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Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen
die Überwachung
der Anwesenheit und/oder Konzentration von Zielanalytika in einem
wässrigen
biologischen System. Die Erfindung betrifft insbesondere die Bestimmung
der Anwesenheit, beispielsweise Messung der Konzentration, von einem
oder mehreren Analyten in einer transdermal extrahierten Probe.
Eine wichtige Anwendung der Erfindung beinhaltet die Überwachung
der Blutglucose, unter Verwendung nichtinvasiver oder minimalinvasiver
Probenahmetechniken.
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HINTERGRUND
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Eine Reihe von Tests wird routinemäßig am Menschen
durchgeführt,
um die Menge oder Existenz von Substanzen zu bewerten, die in Blut
oder anderen Körperflüssigkeiten
vorhanden sind. Diese Tests basieren in der Regel auf physiologischen
Flüssigkeitsproben,
die einem Individuum entweder mittels einer Spritze oder Durchstechen
der Haut entnommen wurden. Ein spezieller Test beinhaltet die Selbstüberwachung
der Blutglucosegehalte durch Diabetiker.
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Diabetes ist ein schwerwiegenderes
medizinisches Problem, und die Behandlung der ernsteren Formen des
Zustands, Typ I (insulinabhängiger)
Diabetes, erfordert eine oder mehrere Insulininjektionen pro Tag. Insulin
regelt die Ausnutzung von Glucose oder Zucker im Blut und verhindert
Hyperglykämie,
die, falls sie nicht korrigiert wird, zu Ketose führen kann.
Unsachgemäße Verabreichung
der Insulintherapie kann andererseits zu hypoglykämischen
Zuständen
führen,
was Koma und Tod verursachen kann. Hyperglykämie bei Diabetikern korreliert
mit mehreren Langzeitwirkungen, wie Herzerkrankungen, Arteriosklerose,
Blindheit, Schlaganfall, Bluthochdruck und Nierenversagen.
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Der Wert der häufigen Überwachung der Blutglucose
als Mittel zur Vermeidung oder mindestens Minimierung der Komplikationen
von Typ I Diabetes wird durchaus anerkannt. Gemäß dem National Institute of Health
wird die Überwachung
der Glucose 4 bis 6 Mal pro Tag empfohlen. Patienten mit Typ II
(insulinunabhängigem)
Diabetes können
auch von der Blutglucoseüberwachung profitieren,
um ihren Zustand mittels Diät und
sportlicher Betätigung
im Griff zu behalten.
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Konventionelle Blutglucoseüberwachungsverfahren
erfordern im Allgemeinen das Ziehen einer Blutprobe (z. B. durch
Stechen in den Finger) für
jeden Test sowie eine Bestimmung des Glucosegehalts unter Verwendung
eines Instruments, das Glucosekonzentrationen mittels elektrochemischer
oder kolorimetrischer Verfahren abliest. Typ I Diabetiker müssen täglich mehrere
Blutglucosemessungen mittels Fingerstich bekommen, um eine engmaschige
glykämische
Kontrolle aufrechtzuerhalten. Der Schmerz und die Unbequemlichkeit,
die mit diese Blutprobennahme verbunden sind, zusammen mit der Furcht
vor Hypoglykämie
hat jedoch zu schlechter Compliance der Patienten geführt, obwohl
es deutliche Anzeichen dafür
gibt, dass engmaschige Kontrollen die Langzeitkomplikationen von
Diabetes dramatisch verringern. Diese Überlegungen können in
der Tat oft zur Vernachlässigung
des Überwachungsprozesses
seitens des Diabetikers führen.
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KURZFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung ist die
Verwendung eines inerten Materials zur Herstellung einer teilchenförmigen Zusammensetzung,
wobei die Teilchen eine Größe von 0,1
bis 250 μm
haben, zur Probenahme eines Analyten, der unter einer Zielhaut-
oder -schleimhautoberfläche
eines Individuums vorhanden ist, mittels eines Verfahrens, bei dem
- (a) die Teilchen aus inertem Material in die Zieloberfläche hinein
und/oder durch die Zieloberfläche
hindurch mit einer Geschwindigkeit von 100 bis 2500 m/s beschleunigt
werden, wobei die Beschleunigung der Teilchen in die Zieloberfläche hinein
oder über
die Zieloberfläche
hindurch wirksam ist, um den Durchgang einer Flüssigkeitsprobe von unterhalb
der Zieloberfläche
zu der Zieloberfläche
zu ermöglichen;
und
- (b) die Anwesenheit des Analyten in der Flüssigkeitsprobe ermittelt wird.
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Das Verfahren kann verwendet werden,
um beispielsweise qualitativ oder quantitativ die Anwesenheit eines
interessierenden Analyten in dem biologischen System zu bestimmen.
Das Verfahren kann auch verwendet werden, um die Menge oder Konzentration
des interessierenden Analyten zu bestimmen. Das Verfahren kann zudem
verwendet werden, um kontinuierlich oder fortwährend die Konzentration des
Analyten zu messen.
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Das Verfahren beinhaltet das Beschleunigen
von Teilchen in eine Zieloberfläche
hinein und/oder durch eine Zieloberfläche hindurch, so dass die Teilchen
eine Menge eines Analyten von unterhalb der Zieloberfläche passieren
lassen. Der Analyt kann dann mit einer Abfühlvorrichtung kontaktiert werden,
um daraus ein nachweisbares Rohsignal abzuleiten, wobei das Rohsignal
entweder die Anwesenheit des Analyten anzeigt oder mit der Konzentration
des Analyten verknüpft
ist. Gewünschtenfalls
kann der Analyt von der Zieloberfläche vor dem Kontakt mit der
Abfühlvorrichtung
aufgefangen werden.
