DE69839148T2

DE69839148T2 - Verwendungen von ölkörpern

Info

Publication number: DE69839148T2
Application number: DE69839148T
Authority: DE
Inventors: Harm M. Calgary DECKERS; Gijs Calgary VAN ROOIJEN; Joseph Calgary BOOTHE; Janis Calgary GOLL; Maurice Calgary MOLONEY; Soheil Sayed Calgary MAHMOUD
Original assignee: SemBioSys Genetics Inc
Current assignee: SemBioSys Genetics Inc
Priority date: 1997-05-27
Filing date: 1998-05-27
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2018-05-28
Also published as: CA2291274A1; CN1084595C; WO1998053698A1; CN1258198A; BR9809691A; NO995802L; JP3869861B2; HK1027487A1; DE69839148D1; EP0986309A1; KR20040101211A; IL132908A; NO316731B1; CA2291274C; AR012877A1; US6210742B1; NZ501404A; CY1107375T1; KR20010013047A; AU737896B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Emulsionen bereit, die Ölkörperchen enthalten. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung der Emulsionen bereit und die Verwendung der Emulsionen in verschiedenen häuslichen und industriellen Zusammensetzungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Emulsionen sind Gemische, die aus zwei ineinander nicht löslichen Komponenten hergestellt sind. Es ist möglich, aus diesen Komponenten durch geeignete Auswahl und durch Beeinflussung der Mischbedingungen Gemische von makroskopisch homogener Erscheinung zu erzeugen. Die häufigsten Emulsionsarten sind diejenigen, bei denen eine wäßrige Komponente und eine lipophile Komponente eingesetzt werden und welche auf dem Gebiet häufig als Öl-in-Wasser- und Wasser-in-Öl-Emulsionen bezeichnet werden. Bei Öl-in-Wasser-Emulsionen ist die lipophile Phase in der wäßrigen Phase dispergiert, während bei Wasser-in-Öl-Emulsionen die wäßrige Phase in der lipophilen Phase dispergiert ist. Die allgemein bekannten Beispiele für auf einer Emulsion basierenden Formulierungen im Hausgebrauch umfassen Mayonnaise, Margarine, Eiscreme, Kosmetika und Farbe. Auch in der Industrie werden Emulsionssysteme ausgiebig eingesetzt, wie z. B. in der pharmazeutischen und der agrochemischen Industrie, wo es häufig gewünscht ist, aktive Inhaltsstoffe in Emulsionen zu formulieren.
Im allgemeinen werden Emulsionen in der Gegenwart einer Vielzahl von anderen Substanzen hergestellt, um ein gewünschtes Gleichgewicht der Emulsionsbildung, Viskosität, Stabilität und Erscheinung zu erreichen. Zum Beispiel erfordert die Formulierung von Emulsionen üblicherweise wenigstens eines und häufig eine Kombination von mehreren Emulgators bzw. Emulgatoren. Diese Mittel erleichtern die Dispersion von einer nicht mischbaren Phase in die andere und unterstützen die Stabilisierung der Emulsion. Die Emulgatoren umfassen eine breite Verschiedenheit an synthetischen und natürlichen Komponenten. Zum Beispiel werden Monoglyceride und chemische Derivate davon weit verbreitet als Emulgatoren bei Nahrungsmittelanwendungen verwendet, wie z. B. bei Margarinen und Backwaren. Ein Beispiel für einen natürlichen Emulgator ist Lecithin, ein Phospholipid, welches im Eidotter vorliegt, welches häufig bei der Herstellung von Mayonnaise verwendet wird. Es ist auch möglich, aktive Bestandteile in Emulsionen einzuschließen. Dies ist besonders wünschenswert bei Zusammensetzungen, die aktive Mittel umfassen, welche schwer in wäßrigen Lösungen zu lösen sind, wie z. B. bestimmte Vitamine und Nukleotide. Aktive Bestandteile werden auch oft als Emulsionen formuliert, um deren Stabilität zu verbessern. Ein Beispiel eines Emulsionssystems, welches ein pharmazeutisches Mittel umfaßt, ist in dem US-Patent 5,602,183 dokumentiert, welches eine Zusammensetzung für die Wundheilung offenbart, welche ein anti-inflammatorisches Mittel enthält. Das Vorangehende stellt lediglich beispielhaft einige wenige der Myriaden von Komponenten dar, die in Formulierungen von Emulsionen, die auf dem Gebiet bekannt sind, eingeschlossen sind. Ein umfassender Überblick über die Emulgatoren und deren Anwendungen kann gefunden werden in Becher, P. Encyclopedia of Emulsion Technology, Dekker Hrsg., 1983.
In den Samen von Ölsamen-Nutzpflanzen, die ökonomisch bedeutende Nutzpflanzen umfassen, wie z. B. Sojabohne, Rapssamen, Sonnenblume und Palme, ist die in Wasser unlösliche Ölfraktion in diskreten subzellulären Strukturen gespeichert, die auf dem Gebiet verschiedentlich als Ölkörperchen, Oleosome, Lipidkörper oder Spherosome bekannt sind (Huang, 1992, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43: 177–200). Neben einem Gemisch aus Ölen (Triacylglyceriden), die chemisch als Glycerolester von Fettsäuren definiert sind, umfassen Ölkörperchen Phospholipide und eine Anzahl von assoziierten Proteinen, die im allgemeinen als Ölkörperproteine bezeichnet werden. Aus dem strukturellen Blickwinkel werden Ölkörperchen als eine Triacylglyceridmatrix betrachtet, die von einer Monoschicht von Phospholipiden eingekapselt ist, in welcher Ölkörperproteine eingebettet sind (Huang, 1992, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43: 177–200). Das Samenöl, welches in der Ölkörperfraktion von Pflanzenarten vorliegt, ist ein Gemisch von verschiedenen Triacylglyceriden, deren exakte Zusammensetzung von der Pflanzenart aus der das Öl abgeleitet wird, abhängt. Durch eine Kombination von klassischer Züchtung mit gentechnischen Verfahren ist es möglich geworden, das Ölprofil von Samen zu manipulieren und das natürlich verfügbare Repertoire von Pflanzenölzusammensetzungen auszuweiten. Für einen Überblick über die vorangehenden Bemühungen auf diesem Gebiet siehe Designer Oil Crops/Breeding, Processing and Biotechnology, D. J. Murphy Hrsg., 1994, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland.
Pflanzensamenöle werden bei einer Vielzahl von industriellen Anwendungen verwendet, namentlich in der Nahrungsmittel-, Tensid- und kosmetischen Industrie. Um die Pflanzenöle zu erhalten, die bei diesen Anwendungen verwendet werden, werden Samen zerkleinert oder gepreßt und nachfolgend aufbereitet unter Anwendung von Prozessen, wie z. B. organische Extraktion, Degummieren, Neutralisieren, Bleichen und Filtern. Auch die wäßrige Extraktion von Pflanzenölsamen wurde dokumentiert (z. B. Embong und Jelen, 1977, Can. Inst. Food Sci. Technol. J. 10: 239–243). Da es die Aufgabe der Verfahren, die im Stand der Technik gelehrt werden, ist, reines Öl zu erhalten, verlieren die Ölkörperchen im Laufe dieser Produktionsverfahren ihre strukturelle Integrität. Daher umfassen die herkömmlichen Emulsionen, die aus Pflanzenölen formuliert werden, im allgemeinen keine intakten Ölkörperchen.
Obwohl es viele Anwendungen gibt, bei denen auf Mineralöl basierende Produkte den Markt dominieren, stehen bei anderen Anwendungen Öle, die aus pflanzlichen Quellen und aus fossilen Quellen abgeleitet sind, in unmittelbarer Konkurrenz. Beispielsweise werden Laurinöle, die bei der Herstellung von Detergentien weit verbreitet angewendet werden, sowohl aus Mineralölen als auch aus Kokosnußöl und seit jüngerer Zeit auch aus gentechnisch veränderten Rapssamen erhalten (Knauf, V. C., 1994, Fat. Sci. Techn. 96: 408). Allerdings besteht gegenwärtig ein ansteigendes Verlangen nach biologisch abbaubaren Quellen für Rohmaterialien. Die auf pflanzlichen Ölkörpern basierenden Emulsionen der vorliegenden Erfindung bieten dahingehend gegenüber ähnlichen auf Mineralöl basierenden Formulierungen einen Vorteil, daß die Ölfraktion aus einer erneuerbaren und umweltfreundlichen Quelle abgeleitet wird.
Die US-Patente 5,683,710 und 5,613,583 offenbaren Emulsionen, die Lipidvesikel aus Öl produzierenden Pflanzen umfassen. Die in diesen Patenten offenbarten Emulsionen werden aus relativ unbehandelten Samenextrakten hergestellt und umfassen eine Reihe von Samenkomponenten, einschließlich glykosylierte und nicht-glykosylierte Proteine. Es ist ein Nachteil der Emulsionen, die diese Patente betreffen, daß sie verunreinigende Samenkomponenten umfassen, die den Emulsionen eine Reihe von ungewünschten Eigenschaften verleihen, die eine Allergenität und ungewünschte Geruchs-, Geschmacks-, Farb- und organoleptische Merkmale einschließen können. Infolge der Gegenwart von Samenverunreinigungen haben die in diesen Patenten offenbarten Zubereitungen von Lipidvesikeln eingeschränkte Anwendungsmöglichkeiten.
WO 98/27115 lehrt ein Verfahren der Abtrennung eines Zielmoleküls aus einem Gemisch, bei dem Ölkörperchen und deren assoziierte Proteine als Affinitätsmatrizes eingesetzt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Emulsionsformulierungen, die eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung umfassen, welche intakte Ölkörperchen von ungefähr einheitlicher Größe, Form und Dichte umfassen, wobei diese Emulsion weiterhin ein Konservierungsmittel umfaßt. Die Emulsionsformulierungen der vorliegenden Erfindung sind erhältlich in nichttoxischen und nahrungsmitteltauglichen Formen. Außerdem sind die Emulsionsformulierungen vorteilhafterweise hergestellt aus einer Ölkörperchenzubereitung, welche eine cremige Textur aufweist, und können daher bei einer Reihe von häuslichen und industriellen Anwendungen einfach angewendet werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, daß die Ölkörperchenfraktion von lebenden Zellen bei der Formulierung von einer Reihe von neuartigen auf einer Emulsion basierenden Nahrungsmittel-, Kosmetik-, Pharmazie- und Industrieprodukten nützlich ist. Allgemein formuliert stellt die vorliegende Erfindung eine Emulsionsformulierung bereit, die gewaschene Ölkörperchen umfaßt, welche aus einer Zelle abgeleitet wurden.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der Emulsionsformulierungen bereit und die Verwendung der Emulsionsformulierungen in verschiedenen häuslichen und industriellen Zusammensetzungen.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Emulsionsformulierungen bereit, bei dem man: 1) Ölkörperchen aus einer Zelle gewinnt, 2) die Ölkörperchen wäscht, um eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung zu erhalten, die intakte Ölkörperchen von etwa einheitlicher Größe, Form und Dichte umfaßt, wobei die gewaschene Ölkörperchenzubereitung weniger als 10% anderes Samenprotein enthält, 3) die gewaschene Ölkörperchenzubereitung in eine Emulsionsformulierung formuliert und 4) die Emulsionsformulierung so behandelt, daß die Kontamination durch Bakterien, Pilze, Mykoplasmen, Viren und dergleichen oder ungewünschte chemische Reaktionen vermieden werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die gewaschene Ölkörperchenzubereitung aus Pflanzensamen erhalten, einschließlich Samen von Rapssamen, Sojabohne, Mais und Sonnenblume. Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Emulsionsformulierungen aus Pflanzensamen bereit, bei dem man:

(a) Pflanzensamen zerkleinert,
(b) Feststoffe von den zerkleinerten Samen entfernt,
(c) die Ölkörperchenphase von der wäßrigen Phase trennt,
(d) die Ölkörperchenphase wäscht, um eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung hervorzubringen, die intakte Ölkörperchen von etwa einheitlicher Größe, Form und Dichte umfaßt, wobei die gewaschene Ölkörperchenzusammensetzung weniger als 10% an anderem Samenprotein enthält,
(e) die gewaschene Ölkörperchenzubereitung in eine Emulsion formuliert,
(f) die Emulsionsformulierung so behandelt, daß die Kontamination durch Bakterien, Pilze, Mykoplasmen, Viren und dergleichen oder ungewünschte chemische Reaktionen vermieden werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird vor oder nach der Zerkleinerung der Samen eine flüssige Phase zugegeben.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Formulieren der Emulsion (e) das Zugeben einer flüssigen Phase zu der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung.
Die Emulsionen der vorliegenden Erfindung können in einem weiten Anwendungsbereich eingesetzt werden, einschließlich bei der Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, pharmazeutischen Produkten, Körperpflegeprodukten und industriellen Produkten. Die Emulsionsformulierung der vorliegenden Erfindung ist insbesondere geeignet für die Herstellung von nahrungsmitteltauglichen Produkten, da sie nicht toxisch, cremig in ihrer Textur und bioabbaubar ist.
Weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden nach Betrachtung der anhängenden Figuren und der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein mit Coomassie-Blau gefärbtes Gel einer Zubereitung von gewaschenen Ölkörperchen aus weißem Senf, Rapssamen (Brassica napus), Sojabohne, Erdnuß, Kürbis, Lein, Sonnenblume, Carthamus und Mais.
2A–C sind mit Coomassie-Blau gefärbte Gele, die die Proteinprofile von verschiedenen Samenfraktionen darstellen, die erhalten wurden aus Brassica napus (Canola) (A), Sonnenblume (B) und Mais (C). Die Gele zeigen die folgenden Fraktionen: (1) Gesamtsamenprotein (TSP), (2) dekantierte flüssige Phase (DL), (3) ungewaschene Ölkörperchen (LP1), (4) drei Waschgänge mit Wasser (LP4), (5) vier Waschgänge mit Wasser und ein Waschgang mit 100 mM Na₂CO₃ (washed).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie zuvor erwähnt wurde, betrifft die vorliegende Erfindung eine Emulsion, die eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung umfaßt, welche intakte Ölkörperchen von ungefähr einheitlicher Größe, Form und Dichte umfaßt, wobei die Emulsion weiterhin ein Konservierungsmittel umfaßt.
Bei einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Emulsionsformulierung bereit, bei dem man:

(1) Ölkörperchen aus einer Zelle erhält,
(2) die Ölkörperchen wäscht, um eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung zu erhalten, die intakte Ölkörperchen von ungefähr einheitlicher Größe, Form und Dichte umfaßt, wobei die gewaschene Ölkörperchenzubereitung weniger als 10% an anderem Samenprotein enthält,
(3) die gewaschene Ölkörperchenzubereitung in eine Emulsionsformulierung formuliert und
(4) diese Emulsionsformulierung so behandelt, daß die Kontamination durch Bakterien, Pilze, Mykoplasmen, Viren und dergleichen oder ungewünschte chemische Reaktionen vermieden werden.

