substrat der Reaktion umfassen. Wenn das genetische Element ein Genprodukt codiert, das in der Lage ist, als ein Katalysator zu wirken, wird das Genprodukt die Umwandlung des Substrats in das Produkt katalysieren. Daher ist am Ende der Reaktion das genetische Element körperlich mit dem Produkt der katalysierten Reaktion verknüpft. Wenn die Mikrokapseln vereinigt werden und die Reaktanden gepoolt werden, können genetische Elemente, die katalytische Moleküle codieren, durch Selektieren auf irgendeine Eigenschaft, die für das Produkt spezifisch ist, angereichert werden (1).
Beispielsweise kann die Anreicherung durch Affinitätsreinigung erfolgen, indem ein Molekül (z.B. ein Antikörper) verwendet wird, der spezifisch an das Produkt bindet. In gleicher Weise kann das Genprodukt die Wirkung haben, eine Nukleinsäurekomponente des genetischen Elements, z.B. durch Methylierung (oder Demethylierung) oder Mutation der Nukleinsäure, zu modifizieren, was diese resistent gegen oder anfällig für einen Angriff durch Nukleasen wie z.B. Restriktionsendonukleasen macht.
Alternativ kann die Selektion indirekt durchgeführt werden, indem eine erste Reaktion mit nachfolgenden Reaktionen gekoppelt wird, die in derselben Mikrokapsel stattfinden. Es gibt zwei allgemeine Wege, auf welchen dieses durchgeführt werden kann. Erstens könnte das Produkt der ersten Reaktion mit einem Molekül umgesetzt werden oder von diesem gebunden werden, welches nicht mit dem Substrat der ersten Reaktion reagiert. Eine zweite, gekoppelte Reaktion wird nur in der Gegenwart des Produkts der ersten Reaktion ablaufen. Ein aktives genetisches Element kann dann durch Selektion auf die Eigenschaften des Produkts der zweiten Reaktion gereinigt werden.
Alternativ kann das Produkt der Reaktion, die selektiert wird, das Substrat oder ein Kofaktor für eine zweite enzymkatalysierte Reaktion sein. Das Enzym, um die zweite Reaktion zu katalysieren, kann entweder in situ in den Mikrokapseln translatiert werden oder vor der Mikroeinkapselung in die Reaktionsmischung eingebaut werden. Nur wenn die erste Reaktion abläuft, wird das gekoppelte Enzym ein selektierbares Produkt erzeugen.
Dieses Konzept der Kopplung kann vervollkommnet werden, um multiple Enzyme einzubauen, von denen jedes als ein Substrat das Produkt der vorhergehenden Reaktion verwendet. Dieses erlaubt eine Selektion von Enzymen, die nicht mit einem immobilisierten Substrat reagieren werden. Es kann ebenfalls so gestaltet werden, dass es durch Signalamplifikation eine erhöhte Empfindlichkeit ergibt, wenn ein Produkt von einer Reaktion ein Katalysator oder ein Kofaktor für eine zweite Reaktion oder eine Reihe von Reaktionen ist, die zu einem selektierbaren Produkt führen (als Beispiel siehe Johannsson und Bates, 1988; Johannsson, 1991). Weiterhin kann ein Enzymkaskadensystem auf der Produktion eines Aktivators für ein Enzym oder der Zerstörung eines Enzyminhibitors basieren (siehe Mize et al., 1989). Die Kopplung hat ebenfalls den Vorteil, dass ein gemeinsames Selektionssystem für eine ganze Gruppe von Enzymen, welche dasselbe Produkt erzeugen, verwendet werden kann und die Selektion von komplizierten chemischen Transformationen, die nicht in einem einzigen Schritt durchgeführt werden können, erlaubt.
Ein solches Verfahren der Kopplung ermöglicht somit die Entwicklung neuer "metabolischer Stoffwechselwege" in vitro in einer schrittweisen Art, wobei zunächst ein Schritt und dann der nächste selektiert und verbessert wird. Die Selektionsstrategie basiert auf dem Endprodukt des Stoffwechselwegs, so dass alle früheren Schritte unabhängig oder nacheinander entwickelt werden können, ohne für jeden Schritt der Reaktion ein neues Selektionssystem einzurichten.
Ausgedrückt in einer alternativen Weise wird ein Verfahren zum Isolieren eines oder mehrerer genetischer Elemente, die ein Genprodukt mit einer gewünschten katalytischen Aktivität codieren, bereit gestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

(1) Exprimieren genetischer Elemente, um deren entsprechende Genprodukte zu ergeben;
(2) Ermöglichen, dass die Genprodukte die Umwandlung eines Substrats in ein Produkt katalysieren, welches entsprechend der gewünschten Aktivität direkt selektierbar sein kann oder nicht;
(3) gegebenenfalls Koppeln der ersten Reaktion an eine oder mehrere nachfolgende Reaktionen, wobei jede Reaktion durch das Produkt der vorhergehenden Reaktionen moduliert wird und zu der Erzeugung eines letzten, selektierbaren Produkts führt;
(4) Verknüpfen des selektierbaren Produkts der Katalyse mit den genetischen Elementen, entweder durch: a) Koppeln eines Substrats an die genetischen Elemente in einer solchen Weise, dass das Produkt mit den genetischen Elementen assoziiert bleibt, oder b) Umsetzen oder Binden des selektierbaren Produkts mit den/an die genetischen Elemente(n) mittels einer geeigneten molekularen „Markierung", die an dem Substrat befestigt ist, welche an dem Produkt verbleibt, oder c) Koppeln des selektierbaren Produkts (nicht aber des Substrats) an die genetischen Elemente mittels einer produktsspezifischen Reaktion oder Wechselwirkung mit dem Produkt; und
(5) Selektieren des Produkts der Katalyse, zusammen mit dem genetischen Element, an welches dieses gebunden ist, entweder mittels einer spezifischen Reaktion oder Wechselwirkung mit dem Produkt oder durch Affinitätsreinigung unter Verwendung einer geeigneten molekularen „Markierung", die an dem Produkt der Katalyse befestigt ist, wobei in den Schritten (1) bis (4) jedes genetische Element und das entsprechende Genprodukt innerhalb einer Mikrokapsel enthalten sind.

(iii) REGULATION
Ein ähnliches System kann verwendet werden, um auf regulatorische Eigenschaften von Enzymen zu selektieren.
In dem Fall einer Selektion auf ein Regulatormolekül, welches als ein Aktivator oder Inhibitor eines biochemischen Prozesses wirkt, können die Komponenten des biochemischen Prozesses entweder in situ in jeder Mikrokapsel translatiert werden oder können vor der Mikroeinkapselung in die Reaktionsmischung eingebaut werden. Wenn das genetische Element, das selektiert wird, dazu dient, einen Aktivator zu codieren, kann die Selektion auf das Produkt der regulierten Reaktion wie oben in Verbindung mit der Katalyse beschrieben durchgeführt werden. Wenn ein Inhibitor gewünscht wird, kann die Selektion im Hinblick auf eine chemische Eigenschaft erfolgen, die für das Substrat der regulierten Reaktion spezifisch ist.
Es wird daher ein Verfahren zum Sortieren eines oder mehrerer genetischer Elemente, die für ein Genprodukt codieren, das eine gewünschte regulatorische Aktivität zeigt, bereit gestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

(1) Exprimieren genetischer Elemente, um deren entsprechende Genprodukte zu ergeben;
(2) Ermöglichen, dass die Genprodukte eine biochemische Reaktion oder eine Folge von gekoppelten Reaktionen entsprechend der gewünschten Aktivität aktivieren oder inhibieren, in einer solchen Weise, dass die Erzeugung oder das Überleben eines selektierbaren Moleküls ermöglicht wird;
(3) Verknüpfen des selektierbaren Moleküls mit den genetischen Elementen durch entweder: a) Befestigen des selektierbaren Moleküls oder des Substrats, von dem dieses abgeleitet ist, an den genetischen Elementen oder b) Umsetzen oder Binden des selektierbaren Produkts mit den/an die genetischen Elemente(n) mittels einer geeigneten molekularen „Markierung", die an dem Substrat befestigt ist, welche an dem Produkt verbleibt oder c) Koppeln des Produkts der Katalyse (nicht aber des Substrats) an die genetischen Elemente, mittels einer produktspezifischen Reaktion oder Wechselwirkung mit dem Produkt;
(4) Selektieren des selektierbaren Produkts, zusammen mit dem genetischen Element, an welches dieses gebunden ist, entweder mittels einer spezifischen Reaktion oder Wechselwirkung mit dem selektierbaren Produkt oder durch Affinitätsreinigung unter Verwendung einer geeigneten molekularen „Markierung", die an dem Produkt der Katalyse befes tigt ist, wobei in den Schritten (1) bis (4) jedes genetische Element und das entsprechende Genprodukt innerhalb einer Mikrokapsel enthalten sind.

(iv) MIKROKAPSELSORTIERUNG
Die Offenbarung sorgt für die Sortierung von intakten Mikrokapseln, wo dieses durch die Sortierungstechniken, die eingesetzt werden, ermöglicht wird. Mikrokapseln können als solche sortiert werden, wenn die Veränderung, die durch das gewünschte Genprodukt hervorgerufen wird, entweder an der Oberfläche der Mikrokapsel stattfindet oder sich dort manifestiert oder außerhalb der Mikrokapsel nachweisbar ist. Die Veränderung kann durch die direkte Wirkung des Genprodukts oder indirekt hervorgerufen werden, wobei eine Reihe von Reaktionen, von denen das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität an einer oder mehreren beteiligt ist, zu der Veränderung führt. Beispielsweise kann die Mikrokapsel so konfiguriert sein, dass das Genprodukt an ihrer Oberfläche zur Schau gestellt wird und somit für Reagenzien zugänglich ist. Wenn die Mikrokapsel eine membranöse Mikrokapsel ist, kann das Genprodukt auf die Membran der Mikrokapsel abzielen oder kann das Abzielen (targeting) eines Moleküls auf diese hervorrufen. Dieses kann beispielsweise erreicht werden, indem eine Membranlokalisationssequenz, wie jene, die von Membranproteinen abgeleitet sind, eingesetzt wird, welche den Einbau eines fusionierten oder verknüpften Moleküls in die Membran der Mikrokapsel begünstigen wird. Wo alternativ die Mikrokapsel durch Phasenaufteilung wie z.B. bei Wasser-in-Öl-Emulsionen gebildet wird, wird ein Molekül mit Teilen, welche in der extrakapsulären Phase besser löslich sind, diese derart anordnen, dass sie an der Grenze der Mikrokapsel vorliegen.
Bei einem bevorzugten Aspekt der Offenbarung wird jedoch die Mikrokapselsortierung auf Sortierungssysteme angewendet, welche auf einer Änderung bei den optischen Eigenschaften der Mikrokapsel, z.B. Absorptions- oder Emissionscharakteristika von dieser, z.B. einer Änderung bei den optischen Eigenschaften der Mikrokapsel, die aus einer Reaktion resultiert, die zu Veränderungen bei der Extinktion, Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz führt, die mit der Mikrokapsel assoziiert ist, beruhen. Alle solche Eigenschaften sind von dem Begriff „optisch" umfasst. In einem solchen Fall können Mikrokapseln durch Lumineszenz-, Fluoreszenz- oder Phosphoreszenz-aktivierte Sortierung sortiert werden. Bei einer in hohem Maße bevorzugten Ausführungsform wird eine durch Fluoreszenz aktivierte Sortierung eingesetzt, um Mikrokapseln zu sortieren, in welchen die Produktion eines Genprodukts mit einer gewünschten Aktivität von der Produktion eines fluoreszierenden Moleküls in der Zelle begleitet wird. Beispielsweise kann das Genprodukt selbst fluoreszierend, z.B. ein fluoreszierendes Protein wie z.B. GFP, sein. Alternativ kann das Genprodukt die Fluoreszenz eines anderen Moleküls induzieren oder modifizieren, indem es beispielsweise an dieses bindet oder damit reagiert.