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Die Probennahme wird so durchgeführt, dass
der interessierende Analyt transdermal von dem biologischen System
extrahiert wird. In dieser Hinsicht sollen sich die Begriffe "Transdermalextraktion" und "transdermal extrahiert" auf jedes nicht-invasive
oder mindestens minimalinvasive Verfahren zur Verwendung von Teilchenabgabetechniken
zur Erleichterung der Extraktion eines Analyten von unterhalb einer
Gewebeoberfläche,
durch Haut- oder Schleimhautgewebe hindurch zur nachfolgenden Analyse,
oder Auffangen von deren Oberfläche
und Analyse beziehen. Die Begriffe schließen ferner jede derartige Extraktion
ein, ob sie mit der Anwendung von Hauteindringungsverstärkern, Negativdruck
(Vakuum oder Saugkraft) oder anderer Extraktionstechnik gekoppelt
ist oder nicht.
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Analyt (im Allgemeinen innerhalb
eines Flüssigkeitsvolumens),
der aus dem biologischen System extrahiert wird, wird dann entweder
direkt mit einer Abfühlvorrichtung
kontaktiert, um ein Rohsignal zu erhalten, das die Anwesenheit und/oder
Konzentration des interessierenden Analyten anzeigt, oder aufgefangen
und danach mit der Abfühlvorrichtung
kontaktiert. Dieses Rohsignal kann unter Verwendung jeder geeigneten
Abfühlmethode
erhalten werden, einschließlich
beispielsweise Verfahren, die auf direktem Kontakt einer Abfühlvorrichtung
mit dem biologischen System basieren, Verfahren, die auf Kontakt
mit einer aufgefangenen Menge des extrahierten Analyten basieren,
und dergleichen. Die Probe kann in ein Auffangmittel hinein aufgefangen werden,
das mit der Zieloberfläche
kontaktiert wird, nachdem die Teilchen in die Oberfläche hinein
beschleunigt werden. Die Beschleunigungs- und Auffang stufen können im
Verlauf des Tages mindestens einmal wiederholt werden, um die kontinuierliche Überwachung
des Analyten bei einem Individuum zu liefern. Die mit jeder der
oben genannten Verfahren verwendete Abfühlvorrichtung kann jedes geeignete
Abfühlelement
verwenden, um das Rohsignal zu liefern, einschließlich, aber
nicht begrenzt auf physikalische, chemische, biochemische (z. B.
enzymatische, immunologische oder dergleichen), elektrochemische,
photochemische, spektrophotometrische, polarimetrische, kolorimetrische,
radiometrische oder ähnliche
Elemente. In bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung wird ein Biosensor verwendet, der ein elektrochemisches
Abfühlelement umfasst.
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Der Analyt kann jede spezifische
Substanz oder Komponente sein, die in einer chemischen, physikalischen,
enzymatischen oder optischen Analyse nachgewiesen und/oder gemessen
werden soll. Solche Analytika schließen Toxine, Verunreinigungen,
Aminosäuren,
Enzymsubstrat oder Produkte, die einen Krankheitszustand oder eine
krankhafte Bedingung anzeigen, andere Marker von Krankheitszuständen oder
krankhaften Bedingungen, Freizeit- und/oder Suchtdrogen, leistungssteigernde
Mittel, therapeutische und/oder pharmakologische Mittel, Elektrolyte,
physiologische interessierende Analytika (z. B. Calcium, Kalium,
Natrium, Chlorid, Bicarbonat (CO2), Glucose,
Harnstoff (Blutharnstoffstickstoff), Laktat und Hämoglobin),
Lipide und dergleichen ein, sind jedoch nicht auf diese begrenzt.
In bevorzugten Ausführungsformen
ist der Analyt ein physiologischer interessierender Analyt, beispielsweise
Glucose, oder eine Chemikalie mit einer physiologischen Wirkung,
beispielsweise eine Droge oder ein pharmakologisches Mittel. Wie
Durchschnittsfachleuten nach Lektüre der vorliegenden Beschreibung
klar werden wird, gibt es eine große Anzahl von Analytika, die
sich zur Probenahme unter Verwendung der vorliegenden Verfahren
eignen.
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Somit können Probenahmen von einem
in einem biologischen System vorhandenen Analyten erfolgen. Der
Analyt ist in der Regel unter einer Zielhautoder -schleimhautoberfläche eines
Individuums vorhanden. Probenahmeteilchen werden in eine Zieloberfläche hinein
und/oder durch eine Zieloberfläche
hindurch beschleunigt. Die Beschleunigung der Probenahmeteilchen
in die Zieloberfläche
hinein oder durch die Zieloberfläche
hindurch ist wirksam, um den Durchgang einer Menge des Analyten
(in der Regel einer Flüssigkeitsprobe,
die den Analyten umfasst) von unterhalb der Zieloberfläche an die Zieloberfläche zu ermöglichen.
Die Probe kann eine diagnostische Menge des Analyten enthalten.
Die Anwesenheit und/oder Menge oder Konzentration des Analyten,
der so extrahiert wird, wird dann durch direkten Kontakt mit einer
Abfühlvorrichtung
bestimmt, oder der Analyt wird von der Zieloberfläche aufgefangen
und dann mit einer Abfühlvorrichtung
kontaktiert. Wenn der Analyt Glucose ist und das Enzym Glucoseoxidase
ist, kann das nachweisbare Signal quantitativ sein und kann mit
dem Blutglucosegehalt eines Individuums korreliert werden. Wenn
der Analyt Ethanol ist und das Enzym eine Alkoholoxidase ist, kann
das nachweisbare Signal qualitativ sein und kann die Anwesenheit
oder Abwesenheit von Ethanol in einem Individuum anzeigen, oder
das nachweisbare Signal kann quantitativ sein und kann mit einem
Blutalkoholgehalt des Individuums korreliert werden.
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Ein Vorteil dieser Erfindung liegt
darin, dass die Probennahme leicht innerhalb und außerhalb
der Krankenhausumgebung und schmerzfrei durchgeführt werden kann.
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Diese und andere Aufgaben, Aspekte,
Ausführungsformen
und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind Fachleuten in Anbetracht
der vorliegenden Offenbarung leicht offensichtlich.
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BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 ist
ein Schemadiagramm der modifizierten Franz-Zelle, die in Beispiel
1 zur in vitro Glucosemessung verwendet wird.