Die Zelle kann jede Zelle sein, die Ölkörperchen (oder Ölkörperchen-ähnliche Strukturen) enthält, einschließlich Pflanzenzellen, Tierzellen, Pilzzellen und Bakterienzellen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Ölkörperchen aus einer Pflanzenzelle erhalten. Die Ölkörperchen können aus einer Pflanzenzelle erhalten werden, indem man die Pflanzenzellmembran und die Zellwand nach einem beliebigen Verfahren aufbricht, bei dem die Zellbestandteile freigesetzt werden, ohne die strukturelle Integrität der Ölkörperchen wesentlich zu beeinträchtigen. Vorzugsweise werden die Ölkörperchen aus Pflanzensamen erhalten. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Emulsionsformulierung bereit, bei dem man:

(1) Ölkörperchen aus Pflanzensamen nach einem Verfahren gewinnt, bei dem man: (a) die Pflanzensamen zerkleinert, (b) Feststoffe von den zerkleinerten Samen entfernt und (c) die Ölkörperchenphase von der wäßrigen Phase trennt,
(2) die Ölkörperchenphase wäscht, um eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung hervorzubringen, die intakte Ölkörperchen von etwa einheitlicher Größe, Form und Dichte umfaßt, wobei die gewaschene Ölkörperchenzubereitung weniger als 10% an anderem Samenprotein enthält,
(3) die gewaschene Ölkörperchenzubereitung in eine Emulsionsformulierung formuliert und
(4) die Emulsionsformulierung so behandelt, daß die Kontamination durch Bakterien, Pilze, Mykoplasmen, Viren und dergleichen oder ungewünschte chemische Reaktionen vermieden werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird vor oder während der Zerkleinerung der Samen eine flüssige Phase zu den Samen zugegeben.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Formulieren der Emulsion (e) das Zugeben einer flüssigen Phase zu der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung.
Der Begriff "Zerkleinern", wie er hier verwendet wird, bedeutet Mahlen, Zerstoßen, Häckseln oder Granulieren der Samen, und diese Begriffe können innerhalb dieser Anmeldung austauschbar verwendet werden. Bei dem Verfahren werden die Samenzellen aufgebrochen.
Der Begriff "Feststoffe", wie er hier verwendet wird, bedeutet jedes Material, das in der wäßrigen Phase oder in der Ölkörperchenphase nicht löslich ist, wie z. B. Samenschalen.
Der Begriff "Waschen der Ölkörperchen", wie er hier verwendet wird, bedeutet jedes Verfahren, welches zelluläre Verunreinigungen aus der Ölkörperchenphase entfernt, insbesondere jede Verunreinigung, die der Emulsionsformulierung ungewünschte Eigenschaften verleiht, wie z. B. allergene Eigenschaften, ungewünschte Farbe, ungewünschter Geruch, ungewünschter Geschmack oder ungewünschte organoleptische Eigenschaften, oder eine beliebige andere ungewünschte Eigenschaft. Die Beispiele für Verfahren des Waschens umfassen Trennverfahren, die auf Gravitation beruhen, wie z. B. zentrifugations- und größenausschlußbasierte Trenntechniken, wie z. B. die Membran-Ultrafiltration und die Querstrom-Mikrofiltration. Die Waschverfahren und -bedingungen werden in Übereinstimmung mit der gewünschten Reinheit der Ölkörperchenzubereitung ausgewählt.
Der Begriff "gewaschene Ölkörperchenzubereitung", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Zubereitung von Ölkörperchen, aus der eine signifikante Menge an zellulärem Material entfernt worden ist, einschließlich Verunreinigungen, die der Emulsionsformulierung ungewünschte Eigenschaften verleihen, wie z. B. allergene Eigenschaften, ungewünschte Farb-, Geruchs-, Geschmacks- oder organoleptische Eigenschaften, oder eine beliebige andere ungewünschte Eigenschaft. Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung enthält weniger als 10% an anderen Samenproteinen.
Mit "Formulieren der Ölkörperchen in eine Emulsion" ist gemeint, daß die gewaschene Ölkörperchenzubereitung, falls erforderlich, vermischt oder homogenisiert wird, bis sich eine Emulsion ausbildet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein zusätzlicher Bestandteil zugegeben, wie z. B. eine flüssige Phase, und die gewaschene Ölkörperchenzubereitung und die flüssige Phase werden vermischt, bis ein homogenes Gemisch erreicht wird.
Die gewaschenen Ölkörperchenzubereitungen sind insbesondere geeignet für die Formulierung von Emulsionen infolge der oben erwähnten vorteilhaften Eigenschaften.
EIGENSCHAFTEN DER ÖLKÖRPERCHEN
Die Emulsionsformulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen intakte gewaschene Ölkörperchen von ungefähr einheitlicher Größe, Form und Dichte. Wenn sie unter dem Elektronenmikroskop betrachtet werden, erscheinen die Ölkörperchen mehr oder weniger als sphärisch geformte Strukturen (siehe: Beispiel Murphy, D. J. und Cummins, I., 1989, Phytochemistry, 28: 2063–2069; Jacks, T. J. et al., 1990, JAOCS, 67: 353–361). Die typischen Größen von Ölkörperchen variieren zwischen 0,4 μm und 1,5 µm (Murphy D. J. und Cummins, I., 1989, Phytochemistry, 28: 2063–2069). Es wurde herausgefunden, daß die Ölkörperchen in einer gewaschenen Ölkörperchenzubereitung, die aus Rapssamen isoliert wurde, symmetrisch und unimodal um 1 µm verteilt vorlagen, wenn sie unter Anwendung eines Malvern Größen-Analysators analysiert wurden. Unter Verwendung eines Malvern Größen-Analysators konnte eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung eindeutig von im Handel erhältlichen Öl-in-Wasser-Emulsionen, einschließlich Sojamilch, Mayonnaise (Kraft Real Mayonnaise) und zwei Kokosnußmilchzubereitungen (Tosca, Aroy-D), unterschieden werden.
Die exakte Größe und Dichte der Ölkörperchen hängt wenigstens zum Teil von der genauen Protein/Phospholipid/Triacylglycerid-Zusammensetzung, welche vorliegt, ab. Die Erzeugung von gewaschenen Ölkörperchen gemäß der vorliegenden Erfindung führt nicht zu einer wesentlichen Veränderung der Form der Ölkörperchen im Vergleich zu denjenigen, die in ganzen Samen vorliegen, wenn man sie unter dem Elektronenmikroskop betrachtet.
Beim Aufbrechen einer Zelle, die Ölkörperchen enthält, kann die Ölkörperchenfraktion schnell und einfach aus wäßrigen Lösungen abgetrennt werden, da die Ölkörperchenfraktion in wäßrigen Lösungen bei Anwendung einer Zentrifugalkraft aufschwimmen wird. In Lösungen, bei denen die Dichte der Ölkörperchenfraktion größer ist als die des Lösungsmittels, wie z. B. 95%-iger Ethanol, werden sich die Ölkörperchen unter den gleichen Bedingungen sedimentieren. Die Ölkörperchenfraktion kann von der wäßrigen Fraktion auch durch auf Größenausschluß basierende Trennverfahren, wie z. B. die Membranfiltration, abgetrennt werden, was insofern vorteilhaft sein kann, da Ölkörperchen von noch einheitlicherer Größe erhalten werden können.
Die Ölkörperchen, die in den Zubereitungen von gewaschenen Ölkörperchen gemäß der vorliegenden Erfindung vorliegen, sind resistent gegen die Exposition gegenüber starken Säuren und Basen, einschließlich einer längeren Exposition gegenüber Säurebedingungen von wenigstens so wenig wie einem pH-Wert von 2 und basischen Bedingungen von wenigstens so viel wie einem pH-Wert von 10. Ein geringer Verlust an Öl wurde beobachtet, wenn es einem kleinem pH-Wert von 12 ausgesetzt wurde, was auf einen Verlust an Integrität der Ölkörperchenstruktur hinweist. Außerdem beeinträchtigt die Extraktion mit verschiedenen organischen Lösungen, einschließlich Methanol, Ethanol, Hexan, Isopropylalkohol und Ethylacetat die Integrität der Ölkörperchen, die in der Zubereitung mit gewaschenen Ölkörperchen vorliegen, nicht oder nur gering. Die Ölkörperchen, die in der Zubereitung mit gewaschenen Ölkörperchen vorliegen, erwiesen sich als widerstandsfähig gegenüber dem Mischen mit anionischen Detergenzien, Natriumdode cylsulfat (SDS), dem kationischen Detergens Hexadecyltrimethylbromid und Tween-80, einem nicht-ionischen Detergens. Das Kochen der Zubereitung mit gewaschenen Ölkörperchen in der Gegenwart von SDS erwies sich als wenigstens teilweise zum Zerfall der Ölkörperchenstruktur führend. Die Ölkörperchen, die in der Zubereitung mit gewaschenen Ölkörperchen vorliegen, sind stabil, wenn sie für 2 Stunden bei wenigstens 100°C gehalten werden. Ein langsames Einfrieren und Auftauen der Zubereitungen mit gewaschenen Ölkörperchen führte zu einer Veränderung in deren physikalischer Erscheinung, die gekennzeichnet war durch die Bildung von Klümpchen im Gegensatz zu einer homogenen Emulsion. Die Klümpchenbildung der Ölkörperchen infolge von Einfrieren-Auftauen könnte bis zu einem hohen Grad auch verhindert werden, indem man entweder a) blitzartig in flüssigem Stickstoff einfriert, anstatt bei –20°C langsam einzufrieren, oder b) Glycerol im Überschuß von 5% (V/V) zu der Ölkörperchenzubereitung vor dem Einfrieren zugibt. Die Widerstandsfähigkeit gegenüber relativ rauhen chemischen und physikalischen Bedingungen ist ein einzigartiges Merkmal der Ölkörperchen, die in der Zubereitung mit gewaschenen Ölkörperchen der vorliegenden Erfindung vorliegen.
Die vorliegende Erfindung stellt Emulsionsformulierungen bereit, die Ölkörperchen umfassen, aus denen eine signifikante Menge an Samenverunreinigungen entfernt worden ist. Diese Verunreinigungen umfassen Proteine, flüchtige Stoffe und andere Verbindungen, die ungewünschte Farb-, Geruchs-, Geschmacks-, organoleptische Eigenschaften oder andere ungewünschte Eigenschaften verleihen können. Von einer Reihe von Samenproteinen wurde berichtet, daß sie allergene Reaktionen verursachen können. Zum Beispiel berichten Ogawa et al. (1993, Biosci. Biotechnol. Biochem., 57: 1030–1033) von der Allergenität des Sojabohnenglykoproteins P34 (alternativ bezeichnet als Gly m Bd 30K). Auch gegen Rapssamen-, Weizen- und Gerstensamenproteine wurden allergene Reaktionen berichtet (Armentia et al., 1993, Clin. Exp. Allergy 23: 410–415; Monsalve et al., 1993, Clin. Exp. Allergy 27: 833–841). Demzufolge ist das Entfernen von verunreinigenden Samenproteinen vorteilhaft. Die Waschbedingungen können so ausgewählt sein, daß eine im wesentlichen reine Ölkörperchenzubereitung erhalten wird. In diesem Fall sind in der Zubereitung im wesentlichen nur die Ölkörperchenproteine vorhanden.
Für viele Anwendungen wird es als vorteilhaft betrachtet, daß eine reine, besser definierte Ölkörperchenzubereitung erhalten wird, da dies eine größere Kontrolle über den Formulierungsprozeß der fertigen Emulsion ermöglicht. Damit die Zubereitung mit gewaschenen Ölkörperchen in eine diverse Reihe von Emulsionen eingeschlossen werden kann, ist es gewünscht, daß flüchtige Stoffe auf einem Minimum gehalten werden und daß die Farbe vorzugsweise hell oder weiß ist. Das Waschen der Ölkörperchenzubereitung führt zu einer heller gefärbten Zubereitung. Außerdem wird eine wesentliche Menge an flüchtigen Stoffen entfernt. Durch das Waschen werden auch die Verbindungen entfernt, die das Wachstum von Mikroorganismen fördern, da beobachtet wurde, daß eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung eine längere Haltbarkeit aufwies als eine ungewaschene Zubereitung. Andere Verbindungen, die durch das Waschen entfernt werden, umfassen antinutritive Glucosinolate und/oder Abbauprodukte davon und faseriges Material. Es wurde beobachtet, daß im Vergleich zu einer ungewaschenen Zubereitung größere Mengen an Wasser von der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung absorbiert bleiben, wenn sie mit bis zu 60°C oder 80°C wärmebehandelt wurde. Beim Herunterkühlen auf Raumtemperatur und beim Zentrifugieren wurde beobachtet, daß die gewaschene Ölkörperchenzubereitung stabil blieb, während bei der ungewaschenen Zubereitung eine Phasentrennung auftrat. Angesichts der verbesserten Stabilität der gewaschenen Ölkörperchen sind diese bevorzugt, wenn das Formulierungsverfahren die Anwendung von Wärme einschließt. Wenn sie auf 40°C erwärmt wurde, war die gewaschene Ölkörperchenzubereitung in der Lage, größere Mengen an exogen zugegebenem Wasser zu absorbieren, ohne daß dies zu einer Phasentrennung führte. Demnach sind bei der Formulierung von wäßrigen Emulsionen gewaschene Ölkörperchen bevorzugt. Die Kapazität, exogen zugegebene Öle zu absorbieren, wurde ebenso zwischen einer Zubereitung mit gewaschenen Ölkörperchen und einer ungewaschenen Zubereitung verglichen. Zu der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung konnten größere Mengen an exogenem Öl zugegeben werden, bevor sich eine nichtstabile Emulsion ausbildete. Dies ist vorteilhaft bei Formulierungen, bei denen exogene Öle oder Wachse bei dem Formulierungsprozeß zugegeben werden, wie z. B. wenn Schmiermittel oder Kosmetika hergestellt werden. Wenn man die Viskosität zwischen einer gewaschenen Ölkörperchenzubereitung und einer nicht gewaschenen Zubereitung verglich, fand man heraus, daß die gewaschene Zubereitung viskoser war. Eine viskosere Zubereitung von Ölkörperchen ist gewünscht, da dies das Erfordernis, Verdickungsmittel bei dem Formulierungsverfahren zuzugeben, beseitigt.
Die hier bereitgestellte Zubereitung mit gewaschenen Ölkörperchen ist in vielerlei Hinsicht einer ungewaschenen Zubereitung überlegen. Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung der vorliegenden Erfindung ist eine besser definierte Zubereitung mit einer längeren Lebenszeit und bevorzugten Farb-, Geruchs- und Viskositätseigenschaften. Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung hat auch überlegene Wasser- und Ölabsorptionseigenschaften. Schließlich ist die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von allergenen Reaktionen aufgrund des Entfernens einer signifikanten Menge an Samenproteinen geringer. Diese Eigenschaften ermöglichen die Verwendung der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung bei der Formulierung einer Reihe von häuslichen und industriellen Emulsionen.
