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Gebiet der
Erfindung
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Hier
wird ein Abbauprodukt von bakteriellen Zellwänden, ein Immunmodulator, bestehend
aus bakteriellen Zellen oder ihren Abbaumaterialien offenbart, das
selektiv die IgE-Antikörperproduktion
unterdrücken kann
und für
die Bereitstellung ihrer Produktionsverfahren und Nahrungsmittel,
die sie enthalten.
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Verwandter
Stand der Technik
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Allergien
oder Atopien vom Direkttyp, wie z. B. eine Pollenallergie, Asthma,
atopische Dermatitis, Nahrungsmittelallergien, werden bekanntlich
von einem Antikörper
vom IgE-Isotyp-Immunglobulin vermittelt. Die Symptome der Atopie
werden hervorgerufen, wenn die IgE-Antikörper auf das Antigen reagieren,
was zu einer Freisetzung verschiedener physiologisch aktiver Substanzen
führt,
wie z. B. Histamin, Serotonin, Leukotrienen und anderen.
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Für die Verhinderung
und Behandlung von Allergien vom Direkttyp sind Arzneimittel, die
allgemein heute verwendet werden diejenigen, die zu den Mediatoren
antagonistisch wirken, z. B. Antihistamine, Arzneimittel, die die
Freisetzung von Mediatoren aus Mastzellen inhibieren und Corticosteroide,
die die Aktivierung verschiedener Immunozyten inhibieren, was zu
einer Inhibition der Cytokinproduktion führt.
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Da
Antikörper,
die eine direkte Allergie vermitteln, IgE-Antikörper sind, kann von einem Mittel,
das die IgE-Antikörperproduktion
unterdrückt,
angenommen werden, dass es für
die Behandlung der Allergie vom Direkttyp effektiv ist. Es gibt
jedoch keine effektiven Arzneimittel, die nur die IgE-Isotyp-Antikörper unterdrücken, ohne
die Unterdrückung
anderer Isotypen, wie z. B. IgG, IgA usw., die für die Körperverteidigungsmechanismen
gegenüber
verschiedenen infektiösen
Erkrankungen wichtig sind.
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Ein
Bericht über
die Modulation der IgE-Isotyp-Expression auf Zellen der Peyerschen
Plaques von keimfreien Ratten durch Verfütterung bestimmter Bakterien
und Bestandteilen der bakteriellen Zellwand oder durch Thymectomie
wird in The Journal of Immunology, 1989, 143, 1777–1783 offenbart.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Abbauprodukts
bakterieller Zellwände
bereitgestellt mit immunmodulatorischer Aktivität, wobei das Abbauprodukt bakterieller
Zellwände
Muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin
umfasst und erhältlich
ist durch Abbau oder Auflösen
der Zellwand von mindestens einem Bakterium, gewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium, der Gattung Brevibacterium
und der Gattung Microbacterium gehören, und mutierten Stämmen dieser Bakterien
zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung
einer Allergie.
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Vorzugsweise
wird der Abbau durch Induktion von lysogenen Bacteriophagen durchgeführt.
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In
geeigneter Weise kann der Abbau durch Autolyse bewirkt werden.
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Vorteilhafterweise
wird die bakterielle Zellwand mit Glucosidase und/oder Endopeptidase
verdaut.
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Vorzugsweise
wird die Auflösung
entweder mit Glucosidase oder Endopeptidase in dem Medium einer isotonischen
Lösung
durchgeführt
und umfasst weiterhin die Abtrennung des Protoplasten, erzeugt durch
den enzymatischen Verdau der bakteriellen Zellen aus dem Medium
und die enzymatische Behandlung des gelösten Materials der bakteriellen
Zellen mit dem anderen Enzym, gewählt aus Endopeptidase und Glucosidase, das
in dem obigen Schritt nicht verwendet wurde.
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In
geeigneter Weise kann die Lösung
mit entweder Glucosidase oder Endopeptidase in dem Medium einer
isotonischen Lösung
durchgeführt
werden und umfasst weiterhin die Zentrifugation der Lösung zum
Erhalt eines Überstandes
und die enzymatische Behandlung des Überstandes mit dem anderen
Enzym, gewählt aus
Endopeptidase und Glucosidase, das in dem obigen Schritt nicht verwendet
wurde.