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2 ist
eine Auftragung der Schwärzung
von Glucoselösung
in dem Donorfach und Glucose, die aus drei unterschiedlichen Häuten in
der in vitro Untersuchung von Beispiel 1 extrahiert wurde.
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3 bis 5 sind Glucosetoleranztestprofile
dreier individueller Versuchsteilnehmer aus der in vivo-Untersuchung
von Beispiel 2.
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6 ist
eine Auftragung der Schwärzung
gegen venösen
Glucosewert aus der Untersuchung aus Beispiel 2.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Bevor die vorliegende Erfindung detailliert
beschrieben wird, sei darauf hingewiesen, dass diese Erfindung nicht
durch speziell als Beispiel verwendete Analyten oder Verfahrensparameter
begrenzt ist, da diese selbstverständlich variieren können. Es
sei auch darauf hingewiesen, dass die hier verwendete Terminologie nur
zum Zwecke der Beschreibung spezieller Ausführungsformen der Erfindung
dient und nicht einschränkend sein
soll.
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Alle hier zitierten Veröffentlichungen,
Patente und Patentanmeldungen, ob vorhergehend oder nachfolgend,
sollen hier vollständig
zum Zweck der Bezugnahme zitiert werden.
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Es muss darauf hingewiesen werden,
dass bei Verwendung in dieser Beschreibung und den angefügten Ansprüchen die
Singularformen "ein", "eine", "eines" usw. sowie "der", "die", "das" den Plural einschließen, es
sei denn, dass der Kontext ausdrücklich
etwas anderes vorschreibt. Die Bezugnahme auf "ein Teilchen" schließt somit beispielsweise eine
Mischung aus zwei oder mehr derartigen Teilchen ein, die Bezugnahme
auf "einen Analyten" schließt Mischungen
von zwei oder mehr derartigen Analyten ein, und dergleichen.
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A. DEFINITIONEN
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Wenn nicht anderweitig definiert,
haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe die Bedeutung,
die der Durchschnittsfachmann, an den sich die Erfindung richtet,
ihnen üblicherweise
beimisst. Obwohl eine Reihe von Verfahren und Materialien, die den
hier beschriebenen ähnlich
oder äquivalent
sind, zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die bevorzugten
Materialien und Verfahren hier beschrieben.
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Bei der Beschreibung der vorliegenden
Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet und sollen wie
nachfolgend angegeben definiert sein.
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Der Begriff "Analyt" wird hier in seinem allgemeinsten Sinne
zur Bezeichnung von jeglicher spezifischen Substanz oder Komponente
verwendet, die in einer physikalischen, chemischen, biochemischen,
elektrochemischen, photochemischen, spektrophotometrischen, polarimetrischen,
kolorimetrischen oder radiometrischen Analyse nachgewiesen und/oder
gemessen wird. Aus derartigem Material kann entweder direkt oder indirekt
ein nachweisbares Signal erhalten werden. In bevorzugten Ausführungsformen
ist der Analyt ein physiologischer interessierender Analyt (z. B.
ein physiologisch aktives Material), beispielsweise Glucose, oder eine
Chemikalie, die eine physiologische Wirkung hat, beispielsweise
eine Droge oder ein pharmakologisches Mittel.
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Der Begriff "pharmakologisches Mittel" soll hier jede Verbindung
oder Stoffzusammensetzung bedeuten, die bei Verabreichung an einen
Organismus (Mensch oder Tier) durch lokale und/oder systemische
Wirkung einen erwünschten
pharmakologischen und/oder physiologischen Effekt herbeiführt.
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Der Begriff "Probenahme" bedeutet hier Extraktion einer Substanz
aus jedem biologischen System durch eine Membran hindurch, im Allgemeinen
durch Haut oder Gewebe hindurch. Die Membran kann natürlich oder
künstlich
sein und ist im Allgemeinen von tierischer Natur, wie natürliche oder
künstliche
Haut, Blutgefäßgewebe,
Intestinalgewebe und dergleichen. Ein "biologisches System" schließt somit sowohl lebende als auch
künstlich
aufrechterhaltene Systeme ein.
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Der Begriff "Auffangreservoir" wird verwendet, um jedes geeignete
Aufnahmemittel zu beschreiben, um eine aus einem Individuum unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
extrahierte Probe aufzunehmen. Geeignete Auffangreservoire schließen Polster,
Membranen, Tauchstäbchen,
Wattebäusche,
Röhrchen,
Ampullen, Küvetten,
Kapillarauffangvorrichtungen und miniaturisierte geätzte, abgetragene
oder geformte Durchflusswege ein.
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Der Begriff "Abfühlgerät" oder "Abfühlvorrichtung" umfasst jedes Gerät, das verwendet
werden kann, um die Konzentration eines interessierenden Analyten
zu messen. Bevorzugte Abfühlgeräte zum Nachweis von
Blutanalyten schließen
im Allgemeinen elektrochemische Geräte und chemische Geräte ein.
Beispiele für elektrochemische
Geräte
schließen
das Clark-Elektrodensystem (siehe z. B. Updike et al. (1967) Nature
214: 986 bis 988) und andere amperometrische, coulometrische oder
potentiometrische elektrochemische Geräte ein. Beispiele für chemische
Geräte
schließen
konventionelle Reaktionen auf Enzymbasis ein, wie sie in dem Lifescan® Glucosemonitor
verwendet werden (siehe z. B. US-A-4 935 346 von Phillips et al.). Nachweis und/oder
Quantifizierung eines chemischen Signals kann auch unter Verwendung
leicht erhältlicher
spektrophotometrischer Überwachungsgeräte durchgeführt werden.
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Der Begriff "Individuum" umfasst jedes warmblütige Tier,
insbesondere ist ein Mitglied der Klasse Mammalia eingeschlossen,
wie ohne Einschränkung
Menschen und nicht-menschliche Primaten, wie Schimpansen und andere
Menschenaffen und Affenspezies, Hoftiere wie Weidevieh, Schafe,
Schweine, Ziegen und Pferde; Haussäugetiere wie Hunde und Katzen;
Labortiere einschließlich
Nagetieren wie Mäusen,
Ratten und Meerschweinchen und dergleichen. Der Begriff bezeichnet
kein spezielles Alter oder Geschlecht. Somit sollen sowohl Erwachsene
als auch Neugeborene sowie Feten, ob männlich oder weiblich, abgedeckt
sein.
