DE69909096T2

DE69909096T2 - Vernetzung von bioprothesematerial zur kalzifikationsverminderung nach implantation

Info

Publication number: DE69909096T2
Application number: DE69909096T
Authority: DE
Inventors: M. Crystal CUNANAN; Lillian Quintero; N. Michael HELMUS; Christine Loshbaugh; H. Chris SARNER
Original assignee: Edwards Lifesciences Corp
Current assignee: Edwards Lifesciences Corp
Priority date: 1998-09-21
Filing date: 1999-09-20
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2019-09-21
Also published as: CA2344061C; US20010032024A1; US6214054B1; US20070255423A1; JP2002526206A; WO2000016820A1; ATE243537T1; DE69909096D1; AU767210B2; US7214344B2; BR9914008A; US6547827B2; AU6154399A; US20030226208A1; EP1098670B1; CA2344061A1; US8236241B2; EP1098670A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein medizinische Verfahren/Einrichtungen und speziell ein Verfahren zum Fixieren (z. B. Gerben. oder Vernetzen) und Sterilisieren von biologischem Gewebe, um i) die Neigung des fixierten Gewebes zur Kalzifizierung nach der Implantation zu verringern und ii) die Thrombogenizität des fixierten Gewebes zu verringern.
Hintergrund der Erfindung
Verschiedene Arten von implantierbaren medizinischen Einrichtungen können entweder vollständig oder zum Teil aus biologischem Gewebe gebildet werden, das chemisch "fixiert" oder konserviert worden ist. Die für das chemische Fixieren von biologischen Geweben angewandte Technik macht es typischerweise erforderlich, das biologische Gewebe einem oder mehreren chemischen Agenzien auszusetzen, die imstande sind, Querverbindungen zwischen Bindegewebsproteinmolekülen zu bilden, die in dem Gewebe vorhanden sind.
Beispiele von fixierten biologischen Geweben, die verwendet werden, um implantierbare Bioprothesen zu bilden, umfassen Herzklappen, Blutgefäße, Haut, Dura mater, Herzbeutel, Bänder und Sehnen. Diese biologischen Gewebe enthalten typischerweise Bindegewebsproteine (z. B. Collagen, Elastin), die als Stützgerüst des Gewebes dienen. Die Geschmeidigkeit oder Steifigkeit jedes biologischen Gewebes ist weitgehend durch die relativen Mengen an Collagen und Elastin, die innerhalb des Gewebes vorhanden sind, und/oder durch die physische, Struktur und Stärkung seines Bindegewebsgerüsts bestimmt.
Jedes Collagenmolekül besteht aus drei (3) Polypeptidketten, die in einer verknäuelten Helixstruktur verschlungen sind. Die chemischen Fixierungsmittel (d. h. Gerbmittel), die dazu dienen, biologische Gewebe zu konservieren, bilden im allgemeinen Querverbindungen zwischen den Polypeptidketten innerhalb eines gegebenen Collagenmoleküls (d. h. intramolekulare Querverbindungen) oder zwischen benachbarten Collagenmolekülen (d. h. intermolekulare Querverbindungen).
Beispiele von chemischen Fixierungsmitteln, die eingesetzt werden, um collagenhaltige biologische Gewebe zu vernetzen, umfassen: Aldehyde (z. B. Formaldehyd, Glutaraldehyd, Dialdehydstärke, Paraformaldehyd, Glycerinaldehyd, Glyoxalacetaldehyd, Acrolein), Diisocyanate (z. B. Hexamethylendiisocyanat), Carbodiimide, die Fotooxidation und bestimmte Polyepoxidverbindungen (z. B. Denacol-810, –512 oder ähnliche Verbindungen). Von den verschiedenen verfügbaren chemischen Fixierungsmitteln ist Glutaraldehyd dasjenige, das am häufigsten eingesetzt wird. Glutaraldehyd wird als Fixiermittel für viele handelsübliche Bioprotheseprodukte eingesetzt, etwa für bioprothetische Herzklappen vom Schwein (d. h. die mit Stents versehene Carpentier-Edwards^® Bioprothese vom Schwein; Baxter Healthcare Corporation; Edwards CVS Division, Irvine, CA 92714-5686), Rinderperikard-Herzklappenprothesen (z. B. Carpentier-Edwards^® Pericardial Bioprosthesis, Baxter Healthcare Corporation, Edwards CVS Division; Irvine, CA 92714-5686) und stentlose Aortaprothesen vom Schwein (z. B. Edwards^®PRIMA? Stentless Aortic Bioprosthesis, Baxter Edwards AG, Spierstraße 5, CN-6048, Horn, Schweiz).
Ein Problem, das mit der Implantierung von Bioprothesematerialien einhergeht, besteht darin, daß die Bindegewebsproteine (d. h. Collagen und Elastin) in diesen Materialien nach der Implantation im Körper kalzifizieren können. Diese Kalzifizierung kann in einer unerwünschten Versteifung oder Verschlechterung der Bioprothese resultieren. Man weiß, daß zwei (2) Arten der Kalzifizierung – die von innen kommende und die von außen kommende – in fixierten collagenhaltigen Bioprothesen auftreten können, obwohl die genauen Mechanismen unbekannt sind, durch die eine solche Kalzifizierung erfolgt. Die von innen kommende bzw. intrinsische Kalzifizierung ist gekennzeichnet durch die Ausfällung von Calcium- und Phosphationen in dem fixierten Bioprothesengewebe, was die Collagenmatrix und Restzellen einschließt. Die von außen kommende oder extrinsische Kalzifizierung ist gekennzeichnet durch die Ausfällung von Calcium- und Phosphationen innerhalb des Thrombus, einschließlich an der Bioprothese anhaftender Zellen (z. B. Trombozyten) und der Entwicklung von Calciumphosphat enthaltender Oberflächenplaque an der Bioprothese.
Die Faktoren, die die Rate beeinflussen, mit der fixierte Gewebebioprothesen eine Kalzifizierung erfahren, sind noch nicht vollständig geklärt. Faktoren, von denen man annimmt, daß sie die Kalzifizierungsrate beeinflussen, sind jedoch die folgenden:

a) Alter des Patienten;
b) vorhandene Stoffwechselstörungen (d. h.
c) Hyperkalzämie, Diabetes usw.)
d) Ernährungsfaktoren
e) Infektion
f) parenterale Verabreichung von Calcium
g) Dehydratation
h) Verformung/mechanische Faktoren
i) unzureichende Koagulationstherapie während der Anfangsperiode nach der operativen Implantation; und
j) Reaktionen des Wirtsgewebes.