Die obigen Beobachtungen wurden gemacht bei der Verwendung von gewaschenen und ungewaschenen Ölkörperchenzubereitungen, die aus Rapssamen erhalten wurden und die, wie in Beispiel 2 der vorliegenden Anmeldung ausführlich beschrieben, hergestellt wurden. Es wird angenommen, daß die Widerstandsfähigkeit gegenüber relativ rauhen chemischen und physikalischen Bedingungen unabhängig von der Quelle der Ölkörperchen ein Merkmal der Ölkörperchen, die in den gewaschenen Ölzubereitungen der vorliegenden Erfindung vorliegen, sein wird. Allerdings ist es wahrscheinlich, daß eine oder mehrere der zuvor aufgeführten Eigenschaften von Rapssamenölkörperchen in Abhängigkeit von den Zellen, aus denen die gewaschene Ölkörperchenzubereitung erhalten wird, variieren wird. Nichtsdestotrotz soll sich die vorliegende Erfindung eindeutig auf eine Ölkörperchenzubereitung beziehen, die aus einer beliebigen Zelle, die Ölkörperchen enthält, erhalten werden kann.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Ölkörperchen aus Pflanzensamen erhalten. Das Vorliegen von intakten Ölkörperchen in der Emulsion und die beschriebenen Merkmale dieser Ölkörperchen unterscheiden die vorliegende Emulsionsformulierung eindeutig von anderen Materialien, die aus Pflanzensamen erzeugt werden können.
QUELLEN UND HERSTELLUNG DER ÖLKÖRPERCHEN
Die vorliegende gewaschene Ölkörperchenzubereitung kann aus einer Zelle, die Ölkörperchen oder ölkörperchenähnliche Organellen enthält, erhalten werden. Diese umfassen tierische Zellen, Pflanzenzellen, Pilzzellen, Hefezellen (Leber, R. et al., 1994, Yeast 10: 1421–1428), Bakterienzellen (Pieper-Fürst et al., 1994, J. Bacterol. 176: 4328–4337) und Algenzellen (Rossler, P. G., 1988, J. Physiol. (London) 24: 394–400). Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die Ölkörperchen aus einer Pflanzenzelle erhalten, einschließlich Zellen aus Pollen, Sporen, Samen und vegetativen Pflanzenorganen, in denen Ölkörperchen oder ölkörperchenähnliche Organellen vorliegen (Huang, 1992, Ann. Rev. Plant Physiol. 43: 177–200). Noch bevorzugter wird die gewaschene Ölkörperchenzubereitung der vorliegenden Erfindung aus einem Pflanzensamen erhalten, und besonders bevorzugt aus der Gruppe von Pflanzenarten umfassend: Rapssamen (Brassica spp.), Sojabohne (Glycine max), Sonnenblume (Helianthus annuus), Ölpalme (Elaeis guineensis), Baumwollsamen (Gossypium spp.), Erdnuss (Arachis hypogaea), Kokosnuss (Cocos nucifers), Rizinus (Rizinus communis), Carthamus (Carthamus tinctorius), Senf (Brassica spp. und Sinapis alba), Koriander (Coriandrum sativum), Kürbis (Cucurbita maxima), Leinsamen/Lein (Linum usitatissimum), Brasilnuss (Bertholletia excelsa), Jojoba (Simmondsia chinenis) und Mais (Zea mays). Man zieht die Pflanzen an und läßt sie Samen bilden unter Anwendung von landwirtschaftlichen Kulturpraktiken, die einem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Nach dem Ernten der Samen und, falls gewünscht, nach dem Entfernen von Material, wie z. B. Steine oder Samenschalen (Schälen), indem man z. B. siebt oder spült, und wahlweise dem Trocknen der Samen, werden die Samen anschließend durch mechanisches Drücken, Zerkleinern oder Zerstoßen weiterverarbeitet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird vor dem Zerkleinern der Samen eine flüssige Phase zugegeben. Dies ist als Naßmahlen bekannt. Vorzugsweise ist die Flüssigkeit Wasser, obwohl organische Lösungsmittel, wie z. B. Ethanol, auch verwendet werden können. Das Naßmahlen bei Ölextraktionsverfahren wurde für Samen aus einer Reihe von Pflanzenarten beschrieben, einschließlich: Senf (Aguilar et al., 1990, Journal of Texture studies 22: 59–84), Sojabohne ( US-Patent 3,971,856 ; Carter et al., 1974, J. Am. Oil Chem. Soc. 51: 137–141), Erdnuß ( US-Patent 4,025,658 ; US-Patent 4,362,759 ), Baumwollsamen (Lawhon et al., 1977, J. Am. Oil Chem. Soc. 63: 533–534) und Kokosnuß (Kumar et al., 1995, INFORM 6 (11): 1217–1240). Es kann auch vorteilhaft sein, die Samen über einen Zeitraum von etwa 15 Minuten bis etwa 2 Tagen vor dem Zerkleinern in einer flüssigen Phase zu imbibieren. Das Imbibieren kann die Zellwände aufweichen und den Zerkleinerungsprozeß erleichtern.
Das Imbibieren über längere Zeiträume kann den Keimungsprozeß vortäuschen und zu bestimm ten vorteilhaften Veränderungen der Zusammensetzung der Samenbestandteile führen. Bei einer anderen Ausführungsform wird die flüssige Phase zugegeben, nachdem die Samen zerkleinert wurden. Dies ist bekannt als Trockenmahlen. Vorzugsweise ist die zugegebene flüssige Phase Wasser.
Die Samen werden vorzugsweise unter Verwendung einer Kolloidmühle, wie z. B. die MZ130 (Fryma Inc.) zerkleinert. Neben Kolloidmühlen können auch andere Mahl- und Zerkleinerungsvorrichtungen, die in der Lage sind, Samenmengen im industriellen Maßstab zu verarbeiten, bei der hier beschriebenen Erfindung eingesetzt werden, einschließlich: Rohrwalzen, Tellermühlen, Kolloidmühlen, Stiftmühlen, Orbital-Mühlen, IKA-Mühlen und Homogenisatoren im industriellen Maßstab. Die Auswahl der Mühle kann von den Samendurchsatzerfordernissen abhängig sein sowie von der Quelle der Samen, die eingesetzt wird. Es ist von wesentlicher Bedeutung, daß die Samenölkörperchen während des Zerkleinerungsprozesses intakt bleiben. Daher sind jegliche Betriebsbedingungen, die bei der Ölsamenverarbeitung üblicherweise eingesetzt werden, welche dazu neigen, die Ölkörperchen zu verletzen, für die Anwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ungeeignet. Die Mahltemperaturen liegen vorzugsweise zwischen 10°C und 90°C und bevorzugter zwischen 26°C und 30°C, während der pH-Wert vorzugsweise zwischen 2,0 und 10 gehalten wird.
Feste Verunreinigungen, wie z. B. Samenschalen, Fasermaterial, ungelöste Kohlehydrate und Proteine und andere unlösliche Verunreinigungen werden aus der zerkleinerten Samenfraktion entfernt. Das Abtrennen der festen Verunreinigungen kann erreicht werden, indem man eine Dekantier-Zentrifuge, wie z. B. eine HASCO 200 2-Phasen-Dekantier-Zentrifuge oder eine NX310B (Alpha Laval) verwendet. In Abhängigkeit von den Samendurchsatzerfordernissen kann die Kapazität der Dekantier-Zentrifuge variiert werden, indem man andere Dekantier-Zentrifugenmodelle verwendet, wie z. B. 3-Phasen-Dekanter. Die Betriebsbedingungen variieren in Abhängigkeit von der bestimmten Zentrifuge, welche eingesetzt wird, und müssen so eingestellt werden, daß unlösliche Verunreinigungsmaterialien sedimentieren und beim Dekantieren sedimentiert bleiben. Eine teilweise Trennung der Ölkörperchenphase und der flüssigen Phase kann unter diesen Bedingungen beobachtet werden.
Im Anschluß an das Entfernen der unlöslichen Verunreinigungen wird die Ölkörperchen phase von der wäßrigen Phase abgetrennt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Rohrzentrifuge eingesetzt. Bei anderen Ausführungsformen können Hydrozyklone, Tellerzentrifugen oder das Absetzen von Phasen unter natürlicher Schwerkraft oder ein beliebiges anderes auf Schwerkraft beruhendes Trennverfahren eingesetzt werden. Ebenso ist es möglich, die Ölkörperchenfraktion von der wäßrigen Phase unter Einsatz von Größenausschlußverfahren, wie z. B. die Membran-Ultrafiltration und die Querstrom-Mikrofiltration, zu trennen. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Rohrzentrifuge ein Sharples-Modell AS-16 (Alpha Laval) oder eine AS-46 Sharples (Alpha Laval). Ein wesentlicher Parameter ist die Größe des Ring damms, der verwendet wird, um die Zentrifuge zu betreiben. Ringdämme sind entfernbare Ringe mit einer zentralen kreisförmigen Öffnung, die, im Falle von AS-16, von 28 bis 36 mm variiert, und sie regulieren die Trennung der wäßrigen Phase von der Ölkörperchenphase, wodurch die Reinheit der Ölkörperchenfraktion, welche erhalten wird, beeinflußt wird. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird eine Ringdammgröße von 29 oder 30 mm eingesetzt, wenn man die AS-16 verwendet. Die genaue eingesetzte Ringdammgröße hängt von der Samenölart, die verwendet wird, ab sowie von der gewünschten finalen Konsistenz der Ölkörperchenzubereitung. Die Effizienz der Trennung wird weiterhin beeinflußt durch die Flußrate. Wenn die AS-16 verwendet wird, sind die Flußraten typischerweise zwischen 750–1000 ml/min (Ringdammgröße 29) oder zwischen 400–600 ml/min (Ringdammgröße 30), und die Temperaturen werden vorzugsweise zwischen 26°C und 30°C gehalten. In Abhängigkeit von dem eingesetzten Zentrifugenmodell müssen die Flußraten und die Ringdammgrößen so eingestellt werden, daß eine optimale Trennung der Ölkörperchenfraktion von der wäßrigen Phase erreicht wird. Diese Einstellungen sind für einen Fachmann offensichtlich.
Die Trennung von Feststoffen und die Trennung der wäßrigen Phase von der Ölkörperchenfraktion kann auch gleichzeitig durchgeführt werden, indem man eine auf Schwerkraft basierende Trennmethode, wie z. B. die 3-Phasen-Röhrenzentrifuge, oder einen Dekanter oder einen Hydrozyklon oder eine auf Größenausschluß basierende Trennmethode verwendet.
Die Zusammensetzungen, die auf dieser Stufe des Verfahrens erhalten werden, sind im allgemeinen relativ grob und umfassen eine Reihe von Samenproteinen, welche glykosylierte und nicht-glykosylierte Proteine und andere Verunreinigungen, wie z. B. Stärke oder Glukosinolate oder Abbauprodukte davon umfassen. Die vorliegende Erfindung umfaßt das Entfernen von signifikanten Mengen an Samenverunreinigungen. Um das Entfernen von verunreinigendem Samenmaterial zu erreichen, wird die Ölkörperchenzubereitung, die bei der Abtrennung aus der wäßrigen Phase erhalten wird, wenigstens einmal gewaschen, indem man die Ölkörperchenfraktion resuspendiert und die resuspendierte Fraktion zentrifugiert. Dieses Verfahren ergibt das, was für Zwecke dieser Anmeldung als eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung bezeichnet wird. Die Anzahl der Waschgänge wird im allgemeinen abhängen von der gewünschten Reinheit der Ölkörperchenfraktion. In Abhängigkeit von den Waschbedingungen, die eingesetzt werden, kann eine im wesentlichen reine Ölkörperchenzubereitung erhalten werden. Bei einer solchen Zubereitung wären die einzigen Proteine, die anwesend sind, die Ölkörperchenproteine. Um die Ölkörperchenfraktion zu waschen, können Röhrenzentrifugen oder andere Zentrifugen, wie z. B. Hydrozyklone oder Teilerzentrifugen, eingesetzt werden. Das Waschen der Ölkörperchen kann durchgeführt werden, indem man Wasser, Puffersysteme, z. B. Natriumchlorid in Konzentrationen zwischen 0,01 M und wenigstens 2 M, 0,1 M Natriumcarbonat mit hohem pH-Wert (11–12), Puffer mit wenig Salz, wie z. B. 50 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, organische Lösungsmittel, Detergenzien oder eine beliebige andere flüssige Phase verwendet. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden die Waschgänge durchgeführt bei einem hohen pH-Wert (11–12). Die flüssi ge Phase, die für das Waschen verwendet wird, sowie die Waschbedingungen, wie z. B. der pH-Wert und die Temperatur, können in Abhängigkeit von der Samenart, die verwendet wird, variiert werden. Das Waschen bei einer Reihe von verschiedenen pH-Werten zwischen pH 2 und pH 11–12 kann vorteilhaft sein, da dies ermöglicht, daß man stufenweise Verunreinigungen, insbesondere Proteine, entfernt. Die Waschbedingungen werden so ausgewählt, daß die Waschstufen zum Entfernen von signifikanten Mengen an Verunreinigungen führen, ohne die strukturelle Integrität der Ölkörperchen zu beeinträchtigen. Bei Ausführungsformen, bei denen mehr als eine Waschstufe ausgeführt wird, können die Waschbedingungen für die verschiedenen Waschstufen variieren. Die SDS-Gelektrophorese oder andere analytische Verfahren können einfach verwendet werden, um das Entfernen von Samenproteinen oder anderen Verunreinigungen durch das Waschen der Ölkörperchen zu kontrollieren. Es ist nicht erforderlich, zwischen den Waschstufen die wäßrige Phase vollständig zu entfernen, und die fertige gewaschene Ölkörperchenzubereitung kann in Wasser, einem Puffersystem, z. B. 50 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, oder einer beliebigen anderen flüssigen Phase suspendiert werden, und wenn dies so gewünscht ist, kann der pH-Wert auf einen beliebigen pH-Wert zwischen pH 2 und pH 10 eingestellt werden.
Das Verfahren zur Herstellung der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung kann durchgeführt werden mit chargenweisem Betrieb oder in einem Verfahren mit kontinuierlichem Durchfluß. Insbesondere dann, wenn Röhrenzentrifugen verwendet werden, erzeugt ein System von Pumpen, die zwischen den Stufen (a) und (b), (b) und (c) und (c) und (d) arbeiten, einen kontinuierlichen Fluß über das verarbeitende System. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Pumpen luftbetriebene Doppelmembranpumpen vom Typ M2 Wilden mit 1 Inch. Bei anderen Ausführungsformen können Pumpen, wie z. B. hydraulische oder peristaltische Pumpen, eingesetzt werden. Um einen Nachschub mit homogener Konsistenz für die Dekanterzentrifuge und für die Röhrenzentrifuge aufrecht zu erhalten, können Homogenisatoren, wie z. B. ein IKA-Homogenisator, zwischen den Trennstufen eingefügt werden. Zwischen verschiedenen Zentrifugen oder auch auf Größenausschluß basierenden Trennvorrichtungen, die eingesetzt werden, um die Ölkörperchenzubereitungen zu waschen, können auch In-Line-Homogenisatoren eingefügt werden. Die Ringdammgrößen, Pufferzusammensetzungen, die Temperatur und der pH-Wert können bei jeder Waschstufe von der Ringdammgröße, die in der ersten Trennstufe eingesetzt wird, verschieden sein.
