DE69909972T2 - Vorrichtung zur durchführung chemischer und biochemischer reaktionen unter anwendung von photoerzeugten reagenzien - Google Patents

Vorrichtung zur durchführung chemischer und biochemischer reaktionen unter anwendung von photoerzeugten reagenzien Download PDF

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    • G03F7/00—Photomechanical, e.g. photolithographic, production of textured or patterned surfaces, e.g. printing surfaces; Materials therefor, e.g. comprising photoresists; Apparatus specially adapted therefor

Description

  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der chemischen und biochemischen Reaktionen. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung die Parallelsynthese und -bestimmung mehrerer organischer und bioorganischer Moleküle auf einer Substratoberfläche entsprechend einem vorbestimmten räumlichen Verteilungsmuster. Die Verfahren und Vorrichtung der vorliegenden Erfindung sind zum Herstellen und Bestimmen von Arrays mit hohen Dichten von DNS- und RNS-Oligonukleotiden, Peptiden, Oligosacchariden, Phospholipiden und anderen Biopolymeren und biologischen Proben auf einer Substratoberfläche nützlich.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Die Entwicklung der modernen Medizin, Landwirtschaft und Werkstoffen stellt enorme Anforderungen an den technologischen und methodologischen Fortschritt, das Durchmustern von Proben bei der chemischen und biologischen Analyse zu beschleunigen. Die Entwicklung von Parallelverfahren in einem Mikromaßstab ist für den Fortschritt entscheidend. Viele Fortschritte sind unter Benutzung der Parallelsynthese, des roboterisierten punktförmigen Probenauftragens, des Tintenstrahldruckens und der Mikrofluidik (Marshall et al., Nature Biotech. 16, 27–31 (1998)) in diesem Bereich gemacht worden. Fortgesetzte Bemühungen um zuverlässigere, flexible, schnellere und billige Technologien werden angestrebt.
  • Für Durchmusterungsanwendungen mit hohem Durchsatz ist die Benutzung von Molekülmikroarray-Chips (MMA-Chips), speziell Biochips, die Arrays von sehr hoher Dichte von Biopolymeren enthalten, die auf festen Oberflächen immobilisiert sind, ein viel versprechender Ansatz.
  • Diese Biochips werden zu leistungsstarken Werkzeugen zum Erforschen von molekulargenetischen und Sequenzinformationen (Marshall et al., Nature Biotechn. 16, 27–31 (1998) und Ramsay, Nature Biotech. 16, 40–44 (1998)). Zum Bestimmen von Nukleotidsequenzen, Sondieren vielfacher Wechselwirkungen von Nukleinsäuren, Identifizieren von Genmutationen, Überwachen der Genexpression und zum Erfassen von Krankheitserregern sind Zielmoleküle zu DNS-Oligonukleotiden und cDNS-Sonden auf Biochips hybridisiert worden; Schena, et al., Science 270, 467–460 (1995); Lockhart et al., Nature Biotech. 14, 1675–1680; Weiler, Nucleic Acids Res. 25, 2792–2799 (1997); de Saizieu et al., Nature Biotech. 16, 45–48; Drmanc et al., Nature Biotech. 16, 54–58. Die kontinuierliche Entwicklung der Biochiptechnologie wird eine bedeutende Auswirkung auf den Gebieten der Biologie, Medizin und klinischen Diagnose haben.
  • Zu der Biochipherstellung des Standes der Technik gehört die direkt auf dem Chip erfolgende Synthese (Erzeugen von mehreren Sequenzen auf einmal) unter Benutzung von Tintenstrahlen, die direkt auf dem Chip erfolgende Parallelsynthese (Erzeugen des gesamten Arrays von Sequenzen gleichzeitig) unter Benutzung der Photolithographie und die Immobilisierung einer Bibliothek von vorsynthetisierten Molekülen unter Benutzung von roboterisiertem punktförmigem Probenauftragen (Ramsay, Nature Biotechn. 16, 40–44 (1998)). Die lichtgesteuerte Parallelsynthese auf dem Chip ist bei der Herstellung von Oligonukleotid-Arrays mit hohen Dichten mit bis zu einer Millionen Sequenzen auf einem einzigen Chip benutzt worden.
  • Zwei Hauptverfahren sind offenbart worden: die Synthese unter Benutzung von Monomeren, die durch photochemisch labile Gruppen geschützt sind (Pirrung et al., US-Patentschrift Nr. 5,143,854 (1992); Fodor et al., US-Patentschrift Nr. 5,424,186 (1995)), und die Synthese unter Benutzung der Chemie der chemischen Ver stärkung (Beecher et al., PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 98/20967 (1997)). Beide Verfahren beziehen die wiederholten Schritte der Entschützung, des Monomerkoppelns, der Oxidation und des Verkappens ein. Photomasken werden benutzt, um eine selektive Lichtexposition in vorbestimmten Gebieten einer festen Substratoberfläche, auf der Oligonukleotid-Arrays synthetisiert werden, zu erreichen.
  • Für das Syntheseverfahren, an dem photochemisch labile Schutzgruppen beteiligt sind, werden die photochemisch labilen Schutzgruppen von wachsenden Oligonukleotidmolekülen in belichteten Oberflächengebieten abgespalten, während die Schutzgruppen in Oligonukleotidmolekülen in nicht belichteten Oberflächengebieten nicht angegriffen werden. Die Substratoberfläche wird anschließend mit einer Lösung in Berührung gebracht, die Monomere enthält, die ein ungeschütztes erstes reaktionsfähiges Zentrum und ein zweites reaktionsfähiges Zentrum aufweisen, das durch eine photochemisch labile Schutzgruppe geschützt ist. In den belichteten Oberflächengebieten koppeln die Monomere über das ungeschützte erste reaktionsfähige Zentrum mit den entschützten Oligonukleotidmolekülen. In den nicht belichteten Oberflächengebieten bleiben die Oligonukleotide jedoch durch die photochemisch labilen Schutzgruppen geschützt, und daher findet keine Kopplungsreaktion statt. Die resultierenden Oligonukleotidmoleküle sind nach dem Koppeln durch photochemisch labile Schutzgruppen an dem zweiten reaktionsfähigen Zentrum des Monomers geschützt. Daher kann die obige photochemisch aktivierte Kettenfortpflanzungsreaktion fortgesetzt werden, bis alle gewünschten Oligonukleotide synthetisiert sind.
  • Für das Syntheseverfahren, das die Chemie der chemischen Verstärkung einbezieht, wird eine ebenere Substratoberfläche mit Oligonukleotidmolekülen (durch geeignete Verknüpfer) verknüpft und mit einer dünnen (einige Mikrometer) Polymer- oder Photoresistschicht oben auf den Oligonukleotidmolekülen beschichtet. Das freie Ende jedes Oligonukleotidmoleküls ist mit einer säurelabilen Gruppe geschützt. Die Polymer-/Photoresistschicht enthält einen Photosäurevorläufer und einen Ester (einen Verstärker), der in der Gegenwart von H+ dissoziiert und eine Säure bildet. Während eines Syntheseverfahrens werden in belichteten Oberflächengebieten innerhalb der Polymer-/Photoresistschicht Säuren erzeugt und säurelabile Schutzgruppen an den Enden der Oligonukleotidmoleküle werden abgespalten. Die Polymer-/Photoresistschicht wird dann unter Benutzung eines Lösemittels oder einer Ablöselösung abgelöst, um die darunter befindlichen Oligonukleotidmoleküle zu exponieren. Die Substratoberfläche wird dann mit einer Lösung in Berührung gebracht, die Monomere enthält, die ein reaktionsfähiges Zentrum besitzen, das durch eine säurelabile Schutzgruppe geschützt ist. Nur in den belichteten Gebieten koppeln die Monomere über das ungeschützte erste reaktionsfähige Zentrum mit den entschützten Oligonukleotidmolekülen. In den nicht belichteten Gebieten besitzen die Oligonukleotidmoleküle ihre Schutzgruppen noch und nehmen daher an der Kopplungsreaktion nicht teil. Das Substrat wird dann wieder mit einem Polymer/Photoresist beschichtet, der einen Photosäurevorläufer enthält. Die Belichtungs-, Entschützungs-, Kopplungs- und Polymer-/Photoresistbeschichtungsschritte werden wiederholt, bis die gewünschten Oligonukleotide erhalten sind.
  • Das Verfahren, das photochemisch labile Schutzgruppen einbezieht, weist bedeutende Nachteile auf: (a) Die benutzte Chemie ist nicht herkömmlich, und das gesamte Verfahren ist äußerst kompliziert, und (b) die Technik leidet unter geringer Sequenztreue aufgrund von chemischen Komplikationen.
  • Das Verfahren unter Benutzung der Chemie der chemischen Verstärkung weist ebenfalls Einschränkungen auf: (a) Das Verfahren erfordert die Aufbringung einer Polymer-/Photoresistschicht und ist für Reaktionen, die in Lösungen durchgeführt werden, die routinemäßig bei chemischen und biochemischen Reaktionen benutzt werden, nicht geeignet, da keine Maßnahme getroffen ist, um die Reaktionsstellen auf einer festen Oberfläche zu trennen; (b) unter bestimmten Umständen verursachen zersetzende chemische Bedingungen, die zum vorherigen und nachherigen Erhitzen und Ablösen der Polymer-/Photoresistschicht erforderlich sind, den Abbau von Oligonukleotiden auf festen Oberflächen; (c) das gesamte Verfahren ist aufgrund der Notwendigkeit vieler Kreisläufe (bis zu 80 Kreisläufe, wenn 20mere synthetisiert werden!) des Photoresistbeschichtens, Erhitzens, Ausrichtens, Lichterposition und Ablösens arbeitsintensiv und schwierig zu automatisieren; (d) das Verfahren ist auf einen weiten Bereich biochemischer Reaktionen oder biologischer Proben, auf die ein photochemisch erzeugtes Reagens angewandt wird, nicht anwendbar, da das Einbetten biologischer Proben in eine Polymer-/Photoresistschicht dies verbieten kann.
  • Zusätzliche Einschränkungen sind mit der Benutzung von Photomasken bei den beiden obigen Verfahren verknüpft: (a) Das Einrichten zum Herstellen eines neuen Chips ist aufgrund der großen Zahl von Photomasken, die hergestellt werden müssen, sehr kostspielig; (b) die Photolithographieausrüstung ist kostspielig und daher vielen interessierten Anwendern nicht zugänglich; (c) die Photolithographieverfahren müssen in einer kostspieligen Reinraumanlage durchgeführt werden und erfordern ausgebildetes technisches Personal; (d) das gesamte Verfahren ist kompliziert und schwierig zu automatisieren. Diese Beschränkungen untergraben die Anwendung von Oligonukleotid-Chips und die Entwicklung der verschiedenen MMA-Chips.
  • Daher besteht eine wirkliche Notwendigkeit für die Entwicklung chemischer Verfahren und Synthesevorrichtungen, die einfach, vielseitig, kosteneffizient, leicht bedienbar sind und die Molekülarrays mit verbesserter Reinheit hervorbringen können.
  • WO-A-9 739 151 offenbart die Benutzung photolithographischer Techniken, um auf einem Substrat ein gewünschtes Lichtmuster zu erzeugen. Eine photolithographische Maske ist zwischen der Lichtquelle und dem Substrat eingefügt.