Die Faktoren, von denen man annimmt, daß sie die Neigung von Thrombozyten zur Anhaftung an fixiertem Bioprothesegewebe beeinflussen, umfassen die folgenden:

a) Gewebeschädigung
b) Ernährung
c) Oberflächeneigenschaften des Gewebes einschließlich der Beschaffenheit von exponiertem Collagen (z. B. Typ I, IV usw.)
d) Stoffwechselveränderungen
e) Gerinnung
f) Hämodynamik
g) Entzündung; und
h) Infektion.

Es sind verschiedene Techniken vorgeschlagen worden, um die In-situ-Kalzifizierung von mit Glutaraldehyd fixierten Bioprothesen zu mildern. Unter diesen die Kalzifizierung mildernden Techniken sind die Methoden, die beschrieben sind in US-PS 4 885 005 (Nashef et al.) mit dem Titel Surfactant Treatment of Implantable Biological Tissue To Inhibit Calcification; US-PS 4 648 881 (Carpentier et al.) mit dem Titel Implantable Biological Tissue and Process For Preparation Thereof; US-PS 4 976 733 (Girardot) mit dem Titel Prevention of Prosthesis Calcification; US-PS 4 120 649 (Schechter) mit dem Titel Transplants; US-PS 5 002 256 (Carpentier) mit dem Titel Calcification Mitigation of Bioprosthetic Implants; EP 103947A2 (Pollock et al.) mit dem Titel Method For Inhibiting Mineralization of Natural Tissue During Implantation; und WO84/01879 (Nashef et al.) mit dem Titel Surfactant Treatment of Implantable Biological Tissue to Inhibit Calcification; und D. Yi, W. Liu, J. Yang, B. Wang, G. Dong und N. Tan: Study of Calcification Mechanism and Anticalcification On Cardiac Bioprostheses, S. 17–22, Proceedings of Chinese Tissue Valve Conference, Beijing, China, Juni 1995.
Derzeit verbleibt auf diesem Gebiet ein Bedarf für die Entwicklung neuer, die Kalzifizierung mildernder Verfahren zum Fixieren (d. h. Gerben und Vernetzen) und Sterilisieren von biologischen Geweben zur Schaffung von Bioprothese-Einrichtungen, die a) eine geringere Neigung zur Kalzifizierung haben und b) weniger thrombogen sind, nachdem sie in den Körper eines Patienten implantiert worden sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Allgemein gesagt, gibt die Erfindung ein Verfahren an zum chemischen Fixieren und Sterilisieren von biologischem Gewebe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

1. ERNTEN/PRÄPARIEREN VON GEWEBE- Ernten und Präparieren eines biologischen Gewebes.
2. FIXIEREN VON GEWEBE- In-Kontakt-Bringen des biologischen Gewebes mit einem Fixierungsmittel wie etwa einem Aldehyd (z. B. Formaldehyd oder Glutaraldehyd) während eines Fixierungszeitraums (wenn z. B. 0,625% Glutaraldehyd als Fixierungsmittel eingesetzt wird, ist der Zeitraum 0,5 h bis 14 d), um eine Vernetzung der Bindegewebsproteine innerhalb des Gewebes zu bewirken.
3. DSV-BEHANDLUNG- Vor oder nach der Durchführung des Fixierungsschritts (obiger Schritt 2) wird das biologische Gewebe in Kontakt gebracht (z. B. getaucht) mit einer DSV-Lösung (Denaturierungsmittel/Surfactant (bzw. oberflächenaktive Substanz)/Vernetzungsmittel-Lösung) mit einer Temperatur zwischen 4 und 50°C über einen Zeitraum zwischen 90 min und 35 h. Dieser DSV-Behandlungsschritt wird typischerweise durchgeführt, bevor das biologische Gewebe in einen Reinraum oder eine sterile Umgebung transportiert wird, kann aber zusätzlich oder alternativ zu anderen Zeiten erfolgen, etwa nach dem Zusammensetzen der Bioprothese, wie nachstehend noch im einzelnen beschrieben wird.
4. ZUSAMMENSETZEN/HERSTELLEN EINER PROTHESE – Zurichten oder Konfigurieren des biologischen Gewebes (falls erforderlich) und Anbringen von etwa erforderlichen nichtbiologischen Komponenten (z. B. Stents, Stützgerüste, Nahtringe, andere Hardware-Elemente) daran. Dieser Schritt des Zusammensetzens/Herstellens wird typischerweise in einem Reinraum oder einer sterilen Umgebung durchgeführt.
5. ENDSTERILISATION- Das biologische Gewebe wird einem Sterilisationsmittel (z. B. einer Sterilisationsflüssigkeit wie etwa einer 6. 0,2–2,0 Gew.-% Glutaraldehydlösung) während einer Sterilisationsperiode ausgesetzt. Eine 0,625% Glutaraldehydlösung kann in Kombination mit Wärme (d. h. Erwärmen über Raumtemperatur, aber unterhalb einer Temperatur, die eine Schädigung des Gewebes der Bioprothese bewirken würde) als Sterilisationslösung eingesetzt werden. Alternativ kann eine geeignete Sterilisationslösung eine osmotisch im Gleichgewicht befindliche wäßrige Lösung entweder allein oder in Kombination mit einer kontaktlosen Sterilisationsquelle (z. B. Strahlung, Elektronenstrahl, UV oder ein anderes gleichartiges Mittel) aufweisen oder eine wäßrige Lösung von Glutareldehyd in Kombination mit dem oben beschriebenen DSV-Gemisch oder einigen Bestandteilen eines solchen DSV-Gemischs aufweisen. In Fällen, in denen als Sterilisationsmittel eine 0,625% Glutaraldehydlösung eingesetzt wird, kann die Sterilisationsdauer 1 bis 6 d bei 37°C oder 1–2 d bei 50°C sein. Dieser Endsterilisationsschritt kann nach dem Verpacken der Bioprothese in ihren Endbehälter durchgeführt werden, so daß keine weitere Handhabung der Bioprothese bis zum Zeitpunkt der Implantation erforderlich ist.