(v) MIKROKAPSELIDENTIFIKATION
Mikrokapseln können mit Hilfe einer Veränderung identifiziert werden, die durch das gewünschte Genprodukt hervorgerufen wird, welche entweder an der Oberfläche der Mikrokapsel auftritt oder sich dort manifestiert oder von außerhalb nachweisbar ist, wie in Abschnitt iii (Mikrokapselsortierung) beschrieben wird. Diese Änderung wird, wenn sie identifiziert wurde, verwendet, um die Modifikation des Gens innerhalb des Kompartiments auszulösen. Unter einem bevorzugten Aspekt der Offenbarung beruht die Identifikation der Mikrokapsel auf einer Veränderung bei den optischen Eigenschaften der Mikrokapsel, die aus einer Reaktion resultiert, die zu Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz innerhalb der Mikrokapsel führt. Die Modifikation des Gens innerhalb der Mikrokapseln würde durch die Identifikation der Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz ausgelöst. Beispielsweise kann die Identifikation der Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz den Beschuss des Kompartiments mit Photonen (oder anderen Partikeln oder Wellen) auslösen, was zu einer Modifikation des genetischen Elements führt. Eine ähnliche Prozedur wurde vorher für die schnelle Sortierung von Zellen beschrieben (Keij et al., 1994). Eine Modifikation des genetischen Elements kann beispielsweise aus der Kopplung einer molekularen „Markierung", die von einem Käfig einer photolabilen Schutzgruppe umgeben ist, an die genetischen Elemente folgen: der Beschuss mit Photonen einer geeigneten Wellenlänge führt zu der Entfernung des Käfigs. Danach werden alle Mikrokapseln vereinigt und die genetischen Elemente in einer Umgebung zusammen gepoolt. Genetische Elemente, die Genprodukte codieren, welche die gewünschte Aktivität zeigen, können durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Moleküls, das spezifisch an die „Markierung" bindet oder spezifisch damit reagiert, selektiert werden.
(vi) MEHRSCHRITTPROZEDUR
Es wird ebenfalls anerkannt werden, dass es gemäß der vorliegenden Offenbarung nicht für alle Prozesse der Transkription/Replikation und/oder Translation und Selektion nötig ist, in einem einzigen Schritt abzulaufen, wo alle Reaktionen in einer Mikrokapsel stattfin den. Die Selektionsprozedur kann zwei oder mehr Schritte umfassen. Zuerst kann die Transkription/Replikation und/oder Translation jedes genetischen Elements einer Bibliothek genetischer Elemente in einer ersten Mikrokapsel stattfinden. Jedes Genprodukt wird dann mit dem genetischen Element verknüpft, welches es codierte (welches in derselben Mikrokapsel vorliegt). Die Mikrokapseln werden dann aufgebrochen, und die genetischen Elemente, die an ihren entsprechenden Genprodukten befestigt sind, gegebenenfalls gereinigt. Alternativ können die genetischen Elemente an ihren entsprechenden Genprodukten befestigt werden, indem Verfahren verwendet werden, die nicht auf einer Einkapselung beruhen. Beispiele sind Phagen-Display (Smith, G.P., 1985), Polysomen-Display (Mattheakkis et al., 1994), RNA-Peptid-Fusion (Roberts und Szostak, 1997) oder lac-Repressor-Peptid-Fusion (Cull, et al., 1992).
In dem zweiten Schritt der Prozedur wird jedes gereinigte genetische Element, das an seinem Genprodukt befestigt ist, in eine zweite Mikrokapsel gegeben, die Komponenten der Reaktion, die selektiert werden soll, enthält. Diese Reaktion wird dann initiiert. Nach Abschluss der Reaktionen werden die Mikrokapseln wieder aufgebrochen, und die modifizierten genetischen Elemente werden selektiert. In dem Fall komplizierter mehrstufiger Reaktionen, an welchen viele einzelne Komponenten und Reaktionsschritte beteiligt sind, können einer oder mehrere dazwischen liegende Schritte zwischen dem anfänglichen Schritt der Erzeugung und Verknüpfung des Genprodukts mit dem genetischen Element und dem letzten Schritt der Erzeugung der selektierbaren Veränderung bei dem genetischen Element durchgeführt werden.
(vii) SELEKTION DURCH AKTIVIERUNG DER REPORTERGENEXPRESSION IN SITU
Das System kann so konfiguriert werden, dass die gewünschte Bindungs-, katalytische oder regulatorische Aktivität, die von einem genetischen Element codiert wird, direkt oder indirekt zu der Aktivierung der Expression eines „Reportergens" führt, das in allen Mikrokapseln vorliegt. Nur Genprodukte mit der gewünschten Aktivität aktivieren die Expression des Reportergens. Die Aktivität, die aus der Expression des Reportergens resultiert, erlaubt die Selektion des genetischen Elements (oder des Kompartiments, das dieses enthält) durch irgendeines der hierin beschriebenen Verfahren.
Beispielsweise kann die Aktivierung des Reportergens das Ergebnis einer Bindungsaktivität des Genprodukts in einer Weise, die analog ist zu dem „Zweihybrid-System" (Fields und Song, 1989), sein. Die Aktivierung kann ebenfalls aus dem Produkt einer Reaktion resultieren, die durch ein gewünschtes Genprodukt katalysiert wird. Beispielsweise könnte das Reaktionsprodukt ein transkriptionaler Inducer des Reportergens sein. Beispielsweise könnte Arabinose verwendet werden, um eine Transkription ausgehend von dem araBAD-Promoter zu induzieren. Die Aktivität des wünschenswerten Genprodukts könnte ebenfalls zu der Modifikation eines Transkriptionsfaktors führen, was zu der Expression des Reportergens führt. Wenn beispielsweise das gewünschte Genprodukt eine Kinase oder Phosphatase ist, kann die Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines Transkriptionsfaktors zu der Aktivierung der Expression des Reportergens führen.
(viii) AMPLIFIKATION
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung umfasst das Verfahren den weiteren Schritt des Amplifizierens der genetischen Elemente. Die selektive Amplifikation kann als ein Mittel verwendet werden, um im Hinblick auf genetische Elemente, die das gewünschte Genprodukt codieren, anzureichern.
Bei all den obigen Konfigurationen kann das genetische Material, das in den genetischen Elementen enthalten ist, amplifiziert werden und der Prozess in iterativen Schritten wiederholt werden. Die Amplifikation kann durch die Polymerasekettenreaktion (Saiki et al., 1988) oder durch Verwendung einer Vielzahl von anderen Genamplifikationstechniken, einschließlich Qβ-Replicase-Amplifikation (Cahill, Foster und Mahan, 1991; Chetverin und Spirin, 1995; Katanaev, Kumasov und Spirin, 1995); der Ligase-Kettenreaktion (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); des selbst unterhaltenden Sequenzreplikationssystems (Fahy, Kwoh und Gingeras, 1991) und der Strangaustausch-Amplifikation (Walker et al., 1992) erfolgen.
(ix) KOMPARTIMENTIERUNG
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung wird ein Verfahren zur Kompartimentierung eines genetischen Elements und Exprimierung des genetischen Elements, um sein Genprodukt innerhalb des Kompartiments zu bilden, bereit gestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bilden einer wässrigen Lösung, welche das genetische Element und die Komponenten, die nötig sind, um dieses zu exprimieren, um sein Genprodukt zu bilden, umfasst;
(b) Mikroeinkapseln der Lösung, um so eine diskrete Mikrokapsel zu bilden, die das genetische Element umfasst; und
(c) Exponieren der Mikrokapsel an Bedingungen, die geeignet sind, damit die Expression des genetischen Elements, um sein Genprodukt zu bilden, ablaufen kann.

Geeignete Mikroeinkapselungstechniken werden im Detail in der vorstehenden allgemeinen Beschreibung beschrieben.
Vorzugsweise wird eine Bibliothek von genetischen Elementen, die ein Repertoire von Genprodukten codieren, gemäß der Erfindung durch das oben beschriebene Verfahren eingekapselt und die genetischen Elemente exprimiert, um ihre entsprechenden Genprodukte zu erzeugen. Bei einer in hohem Maße bevorzugten Ausführungsform wird eine Mikroeinkapselung erreicht, indem eine Wasser-in-Öl-Emulsion der wässrigen Lösung, welche die genetischen Elemente umfasst, gebildet wird.
Die Offenbarung stellt demgemäß ebenfalls eine Mikrokapsel bereit, die durch das oben angegebene Verfahren erhältlich ist.
Verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und der vorliegenden Offenbarung werden in den folgenden Beispielen dargestellt.
BEISPIELE
Beispiel 1.
Die Produktion von wässrigen Mikrokapseln mit ungefähr 2 μm in einem Wasser-in-Öl-Emulsionssystem.
Mikrokapseln innerhalb des bevorzugten Größenbereichs der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems erzeugt werden.
Leichtes weißes Mineralöl (Sigma; M-3516) wird hierin als die kontinuierliche Phase verwendet, und die Emulsion wird durch die Emulgatoren Sorbitanmonooleat (Span 80, Fluka; 85548) und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80, Sigma Ultra; P-8074) und in manchen Fällen ebenfalls mit 0,5% w/v Natriumdeoxycholat (Fluka; 30970) stabilisiert.
Die Ölphase wird frisch hergestellt, indem 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka) in Mineralöl (Sigma, #M-5904) gelöst werden, gefolgt von 0,5% (v/v) Tween 80 (SigmaUltra; #P-8074). Eisgekühlte in vitro-Reaktionsmischungen (50 μl) werden schrittweise (in 5 Aliquots von 10 μl über ~2 Minuten) zu 0,95 ml eisgekühlter Ölphase in einem 5 ml-Costar Biofreeze Vial (#2051) zugegeben, während mit einem Magnetstäbchen gerührt wird (8 × 3 mm mit einem Mittelring; Scientific Industries International, Loughborough, UK). Das Rühren (bei 1150 Upm) wird für 1 zusätzliche Minute auf Eis fortgesetzt. Bei einigen Emulsionen wird die wässrige Phase mit einem anionischen Tensid ergänzt – z.B. Natriumdeoxycholat, Natriumcholat, Natriumglycocholat und Natriumtaurocholat, typischerweise bis auf 0,5% (w/v).
Wenn angegeben, wird die Emulsion weiter homogenisiert, indem ein Ultra-Turrax T25-Dispergierer (IKA), welcher mit einem Dispergierwerkzeug mit 8 mm Durchmesser ausgerüstet ist, für 1 Minute bei 8 k, 9 k oder 13,5 k Upm oder für 1 oder 5 Minuten bei 20 k Upm auf Eis verwendet wird. Dieses verringert die Mikrokapselgröße.
Die Reaktionen können gequencht werden und die Emulsion kann aufgebrochen werden wie in den einzelnen Beispielen angegeben ist, indem bei 3.000 g für 5 Minuten abzentrifugiert wird und die Ölphase entfernt wird, was die konzentrierte Emulsion am Boden des Vials zurücklässt. Quenchpuffer (typischerweise 0,2 ml 25 μg/ml Hefe-RNA in W+B-Puffer: 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4) und 2 ml wassergesättigter Diethylether werden zugegeben und die Mischung wird gevortext, kurz zentrifugiert und die Etherphase entfernt. Die wässrige Phase wird mit Ether gewaschen und getrocknet (5 Minuten in einer Speedvac bei Umgebungstemperatur).
Die Größenverteilung der wässrigen Tröpfchen in den Emulsionen wurde durch Laserbeugung bestimmt, indem ein Coulter LS230-Partikelgrößenanalysator verwendet wurde. Ein Aliquot der Emulsion, frisch verdünnt (1:10) in Mineralöl, wird zu der Mikrovolumenkammer, die gerührtes Mineralöl enthält, zugegeben. Die Ergebnisse werden analysiert mit dem in das Instrument eingebauten optischen Mie-Modell, wobei Brechungsindizes von 1,468 für Mineralöl und 1,350 für die wässrige Phase verwendet werden. Die Größenverteilung der wässrigen Tröpfchen in der Emulsion ist in 2 gezeigt. Die Zugabe von Natriumdeoxycholat verändert die Größenverteilung nicht signifikant.
Beispiel 2.
Effiziente in vitro-Transkriptionsreaktionen, durchgeführt in den wässrigen Mikrokapseln einer Wasser-in-Öl-Emulsion.