Bei Ausführungsformen der Erfindung, bei denen Ölkörperchen aus weicheren Geweben isoliert werden, z. B. aus dem Mesocarpgewebe von Oliven, können die Techniken, die eingesetzt werden, um die Zellen aufzubrechen, von denjenigen, die eingesetzt werden, um härtere Samen aufzubrechen, in gewisser Weise abweichen. Zum Beispiel können auf Druck basierende Techniken gegenüber zerstoßenden Techniken bevorzugt sein. Die Methodik der Isolierung von Ölkörperchen in einem kleinen Maßstab wurde berichtet für die Isolierung von Ölkörperchen aus den Mesocarpgeweben der Olive (Olea europea) und der Avocado (Persea mericana) (Ross et al., Plant Science, 1993, 93: 203–210) und aus Rapssamenembryonen, die aus dem Mikrospur abgeleitet wurden (Brassica napus) (Holbrook et al., Plant Physiol., 1991, 97: 1051–1058).
Bei Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die Ölkörperchen aus nichtpflanzlichen Zellen erhalten werden, wird die gewaschene Ölkörperchenzubereitung nach ähnlichen Verfahren, wie sie oben beschrieben wurden, isoliert. Die Methodik des Isolierens von Ölkörperchen aus Hefe wurde dokumentiert (Ting et al., 1997, Journal Biol. Chem. 272: 3699–3706).
Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Ölfraktion können auf wenigstens zwei Weisen variiert werden. Erstens enthalten verschiedene Pflanzenarten Ölkörperchen mit verschiedenen Ölzusammensetzungen. Zum Beispiel ist die Koskosnuß reich an Laurinölen (C₁₂), wohingegen Erucasäureöle (C₂₂) in manchen Brassica spp. häufig vorkommen. Zweitens können die relativen Mengen von Ölen innerhalb einer bestimmten Pflanzenart beeinflußt werden, indem der Fachmann bekannte Züchtungs- und Gentechnikverfahren anwendet. Diese beiden Verfahren zielen auf die Veränderung der relativen Aktivitäten von Enzymen, die die Stoffwechselwege kontrollieren, die bei der Ölsynthese beteiligt sind. Durch die Anwendung dieser Verfahren können Samen mit einer raffinierten Zusammenstellung verschiedener Öle erhalten werden. Zum Beispiel haben Bemühungen im Hinblick auf das Anziehen zu der Entwicklung von Rapssamen mit einem geringen Erucasäuregehalt (Canola) geführt (Bestur, T. H., 1994, Dev. Genet. 15: 458), und durch gentechnische Verfahren wurden Pflanzenlinien mit Ölen mit Veränderungen in der Position und Anzahl von Doppelbindungen, mit einer Variation der Fettsäurekettenlänge und mit der Einführung von gewünschten funktionellen Gruppen erzeugt (Töpfer et al., 1995, Science, 268: 681–685). Durch die Anwendung ähnlicher Ansätze ist ein Fachmann in der Lage, die gegenwärtig verfügbaren Quellen von Ölkörperchen weiter auszudehnen. Verschiedene Ölzusammensetzungen werden zu verschiedenen physikalischen und chemischen Eigenschaften der Ölkörperchen führen. Daher kann durch die Auswahl von Ölsamen oder Gemischen davon unter verschiedenen Arten oder Pflanzenlinien als eine Quelle für Ölkörperchen ein breites Repertoire an Emulsionen mit verschiedenen Texturen und Viskosiäten erreicht werden.
FORMULIEREN DER EMULSION
Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung kann in eine Emulsion formuliert werden, indem man auf dem Gebiet bekannte Verfahren anwendet. Vorzugsweise wird wenigstens ein zusätzlicher Bestandteil zu der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung zugegeben. Der zusätzliche Bestandteil kann als eine Lösung, Suspension, ein Gel oder ein Feststoff zugegeben werden, und die Mengen des zusätzlichen Bestandteils werden von der Formulierung abhängen. Der zusätzliche Bestandteil kann bei der Formulierung mit den Ölkörperchen assoziieren, in der Lösung suspendiert verbleiben oder eine Suspension ausbilden, in der die Ölkörperchen dispergiert sind. Der Bestandteil kann auch die Phospholipidmonoschicht, die die Ölkörperchen umgibt, oder die Triacylglyceridmatrix penetrieren. Bestandteile, die die Ölkörperchen penetrieren können, schließen Öle, Wachse und den Farbstoff Nilrot ein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der zusätzliche Bestandteil eine flüssige Phase. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die flüssige Phase Wasser. Wasser kann entweder direkt zugegeben werden oder durch mit einem anderen Bestandteil assoziierte Feuchtigkeit. Die endgültige Menge an Wasser ist nicht wesentlich, solange sich beim Mischen der Bestandteile eine stabile Emulsion ausbildet. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen wenigstens 1% Wasser und bis zu 99% Wasser enthalten. Üblicherweise wird das Vermischen erforderlich sein, um eine geeignete Emulsion zu erhalten, und es kann notwendig sein, Wärme oder Druck anzuwenden.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der zusätzliche Bestandteil ein Öl oder ein Wachs. Öle oder Wachse können sich in der Triacylglyceridmatrix der Ölkörperchen verteilen, und auf diese Weise können lipidlösliche Bestandteile, wie z. B. lipidlösliche Vitamine, der Ölkörperchenmatrix zugeführt werden. Wenn Öle oder Wachse den zugegebenen Bestandteil umfassen, können die Ölkörperchen in der lipophilen Phase suspendiert bleiben, oder es können sich Doppelemulsionen ausbilden.
Die fertigen Zusammensetzungen können in fester oder in flüssiger Form vorliegen oder in Form von jeder beliebigen anderen gewünschten Viskosität. Die Emulsion kann eingedickt werden, indem man Gelierungsmittel, wie z. B. Cellulose und Derivate, Carbopol und Derivate, Johannisbrotsubstanz, Carragenan und Derivate, Xanthangummi, Scleranegummi, langkettige Alkanolamide und Benton und Derivate verwendet, wobei diese typischerweise in Konzentrationen von weniger als 2%, bezogen auf das Gewicht, vorliegen.
Die Emulsion kann weiterhin oberflächenaktive Substanzen umfassen, um ein ausgewähltes Material zu befeuchten, zu schäumen, zu penetrieren, zu emulgieren, zu solubilisieren und/oder zu dispergieren. Zum Beispiel können anionische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Natrium-Kokosnuß-Monoglyceridsulfonat, kationische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Lauryltrimethylammoniumchlorid, Cetylpyridiniumchlorid und Trimethylammoniumbromid, nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, einschließlich Pluronics, und Polyethylenoxidkondensate von Alkylphenolen, und Zwitter-ionische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Derivate von aliphatischen quaternären Ammonium-, Phosphonium- und Sulfunionverbindungen, alle je nach Bedarf zugegeben werden.
Chelatbildende Mittel, die in der Lage sind, Metallionen zu binden, wie z. B. Weinsäure, EDTA, Zitronensäure, Alkalimetallcitrate, Pyrrophosphatsalze oder anionische polymere Polycarboxylate, können ebenfalls in die Emulsionsformulierung je nach Bedarf eingeschlossen werden.
Im allgemeinen werden die Emulsionsformulierungen so behandelt werden, daß die Kontamination durch Bakterien, Pilze, Mykoplasmen, Viren und dergleichen oder ungewünschte chemische Reaktionen, wie z. B. oxidative Reaktionen, vermieden werden. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird dies erreicht durch den Zusatz von Konservierungsmitteln, z. B. Natriummetabisulfit, oder anderen chemischen Additiven oder durch Bestrahlung, z. B. mit ionisierender Bestrahlung, wie z. B. Kobalt-60- oder Cäsium-137-Bestrahlung oder durch ultraviolette Bestrahlung.
Zudem können zu der gewaschenen Ölkörperzubereitung aktive Stoffe zugesetzt werden. Zum Beispiel können kosmetische Zusammensetzungen als stabile Suspensionen formuliert werden, indem die vorliegende Emulsionsformulierung und Vitamine und feuchtigkeitsspendende Mittel in den Hautcremes eingeschlossen werden können. Ein besonders vorteilhafter Weg, über den ein aktiver Bestandteil in Emulsionen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden kann, ist über die Konstruktion von Oleosingenfusionen, wie beschrieben in WO 96/21029 . Kurz wiedergegeben offenbart WO 96/21029 ein Verfahren zum Erzeugen von Proteinen und Peptiden als Fusionsproteine von Oleosinen. Diese Fusionsproteine werden durch genetische Verknüpfungen des Gens, das Oleosin codiert, mit einem Gen, das ein interessierendes Peptid oder Protein codiert, erzeugt. Die Expression des Fusionsgens in beispielsweise einer Ölsamenpflanze führt zur Synthese eines Fusionsproteins, welches dann zu dem Ölkörperchen geführt wird. Die Isolierung der Ölkörperchenfraktion führt zu einer Gewinnung des Fusionsproteins. Grundsätzlich kann jedes gewünschte Protein oder Peptid nach diesem Verfahren erzeugt werden. Beispielsweise wird ins Auge gefaßt, daß Antigefrierpeptide aus Fischen aus der Polarregion als Oleosinfusionsproteine erzeugt werden (Davies, P. L. et al., 1990, FASER J. 4: 2460–2468). Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung kann dann eingesetzt werden, um Eiscremes, Milchshakes oder andere gefrorene Materialien mit Nahrungsmittelqualität mit verbesserten Gefriereigenschaften herzustellen, indem man die Eiskristallbildung hemmt oder vermindert. Bei einem anderen Beispiel kann ein therapeutisches Protein als eine Oleosinfusion hergestellt werden. Die Ölkörperchen können dann verwendet werden, um eine gewünschte Suspension zu formulieren, die für den oralen Verzehr oder für die topische Anwendung auf der Haut bestimmt ist. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird noch weiter beispielhaft ausgeführt in Beispiel 11 der vorliegenden Erfindung, indem ein Fischfutter hergestellt wird, welches Ölkörperchen umfaßt, die eine Oleosin-Karpfen-Wachstumshormon-Fusion umfassen.
Eine Emulsion mit filmbildenden Eigenschaften kann ebenso formuliert werden. Eine solche Emulsion bildet, wenn sie auf eine Oberfläche aufgebracht und getrocknet wird, eine Beschichtung. Ein Beispiel einer Emulsion, bei der ein beschichteter Ölkörperchenfilm zur Anwendung kommt, ist ein Fischfutter, bei dem die Ölkörperchen auf das Fischfutter aufgebracht werden können, um den Nährwert zu erhöhen. Eine filmbildende Emulsion ist insbesondere nützlich bei Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen eine kontrollierte Freisetzung eines aktiven Bestandteils gewünscht ist, wie z. B. bei der Zuführung von pharmazeutischen Mitteln oder flüchtigen Stoffen, wie z. B. Duftstoffen. Die Freisetzungszeit des aktiven Mittels aus einem Film einer Emulsion, die während des Trocknens auftritt, hängt unter anderen Faktoren von der Dicke des Films ab. Wenn eine dickere Beschichtung angewendet wird, wird eine längere Trocknungszeit zu einer langsameren Freisetzung des aktiven Mittels führen. Bei verschiedenen in Betracht gezogenen Formulierungen tritt die Freisetzung des Mittels lediglich auf, wenn der Film trocken ist. Andere Faktoren, wie z. B. die Zusammensetzung der Emulsion und die Art und die Konzentration des aktiven Bestandteils bestimmen ebenso die Charakteristika der Freisetzung.
Zum Beispiel können Co-Lösungsmittel, wie z. B. Ethanol, in die Formulierung eingeschlossen werden und beeinflussen die Freisetzungszeit. Die Freisetzung eines aktiven Bestandteils ist auch bei Nahrungsmittelanwendungen wünschenswert, wenn ein in einer Emulsion eingeschlossener Duftstoff während der Konsumierung freigesetzt wird. Die Freisetzung eines Duftstoffes kann in Abhängigkeit von der genauen Formulierung der Emulsion einen plötzlichen, intensiven Sinneseindruck auslösen oder ein eher subtiles Gemisch von Aromen und Essenzen.
Die Emulsionsformulierung kann auch in Sprays und Aerosolen verwendet werden. Vorzugsweise werden für diese Zwecke Ölkörperchen kleiner Größe, z. B. 1 µm oder weniger Durchmesser, wie z. B. diejenigen, die in B. napus zu finden sind, verwendet. In diesen Sprays können flüchtige Stoffe, wie z. B. Alkohole und Duftstoffe, eingeschlossen sein. Emulsionen dieses Typs können auch auf die Oberflächen von getrockneten Nahrungsmittelzubereitungen, wie z. B. Kartoffelchips und Trockensuppe, gesprüht werden. Die Emulsion könnte einen Duftstoff einschließen und eine konservierende Wirkung verleihen oder bei der Aufrechterhaltung der angemessenen Feuchtigkeitsniveaus des Nahrungsmittels helfen.
VERWENDUNGEN DER EMULSIONSFORMULIERUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf die Erzeugung von Emulsion gerichtet, die bei industriellen und häuslichen Zusammensetzungen nützlich sind. Es wird darauf hingewiesen, daß die Emulsionen in Zusammensetzungen eingesetzt werden können, die in ihren physikalischen Eigenschaften und in ihrer Verwendung breit variieren können. Daher schließen spezifische Ausführungsformen solche Anwendungen ein, wie Nahrungsmittel und Futtermittel, pharmazeutische Produkte, Körperpflegeprodukte und industrielle Produkte.