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B. ALLGEMEINE VERFAHREN
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Die Erfindung betrifft die Probenahme
von Analyten, die in einem biologischen System vorhanden sind, typischerweise
einem physiologisch aktiven Material, das sich unter einer Zielhaut-
oder schleimhautoberfläche
eines Individuums befindet. Es sind zwei allgemeine Stufen beteiligt,
eine Probenahmestufe und eine Bestimmungsstufe. Die Probenahmestufe
kann wie folgt allgemein beschrieben werden. Kleine Probenahmeteilchen
werden in eine Zieloberfläche
hinein und/oder durch eine Zieloberfläche hindurch beschleunigt.
Beschleunigung und Eindringung dieser Teilchen sind ausreichend,
um Durchgänge
zu erzeugen, durch die eine Menge eines interessierenden Analyten
fließen,
ausschwitzen oder anderweitig von unterhalb der Zieloberfläche zu der
Zieloberfläche
hindurchgelangen kann. Die Zieloberfläche hat im Allgemeinen eine
Gesamtgröße im Bereich
von etwa 0,1 bis etwa 5 cm2.
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Die Probenahmeteilchen umfassen in
der Regel ein inertes Material. Das Material kann auflösbar sein, wie üblicherweise
verwendete, physiologisch annehmbare, lösliche Materialien, einschließlich Zuckern
(z. B. Mannitol, Sucrose, Lactose, Trehalose und dergleichen) sowie
löslichen
oder auflösbaren
Polymeren. Alternativ können
die Probenahmeteilchen aus unlöslichen
Materialien zusammengesetzt sein, wie Stärke, TiO2,
Calciumcarbonat, Phosphat salzen, Hydroxyapatit oder sogar Polymeren
oder Metallen, wie Gold, Platin oder Wolfram. Unlösliche Materialien
werden mit dem normalen Erneuerungsprozess von Haut oder Schleimhaut abgestreift.
Bevorzugte Materialien sind Lactose, Milchsäure, Mannitol und Polyethylenglykol,
wie PEG 8000.
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Gewünschtenfalls können die
Probenahmeteilchen mit einem lokal aktiven Mittel beschichtet werden, das
die Probenahmestufe erleichtert. Die Probenahmeteilchen können beispielsweise
mit einem pharmakologischen Mittel beschichtet werden, wie einem
vasoaktiven Mittel oder einem entzündungshemmenden Mittel. Das
vasoaktive Mittel wird im Allgemeinen verwendet, um kurz wirkende
Vasoaktivität
zu liefern, um den Flüssigkeitszugriff
zu maximieren (die Analytprobe zu maximieren), während das entzündungshemmende
Mittel im Allgemeinen verwendet wird, um lokale entzündungshemmende
Wirkung zu liefern, um den Zielort zu schützen. Die Probenahmeteilchen
können
auch mit einem osmotisch aktiven Mittel beschichtet werden, um den Probenahmeprozess
zu erleichtern.
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Die Probenahmeteilchen können aus
einem nadellosen Spritzensystem abgegeben werden, wie jenen, die
in den in gemeinsamem Besitz befindlichen internationalen Veröffentlichungen
Nr. WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513 und WO 96/20022 beschrieben
sind. Die Abgabe von Probenahmeteilchen aus diesen nadellosen Spritzensystemen
wird im Allgemeinen mit Teilchen durchgeführt, die im Allgemeinen eine
ungefähre
Größe im Bereich
von 0,1 bis 250 μm,
vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis 70 μm aufweisen. Teilchen, die größer als
etwa 250 μm
sind, können
aus den Geräten
auch abgegeben werden, wobei die Obergrenze der Punkt ist, an dem
die Größe der Teilchen
ungünstige
Schmerzen und/oder Gewebeschäden
hervorrufen würde.
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Der eigentliche Abstand, bei dem
die abgegebenen Teilchen in eine Zieloberfläche eindringen, hängt ab von
der Teilchengröße (z. B.
dem nominellen Teilchendurchmesser unter Annahme einer ungefähr kugelförmigen Teilchengeometrie),
der Teilchendichte, der Anfangsgeschwindigkeit, mit der das Teilchen
auf die Oberfläche
auftrifft, und der Dichte und kinematischen Viskosität des angezielten
Hautgewebes. In dieser Hinsicht liegen optimale Teilchendichten
zur Verwendung bei der nadellosen Injektion im Allgemeinen im Bereich zwischen
etwa 0,1 und 25 g/cm3, vorzugsweise zwischen
etwa 0,9 und 1,5 g/cm3, und Injektionsgeschwindigkeiten
liegen im Allgemeinen im Bereich zwischen etwa 100 und 3000 m/s.
Mit geeignetem Gasdruck können Teilchen
mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10 bis. 70 μm leicht
mit Geschwindigkeiten, die sich den Überschallgeschwindigkeiten
eines treibenden Gasstroms nähern,
durch die Düse
beschleunigt werden. Der zur Beschleunigung der Teilchen verwendete
Druck liegt vorzugsweise unter 30 bar, vorzugsweise unter 25 bar
und am meisten bevorzugt 20 bar oder weniger.
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Alternativ kann das Probenahmeteilchen
aus einem teilchenvermittelten Abgabegerät abgegeben werden, wie einem
sogenannten Gerät
vom "Genpistolen"-Typ, das Teilchen
unter Verwendung einer Gas- oder elektrischen Entladung abgibt.
Ein Beispiel für
ein Gasentladungsgerät
ist in US-A-5 204 253 beschrieben. Ein Gerät vom Explosionstyp ist in
US-A-4 945 050 beschrieben. Ein Beispiel für eine Teilchenbeschleunigungsvorrichtung
vom Heliumentladungstyp ist das PowderJect XR® Instrument (PowderJect Vaccines,
Inc., Madison), WI, USA, wobei dieses Instrument in US-A-S 120 657
beschrieben ist. Eine hier zur Verwendung geeignete elektrische
Entladungsvorrichtung ist in US-A-5 149 655 beschrieben.