Um innerhalb jeder Mikrokapsel RNA ausgehend von DNA zu erzeugen, muss das einzige Molekül an DNA, das innerhalb jeder wässrigen Mikrokapsel des Systems vorliegt, effizient transkribiert werden. Hierin wird eine in vitro-Transkription innerhalb von Mikrokapseln demonstriert.
Der katalytische Kern des selbstspleißenden Tetrahymena-Introns ist ein viel untersuchtes Ribozym, welches eine Vielzahl von Phosphoestertransferreaktionen katalysieren kann (Sag et al., 1986; Sag und Czech, 1986; Sag und Czech, 1986). Beispielsweise kann ein modifiziertes Tetrahymena-Intron, welchem der P1 Stem-loop von dem 5'-Ende fehlt und dem die 3'-Stem-loops P9.1 und P9.2 fehlen, als eine RNA-Ligase fungieren, welche effizient zwei oder mehrere Oligonukleotide, die an einem Matrizenstrang ausgerichtet (aligned) sind, zusammen spleißt (Green und Szostak, 1992).
DNA, welche das oben beschriebene Tetrahymena-Ribozym codiert, wird PCR-amplifiziert, indem die Primer P2T7Ba (welcher sich an die P2-Loop-Region anlagert und einen T7-RNA-Polymerasepromoter anhängt) und P9Fo (welcher sich an die P9-Loop-Region anlagert) verwendet werden. Dieses erzeugt ein DNA-Fragment mit 331 Basenpaaren, das den T7-RNA-Polymerasepromoter trägt. Dieses Fragment wird direkt gereinigt, indem Wizard PCR Preps (Promega) verwendet werden, und als die Matrize für eine in vitro-Transkriptionsreaktion unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase verwendet.
Die in vitro-Transkription wird über eine Anfangsperiode von 10 Minuten getestet, während welcher die Reaktionsgeschwindigkeit im Wesentlichen linear ist (Chamberlin und Ring, 1973). Die Reaktionsbedingungen für die Transkription sind wie von Wyatt et al., 1991 beschrieben.
Der Einbau von [γ^–32P]-UTP wird verwendet, um das Fortschreiten der Reaktion zu testen.
Eine Transkriptionsreaktion wird in einem Volumen von 200 μl angesetzt und in 2 Aliquots unterteilt, die jeweils 3 × 10¹¹ Moleküle DNA (5 nM) enthalten. Ein 100 μl-Aliquot wird zu 2 ml leichtem Mineralöl von Sigma, das 4,5% Span 80 und 0,5% Tween 80 enthält, zugegeben und für 5 Minuten mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 20.000 Upm wie in Beispiel 1 homogenisiert. Auf der Basis des mittleren Mikrokapselvolumens bei diesen Emulsionen (2,8 × 10^–19 m³ für einen Mikrokapseldurchmesser von 0,81 μm) würde die 100 μl-Reaktion in 3,6 × 10¹¹ Mikrokapseln unterteilt. Damit sollte es im Durchschnitt 1 Molekül DNA pro Mikrokapsel geben.
Beide Aliquots werden in einem Wasserbad mit 37°C inkubiert. 0,5 ml-Proben der Emulsion werden sowohl vor dem Start der Inkubation als auch nach 10 Minuten entnommen und auf Eis gestellt. Ähnliche 25 μl-Proben werden zur selben Zeit aus den nicht emulgierten Kontrollreaktionen entnommen. Die Emulsionen werden aufgebrochen und die Reaktionen mit 0,5 ml EDTA (50 mM) und 2 ml wassergesättigtem Diethylether wie in Beispiel 1 beschrieben gestoppt. Dann werden 100 μl Lachssperma-DNA (500 μg/ml) in 20 mM EDTA zugegeben. Drei 100 μl-Aliquots werden dann sowohl aus den Emulsionen als auch den Kontrollen entnommen, und markierte RNA wird durch TCA-Fällung und Szintillationszählung getestet.
Die Geschwindigkeit der Transkription wird als die Zunahme bei den in Säure wahrnehmbaren cpm über die 10 Minuten Inkubation bei 37°C genommen. In der nicht emulgierten Kontrollreaktion gibt es 442.000 cpm in Säure wahrnehmbares Material im Vergleich zu 147.000 cpm in der Emulsion. Damit beträgt die Geschwindigkeit der Transkription in der Emulsion 33% von der, die in der nicht emulgierten Kontrollreaktion gefunden wird.
Diese Prozedur zeigt daher, dass RNA effizient durch T7-RNA-Polymerase in den wässrigen Mikrokapseln einer Wasser-in-Öl-Emulsion synthetisiert werden kann.
Beispiel 3.
Effizient gekoppelte in vitro-Transkriptions/Translationsreaktionen, durchgeführt in den wässrigen Mikrokapseln einer Wasser-in-Öl-Emulsion.
Um Proteine zu synthetisieren, indem die Prozedur der vorliegenden Offenbarung verwendet wird, muss die Translation in den wässrigen Mikrokapseln der hierin beschriebenen Wasser-in-Öl-Emulsion aktiv sein.
Hier wird gezeigt, wie ein Protein (E. coli-Dihydrofolatreduktase) effizient aus DNA in den wässrigen Mikrokapseln eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems erzeugt werden kann, indem ein gekoppeltes Transkriptions/Translationssystem verwendet wird.
Das E. coli folA-Gen, welches Dihydrofolatreduktase (DHFR) codiert, wird PCR-amplifiziert, indem die Oligonukleotide EDHFRFo und EDHFRBa verwendet werden. Diese DNA wird dann in den pGEM-4Z-Vektor (Promega), der mit HindIII und KpnI verdaut wurde, stromabwärts von sowohl dem lac-Promoter als auch dem T7-RNA-Polymerase-Promoter kloniert. Das Oligonukleotid EDHFRBa hängt die effiziente Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle stromaufwärts des DHFR-Startcodons an.
Die DNA-Sequenzierung identifiziert einen Klon, welcher die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wird gefunden, dass Bakterien, die mit diesem Klon (pGEM-folA) transformiert sind, aktive DHFR überexprimieren (angetrieben von dem lac-Promoter), wenn sie mit IPTG induziert werden.
Das pGEM-folA-Plasmid wird dann PCR-amplifiziert, indem die Primer LMB2 und LMB3 unter den oben beschriebenen Bedingungen verwendet werden, um ein DNA-Fragment mit 649 bp zu erzeugen, das den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle und das folA-Gen trägt. Dieses PCR-Fragment wird direkt gereinigt, indem Wizard PCR Preps (Promega) verwendet werden, und verwendet, um ein prokaryotisches gekoppeltes in vitro-Transkriptions/Translationssystem zu programmieren, das für linear Matrizen entworfen wurde (Lesley, Brow und Burgess, 1991).
Eine kommerzielle Präparation dieses Systems wird verwendet (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega), das mit T7-RNA-Polymerase ergänzt ist.
Eine 300 μl-Translationsreaktion wird auf Eis angesetzt, die 3 × 10¹² Moleküle DNA enthält. T7-RNA-Polymerase (10⁴ Einheiten) wird zugegeben, um die Transkription anzutreiben, und das translatierte Protein wird durch die Zugabe von [³⁵S]-Methionin markiert. Ein 150 μl-Aliquot dieser Reaktion wird zu 2,85 ml leichtem Mineralöl von Sigma, das 4,5% Span 80 und 0,5% Tween 80 enthält, zugegeben und für 1 Minute mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 20.000 Upm wie in Beispiel 1 homogenisiert. Das andere Aliquot wird nicht emulgiert.
Auf der Basis des mittleren Mikrokapselvolumens bei den Emulsionen (1,1 × 10^–18 m³ für eine Mikrokapsel mit einem Durchmesser von 1,29 μm) würde die 150 μl-Reaktion in 1,3 × 10¹¹ Mikrokapseln unterteilt. Damit sollte es im Durchschnitt ungefähr 11 Moleküle DNA pro Mikrokapsel geben.
Vier 0,5 ml-Aliquots werden aus der Emulsionsreaktionsmischung entnommen. Ein Aliquot wird unmittelbar auf Eis gestellt und die anderen drei werden in einem Wasserbad mit 25°C für 2 Stunden inkubiert, bevor sie auf Eis gestellt werden. Vier 25 μl-Proben werden ebenfalls aus der nicht emulgierten Reaktionsmischung entnommen; eine wird unmittelbar auf Eis gestellt und die anderen drei werden in einem Wasserbad mit 25°C für 2 Stunden inkubiert und dann auf Eis gestellt.
Die Emulsionen werden in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 Upm für 5 Minuten bei 4°C abzentrifugiert und das Mineralöl entfernt, was die konzentrierte (aber immer noch intakte) Emulsion am Boden des Röhrchens zurücklässt. Nach kurzem erneuten Abzentrifugieren und Entfernung von jeglichem weiteren Mineralöl wird die Emulsion aufgebrochen, und jegliche weitere Translation wird gestoppt, indem 100 μl Wasser, das 125 μg/ml Puromycin enthält, und 1 ml wassergesättigter Diethylether zugegeben werden. Diese Mischung wird gevortext und erneut in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 Upm für 1 Minute bei 4°C abzentrifugiert. Der Ether und gelöstes Mineralöl werden dann durch Absaugen entfernt und die Extraktion mit einem weiteren 1 ml Ether wiederholt. Jeglicher verbleibende Ether wird durch Abzentrifugieren für 5 Minuten in einer Speedvac bei Raumtemperatur abgetrieben.
100 μl Wasser, das 125 μg/ml Puromycin enthält, wird ebenfalls zu den 25 μl nicht emulgierter Kontrollreaktionen zugegeben. 25 μl von jeder der Proben werden dann mit Aceton ausgefällt und auf einem 20% SDS-PAGE-Gel entsprechend den Anleitungen, die von den Herstellern des in vitro-Transkriptions/Translationssystems (Promega) angegeben werden, laufen gelassen. Das Gel wird getrocknet und unter Verwendung eines Phosphorlmager (Molecular Dynamics) gescannt. Eine einzelne starke Bande wird mit dem erwarteten Molekulargewicht von DHFR (18 kd) bei sowohl den Reaktionen, die in Emul sionen durchgeführt wurden, als auch den Kontrollen beobachtet. Diese Bande wird genau quantifiziert.
Bei den emulgierten Reaktionen beträgt die mittlere Fläche unter dem 18 kd-Peak 15.073 Einheiten, während die mittlere Fläche unter demselben Peak bei den nicht emulgierten Kontrollreaktionen 18.990 Einheiten beträgt. Damit wird bei den emulgierten Reaktionen die Menge an DHFR-Protein auf 79% von der berechnet, die bei den nicht emulgierten Kontrollreaktionen gefunden wird. Dieses zeigt daher, dass das Transkriptions/Translationssystem in dem Wasser-in-Öl-Emulsionssystem der vorliegenden Offenbarung funktionsfähig ist.
Beispiel 4.
Dihydrofolatreduktase, die unter Verwendung der gekoppelten in vitro-Transkriptions/Translationsreaktionen erzeugt wurde, ist aktiv.
Hier wird gezeigt, dass Protein (E. coli-Dihydrofolatreduktase) effizient in einer katalytisch aktiven Form durch gekoppelte Transkription/Translation des folA-Gens in den wässrigen Mikrokapseln eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems erzeugt werden kann. In diesem Test wird eine Emulsion, die Mikrokapseln unterhalb der optimalen Größe umfasst, verwendet; es wird gezeigt, dass die DHFR-Aktivität bei den größeren Mikrokapselgrößen höher ist.
175 μl Translationsreaktionen (unmarkiert) werden auf Eis angesetzt, die entweder 2 × 10¹¹, 6 × 10¹² oder 1,8 × 10¹² Moleküle der folA-Matrizen-DNA, die in Beispiel 3 verwendet wurde, oder keine DNA enthalten. T7-RNA-Polymerase (6 × 10³ Einheiten) wird zu jeder Reaktion zugegeben, um die Transkription anzutreiben.