Die Nahrungs- und Futtermittelverwendungen schließen Nicht-Milch-Austauschprodukte, wie z. B. Nicht-Milch-Käse oder Joghurt, -Margarinen, -Mayonnaisen, -Vinaigrette, -Vereisungen, -Eiscremes, -Salatdressings, synthetischen Senf, Süßigkeiten, Kaugummi, Pudding, Backwaren, Würzmittel, Safttrübungsmittel, ein Babyrezept, Geschmacksträger, Strukturierungsmittel (verkürzend), Haustierfutter, Fischfutter und Viehfutter ein. Die Körperpflegeproduktanwendungen umfassen Seifen, Kosmetika, Hautcremes, Gesichtscremes, Zahnpasta, Lippenstift, Parfüme, Make-up, Grundierung, Rouge, Mascara, Lidschatten, Sonnenschutzlotionen, Haarconditioner und Haarfärbemittel. Die pharmazeutischen Produkte, die unter Verwendung der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung der vorliegenden Erfindung formuliert werden können, umfassen therapeutische Mittel, diagnostische Mittel und Zuführungsmittel. Als ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel wird die Emulsion zusätzlich einen aktiven Bestandteil enthalten. Der aktive Bestandteil kann jeder beliebige sein, den man einem Wirt zuführen möchte. Bei einer Ausführungsform kann der aktive Bestandteil ein Protein oder Peptid sein, welches einen therapeutischen oder diagnostischen Wert aufweist. Solche Peptide umfassen Antigene (für Impfformulierungen), Antikörper, Cytokine, Blutgerinnungsfaktoren und Wachstumshormone. Die industriellen Anwendungen für die Emulsionen der vorliegenden Erfindung umfassen Farben, Beschichtungen, Schmiermittel, Filme, Gele, Bohrflüssigkeiten, Papierleimungen, Latex, Bau- oder Straßenbauma terial, Tinten, Farbstoffe, Wachse, Poliermittel und agrochemische Formulierungen. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die vorliegende Erfindung ausgerichtet auf Zusammensetzungen, die von Tieren oder Menschen ingestiert werden können. Da diese Zusammensetzungen ingestiert werden können, müssen sie Nahrungsmittelqualität aufweisen. Das bestimmte Produkt und die bestimmte Form, in der die Emulsion angewendet wird, ist allerdings nicht von wesentlicher Bedeutung und kann so, wie es gewünscht ist, sein. Es ist klar, daß die mit der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung formulierte Emulsion in jedem beliebigen häuslichen oder industriellen Produkt angewendet werden kann.
Die Stabilität der vorliegenden Emulsionsformulierung bei niedrigem pH-Wert kann für Formulierungen von sauren Emulsionen ausgenutzt werden. Zum Beispiel kann die Emulsionsformulierung bei der Herstellung eines mayonnaiseähnlichen Nahrungsmittels verwendet werden, welches neben der gewaschenen Olkorperchenzubereitung je nach Bedarf ein Pflanzenöl, Senf, Essig und Eidotter umfaßt. Gießfähige Emulsionen, wie z. B. Salatdressings, können hergestellt werden, indem man die relative Menge an Essig erhöht und/oder durch die Zugabe von Wasser.
Ein Beispiel einer Anwendung, bei der Wärme zum Einsatz kommen kann, ohne daß offensichtlich nachteilige Effekte auftreten, ist bei der Herstellung einer pikanten Soße, wie z. B. einer Béchamel-Soße, oder bei süßen Soßen, wie z. B. Schokoladen-Soßen. Bei diesen Anwendungen wird die gewaschene Ölkörperchenzubereitung als ein Trockenzusatz eingesetzt. Um eine Béchamel-Soße herzustellen, werden zu 1 Teil der erwärmten gewaschenen Ölkörperchenzubereitung 1 Teil (m/m) Mehl zugegeben, und es wird gerührt, bis sich eine dicke Suspension ausbildet. Bei moderater Wärme wird stufenweise Milch zugegeben, bis eine Soße mit der gewünschten Viskosität erhalten wird.
Die Emulsionsformulierung kann auch als ein Butterersatz verwendet werden. Bei dieser Anwendung werden kleine Mengen an Wasser zu der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung zugegeben, z. B. weniger als 10%, bis die gewünschte Viskosität erhalten wird. Je nach Bedarf können natürliche Buttergeschmacksstoffe und Verdickungsmittel zugegeben werden. Der Butterersatz kann auf Mais, Brot, in Kuchenmischungen oder beim Brotmachen verwendet werden. Es kann Salz, welches zum Geschmack beiträgt und welches als ein Konservierungsmittel wirkt, zugegeben werden, typischerweise bis zu einem Gehalt von etwa 2,5% (m/V). Farbstoffe, wie z. B. Extrakte von Annatto-Samen oder Karotin können zugegeben werden, um je nach Bedarf die Farbe zu intensivieren. Ein Vorteil dieser Anwendung ist, daß die Butter auf Ölkörperchenbasis keine hydrogenierten Fettsäuren umfaßt, wie sie bei den Formulierungen von Margarinen und dergleichen verwendet werden, um eine gewünschte Konsistenz zu erreichen, die jedoch auch mit kardiovaskulären Störungen assoziiert sind.
Shortening (beispielsweise Back-, Brat- und Ziehfett) kann bis zu verschiedenen Steifheitsgraden erzeugt werden, d. h. von einem Schaum bis zu einem gießbaren Shortening. Bei dieser Anwendung wird Luft in die Emulsionsformulierung eingerührt, und die Emulsionsformulierung kann als in der kontinuierlichen Phase, Luft, dispergiert betrachtet werden. Shortenings können bei Gemischen angewendet werden, bei denen eine Cremebildung und eine Auflockerung gewünscht sind. Diese Gemische umfassen Vereisungen, synthetische Cremes, Eiscremes und Backteig.
Eine Fruchtsaftnachahmung kann aus künstlichen und natürlichen Geschmacksstoffen und Nährstoffen erzeugt werden. Solche Fruchtsaftimitationen haben keine korrekte Erscheinung und scheinen infolge ihrer Transparenz dünn oder verdünnt. Indem eine kleine Menge, z. B. 0,1 bis 1% (V/V) der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung oder einer Emulsion davon zugegeben wird, kann eine Eintrübung auftreten, die dem Saft eine reichhaltige Erscheinung verleiht. Demzufolge kann die vorliegende Ölkörperchenzubereitung als ein Eintrübungsmittel verwendet werden.
Bei einer anderen Anwendung, die Fruchtsäfte einschließt, kann die gewaschene Ölkörperchenzubereitung oder eine Emulsion davon zu Fruchtsäften mit sedimentierfähigen Feststoffen, wie z. B. Tomatensaft, zugegeben werden. Das Zugeben einer kleinen Menge der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung, z. B. 0,1 bis 1% (V/V) kann die Sedimentationsrate der Feststoffe in dem Saft verringern und dabei helfen, die reichhaltige Erscheinung aufrechtzuerhalten.
Es wenden auch topische Anwendungen der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung der vorliegenden Erfindung ins Auge gefaßt. Bei dieser Ausführungsform wird die Emulsion als eine dermatologisch verträgliche Emulsion formuliert, die beispielsweise eingesetzt werden kann, um die Gesichts- und/oder die Körperhaut mit Feuchtigkeit zu versorgen, einschließlich die Nägel und die Lippen, oder sie kann Eigenschaften aufweisen, die die Alterung der Haut, Akne, Pigmentierung, Haarverlust bekämpfen oder das Entfernen von Haaren fördern oder die Wundheilung und/oder die Restrukturierung des Hautgewebes erleichtern. Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung repräsentiert vorzugsweise 1–99 Gew.% der fertigen Zusammensetzung.
Die kosmetischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zusätzlich Kohlenwasserstoffverbindungen, wie z. B. pflanzliche, tierische, mineralische oder synthetische Öle oder Wachse oder Gemische davon enthalten. Diese umfassen Paraffin, Petrolatum, Perhydrosqualen, Araraöl, Mandelöl, Calophyllumöl, Avocadoöl, Sesamöl, Rizinusöl, Jojobaöl, Olivenöl oder Getreidesamenöl. Es können Ester eingeschlossen sein, wie z. B. Ester von Lanolinsäure, Ölsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Myristinsäure. Es ist auch möglich, Alkohole einzuschließen, z. B. Oleoylalkohol, Linoleylalkohol oder Linolenylalkohol, Isostearylalkohol oder Octyldodecanol, Alkohol oder Polyalkohol. Weitere Kohlenwasserstoffe, die eingeschlossen sein können, sind Octanoate, Decanoate, Rizinoleate, Capryl/Caprin-Triglyceride oder C₁₀- bis C₂₂-Fettsäuretriglyceride. Die Zugabe dieser Mittel kann zu der Ausbildung von Doppelemulsionen führen.
Hydrogenierte Öle, welche bei 25°C fest sind, wie z. B. hydrogeniertes Rizinusöl, Palmöl oder Kokosnußöl, oder hydrogenierter Talk, Mono-, Di-, Tri- oder Sucroglyceride, Lanoline und Fettsäuren, die bei 25°C fest sind, können in den kosmetischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung ebenso eingeschlossen sein. Unter den Wachsen, die eingeschlossen sein können, sind tierische Wachse, wie z. B. Bienenwachs, Pflanzenwachse, wie z. B. Camaubawachs, Can delillawachs, Ouricurywachs, Japanwachs oder Wachse aus Korkfasern oder Zuckerrohr. Mineralwachse, z. B. Paraffinwachs, Montanwachs, mikrokristalline Wachse oder Ozokerite und synthetische Wachse.
Es können Pigmente eingeschlossen sein, und diese können weiß oder farbig, anorganisch oder organisch und/oder mit Perlglanz sein. Diese Pigmente umfassen Titandioxid, Zinkoxid, Zirkoniumdioxid, schwarze, gelbe, rote und braune Eisenoxide, Ceriumdioxid, Chromoxid, Eisenblau, Kohleschwarz, Barium, Strontium, Calcium und Aluminiumlacke und Glimmer beschichtet mit Titanoxid oder mit Bismuthoxid.
In kosmetische und/oder dermatologische Zusammensetzungen können aktive Bestandteile, die üblicherweise in Hautcremes eingesetzt werden, eingeschlossen sein, wie z. B. Vitamine, z. B. Vitamin A oder C, und Alphahydroxysäuren, wie z. B. Zitronen-, Glykol-, Milch- und Weinsäure. Beispielsweise lehrt das US-Patent 5,602,183 , daß Vitamin C oder Ascorbinsäure das Wachstum von Bindegewebe fördert, insbesondere in der Haut, was die Haut gegenüber äußeren Belastungen, wie z. B. durch Rauch und UV-Strahlung stärkt. Die Feuchtigkeitsmittel, die beispielsweise in Hautcremes und Kosmetika eingeschlossen sein können, sind Mineralöl und Hamstoff. Es können auch Antioxidantien, wie z. B. die natürlich vorkommenden Tocopherole und Polyphenole oder butyliertes Hydroxytoluen und Hydroxyanisol zugegeben werden. Sonnenschutzmittel, wie Z. B. Octylmethoxycinnamat (Parsol MCX), 3-Benzophenol (Uvinul M40) und Butylmethoxydibenzoylmethan (Parsol 1789) können eingesetzt werden, um eine Lotion für das Bräunen in der Sonne herzustellen. Die pharmazeutisch aktiven Mittel, die verwendet werden können, um kosmetische Zusammensetzungen zu formulieren, umfassen z. B. Antibiotika, Fungizide und antiinflammatorische Mittel.
Das kosmetische Endprodukt kann in der Form eines freien, eines geschütteten oder eines verdichteten Pulvers (Grundierung, Rouge oder Lidschatten), eines relativ schmierigen Produkts, wie z. B. Lippenstift, Mascara oder einem Öl oder einer Lotion für den Körper oder das Gesicht, vorliegen.
Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung kann auch verwendet werden, um als ein oral verträglicher Träger in Zahnpasta zu dienen, welche weiterhin Siliziumdioxide, oberflächenaktive Mittel, chelatbildende Mittel, ein Fluorid, Verdicker, Süßstoffe, Geschmacksstoffe, z. B. als Pfefferminzöl, Enzyme und Biozide umfassen kann.
Ein Beispiel eines industriellen Produkts, welches formuliert werden kann, ist eine Farbe, wobei das Hauptharz, wie z. B. diejenigen, die auf silikonartigen Verbindungen, Acrylverbindungen, Polyester, Alkyd, Fluor, Epoxy, Polyurethan basieren, teilweise oder vollständig durch die gewaschene Ölkörperchenzubereitung der vorliegenden Erfindung ausgetauscht werden kann. Weitere Additive, wie z. B. Pigmente, Farbstoffe, Glasplättchen und Aluminiumplättchen, Pigmentdispergiermittel, Verdicker, Nivellierungsmittel, Härtungskatalysatoren, Härtungsmittel, wie z. B. Diisocyanate, Härtungskatalysatoren, Gelierungsinhibitoren, ultraviolett-absorbierende Mittel, freie Radikale abfangende Mittel, etc. können je nach Bedarf in Farbzusammensetzungen formuliert werden.
Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung kann auch zum Formulieren von Schmiermit teln dienen. Zum Beispiel kann die gewaschene Ölkörperchenzubereitung verwendet werden, um teilweise oder vollständig die Schmieröle zu ersetzen, wie z. B. tierische Öle, pflanzliche Öle, schmierende Petroleumöle, synthetische Schmieröle, oder das Schmierfett, wie z. B. Lithiumfett, Harnstofffett und Kalziumfett. Die anderen Zusammensetzungen, die in Schmiermittelformulierungen eingesetzt werden können, umfassen Antioxidanzien, Detergensdispergiermittel, Mittel für die Öligkeit, Reibungsmodifikatoren, Viskositätsindexverbesserer, fließpunkterniedrigende Mittel, schmierendes Feststoffmaterial, Rosthemmstoffe und Antischaummittel.
Unter Verwendung der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung der vorliegenden Erfin dung können auch Wachse hergestellt werden. Diese umfassen Wachse vom Reinigungstyp, wie z. B. diejenigen, die einen stabilen hydrophoben Filmabschluß auf Automobilen bereitstellen, und andere schützende Beschichtungen. Die anderen Zusammensetzungen, die bei der Herstellung eines Wachses verwendet werden, umfassen oberflächenaktive Mittel, Mineralöle, wie z. B. gemischte paraffinische und aromatische/naphthenische Öle, Geruchsstoffe, Biozide, Färbemittel, welche je nach Bedarf in miteinander vereinbaren Mengen zugegeben werden können.
In den Fällen, in denen industrielle Produkte, wie z. B. Farben oder Schmiermittel formuliert werden, kann die Reinheit der Ölkörperchenphase weniger wesentlich sein, und es muß nicht unbedingt erforderlich sein, die Ölkörperchen einem Waschgang zu unterziehen. Eine industrielle Emulsion kann hergestellt werden, indem man (i) Ölkörperchen aus einer Zelle erhält und (ii) die Ölkörperchen in eine industrielle Emulsion formuliert. Die Ölkörperchen können erhalten werden, indem man (a) Pflanzensamen zerkleinert, (b) Feststoffe von den zerkleinerten Samen entfernt und (c) die Ölkörperchenphase von der wäßrigen Phase abtrennt. Die Erfindung umfaßt auch eine industrielle Emulsion, die Ölkörperchen umfaßt, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden.
Die folgenden nicht beschränkenden Beispiele sind beispielhaft für die vorliegende Erfin dung:
BEISPIELE
Beispiel 1
Erhalten einer gewaschenen Ölkörperchenzubereitung aus den Ölsamen von Raps, Sojabohne, Sonnenblume, weißem Senf, Erdnuß, Kürbis, Lein, Carthamus und Mais-Labormaßstab.