  • WO-A-9 302 992 offenbart das nacheinander erfolgende Abtasten durch einen drehbaren Spiegel. Ein Laserstrahl streicht über die Oberfläche eines Trägers, und dieser Träger wird immer weiter vorgeschoben.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, stellt Vorrichtungen zum Durchführen von chemischen und biochemischen Reaktionen in Lösungen unter Benutzung von in situ erzeugten Photoprodukten als Reagenzien oder Co-Reagenzien bereit. Diese Reaktionen werden durch Bestrahlung, wie z. B. mit UV- oder sichtbarem Licht, gesteuert. Sofern nicht anders angegeben, erfolgen alle hier beschriebenen Reaktionen in Lösungen aus mindestens einem gemeinsamen Lösemittel oder einer Mischung aus mehr als einem Lösemittel. Das Lösemittel kann jedes beliebige gewöhnliche Lösemittel sein, das herkömmlicherweise bei der chemischen Reaktion eingesetzt wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf solche Lösemittel wie CH2Cl2, CH3CN, Toluol, Hexan, CH3OH, H2O und/oder eine wässrige Lösung, die mindestens einen hinzugefügten gelösten Stoff, wie z. B. NaCl, MgCl2, Phosphatsalze usw., enthält. Die Lösung ist innerhalb definierter Gebiete auf einer festen Oberfläche enthalten, die einen Array von Reaktionsstellen enthält. Nach dem Aufbringen einer Lösung, die mindestens einen Vorläufer eines photochemisch erzeugten Reagenzes (PGR) (Verbindungen, die bei Bestrahlung mindestens ein Zwischenprodukt oder ein Produkt bilden) enthält, auf die feste Oberfläche, gefolgt vom Projizieren eines Lichtmusters durch einen digitalen Sichtanzeigenprojektor auf die feste Oberfläche, bildet sich an belichteten Stellen PGR; an dunklen (d. h. nicht belichteten) Stellen erfolgt keine Reaktion. Das PGR verändert die Reaktionsbedingungen und kann nach Wunsch in seinem begrenzten Gebiet weitere Reaktionen durchlaufen. Daher kann bei Gegenwart mindestens eines photochemisch erzeugten Reagenzes (PGR) mindestens ein Schritt einer Mehrschrittreaktion an einer spezifischen Stelle auf der festen Oberfläche durch Strahlung, wie z. B. Bestrahlung durch Licht, gesteuert werden. Folglich besitzt die vorliegende Erfindung ein großes Potential bei den Anwendungen von Parallelreaktionen, wobei in jedem Schritt der Reaktion nur ausgewählte Stellen in einer Matrix oder einen Array von Stellen zu reagieren ermöglicht wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zum Durchführen der oben beschriebenen lichtgesteuerten Reaktionen bereit. Eine der Anwendungen des Gerätes ist es, Reaktionen auf einer festen Oberfläche, die mehrere isolierte Reaktionsstellen enthält, wie z. B. Behälter (der Reaktor), zu steuern. Die Lichtmuster zum Bewirken der Reaktionen werden unter Benutzung eines Computers und eines digitalen optischen Projektors (dem optischen Baustein) erzeugt. Zu einem Muster gebildetes Licht wird auf spezifische Stellen in dem Reaktor projiziert, an denen lichtgesteuerte Reaktionen erfolgen.
  • Eine der Anwendungen der vorliegenden Erfindung stellt die In-situ-Erzeugung von chemischen/biochemischen Reagenzien bereit, die in den anschließend erfolgenden chemischen und biochemischen Reaktionen an bestimmten ausgewählten Stellen unter den vielen möglichen vorhandenen Stellen benutzt werden. Ein Gesichtspunkt der Erfindung ist es, durch die photochemische Erzeugung von Säuren oder Basen in einer kontrollierten Weise den pH der Lösung zu ändern. Die pH-Bedingungen ausgewählter Proben können durch die Menge an vorhandenen photochemisch erzeugten Säuren oder Basen gesteuert werden. Die Änderungen der pH-Bedingungen bewirken chemische oder biochemische Reaktionen, wie z. B. durch Aktivieren von Enzymen und Herbeiführen von Kopplungen und Vernetzung durch Bildung kovalenter oder nichtkovalenter Bindungen zwischen Ligandenmolekülen und ihren entsprechenden Rezeptoren.
  • Unter anderen Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung wirken die photochemisch erzeugten Reagenzien selbst als bindende Moleküle, die mit anderen Molekülen in der Lösung wechselwirken können. Die Konzentration der bindenden Moleküle wird durch die Dosis der Lichtbestrahlung bestimmt, und somit kann die Ligandenbindungsaffinität und -spezifizität in mehr als einem System parallel untersucht werden. Daher ermöglicht die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, mehrere Verfahren gleichzeitig zu untersuchen und/oder zu überwachen und chemische, biochemische und biologische Proben mit hohem Durchsatz zu durchmustern.
  • Ein weiterer wichtiger Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Parallelsynthese von Biopolymeren, wie z. B. Oligonukleotiden und Peptiden, wobei das Verfahren und das Gerät der vorliegenden Erfindung zur selektiven Entschützung oder für Kopplungsreaktionen benutzt werden. Diese Reaktionen erlauben die gesteuerte Herstellung von verschiedenen Biopolymeren auf festen Oberflächen. Diese molekularen Mikroarray-Chips (MMA-Chips) werden in einer Reihe von Gebieten benutzt, wie z. B. der funktionellen Genomanalyse, der Diagnose, Therapeutik und genetischen Landwirtschaft und zum Erfassen und Analysieren von Gensequenzen und deren Wechselwirkungen mit anderen Molekülen, wie z. B. Antibiotika, Antitumormitteln, Oligosacchariden und Proteinen. Diese und andere Gesichtspunkte zeigen die Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung auf. Weitere Einzelheiten werden durch Bezugnahme auf die verbleibenden Abschnitte der Beschreibung und der angefügten Skizzen deutlich gemacht.
  • Bei der optischen Mustererzeugung bei der Biochip-Herstellung des Standes der Technik werden normale lithographische Werkzeuge auf Basis von Photomasken benutzt, Karl et al., US-Patentschrift Nr. 5,593,839 (1997). Im Allgemeinen vergrößern sich die Zahl und die Musterkomplexität der Masken, wenn sich die Länge und Vielfalt an Oligomeren vergrößert. Z. B. sind 4 × 12 = 48 Masken erforderlich, um einen Teilsatz von Dodecanukleotiden zu synthetisieren, und diese Zahl kann in Abhängigkeit von der Auswahl des kundenspezifischen Chips noch größer sein. Um einen neuen Satz an Sequenzen herzustellen, muss ein neuer Satz von Masken angefertigt werden. Kritischer ist die Hochpräzisionsausrichtung (Auflösung in der Größenordnung von < 10 μm) aufeinander folgender Photomasken, eine Aufgabe, die ohne spezielle Ausrüstung und technisches Fachwissen unmöglich zu lösen ist. Die Technik ist nur halbautomatisch, und das Verfahren ist eindeutig unflexibel und kostspielig. Außerdem erfordert das Verfahren zur Photomaskenherstellung kostspielige Reinraumanlagen und spezielles technisches Fachwissen auf dem Gebiet der Mikroelektronik. Daher ist das gesamte Chip-Herstellungsverfahren für die meisten der Forschungsgemeinschaft nicht zugänglich.
  • Die vorliegende Erfindung ersetzt die Photomasken durch einen computergesteuerten räumlichen optischen Wandler, so dass Lichtmuster für die Photolithographie durch einen Computer in derselben Weise erzeugt werden können, in der er Schwarzweißbilder auf einem Computerbildschirm anzeigt. Diese Abänderung stellt ein Höchst maß an Flexibilität zum Synthetisieren jedes wünschenswerten Sequenzarrays bereit und vereinfacht das Herstellungsverfahren, indem sie die Notwendigkeit des Durchführens von Maskenausrichtung wie bei der herkömmlichen Photolithographie, das zeitraubend und für Ausrichtungsfehler anfällig ist, beseitigt. Außerdem sind sowohl das optische System als auch das Reaktorsystem der vorliegenden Erfindung kompakt und können in ein Tischgehäuse eingebaut werden. Ein derartiges Gerät kann durch einen Personalcomputer vollständig gesteuert werden, so dass jeder Laborchemiker Biochips mit seinem eigenen Sequenzentwurf auf eine Weise herstellen kann, die der Biooligomersynthese unter Benutzung eines Synthesizers ähnlich ist. Zudem kann das Gerät in jedem normalen chemischen Labor ohne die Notwendigkeit eines Reinraums betrieben werden. Die vorliegende Erfindung kann auch in einfacher Weise übernommen werden, um die Herstellung großer Mengen normaler Biochips oder eine festgelegte Anzahl von speziellen Biochips durch automatisierte Fertigungslinien zu rationalisieren. Es ist offensichtlich, dass durch das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung die Kosten zum Herstellen von Biochips bedeutend verringert werden können und daher die Zugänglichkeit der Biochip-Technologie für Forschungs- und biomedizinische Gemeinschaften bedeutend verbessert werden kann.
  • Von größter Bedeutung ist, dass die Benutzung von photochemisch erzeugten Reagenzien in Verbindung mit einem computergesteuerten räumlichen optischen Wandler die MMA-Chip-Herstellung zu einem Routineverfahren macht, das die Beschränkungen der Verfahren des Standes der Technik überwindet.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER SKIZZEN
  • Die 1 ist eine Skizze der Oligonukleotidsynthese unter Benutzung von photochemisch erzeugten Säuren.
    L – Verknüpfergruppe; Pa – säurelabile Schutzgruppe;
    H+ – photochemisch erzeugte Säure; T, A, C und
    G – Nukleotidphosphoramiditmonomere;
    bν – Lichtexposition.
  • Die 2 ist eine Skizze des Entschützungsverfahrens unter Benutzung von photochemisch erzeugten Säuren bei der Oligonukleotidsynthese.
  • Die 3 ist eine Skizze der Oligonukleotidsynthese unter Benutzung von photochemisch erzeugten Reagenzien. Das Verfahren ist dasselbe wie dasjenige, das in der 1 gezeigt ist, mit der Ausnahme, dass ein photochemisch erzeugter Aktivator, wie z. B. Dimethoxybenzoinyltetrazol, benutzt wird, während der Entschützungsschritt unter Benutzung einer herkömmlichen Säure ausgeführt wird.
  • Die 4 ist eine Skizze der Aminosäure-Entschützung unter Benutzung von photochemisch erzeugten Säuren oder photochemisch erzeugten Basen; Boc = Butyloxycarbonyl; Fmoc = Fluorenylmethyloxycarbonyl.
  • Die 5 ist eine Skizze der Peptidsynthese unter Benutzung von photochemisch erzeugten Säuren; L – Verknüpfergruppe; Pa – säurelabile Schutzgruppe; F, Q, D, Y, S und A – typische Boc-geschützte Aminosäuren; bν – Lichtexposition.
  • Die 6 ist eine Skizze der Peptidsynthese unter Benutzung von photochemisch erzeugten Basen; L – Verknüpfergruppe; Pb – baselabile Schutzgruppe; F, Q, D, Y, S und A – typische Fmoc-geschützte Aminosäuren; bν – Lichtexposition.
  • Die 7 ist eine Skizze der Kohlenhydratsynthese unter Benutzung von sowohl photochemisch erzeugten Säuren als auch photochemisch erzeugten Basen in verschiedenen der Reaktionsschritte.
  • Die 8A ist eine Prinzipabbildung der Synthesevorrichtung, bei der ein Mikrospiegel-Array-Wandler benutzt wird.
  • Die 8B ist eine Prinzipabbildung der Synthesevorrichtung, bei der ein reflektierender LCD-Array-Wandler benutzt wird.
  • Die 8C ist eine Prinzipabbildung der Synthesevorrichtung, bei der ein durchlässiger LCD-Array-Wandler benutzt wird.
  • Die 9A veranschaulicht einen Isolierungsmechanismus, bei dem Mikrobehälterstrukturen auf einem Boden benutzt werden.
  • Die 9B veranschaulicht einen Isolierungsmechanismus, bei dem Mikrobehälterstrukturen auf einem Substrat benutzt werden.
  • Die 9C veranschaulicht einen Isolierungsmechanismus, bei dem eine gemusterte, nichtnetzende, dünne Schicht auf einem Substrat benutzt wird.
  • Die 10 ist eine auseinander gezogene Prinzipskizze einer Reaktorkassette und eine vergrößerte Ansicht von Reaktionsbehältern.
  • Die 11A ist eine Prinzipabbildung der Entschützungsreaktion in einem teilweise maskierten Reaktionsbehälter.
  • Die 11B ist eine Prinzipabbildung der Entschützungsreaktion, wobei ein Reaktionsbehälter teilweise freigelegt ist.
  • Die 12 veranschaulicht einen Schrittmechanismus für die Parallelsynthese mehrerer Arrays.
  • Die 13A veranschaulicht ein Herstellungsverfahren zum Herstellen von Mikrobehältern auf einem flachen Substrat.