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Nachdem die Probenahmeteilchen in
die Zieloberfläche
abgegeben worden sind, gelangt eine Flüssigkeitsprobe zu der Zieloberfläche. In
der Regel ist dies eine Probe aus interstitieller Flüssigkeit
oder enthält diese.
Der Durchgang der Flüssigkeitsprobe
zu der Oberfläche
kann im Wesentlichen unverzüglich
erfolgen, oder kann über
eine Zeitspanne erfolgen. Die Menge der Probe, die an die Zieloberfläche abgegeben
wird, kann variiert werden, indem Bedingungen wie die Größe und/oder
Dichte der Probenahmeteilchen und die Einstellungen der zur Abgabe
der Teilchen verwendeten Vorrichtung geändert werden. Die Menge der
abgegebenen Flüssigkeit
kann oft gering sein, wie < 1 μl, was im
Allgemeinen zum Nachweis des Analyten ausreicht.
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Nachdem die Probe zu der Zieloberfläche gelangt
ist, wird die Anwesenheit und/oder Menge oder Konzentration des
Analyten in der Probe bestimmt. Die Probe kann mit einer geeigneten
Abfühlvorrichtung
kontaktiert werden. Diese Nachweisstufe kann natürlich in fortwährender
oder kontinuierlicher Weise durchgeführt werden. Fortwährender
oder kontinuierlicher Nachweis ermöglicht die Überwachung von Fluktuationen
der Zielanalytkonzentration. Außerdem kann
die Probe, die vermutlich den Analyten enthält, zuerst von der Zieloberfläche aufgefangen
werden, bevor sie mit der Abfühlvorrichtung
kontaktiert wird.
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Die Probe kann auf zahlreichen Wegen
von der Zieloberfläche
aufgefangen werden. Als Auffangreservoire können beispielsweise Polster,
Membranen, Tauchstäbchen,
Wattebäusche,
Röhrchen,
Ampullen, Küvetten,
Kapillarauffangvorrichtungen und miniaturisierte geätzte, abgetragene
oder geformte Durchflusswege verwendet werden. In einem bevorzugten
Aspekt wird ein Absorbensmaterial über die Zieloberfläche geleitet, um
die Flüssigkeitsprobe
von der Zieloberfläche
zum nachfolgenden Nachweis der Anwesenheit oder Menge des Analyten
zu absorbieren. Das Absorbensmaterial kann in Form eines Polsters
oder Wattebausches vorliegen. Das Absorbensmaterial kann zusätzlich Mittel
zur Erleichterung des Analyten einschließen, wie Enzyme, wie nachfolgend
detaillierter beschrieben wird.
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Das Absorbensmaterial kann auf die
Zieloberfläche
aufgebracht und nachfolgend mit einem Nachweismittel kontaktiert
werden, um den Analyten nachzuweisen. Das Absorbensmaterial kann
ein Hydrogel umfassen. Geeignete Geliermittel zur Bildung eines
Hydrogels schließen
Carbopol, Calciumlactat, Cellulosegummi, Kulcel (HPMC), Natrosol,
Gelatinepulver oder Natriumalginat ein. Die Geliermittel können in
Wasser in Gehalten wie 1 Gew.% in Wasser vorhanden sein.
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Das Gel kann auf die Zieloberfläche aufgebracht
werden und dem Analyten vor der Nachweisstufe ausreichend Zeit gelassen
werden, damit sich von der Zieloberfläche ins Gel ein Gleichgewicht
einstellt. Die Zeit kann recht kurz sein, wie 30 Sekunden bis 5
Minuten. Der Nachweis kann dann durchgeführt werden, indem auf das Gel
das Abfühlmittel
aufgebracht wird, wie durch Kontaktieren einer Membran, die ein
geeignetes Enzymsystem für
den Analyten enthält,
mit dem Hydrogel.
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Die Nachweisstufe kann allgemein
wie folgt beschrieben werden. Eine Anfangsstufe kann das Erhalten
eines Rohsignals aus einem Abfühlgerät beinhalten,
wobei das Signal mit einem Zielanalyten verknüpft ist, der in dem biologischen
System vorhanden ist. Das Rohsignal kann dann direkt verwendet werden,
um eine Antwort in Bezug auf den Analyten; beispielsweise eine positive
oder negative Antwort in Bezug auf die Anwesenheit des Analyten, oder
eine direkte Messung zu erhalten, die die Menge oder Konzentration
des extrahierten Analyten anzeigt. Das Rohsignal kann auch indirekt
verwendet werden, um Information über den Analyten zu erhalten.
Das Rohsignal kann beispielsweise Signalverarbeitungsstufen unterzogen
werden, um eine Messung des in der Probe gezogenen Analyten mit
der Konzentration dieses Analyten in dem biologischen System zu
korrelieren. Solche Korrelationsmethoden sind Fachleuten wohl bekannt.
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Der Nachweis kann mit jedem geeigneten
Verfahren durchgeführt
werden, das den Nachweis eines abgeleiteten Analyten ermöglicht.
Die Analyse kann physikalische, chemische, biochemische, elektrochemische,
photochemische, spektrophotometrische, polarimetrische, kolorimetrische
oder radiometrische Analyse sein.
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Um den Nachweis des Analyten zu erleichtern,
kann ein Enzym auf der aktiven Oberfläche oder einem Teil einer Abfühlvorrichtung
angeordnet werden, die bzw. der mit dem extrahierten Analyten (z.
B. einer extrahierten Probe, die den Analyten enthält) kontaktiert
wird, oder in ein oder mehrere Auffangreservoire eingeschlossen
wird, die zum Auffangen des extrahierten Analyten verwendet werden.