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Vorteilhafterweise
ist die Glucosidase Eiweisslysozym oder N-Acetylmuramidase SG.
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Vorzugsweise
ist die Endopeptidase Bromelain.
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In
geeigneter Weise wird die Endopeptidase gewählt aus der Gruppe bestehend
aus Serratiopeptidase, Protease, erzeugt von Streptomyces griseus
(K-1-Stamm), Protease, erzeugt von Bacillus subtilis, Seaproze S,
erzeugt von Armillaria mellea (Naratake auf Japanisch), Trypsin,
Achromobacter-Protease I und Grifola frondosa (Maitake auf Japanisch)-Metalloendopeptidase.
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Vorteilhafterweise
umfasst das mindestens eine Bakterium Corynebacterium glutamicum
oder Corynebacterium herculis.
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Bevorzugt
umfasst das mindestens eine Bakterium Brevibacterium flavum.
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In
geeigneter Weise umfasst das mindestens eine Bakterium Microbacterium
ammoniaphilum.
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Dementsprechend
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines
Immunmodulators mit unterdrückender
Aktivität
auf die IgE-Produktion ohne unterdrückende Wirkung auf andere Antikörper-Isotypen.
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Als
Ergebnis extensiver Untersuchungen, um das oben erwähnte Problem
zu lösen,
haben die gegenwärtigen
Erfinder unerwarteterweise festgestellt, zunächst, dass bakterielle Zellen
von Corynebacterium, Brevibacterium und Microbakteriumarten und
mutierte Stämme,
die von diesen Arten abgeleitet sind, in der Lage sind, durch orale
Verabreichung dieser bakteriellen Zellen selektiv die IgE-Typ-Antikörperproduktion
zu unterdrücken
ohne supprimierende Wirkung auf die Produktion anderer Isotypen
und sogar mit einer Verstärkung der
Produktion dieser Antikörper
und zweitens, dass ein z. B. durch enzymatische Behandlung erhaltenes
Abbauprodukt der oben erwähnten
Bakterien eine wirksamere immunomodulatorische Aktivität aufweist
als diejenige der bakteriellen Zellen selbst. Diese Erkenntnisse
haben zu der Vervollständigung
der vorliegenden Erfindung geführt.
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Hier
wird ein Immunmodulator, ein immunmodulatorisches Nahrungsmittel,
ein immunmodulatorisches Getränk,
enthaltend bakterielle Zellen, die zur Art Corynebacterium, Brevibacterium
und Microbacterium gehören
und mutierte Stämme,
die von dieser Art abstammen und ein durch enzymatische Behandlung
erhaltenes Abbaumaterial der oben erwähnten Bakterien beispielsweise
offenbart.
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Hier
wird auch ein Medikament für
die Modulation der Immunfunktion durch orale Verabreichung einer pharmakologisch
wirksamen Menge von Bakterienzellen oder ihrer Abbaumaterialien
an einen Menschen offenbart.
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Ebenfalls
offenbart wird ein Abbauprodukt einer bakteriellen Zellwand (oder
ein Abbaumaterial) mit einer immunomodulatorischen Aktivität, das durch
Lösen der
Zellwand von mindestens einem Bakterium, gewählt aus der Gruppe, bestehend
aus den Bakterien, gehörend
zur Gattung Corynebacterium, Gattung Brevibacterium und Gattung
Microbacterium und mutierten Stämmen
dieser Bakterien erzeugt wird.
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Ebenfalls
offenbart wurde ein Verfahren zur Herstellung des oben gezeigten
Abbauprodukts einer bakteriellen Zellwand, das das Lösen der
Zellwand von mindestens einem Bakterium umfasst, gewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Bakterien, gehörend zur Gattung Corynebacterium,
Brevibacterium und Microbacterium und mutierten Stämmen dieser
Bakterien.