  • Die 13B ist ein vergrößertes Foto von Mikrobehältern in einem Glassubstrat.
  • Die 14A veranschaulicht ein Herstellungsverfahren zum Herstellen eines Musters in einer nichtnetzenden dünnen Schicht auf einem flachen Substrat.
  • Die 14B ist ein vergrößertes Foto von Methanoltröpfchen, die auf einer Glasoberfläche gebildet sind, die Muster einer nichtnetzenden dünnen Schicht enthält.
  • Die 15 ist ein Fluoreszenzbild von mit Fluorescein markiertem Thymin, das auf einer Glasplatte, die mit einer nichtnetzenden dünnen Schicht gemustert ist, gewachsen ist.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Verfahren für chemische/biochemische Reaktionen unter Benutzung von photochemisch erzeugten Reagenzien (PGR) Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung für auf Lösungen basierende photochemische Reaktionen, an denen Reagenzien, die durch Bestrahlung in situ erzeugt werden, beteiligt sind. Eine herkömmliche chemische/biochemische Reaktion erfolgt zwischen mindestens einem Reaktionsteilnehmer (allgemein als „A" gekennzeichnet) und mindestens einem Reagens (allgemein als „R" gekennzeichnet), um mindestens ein Produkt zu ergeben, wie unten dargestellt: A + R → A' + R'
  • Die vorliegende Erfindung soll Reaktionsbedingungen bereitstellen, die durch Bestrahlung mit Licht gesteuert werden. Das R in der obigen Reaktion ist vor wiegend photochemisch erzeugt. Das photochemisch erzeugte Reagens (PGR) wirkt in derselben Weise wie ein Reagens, das herkömmlicherweise benutzt wird, und somit erfolgt die Reaktion in einer im Übrigen herkömmlichen Weise. Die photochemisch gesteuerte Gesamtreaktion ist unten dargestellt:
    Figure 00140001
  • In einigen Ausführungsformen sind die PGR-Vorläufer (Tabelle 1) Vorläufer photochemisch erzeugter Säuren, die H+ ergeben, in der Form von R1CO2H, R1PO3H, R1SO3H, H+X– (R1 = H, Alkyl (C1–C12) , Aryl (aromatische Strukturen, die Phenyl enthalten) oder deren substituierte Derivate (Substitutionen = Halogenatome, NO2, CN, OH, CF3, C(O)H, C(O)CH3, C(O)R2, SO2CH3, SO2R2, OCH3, OR2, NH2, NHR2, NR2R3 (R2 und R3 = Alkyl oder Aryl (C1–C12); X = Halogenatome, Ionen anorganischer Salze oder dergleichen. Photochemisch erzeugte Säuren sind auch Komplexe, wie z. B. MmXn (Lewis-Säuren, m und n sind die Anzahl von Atomen), die bei Bestrahlung gebildet werden. In anderen Ausführungsformen sind die PGR-Vorläufer (Tabelle 1) Vorläufer photochemisch erzeugter Basen, die bei Bestrahlung eine Base ergeben, wie z. B. ein Amin, ein Oxid oder dergleichen. Tabelle 1A – Beispiele für Vorläufer photochemisch erzeugter Reagenzien und ihre Produkte
    Figure 00140002
    Figure 00150001
    Figure 00160001
    Figure 00170001
    Figure 00180001
    Figure 00190001
    Figure 00200001
    N(R2)2 (R2 = Alkyl; immer wenn es in der Formel erscheint, kann es dasselbe oder verschieden sein) gehören, aber nicht auf diese beschränkt sind.
  • In einigen Ausführungsformen werden PGR-Vorläufer in Verbindung mit Co-Reagenzien, wie z. B. Strahlungssensibilisatoren, benutzt. Ein spezifisches Beispiel ist die Benutzung von Photosensibilisatoren, die Verbindungen mit geringeren Anregungsenergien als die benutzten PGR sind. Die Bestrahlung regt Photosensibilisatoren an, die wiederum die Umwandlung von PGR-Vorläufern in PGR auslösen. Die Wirkung des Photosensibilisators ist es, die Anregungswellenlänge, die bei photochemischen Reaktionen benutzt wird, zu verschieben und die Effizienz der Bildung von photochemisch erzeugten Reagenzien zu erhöhen. Demgemäß werden in einer Ausführungsform Photosensibilisatoren, aber nicht eingeschränkt auf diese, als Co-Reagenzien in PGR-Reaktionen benutzt. Viele Strahlungssensibilisatoren sind dem Fachmann bekannt, und zu ihnen gehören die vorstehend erwähnten. Es versteht sich, dass ein Durchschnittsfachmann in der Lage sein wird, auf der Grundlage der vorliegenden Offenbarung leicht zusätzliche Strahlungssensibilisatoren zu identifizieren.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Substratoberfläche fest und im Wesentlichen flach. Als nicht einschränkende Beispiele kann das Substrat ein Typ von Silikat, wie z. B. Glas, Pyrex oder Quarz, ein Typ von Polymermaterial, wie z. B. Propylen oder Polyethylen und dergleichen sein. Die Substratoberflächen werden für Anwendungen der vorliegenden Erfindung angefertigt und derivatisiert.
  • Entschützung durch photochemisch erzeugte Säure (PGA) und Oligonukleotidsynthese Gemäß einer Anwendung der vorliegenden Erfindung (Figur 1 und 2) werden Verknüpfermoleküle an einer Substratoberfläche befestigt, auf der Oligonukleotidsequenzarrays synthetisiert werden sollen (der Verknüpfer ist eine „Initiierungsgruppierung", ein Ausdruck, der im weiten Sinne auch Monomere oder Oligomere, an die ein weiteres Monomer angefügt werden kann, einschließt). Die Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden sind bekannt, McBride et al., Tetrahedron Letter 24, 245–248 (1983). Jedes Verknüpfermolekül enthält eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe, wie z. B. 5'-OH, die durch eine säurelabile Schutzgruppe geschützt ist 100. Dann werden ein Photosäurevorläufer oder ein Photosäurevorläufer und sein Photosensibilisator (Tabelle 1) auf das Substrat aufgebracht. Ein vorbestimmtes Lichtmuster wird dann auf die Substratoberfläche projiziert 110. An den belichteten Stellen werden Säuren erzeugt, welche die Abspaltung der säurelabilen Schutzgruppe (wie z. B. DMT) von dem 5'-OH verursachen, und die endständigen OH-Gruppen sind frei, um mit ankommenden Monomeren zu reagieren (2, „Monomere", wie im folgenden benutzt, sind im weiten Sinne als chemische Einheiten definiert, die, wie durch chemische Strukturen definiert, Monomere oder Oligomere oder deren Derivate sein können.). An den dunklen (d. h. nicht belichteten) Stellen wird keine Säure gebildet, und deshalb bleiben die säurelabilen Schutzgruppen der Verknüpfermoleküle unversehrt (ein Verfahren zum Verhindern der H+-Diffusion zwischen benachbarten Stellen wird später beschrieben). Dann wird die Substratoberfläche gewaschen und anschließend mit dem ersten Monomer (z. B. einem Nukleophosphoramidit, einem Nukleophosphonat oder einer analogen Verbindung, die zu Kettenwachstum in der Lage ist) in Berührung gebracht, das sich unter herkömmlichen Kopplungsreaktionsbedingungen nur an die entschützten Verknüpfermoleküle anlagert 120. Somit ist eine chemische Bindung zwischen den OH-Gruppen der Verknüpfermoleküle und einer ungeschützten reaktionsfähigen Stelle (z. B. Phosphor) der Monomere, z. B. eine Phosphitverknüpfung, gebildet. Nach den sachgemäßen Wasch-, Oxidations- und Verkappungsschritten ist die Addition des ersten Restes abgeschlossen.
  • Das angefügte Nukleotidmonomer enthält ebenfalls eine reaktionsfähige funktionelle endständige Gruppe, die durch eine säurelabile Gruppe geschützt ist. Das Substrat, welches das Array wachsender Sequenzen enthält, wird dann mit einer zweiten Ladung eines Photosäurevorläufers versorgt und einem zweiten vorbestimmten Lichtmuster ausgesetzt 130. Die ausgewählten Sequenzen werden entschützt, und das Substrat wird gewaschen und anschließend mit dem zweiten Monomer versorgt. Wiederum pflanzt sich das zweite Monomer nur an den Oberflächenstellen, die dem Licht ausgesetzt wurden, am entstehenden Oligomer fort. Der zweite Rest, der an die wachsenden Sequenzen angefügt wurde, enthält ebenfalls eine reaktionsfähige funktionelle endständige Gruppe, die durch eine säurelabile Gruppe geschützt ist 140. Dieser Kettenfortpflanzungsvorgang wird wiederholt, bis an allen ausgewählten Oberflächenstellen Polymere von gewünschten Längen und gewünschten chemischen Sequenzen gebildet sind 150. Für einen Chip, der ein Oligonukleotid-Array jedes beliebigen festgelegten Sequenzmusters enthält, ist die Höchstzahl an Reaktionsschritten 4 × n, wobei n die Kettenlänge ist und 4 eine Konstante für natürliche Nukleotide ist. Arrays, die modifizierte Sequenzen enthalten, können mehr als 4 × n Schritte erfordern.
  • PGA-aktivierte Kopplungsreaktion und Oligonukleotidsynthese
  • Einer anderen Ausführungsform (3) gemäß wird ein Photoaktivatorvorläufer benutzt, wie z. B. eine Verbindung, die Tetrazol mit einer photochemisch labilen Gruppe verknüpft enthält. Die Verknüpfermoleküle sind auf einer Substratoberfläche befestigt, auf der Oligonukleotidsequenzarrays synthetisiert werden sollen 300.
  • Die säurelabilen Schutzgruppen an den Verknüpfern werden entfernt 310. Dann werden ein Photoaktivatorvorläufer oder ein Photoaktivatorvorläufer und sein Photosensibilisator (Tabelle 1) auf das Substrat aufgebracht. Ein vorbestimmtes Lichtmuster wird dann auf die Substratoberfläche projiziert 320. An den belichteten Stellen werden Aktivatormoleküle erzeugt und Monomere werden an den Verknüpfer angekoppelt. An den nicht belichteten Stellen werden keine Aktivatormoleküle erzeugt, und deshalb erfolgt keine Reaktion (ein Verfahren zum Verhindern der Aktivatordiffusion zwischen benachbarten Stellen wird später beschrieben). Nach den sachgemäßen Wasch-, Oxidations- und Verkappungsschritten ist die Addition des ersten Restes abgeschlossen.
  • Das angefügte Nukleotidmonomer enthält ebenfalls eine geschützte funktionelle endständige Gruppe. Das Substrat, welches das Array wachsender Sequenzen enthält, wird dann mit einer zweiten Ladung an Säure in Berührung gebracht 330. Die Sequenzen werden entschützt, und das Substrat wird gewaschen und anschließend mit dem zweiten Monomer in Berührung gebracht. Wiederum pflanzt sich das zweite Monomer nur an den Oberflächenstellen, die dem Licht ausgesetzt wurden, am entstehenden Oligomer fort 340. Dieser Kettenfortpflanzungsvorgang wird wiederholt, bis an allen ausgewählten Oberflächenstellen Polymere von gewünschten Längen und chemischen Sequenzen gebildet sind 350.
  • Alternative Ausführungsformen der Oligonukleotidsynthese unter Benutzung photochemisch erzeugter Reagenzien
  • In einigen Ausführungsformen sind die geeigneten Monomere, die in den Kopplungsschritten 120, 140, 150, 320, 340 und 350 benutzt werden, Nukleotidanaloga. Die Reaktion dieser Monomere schreitet wie in den 1 und 3 beschrieben fort und ergibt Oligonukleotide, die modifizierte Reste enthalten.
  • In einigen Ausführungsformen sind die geeigneten Monomere, die in den Kopplungsschritten 120, 140, 150, 320, 340 und 350 benutzt werden, diejenigen, die eine säurelabile Schutzgruppe, wie z. B. DMT, an der 3'-OH-Position enthalten. Die Reaktion dieser Monomere schreitet wie in den 1 und 3 beschrieben fort, jedoch mit einer Sequenz, die im Vergleich mit derjenigen, bei der am 5'-OH geschützte Monomere benutzt werden, mit einer entgegen gesetzten Ausrichtung wächst. Derartige Synthesen erzeugen Oligonukleotide, die ein endständiges 3'-OH enthalten, welche als Primer für In-situ-Polymerasekettenreaktionen (PCR) besonders nützlich sind.