Ein 100 μl-Aliquot jeder Reaktion wird zu 1,9 ml leichtem Mineralöl von Sigma, das 4,5% Span 80 und 0,5% Tween 80 enthält, zugegeben und für 1 Minute oder 5 Minuten mit einem Ultra-Turrax T25-Homogenisator, welcher mit einem Dispergierwerkzeug mit 8 mm Durchmesser ausgerüstet ist, bei 20.000 Upm wie in Beispiel 1 homogenisiert. Nach Homogenisation für 1 Minute beträgt der mittlere Durchmesser der Partikel (bezogen auf das Volumen) 1,30 μm (Median 1,28 μm). 98 Volumen-% der inneren (wässrigen) Phase liegen in Partikeln vor, die von 0,63 μm bis 2,12 μm variieren. Nach Homogenisation für 5 Minuten beträgt der mittlere Durchmesser der Mikrokapseln (bezogen auf das Volumen) 0,81 μm (Median 0,79 μm) und 98 Volumen-% der inneren (wässrigen) Phase liegen in Partikeln vor, die von 0,41 μm bis 1,38 μm variieren.
Auf der Basis des mittleren Mikrokapselvolumens bei den 1 Minuten-Emulsionen (1,1 × 10^–18 m³ für eine Mikrokapsel mit 1,299 μm Durchmesser) würde die 100 μl-Reaktion in 8,7 × 10¹⁰ Mikrokapseln unterteilt werden. Damit sollte es ungefähr 1,3, 3,9 oder 11,8 Moleküle DNA pro Mikrokapsel geben.
Auf der Basis des mittleren Mikrokapselvolumens bei den 5 Minuten-Emulsionen (2,8 × 10^–19 m³ für eine Mikrokapsel mit 0,81 μm Durchmesser) würde die 100 μl-Reaktion in 3,6 × 10¹¹ Mikrokapseln unterteilt werden. Damit sollte es ungefähr 0,3, 1,0 oder 2,9 Moleküle DNA pro Mikrokapsel geben.
Die Emulsionen und die nicht emulgierte Reaktionsmischung werden in einem Wasserbad mit 25°C inkubiert. 0,5 ml-Proben der Emulsion werden unmittelbar vor dem Start der Inkubation und nach 2 Stunden entnommen und auf Eis gestellt. 25 μl-Proben werden zu denselben Zeiten aus den nicht emulgierten Kontrollreaktionen entnommen.
Die Emulsionen werden in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 Upm für 5 min bei 4°C abzentrifugiert und das Mineralöl durch Absaugen entfernt, was die konzentrierte (aber immer noch intakte) Emulsion am Boden des Röhrchens zurücklässt. Nach kurzem erneuten Abzentrifugieren und Entfernung von jeglichem weiteren Mineralöl wird die Emulsion aufgebrochen, und jegliche weitere Translation wird gestoppt, indem 100 μl Puffer A (100 mM Imidazol pH 7,0, 10 mM β-Mercaptoethanol), der 125 μg/ml Puromycin enthält, und 1 ml wassergesättigter Diethylether zugegeben werden. Die Mischung wird gevortext und in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 Upm für 1 min bei 4°C abzentrifugiert. Der Ether und gelöstes Mineralöl werden durch Absaugen entfernt, und die Extraktion wird mit einem weiteren 1 ml Ether wiederholt. Jeglicher verbleibende Ether wird durch Abzentrifugieren für 5 Minuten in einer Speedvac bei Raumtemperatur abgetrieben. 100 μl Puffer A, der (125 μg/ml) Puromycin enthält, wird ebenfalls zu den nicht emulgierten 25 μl-Kontrollreaktionen zugegeben.
Die Dihydrofolatreduktaseaktivität wird durch spektrophotometrisches Überwachen der Oxidation von NADPH zu NADP bei 340 nm über einen Zeitverlauf von 10 Minuten getestet, wie von Williams et al., 1979; Ma et al., 1993 beschrieben wird. 10 μl jeder gequenchten in vitro-Translationsreaktion werden zu 150 μl Puffer A (100 mM Imidazol, pH 7,0, 10 mM β-Mercaptoethanol) und 20 μl 1 mM NADPH zugegeben. 20 μl Dihydrofolat (1 mM) (H₂F) werden nach 1 Minute zugegeben und die Reaktion bei 340 nm unter Verwendung eines ThermoMax Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices) überwacht. Die Aktivität wird durch die Anfangsgeschwindigkeiten unter Bedingungen (ν_max) von So>>K_M berechnet. Die Hintergrundaktivität in dem S30-Extrakt wird von allen Proben abgezogen.
Die DHFR-Aktivität, die in den Emulsionen erzeugt wird, wird aus der Differenz bei der Aktivität, die nach 0 Stunden und 2 Stunden Inkubation gemessen wird, entnommen. Keine Zunahme bei der NADPH-Oxidation trat zwischen den Proben nach 0 Stunden und 2 Stunden auf, wenn 0,1 μM Methotrexat (ein spezifischer Inhibitor der DHFR) zugegeben wurde, was zeigt, dass die gesamte Zunahme bei der NADPH-Oxidation, die beobachtet wird, auf DHFR beruht, die in den in vitro-Translationsreaktionen erzeugt wurde.
Bei der Verwendung einer Homogenisation von 1 Minute bei 20.000 Upm beträgt die DHFR-Aktivität, die in den Emulsionen mit 1,3 Molekülen DNA pro Mikrokapsel erzeugt wurde, 31% von der, die in den nicht emulgierten Kontrollreaktionen gefunden wurde; 45% mit 3,9 Molekülen DNA pro Mikrokapsel; und 84% mit 11,8 Molekülen DNA pro Mikrokapsel.
Bei der Verwendung einer Homogenisation von 5 Minuten bei 20.000 Upm beträgt die DHFR-Aktivität, die in den Emulsionen mit 0,3 Molekülen DNA pro Mikrokapsel erzeugt wurde, 7% von der, die in den nicht emulgierten Kontrollreaktionen gefunden wurde; 15% mit 1 Molekül DNA pro Mikrokapsel; und 35% mit 2,9 Molekülen DNA pro Mikrokapsel, im Durchschnitt.
Unter der Annahme, dass die Wechselzahl von DHFR so ist, wie sie von Posner et al., 1996, beschrieben wird, entspricht dieses einer Ausbeute bei der höchsten DNA-Konzentration von 6,3 μg (340 pmol) DHFR pro 100 μl-Reaktion (nicht emulgierte Kontrolle), 1,98 μg (104 pmol) DHFR pro 100 μl-Reaktion (emulgiert für 1 min) oder 0,46 μg (24,8 pmol) DHFR pro 100 μl-Reaktion (emulgiert für 5 Minuten). Dieses entspricht 74 Molekülen DHFR pro Mikrokapsel bei den 1 Minuten-Emulsionen und 44 Molekülen pro Mikrokapsel bei den 5 Minuten-Emulsionen (unter der Annahme, dass alle Mikrokapseln von mittlerer Größe sind).
Die DHFR-Aktivität, die aus der gekoppelten Transkription/Translation der folA-Gene resultiert, wird ebenfalls in den größeren Mikrokapseln gemessen, welche allein durch Rühren oder durch Rühren gefolgt von einer weiteren Homogenisation mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 8.000 Upm, 9.000 Upm oder 13.500 Upm für 1 Minute wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt wurden. Die Ergebnisse sind in 2b dargestellt. Die verwendete Konzentration der folA-Gene (2,5 nM) ergibt einen Durchschnitt von 1, 1,5 und 4,8 genetischen Elementen pro Tröpfchen in den Emulsionen, die bei 13.500 Upm, 9.500 Upm bzw. 8.000 Upm homogenisiert wurden, und einen Durchschnitt von 14 genetischen Elementen pro Tröpfchen in der Emulsion, die nur durch Rühren hergestellt wurde. Eine Zugabe von Natriumdeoxycholat (0,5%) zu der in vitro-Translationsreaktionsmischung beeinflusst die DHFR-Aktivität, die in den aufgebrochenen Emulsionen beobachtet wird, nicht signifikant.
Beispiel 5.
Verknüpfung eines immobilisierten Substrats mit einem genetischen Element über ein Protein mit hohem Molekulargewicht.
Um mehrere immobilisierte Substratmoleküle mit einem DNA-Fragment zu verknüpfen, welches das folA-Gen umfasst, wird das DNA-Fragment zuerst biotinyliert und dann an einen Komplex von Avidin mit Apoferritin gekoppelt. Apoferritin aus der Milz von Pferden ist ein großes, nahezu kugelförmiges Proteinmolekül mit 12,5 nm Durchmesser, welches daher mehrere Stellen bietet, die mit Substrat derivatisiert werden können (z.B. die ε-Aminogruppe von Oberflächenlysinen). Das pGEM-folA-Plasmid, welches DHFR von E. coli codiert, wird PCR-amplifiziert, indem die Primer LMB3 und 5'-biotinyliertes LMB2 (LMB2-Biotin) verwendet werden, um ein biotinyliertes DNA-Fragment mit 649 bp zu erzeugen, welches den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle und das folA-Gen trägt (siehe Beispiel 3). Die DNA wird radiomarkiert, indem die 500 μl-PCR-Reaktionsmischung mit 100 μCi [α-³²P]dCTP (Amersham; 3000 Ci/mmol) ergänzt wird. Das biotinylierte PCR-Fragment wird direkt gereinigt, indem Wizard PCR Preps (Promega) verwendet werden, und die Konzentration wird spektrophotometrisch bestimmt. Der Prozentsatz an biotinylierter DNA wird durch Binden an Streptavidin M-280 Dynabeads (Dynal) und Szintillationszählung getestet. Es wird unter Verwendung dieser Technik bestimmt, dass 83% der DNA biotinyliert sind.
Das maskierte Eisen wird aus einem kommerziellen Konjugat von Avidin und Ferritin (Avidin-Ferritin; ungefähr 1,1 Mol Ferritin pro Mol Avidin; Sigma) durch Dialyse über Nacht (4°C) einer Lösung von Avidin-Ferritin in PBS (1 mg/ml) gegen 0,12 M Thioglycolsäure, pH 4,25, gefolgt von 24 Stunden Dialyse gegen PBS (4°C) wie von Kadir und Moore, 1990 beschrieben, entfernt. Die Entfernung von Eisen wird durch Analyse der Extinktionsspektren überprüft (maskiertes Fe(III) absorbiert stark bei 310-360 nm).
0,3 pmol radiomarkierte, biotinylierte DNA wird mit variierenden Molverhältnissen von Avidin-Apoferritin in PBS (Gesamtvolumen 9 μl) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ein 4,5 μl-Aliquot wird entnommen und der Prozentsatz von DNA, die mit Avidin-Apoferritin komplexiert ist, unter Verwendung des Bandenverschiebungstests auf einem 1,5% Agarosegel wie von Berman et al., 1987 beschrieben getestet. Das Gel wird dann getrocknet und unter Verwendung eines Phosphorlmager (Molecular Dynamics) gescannt. Der Prozentsatz an DNA, die nicht verschoben wird (d.h. nicht mit Avidin-Apoferritin komplexiert ist), beträgt 17% (1:1 Molverhältnis Avidin-Apoferritin:DNA), 15% (5:1 Molverhältnis Avidin-Apoferritin:DNA) oder 14% (25:1 Molverhältnis Avidin-Apoferritin:DNA). Dieses bedeutet, dass selbst bei einem Verhältnis von 1:1 von Avidin-Apoferritin:DNA praktisch die gesamte biotinylierte DNA gebunden ist. Keine Verschiebung der Banden wird beobachtet, wenn biotinylierte DNA mit Apoferritin gemischt wird oder wenn nicht biotinylierte DNA mit Avidin-Apoferritin gemischt wird.
Die verbleibenden 4,5 μl DNA, die mit Avidin-Apoferritin komplexiert sind, werden als die Matrize für eine 25 μl-in vitro-Transkriptions/Translationsreaktion verwendet (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega). Nach 2 Stunden bei 25°C wird die Reaktion gestoppt, indem 100 μl Puffer A, der Puromycin (125 μg/ml) enthält, zugegeben werden. Die Dihydrofolatreduktaseaktivität wird wie oben getestet, indem spektrophotometrisch die Oxidation von NADPH zu NADP bei 340 nm über einen Zeitverlauf von 10 Minuten überwacht wird.