Trockene reife Samen, die erhalten wurden aus Brassica napus cv Westar, Sojabohne, Sonnenblume, weißem Senf, Erdnuß, Kürbis, Lein, Carthamus und Mais wurden in fünf Volumen von kaltem Zerkleinerungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,4 M Suchrose und 0,5 M NaCl) homogenisiert unter Anwendung eines bei hoher Geschwindigkeit arbeitenden Polytron. Das Homogenisat wurde bei 10 × g für 30 Minuten zentrifugiert, um partikulierte Substanz zu entfer nen und um die Ölkörperchen von der wäßrigen Phase, welche die Masse des löslichen Samenproteins enthält, abzutrennen. Die Ölkörperchenfraktion wurde von der Oberfläche des Überstandes mit einem Metallspatel abgeschöpft und zu einem Volumen des Zerkleinerungspuffers zugegeben. Um in den nachfolgenden Stufen ein effizientes Waschen zu erreichen, hat es sich als erforderlich herausgestellt, die Ölkörperchen in dem Zerkleinerungspuffer sorgfältig zu redispergieren. Dies wurde erreicht, indem die Ölkörperchen in dem Zerkleinerungspuffer unter Anwendung eines Polytron bei niedriger Geschwindigkeit vorsichtig homogenisiert wurden. Unter Anwendung einer Spritze wurden die redispergierten Ölkörperchen vorsichtig unter 5 Volumina von kaltem 50 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5 untergeschichtet und wie oben zentrifugiert. Im Anschluß an die Zentrifugation wurden die Ölkörperchen entfernt, und die Waschprozedur wurde zweimal wiederholt. Die fertige gewaschene Ölkörperchenzubereitung wurde in einem Volumen von kaltem Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5 resuspendiert und mit dem Polytron redispergiert.
Die Ölkörperchenproben wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und dann mit SDS- Gelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Das auf diese Weise erhaltene Material war dann bereit, um in verschiedenen Formulierungen eingesetzt zu werden.
Beispiel 2
Erhalten einer gewaschenen Ölkörperchenzubereitung aus Ölsamen von Raps, Sonnenblume und Mais in einem großen Maßstab.
Dieses Beispiel beschreibt die Gewinnung der Ölkörperchenfraktion aus Canola-, Sonnenblumen- und Maissamen in einem großen Maßstab. Die resultierende Zubereitung enthält intakte Ölkörperchen und ist in der Reinheit vergleichbar mit einer Zubereitung, die erreicht wird, indem man die Verfahren im Labormaßstab anwendet.
Zerkleinern der Samen.
Insgesamt 10–15 kg von trockenem Samen von Canola (Brassica napus cv Westar), Sonnenblume (Helianthus annuus) oder Mais (Zea mays) wurden durch den Einfülltrichter einer Kolloidmühle (Colloid Mill, MZ-130 (Fryma); Kapazität: 500 kg/Std.) eingefüllt, wobei die Mühle ausgestattet war mit einem kreuzweise gezähnten Rotor/Stator-Zerkleinerungsset vom Typ MZ-120 und einem von oben zu befüllenden Einfülltrichter. Ungefähr 50–75 l Wasser wurden über einen extern verbundenen Schlauch vor dem Mahlen zugeführt. Der Betrieb der Mühle erfolgte unter Einstellung des Zwischenraums auf 1R, was gewählt wurde, um eine Partikelgröße von weniger als 100 µm bei 18°C und 30°C zu erreichen. Im Anschluß an die Zerkleinerung der Samen wurde zu dem Samenbrei Leitungswasser bis zu einem Volumen von 90 Litern zugefügt.
Entfernung von Feststoffen.
Der resultierende Brei wurde in eine Dekanterzentrifuge (Hasco 200 2-Phasen-Dekanterzentrifuge mit einer maximalen Betriebsgeschwindigkeit von 6.000 UpM) gepumpt, nachdem man die Zentrifuge auf eine Betriebsgeschwindigkeit von 3.500 UpM gebracht hatte. Die Überführung von der Mühle in die Dekanterzentrifuge bei einer Flußrate von 360 l/Std. wurde erreicht, indem man eine luftbetriebene Doppelmembranpumpe vom Typ M2 Wilden mit 1 Inch verwendete. In 15–20 Minuten wurden ungefähr 15 kg Samen dekantiert.
Abtrennung der Ölkörperchen.
Die Abtrennung der Ölkörperchenfraktion wurde erreicht, indem man eine Sharples-Röhrenzentrifuge, Modell AS-16 (Alpha Laval) verwendete, die ausgestattet war mit einer 3-Phasen-trennenden Schale und austauschbaren Ringdamm-Serien; Kapazität: 150 l/Std.; Ringdamm: 30 mm. Die Betriebsgeschwindigkeit betrug 15.000 UpM (13.200 × g). Eine peristaltische Pumpe vom Typ Watson-Marlow (Modell 704) wurde verwendet, um die dekantierte flüssige Phase (DL) in die Röhrenzentrifuge zu pumpen, nachdem die Zentrifuge auf Betriebsgeschwindigkeit gebracht worden war. Dies führt zu einer Trennung der dekantierten flüssigen Phase in eine schwere Phase (HP), die Wasser und lösliche Samenproteine enthält, und eine leichte Phase (LP), die die Ölkörperchen enthält. Die Ölkörperchenfraktion, die nach einem Durchlauf durch die Zentrifuge erhalten wurde, wird als eine nicht gewaschene Ölkörperchenzubereitung bezeichnet. Die Ölkörperchenfraktion wurde dann drei weitere Male durch die Zentrifuge geführt. Zwischen jedem Durchgang durch die Zentrifuge wurden die konzentrierten Ölkörperchen mit ungefähr 5 Volumina an frischem Wasser vermischt. Das gesamte Verfahren wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die im Anschluß an die zweite Abtrennung erhaltenen Zubereitungen werden alle als die gewaschene Ölkörperchenzubereitung bezeichnet. Nach drei Waschgängen war viel von dem kontaminierenden löslichen Protein entfernt, und die Ölkörperchenproteinprofile, die bei SDS-Gelelektrophorese erhalten wurden, waren in ihrer Erscheinung ähnlich zu denjenigen, die erhalten wurden, wenn man die Verfahren im Labormaßstab anwandte.
Beispiel 3
Entfernung der Samenproteine durch Waschen der Ölkörperchenphase.
Dieses Beispiel beschreibt die Gewinnung. einer gewaschenen Ölkörperchenfraktion aus Canola-, Mais- und Sonnenblumensamen. Unter Anwendung verschiedener Waschbedingungen wird gezeigt, daß die Waschgänge zu dem Entfernen von signifikanten Mengen von Samenproteinen aus der Ölkörperchenzubereitung führen. Diese Proteine umfassen Proteine, die allergen sein könnten.
Insgesamt 10–15 kg von trockenem Samen von Canola (Brassica napus cv Westar), Sonnenblume (Helianthus annuus) oder Mais (Zea mays) wurden durch den Einfülltrichter einer Kolloidmühle (Colloid Mill, MZ-130 (Fryma)) eingefüllt, wobei die Mühle ausgestattet war mit einem kreuzweise gezähnten Rotor/Stator-Zerkleinerungsset vom Typ MZ-120 und einem von oben zu befüllenden Einfülltrichter. Ungefähr 50–75 l Wasser wurden über einen extern verbundenen Schlauch vor dem Mahlen zugeführt. Der Betrieb der Mühle erfolgte unter Einstellung des Zwischenraums auf 1R, was gewählt wurde, um eine Partikelgröße von weniger als 100 µm bei 18°C und 30°C zu erreichen. Im Anschluß an die Zerkleinerung der Samen wurde zu dem Samenbrei Leitungswasser bis zu einem Endvolumen von 60–90 Litern zugefügt, und eine Probe des Samenbreis wurde genommen für die SDS-Gelelektrophorese. Der resultierende Brei wurde dann in eine Dekanterzentrifuge (Hasco 200 2-Phasen-Dekanterzentrifuge mit einer maximalen Betriebs geschwindigkeit von 6.000 UpM) gepumpt, nachdem man die Zentrifuge auf eine Betriebsgeschwindigkeit von 3.500 UpM gebracht hatte. Die Überführung von der Mühle in die Dekanterzentrifuge bei einer Flußrate von 360 l/Std. wurde erreicht, indem man eine luftbetriebene Doppelmembranpumpe vom Typ M2 Wilden mit 1 Inch verwendete. In 15–20 Minuten wurden ungefähr 15 kg Samen dekantiert. Eine Probe der dekantierten flüssigen Phase wurde genommen für die SDS-Gelelektrophorese. Die Abtrennung der Ölkörperchenfraktion wurde erreicht, indem man eine Sharples-Röhrenzentrifuge, Modell AS-16 (Alpha Laval) verwendete, die ausgestattet war mit einer 3-Phasen-trennenden Schale und austauschbaren Ringdamm-Serien; Kapazität: 150 l/Std.; Ringdamm: 29 mm. Die Betriebsgeschwindigkeit betrug 15.000 UpM (13.200 × g). Eine peristaltische Pumpe vom Typ Watson-Marlow (Modell 704) wurde verwendet, um die dekantierte flüssige Phase (DL) in die Röhrenzentrifuge zu pumpen, nachdem die Zentrifuge auf Betriebsgeschwindigkeit gebracht worden war. Die ungewaschene Ölkörperchenphase wurde entnommen und mit ungefähr 5 Volumina an Wasser gemischt. Dieses Verfahren wurden insgesamt dreimal wiederholt. Die Ölkörperchenphase, die nach dem ersten Rotieren gewonnen worden war, wird als eine ungewaschene Ölkörperchenzubereitung bezeichnet. Alle anderen Zubereitungen sind gewaschene Ölkörperchenzubereitungen. Die Proben für die Analyse für die SDS-Gelelektrophorese wurden im Anschluss an die erste und die vierte Trennung genommen.
Nach Abschluß des vierten Waschgangs wurde eine Probe mit 0,9 ml der Ölkörperchenzubereitung in 0,1 ml 1 M Na₂CO₃ homogenisiert und bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter Rühren gehalten. Die gewaschene Ölkörperchenfraktion wurde dann im Anschluss an die Zentrifugation gewonnen, einmal mit Wasser gewaschen und für die SDS-Gelelektrophorese aufbereitet.
Alle Proben wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und die Proben wurden durch SDS-Gelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
Beispiel 4
Der Effekt des Waschens der Ölkörperchenphase auf die Wasserretentionseigen schaften.
Eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung und eine ungewaschene Ölkörperchenphase wurden aus Rapssamen, wie in Beispiel 2, hergestellt. Um den Unterschied in der Wasserretentionskapazität zwischen der ungewaschenen Ölkörperchenphase und der gewaschenen Ölkörperchenphase zu bestimmen, wurden 30 ml der Ölkörperchenzubereitungen unter Verwendung eines Vortex gründlich gemischt. Die Zubereitungen wurden dann für zwei Stunden in einem Wasserbad bei 40, 60 oder 80°C inkubiert, und die Proben wurden bei 1.500 × g für 20 Minuten (unverdünnte Proben) zentrifugiert. Ein weiteres Probenset wurden hergestellt, indem man 15 g der gewaschenen oder ungewaschenen Ölkörperchenzubereitung mit 15 ml Wasser mischte. Die Proben wurden auf einem Vortex gemischt und dann bei 40, 60 oder 80°C für zwei Stunden inkubiert, und die Menge an Wasser, die in den Proben vorlag, wurde im Anschluß an die Zentrifugation bei 1.500 × g für 20 Minuten (verdünnte Proben) bestimmt. Der Massenverlust, der der Verdampfung zugeschrieben werden konnte, wurde bei 80°C gemessen.
Bei 80°C verloren die unverdünnten Zubereitungen, die Ölkörperchen enthielten, signifikante Mengen an Wasser durch Verdampfung. Die Zubereitung der ungewaschenen Ölkörperchen verlor 26% ihrer Masse, während die gewaschene Zubereitung 16% verlor. Beim Zentrifugieren setzte die ungewaschene Zubereitung ungefähr 2,5 ml wäßrige Phase frei, während die gewaschenen Ölkörperchen in der gleichen Phase verblieben. Beide verdünnten Zubereitungen absorbierten Wasser. Das Volumen der Ölkörperchen erhöhte sich in beiden Fällen auf 18,5 ± 1 ml.
Bei 60°C verloren die unverdünnten Zubereitungen ungefähr 10% des Wassers durch Verdampfung. Im Anschluß an die Zentrifugation setzte die gewaschene Zubereitung etwa 0,5 ml wäßrige Phase frei, während die gewaschene Ölkörperchenzubereitung in der gleichen Phase verblieb. Beide verdünnten Zubereitungen absorbierten Wasser. Bei 60°C erhöhte sich das Volumen der Ölkörperchen in beiden Fällen auf 18 ± 1 ml.
Bei 40°C setzten die unverdünnten Proben ungefähr 2 ml wäßrige Phase frei. Wenn man die verdünnten Proben verglich, absorbierte die ungewaschene Zubereitung etwa 3 ml Wasser, wie dies auch der Fall bei 60 oder 80°C war. Allerdings absorbierte die gewaschene Zubereitung bei 40°C 8 ml an Wasser.
Diese Versuche zeigen, daß bei einer gewaschenen Ölkörperchenzubereitung, die auf 60°C oder 80°C erwärmt wird, Wasser stärker mit der Ölkörperchenzubereitung assoziiert bleibt als bei einer ungewaschenen Zubereitung. Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung schien, wenn sie heruntergekühlt wurde, stabiler zu sein als die ungewaschene Emulsion. Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung war, wenn sie auf 40°C erwärmt wurde, in der Lage, ein größeres Volumen an exogen zugegebenem Wasser zu absorbieren, ohne daß dies zu einer Phasentrennung führte.
Beispiel 5
Der Effekt des Waschens der Ölkörperchen auf die Ölabsorptionseigenschaften.
Eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung und eine ungewaschene Ölkörperchenphase wurden aus Rapssamen, wie in Beispiel 2, hergestellt. Um den Unterschied in der Ölabsorptionskapazität zwischen der ungewaschenen Ölkörperchenphase und der gewaschenen Ölkörperchenzubereitung zu bestimmen, wurden 2 g der Ölkörperchenzubereitungen in 12 ml raffiniertem, gebleichtem, desodoriertem Canolaöl in einem 50 ml Probenröhrchen dispergiert. Der Inhalt wurde über 30 Minuten alle fünf Minuten für 30 Sekunden gerührt. Die Röhrchen wurden dann bei 4.400 UpM über 25 Min. zentrifugiert. Das freie Öl wurde dekantiert, und der Prozentsatz des absorbierten Öls wurde anhand der Gewichtsdifferenz bestimmt. Die Zubereitung der gewaschenen Ölkörperchen wurde untersucht, und die drei Zubereitungen von ungewaschenen Ölkörperchen wurden untersucht.
Für die Ölabsorptionskapazität der ungewaschenen Ölkörperchen wurde herausgefunden, daß sie zwischen den drei Chargen signifikant variierten und daß sie zwischen 18,7% und 28% variierten. Die gewaschenen Ölkörperchen wiesen eine reproduzierbare Ölabsorption von 32 ± 1% auf. Demzufolge erwies sich die gewaschene Ölkörperchenzubereitung als überlegen, da (1) es sich gezeigt hat, daß eine größere Menge an Öl absorbiert wurde, und (2) die Absorption in einer besser reproduzierbaren Weise erfolgte.
Beispiel 6
Herstellung einer mayonnaiseartigen Emulsion umfassend eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung.
Eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung wurde aus Rapssamen, wie in Beispiel 2, hergestellt, und eine mayonnaiseähnliche Emulsion wurde produziert, indem man die folgenden Komponenten unter Verwendung eines elektrischen Haushaltsmischgeräts vermischte.