  • Photochemisch erzeugte Reagenzien und Photosensibilisatoren
  • Die Benutzung von PGR ermöglicht chemische/biochemische Reaktionen unter herkömmlichen Bedingungen. Das Eintreten der Reaktion wird jedoch durch die In-situ-Bildung von mindestens einem Reagenz bei Bestrahlung gesteuert. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Bestrahlung durch eine Lichtquelle, die UV- und sichtbares Licht ausstrahlt. Wärme-, IR- und Röntgenbestrahlung sind ebenfalls Bestrahlungsquellen. Ein PGR wird durch Bestrahlung eines PGR-Vorläufers oder eines Photosensibilisators (der wiederum seine Energie an einen PGR-Vorläufer überträgt) erzeugt. Die chemische Umwandlung erfolgt, um mindestens ein Produkt (PGR) zu erhalten, das ein Zwischenprodukt oder eine stabile Verbindung ist. Das PGR stammt von einem Teil des PGR-Vorläufermoleküls, das von der Mutterstruktur dissoziiert ist, oder ist eine umgeordnete Struktur des PGR-Vorläufers. Ein PGR kann eine Säure, eine Base, ein Nukleophil, ein Elektrophil oder andere Reagenzien mit spezifischen Reaktivitäten sein (Tabelle 1).
  • In einigen Ausführungsformen sind verbesserte Reaktionsausbeuten und/oder Unterdrückung von Nebenreaktionen durch Vorbestrahlungsaktivierung mindestens eines PGR vor dem Zusammenmischen mit anderen Reaktionsteilnehmern erzielt. Die Vorbestrahlungsaktivierung erbringt Zeit, damit aktive Reaktionszwischenprodukte, wie z. B. Spezies von freien Radikalen, die während der Bestrahlung erzeugt wurden, verschwinden und Produkte, wie z. B. H+, eine stabile Konzentration erreichen. Verbesserte Reaktionsausbeuten und/oder die Unterdrückung von Nebenreaktionen werden auch erreicht, wenn mindestens ein geeigneter Stabilisator benutzt wird. Ein Beispiel dafür ist es, mindestens ein Reagens bereitzustellen, um die Lebensdauer aktiver Reaktionszwischenprodukte, wie z. B. einer Spezies eines freien Radikals, die während der Bestrahlung erzeugt wurde, zu vermindern und eine Wasserstoffquelle von geringer Energie bereitzustellen. Dies ist durch die folgenden Reaktionen zum Erzeugen von H+ aus Sulfoniumsalzen (Ar3S+X–) veranschaulicht:
    Figure 00260001
  • RH-Verbindungen in der obigen Gleichung sind stabil und gute H-Donatoren. Zu Beispielen für derartige Verbindungen gehören Propylencarbonat (einer der Hauptbestandteile von UVI 6974 und UVI 6990), t-Butan, Cyclohexen und dergleichen (Tabelle 1C).
  • Zu Photosäurevorläufern gehören alle Verbindungen, die bei Bestrahlung PGA erzeugen. Zu Beispielen für derartige Verbindungen gehören Diazoketone, Triarylsulfonium, Iodoniumsalze, o-Nitrobenzyloxycarbonatverbindungen, Triazinderivate und dergleichen. Typische Beispiele für diese Verbindungen sind in der Tabelle 1A veranschaulicht. Die Tabelle ist auf Daten basierend zusammengestellt, die sich in den folgenden Quellen finden: Süs et al., Liebigs Ann. Chem. 556, 65–84 (1994); Hisashi Sugiyama et al., US-Patentschrift 5,158,885 (1997); Cameron et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 4303–4313 (1991); Fréchet, Pure & Appl. Chem. 64, 1239–1248 (1992); Patchornik et al., J. Am. Chem. Soc. 92, 6333–6335 (1970).
  • Ein Beispiel für einen Photosäurevorläufer sind Triarylsulfoniumhexafluorantimonatderivate (Dektar et al., J. Org. Chem. 53, 1835–1837 (1988); Welsh et al., J. Org. Chem. 57, 4179–4184 (1992); DeVoe et al., Advances in Photochemistry 17, 313–355 (1992)). Diese Verbindung gehört zu einer Familie von Oniumsalzen, die Photoabbau erleiden, entweder direkt oder sensibilisiert, um Spezies von freien Radikalen zu bilden und schließlich Diarylsulfide und H+ zu erzeugen (siehe oben).
  • Ein weiteres Beispiel für einen Photosäurevorläufer ist Diazonaphthochinonsulfonattriesterester, der bei UV-Bestrahlung mit λ > 350 nm Indencarbonsäure erzeugt. Die Bildung der Säure ist durch eine Wolff-Umlagerung durch eine Carbenspezies bedingt, wobei ein Kettenzwischenprodukt gebildet wird, und die anschließende Hydratisierung des Kettens bedingt (Süs et al., Liebigs Ann. Chem. 556, 65–84 (1944); Hisashi Sugiyama et al., US-Patentschrift 5,158,885 (1997)).
  • Figure 00270001
  • Diese photolytischen Zwischenprodukte und Produkte sind bei der kationisch und radikalisch katalysierten Polymerisation für die hochauflösende mikrobilderzeugende Photolithographie ausgiebig benutzt worden.
  • Photosäurevorläuferverbindungen sind viele Jahre lang in der Druck- und Mikroelektronikindustrie als ein Bestandteil in Photoresistformulierungen in weiten Kreisen benutzt worden (Willson, in „Introduction to microlithography", Thompson et al. Hrsg., Am. Chem. Soc.: Washington D. C. (1994)). Diese Reaktionen sind im Allgemeinen schnell (innerhalb von Sekunden oder Minuten abgeschlossen), verlaufen unter milden Bedingungen (Raumtemperatur, neutrale Lösung), und die Lösemittel, die bei den Photoreaktionen benutzt werden (Halogenalkane, Ketone, Ester, Ether, Toluol und andere erotische oder aprotische polare Lösemittel) sind mit der Oligonukleotid- (McBride et al., Tetrahedron Fetter 24, 245–248 (1983))6 oder anderer organischer Lösungschemie kompatibel. Unter den photochemisch erzeugten Säuren, die in der Tabelle 1 aufgelistet sind, sind für die chemische Kompatibilität Auswahlen getroffen, um Nebenreaktionen zu minimieren. Die chemischen Eigenschaften, wie z. B. die Säurestärke der photochemisch erzeugten Säuren, können durch verschiedene Substitutionsgruppen am Ring oder den Kettengruppierungen eingestellt werden. Z. B. hilft die elektronegative Sulfonatgruppe in der gebildeten Indencarbonsäure, die negative Ladung an der Carboxylgruppe, die an derselben Ringgruppierung befestigt ist, zu stabilisieren, um eine Säure zu ergeben, welche die 5'-O-DMT-Gruppe (2) in einer Weise, die der Benutzung der herkömmlichen Trichloressigsäure (TCA) vergleichbar ist, wirksam entschützt. Im Allgemeinen erhöhen elektronenabziehende Gruppen, wie z. B. O2SOR, NO2, Halogene, C(=O)R (R = Aryl, Alkyl und deren substituierte Derivate, oder XR1 (X = S, O, N; R1 = Aryl, Alkyl und deren substituierte Derivate), die Stärke der entsprechenden Säuren. Elektronenspendende Gruppen, wie z. B. OR (R = Aryl, Alkyl und deren substituierte Derivate), verringern die Stärke der entsprechenden Säuren. Die Verfügbarkeit von Säuren unterschiedlicher Stärken stellt ein Repertoire an Reagenzien für einen Bereich von säurekatalysierten Entschützungsreaktionen bereit.
  • Zu Photobasevorläufern gehören alle Verbindungen, die bei Bestrahlung PGB erzeugen. Zu Beispielen für derartige Verbindungen gehören o-Benzocarbamate, Benzoinylcarbamate, Nitrobenzyloxyaminderivate, die in der Tabelle 1 aufgelistet sind, und dergleichen. Im Allgemeinen können Verbindungen, die Aminogruppen enthalten, die durch photochemisch labile Gruppen geschützt sind, mit quantitativen Ausbeuten Amine freisetzen. Die Photoprodukte dieser Reaktionen, d. h. in situ erzeugte Aminoverbindungen, sind die basischen Reagenzien, die für weitere Reaktionen nützlich sind.
  • Zu Photoreagensvorläufern gehören alle Verbindungen, die bei Bestrahlung ein Reagens erzeugen, das für eine chemische/biochemische Reaktion erforderlich ist. Zu Beispielen für solche Verbindungen gehören 1-(Dimethoxybenzoinyl)tetrazol (die heterocyclische Verbindung Tetrazol ist ein PGR), DimethoxybenzoinylOR1 (R1OH ist ein PGR, R1 = Alkyl, Aryl und deren substituierte Derivate), Sulfoniumsalze (der Thiolether Ar2S ist ein PGR) und dergleichen.
  • Zu Photosensibilisatoren gehören alle Verbindungen, die Bestrahlung gegenüber empfindlich sind und in der Lage sind, das Anregungsprofil des PGR durch Verschieben seiner Anregungswellenlänge und Erhöhen der Effizienz der Bestrahlung zu verbessern. Zu Beispielen für derartige Verbindungen gehören Benzophenon, Anthracen, Thioxanthon, deren Derivate (Tabelle 1B) und dergleichen.
  • Alternative Anwendungen von PGR
  • In einer Ausführungsform sind photochemisch erzeugte Reagenzien (Tabelle 1) auf die Parallelsynthese von Peptid-Arrays auf dem Chip unter Benutzung von Aminosäuremonomeren angewandt, die reaktionsfähige funktionelle Gruppen enthalten, die durch t-Boc- (säurelabil) oder Fmoc-Gruppen (baselabil) (4) geschützt sind. Die Verfahren der Peptidsynthese sind bekannt: Sterwart und Young, „Solid Phase peptide synthesis", Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Merrifield, Science 232, 341–347 (1986); Pirrung et al., US-Patentschrift Nr. 5,143,854 (1992). Gemäß einer Ausführungsform sind Verknüpfermoleküle auf einer Substratoberfläche befestigt, auf der Peptidsequenzarrays synthetisiert werden sollen. Jedes Verknüpfermolekül enthält eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe, wie z. B. eine -NH2-Gruppe, die durch die säurelabile t-Boc-Gruppe geschützt ist 500. Dann werden ein Photosäurevorläufer oder ein Photosäurevorläufer und sein Photosensibilisator auf das Substrat aufgebracht. Ein vorbestimmtes Lichtmuster wird dann auf die Substratoberfläche projiziert 505. An den belichteten Stellen werden Säuren erzeugt, die säurelabilen Schutzgruppen, wie z. B. t-Boc, werden von dem N-endständigen NH2 abgespalten, wodurch es befähigt wird, mit ankommenden Monomeren (4) zu reagieren. An den dunklen Stellen wird keine Säure erzeugt, und deshalb bleiben die säurelabilen Schutzgruppen der Verknüpfermoleküle unversehrt. Dann wird die Substratoberfläche gewaschen und anschließend mit dem ersten Monomer (eine geschützte Aminosäure, deren Analoga oder Oligomere) versorgt, das sich unter herkömmlichen Kopplungsreaktionsbedingungen nur an die entschützten Verknüpfermoleküle anlagert 510. Somit ist eine chemische Bindung zwischen der NH2-Gruppe der Verknüpfermoleküle und dem Carbonylkohlenstoff der Monomere gebildet, um eine Amidverknüpfung zu schaffen. Nach den sachgemäßen Waschschritten ist die Addition des ersten Restes abgeschlossen. Das angefügte Aminosäuremonomer enthält ebenfalls eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe, die durch die säurelabile t-Boc-Gruppe geschützt ist. Das Substrat, das die Arrays wachsender Sequenzen enthält, wird dann mit einer zweiten Ladung eines Photosäurevorläufers versorgt und einem zweiten vorbestimmten Lichtmuster ausgesetzt 515. Die ausgewählten Sequenzen werden entschützt, und das Substrat wird gewaschen und anschließend mit dem zweiten Monomer versorgt. Wiederum pflanzt sich das zweite Monomer nur an den Oberflächenstellen fort, die dem Licht ausgesetzt wurden. Der zweite Rest, der zu der wachsenden Kette hinzugefügt wurde, enthält ebenfalls eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe, die durch eine säurelabile Gruppe geschützt ist 520. Dieser Kettenfortpflanzungsvorgang wird wiederholt, bis an allen ausgewählten Oberflächenstellen Polymere von gewünschten Längen und chemischen Sequenzen gebildet sind 525. Für einen Chip, der ein Peptid-Array mit jedem beliebigen festgelegten Sequenzmuster enthält, ist die Höchstzahl an Reaktionsschritten 20 × n, wobei n die Kettenlänge und 20 eine Konstante ist, die Anzahl der natürlich vorkommenden Aminosäuren. Arrays, die modifizierte Aminosäuren enthalten, können mehr als 20 × n Schritte erfordern.