10 μl von jeder in vitro-Translationsreaktion werden zu 150 μl Puffer A und 20 μl NADPH (1 mM) zugegeben. 20 μl Dihydrofolat (1 mM) (die Emulsionen wurden aufgebrochen und die Reaktionen wurden mit 0,5 ml EDTA (50 mM) und 2 ml wassergesättigtem Diethylether wie in Beispiel 1 beschrieben gestoppt) werden nach 1 Minute zugegeben und die Reaktion bei 340 nm unter Verwendung eines ThermoMax-Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices) überwacht. Es wird selbst bei dem höchsten Verhältnis Avidin-Apoferritin: DNA im Vergleich zu einer Kontrolle ohne zugegebenes Avidin-Apoferritin keine Differenz bei der DHFR-Aktivität gefunden. Dieses zeigt, dass die überwiegende Mehrheit der DNA komplexiert werden kann, ohne die Effizienz der in vitro-Translation zu beeinträchtigen.
Beispiel 6.
Sowohl die in vitro-Transkription-Translation als auch die DHFR-Aktivität sind in demselben System vereinbar.
Um auf die Aktivität von DHFR zu selektieren, die in situ durch gekoppelte Transkription-Translation erzeugt wurde, müssen sowohl die Transkriptions-Translationsreaktion als auch die DHFR in demselben Puffersystem aktiv sein.
Ein direkter Test auf DHFR-Aktivität in einem vollständigen E. coli in vitro-Translationssystem, der auf der spektrophotometrischen Überwachung der Oxidation von NADPH zu NADP bei 340 nm basiert, ist aufgrund der Trübung der S30-Extrakte nicht praktikabel.
Jedoch ist es möglich, sicherzustellen, dass DHFR in demselben Puffersystem aktiv ist wie die in vitro-Translation. E. coli-DHFR wird durch IPTG-Induktion von Bakterien, welche das Plasmid pGEM-folA enthalten, erhalten und auf einer Methotrexat-Sepharose-Säule affinitätsgereinigt (Baccanari et al., 1977).
Die DHFR-Aktivität wird in Puffer A wie oben oder in einer in vitro-Translationsmischung verglichen, die vollständig ist, außer dass der S30-Dialysepuffer (Lesley 1995) (10 mM Tris-Acetat pH 8,0, 14 mM Magnesiumacetat, 60 mM Kaliumacetat, 1 mM DTT) die S30-Fraktion ersetzt. In jedem Fall beträgt das gesamte Reaktionsvolumen 200 μl, und die Konzentration von NADPH [und die Emulsionen wurden aufgebrochen und die Reaktionen wurden gestoppt mit 0,5 ml EDTA (50 mM) und 2 ml wassergesättigtem Diethylether wie in Beispiel 1 beschrieben] jeweils 0,1 mM. Die Reaktionen werden spektrophotometrisch bei 340 nm überwacht. Die Zugabe von 1,75 pmol (1,3 m Einheiten) E. coli-DHFR ergibt Anfangsraten von –25,77 mOD/min (in Puffer A) und –11,24 mOD/min (in Translationspuffer); somit ist die Reaktion zu 44% so effizient in dem Translationspuffer wie in einem optimierten Puffer (Puffer A).
Weiterhin verursacht das Vorliegen der Substrate von DHFR (NADPH und H₂F) in einer Konzentration von 0,1 mM (entweder allein oder in Kombination) keinerlei Inhibition der Erzeugung von aktiver DHFR aus einer 2stündigen gekoppelten Transkriptions-Translationsreaktion.
Beispiel 7.
Die Aktivität von DHFR auf einem genetischen Element, das ein immobilisiertes Dihydrofolatsubstrat enthält, führt zu der Bildung eines Tetrahydrofolatprodukts, das mit der Nukleinsäure, die DHFR codiert, verknüpft ist.
Es wird ein Peptid synthetisiert, welches drei Glutaminsäuren, die über ihre γ-Carboxylate (unter Verwendung von N-Fluorenylmethoxycarbonyl-Glutaminsäure-α-Benzylester als einem Ausgangsmaterial) mit einem Lysin an dem Carboxyterminus verknüpft sind, und Biotin, das mit seiner ε-Aminogruppe verknüpft ist, indem veröffentlichte Verfahren (Krumdiek et al., 1980) modifiziert wurden, umfasst. Folsäure wird mit dem Aminoterminus verknüpft und die Benzyl- und Trifluoracetamid-Schutzgruppen durch alkalische Hydrolyse wie vorher beschrieben entfernt. Das Peptid wird durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und durch Massen- und UV-Spektroskopie charakterisiert. Dieses Folsäurepeptid wird chemisch zu dem entsprechenden Dihydrofolsäurepeptid (indem Dithionat und Ascorbinsäure verwendet werden) und dann zu dem entsprechenden Tetrahydrofolsäurepeptid reduziert (indem Natriumborhydrid verwendet wird), wobei veröffentlichte Verfahren (Zakrzewski et al., 1980) verwendet werden. Diese Transformationen werden durch UV-Spektroskopie charakterisiert.
Ein genetisches Element wird konstruiert, indem im Durchschnitt zwei bis drei Moleküle des Folsäurepeptids mit Avidin (oder Streptavidin) zusammen mit einem Molekül der DHFR-codierenden, PCR-amplifizierten DNA aus dem Plasmid pGEM-folA verknüpft werden, indem die Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO: 9) und LMB3 verwendet werden (siehe Beispiel 3). Die immobilisierte Folsäure wird chemisch zu Dihydrofolat reduziert, indem Dithionat und Ascorbinsäure verwendet werden, und durch Dialyse gegen Puffer A gereinigt. E. coli-DHFR wird durch IPTG-Induktion von Bakterien, die das Plasmid pGEM-folA enthalten, erhalten und auf einer Methotrexat-Sepharose-Säule affinitätsgereinigt. Es wird gezeigt, dass E. coli-DHFR mit der Dihydrofolsäure, die an diesem genetischen Element immobilisiert ist, reagiert, indem die Oxidation von NADPH zu NADP spektrophotometrisch überwacht wird, wobei 0-10 μM des Avidin-verknüpften Dihydrofolsäurepeptids und 0-50 μM NADPH verwendet werden. Damit ist am Ende dieser Reaktion das Produkt Tetrahydrofolat mit dem folA-Gen, welches für das Enzym (d.h. DHFR) codiert, das dessen Bildung katalysiert, verknüpft.
Um jene Gene zu isolieren, die an dem Tetrahydrofolatprodukt befestigt sind, gibt es zwei Ansätze. Der erste beinhaltet die Erzeugung von Phagen-Display-Antikörpern, die für Tetrahydrofolat spezifisch sind (Hoogenboom, 1997). Der zweite Ansatz basiert auf der Verwendung eines markierten Reagenzes, welches spezifisch mit dem immobilisierten Produkt, nicht aber mit dem Substrat, reagiert. Wir haben ein Molekül synthetisiert, welches aus einer Dinitrophenyl(DNP)-Markierung besteht, die über einem Spacer mit 14 Atomen mit Benzaldehyd verknüpft ist. Die Aldehydgruppe reagiert spezifisch mit Tetrahydrofolat, um ein kovalentes Addukt zu bilden (Kallen und Jencks, 1966), und eine Affinitätsreinigung kann durchgeführt werden, indem ein anti-DNP-Antikörper verwendet wird.
Beispiel 8.
Ein alternatives Verfahren zur Selektion auf DHFR-Aktivität
Auf die DHFR-katalysierte Reaktion kann durch eine in situ-Kopplung mit einer zweiten Reaktion, die durch Hefealdehyddehydrogenase katalysiert wird, mit einem „markierten" Substrat selektiert werden.
Anstelle des Selektierens im Hinblick auf Gene, die mit einem der Produkte der DHFR-Reaktion (5,6,7,8-Tetrahydrofolat oder NADP⁺) verbunden sind, wird die DHFR-Reaktion mit einer zweiten Reaktion gekoppelt. Die Selektion wird in diesem Fall durch die Bildung des zweiten Produkts der DHFR-katalysierten Reaktion-Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP⁺) vermittelt.
Die Reaktion, die wir zur Kopplung ausgewählt haben, wird durch Hefealdehyddehydrogenase (YAD; EC 1.2.1.5) katalysiert. Dieses Enzym verwendet entweder NAD⁺ oder NADP⁺ bei der Oxidation eines weiten Bereichs von aliphatischen und aromatischen Aldehyden zu ihren entsprechenden Carbonsäuren, was NADH oder NADPH in dem Prozess erzeugt. Die Reaktion hat den großen Vorteil, dass sie im Wesentlichen irreversibel ist – Dehydrogenasen (einschließlich DHFR und YAD) katalysieren nämlich nicht die Reduktion der Säure zurück zu dem Aldehyd. Da eine große Anzahl von Enzymen, die Redoxreaktionen katalysieren, NAD⁺ oder NADP⁺ erzeugen, kann die YAD-Reaktion ebenfalls bei der Selektion dieser Enzyme verwendet werden und ist nicht nur auf die Selektion auf Dihydrofolatreduktase beschränkt.
Ein Pentaaldehydsubstrat wird synthetisiert und mit einer DNP (Dinitrophenyl)-Markierung über einen C₂₀-Linker verknüpft (im Folgenden DNP-PA). Die Oxidation von DNP-PA zu der entsprechenden Säure (DNP-PC) wird durch HPLC verfolgt (Umkehrphasen-C₁₈-Säule; H₂O/CH₃CN-Gradient + 0,1% Trifluoressigsäure; Retentionszeiten: DNP-PA, 5,0 min; DNP-PC, 4,26 min). Die Umwandlung von DNP-PA zu DNP-PC wird nur in Gegenwart von sowohl YAD als auch NADP⁺ beobachtet. Die Reaktionen werden ebenfalls spektrophotometrisch verfolgt; die Zunahme der Extinktion bei 340 nm zeigte, dass NADP⁺ gleichzeitig zu NADPH umgewandelt wird.
Die gekoppelte DHFR-YAD-Reaktion wird verfolgt, indem derselbe HPLC-Test verwendet wird. Die anfängliche Reaktionsmischung enthielt die Substrate für DHFR – NADPH (50 μM) und 7,8-Dihydrofolat (H₂F; 50 μM), YAD (Sigma, 0,5 Einheiten) und DNP-PA (50 μM) in Puffer pH 7,7 (100 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol und 25 mM KCl). Eine Umwandlung von DNP-PA zu DNP-PC wird beobachtet, wenn DHFR zu der obigen Reaktionsmischung zugegeben wird (DHFR 5 nM, 83 %; 1,25 nM, 14,5 % nach 32 min).
Die Konzentration von DHFR, die bei der kompartimentierten in vitro-Translation erhalten wird, ist in der Tat viel höher als 5 nM (siehe Beispiel 4). Die Umwandlung von DNP-PA zu DNP-PC ist vernachlässigbar in Abwesenheit von DHFR oder wenn Methotrexat (MTX) – ein potenter Inhibitor des Enzyms – vorliegt (10 μM). So ist die Bildung des sekundären Produkts, DNP-PC, daher mit dem Vorliegen der DHFR verknüpft.
Unter Verwendung dieser gekoppelten Reaktion können Proteine, die DHFR-Aktivität verleihen, selektiert werden durch: i) Verknüpfen der Gene mit Antikörpern, die spezifisch das Carboxylprodukt von DNP-PA binden, und ii) Isolieren dieser Gene durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines anti-DNP-Antikörpers.
Dieser Ansatz wird durch einen routinemäßigen Immunoassay demonstriert, welcher auf dem catELISA (Tawfik et al., 1993) basiert. Mikrotiterplatten werden mit anti-Kaninchen-Immunglobulinen (Sigma, 10 μg/Vertiefung) beschichtet, worauf polyklonales Kaninchenserum folgt, das spezifisch Glutarsäurederivate bindet (Tawfik et al., 1993), verdünnt 1:500 in Phosphatsalzpuffer + 1 mg/ml BSA). Die Platten werden gespült und mit BSA blockiert. Die oben beschriebenen gekoppelten Reaktionsmischungen werden in Tris/BSA-Puffer (50 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, 10 mg/ml BSA, pH 7,4) verdünnt und für 1 h inkubiert. Die Platte wird gespült, und ein anti-DNP-Antikörper (monoklonaler Maus-SPE21.11), der in demselben Puffer verdünnt ist (1:10.000), wird zugegeben und für eine Stunde inkubiert. Die Platte wird gespült und Peroxidase-markierter anti-Maus-Antikörper (Jackson) wird zugegeben, worauf ein Peroxidasesubstrat (BM Blue; Boehringer Mannheim) folgt. Ein spezifisches Signal wird nur in den Proben der gekoppelten Reaktionen, die DHFR (zusätzlich zu H₂F, NADPH, YAD und DNP-PA) enthielten, beobachtet.