Ein solches Enzym muss in der Lage sein, eine spezifische Reaktion
in dem extrahierten Analyten (z. B. Glucose) in dem Maße zu katalysieren,
dass ein Produkt der Reaktion abgefühlt werden kann (z. B. elektrochemisch
durch Erzeugung eines Stroms nachgewiesen werden kann, wobei der
Strom nachweisbar und proportional zu der Menge des Analyten ist,
der reagiert hat). Ein geeignetes Enzym ist Glucoseoxidase, die
Glucose zu Gluconsäure
und Wasserstoffperoxid oxidiert. Der anschließende Nachweis von Wasserstoffperoxid
mit einer geeigneten Biosensorelektrode erzeugt zwei Elektronen
pro Wasserstoffperoxidmolekül,
wodurch ein Strom erzeugt wird, der nachgewiesen und mit der Menge
an Glucose verknüpft
werden kann, die in das Gerät
eintritt. Glucoseoxidase (GOx) ist leicht im Handel erhältlich und
hat wohl bekannte katalytische Eigenschaften. Es können jedoch
auch andere Enzyme verwendet werden, so lange sie spezifisch eine
Reaktion mit einem interessierenden Analyten oder einer interessierenden
Substanz katalysieren, um ein nachweisbares Produkt in Proportion
zu der Menge des so umgesetzten Analyten zu erzeugen.
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Eine Reihe anderer analytspezifischer
Enzymsysteme kann in der Erfindung verwendet werden. Wenn eine übliche Biosensorelektrode
verwendet wird, die Wasserstoffperoxid nachweist, können geeignete
Enzymsysteme verwendet werden, um Ethanol (ein Alkoholoxidaseenzymsystem)
oder in ähnlicher
Weise Harnsäure (ein
Uratoxidasesystem), Cholesterin (ein Cholesterinoxidasesystem) und
Theophyllin (ein Xanthinoxidasesystem) nachzuweisen. Hydrogele,
die diese analytspezifischen Enzymsysteme enthalten, können unter
Verwendung leicht erhältlicher
Techniken hergestellt werden, die dem durchschnittlich versierten
Fachmann vertraut sind.
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Bevorzugte Abfühlgeräte sind Pflaster, die ein Enzym
oder anderes spezifisches Reagenz einschließen, das mit dem extrahierten
interessierenden Analyten reagiert, um eine nachweisbare Farbänderung
oder anderes chemisches Signal zu produzieren. Die Farbveränderung
kann durch Vergleich mit einem Standard bewertet werden, um die
Analytmenge zu bestimmen, oder die Farbveränderung kann unter Verwendung
von elektronischen Standardreflektionsmessinstrumenten nachgewiesen
werden. Ein solches System ist das transdermale Glucoseüberwachungssystem,
das von Technical Chemicals and Products, Inc. (TCPI) aus Pompano
Beach, FL, USA, erhältlich
ist. Ein weiteres geeignetes System ist in US-A-5 267 152 von Yang
et al. beschrieben (a device and method for measuring blood glucose
concentraton using near-IR radiation diffuse-reflection laser spectroscopy;
Gerät und
Verfahren zum Messen der Blutglucosekonzentration unter Verwendung
von diffus reflektierender Laserspektroskopie mit naher IR-Strahlung). Ähnliche
spektrometrische Geräte
mit nahem IR sind auch in US-A-S 086 229 von Rosenthal et al. und
US-A-4 975 581 von
Robinson et al. beschrieben. US-A-5 139 023 von Stanley beschreibt
eine Blutglucoseüberwachungsvorrichtung,
die auf einem Durchlässigkeitserhöhungsmittel
(z. B. einem Gallensalz) zur Erleichterung der Transdermalbewegung von
Glucose entlang eines Konzentrationsgradientens basiert, der zwischen
der interstitiellen Flüssigkeit
und einem empfangenden Medium besteht. US-A-5 036 861 von Sembrowich
beschreibt eine passiven Glucoseüberwachung,
die Schweiß durch
ein Hautpflaster sammelt, wo ein cholinerges Mittel verwendet wird,
um die Schweißsekretion
aus der ekkrinen Schweißdrüse zu stimulieren. Ähnliche
Schweißauffanggeräte sind
in US-A-5 076 273
von Schoendorfer und US-A-5 140 985 von Schroeder beschrieben worden.
Der Nachweis der extrahierten Glucose wird unter Verwendung von chemischen
(z. B. enzymatischen), kolorimetrischen oder spektrometrischen Standardtechniken
durchgeführt.
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Alternativ kann zusammen mit der
vorliegenden Erfindung ein iontophoretisches Transdermalprobenahmesystem
verwendet werden, wobei beispielsweise das vorliegende Teilchenverfahren
zur Vorbehandlung einer Hautstelle verwendet wird, um verbesserte
Probenahme aus einem GlucoWatch-System (Cygnus, Redwood, CA, USA)
zu erleichtern. Dieses iontophoretische System ist in Gliebfeld
et al. (1989), Pharm. Res. 6(11): 988 et seq. und US-A-S 771 890
beschrieben.
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C. EXPERIMENTELLER TEIL
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Es folgen Beispiele für spezielle
Ausführungsformen
zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung
und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung in keinerlei Weise
einschränken.
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Wir haben uns natürlich bemüht, Genauigkeit in Bezug auf
die verwendeten Zahlenangaben (z. B. Mengen, Temperaturen, usw.)
zu gewährleisten,
experimentelle Fehler und Abweichungen sollten jedoch zugestanden
werden.
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BEISPIEL 1
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EINFÜHRUNG
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Die interstitielle Flüssigkeit
ist die klare Körperflüssigkeit
zwischen Zellen auf der obersten Oberflächenschicht der Haut. Der Glucosegehalt
in dieser Flüssigkeit
zeigt direkt den Glucosegehalt im Blut. Ein nadelloses Spritzengerät kann Diffusionswege
in diese Schichten erzeugen und ermöglicht das Auffangen einer geringen
Menge (< 1 ml)
interstitieller Flüssigkeit,
aus der der Glucosegehalt gemessen werden kann.