  • In einer weiteren Ausführungsform (6) ist ein Photobasevorläufer, wie z. B. ein Amin, das durch eine photolabile Gruppe geschützt ist, auf die feste Oberfläche aufgebracht, die mit Verknüpfern beladen ist 600. Jedes Verknüpfermolekül enthält eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe, wie z. B. NH2, die durch eine baselabile Schutzgruppe geschützt ist. Danach wird ein Photobasevorläufer, wie z. B. (((2-Nitrobenzyl)oxy)carbonyl)piperidin (Cameron und Frechet, J. Am. Chem. Soc. 113, 4303–4313 (1991)) auf das Substrat aufgebracht. Ein vorbestimmtes Lichtmuster wird dann auf die Substratoberfläche projiziert 605. An den belichteten Stellen werden Basen erzeugt, welche die Abspaltung der baselabilen Schutzgruppen von den Verknüpfermolekülen verursachen, und die endständigen NH2-Gruppen sind frei, um mit ankommenden Monomeren zu reagieren. An den dunklen Stellen wird keine Base erzeugt, und deshalb bleiben die baselabilen Schutzgruppen der Verknüpfermoleküle unversehrt. Dann wird die Substratoberfläche gewaschen und anschließend mit dem ersten Monomeren, das eine Carbonsäuregruppe enthält, versorgt, das sich unter herkömmlichen Kopplungsreaktionsbedingungen nur an die entschützten Verknüpfermoleküle anlagert und eine Amidverknüpfung schafft 610. Nach dem sachgemäßen Waschen ist die Addition des ersten Restes abgeschlossen. Das angefügte Aminosäuremonomer enthält ebenfalls eine reaktionsfähige funktionelle endständige Gruppe, die durch eine baselabile Gruppe geschützt ist. Das Substrat, das die Arrays wachsender Sequenzen enthält, wird dann mit einer zweiten Ladung eines Photobasevorläufers versorgt und einem zweiten vorbestimmten Lichtmuster ausgesetzt 615. Die ausgewählten Sequenzen werden entschützt, und das Substrat wird gewaschen und anschließend mit dem zweiten Monomer versorgt. Wiederum pflanzt sich das zweite Monomer nur an den Oberflächenstellen fort, die dem Licht ausgesetzt wurden. Der zweite Rest, der zu den wachsenden Sequenzen hinzugefügt wurde, enthält ebenfalls eine reaktionsfähige funktionelle endständige Gruppe, die durch eine baselabile Gruppe geschützt ist 620. Dieser Kettenfortpflanzungsvorgang wird wiederholt, bis an allen ausgewählten Oberflächenstellen Polymere von gewünschten Längen und gewünschten chemischen Sequenzen gebildet sind 625.
  • Die Anwendung der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die Parallelsynthese von Arrays von Oligonukleotiden und Peptiden beschränkt. Das Verfahren ist bei der Festphasensynthese von Molekülarrays von allgemeinem Nutzen, bei der in jedem Schritt der Kettenerweiterungssynthese das komplexe Synthesemuster erforderlich ist. Ein spezifisches Beispiel ist die Synthese von Arrays von Oligosacchariden, die Sequenzen verschiedener Kohlenhydrateinheiten und verzweigte Ketten aufweisen (7). Erfindungsgemäß wird ein Photosäurevorläufer auf eine feste Oberfläche aufge bracht, die geschützte Kohlenhydrate enthält. Jedes Kohlenhydratmolekül enthält mehrere reaktionsfähige OH-Gruppen, von denen jede durch eine Schutzgruppe geschützt ist. Jede dieser Schutzgruppen erfordert verschiedene Entschützungsbedingungen. Ein vorbestimmtes Lichtmuster wird dann auf die Substratoberfläche projiziert. An den belichteten Stellen wird Säure erzeugt, und die Schutzgruppen, die bei einem besonderen Satz an Bedingungen labil sind, werden abgespalten. Entschützte OH-Gruppen sind frei, um mit einem ankommenden Molekül zu reagieren. An den dunklen Stellen wird keine Säure erzeugt, und deshalb bleiben die säurelabilen Schutzgruppen der Kohlenhydratmoleküle unversehrt. Dann wird die Substratoberfläche gewaschen und anschließend mit einem Monomer (einem Kohlenhydrat oder Oligosaccharid) versorgt, das sich unter herkömmlichen Reaktionsbedingungen nur an das entschützte OH anlagert und eine glycosidische Verknüpfung schafft; Wong et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 7137–7138 (1998). Diese Schritte werden wiederholt, um Oligosaccharide zu ergeben, die verschiedene glycosidische Verknüpfungen an der ersten entschützten OH-Position enthalten. Danach wird ein Photobasevorläufer auf das Substrat aufgebracht. Ein zweites vorbestimmtes Lichtmuster wird dann zum zweiten Mal auf die Substratoberfläche projiziert. An den belichteten Stellen wird Base erzeugt, und die Schutzgruppen, die unter diesen Bedingungen labil sind, werden abgespalten. Entschützte OH-Gruppen der zweiten Ladung sind frei, um mit einem ankommenden Molekül zu reagieren. An den dunklen Stellen wird keine Base erzeugt, und deshalb bleiben die baselabilen Schutzgruppen der Kohlenhydratmoleküle unversehrt. Dann wird die Substratoberfläche gewaschen und anschließend mit einem zweiten Monomer versorgt, das sich unter herkömmlichen Reaktionsbedingungen nur an das zweite entschützte OH des zweiten Durchgangs anlagert und eine glycosidische Verknüpfung schafft. Diese Schritte werden wiederholt, um Oligosaccharide zu ergeben, die verschiedene glycosidische Verknüpfungen an der zweiten entschützten OH-Position enthalten. Verzweigte Oligosaccharide werden gebildet. Bei der weiteren Synthese werden verschiedene PGR benutzt, um eine selektive Entfernung der OH-schützenden Gruppen zu erreichen, bis die gewünschten Oligosaccharid-Arrays synthetisiert sind.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Benutzung von photochemisch erzeugten Reagenzien in mehr Fällen als Entschützungsreaktionen allein, um die selektive Reaktion gemäß einem vorbestimmten Muster zu erreichen, ohne den Verlauf der gut entwickelten herkömmlichen Chemie zu ändern. Zudem ist die vorliegende Erfindung nicht auf Entschützungsreaktionen begrenzt; photochemisch erzeugte reaktionsfähige Verbindungen, wie z. B. Alkohole (ROH, R = Alkyl, Aryl und deren substituierte Derivate), können als Reagenzien für eine Vielfalt an chemischen Umwandlungen, wie z. B. Veresterungs-, nukleophile Substitutions- und Eliminierungsreaktionen, benutzt werden. Diese Reaktionen sind wichtige Schritte zur Herstellung von kundenspezifischen MMA-Chips.
  • Synthesevorrichtung
  • Die 8A bis 8C veranschaulichen drei Ausführungsformen der programmierbaren, lichtgesteuerten Synthesevorrichtung dieser Erfindung. Wie in der 8A gezeigt, besteht die Vorrichtung aus vier Abschnitten: einem Reagensverteiler 812, einem optischen System, einer Reaktoreinheit und einem Computer 814.
  • Reagensverteiler
  • Der Reagensverteiler 812 der 8A führt normales Reagensdosieren, -transport, -umlauf und -entsorgung durch. Er besteht aus Reagensbehältern, Magnet- oder pneumatischen Ventilen, Dosierungsventilen, Rohr leitungen und Verfahrenssteuerungen (in der 8A nicht gezeigt). Zu dem Reagensverteiler 812 gehört auch ein Inertgas-Transportsystem für den Lösemittel/Lösungstransport und die Leitungsspülung. Der Entwurf und der Bau eines derartigen Verteilers sind dem Fachmann auf dem Gebiet des Fluid- und/oder Gastransports wohlbekannt. In vielen Fällen können handelsübliche DNS/RNS-, Peptid- und andere Typen von Synthesizern als der Reagensverteiler 812 dieser Erfindung benutzt werden.
  • Optisches System
  • Die Aufgabe des optischen Systems, das in der 8A gezeigt ist, ist es, zu einem Muster gebildete Lichtstrahlen oder Lichtmuster 807c zum Auslösen photochemischer Reaktionen an vorbestimmten Orten auf einer Substratoberfläche 810a zu erzeugen. Das optische System, das in der 8A gezeigt ist, besteht aus einer Lichtquelle 802, einem oder mehreren Filtern 803, einer oder mehreren Kondensorlinsen 804, einem Reflektor 805, einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung (DMD) 801 und einer Projektionslinse 806. Im Betrieb wird durch die Lichtquelle 802 ein Lichtstrahl 807a erzeugt, geht durch das (die) Filter 803 und wird zu einem Lichtstrahl 807b von gewünschter Wellenlänge. Eine Kondensorlinse 804 und ein Reflektor 805 werden benutzt, um den Lichtstrahl 807b auf die DMD 801 zu richten. Durch eine Projektionslinse 806 projiziert die DMD ein Lichtmuster 807c auf die Substratoberfläche 810a eines Reaktors 810. Einzelheiten über das DMD 801 sind unten beschrieben.
  • Eine Lichtquelle 802 kann aus einem weiten Bereich von lichtaussendenden Vorrichtungen ausgewählt sein, wie z. B. einer Quecksilberlampe, einer Xenonlampe, einer Halogenlampe, einem Laser, einer lichtaussendenden Diode oder einem beliebigen anderen geeigneten Lichtstrahler. Die Wellenlängen der Lichtquelle 802 sollten sich mit den Wellenlängen der betreffenden photochemischen Reaktion überschneiden bzw, innerhalb dieser liegen. Die bevorzugten Wellenlängen für die meisten der betreffenden photochemischen Reaktionen liegen zwischen 280 nm und 500 nm. Die Leistung der Lichtquelle 802 sollte ausreichen, um ein Lichtmuster 807c zu erzeugen, das intensiv genug ist, um die betreffenden photochemischen Reaktionen in einem Reaktor 810 innerhalb eines vernünftigen Zeitraumes abzuschließen. Für die meisten Anwendungen beträgt die bevorzugte Lichtintensität am Ort der Substratoberfläche 810a zwischen 0,1 und 100 mW/cm2. Für viele Anwendungen ist aufgrund ihrer breiten Wellenlängen und der Verfügbarkeit verschiedener Leistungen eine Quecksilberlampe bevorzugt.
  • Die Auswahlkriterien für (ein) Filter 803 basieren auf der Anregungswellenlänge der betreffenden photochemischen Reaktionen und anderer Erwägungen. Z. B. ist es oftmals wünschenswert, unerwünscht kurze und lange Wellenlängen aus dem Lichtstrahl 807a zu entfernen, um unerwünschte Photoabbaureaktionen und Erwärmen in einem Reaktor 810 zu vermeiden. Z. B. wird es bei der Synthese von Oligonukleotiden und anderen bio-bezogenen Molekülen bevorzugt, Wellenlängen zu entfernen, die kürzer als 340 nm sind. Um ein Erwärmen zu vermeiden, wird vorzugsweise ein Infrarot-Sperrfilter benutzt, um Wellenlängen jenseits von 700 nm zu entfernen. Deshalb kann mehr als ein Filter notwendig sein.