Ferner werden gemäß der Erfindung verschiedene Arten von Bioprothesegegenständen angegeben, die entweder vollständig oder teilweise aus Gewebe gebildet sind, das nach dem oben zusammengefaßten Fixierungs- /Sterilisationsverfahren der vorliegenden Erfindung präpariert worden ist. Beispiele von speziellen biologischen Geweben, die verwendet werden können, um Bioprothesegegenstände gemäß der vorliegenden Erfindung zu präparieren, umfassen – ohne daß dies eine Einschränkung darstellt – Herzklappen; Venenklappen; Blutgefäße; Harnleiter; Sehnen; Dura mater; Haut; Perikard; Knorpel (z. B. Meniskus); Bänder; Knochen; Gedärme (z. B. Darmwand); und Knochenhaut.
Weitere Aspekte und Ziele der vorliegenden Erfindung ergeben sich für den Fachmann beim Lesen der nachfolgenden genauen Beschreibung von derzeit bevorzugten Ausführungsbeispielen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein allgemeines Ablaufdiagramm eines Behandlungsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zur Milderung von Kalzifizierung;
2 ist ein allgemeines Ablaufdiagramm eines Behandlungsverfahrens, das als Kontrolle bei einer Untersuchung der Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung zur Milderung von Kalzifizierung dient;
3 ist ein allgemeines Ablaufdiagramm eines Behandlungsverfahrens, das als Kontrolle bei einer Untersuchung der Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf eine Verbesserung der Hämokompatibilität dient;
4 ist eine REM-Abbildung der Oberfläche von Gewebe, das gemäß dem Verfahren von 3 behandelt wurde; und
5 ist eine REM-Abbildung der Oberfläche von Gewebe, das gemäß dem Verfahren von 1 behandelt wurde.
Zusätzliche Ausführungsformen und Aspekte der Erfindung ergeben sich für den Fachmann aus dem Studium und dem Verständnis der folgenden genauen Beschreibung und der speziellen Beispiele.
Genaue Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
Wie 1 zeigt, weist das Fixierungs-/Sterilisationsverfahren der vorliegenden Erfindung im allgemeinen die folgenden sechs (6) Schritte auf:
Schritt 1 Ernten/Präparieren von biologischem Gewebe
Das gewünschte biologische Gewebe wird geerntet (d. h. vom Wirtstier operativ entfernt oder weggeschnitten). Danach wird es typischerweise zugerichtet oder auf die gewünschte Größe zugeschnitten und mit sterilem Wasser, einer im Gleichgewicht befindlichen Salzlösung, einer Kochsalzlösung oder einer anderen geeigneten Waschlösung gewaschen.
Schritt 2 Fixierung des biologischen Gewebes
Das biologische Gewebe wird dann in Kontakt gebracht mit einem Vernetzungsmittel wie etwa einem Aldehyd (z. B. Formaldehyd, Glutaraldehyd, Dialdehydstärke), Polyglycidylether (z. B. Denacol 810), Diisocyanaten, Fotooxidation oder Carbodiimid(en), um die in dem Gewebe vorhandenen Bindegewebsproteine zu vernetzen. Aufgrund des schon lang verwendeten Glutaraldehyds und der damit gemachten Erfahrungen ist ein derzeit bevorzugtes Fixierungsmittel zur Verwendung bei diesem Schritt eine Lösung von 0,2 bis 2,0 Gew.-% Glutaraldehyd. Beispielsweise kann das biologische Gewebe für 0,5 h bis 14 d bei 4 bis 37°C in eine Lösung aus 0,625 Gew.-% Glutaraldehyd getaucht sein, die mit einem geeigneten Puffer wie etwa einem Phosphatpuffer auf einen pH von ungefähr 7,4 gepuffert ist.
Schritt 3 Behandlung mit Denaturierungsmittel/Surfactant/Vernetzungsmittel (DSV-Behandlung):

a. Vor oder nach der Fixierung des Gewebes in Schritt 2 wird das Gewebe in ein Gemisch getaucht oder anderweitig damit in Kontakt gebracht, das enthält: i) ein Vernetzungsmittel, ii) ein Denaturierungsmittel und iii) eine oberflächenaktive Substanz bzw. ein Surfactant (d. h. eine DSV-Lösung). Eine bevorzugte DSV-Lösung ist ein Gemisch aus i) Formaldehyd, ii) Ethanol und iii) Surfactant (z. B. oberflächenaktive Substanz Tween 80^TM, erhältlich von ICI Americas, Brantford, Ontario). Eine bevorzugte Formulierung für die DSV-Lösung ist wie folgt: Formaldehyd 0,1–10,0 Gew.-% (stärker bevorzugt 4 ± 0,4 Gew.-%) Ethanol 1 bis weniger als 60 Gew.-% (stärker bevorzugt 22 ± 2,2 Gew.-%) Tween 80 0,1–5,0 Gew.-% (stärker bevorzugt 1,2 ± 0,12 Gew.-%)