In hohem Maße spezifische anti-Carbonsäure-Antikörper (Tawfik et al., 1993) werden zur Selektion in zwei Formaten verwendet.
Bei dem ersten wird der anti-Carbonsäure-Antikörper chemisch an einen Avidin (oder Streptavidin) mit höherem Molekulargewicht enthaltenden Komplex, wie z.B. der in Beispiel 5 beschriebene, gekoppelt. Biotinylierte DNA, welche DHFR codiert, wird über die Avidin-Biotin-Wechselwirkung wie in Beispiel 5 beschrieben an diesen Komplex gekoppelt. Dieser Komplex wird dann in einem kompartimentierten gekoppelten Transkriptions/Translationssystem verwendet, welches ebenfalls YAD und ein markiertes YAD-Substrat wie z.B. DNP-PA enthält. Wenn es DHFR-Aktivität in dem Kompartiment gibt, wird das DNP-PA in DNP-PC umgewandelt. Die anti-Carbonsäure-Antikörper, gekoppelt an die DNA über den Komplex mit hohem Molekulargewicht, werden nur DNP-PC-Moleküle und keine Aldehydmoleküle einfangen. DNA aus jenen Kompartimenten, die aktive DHFR enthalten (und damit aktive DHFR codieren, wenn es nur ein Molekül DNA pro Kompartiment gibt), werden dann affinitätsgereinigt, indem anti-DNP-Antikörper verwendet werden.
Bei dem zweiten Format werden mehrere Streptavidinmoleküle in einem Komplex mit hohem Molekulargewicht zusammen gekoppelt, welcher leicht an biotinylierte DNA, die DHFR codiert, gekoppelt werden kann (siehe Beispiel 5). Dieser Komplex wird in einem kompartimentierten gekoppelten Transkriptions/Translationssystem verwendet, welches ebenfalls YAD und ein YAD-Substrat wie z.B. MeNPOC-Biotin-Benzaldehyd enthält. Die Biotingruppe in MeNPOC-Biotin-Benzaldehyd ist „in einem Käfig eingeschlossen" („caged") (Sundberg et al., 1995; Pirrung und Huang, 1996), d.h., sie kann nicht durch Avidin oder Streptavidin gebunden werden, bis durch Bestrahlung mit Licht eine durch Licht entfernbare Nitrobenzylgruppe abgespalten wurde. Wenn es DHFR-Aktivität in dem Kompartiment gibt, wird der MeNPOC-Biotin-Benzaldehyd in MeNPOC-Biotin-Benzoesäure umgewandelt. Nachdem die kompartimentierte Reaktion eine Weile gelaufen ist, wird die Reaktion mit Licht bestrahlt und die Nitrobenzylgruppe entfernt, und die Verbindung wird an den Streptavidin-DNA-Komplex binden. DNA in jenen Kompartimenten, die aktive DHFR enthalten (und somit aktive DHFR codieren, wenn es nur ein Molekül DNA pro Kompartiment gibt), wird mit Biotin-Benzoesäure (anstelle von Biotin-Benzaldehyd) komplexiert und kann affinitätsgereinigt werden, indem immobilisierte anti-Benzoesäure-Antikörper verwendet werden.
Das Vorliegen von anderen Enzymen, welche die Oxidation von NAD⁺ oder NADP⁺ zu NADH oder NADPH in dem in vitro-Transkriptions/Translationssystem katalysieren können, kann es unter gewissen Umständen schwierig machen, dieses YAD-System zur Selektion direkt in dem kompartimentierten in vitro-Transkriptions/Translationssystem zu verwenden. In diesem Fall wird die Selektion durchgeführt, indem das früher beschriebene Zweischritt-Kompartimentierungssystem verwendet wird. Das heißt, die DHFR wird zuerst in Kompartimenten translatiert und dann mit der DNA in demselben Kompartiment mit Hilfe einer geeigneten Affinitätsmarkierung verknüpft. Die Emulsion wird aufgebrochen, der Inhalt der Kompartimente gepoolt und die DNA von den anderen Komponenten des Transkriptions/Translationssystems (einschließlich kontaminierender Oxidoreduktasen) weg affinitätsgereinigt, indem Antikörper verwendet werden, die für eine Digoxigenin„Markierung" spezifisch sind, die an einem Ende des DNA-Moleküls befestigt ist. Die gereinigten DNA-Moleküle, zusammen mit dem befestigten DHFR-Protein, werden dann in eine Reaktionsmischung gegeben, welche die Substrate für DHFR – NADPH (50 μM) und 7,8-Dihydrofolat (H₂F; 50 μM), YAD (Sigma, 0,5 Einheiten) und DNP-PA (50 μM) in Puffer pH 7,7 (100 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol und 25 mM KCl) enthält, und die Reaktion wird erneut durch Emulgierung kompartimentiert, um nur eins oder höchstens einige Moleküle DNA pro Kompartiment zu ergeben. Anti-Carbonsäure-Antikörper (Tawfik et al., 1993) werden zur Selektion in jedem der zwei oben beschriebenen Formate verwendet.
Beispiel 9.
Methylierung der genetischen Elemente durch Genprodukte
DNA-Methyltransferasen, die durch in vitro-Transkription/Translation in den wässrigen Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion erzeugt wurden, methylieren die DNA-Moleküle, welche diese codieren, in den Kompartimenten.
Das Selektieren von Proteinen mit Bindungs- oder katalytischen Aktivitäten unter Verwendung des hier beschriebenen Kompartimentierungssystems stellt zwei grundlegende Anforderungen: i) ein einzelnes Molekül an DNA (oder höchstens einige wenige Moleküle), welches die zu selektierenden Proteine codiert, wird in einer biologisch aktiven Form durch ein gekoppeltes Transkriptions/Translationssystem in den wässrigen Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion exprimiert; und ii) das zu selektierende Protein muss in der Lage sein, das genetische Element, das dieses codierte, in einer solchen Weise zu modifizieren, dass es in einem nachfolgenden Schritt selektierbar gemacht wird. In diesem Beispiel beschreiben wir eine Gruppe von Proteinen – DNA-Methyltransferasen (Typ II) – die effizient in den wässrigen Kompartimenten eines Wasser-in-Öl-Emulsionssystems erzeugt werden, indem ein gekoppeltes Transkriptions/Translationssystem verwendet wird. Weiterhin modifizieren die in vitro translatierten DNA-Methyltransferasen die DNA-Moleküle, welche diese codieren, effizient in situ in den wässrigen Kompartimenten, so dass sie selektiert und amplifiziert werden können. Die Targetstellen auf den DNA-Molekülen werden durch Methylierung eines Cytosins an der C5-Position modifiziert, was die Stellen resistent gegen eine Spaltung durch die zugehörige Restriktionsendonuklease macht (d.h. HhaI für M.HhaI, und HaeIII für M.HaeIII). Somit ist methylierte DNA gegenüber nicht methylierter DNA mittels ihrer Resistenz gegenüber einer Spaltung durch die Restriktionsendonuklease selektierbar.
Das Gen, welches M.HhaI codiert, wird durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide HhaI-Fo2S und HhaI-Bc direkt aus Haemophilus parahaemolyticus (ATCC 10014) amplifiziert. Das Gen, welches M.HaeIII codiert, wird durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide HaeIII-Fo2s und HaeIII-Bc (SEQ ID NO: 4) direkt aus Haemophilus influenzae (Biogruppe aegyptius) (ATCC 11116) amplifiziert. Beide PCR-Fragmente werden in den Vektor pGEM-4Z (Promega), welcher mit HindIII und KpnI verdaut wurde, stromabwärts des lac-Promoters und des T7-RNA-Polymerase-Promoters kloniert. Die Oligonukleotide HhaI-Bc und HaeIII-Bc (SEQ ID NO: 4) hängen die effiziente Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle stromaufwärts des Methyltransferasegen-Startcodons an. Das Oligonukleotid HhaI-Fo hängt eine HhaI-Methylierungs/Restriktionsstelle (M/R) und eine HaeIII (INotI)-Stelle an, welche als Substrate für M.HhaI bzw. M.HaeIII fungieren sollen. Das Oligo nukleotid HaeIII-Fo hängt eine NotI/HaeIII M/R-Stelle an, welche als ein Substrat für M.HaeIII fungiert (das M.HaeIII-Gen enthält bereits zwei innere HhaI M/R-Stellen). Eine DNA-Sequenzierung identifiziert Klone mit der korrekten Nukleotidsequenz.
Die oben beschriebenen Plasmide pGEM-M.HhaI und pGEM-M.HaeIII werden durch PCR amplifiziert, indem wie oben die Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO: 9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO: 10) verwendet werden, um entweder DIG-M.HhaI-Biotin mit 1167 Basenpaaren oder ein DIG-M.HaeIII-Biotin DNA-Fragment mit 1171 Basenpaaren zu erzeugen, die an einem Ende durch Biotin und dem anderen Ende durch Digoxigenin markiert sind und welche den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle, das Methyltransferasegen und M/R-Stellen von HaeIII und HhaI tragen. Die PCR-Fragmente werden jeweils unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) direkt gereinigt.
Die Gene, die für die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation von M.EcoRI und M.EcoRV benötigt werden, werden durch PCR amplifiziert, indem die Plasmide pMB1 (Betlach et al., 1976) bzw. pLB1 (Bougueleret et al., 1984) als Matrizen, ein Rückwartsprimer, welcher die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle und LMB3 stromaufwärts der Methyltransferasegen-Ribosomenbindungsstelle (EcoRI-Bc oder EcoRV-Bc) anhängt, und ein Vorwärtsprimer (EcoRI-Fo oder EcoRI-Fo), welcher LMB2 anhängt, verwendet werden. Diese Fragmente werden weiter durch PCR amplifiziert, indem die Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO: 9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO: 10) wie oben beschrieben verwendet werden, um die DNA-Fragmente DIG-M.EcoRI-Biotin and DIG-M.EcoRV-Biotin zu erzeugen, welche den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle, das Methyltransferasegen und M/R-Stellen von EcoRI und EcoRV tragen. Diese PCR-Fragmente werden jeweils direkt unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt.
Die oben beschriebenen PCR-amplifizierten DNA-Methylasegene werden in einem prokaryotischen gekoppelten in vitro-Transkriptions/Translationssystem, das für lineare Matrizen entwickelt wurde (Lesley et al., 1991), exprimiert. Eine kommerzielle Präparation dieses Systems wird verwendet (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega), das mit T7-RNA-Polymerase und S-Adenosylmethionin (SAM) in einer Konzentration von 80 μM ergänzt ist.
Die Methylierung wird getestet durch ein Messen der Resistenz der DNA-Fragmente, die mit DIG und Biotin markiert sind, gegen eine Spaltung durch das zugehörige Restriktionsenzym, wobei der DIG-Biotin-ELISA von Boehringer-Mannheim verwendet wird, oder mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten und Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. In vitro-Reaktionsmischungen, die DIG-Biotin-markierte Fragmente enthalten, die wie nachstehend beschrieben in situ durch gekoppelte in vitro-Transkription-Translation umgesetzt wurden, werden in 1 × W&B-Puffer (1 M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4) + 0,1% Tween-20 (die Konzentration der DIG/Biotin-markierten DNA in dem Test liegt in dem Bereich von 0-250 pM) verdünnt und in mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten (hohe Kapazität) für 30-60 min inkubiert. Die Platte wird gespült (3mal 2 × W&B und schließlich mit 50 mM Tris pH 7,4 + 5 mM MgCl₂), und die Restriktionsenzyme (NEB) werden zugegeben (10-50 Einheiten Enzym in 0,2 ml des entsprechenden Puffers) und bei 37°C für 3-12 Stunden inkubiert. Die Platte wird gespült, und mit Peroxidase verknüpfte anti-DIG-Antikörper (verdünnt 1:1.500 in PBS + 0,1% Tween-20 + 2 mg/ml BSA) werden für 40-60 min zugegeben, worauf das Peroxidasesubstrat (BM Blue; 70 μl/Vertiefung) folgt. Die Extinktion (bei 450 minus 650 nm) wird nach Quenchen mit 0,5 M H₂SO₄ (130 μl/Vertiefung) gemessen.