  • Eine Schlüsselkomponente in dem optischen System, das in der 8A gezeigt ist, ist eine digitale Mikrospiegelvorrichtung 801, die benutzt wird, um Lichtmuster 807b zu erzeugen. Eine DMD ist eine elektronisch gesteuerte Sichtanzeigenvorrichtung und ist in der Lage, graphische und Textbilder in derselben Weise wie ein Computermonitor zu erzeugen. Die Vorrichtung ist im Handel von Texas Instruments Inc., Dallas, Texas, USA für Projektionssichtanzeigenanwendungen (Hornbeck, L. J., „Digital light processing and MEMS, reflecting the digital display needs of the networked society," SPIE Europe Proceedings, 2783, 135–145 (1996)) erhältlich. Jede DMD 801 enthält mehrere kleine und einzeln steuerbare Kippspiegel 801a, welche die Strahlen lenken, um Bilder oder Lichtmuster 807c zu erzeugen.
  • Die DMD 801 ist aus mehreren Gründen in der vorliegenden Erfindung ein bevorzugtes Mittel zum Erzeugen von Lichtmustern. Erstens ist sie in der Lage, mit relativ kurzen Wellenlängen umzugehen, die zum Auslösen der betreffenden photochemischen Reaktionen nötig sind. Zweitens besitzt die Vorrichtung eine hohe optische Effizienz. Drittens kann sie Lichtmuster von hohem Kontrastverhältnis erzeugen. Außerdem sind Vorrichtungen von hochaufgelösten Formaten (bis zu 1.920 × 1.080) vorgeführt worden. Diese Merkmale erlauben es, durch Benutzung der in dieser Erfindung beschriebenen Photochemie auf geeignete Weise optische Muster für die Synthese praktisch jedes beliebigen gewünschten Molekülsequenzarrays zu erzeugen. Unter diesem Gesichtspunkt ist die Vorrichtung dieser Erfindung verglichen mit dem Verfahren des Standes der Technik zum Erzeugen von Sequenzarrays unter Benutzung von Photomasken in hohem Maße flexibel.
  • Andere Typen von elektronisch gesteuerten Sichtanzeigevorrichtungen können zum Erzeugen von Lichtmustern benutzt werden. Die 8B veranschaulicht eine beispielhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der eine reflektierende Flüssigkristallarray-Sichtanzeigen-(LCD)-Vorrichtung benutzt wird 821. Reflektierende LCD-Vorrichtungen sind im Handel von einer Zahl von Firmen, wie z. B. Displaytech, Inc., Longmont, Colorado, USA erhältlich. Jede reflektierende LCD-Vorrichtung 821 enthält mehrere kleine Reflektoren (nicht gezeigt) mit einem Flüssigkristallverschluss 821a, der sich vor jedem Reflektor befindet, um Bilder oder Lichtmuster zu erzeugen. Hochauflösende Vorrichtungen, bis zu 1.280 × 1.024, sind von Displaytech bereits erhältlich. Das optische System, das in der 8B gezeigt ist, ist gleich dem der Vorrichtung der 8A, mit Ausnahme der optischen Anordnung zum Richten des Lichts auf Sichtanzeigenvorrichtungen. Ein Strahlenteiler 825 wird in dem optischen System, das in der 8B gezeigt ist, benutzt, um Licht wirkungsvoll auf und aus flachen Reflektoren heraus zu koppeln.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine durchlässige LCD-Sichtanzeige 841 benutzt, um Lichtmuster zu erzeugen, wie in der 8C gezeigt. Eine durchlässige LCD-Sichtanzeige 841 enthält mehrere Flüssigkristall-Lichtventile 841a, die in der 8C als kurze Querstriche gezeigt sind. Wenn ein Flüssigkristall-Lichtventil 841a geöffnet ist, geht Licht hindurch; wenn ein Flüssigkristall-Lichtventil 841a geschlossen ist, wird das Licht blockiert. Daher kann in einem normalen Photolithographieverfahren eine durchlässige LCD-Sichtanzeige in derselben Weise wie eine gewöhnliche Photomaske benutzt werden (L. F. Thompson et al., „Introduction to Microlithography", American Chemical Society, Washington, DC (1994)). In _ der 8C wird ein Reflektor 845 benutzt, um einen Lichtstrahl 847b auf die durchlässige LCD-Sichtanzeige 841 zu richten.
  • Die meisten handelsüblichen Sichtanzeigevorrichtungen, einschließlich DMD, reflektierende LCD und durchlässige LCD, sind zum Umgang mit sichtbarem Licht (400 nm bis 700 nm) entworfen. Daher wird, wenn diese im Handel erhältlichen Sichtanzeigevorrichtungen benutzt werden, die beste Funktionsweise der programmierbaren, lichtgesteuerten Synthesevorrichtung dieser Erfindung erzielt, wenn die Anregungswellenlänge des Photoreagensvorläufers zwischen 400 nm und 700 nm liegt. Die Verwendung des Gerätes und der Verfahren dieser Erfindung erstreckt sich jedoch über den obigen Wellenlängen bereich hinaus.
  • Die 8A bis 8C veranschaulichen Vorrichtungsbauweisen zum Herstellen von jeweils einem Array-Chip auf einmal. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Vorrichtungen zum Herstellen mehrerer Chips. Die 12 veranschaulicht schematisch einen mechanischen/optischen Schrittmechanismus zum Erhöhen des Durchsatzes und der Effizienz der Synthesevorrichtung dieser Erfindung. In diesem Schrittmechanismus wird ein Lichtstrahl 1204a von einer Sichtanzeigenvorrichtung (in der Figur nicht gezeigt) projiziert, geht durch eine Projektionslinse 1202 und wird von einem Reflektor 1203 auf einen Reaktor 1201a gerichtet, wobei ein Bild oder ein Lichtmuster 1204b gebildet wird. Der Reflektor 1203 besitzt einen Drehmechanismus, der das Lichtmuster 1204b auf jeden einzelnen der mehreren umgebenden Reaktoren 1201a bis 1201f richten kann. Bei einem gewöhnlichen Synthesevorgang, z. B. von Oligonukleotiden, wird das Lichtmuster 1204b nur während eines photochemischen Entschützungsreaktionsschrittes auf einen spezifischen Reaktor gerichtet, z. B. 1201a. Dann wird das Lichtmuster 1204b auf andere Reaktoren gerichtet, während der Reaktor 1201a die restlichen Syntheseschritte durchläuft, wie z. B. Spülen, Koppeln, Verkappen usw.
  • Andere Schrittmechanismen können in der vorliegenden Erfindung ebenfalls benutzt werden. Z. B. kann ein Repetier-Expositionsschema benutzt werden, das in der Photolithographie von Halbleitern routinemäßig benutzt wird. Allgemeine Beschreibungen der Repetier-Photolithographie sind von L. F. Thompson et al. in Introduction to Microlithography, American Chemical Society, Washington, DC (1994) gegeben. Bei diesem Schema wird ein großes Substrat benutzt, das mehrere Reaktionsbehälter-Arrays enthält. Das Substrat ist auf einem x-y-Verschiebetisch montiert. In jedem Schritt erfolgt eine optische Exposition eines oder mehrerer Arrays. Dann wird das Substrat in die nächste Position bewegt, und eine weitere optische Exposition wird durchgeführt. Der Vorgang wird wiederholt, bis alle Reaktionsbehälter-Arrays exponiert sind.
  • Reaktorkonfiguration
  • Wie in früheren Abschnitten beschrieben, befinden sich die photochemisch erzeugten Reagenzien, die in die gegenwärtige Erfindung einbezogen sind, in einer Lösungsphase. Wenn die Reagenzien benutzt werden, um räumlich definierte Muster zu erzeugen, wie z. B. Arrays, sollten geeignete Maßnahmen getroffen werden, um einzelne Elemente räumlich zu isolieren. Die 9A bis 9C veranschaulichen schematisch drei bevorzugte Ausführungsformen der Isolierungsmechanismen der vorliegenden Erfindung. In der Ausführungsform, die in der 9A gezeigt ist, bilden ein transparentes Substrat 901 und ein Deckel 902 eine Reaktionszelle oder einen Reaktor, die bzw. der mit einer Lösung gefüllt ist, die einen oder mehrere Photoreagensvorläufer enthält. Die Reaktionsbehälter, die von Barrieren 903 begrenzt sind, sind in den Deckel 902 eingeprägt. Der Deckel 902 ist vorzugsweise aus einem Kunststoff- oder einem Elastomermaterial hergestellt, das gegenüber allen Chemikalien, die an den Reaktion beteiligt sind, inert ist. Bevor eine photolytische Reaktion stattfindet, wird der Deckel 902 gegen das Substrat 901 gedrückt, wobei es zwischen den Barrieren 903 und dem Substrat zur Berührung kommt und die einzelnen Reaktionsbehälter isoliert werden. Dann werden Lichtstrahlen in eine Zahl von ausgewählten Reaktionsbehältern 904a und 904c projiziert, wie in dem Schritt 3 der 9A gezeigt. Photolytische und andere Photoreagens-induzierte Reaktionen finden in den Reaktionsbehältern 904a und 904c statt, die dem Licht ausgesetzt sind, während in dem nicht ausgesetzten Reaktionsbehälter 904b keine photochemisch aktivierte Reaktion erfolgt. Wenn der beschriebene Isolierungsmechanismus sachgemäß gebaut und betrieben wird, verhindert er die Diffusion von Reagenzien über die einzelnen Reaktionsbehälter hinweg. Außerdem schafft der Abstand zwischen benachbarten Reaktionsbehältern 904b und 904c eine Pufferzone 904d, um jegliches gegenseitiges Vermischen zwischen Reaktionsbehältern weiter zu verhindern.
  • Die Pufferzone 904d, die in der 9A gezeigt ist, schafft einen Abstand für das Hinzufügen von Mechanismen zur Verhinderung von Störungen zwischen den einzelnen Reaktionsbehältern. Die 10 veranschaulicht die detaillierte Struktur der Reaktionsbehälter der gegenwärtigen Erfindung in einer dreidimensionalen perspektivischen Ansicht. Die Figur zeigt, dass die Pufferzonen (in der 10 als 1006 gekennzeichnet) alle untereinander verbunden sind. Die untereinander verbundene Struktur ermöglicht es, die Pufferzone mit geeigneten Lösungen zu spülen, während alle Reaktionsbehälter geschlossen sind. Bei einem bevorzugten Verfahren wird die Pufferzone 904d nach dem Abschluss der photolytischen und Photoreagens-induzierten Reaktionen und vor dem Anheben des Deckels 902 mit einer Lösung gespült, welche entweder die Photoreagens-induzierten chemischen Reaktionen löschen oder die photochemisch erzeugten Reagenzien innerhalb der ausgesetzten Reaktionsbehälter 904a und 904c neutralisieren würde. Das Überlaufen der photochemisch erzeugten Reagenzien in den ausgesetzten Reaktionsbehältern 904a und 904c würde somit keine unerwünschten chemischen Reaktionen in anderen Gebieten verursachen, nachdem der Deckel 902 angehoben ist. Zum Neutralisieren einer photochemisch erzeugten Säure kann eine schwach basische Lösung, wie z. B. Pyridin in CH2Cl2 angewandt werden. Zum Löschen der Nukleotidkopplungsreaktion können Acetonitril oder andere geeignete Lösemittel benutzt werden.
  • Die 9B veranschaulicht eine weitere Ausführungsform des Isolierungsmechanismus der vorliegenden Er findung. In dieser Ausführungsform sind die Reaktionsbehälterstrukturen oder Reaktionsbehälterbarrieren 913 auf einem transparenten Substrat 911 gebildet, wobei der Deckel 912 eine flache Innenoberfläche aufweist. Das Substrat 911 ist vorzugsweise aus Glas hergestellt. Der Deckel 912 ist vorzugsweise aus einem Kunststoff- oder einem Elastomermaterial hergestellt, das gegenüber allen Chemikalien, die an den Reaktionen beteiligt sind, inert ist. Der Dichtungsmechanismus und die bevorzugte Funktionsweise sind denjenigen ähnlich, die früher für die Ausführungsform beschrieben ist, die in der 9A gezeigt ist.