Das Gewebe wird bevorzugt für 2 bis 24 h, typischerweise für ungefähr 9 h, in die DSV-Lösung getaucht. Während dieser Tauchperiode wird die DSV-Lösung auf einer Temperatur von 4 bis 50°C und typischerweise ungefähr 20 bis 37°C gehalten.
Für den Fachmann ist ersichtlich, daß jeder Bestandteil der DSV-Lösung durch verschiedene alternative chemische Verbindungen oder Lösungen ersetzt werden kann, und zwar wie folgt:
Potentielle alternative Denaturierungsmittel:

A. Alkohole/Lösungsmittel: z. B. Ethanol, Isopropylalkohol, Aceton, Ether mit kleiner Alkylgröße (Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl)
B. Angesäuerte Ether: z. B. Gemisch aus Schwefelsäure/Ether
C. Ketone: z. B. Methylethylketon (MEK)
D. Fluorchlorkohlenstofflösungsmittel: z. B. Genesolve^TM (Allied Signal, Inc., Morristown, NJ)
E. Glykole: Glycerinethylenglykol, Polyethylenglykole mit unterschiedlicher relativer Molekülmasse
F. Chaotrope Mittel: z. B. Harnstoff, Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanatkaliumiodid
G. Hochkonzentrierte Salzlösungen: z. B. Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Cäsiumchlorid.

Potentielle alternative oberflächenwirksame Substanzen (Surfactants)**:

A. Anionische Surfactants: z. B. Ester von Dodecansäure einschließlich, jedoch ohne Beschränkung darauf, Natriumlaurylsulfat (auch als Natriumdodecylsulfat bezeichnet)
B. Alkansulfonsäuresalze: z. B. 1-Decansulfonsäurenatriumsalz
C. Nichtionische Verbindungen: z. B. Verbindungen auf der Basis der Polyoxyethylenether-Strukturen (einschließlich Triton X-100, 114, 405, N-101, die von Sigma Chemical, St. Louis, MO, im Handel erhältlich sind) und verwandte Strukturen; Pluronic- und Tetronic-Tenside (handelsüblich von BASF Chemicals, Mount Olive, N))
D. Alkylierte Phenoxypolyethoxyalkohole: z. B. NP40, Nonidet P40, Igepal, CA630, hydrolysierte/funktionalisierte tierische und pflanzliche Verbindungen einschließlich Tween 80, Tween 20, Octylderivate, Octyl-b-glukosid, Octyl-b-thioglukopyranosid, Desoxycholat und Derivate davon, zwitterionische Verbindungen, 3-([Cholamidopropyl]dimethylammonio)1-propansulfonat (CHAPS), 3-([Cholamidopropyl]dimethylammonio)2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO), erhältlich von Pierce Biotex Company, Rockford, IL.

** Diese Surfactant-Verbindungen können entweder einzeln oder in Gemischen wie Desoxycholat/Triton oder handelsüblichen Gemischen wie Micro-80/90 eingesetzt werden.
Potentielle alternative Vernetzungsmittel:

A. Aldehyde: Formaldehyd, Glutaraldehyd, Paraformaldehyd, Glyceraldehyd, Glyoxalacetaldehyd oder Acrylaldehyd, Dialdehydstärke
B. Epoxide: z. B. jeder der verschiedenen Denacole und ihre einzelnen reaktionsfähigen Spezies einschließlich mono-, di-, tri- und multifunktionalisierte Epoxide
C. Carbodiimide
D. Diisocyanate
E. Fotooxidation

Schritt 4 Zusammensetzen/Herstellen der Prothese
Nach Beendigung der Schritte 1 bis 3 und ungeachtet der Reihenfolge, in der die Schritte 2 und 3 durchgeführt wurden, wird das Gewebe mit einer geeigneten Spüllösung wie etwa isotonischer Kochsalzlösung oder 0,625% Glutaraldehyd gespült. Danach kann das Gewebe in einen Reinraum oder eine aseptische Umgebung verbracht und (erforderlichenfalls) weiter zugerichtet oder geformt und an irgendwelchen nichtbiologischen Komponenten angebracht oder damit zusammengesetzt werden (z. B. Stents, Gerüsten, Nahtringen, Leitungen, Segmenten von Polyesternetz, um ein Durchreißen von Nahtmaterial zu verhindern, usw...), um die gewünschte implantierbare Bioprotheseeinrichtung zu bilden. Beispiele von solchen zusammengesetzten Bioprotheseeinrichtungen umfassen vom Schwein stammende Herzklappen-Bioprothesen (d. h. die mit Stents versehene, vom Schwein stammende Bioprothese von Carpentier-Edwards^TM; Baxter Healthcare CVS Division, Irvine, CA 92714-5686), vom Rinderperikard stammende Herzklappenprothesen (z. B. Carpentier-Edwards^TM Pericardial Bioprosthesis, Baxter Healthcare Corporation, Edwards CVS Division; Irvine, CA 92714-5686), vom Schwein stammende stentlose Aortenprothesen (z. B. Edwards^® PRIMA? Stentless Aortic Bioprosthesis, Baxter Edwards AG, Spierstraße 5, CH-6048, Horn, Schweiz) und biomechanische Ventrikel-Hilfseinrichtungen (z. B. das Novacor-Modell N-100PC; Novacor, Oakland, CA).
Schritt 5: Behandlung, mit Denaturierungsmittel/Surfactant/Vernetzungsmittel (DSV-Behandlung) (fakultativ)
Fakultativ kann die in Schritt 3 beschriebene DSV-Behandlung an diesem Punkt des Prozesses anstelle des dritten Schritts des Prozesses durchgeführt werden. Oder wenn eine solche DSV-Behandlung bereits als dritter Schritt des Prozesses ausgeführt wurde, kann sie an diesem Punkt des Prozesses wiederholt werden (beispielsweise als fünfter Schritt des Prozesses).
Schritt 6: Endsterilisation
Die Bioprothese wird in ein Endsterilisationsmittel getaucht oder damit in Kontakt gebracht und für einen Zeitraum erwärmt, der ausreicht, um die Sterilität der Bioprothese bis zum Zeitpunkt der Implantation zu gewährleisten. Dieser Endsterilisationsvorgang wird bevorzugt in dem hermetischen Behälter oder der hermetischen Verpackung ausgeführt, in der die Bioprothese versandt und bis zum Zeitpunkt der Implantation aufbewahrt wird.
Ein bevorzugtes Endsterilisationsmittel ist 0,2 bis 2,0 Gew.-% Glutaraldehyd, am meisten bevorzugt ungefähr 0,25 Gew.-% Glutaraldehyd, obwohl auch eine DSV-Lösung oder Bestandteile der DSV-Lösung verwendet werden können. Die bevorzugte Endsterilisationsdauer und -temperatur sind 1–6 d bei 37°C oder 1–2 d bei 50°C.
Präparieren einer mit Stent versehenen Perikardklappen-Bioprothese
Es folgt ein Beispiel der Art und Weise, wie eine mit Stent versehene Bioprothese in Form einer Perikard-Herzklappe nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann.