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Es
wird in dem Verfahren bevorzugt, die Zellwände mit entweder Glucosidase
oder Endopeptidase in einem Medium einer isotonischen Lösung zu
lösen,
den durch den enzymatischen Verdau der bakteriellen Zellen erzeugten
Protoplasten aus dem Medium abzutrennen und weiterhin das gelöste Material
der Bakterienzellen mit dem anderen Enzym, der Endopeptidase oder
Glucosidase, das in dem obigen Schritt nicht verwendet wurde, zu
behandeln.
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Es
wird bevorzugt, die Zellwände
mit einem der Enzyme Glucosidase oder Endopeptidase in einem Medium
einer isotonischen Lösung
(biologische Salzlösung)
zu lösen,
die Lösung
zum Erhalt eines Überstandes
zu zentrifugieren und den Überstand
mit dem anderen Enzym, Endopeptidase oder Glucosidase, das in dem
obigen Schritt nicht verwendet wurde, enzymatisch zu behandeln.
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Das
Abbauprodukt der Erfindung kann erhalten werden, wenn mindestens
30% oder 29% der bakteriellen Zellen abgebaut wurden. Dieses Ausmaß des Abbaus
kann im Hinblick auf eine Bestimmung gelöstem Hexosamins oder Glucosamins
beobachtet werden, das in dem Überstand
vorliegt. Alternativ kann dies im Hinblick auf die optische Dichte
der bakteriellen Suspension überwacht
werden. Die Erfindung kann mindestens 25% optische Dichte erreichen.
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Es
wird ein immunmodulatorisches Nahrungsmittel oder Getränk offenbart,
das das bakterielle Zellwandabbauprodukt der Erfindung enthält.
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Ebenfalls
offenbart wird ein Medikament für
die Behandlung oder Verhinderung einer Allergie, das indiziert ist
für eine
Verabreichung einer pharmakologischen effektiven Menge des Abbauprodukts
der Erfindung an eine Person, die an einer Allergie leidet und Verwendung
des Abbauprodukts für
die Herstellung eines Immunmodulators.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Bakterien, die zur Gattung
Corynebacterium, Brevibacterium und Microbacterium gehören und
mutierte Stämme
dieser Bakterien, für
die Herstellung von Medikamenten. Das heißt, hier wird ein Medikament
für die
Behandlung oder Verhinderung einer Allergie offenbart, das indiziert
ist, für
die Verabreichung einer pharmakologisch effektiven Menge der Bakterien
an eine Person, die an einer Allergie leidet; die Verwendung der
Bakterien für
die Herstellung eines Immunmodulators; eines immunmodulatorischen
Nahrungsmittels oder Getränks,
enthaltend die Bakterien und ein Medikament für die Bewirkung einer Immunmodulation,
das indiziert ist für
die Verabreichung einer pharmakologisch effektiven Menge der Bakterien
an eine Person, die an einer Immundefizienz leidet.
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Bei
der Produktion des Abbauprodukts wird folgendes bevorzugt: die bakterielle
Zellwand wird mit Glucosidase und/oder Endopeptidase verdaut; ein
Bakterium der Gattung Corynebacterium ist Corynebacterium glutamicum
oder Corynebacterium herculis; ein Bakterium der Gattung Brevibacterium
ist Brevibacterium flavum; ein Bakterium der Gattung Microbacterium
ist Microbacterium ammoniaphilum; die Glucosidase ist Eiweisslysozym
oder N-Acetylmuramidase SG; der Abbau wird durch Induktion von lysogenen
Bacteriophagen durchgeführt;
der Abbau wird durch Autolyse durchgeführt; die Endopeptidase ist
Bromelain oder die Endopeptidase ist eine, gewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Serratiopeptidase, Protease, erzeugt von Streptomyces griseus
(K-1-Stamm), Protease, erzeugt von Bacillus subtilis, Seaproze S,
erzeugt von Armillaria mellea (Naratake auf Japanisch), Trypsin,
Achromobacter Protease I und Grifola frondosa (Maitake in Japanisch)
Metalloendopeptidase.