Sonnenblumenöl 78 g

Eidotter 8 g

Essig 9 g

Salz 0,5 g

gewaschene Ölkörperchen 5 g
Es wurde ein Produkt mit einer mayonnaiseartigen Textur erhalten. Das mayonnaiseartige Produkt war über wenigstens einen Tag bei 4°C stabil.
Beispiel 7 Herstellung einer cholesterinfreien mayonnaiseartigen Emulsion. Eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung wurde aus Rapssamen, wie im Beispiel 2, hergestellt, und es wurde eine mayonnaiseartige Emulsion erzeugt, indem man die folgenden Bestandteile vermischte:

Sonnenblumenöl 200 g

gewaschene Ölkörperchen 100 g

Essig 30 ml
Es wurde ein Produkt mit einer mayonnaiseartigen Textur erhalten. Da die Mayonnaise ohne Eidotter, einem Bestandteil, der üblicherweise in im Handel erhältlichen Mayonnaisen eingesetzt wird, hergestellt ist, ist das unter Verwendung der gewaschenen Ölkörperchen erzeugte Produkt frei von Cholesterol. Die Mayonnaise erwies sich als gleich stabil wie eine kommerzielle Mayonnaise, wenn man die Stabilität unter Anwendung von Zentrifugation bestimmte.
Beispiel 8
Herstellung einer vinaigretteähnlichen Emulsion, die eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung umfasst.
Eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung wurde hergestellt aus Rapssamen, wie in Beispiel 2, und es wurde eine vinaigretteähnliche Emulsion erzeugt, indem man die folgenden Komponenten von Hand vermischte.

Sonnenblumenöl 17,5 g

Senf 0,4 g

Essig 0,5 g

gewaschene Ölkörperchen 7,7 g
Es wurde ein Produkt mit vinaigretteähnlicher Textur erhalten. Das vinaigretteähnliche Produkt war über wenigstens mehrere Tage bei 4°C stabil.
Beispiel 9 Herstellung eines verstreichbaren senfähnlichen Produkts. Eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung wurde erhalten aus Rapssamen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die folgenden Bestandteile wurden vermischt, um ein senfähnliches Produkt zu erhalten.

Senf 70 g

gewaschene Ölkörperchen 30 g
Die resultierende Emulsionsformulierung ist ein senfähnliches Produkt, welches leicht verstrichen werden kann und welches cremigere, weniger körnige Geschmackseigenschaften als Senf aufweist.
Beispiel 10
Herstellung einer béchamelartigen Soße.
Es wurde eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung aus Rapssamen erhalten, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die gewaschene Ölkörperchenzubereitung wurde bei moderater Wärme erwärmt, und es wurde ein gleicher Teil Milch zugegeben und mit der erwärmten gewaschenen Ölkörperchenzubereitung vermischt. Während dem Rühren wurde von Hand stufenweise Milch zu diesem Gemisch zugegeben.