Schritt 1: Ein Rinderherzbeutel wird von einem Schlachthof besorgt, auf Eis gelegt und zu dem Ort transportiert, an dem die Bioprothese hergestellt wird. Dann wird das Gewebe entfettet und zugerichtet.
Schritt 2: Das Gewebe wird mit steriler isotonischer Salzlösung gewaschen und dann für ungefähr 30 min bei Raumtemperatur in eine Lösung von 0,625 Gew.-% Glutaraldehyd getaucht, der mit einem geeigneten Puffer wie etwa Phosphatpuffer auf einen pH von ungefähr 7,4 gepuffert ist. Das resultiert in einer Vernetzung des Collagens, das innerhalb des Gewebes vorhanden ist.
Schritt 3: Das Gewebe wird aus der in Schritt 2 verwendeten Fixierungslösung entnommen und gründlich mit einer wäßrigen Lösung von 0,625 Gew.-% Glutaraldehyd gespült. Einige Zeit danach wird die DSV-Behandlung von Schritt 3 durchgeführt, indem das Gewebe für 2 h bei Umgebungstemperatur in eine DSV-Lösung getaucht wird. Die DSV-Lösung hat die folgende Zusammensetzung: Formaldehyd 4,0 ± 0,4 Gew.-% Ethanol 22 ± 2,2 Gew.-% Tween 80 1,2 ± 0,12 Gew.-%
Schritt 4: Nach Abschluß der DSV-Behandlung von Schritt 3 wird das Gewebe aus der DSV-Lösung entnommen, und Blättchen werden geformt. Danach werden die Blättchen an einem Stent angebracht und daran angenäht. Ferner wird ein von einer Nadel durchstechbarer Nahtring um das Zulaufende der Klappe herum befestigt, um das Annähen der Bioprothese an das Eigengewebe des Wirtspatienten zu erleichtern. Damit ist das Zusammensetzen und die Herstellung der Herzklappen-Bioprothese abgeschlossen.
Schritt 5: Nach Inspektion wird die fertige Klappe erneut einer DSV-Behandlung für 9 h bei 37°C unterzogen.
Schritt 6: Nach Entnahme der Bioprothese aus der DSV-Lösung wird sie in einen Behälter verbracht, der vorher mit wäßriger 0,25% Glutaraldehydlösung befüllt wurde, die mit Natriumhydroxid auf einen pH von 7,4 gepuffert wurde, so daß die Herzklappen-Bioprothese vollständig mit der gepufferten Glutaraldehydlösung bedeckt ist. Dann wird der Behälter dicht verschlossen und in einen Ofen verbracht, in dem er auf eine Endsterilisationstemperatur von 37,5 +2,5°C für 25 bis 27 h erwärmt wird. Dann wird der Behälter auf Raumtemperatur abgekühlt und an das Krankenhaus oder einen anderen Ort versandt, wo er bis zur Implantation der Herzklappen-Bioprothese gelagert wird.

Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Vorteile des oben beschriebenen Verfahrens zur Verringerung der Kalzifizierung und der Verbesserung der Hämokompatibilität zu bewerten. Zuerst wurde das neue Verfahren mit einem Verfahren verglichen, wie es in 2 gezeigt ist, das einen Endsterilisationsschritt nach dem "Zusammensetzen" aufweist, jedoch keine DSV-Zwischenschritte umfaßt. Der Zusammensetzschritt bestand in diesem Fall darin, daß Stücke von fixiertem Gewebe zu Kreisen geschnitten wurden, um subkutan in Tiere implantiert zu werden. Nach einem geeigneten Zeitraum wurden die Gewebe explantiert und auf ihren Kalziumgehalt untersucht, der ein Indikator für die Kalzifizierungsrate ist. Bei einer zweiten Untersuchung wurde das neue Verfahren mit einem in 3 gezeigten Verfahren verglichen, das zwar DSV-Zwischenschritte aufweist, aber keinen Endsterilisationsschritt umfaßt. Die resultierenden Gewebe wurden dann über einen Zeitraum Vollblut ausgesetzt, und die Oberflächen wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop fotografiert, um eine Sichtbestimmung von etwaigen Unterschieden durchzuführen.
In der ersten vergleichenden Untersuchung wurden Kontrollgewebe erzeugt durch herkömmliche Glutaraldehyd-Fixierung in Verbindung mit einem Endsterilisationsschritt, wie oben beschrieben. Bei diesen Tests wurden kreisrunde Gewebestücke, die nach dem neuen Verfahren und nach dem Kontrollverfahren präpariert worden waren, operativ entweder in den subkutanen Raum von Ratten und Kaninchen eingebracht oder in eine Tasche verbracht, die in dem Paravertebralmuskel bei Kaninchen geschaffen wurde. Dreißig Tage nach der Implantation wurden die Gewebe aus dem Wirtsgewebe herausgeschnitten, gespült, und der Kalziumgehalt mittels Atomabsorptions-Spektroskopie bestimmt. Die Untersuchungsergebnisse sind wie folgt:
Bestimmung des Kalziumgehalte durch Atomabsorptions-Spektroskopie Gewebe für dreißig Tage operativ implantiert (μg Ca/mg Gewebe, Trockengewicht)
Es ist ersichtlich, daß Gewebe, das nach dem neuen Verfahren hergestellt ist, eine verminderte Kalzifizierung bei Ratten- und Kaninchen-Implantierungs-Assays zeigt und die Überlegenheit des neuen Gewebeherstellungsverfahrens gegenüber dem Kontrollverfahren demonstriert.
Die zweite Studie zeigt, daß nach dem neuen Verfahren präparierte Gewebe auch eine verminderte Anhaftung von Blutzellen im Vergleich mit einer herkömmlichen Behandlungsmethode zeigen. Das Kontrollverfahren für die zweite Studie ist in 3 zu sehen und umfaßt die herkömmliche Fixierung mit Glutaraldehyd in Verbindung mit DSV-Zwischenschritten. Rasterelektronenmikroskopie wurde angewandt, um den Grad des Anhaftens von Blutzellen zu bestimmen, nachdem gerinnungsgehemmtes menschliches Vollblut Geweben ausgesetzt worden war, die gemäß dem neuen Verfahren präpariert waren, sowie Geweben, die nach dem Kontrollverfahren von 3 präpariert waren. Nachdem die Gewebe für eine Stunde menschlichem Vollblut ausgesetzt waren, wurden sie gespült, bis zum kritischen Punkt getrocknet, leicht mit Gold beschichtet und im SEI-Modus mit einer Beschleunigungsspannung von 5 kV in einem JEOL 6300 Feldemissions-REM abgebildet. Die Ergebnisse sind in den 4 und 5 gezeigt.
4 zeigt eine Abbildung eines repräsentativen Bereichs an den Kontrollgeweben, nachdem diese menschlichem Vollblut in vitro ausgesetzt waren. An der Oberfläche sind zahlreiche anhaftende Zellen und Thrombozyten zu beobachten. 5 zeigt eine Abbildung eines repräsentativen Bereichs an Geweben, die nach dem neuen Verfahren präpariert worden waren, nachdem sie menschlichem Vollblut in vitro ausgesetzt waren. Dabei ist die nahezu vollständige Abwesenheit von anhaftenden Zellen und Thrombozyten an der Oberfläche zu beachten. Diese Abbildungen zeigen die verbesserte Hämokompatibilität (d. h. verminderte Thrombogenizität) des Materials, das unter Anwendung des neuen Verfahrens hergestellt war, im Vergleich mit dem Kontrollverfahren.
Die Erfindung wurde vorstehend nur unter Bezugnahme auf bestimmte derzeit bevorzugte Ausführungsformen oder Beispiele beschrieben, und es wurde nicht versucht, alle möglichen Ausführungsformen oder Beispiele der Erfindung erschöpfend zu beschreiben. Der Fachmann erkennt, daß zahlreiche Modifikationen, Zusätze und Änderungen an den hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen und Beispielen vorgenommen werden können, ohne dabei vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Daher sollen alle derartigen Modifikationen, Zusätze und Änderungen vom Umfang der nachfolgenden Patentansprüche umfaßt sein.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Bioprothese, die Bindegewebsprotein enthält, um die Gefahr einer Kalzifizierung und Thrombogenizität nach der Implantation zu verringern, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a. Vernetzen des Bindegewebsproteins innerhalb des biologischen Gewebes mit einem Fixierungsmittel; b. In-Kontakt-Bringen des biologischen Gewebes mit einem Gemisch aus einem Denaturierungsmittel, einer oberflächenaktiven Substanz und einem Vernetzungsmittel; c. Zusammensetzen der Bioprothese, indem dem biologischen Gewebe jede erforderliche Gestalt gegeben wird und alle nichtbiologischen Komponenten der Prothese an dem biologischen Gewebe angebracht werden; und d. nach Beendigung der Schritte a, b und c, Eintauchen der Bioprothese in eine flüssige Endsterilisationslösung und Erwärmen der Endsterilisationslösung auf eine Temperatur zwischen 37 und 50°C.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in Schritt A verwendete Fixierungsmittel einen Aldehyd aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in Schritt A verwendete Fixierungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. Diisocyanaten, b. Carbodiimiden, c. Fotooxidationsmitteln, und d. Polyepoxyverbindungen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt A aufweist: Eintauchen des biologischen Gewebes in eine Lösung, die 0,2 bis 2,0 Gew.-% Glutaraldehyd enthält, für 0,5 h bis 14 d bei 4 bis 37°C.