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Es
wird bevorzugt, dass die immunmodulatorischen bakteriellen Zellen
Produkte sind, erzeugt von Kulturzellen von Stämmen, gehörend zu Arten von Corynebacterium,
Brevibacterium und Microbacterium und mutierten Stämmen, die
von diesen Arten abgeleitet sind, Erwärmen der Kultur zum Abtöten der
Zellen, Ernten der getöteten
Zellen und Trocknen. Im Hinblick auf die Produkte der immunmodulatorischen
Abbaumaterialien, die aus den oben erwähnten Bakterien hergestellt
werden, werden die kultivierten Zellen durch Autolyse abgebaut,
durch Induktion von lysogenen Bacteriophagen und enzymatische Behandlung
unter Verwendung von Zellwand verdauenden Enzymen.
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Bei
dieser Erfindung ist das Abbaumaterial durch eine Erzeugung von
löslichem
Hexosamin von mindestens 30% des gesamtbakteriellen Hexosamins definiert.
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Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
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Ein
Immunadjuvans wird für
die Substanzen, die die Antikörperbildung
durch Injektion, vermischt mit Antigen, an Tiere verstärken, benötigt. Getötete bakterielle
Zellen von Mycobacterium tuberculosis haben bekanntlich eine Immunoadjuvansaktivität. Ergebnisse
einer Studie für
die Erhellung eines effektiven Bestandteils der Adjuvansaktivität ergaben,
dass der kleinste Bestandteil Muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (MDP) war, ein Bestandteil
des Peptidoglycans der bakteriellen Zellwand. Die Existenz von MDP
ist auch in all den bakteriellen Zellen bekannt, die nicht Bakterien,
wie Mycobacterium tuberculosis sind, einschließlich pathogenen und auch nicht-pathogenen
Bakterien, unabhängig
von ihrer Klassifikation durch grampositive oder gramnegative Färbung. Tatsächlich zeigten
bakterielle Zellwandfraktionen, enthaltend MDP, eine Adjuvansaktivität bei fast
allen untersuchten Bakterien (Kotani, S. Seikagaku 48, 1081–1107 1976
in Japanisch).
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Eine
Mucopeptidschicht der bakteriellen Zellwand besteht aus langen Glucosidketten,
polymerisiert an der β-1,4-Bindung
von N-Acetylglucosamin und Muraminsäure und einer Peptidbindung,
die den Carbonsäurerest
von Muraminsäure
mit Alanin oder L-Glycin verbindet, D-Glutaminsäure, L-Lysin oder Mesodiaminopimelinsäure, D-Alanin
in diesem Wechsel. Das letzte D-Alanin macht eine Peptidbindung
mit einem Carbonsäurerest
von einer anderen D-Glutaminsäure,
Lysin und Mesodiaminopimelinsäure,
wobei es sich um die Peptidkette handelt, die von einer benachbarten
Glucosidkette abstammt. Die Zahl der Aminosäuren in dem Peptid, die die
beiden benachbarten Glucosidketten verbinden, beträgt abhängig etwas
von der Art der Bakterien, 6 und 7 Aminosäuren. Unter der Annahme, dass
viele Glucosidketten parallel zueinander angeordnet die Kettfäden sind,
sind die Peptidketten, die die Glucosidketten miteinander verbinden,
die Schussfäden,
daher formen sowohl Schuss- als auch Kettfäden eine netzähnliche
Struktur und werden als Peptidoglycan bezeichnet. Das Peptidoglycan
umgibt das Cytoplasma der bakteriellen Zelle und errichtet eine
starke Wand, die die bakterielle Zelle vor Schaden durch physikalische
Veränderung
des osmotischen Drucks schützt.
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Die
Enzyme, die die bakteriellen Zellwände löslich machen, gehören zu den
Hydrolaseenzymen. Abhängig
von ihren Wirkungsmechanismen sind sie in drei Kategorien unterteilt.
Eine sind Glycosidasen, die Kohlenhydratbindung hydrolysieren (z.
B. Eiweisslysozym), andere sind Endopeptidasen, die Peptidbindungen des
Peptidoglycans hydrolysieren und Amidasen, die eine Bindung zwischen
Muraminsäure
und einer Aminosäure
hydrolysieren.