  • Die 9C veranschaulicht die dritte Ausführungsform des Isolierungsmechanismus der vorliegenden Erfindung. In dieser Ausführungsform ist ein Muster der nichtnetzenden dünnen Schicht 933 auf die Oberfläche eines transparenten Substrats 931 geschichtet. Während des Betriebs wird ein Reaktor zuerst mit einer Lösung 934 befüllt. Dann wird die Lösung 934 aus dem Reaktor ablaufen lassen, und Tröpfchen werden auf der Oberfläche des Substrats 931 gebildet, da die Lösung die Oberfläche des Substrats 931 benetzt, die Oberfläche der nichtnetzenden dünnen Schicht 933 jedoch nicht. Die Tröpfchen sind voneinander isoliert. Die Lichtstrahlen 935 können dann auf die vorbestimmten Tröpfchen 934a und 934c projiziert werden, um photolytische und andere Photoreagens-induzierte Reaktionen auszulösen. Diese Ausführungsform beseitigt die Notwendigkeit für einen Dichtungsmechanismus und ist für die Biochip-Massenherstellung unter Benutzung von großen Substraten geeignet. Die Benutzung von nichtnetzenden dünnen Schichten, um Fluide einzugrenzen, ist in dem Fachgebiet wohlbekannt und ist von Thomas M. Brennan in der US-Patentschrift Nr. 5,474,596 für die Synthese von DNS-Oligomeren unter Benutzung eines Tintenstrahldruckverfahrens beschrieben worden.
  • Die Reaktoren dieser Erfindung sind vorzugsweise zu einer Kassettenform zusammengesetzt, wie in der 10 veranschaulicht. Die Bauweise, die in der Figur gezeigt ist, benutzt den Isolierungsmechanismus, der in der 9B gezeigt ist. Andere Isolierungsmechanismen, wie z. B. diejenigen, die in den 9A und 9C gezeigt sind, können leicht in ähnlichen Kassettenformen gebaut werden. Wie in der 10 gezeigt, enthält jede Kassette ein transparentes Substrat 1001, das aus Glas oder Polymermaterialien mit geeigneten chemischen und optischen Eigenschaften hergestellt ist. Über dem Substrat befindet sich eine Barriereschicht 1003, die mehrere Öffnungen enthält, um Arrays von isolierten Reaktionsbehältern 1004 zu bilden. Die Reaktionsbehälter können im Prinzip von jeder beliebigen vernünftigen Gestalt und Größe sein. Runde und quadratische Behälter sind bevorzugt. Am stärksten bevorzugt sind die Behälter von runder Gestalt mit einem Durchmesser von 10 bis 1.000 μm und einer Tiefe von 5 bis 100 μm. Zum Beispiel besitzen in einer spezifischen Bauweise runde Reaktionsbehälter einen Durchmesser von 140 μm, eine Tiefe von 20 μm und sind als orthogonales Array mit einem gleichmäßigen Abstand von Mitte zu Mitte von 200 μm angeordnet. In dieser Bauweise sind 2.500 Reaktionsbehälter in eine Fläche von einem Quadratzentimeter gepackt. In jedem Reaktionsbehälter können etwa 6,4 fmol Moleküle synthetisiert werden, unter der Annahme, dass der mittlere Abstand zwischen immobilisierten benachbarten Molekülen 20 Å beträgt. Das Volumen des Reaktionsbehälters beträgt etwa 300 Pikoliter und bietet ein ausreichendes Volumen für die Reaktionen. Die Barriereschicht 1003 besteht aus undurchsichtigen Materialien, wie z. B. Metallen oder geschwärzten Polymeren, um die einzelnen Reaktionsbehälter voneinander zu isolieren. Die dritte Schicht ist ein Reaktordeckel 1002. Der Deckel 1002 besitzt drei Funktionen: Reaktorgehäuse, Reagensverbindung/-verteilung und Reaktionsbehälterisolierung. Der Deckel 1002 ist vorzugsweise aus einem Polymermaterial hergestellt, das flexibel und gegenüber Chemikalien/Lösemitteln, die an den betreffenden Syntheseverfahren beteiligt sind, beständig ist. Das Material kann aus einer Gruppe von Polymeren ausgewählt sein, zu der Polyethylen, Polypropylen, Polyethylen-Polypropylen-Copolymer, fluorierte Polymere und verschiedene andere geeignete gehören. Der Reagenseinlass 1012 und der -auslass 1013 sind an zwei gegenüberliegenden Enden des Reaktors angeordnet. Die Abzweigungskanäle 1011 sind hergestellt, um die Reagenzien gleichmäßig über den Reaktor zu verteilen. Die Mittelzone des Deckels ist eine Druckunterlage 1015, die nach unten gedrückt werden kann, um die Reaktionsbehälter 1004 darunter gut abzudichten. Gleich über dem Reaktor befindet sich ein mechanisches Stellglied (in der 10 nicht gezeigt, gezeigt jedoch in den 8A bis 8C als 811, 831 und 851), das z. B. entweder über eine Spule oder pneumatisch betätigt werden kann. Das Stellglied kann entweder die Druckunterlage des Reaktordeckels drücken, um alle Reaktionsbehälter abzudichten, oder zurückziehen, um alle Reaktionsbehälter zu öffnen. Dieser Vorgang erfolgt, um den Dichtungsmechanismus, der in den 9A und 9B gezeigt ist, einzupassen. Das Nebenbild in der 10 zeigt eine vergrößerte Ansicht der Reaktionsbehälterstrukturen, die extrudierte Kränze 1005 enthalten, um das Abdichten zu erleichtern. Obwohl in der 10 nicht gezeigt, enthält das Reaktorsubstrat Ausrichtungsmarkierungen, welche die Ausrichtung des Reaktors in einem optischen Lithographiesystem der vorliegenden Erfindung ermöglichen.
  • Die Reaktorkassette, die in der 10 gezeigt ist, ist für die Benutzung in einer gewöhnlichen chemischen und biochemischen Laborumgebung in höchstem Maße geeignet. Die umhüllte Bauweise der Kassette verhindert chemische und Teilchenkontamination aus der Umgebung. Um die besten und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, werden die Kassetten vorzugsweise in einer kontrollierten Umgebung hergestellt, um die chemische Unversehrtheit innerhalb der Kassette sicherzustellen. Die Kassetten werden dann mit einem Inertgas befüllt, wie z. B. Ar, und durch Verstopfen des Einlasses und Auslasses des Reaktors abgedichtet. Dann können die Kassetten gelagert und/oder an die Anwenderlaboratorien versandt werden.
  • Reaktorherstellung
  • Die Reaktoren der vorliegenden Erfindung (9A bis 9C und 10) können unter Benutzung verschiedener wohlbekannter Mikroherstellungsverfahren, wie z. B. Photolithographie, Dünnschichtabscheidung, Elektroplattieren und Formen (M. Madou, Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, New York, (1997)) hergestellt werden. Diese Techniken sind zum Herstellen verschiedener Mikrofluidvorrichtungen, elektromechanischer Vorrichtungen, chemischer Sensoren und optischer Mikrovorrichtungen in weiten Kreisen benutzt worden. Z. B. kann die Reaktionsbehälterstruktur, die in der 10 gezeigt ist, durch Benutzen des Elektroplattierens geeigneter dünner Metallschichten auf einem Glassubstrat hergestellt werden. Am Ende dieser Beschreibung ist ein Beispiel gegeben, um die einbezogenen Herstellungsverfahren . darzustellen. Die Reaktionsbehälterstrukturen auf einem Glassubstrat können auch durch Benutzen von chemischen Ätzverfahren hergestellt werden, die in weiten Kreisen benutzt worden sind, um verschiedene Mikrofluidvorrichtungen herzustellen (Peter C. Simpson et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 2256–2261(1998)).
  • Der Reaktordeckel 1002, der in der 10 gezeigt ist, kann unter Benutzung eines Präzisionsformverfahrens hergestellt werden. Ein solches Verfahren ist in der Kunststoffherstellungsindustrie in weiten Kreisen erhältlich. Das benutzte Polymermaterial ist vorzugsweise von schwarzer Farbe, um die Lichtreflexion und -streuung während der Lichtexposition so gering wie möglich zu machen. Schweiß- und Haftbinde verfahren können benutzt werden, um den Kunststoffdeckel 1002 und ein Substrat 1001 zu einer integrierten Kassette zusammenzusetzen.
  • Das Herstellen von Mustern nichtnetzender dünner Schichten auf Glas und anderen Substraten ist auf vielen Gebieten eine bekannte Technik (Uthara Srinivasan et al., Proc. IEEE Solid-State Sensors and Actuators, Juni 1991, 1399–1402). Die dünne Schicht wird üblicherweise von einer Monoschicht selbstorganisierter Molekülen (SAM) oder einer dünnen Polymerschicht aus Material mit geringer Oberflächenenergie, wie z. B. Teflon, gebildet. Die auf Glassubstraten am häufigsten benutzten SAM umfassen verschiedene Kohlenwasserstoffalkylsilane und -fluoralkylsilane, wie z. B. Octadecyltrichlorsilan und 1H,1H,2H,2H-Perfluordecyltrichlorsilan. In das Verfahren der Musterbildung ist die Benutzung von Photoresists und Photolithographie einbezogen. Das Beispiel VII am Ende dieser Bezeichnung liefert ein ausführliches Verfahren der Musterbildung. Dünne Polymerschichten, wie z. B. Teflon, können unter Benutzung eines Siebdruckverfahrens auf Glas- und Kunststoffoberflächen gedruckt werden. Das Siebdruckverfahren ist in der Druckindustrie und in der Elektronikindustrie eine wohlbekannte Technik. Die allgemeinen Arbeitsabläufe des Siebdruckens für Mikroherstellungsanwendungen sind von M. Madou in Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, New York (1997) beschrieben. Außerdem sind hydrophobe bedruckte Objektträger von Anbietern, wie z. B. der Erie Scientific Company, Portsmouth, New Hampshire, USA im Handel erhältlich. Wenn mit einer nichtnetzenden dünnen Schicht gemusterte Substrate benutzt werden, kann die Reaktorkonfiguration vereinfacht sein, da die Dichtungsmechanismen der Reaktionsbehälter, die in den 8A bis 8C und in der 10 gezeigt sind, nicht mehr erforderlich sind.
  • Steuerung der Vorrichtung
  • Wie in der 8A veranschaulicht, wird die Synthesevorrichtung der vorliegenden Erfindung durch einen Computer 814 gesteuert, der die Tätigkeiten der DMD 801, des Dichtungsstellgliedes 811, des Reaktors 810 und des Reagensverteilers 812 steuert. Im Falle des Synthetisierens von Oligonukleotiden arbeitet die Synthesevorrichtung während der meisten Syntheseschritte wie ein herkömmlicher Synthesizer, und der Computer 814 steuert den Reagensverteiler 812 so, dass dieser verschiedene Reagenzien zu dem Reaktor 810 transportiert. Bei einem photochemisch gesteuerten Entschützungsschritt transportiert der Reagensverteiler 812 einen Photosäurevorläufer in den Reaktor 810. Der Computer 814 betätigt das Dichtungsstellglied 811, um die Reaktionsbehälter zu isolieren, und sendet dann Daten an die DMD 801, um auf den Reaktor 801 ein Lichtmuster 807c zu projizieren. Nach dem Abschluss der Photoreaktionen wird das Lichtmuster 807c abgeschaltet, eine Löschlösung wird in den Reaktor 801 transportiert, das Dichtungsstellglied 811 wird angehoben, und das Synthesesteuerungssystem nimmt die Schritte der herkömmlichen Synthese wieder auf.