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt A vor Schritt B ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt B vor Schritt A ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt B nach Schritt C ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt B vor Schritt A und noch einmal vor Schritt C ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt B vor Schritt A und noch einmal nach Schritt C ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt B nach Schritt A und noch einmal nach Schritt C ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt B vor Schritt A, noch einmal nach Schritt A und noch einmal nach Schritt C ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Vernetzungsmittel des in Schritt B verwendeten Gemischs ein Aldehyd ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Denaturierungsmittel des in Schritt B verwendeten Gemischs ein Alkohol ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Denaturierungsmittel des in Schritt B verwendeten Gemischs aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. angesäuerten Ethern; b. Ketonen; c. Fluorchlorkohlenstofflösungsmitteln; d. Glykolen; e. chaotropen Mitteln; und f. Salzlösungen hoher Konzentration.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die oberflächenaktive Substanz des in Schritt B verwendeten Gemischs aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. anionischen oberflächenaktiven Substanzen; b. Alkansulfonsäuresalzen; c. nichtionischen Verbindungen; und d. alkylierten Phenoxypolyethoxyalkoholen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in Schritt B verwendete Gemisch eine DSC-Lösung ist, die folgendes aufweist: a. Formaldehyd 0,1 bis 10,0 Gew.-%; b. Ethanol 1 Gew.-% bis weniger als 60 Gew.-%; und c. Tween 80 0,1 bis 5,0 Gew.-%.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das in Schritt B verwendete Gemisch auf einer Temperatur von mindestens 4°C, aber unter 50°C gehalten wird, während es mit dem biologischen Gewebe in Kontakt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die in Schritt B verwendete DSC-Lösung auf einer Temperatur von mindestens 4°C, aber unter 50°C gehalten wird, während sie mit dem biologischen Gewebe in Kontakt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt B aufweist: a. Eintauchen des biologischen Gewebes in eine Lösung, die enthält: 0,1 bis 10,0 Gew.-% Formaldehyd, 1 Gew.-% bis weniger als 60 Gew.-% Ethanol und 0,1 bis 5,0 Gew.-% einer oberflächenaktiven Substanz; und b. Halten der Lösung auf einer Temperatur von mindestens 4°C, aber unter 50°C für 1 bis 36 h.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in Schritt D verwendete Sterilisationsmittel aus der Gruppe von Sterilisationsmitteln ausgewählt ist, die besteht aus: a. flüssigen Sterilisationsmitteln; und b. einer kontaktlosen Sterilisationsquelle.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt D ferner aufweist: Halten der Temperatur der flüssigen Endsterilisationslösung zwischen 37 und 50°C für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Sterilität der Bioprothese bis zum Zeitpunkt der Implantation sicherzustellen.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei Schritt D in einem hermetisch verschlossenen Behälter ausgeführt wird und ferner aufweist: Zulassen, daß die Bioprothese bis zu dem Zeitpunkt der Implantation in dem hermetisch verschlossenen Behälter bleibt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Endsterilisationslösung eine wäßrige Lösung aus 0,2 bis 2,0 Gew.-% Glutaraldehyd aufweist, der auf einen pH-Wert von ungefähr 7,4 gepuffert ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Endsterilisationslösung eine osmotisch im Gleichgewicht befindliche Salzlösung bei Abwesenheit anderer chemischer Sterilisationsmittel aufweist und wobei die Lösung auf eine Temperatur von mindestens 45°C erwärmt wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Endsterilisationslösung eine osmotisch im Gleichgewicht befindliche Salzlösung in Kombination mit mindestens einem chemischen Sterilisationsmittel aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Endsterilisationslösung mindestens eine Komponente aufweist, die ausgewählt ist aus i) einem Denaturierungsmittel, ii) einer oberflächenaktiven Substanz und iii) einem Vernetzungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt D aufweist: a. Abgeben einer Menge der Endsterilisationslösung in einen Behälter, die 0,2 bis 2,0 Gew.-% Glutaraldehyd aufweist, der auf einen pH-Wert von ungefähr 7,4 gepuffert ist; b. Eintauchen der Bioprothese in die Endsterilisationslösung in dem Behälter; c. hermetisches Verschließen des Behälters; d. Erwärmen des Behälters sowie der darin enthaltenen Endsterilisationslösung und Bioprothese auf eine Temperatur von 37 bis 50°C für 1 bis 6 d; e. Abkühlen des Behälters sowie der darin enthaltenen Endsterilisationslösung und Bioprothese auf Raumtemperatur; und f. Zulassen, daß der Behälter hermetisch verschlossen bleibt, bis die Bioprothese in einen Patienten, der ein Säuger ist, implantiert werden soll.
Bioprothese, die ein biologisches Gewebe mit verringerter Gefahr einer Kalzifizierung und Thrombogenizität nach der Implantation aufweist, das nach einem Verfahren fixiert und sterilisiert worden ist, das die folgenden Schritte aufweist: a. Vernetzen des Bindegewebsproteins innerhalb des biologischen Gewebes mit einem Fixierungsmittel; b. In-Kontakt-Bringen des biologischen Gewebes mit einem Gemisch aus einem Denaturierungsmittel, einer oberflächenaktiven Substanz und einem Vernetzungsmittel; c. Zusammensetzen der Bioprothese, indem dem biologischen Gewebe jede erforderliche Gestalt gegeben und alle nichtbiologischen Komponenten der Prothese an dem biologischen Gewebe angebracht werden; und d. nach Beendigung der Schritte a, b und c, Eintauchen der Bioprothese in eine flüssige Endsterilisationslösung und Erwärmen der Endsterilisationslösung auf eine Temperatur zwischen 37 und 50°C.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei das in Schritt A verwendete Fixierungsmittel einen Aldehyd aufweist.