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MATERIALIEN
UND VERFAHREN
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Lactosemonohydrat, NF-Qualität, wurde
von Amresco® (Solon,
OH, USA) erhalten. Das Lactosepulver wurde unter Verwendung des
US-Standardsiebs (Chicago, IL, USA) auf 38 bis 53 μm gesiebt.
D(+)-Glucose wurde von Sigma (St. Louis, MO, USA) erhalten. Menschliche
Leichenhäute
wurden von New York Firefighter Skin Bank (New York, NY, USA) geliefert,
mit 80% Kombinationssalzlösung,
10% Kalbserum und 10% Glycerin vorbehandelt und in der Hautbank
gefroren. Die Haut wurde wie geliefert nach 1 bis 2 Stunden Auftauen bei
Raumtemperatur verwendet.
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Modifizierte Franz-Zellen (6,9 ml)
wurden zur Untersuchung von in vitro-Glucoseextraktion entworfen (1). Der Donorteil am Boden
der Zelle wurde mit unterschiedlichen Glucosekonzentrationen im
Bereich von 10 bis 500 mg/dl gefüllt.
Die Temperatur der Glucoselösung
wurde während
der Experimente auf 32°C
gehalten. Menschliche Leichenhaut mit einer Dicke von 200 bis 300 μm wurde verwendet.
Die Haut wurde mit einer 1 Zoll (2,54 cm) Stanze ausgestanzt und
auf der modifizierten Franz-Zelle positioniert.
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Nach einigen Stunden zur Gleichgewichtseinstellung
wurden 2 mg Lactoseteilchen mit 38 bis 53 μm in die Trilaminatkassette
der 20 μm
Polycarbonatmembran gefüllt
und unter Verwendung eines PowderJect ND1 nadellosen Spritzgeräts, das
mit einer Ultraschalldüse
ausgestattet war, auf das Hautgewebe injiziert. Der Gerätedruck
für die
Teilchenverabreichung betrug 20 bar.
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. Dann wurden 5 μl Hydrogel oben auf der injizierten
Haut angeordnet, und eine One Touch enzymatische Membran (Lifescan,
Milpitas, CA, USA) wurde eine Minute mit dem Gel kontaktiert. Die
Schwärzung
der Membran wurde dann mit einem Densitometer (Hercules, CA, USA)
gemessen.
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ERGEBNISSE
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Tabelle 1 ist eine Zusammenfassung
der Schwärzung
von Membranen, die mit dem Donorteil (Bodenteil der Franz-Zelle)
oder dem Hydrogel oben auf der behandelten Haut kontaktiert wurden.
Wie zu sehen ist, nimmt die Schwärzung
der extrahierten Glucose aus dem oberen Bereich der drei unterschiedlichen
Hautproben von 0,04 bis 0,08 auf 0,65 bis 0,89 zu, wenn die Schwärzung des
Donorteils von 0,10 auf 0,71 steigt. 2 ist
die zusammengefasste Auftragung der Schwärzung von drei Hautproben über dem
Donorteil. Die Korrelation (r2-Wert) beträgt bei den
drei Hautproben 0,2.
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Diese in vitro experimentellen Ergebnisse
zeigen, dass es eine gute Korrelation (r2 =
0,92) zwischen den gemessenen Werten der extrahierten Glucose unter Verwendung
von erfindungsgemäßer Teilchenabgabe und
Donorfach gibt, die menschliche interstitielle Flüssigkeit
simuliert.
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Tabelle
1: Glucosestandardlösung
und Schwärzung
von Glucoselösung
in dem Donorfach und Glucose, die aus drei unterschiedlichen Hautproben
extrahiert wurde
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BEISPIEL 2
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EINFÜHRUNG
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Die in Beispiel 1 beschriebene in
vitro Untersuchung mit menschlicher Leichenhaut zeigt, dass es eine gut
fundierte Korrelation "systemischer" Glucosegehalte mit
Flüssigkeitsproben
gibt, die über
ein Teilchenabgabeverfahren zugänglich
waren (r2 = 0,92). Diese Untersuchung wurde
somit durchgeführt,
um Glucosegehalte aus zwei Blutquellen (venöse Blutglucose und Kapillarblutglucose)
mit dem Glucosegehalt von interstitieller Flüssigkeit zu vergleichen, auf
die bei menschlichen Individuen mittels eines nadellosen Injektionsgeräts zugegriffen
wurde.
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Bei den nadellosen Injektionsstellen
wurden zudem sichtbare Erythemgrade oder Ödeme unter Verwendung der Draize-Skala, Änderung
der Chromatizität, Änderung
des transepidermalen Wasserverlusts (TEWL) und jegliche Schmerzwahrnehmung
(VAS) gemessen, um Unterbrechung des Stratum corneums zu zeigen
und die Eindringung des Teilchens zu bestätigen. Messungen wurden unmittelbar
nach der Teilcheninjektion und 24 und 48 Stunden nach der Probenahme
durchgeführt.
Diese Messungen zeigen ein Profil von jeglicher Korrelation zwischen
venöser
Glucose, Kapillarglucose und interstitieller Glucose und der Belastbarkeit
der Haut.
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MATERIALIEN
UND VERFAHREN
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In die Studie wurden 120 Versuchsteilnehmer
mit Diabetes eingeschlossen. Die Versuchsteilnehmer waren männliche
oder weibliche Diabetiker vom Typ I oder Typ II im Alter von 18
bis 70, jedoch unter Ausschluss von Diabetikern mit beliebigen Hautproblemen
an den Teststellen, einschließlich
Ekzemen, Psoriasis, usw., oder mit wiederkehrenden Hautinfektionen
in der Vorgeschichte. Die Probenahmestellen waren Fossa cubitalis
(venös),
Fingerbeere (kapillar) oder palmarer Unterarm (Teilchenabgabe).
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Das nadellose Spritzen-Teilchenabgabegerät und die
Verbindungen waren wie folgt:
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- Pulver: Lactose, Teilchengröße 20 bis 38 μm, gesiebt.