Für den radioaktiven Test werden die oben beschriebenen Plasmide und PCR-Fragmente durch PCR amplifiziert, indem die Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO: 9) und LMB3 und α-P³²-CTP verwendet werden, um P³²-markierte DNA-Fragmente zu ergeben, die an einem Ende mit Biotin markiert sind und welche den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle, das Methyltransferasegen und die relevanten M/R-Stellen tragen. Diese PCR-Fragmente werden unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) direkt gereinigt. Reaktionsmischungen, welche die Biotin-P³²-markierte DNA enthalten, die in situ durch gekoppelte in vitro-Transkription-Translation umgesetzt wurden, werden in 1 × W&B-Puffer + 0,1% Tween-20 verdünnt und mit Streptavidinbeschichteten magnetischen Kügelchen (Dynal, M-280; 1-5 × 10⁶ Kügelchen) für 30-60 min inkubiert. Die Kügelchen werden abgetrennt und gespült (3mal 2 × W&B + 0,1% Tween-20 + 3% BSA und schließlich mit 50 mM Tris pH 7,4 + 5 mM MgCl₂). Die Restriktionsenzyme (NEB) werden zugegeben (10-50 Einheiten Enzym in 50-150 μl des entsprechenden Puffers) und bei 37° für 5-20 Stunden inkubiert. Der Überstand wird entfernt und die Kügelchen gespült und in 100 μl Wasser resuspendiert. Die Menge der radioaktiv markierten DNA auf den Kügelchen und in den Überständen wird durch Szintillation bestimmt.
Alle vier hier beschriebenen Methylasen – M.HaeIII, M.HhaI, M.EcoRI und M.EcoRV – werden bei der gekoppelten in vitro-Transkription/Translation exprimiert und sind aktiv. Weiterhin kann die in vitro translatierte Methylase ihr eigenes Gen methylieren, was dieses so gegen eine Spaltung durch die zugehörige Methylase resistent macht (Selbstmethylierung). Beide Prozesse, die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation des Methylasegens wie auch dessen Methylierung laufen in derselben Reaktionsmischung effizient ab. Insbesondere werden DNA-Fragmente (in Konzentrationen von 0,5 bis 10 nM), welche den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle, ein Methyltransferasegen und M/R-Stellen von allen vier Methylasen tragen, resistent gegen eine Spaltung durch die zugehörige Restriktionsendonuklease. Beispielsweise wird das DNA-Fragment, welches M.EcoRI-Methyltransferase codiert, resistent gegen eine Spaltung durch EcoRI (75-100% nach 20-90 Minuten bei 25°C), wenn es mit dem E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega), SAM (80 μM) und T7-RNA-Polymerase inkubiert wird. Die Resistenz gegenüber einer Spaltung als eine Folge der Methylierung ist selektiv und spezifisch: unter denselben Bedingungen wird eine Resistenz gegenüber einer Spaltung durch HhaI oder M.EcoRV nicht beobachtet; darüber hinaus wird eine Resistenz gegenüber einer Spaltung durch EcoRI nicht beobachtet, wenn die Translation inhibiert wird (z.B. in der Gegenwart von Puromycin oder in der Abwesenheit von T7-RNA-Polymerase). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn das Überleben der Gene durch DIG-Biotin-ELISA oder mit Biotin-P³²-markierten DNA-Fragmenten wie oben beschrieben getestet wird. Eine Methylierung in trans, d.h. von DNA-Fragmenten (außer denen, die für die zugehörige Methylase codieren), die M/R-Stellen anfügen, wird ebenfalls in dem E. coli S30 gekoppelten in vitro-Transkriptions-Translationssystem in der Gegenwart eines Gens, das für eine Methylase codiert, beobachtet.
Beide Prozesse, die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation der Methylasegene wie auch deren Selbstmethylierung läuft effizient in den wässrigen Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion ab. Insbesondere werden DNA-Fragmente (bei Konzentrationen von 0,1-10 nM), welche den T7-RNA-Polymerase-Promoter, die Phage T7-Gen 10-Translationsstartstelle, das Methyltransferasegen (z.B. M.HhaI) und die M/R-Stellen von HaeIII, HhaI und EcoRI tragen, zu dem E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega) in der Gegenwart von SAM (80 μM) und T7-RNA-Polymerase zugegeben. Die eisgekühlten Reaktionsmischungen werden durch Homogenisieren für 1 Minute mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 20.000 Upm wie in Beispiel 1 beschrieben emulgiert und bei 25°-30° für 0-180 min inkubiert. Die Reaktion wird gestoppt, und die wässrige Phase wird abgetrennt (siehe Beispiel 1), und die Methylierung der DIG-Biotin- oder Biotin-P³²-markierten DNA-Fragmente wird wie oben beschrieben getestet. Eine Methylierung von bis zu 20% der kompartimentierten Gene gegenüber einer Spaltung durch HhaI wird nach 60-180 min Inkubation beobachtet. Keine Resistenz wird beobachtet, wenn die eiskalte Emulsion aufgebrochen wird, nachdem sie gerade hergestellt wurde, und die Reaktion durch Etherextraktion ('0 min') gequencht wird. Die Methylierung ist selektiv: unter denselben Bedingungen wird eine Resistenz gegenüber einer Spaltung durch HaeIII oder EcoRI nicht beobachtet. Darüber hinaus hat der Test mit P³²-markierten DNA-Fragmenten gezeigt, dass die Selbstmethylierung von sowohl M.HaeIII als auch M.HhaI bei Konzentrationen von Genen abläuft, die einem Durchschnitt von weniger als einem Gen pro Kompartiment entsprechen (0,1-0,5 nM; siehe Beispiel 4). Somit laufen die gekoppelte in vitro-Transkription-Translation der Methylasegene wie auch deren Selbstmethylierung effizient ab, selbst wenn nur ein einzelnes genetisches Element in den wässrigen Kompartimenten der Wasser-in-Öl-Emulsion vorliegt.
HaeIII-Methylaseaktivität, die aus einer gekoppelten Transkription/Translation von M.HaeIII-Genen resultiert, wird ebenfalls in den größeren Mikrokapseln gemessen, die nur durch Rühren und durch Rühren gefolgt von einer weiteren Homogenisation mit einem Ultra-Turrax T25-Dispergierer bei 8.000 Upm, 9.000 Upm oder 13.500 Upm für 1 Minute wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt wurden. Die Ergebnisse sind in 2b dargestellt. Die verwendete Konzentration der M.HaeIII-Gene (2,5 nM) ergibt einen Durchschnitt von 1, 1,5 und 4,8 genetischen Elementen pro Tröpfchen in den Emulsionen, die bei 13.500 Upm, 9.500 Upm bzw. 8.000 Upm homogenisiert wurden, und einen Durchschnitt von 14 genetischen Elementen pro Tröpfchen in der Emulsion, die nur durch Rühren hergestellt wurde. Die Zugabe eines anionischen Tensids – z.B. Natriumdeoxycholat, typischerweise bis auf 0,5% (w/v), zu der in vitro-Translationsmischung erhöht signifikant den Prozentsatz der genetischen Elemente, die in den Emulsionen methyliert sind.
Beispiel 10.
Genetische Elemente, die DNA-Methyltransferasen codieren, können nach deren Selbstmethylierung in den wässrigen Kompartimenten einer Wasser-in-Öl-Emulsion selektiert und amplifiziert werden.
Die Methylierung von Genen, die für DNA-Methylasen codieren, erlaubt, dass diese in einem nachfolgenden Schritt isoliert und amplifiziert werden. Die methylierte DNA ist selektierbar gegenüber nicht methylierter DNA mittels ihrer Resistenz gegen eine Restriktionsendonukleasespaltung. Somit können die genetischen Elemente, die nach Behandlung mit dem zugehörigen Restriktionsenzym intakt bleiben, durch PCR amplifiziert werden. Jedoch ist eine solche Selektion offensichtlich nicht erreichbar, wenn andere Gene, die dieselbe R/M-Stelle enthalten, aber nicht für die Methylase codieren, in derselben Reaktionsmischung vorliegen. Dieses beruht darauf, dass eine Kreuzmethylierung der nicht-Methylasegene (die in einem großen Überschuss vorliegen) diese resistent gegen eine Spaltung durch das zugehörige Restriktionsenzym und so durch PCR amplifizierbar machen wird. Unter diesen Bedingungen wird die Selektion von Genen, welche die Methylase codieren, nur möglich werden, wenn diese kompartimentiert sind – wenn nämlich nur eines oder wenige Gene in einem einzelnen Kompartiment vorliegen, so dass die Selbstmethylierung der vorherrschende Prozess in diesem Kompartiment ist. Eine Kreuzmethylierung wird vermieden, da nicht-Methylasegene, die in Kompartimenten vorliegen, die kein Methylasegen enthalten, unmethyliert bleiben werden.
Die Gene, die in dem Experiment verwendet werden, sind ein M.HaeIII-Fragment mit 1194 Basenpaaren (DIG-M.HaeIII-3s-Biotin), das die Methylase HaeIII codiert, und ein folA-Fragment mit 681 Basenpaaren (DIG folA-3s-Biotin), das das Enzym Dihydrofolatreduktase (DHFR) codiert, das zusätzliche HaeIII- und HhaI-Restriktions/Modifikationsstellen enthält (siehe 1b). Beide DNA-Fragmente sind an einem Ende mit Digoxigenin (DIG) und an dem anderen mit Biotin markiert und enthalten einen T7-RNA-Polymerase-Promoter (T7-Promoter) und eine T7-Gen 10-Translationsstartstelle (rbs) zur Expression in vitro.
pGEM-4Z-3s wird erzeugt, indem die Oligonukleotide HaeHha-P1 und HaeHha-Mi (SEQ ID NO: 2) (Tabelle 1) annealt werden und diese in mit HindIII und EcoRI geschnittenes pGEM-4Z (Promega) ligiert werden. Das M.HaeIII-Gen wird durch PCR aus Haemophilus influenzae (Biogruppe aegyptius) (ATCC 11116) amplifiziert, indem die Oligonukleotide HaeIII-FoNC (SEQ ID NO: 3) und HaeIII-Bc (SEQ ID NO: 4) (Tabelle 1) verwendet werden. Das folA-Gen wird aus Escherichia coli amplifiziert, indem die Primer EDHFR-Fo (SEQ ID NO: 5) und EDHFR-Ba (SEQ ID NO: 6) (Tabelle 1) verwendet werden. Beide amplifizierten Gene werden mit HindIII und KpnI verdaut und in pGEM-4Z-3s kloniert, was die Expressionsvektoren pGEM-HaeIII-3s und pGEM-folA-3s erzeugt. DIG-M.HaeIII-3s- Biotin und DIG-folA-3s-Biotin (siehe 1b) werden aus diesen Vektoren durch PCR mit Pfu-Polymerase amplifiziert, indem die Primer LMB2-Biotin (SEQ ID NO: 9) und LMB3-DIG (SEQ ID NO: 10) (20 Zyklen) verwendet werden, und unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt. DIG-D1.3-Biotin, ein DNA-Fragment mit 942 bp, das vier HaeIII-R/M-Stellen enthält, das als ein Substrat verwendet wird, um auf HaeIII-Methylaseaktivität zu testen, wird wie oben aus einem pUC19-Derivat amplifiziert, das ein D1.3-Einzelketten-Fv-Gen enthält (McCafferty et al., 1990). Eine Carrier-DNA mit 558 bp (g3 Carrier DNA; ein inneres Fragment des Phage fd-Gens III, welches keinen T7-Promoter, HaeIII- oder HhaI-R/M-Stellen aufweist) wird durch PCR mit Taq-Polymerase aus pHEN1-DNA (Hoogenboom et al., 1991) amplifiziert, indem die Primer G3FRAG-Fo (SEQ ID NO: 11) und G3FRAG-Ba (SEQ ID NO: 12) (Tabelle 1) verwendet werden, und durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt. Diese DNA (bei ≥ 10 nM) wurde als ein Träger bei der Verdünnung der gesamten DNA, die für die Reaktionen in diesem Beispiel verwendet wurde, verwendet.