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei das in Schritt A verwendete Aldehyd-Fixierungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. Diisocyanaten, b. Carbodiimiden, c. Fotooxidationsmitteln; und d. Polyepoxyverbindungen.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt A aufweist: Eintauchen des biologischen Gewebes in eine Lösung, die 0,2 bis 2,0 Gew.-% Glutaraldehyd enthält, für 0,5 h bis 14 d bei 4 bis 37°C.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt A vor Schritt B ausgeführt wird.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt B vor Schritt A ausgeführt wird.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt B nach Schritt C ausgeführt wird.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt B vor Schritt A und vor Schritt C ausgeführt wird.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt B vor Schritt A und noch einmal nach Schritt C ausgeführt wird.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt B nach Schritt A und noch einmal nach Schritt C ausgeführt wird.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt B vor Schritt A, noch einmal nach Schritt A und noch einmal nach Schritt C ausgeführt wird.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei das Vernetzungsmittel des in Schritt B verwendeten Gemischs ein Aldehyd ist.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei das Denaturierungsmittel des in Schritt B verwendeten Gemischs ein Alkohol ist.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei das Denaturierungsmittel des in Schritt B verwendeten Gemischs aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. angesäuerten Ethern; b. Ketonen; c. Fluorchlorkohlenstofflösungsmitteln; d. Glykolen; e. chaotropen Mitteln; und f. Salzlösungen hoher Konzentration.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei die oberflächenaktive Substanz des in Schritt B verwendeten Gemischs aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a. anionischen oberflächenaktiven Substanzen; b. Alkansulfonsäuresalzen; c. nichtionischen Verbindungen; und d. alkylierten Phenoxypolyethoxyalkoholen.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei das in Schritt B verwendete Gemisch eine DSC-Lösung ist, die folgendes aufweist: a. Formaldehyd 0,1 bis 10,0 Gew.-%; b. Ethanol 1 Gew.-% bis weniger als 60 Gew.-%; und c. Tween 80^® 0,1 bis 5,0 Gew.-%.
Bioprothese nach Anspruch 43, wobei das in Schritt B verwendete Gemisch auf einer Temperatur von mindestens 4°C, aber unter 50°C gehalten wird, während es mit dem biologischen Gewebe in Kontakt ist.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei das in Schritt B verwendete Gemisch auf einer Temperatur von mindestens 4°C, aber unter 50°C gehalten wird, während es mit dem biologischen Gewebe in Kontakt ist.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt B aufweist: a. Eintauchen des biologischen Gewebes in eine Lösung, die enthält: 0,1 bis 10,0 Gew.-% Formaldehyd, 1 Gew.-% bis weniger als 60 Gew.-% Ethanol und 0,1 bis 5,0 Gew.-% einer oberflächenaktiven Substanz; und b. Halten der Lösung auf einer Temperatur von mindestens 4°C, aber unter 50°C für 1 bis 36 h.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei das in Schritt D verwendete Sterilisationsmittel aus der Gruppe von Sterilisationsmitteln ausgewählt ist, die besteht aus: a. flüssigen Sterilisationsmitteln; und b. einer kontaktlosen Sterilisationsquelle.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt D ferner aufweist: Aufrechterhalten der Temperatur der flüssigen Endsterilisationslösung und Erwärmen der Endsterilisationslösung auf eine Temperatur zwischen 37 und 50°C für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Sterilität der Bioprothese bis zu dem Zeitpunkt der Implantation sicherzustellen.
Bioprothese nach Anspruch 48, wobei Schritt D in einem hermetisch verschlossenen Behälter ausgeführt wird und ferner aufweist: Zulassen, daß die Bioprothese bis zu dem Zeitpunkt der Implantation in dem hermetisch verschlossenen Behälter bleibt.
Bioprothese nach Anspruch 48, wobei die Endsterilisationslösung eine wäßrige Lösung aus 0,2 bis 2,0 Gew.-% Glutaraldehyd aufweist, der auf einen pH-Wert von ungefähr 7,4 gepuffert ist.
Bioprothese nach Anspruch 48, wobei die Endsterilisationslösung eine osmotisch im Gleichgewicht befindliche Salzlösung bei Abwesenheit anderer chemischer Sterilisationsmittel aufweist und wobei die Lösung auf eine Temperatur von mindestens 45°C erwärmt wird.
Bioprothese nach Anspruch 48, wobei die Endsterilisationslösung eine osmotisch im Gleichgewicht befindliche Salzlösung in Kombination mit mindestens einem chemischen Sterilisationsmittel aufweist.
Bioprothese nach Anspruch 48, wobei die Endsterilisationslösung mindestens eine Komponente aufweist, die ausgewählt ist aus i) einem Denaturierungsmittel, ii) einer oberflächenaktiven Substanz und iii) einem Vernetzungsmittel.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt D aufweist: a. Abgeben einer Menge einer Endsterilisationslösung in einen Behälter, die 0,2 bis 2,0 Gew.-% Glutaraldehyd aufweist, der auf einen pH-Wert von ungefähr 7,4 gepuffert ist; b. Eintauchen der Bioprothese in die Endsterilisationslösung in dem Behälter; c. hermetisches Verschließen des Behälters; d. Erwärmen des Behälters sowie der darin enthaltenen Endsterilisationslösung und Bioprothese auf eine Temperatur von 37 bis 50°C für 1 bis 6 d; e. Abkühlen des Behälters sowie der darin enthaltenen Endsterilisationslösung und Bioprothese auf Raumtemperatur; und f. Zufassen, daß der Behälter hermetisch verschlossen bleibt, bis die Bioprothese in einen Patienten, der ein Säuger ist, implantiert werden soll.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt B vor Schritt C ausgeführt wird, und wobei Schritt B dann zwischen den Schritten C und D wiederholt wird.
Bioprothese nach Anspruch 28, wobei Schritt B vor Schritt C ausgeführt wird, und wobei Schritt B dann zwischen den Schritten C und D wiederholt wird.