- Kassette: Trilaminat mit 10 μm
Polycarbonatmembranen (vorgeordnete Membran war geschlitzt), 1,0
mg Pulver Nutzlast, hergestellt und verpackt in einer reinen Laborumgebung
und am Ende mit γ-Strahlung
sterilisiert.
- Gerät:
Ein dermales PowderJectTM ND1 nadelloses
Spritzengerät,
das mit einer Ultraschalldüse,
5 cm3 Expansionskammer, die zur Aufnahme
von Trilaminatkassetten modifiziert worden war, 10 bar Druckluftdruck,
Druckknopf-Gaszylinder
aus rostfreiem Stahl ausgestattet war.
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Das nadellose Spritzengerät wurde
so vertikal wie möglich
gehalten, wobei die Düse
fest gegen die Haut gedrückt
wurde, so dass gewährleistet
war, dass es keine Lücke
zwischen der Haut und dem Ende des Geräts gab. Das Gerät wurde
betätigt,
indem der Knopf im oberen Bereich gedrückt wurde.
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TEWL und Chromatizität wurden
für jede
palmare Unterarminjektionsstelle vor der Pulverabgabe gemessen.
Nachdem das Pulver an die Stelle abgegeben worden war, wurde TEWL
für jede
Injektionsstelle gemessen. Jeder Versuchsteilnehmer wurde gebeten,
das Gefühl
bei der Verabreichung in wenigen Worten zu beschreiben und das Schmerzgefühl auf einer
visuellen 100 mm Analogskala (VAS) zu beschreiben, wobei 100 der
Schmerz des Fingerstechens und 0 schmerzfrei war.
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Ein LifeScanTM Glucosenachweismembranstreifen
wurde mit 5 μl
Hydrogel angefeuchtet und 1 Minute auf die Pulverinjektionsstelle
aufgebracht. Die behandelten Stellen wurden mit einem Wattebausch
abgetupft und die Chromatizität
zum Vergleich mit den Werten vor der Behandlung gemessen. Kapillarblutproben
wurden mittels Fingerstich zur Glucoseanalyse unter Verwendung des
LifeScan One-Touch-Systems aufgefangen. Blutproben wurden aus einer
Vene in der Fossa cubitalis zur Glucoseanalyse aufgefangen. Die
Farbintensität der
Membranen wurde mit dem Bio-Rad Densitometer quantifiziert. TEWL
und Chromatizität
der Injektionsstelle wurden 24 und 48 Stunden nach der Injektion
gemessen.
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Das für einen oralen Glucosetoleranztest
verendete Protokoll war wie folgt. Jegliche Arzneimitteltherapie,
die den Test beeinflussen könnte,
wurde mindestens 3 Tage vor dem Test abgesetzt. Die Teilnehmer wurden
angewiesen, eine Kohlenhydrataufnahme von mindestens 150 g/Tag für 3 Tage
vor dem Test aufzunehmen, und 14 bis 15 Stunden zu fasten (von 18:00
abends am Tag vor dem Test bis 8:00 bis 9:00 morgens am Testtag).
Die Testteilnehmer enthielten sich während des Tests von Tabak,
Kaffee, Tee, Nahrungsmitteln und Alkohol. Die Teilnehmer saßen während des
Tests ruhig aufrecht. Es wurde langsames Gehen erlaubt, anstrengende
sportliche Betätigung
wurde jedoch vermieden. Bevor eine Glucosebelastung gegeben wurde, wurde
Nüchtern-Plasmaglucose
(FPG) durch die oben beschriebenen venösen, Kapillar- und interstitiellen Glucoseprobenahmetechniken
gemessen. 75 g Glucose wurden als 25% Lösung gegeben (400 ml). Proben wurden
aufgefangen und die Kapillar- und interstitiellen Glucosegehalte
wie oben nach 30, 60, 90, 120 Minuten gemessen.
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ERGEBNISSE
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Die Glucosetoleranztestergebnisse
von drei Versuchsteilnehmern sind in 3 bis 5 abgebildet. Die Blutglucosekonzentration
(mg/dl) und Schwärzung
aus der Reaktion mit Glucose in interstitieller Flüssigkeit
sind gezeigt. Um die Ergebnisse in der gleichen Figur zu kombinieren,
wurde die Schwärzung
mit 1000 multipliziert.
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Der dynamische Glucosebereich des
Versuchsteilnehmers 1 betrug 150 bis 270 mg/dl. Die Schwärzung gemäß dem Blutglucosewert
korrelierte gut mit der venösen
Glucosekonzentration (3).
Der dynamische Glucosebereich des Versuchsteilnehmers 2 betrug
160 bis 400 mg/dl. Es gab eine Korrelation zwischen venöser Glucose
und Schwärzung,
außer
an dem Punkt nach einer Stunde (4).
Eine ähnliche
Tendenz konnte bei Versuchsteilnehmer 3 ( 5) beobachtet werden.
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In 6 werden
die Schwärzungsablesungen
von Glucose in interstitieller Flüssigkeit gegen Glucose in venösem Blut
für alle
Versuchsteilnehmer aufgetragen. Das Fehlergitterverfahren wurde
auf die gewonnenen Daten angewendet und aufgetragen. Die meisten
Datenpunkte befinden sich in Bereich A und B, die klinisch korrelierte
Bereiche sind. Der r-Wert aus einer linearen Regressionsanalyse
betrug 0,76. Tabelle 2 zeigt einen Vergleich der Fehlergitteranalysen
zwischen dem invasiven Glucometer, dem iontoporetischen GIucoWatch-Verfahren
und der erfindungsgemäßen Teilchenabgabe.
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Tabelle
2: Vergleich der klinischen Ergebnisse zwischen Glucometer®, GIucoWatch® und der
Erfindung
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In Bezug auf Schmerz bevorzugten
die meisten Versuchsteilnehmer (> 90%)
das erfindungsgemäße Teilchenabgabeverfahren
gegenüber
den Glucometerund GIucoWatch-Glucosemessvertahren. Es gab jedoch bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
etwas Erythem, das bei einigen Versuchsteilnehmern auftrat und nach 3
bis 4 Tagen verschwand.