  • Variationen und Modifikationen
  • Viele Variationen und Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind möglich. Die 11A veranschaulicht eine Variante einer Reaktionsbehälterstruktur. Eine Maskenschicht 1103 wird auf den Boden des Reaktionsbehälters gegeben. Eine oder mehrere Öffnungen, die insgesamt ein Zehntel bis die Hälfte der Reaktionsbehälteroberfläche einnehmen, sind in den Masken hergestellt, durch die das Licht 1104 hindurchgehen kann. Die Maskenschicht 1103 ist vorzugsweise aus einer dünnen und chemisch beständigen Metallschicht, wie z. B. aus Cr, hergestellt. Oben auf der dünnen Metallschicht ist eine dünne SiO2-Schicht (nicht gezeigt) abgeschieden, um die Immobilisierung von Verknüpfermolekülen zu erleichtern. Diese Reaktionsbehälterbauweise ermöglicht die räumliche Trennung einer photochemischen Reaktion und von durch photochemisch erzeugtes Reagens hervorgerufenen chemischen Reaktionen. Die 11A veranschaulicht eine durch Photosäure hervorgerufene chemische Reaktion. Bei Lichtexposition werden in den offenen Gebieten aus einem Photosäurevorläufer Protonen, H+, erzeugt. Die Protonen diffundieren dann in umgebende Gebiete in dem Behälter und spalten säurelabile Schutzgruppen Pa in immobilisierten Oligomermolekülen 1106 ab. Diese Anordnung hilft, die Berührung zwischen photochemisch erzeugten radikalischen Zwischenprodukten und den Oligomeren so gering wie möglich zu halten und somit unerwünschte Nebenreaktionen zu unterdrücken, die aufgrund der Gegenwart radikalischer Zwischenprodukte erfolgen könnten.
  • Die 11B veranschaulicht eine weitere Variante der Reaktionsbehälterstruktur und Lichtexpositionsstrategie. Diese Ausführungsform ist ebenfalls ausgelegt, um die Möglichkeit für unerwünschte Nebenreaktionen aufgrund von radikalischen Zwischenprodukten _ herabzusetzen. Nur ein Bruchteil der Reaktionsbehälteroberfläche ist dem Licht 1114 ausgesetzt. Die Wahrscheinlichkeit für unerwünschte Nebenreaktionen in anderen Gebieten ist folglich herabgesetzt.
  • Die Anwendungen der chemischen Verfahren und der Vorrichtung (8A bis 8C) der vorliegenden Erfindung gehen über die Herstellung von Molekülarrays hinaus. Z. B. kann die Vorrichtung, bei der die DMD 801 benutzt wird, die in der 8A gezeigt ist, als eine universelle Assay-Vorrichtung zum Untersuchen chemischer und biochemischer Reaktionen benutzt werden. Die digitale Mikrospiegelvorrichtung 801 steuert die Lichtdosen in den einzelnen Reaktionsbehältern eines Reaktors 810 präzis und gleichzeitig. Dieses Merkmal ermöglicht es, die Herstellung von photochemisch erzeugtem Reagenz in allen Reaktionsbehältern präzis zu steuern und daher eine Parallelanalyse großen Umfangs durchzuführen.
  • Beispiel I
  • Herstellung von Mikroreaktionsbehältern
  • In diesem Beispiel ist die Bildung von Mikroreaktionsbehältern veranschaulicht. Die 13A veranschaulicht schematisch den benutzten Herstellungsvorgang. In dem ersten Herstellungsschritt wurde in einem zerstäubenden Bedampfer eine dünne, 200/1.000 Å dicke Bimetallschicht 1702 aus Cr/Cu auf ein Glassubstrat 1701 aufgedampft. Das Cr der dünnen Bimetallschicht 1702 schafft eine gute Haftung an der Glasoberfläche, und das Cu schafft eine gute Grundlage für das anschließende Elektroplattieren. Die Oberfläche wurde dann mit einem positiven, 18 μm dicken Photoresist 1703 schleuderbeschichtet. Die dünne Photoresistschicht 1703 wurde dann unter Benutzung der Photolithographie (Exposition gegenüber UV-Licht unter Benutzung eines Photomaskenausrichters und Entwicklung) mit einem Muster versehen. Elektroplattieren unter Benutzung einer Plattierlösung für Glanznickel wurde benutzt, um eine Platte einer dünnen, 18 μm dicken Ni-Schicht auf die freiliegende Cu-Oberfläche aufzutragen, was die Mikrobehälterbarrieren 1704 ergab. Die Formel der Lösung und die Plattierbedingungen sind wie folgt: NiSO4.6H2O: 300 g/l, NiCl2·6H2O: 30 bis 40 g/l, Borsäure: 40 g/l, Natriumsaccharin: 2 bis 5 g/l, Butindiol (2-Butin-1,4-diol): 100 mg/l, Natriumlaurylsulfat: 50 ppm, pH: 3,0 bis 4,2, Stromdichte: 10 A/dm2, Temperatur: 50°C. Die dünne Photoresistschicht 1703 wurde dann abgelöst. Die dünne Cu-Schicht wurde unter Benutzung einer Lösung aus HNO3 : HP3O4 : CH3COOH = 0, 5 : 50,0 : 49,5 (Volumen) geätzt, und die dünne Cr-Schicht wurde unter Benutzung einer Lösung aus HCl : H3PO4 : CH3COOH = 5 : 45 : 50 (Volumen), aktiviert durch einen Aluminiumstab, geätzt. Dann wurde eine dünne aufgeschleuderte Glasschicht auf die Probenoberfläche geschichtet, um eine dünne SiO2-Schicht 1705 zu bilden. Die 13B zeigt eine Fotografie der resultierenden Mikrobehälterprobe.
  • Beispiel II
  • Lösungsisolierung unter Benutzung von gemusterten nichtnetzenden dünnen Schichten
  • Dieses Beispiel veranschaulicht, dass unter Benutzung der Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung gelehrt werden, Arrays von Tröpfchen organischen Lösemittels auf einer Glasoberfläche gebildet wurden, die mit nichtnetzenden dünnen Schichten gemustert war. Die 14A veranschaulicht schematisch einen Herstellungsvorgang zum Schichten einer gemusterten, nichtnetzenden dünnen Schicht auf ein Glassubstrat 1801. Ein Glassubstrat 1801 wurde in einer warmen Lösung aus H2SO4 : H2O = 1 : 1 (Volumen) gründlich gereinigt. Das Substrat 1801 wurde dann mit einem positiven, etwa 2,7 μm dicken Photoresist schleuderbeschichtet. Die dünne Photoresistschicht 1802 wurde unter Benutzung eines Photomaskenausrichters UV-Licht ausgesetzt und entwickelt. In diesem Beispiel wurde eine Photomaske benutzt, die eine Matrix runder Punkte enthielt, und daher wurde dasselbe Muster in der dünnen Photoresistschicht 1802 gebildet. Das gemusterte Glassubstrat wurde in einem Trockenschrank in eine Lösung aus 1 mM FDTS (1H,1H,2H,2H-Perfluordecyltrichlorsilan) in wasserfreiem Isooctan getaucht und mindestens etwa 10 Minuten einweichen lassen. Dann wurde das Substrat 2- bis 3-mal mit Isooctan abgespült, gefolgt von einer gründlichen Spülung mit Wasser. Der Photoresist wurde abgelöst, und eine dünne FDTS-Schicht blieb als eine nichtnetzende dünne Schicht auf der Glasoberfläche zurück.
  • Prüfungen der Benutzungswirkungen wurden in einer abgeschlossenen Zelle durchgeführt, um die Verdunstung von flüchtigen Lösemitteln zu vermeiden. Während einer Prüfung wurde die Zelle mit einem Prüflösemittel oder -lösung befüllt und dann entleert. Prüfungen wurden an verschiedenen organischen/anorganischen Lösemitteln und Lösungen, einschließlich CH2Cl2, CH3CN, CH3OH, CH3CH2OH, TCA/CH2Cl2-Lösung, I2/Tetrahydrofuran-Wasser-Pyridin-Lösung und anderer Lösungen, die an der Oligonukleotidsynthese beteiligt sind, durchgeführt. Die Bildung von Tröpfchen-Arrays wurde bei jedem Prüflösemittel/-lösung beobachtet. Die 14B zeigt eine Fotografie eines Methanoltröpfchen-Arrays, das auf einer Glasplatte gebildet ist, die mit einer nichtnetzenden dünnen Schicht gemustert ist.
  • Beispiel III
  • Array-Synthese auf einem gemusterten Glassubstrat unter Benutzung von PGA
  • Diese Experimente veranschaulichen die Benutzung des Geräts der vorliegenden Erfindung beim Herstellen von Molekülmikroarray-Chips.
  • Es wurden die hergestellten Glassubstrate, die in spezifizierten Gebieten isolierte Reaktionsbehälter enthalten, wie in dem Beispiel VI beschrieben, eingesetzt. Die Glasplatten wurden mit Verknüpfermolekülen (10% N-(3-Triethoxysilylpropyl)-4-hydroxylbutyramid in Ethanol) derivatisiert, die freie OH-Gruppen enthalten. Die Synthese auf dem Glassubstrat wurde unter Benutzung eines Reaktors und eines digitalen Lichtprojektors, wie in dieser Beschreibung beschrieben, und eines DNS-Synthesizers (Perspective) durchgeführt. Die Oligonukleotidsynthese wurde gemäß der Vorschrift, die in der Tabelle 2 gezeigt ist, durchgeführt. Die Glasoberfläche wurde zuerst mit DMT-T-Phosphoramidit in Berührung gebracht, um den ersten Rest anzukoppeln. Die Sequenzen wurden in nachfolgenden Schritten mit Verkappungs- und Oxidationsreagenzien behandelt und vor und nach jedem Schritt der Reaktionen mit CH3CN gewaschen. Die Glasplatte wurde dann mit einem PGA (0,4 von 50%igem Triarylsulfoniumhexafluorphosphat in CH2Cl2) behandelt, das von dem Synthesizer geliefert wurde, und einer computererzeugten, zu einem Muster gebildeten Lichtbestrahlung (30 s) aus einer Quelle parallelgerichteten Lichtes von 365 nm und 3 mW Lichtquellenintensität (Stanford, CA) ausgesetzt. Die Oberfläche wurde dann ausgiebig mit CH3CN gewaschen. In den Gebieten, die dem Licht ausgesetzt waren, wurden freie Hydroxylgruppen erzeugt. Nach den Oxidations- und Waschschritten wurde die Oberfläche in einem zweiten Kopplungsschritt mit fluoresceinmarkierten Phosphoramiditmonomeren in Berührung gebracht. Die synthetisierten Molekülarrays wurden mit wässriger NaOH-Lösung (0,1 M) behandelt. Das Array enthält fluoreszenzmarkierte Dimere, die unter einem Fluoreszenzmikroskop (Bio-Rad, Richmond, CA) betrachtet wurden. Die Ergebnisse sind in der 15 gezeigt.

Claims (8)

  1. Vorrichtung zum Durchführen chemischer oder biochemischer Reaktionen, umfassend: a) einen Reaktor, umfassend eine feste Oberfläche (810a), die mehrere Reaktionsstellen enthält, b) ein optisches System, das betriebsfähig mit dem Reaktor verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das optische System einen computergesteuerten räumlichen optischen Wandler umfaßt, um ein Bestrahlungsmuster zu bilden, wobei das optische System mehrere Reaktionsstellen selektiv bestrahlt.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der räumliche optische Wandler ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung (801), einer reflektierenden Flüssigkristall-Sichtanzeigenvorrichtung (821) und einer durchlässigen Flüssigkristall-Sichtanzeigenvorrichtung (841).
  3. Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei die digitale Mikrospiegelvorrichtung (801) mehrere einzelne Mikrokippspiegel (801a) umfaßt.
  4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, ferner umfassend einen Computer (814, 834, 854), der konfiguriert ist, um die Bewegung der digitalen Mikrospiegelvorrichtung zu steuern.
  5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend mindestens einen Filter (803, 823, 843) in Reihe mit einer Lichtquelle (802, 822, 842), wobei der Filter konfiguriert ist, um eine gewünschte Wellenlänge zu erzeugen.
  6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Substrat lichtdurchlässig ist.
  7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ferner umfassend einen Reagensverteiler (812, 832, 852) mit einem oder mehreren Einlässen und einem oder mehreren Auslässen, wobei der Verteiler konfiguriert ist, mindestens eine Reagenslösung an die Reaktionsstelle zu leiten.
  8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Reaktionsstellen isolierte Reaktionsbehälter (1004) sind.
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