3 demonstriert die Selektion von M.HaeIII-Genen, welche die DNA-Methylase HaeIII codieren, aus einem Überschuss an folA-Genen (welche DHFR codieren, die DNA nicht methyliert). An beide Gene sind dieselben HaeIII-R/M-Sequenzen angehängt, um als ein Substrat zu wirken (1b). Nach Translation in den wässrigen Kompartimenten einer Emulsion werden die HaeIII-R/M-Sequenzen, die an Methylasegenen befestigt sind, methyliert. Diese Gene werden gegen eine Spaltung durch HaeIII-Endonuklease resistent gemacht und werden anschließend durch PCR amplifiziert. folA-Gene, die in anderen Kompartimenten vorliegen, bleiben unmethyliert, werden gespalten und nicht amplifiziert. Die PCR-Produkte werden durch Agarosegelelektrophorese analysiert, wo eine Anreicherung im Hinblick auf die M.HaeIII-Gene durch das Erscheinen einer Bande mit 1194 bp sichtbar gemacht werden kann (2b).
Das E. coli S30-Extraktsystem für lineare DNA (Promega) wird verwendet, welches mit g3-Carrier-DNA (10 nM), DNA-Fragmenten (DIG-M.HaeIII-3s-Biotin und DIG-M.folA-3s-Biotin in den unten angegebenen Verhältnissen und Konzentrationen), T7-RNA-Polymerase (10⁴ Einheiten), Natriumdeoxycholat (Fluka, 0,5% w/v; nur in emulgierten Reaktionen) und S-Adenosylmethionin (NEB, 80 μM) ergänzt ist. Die Reaktionen werden angesetzt, indem die DNA-Fragmente DIG-M.HaeIII-3s-Biotin und DIG-M.folA-3s-Biotin in einem Verhältnis von 1:10³ und bei einer Gesamtkonzentration von 200 pM (3a) und Verhältnissen von 1:10⁴ bis 1:10⁷ und einer Gesamtkonzentration von 500 pM (3b) verwendet werden. Fünfzig Mikroliter-Reaktionen werden auf Eis hergestellt und nur durch Rühren wie in Beispiel 1 beschrieben emulgiert. Die Reaktionen werden für 2 Stunden bei 25°C inkubiert. Um die Reaktionsmischungen zurück zu gewinnen, werden die Emulsionen für 5 Minuten bei 3.000 g abzentrifugiert und die Ölphase entfernt, was die konzentrierte Emulsion am Boden des Vials zurück lässt. Quenchpuffer (0,2 ml 25 μg/m1 Hefe-RNA in W+B-Puffer: 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4) und 2 ml wassergesättigter Ether werden zugegeben, und die Mischung wird gevortext, kurz zentrifugiert und die Etherphase entfernt. Die wässrige Phase wird mit Ether gewaschen und getrocknet (5 Minuten in einer Speedvac bei Umgebungstemperatur). Die DNA wird auf 100 μg M-280 Streptavidin-Dynabeads eingefangen (2 Stunden bei Umgebungstemperatur). Die Dynabeads werden nacheinander gewaschen mit: W+B-Puffer; 2,25 M Guanidin-HCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7,4; W+B-Puffer; und zweimal mit Restriktionspuffer. Die Kügelchen werden in 100 μl Restriktionspuffer, welcher 10 Einheiten HaeIII (oder HhaI) enthält, resuspendiert und für 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Kügelchen werden dreimal mit W+B-Puffer, zweimal mit 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X-100, pH 9,0, gewaschen und dann in 100 μl desselben Puffers, der mit 1,5 mM MgCl₂ ergänzt ist (PCR-Puffer), resuspendiert. Aliquots der Kügelchen (2-20 μl) werden durch PCR amplifiziert, indem Taq-Polymerase verwendet wird, die bei 94°C mit den Primern LMB2-Biotin und LMB3-DIG zugegeben wird (50 μl-Reaktionen; 32 Zyklen von 1 Minute bei 94°, 1 Minute bei 55°, 2 Minuten bei 72°). Diese DNA wird unter Verwendung von Wizard PCR Preps gereinigt und für die zweite Runde der Selektion verwendet (20 pM bei den 1:10⁴ und 1:10⁵ Selektionen und 500 pM bei den 1:10⁶ und 1:10 Selektionen). Für eine Gelelektrophorese und Aktivitätstests wird diese DNA (verdünnt auf ~1 pM) weiter mit den Primern LMB2-Nest und LMB3-Nest amplifiziert, welche unmittelbar innerhalb von LMB2 bzw. LMB3 annealen (25 Zyklen von 1 Minute bei 94°, 1 Minute bei 50°, 1,5 Minuten bei 72°), und wie oben gereinigt. Diese DNA (bei 10 nM), an welche weder DIG noch Biotin angehängt ist, wird ebenfalls in vitro in der Gegenwart von 10 nM DIG-D1.3-Biotin, einer DNA mit 942 bp, welche vier HaeIII-R/M-Stellen enthält, translatiert. Die Methylierung des DIG-D1.3-Biotin-Substrats wird wie in Beispiel 9 durch einen DIG-Biotin-ELISA bestimmt.
Eine einzige Runde der Selektion eines 1:1000-Verhältnisses von M.HaeIII-:folA-Genen in der Emulsion führt zu einem endgültigen Genverhältnis von ungefähr 1:1 (3a). Mehrere Kontrollexperimente zeigen, dass die Selektion nach dem oben beschriebenen Mechanismus abläuft: eine Bande, die dem M.HaeIII-Gen entspricht, wird nicht beobachtet, wenn die Anfangsmischung der Gene durch PCR amplifiziert wird; noch nach Reak tion in Lösung (nicht emulgiert); noch, wenn in der Abwesenheit von Transkription/Translation emulgiert wird (wenn T7-RNA-Polymerase weggelassen wird); noch wenn die umgesetzten Gene an R/M-Stellen außer denen von HaeIII – z.B. nach Verdau mit HhaI – gespalten werden. Die Ausbeute an M.HaeIII-DNA nach der Selektion beträgt weniger als 100%, hauptsächlich aufgrund einer unvollständigen Verdauung durch HaeIII und nicht einer Kreuzmethylierung, wie durch die große folA-Bande angezeigt wird, die in der Abwesenheit von Methylaseaktivität (wenn T7-Polymerase nicht zugegeben wird) beobachtet wird. Während des Verdaus fällt die Konzentration der DNA weit unter die K_M von HaeIII (6 nM), und der Verdau wird extrem ineffizient.
Eine Bande, welche den M.HaeIII-Genen entspricht, wird ebenfalls nach einer einzigen Runde der Selektion ausgehend von M.HaeIII:folA-Verhältnissen von 1:10⁴ bis 1:10⁵ (3b), nicht aber bei niedrigeren Verhältnissen sichtbar, was einen Anreicherungsfaktor von wenigstens 5000fach zeigt. Die Selektion einer kleinen Anzahl von Genen aus einem großen Pool (z.B. einer Genbibliothek) erfordert daher weitere Runden der Selektion. Wenn die mit HaeIII verdaute und amplifizierte DNA aus der ersten Runde der Selektion einer zweiten Runde der Selektion unterzogen wird, wird eine Bande, welche M.HaeIII-Genen entsprach, ebenfalls bei Ausgangsverhältnissen von 1:10⁶ und 1:10⁷ von M.HaeIII:folA sichtbar. Eine zweite Runde der Selektion wird ebenfalls mit der DNA durchgeführt, die aus den Ausgangsverhältnissen von 1:10⁴ bis 1:10⁵ von M.HaeIII:folA stammte. Dieses ergibt eine weitere Anreicherung, bis zu einem Verhältnis von ungefähr 3:1 zugunsten der M.HaeIII-Gene. Vor und nach jeder Selektionsrunde werden die Gene amplifiziert, in vitro translatiert und mit einem separaten DNA-Substrat umgesetzt, um auf HaeIII-Methylaseaktivität zu testen. Diese Tests zeigen, dass die Anreicherung im Hinblick auf die M.HaeIII-Gene, wie sie durch Gelelektrophorese beobachtet wird, zu einer parallelen Zunahme bei der HaeIII-Methylaseaktivität führt (3b).
Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren zur Erhöhung der Konzentration eines Nukleinsäuremoleküls, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bilden von wässrigen Mikrokapseln in einer Wasser-in-Öl-Emulsion, wobei die Mikrokapseln eine wässrige innere Phase umfassen, die als diskrete Tröpfchen in einer hydrophoben äußeren Phase suspendiert ist, und wobei eine Mehrzahl der Mikrokapseln ein Nukleinsäuremolekül und eine wässrige Lösung beinhaltet, die Komponenten umfasst, die für eine Nukleinsäureamplifikation in der wässrigen inneren Phase notwendig sind; (b) Amplifizieren des Nukleinsäuremoleküls in den Mikrokapseln, um weitere amplifizierte Kopien des Nukleinsäuremoleküls zu bilden; und (c) Anreichern im Hinblick auf die Nukleinsäure unter Verwendung einer Markierung, die mit der Nukleinsäure verknüpft ist.
Ein Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, welches das Koppeln der Nukleinsäure an einen Festphasenträger umfasst.
Ein Verfahren wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei der Festphasenträger ein Kügelchen umfasst.
Ein Verfahren wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das Kügelchen Polystyrol oder ein magnetisches Kügelchen ist.
Ein Verfahren wie in Anspruch 2 oder Anspruch 3 beansprucht, wobei das Kügelchen eine Beschichtung umfasst, die ausgewählt ist aus Avidin und Streptavidin.
Ein Verfahren wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei das Nukleinsäuremolekül eine Biotin-Markierung umfasst.
Ein Verfahren wie in irgendeinem vorhergehenden Anspruch beansprucht, wobei die Nukleinsäureamplifikation durchgeführt wird unter Verwendung von RNA-Polymerase, Qβ-Replicase-Amplifikation, Ligasekettenreaktion, sich selbst unterhaltender Sequenzreplikation oder Strangaustauschamplifikation.
Ein Verfahren wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, wobei die Nukleinsäureamplifikation unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion durchgeführt wird.
Ein Verfahren wie in irgendeinem vorhergehenden Anspruch beansprucht, wobei die Emulsion wenigstens einen Emulsionsstabilisator beinhaltet.
Ein Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei der Emulsionsstabilisator ein nichtionisches Tensid ist.
Ein Verfahren wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei der Emulsionsstabilisator ausgewählt wird aus Sorbitanmonooleat und Polyoxyethylensorbitanmonooleat.
Ein Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei der Emulsionsstabilisator ein anionisches Tensid ist.
Ein Verfahren wie in Anspruch 12 beansprucht, wobei der Emulsionsstabilisator ausgewählt wird aus Natriumcholat, Natriumglycocholat, Natriumtaurocholat und Natriumdeoxycholat.
Ein Verfahren wie in irgendeinem vorhergehenden Anspruch beansprucht, wobei die Emulsion thermostabil ist.
Ein Verfahren wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei der Festphasenträger ein Kügelchen ist, die Nukleinsäureamplifikation durchgeführt wird, indem die Polymerasekettenreaktion verwendet wird, und die Emulsion thermostabil ist.
Ein Verfahren wie in irgendeinem vorhergehenden Anspruch beansprucht, wobei eine Mehrzahl von Mikrokapseln, wenn diese gebildet werden, jeweils im Durchschnitt ein oder weniger als ein Nukleinsäuremolekül enthält.
Ein Verfahren wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 beansprucht, wobei eine Mehrzahl von Mikrokapseln, wenn diese gebildet werden, jeweils im Durchschnitt zwischen 5 und 1000 Nukleinsäuremoleküle enthält.