Mehl 50 g

gewaschene Ölkörperchen 50 g

Milch 100 ml–1 l
Eine béchamelartige Soße wurde erhalten. Die Konsistenz der Soße kann in Abhängigkeit von der Menge an Milch, welche zugegeben wird, so sein, wie es gewünscht ist. Je nach Bedarf können auch zusätzliche Geschmacksstoffe zugegeben werden. Die Abwesenheit von hydrogenierten Fettsäuren in diesem Produkt verleiht diesem einen Vorteil gegenüber einer Soße, die aus im Haushalt üblicher Margarine hergestellt wird.
Beispiel 11
Herstellung einer pharmazeutischen Emulsion für das Aufschichten auf ein Fisch futter.
Eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung aus einer transgenen B. napus-Pflanze, die das Karpfen-Wachstumshormon (cGH) fusioniert mit Oleosin exprimiert, wobei das Fusionsprotein zu den Ölkörperchen geführt wurde, wurde wie folgt erhalten. Ein DNA-Fragment, enthaltend die cGH-kodierende Region, die deren Aminosäuresignalsequenz 22 nicht aufweist, wurde aus einem Plasmid, welches auf einem Insert eine übliche Karpfen-(Cyprinus carpio)Wachstumshormon-cDNA enthält (Koren et al., 1989, Gene 67: 309–315), unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion in Verbindung mit zwei cGH-spezifischen Primern amplifziert. Das amplifizierte cGH-Fragment wurde in den korrekten Leserahmen und 3' zu dem Arabidopsis thaliana-Oleosin unter Verwendung von pOThromb (van Rooijen, 1993, Doktorarbeit, Universität Calgary) als ein Elternplasmid und unter Einsatz von dem Fachmann bekannten Klonierungsstrategien fusioniert. In pOThromb wurde eine Thrombin-Spaltstelle 3' zu der Oleosin-kodierenden Sequenz eingebaut. Das Oleosin-cGH-Fusionsgen wurde in den binären Vektor pCGN1559 (McBride und Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol. 14: 269–276) eingebracht, und das resultierende Konstrukt wurde verwendet, um A. tumefaciens zu transformieren. Der Agrobacterium-Stamm wurde eingesetzt, um B. napus cv-Westar-Setzlinge zu transformieren. Aus den transgenen Pflanzen wurden Samen erhalten, und die Ölkörperchen wurden aus den transgenen Samen, wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert.
Die Ölkörperchen wurden anschließend in eine Spritze aufgenommen und auf Fischfutter gesprüht, wobei man ungefähr 2,5 μg Ölkörperchenprotein pro 1 mg Fischfutter verwendete. Das mit den Ölkörperchen beschichtete Fischfutter wurde dann über Nacht zum Trocknen liegen gelassen. Insgesamt 50 mg Fischfutter wurden dann mit 10 ml Wasser vermischt und für 0, 30, 45 oder 60 Minuten inkubiert. Das Futter wurde dann gesammelt und in 0,2 ml 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) resuspendiert und für die Analyse durch SDS-Gelelektrophorese durch Kochen in 2,5% SDS vorbereitet. Die Gegenwart der Ölkörperchen auf dem Fischfutter wurde untersucht, indem man einen Western Blot durchführte und monoklonale Antikörper gegen cGH einsetzte.
Auf der Grundlage der Intensität des Signals der einzelnen Bande, die in jeder Spur des Western Blots beobachtet wurde, urteilend, verblieben die Ölkörperchen, die cGH umfaßten, mit dem Fischfutter während der Inkubation der Ölkörperchen in Wasser assoziiert. Für Fischfutter, welches für 30, 45 oder 60 Minuten in Wasser inkubiert wurde, wurde gezeigt, daß es ungefähr die gleichen Mengen an cGH enthält wie das Kontrollfischfutter, welches nicht in Wasser inkubiert wurde.
Dieses Beispiel zeigt, daß eine transgene Pflanzenvarietät erzeugt werden kann, die einer Emulsion spezifische gewünschte Eigenschaften verleiht. Dieses Beispiel zeigt weiterhin, daß aus einer gewaschenen Ölkörperchenzubereitung eine Emulsion erzeugt werden kann, die als eine Beschichtung oder ein Film verwendet werden kann. Letztlich zeigt dieses Beispiel, daß die gewaschene Ölkörperchenzubereitung eingesetzt werden kann, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu formulieren.
Obwohl bestimmte bevorzugte Ausführungsformen zum Zwecke der Erläuterung der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, sind die Anwendungen, die für den Fachmann offensichtlich sind, vom Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Emulsionsformulierung, bei dem man: (1) Ölkörperchen aus einer Zelle gewinnt, (2) die Ölkörperchen wäscht, um eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung zu erhalten, die intakte Ölkörperchen von etwa einheitlicher Größe, Form und Dichte umfaßt, wobei die gewaschene Ölkörperchenzubereitung weniger als 10% andere Samenproteine enthält, (3) die gewaschene Ölkörperchenzubereitung in eine Emulsionsformulierung formuliert, und (4) die Emulsionsformulierung so behandelt, daß die Kontamination durch Bakterien, Pilze, Mykoplasmen, Viren und dergleichen oder ungewünschte chemische Reaktionen vermieden werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Pflanzenzelle aus Sporen, Pollen, Samen oder einem vegetativen Pflanzenorgan gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Ölkörperchen aus Pflanzensamen gewonnen werden.
Verfahren zur Herstellung einer Emulsionsformulierung, bei dem man: (1) Ölkörperchen aus Pflanzensamen nach einem Verfahren gewinnt, bei dem man: (a) die Pflanzensamen zerkleinert, (b) Feststoffe von den zerkleinerten Samen entfernt, und (c) die Ölkörperchenphase von der wäßrigen Phase trennt, (2) die Ölkörperchenphase wäscht, um eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung hervorzubringen, die intakte Ölkörperchen von etwa einheitlicher Größe, Form und Dichte umfaßt, wobei die gewaschene Ölkörperchenzubereitung weniger als 10% an anderen Samenproteinen enthält, (3) die gewaschene Ölkörperchenzubereitung in eine Emulsionsformulierung formuliert, und (4) die Emulsionsformulierung so behandelt, daß die Kontamination durch Bakterien, Pilze, Mykoplasmen, Viren und dergleichen oder ungewünschte chemische Reaktionen vermieden werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei vor oder nach der Zerkleinerungsstufe eine flüssige Phase zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Formulieren umfaßt, daß man die gewaschenen Ölkörperchen durchmischt, bis sich eine Emulsion ausbildet.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei zu den gewaschenen Ölkörperchen eine flüssige Phase zugegeben wird und die flüssige Phase und die gewaschenen Ölkörperchen gemischt werden, bis sich eine Emulsion ausbildet.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 8, wobei die flüssige Phase Wasser ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die flüssige Phase in der Emulsion in einer Menge, die von 1% bis etwa 99% V/V variiert, vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Pflanze eine Ölsamenpflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe von Pflanzen, bestehend aus Rapssamen (Brassica spp.), Sojabohne (Glycine max), Sonnenblume (Helianthus annuus), Ölpalme (Elaeis guineensis), Baumwollsamen (Gossypium spp.), Erdnuss (Arachis hypogaea), Kokosnuss (Cocos nucifera), Rizinus (Rizinus communis), Carthamus (Carthamus tinctorius), Senf (Brassica spp. und Sinapis alba), Koriander (Coriandrum sativum), Kürbis (Cucurbita maxima), Leinsamen/Lein (Linum usitatissimum), Brasilnuss (Bertholletia excelsa), Jojoba (Simmondsia chinenis) und Mais (Zea mays).
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Feststoffe durch Zentrifugation oder Filtration der zerkleinerten Samen entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Ölkörperchenphase von der wäßrigen Phase abgetrennt wird durch ein auf der Schwerkraft basierendes Verfahren oder ein Verfahren, das auf Größenausschluß basiert.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die gewaschene Ölkörperchenzubereitung im Wesentlichen frei von Nicht-Ölkörperchen-Samenproteinen, antinutritiven Verbindungen, Stärke, Glucosinolaten oder Abbauprodukten davon und Fasern ist.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Samenproteine glykosyliert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Formulieren die Zugabe eines Konservierungsmittels umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem die Emulsion ein Nahrungs- oder Futtermittel, ein Körperpflegeprodukt, ein pharmazeutisches Produkt oder ein industrielles Produkt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Samen vor dem Zerkleinern für oder von 15 Minuten bis 2 Tage in eine flüssige Phase eingetaucht werden.
Emulsion, umfassend eine gewaschene Ölkörperchenzubereitung, die intakte Ölkörperchen von etwa einheitlicher Größe, Form und Dichte umfaßt, wobei die gewaschene Ölkörperchenzubereitung weniger als 10% an anderen Samenproteinen enthält, und wobei die Emulsion weiterhin ein Konservierungsmittel umfaßt.
Emulsion nach Anspruch 20, welche des weiteren eine flüssige Phase umfaßt.
Emulsion nach Anspruch 21, wobei die flüssige Phase Wasser ist.
Emulsion nach Anspruch 20, wobei die Ölkörperchen aus einer Pflanze gewonnen werden.
Emulsion nach Anspruch 23, wobei die Ölkörperchen aus einer Pflanze gewonnen werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Rapssamen (Brassica spp.), Sojabohne (Glycine max), Sonnenblume (Helianthus annuus), Ölpalme (Elaeis guineensis), Baumwollsamen (Gossypium spp.), Erdnuss (Arachis hypogaea), Kokosnuss (Cocos nucifera), Rizinus (Ricinus communis), Carthamus (Carthamus tinctorius), Senf (Brassica spp. und Sinapis alba), Koriander (Coriandrum sativum), Kürbis (Cucurbita maxima), Leinsamen/Lein (Linum usitatissimum), Brasilnuss (Bertholletia excelsa), Jojoba (Simmondsia chinenis) und Mais (Zea mays).
Emulsion nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei die Emulsion ein Nahrungs- oder Futtermittel, ein Körperpflegeprodukt, ein pharmazeutisches Produkt oder ein industrielles Produkt ist.
Emulsion nach Anspruch 25, wobei das Nahrungs- oder Futtermittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Nicht-Milch-Austauschprodukt, einem Nicht-Milch-Käse, einem Nicht-Milch-Joghurt, einer Margarine, einer Mayonnaise, einer Vinaigrette, einer Vereisung, Eiscremes, einem Salatdressing, einem synthetischen Senf, einer Süßigkeit, Kaugummi, einem Pudding, einer Backware, einem Würzmittel, einem Saft, einem Baby-Rezept, einem Geschmacksträger, einem Strukturierungsmittel, Haustierfutter und Viehfutter.
Emulsion nach Anspruch 25, wobei das Nahrungs- oder Futtermittel eine Mayonnaise, eine cholesterinfreie Mayonnaise, eine Béchamel-Soße, eine Vinaigrette, ein Senf oder ein Fischfutter ist.
Emulsion nach Anspruch 25, wobei das Körperpflegeprodukt ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Seife, einem kosmetischen Produkt, einer Hautcreme, einer Gesichtscreme, einer Zahnpasta, einem Lippenstift, einem Parfüm, Make-up, einer Grundierung, einem Rouge, einem Mascara, einem Lidschatten, einer Sonnenschutzlotion und einem Haarpflegeprodukt.
Emulsion nach Anspruch 25, wobei das pharmazeutische Produkt ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem therapeutischen Mittel, einem diagnostischen Mittel und einem Zuführungsmittel.
Emulsion nach Anspruch 29, wobei das therapeutische Mittel ein Wachstumshormon umfaßt.
Emulsion nach Anspruch 25, wobei das industrielle Produkt ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Farbe, einer Beschichtung, einem Schmiermittel, einem Film, einem Gel, einer Bohrflüssigkeit, einer Papierleimung, einem Latex, einem Bau- oder Straßenbaumaterial, einer Tinte, einem Farbstoff, einem Wachs, einem Poliermittel und einer agrochemischen Formulierung.
Verwendung einer Emulsion nach einem der Ansprüche 20 bis 31 zur Herstellung eines Körperpflegeprodukts, eines Nahrungs- oder Futtermittels, eines industriellen Produkts oder eines pharmazeutischen Produkts.
Verwendung einer Emulsion nach Anspruch 32, wobei das Nahrungs- oder Futtermittel ein Nicht-Milch-Austauschprodukt, einen Nicht-Milch-Käse, einen Nicht-Milch-Joghurt, eine Margarine, eine Mayonnaise, eine Vinaigrette, eine Vereisung, Eiscremes, ein Salatdressing, einen synthetischen Senf, eine Süßigkeit, Kaugummi, einen Pudding, eine Backware, ein Würzmittel, einen Saft, ein Baby-Rezept, einen Geschmacksträger, ein Strukturierungsmittel, Haustierfutter und Viehfutter umfaßt.
Verwendung einer Emulsion nach Anspruch 32, wobei das Nahrungs- oder Futtermittel eine Mayonnaise, eine cholesterinfreie Mayonnaise, eine Béchamel-Soße, eine Vinaigrette, ein Senf oder ein Fischfutter ist.
Verwendung einer Emulsion nach Anspruch 32, wobei das Körperpflegeprodukt eine Seife, ein kosmetisches Produkt, eine Hautcreme, eine Gesichtscreme, eine Zahnpasta, einen Lippenstift, ein Parfüm, Make-up, eine Grundierung, ein Rouge, eine Mascara, einen Lidschatten, eine Sonnenschutzlotion und ein Haarpflegeprodukt umfaßt..
Verwendung einer Emulsion nach Anspruch 32, wobei das industrielle Produkt eine Farbe, eine Beschichtung, ein Schmiermittel, einen Film, ein Gel, eine Bohrflüssigkeit, eine Papierleimung, ein Latex, ein Bau- oder Straßenbaumaterial, eine Tinte, einen Farbstoff, ein Wachs, ein Poliermittel und eine agrochemische Formulierung umfaßt.
Verwendung einer Emulsion nach Anspruch 32, wobei das pharmazeutische Produkt ein therapeutisches Mittel, ein diagnostisches Mittel oder ein Zuführungsmittel ist.