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Dementsprechend
werden MDP-haltige Bestandteile aus bakteriellen Zellwänden durch
die oben erwähnten
Hydrolyseenzyme ausschließlich
der Amidase löslich
gemacht.
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Vor
diesem Hintergrund wurde Forschung zum Zwecke einer Verstärkung des
Immunstatus des Wirts durchgeführt.
Im Ergebnis wurde über
Studien hinsichtlich einer Resistenz gegenüber Tumoren berichtet (Bogdanov
IG. et al. Antitumor glycopeptide from Lactobacillus bulgaricus
cell wall FEBS LETT: 57(3) 259–261 1975),
einer Aktivierung der Makrophagenfunktion und einer zellulären Immunität, betreffend
eine antiinfektiöse
Immunität
und eine verstärkte
Produktion von IgG-Antikörpern,
die eine wichtige Rolle bei der Resistenz gegenüber bakteriellen und viralen
Infektionen spielen (Nammba Y et al. Effect of oral administration
of lysozyme or digested cell wall on immunostimulation in guinea
pigs. Infect Immun 31: 580–583
1981). Im Hinblick auf die Beziehungen zwischen chemischer Struktur
und biologischer Aktivität
wurden bakterielle Zellwände und
ihr enzymatisch verdautes Material untersucht (Kotani, S. Seikagaku
48, 1081–1107
1976 in Japanisch). Es wurden jedoch bis zum heutigen Tage keine
Feststellungen im Hinblick auf eine Produktion eines IgE-Antikörpers veröffentlicht,
der eine allergische Erkrankung, wie z. B. Atopie, induziert.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung sind die Bakterien nicht notwendigerweise spezielle Bakterien.
Im Hinblick auf die Sicherheit und die Verwendung von Abfallmaterial
können
jedoch Aminosäure
produzierende Bakterien, z. B. Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium
herculis, Corynebacterium fermentum, Brevibacterium fluvum und Microbacterium
ammoniaphilum erwähnt
werden.
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Die
gegenwärtigen
Erfinder untersuchten die Wirkung der oben erwähnten bakteriellen Zellen,
eines mutierten Stamms dieser Bakterien und enzymatisch verdauter
Materialien dieser Bakterienzellen auf die IgE-Antikörperproduktion
durch orale Verabreichung und haben festgestellt, dass jedes Bakterium
die IgE-Antikörperproduktion
durch Verabreichung von mit Wärme
getöteter
Bakterien unterdrückt,
sowie von enzymatisch verdauten Materialien der Bakterien, enthaltend
MDP und dass die IgE-produktionsunterdrückende Aktivität der bakteriellen
Zellen durch Verdau der Zellen mit Zellwand verdauenden Enzymen
verstärkt
wurde.
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Kulturen
von Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium, Brevibacterium und
Microbacterium gehören,
können
durch ein bekanntes Verfahren in einem geeigneten Medium hergestellt
werden. Jede Form einer Bakterienzellpräparation kann als Ausgangsmaterial
verwendet werden, wie z. B. eine Kultur selbst, zentrifugierte Zellen,
gefriergetrocknete Zellen, wärmegetötete Zellen
und sprühgetrocknete
Zellen für
den Zweck einer Herstellung der endgültigen Rohprodukte. Wärmegetötete Zellen
oder sprühgetrocknete
Zellen können
als das IgE-Produktions-immunmodulatorische Material mit unterdrückender
Wirkung auf die IgE-Produktion verwendet werden.
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Die
Produktion des immunmodulatorischen Abbaumaterials, ausgehend von
bakteriellen Zellpräparationen,
wird durch Löslichmachen
der bakteriellen Zellwand unter Verwendung von Zellwand verdauenden
Enzymen, Induktion von lysogenen Bacteriophagen und Autolyse unter
Verwendung endogener autolytischer Enzyme durchgeführt.
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Von
den oben erwähnten
Verfahren ist ein effizientes Verfahren für den Abbau von bakteriellen
Zellwänden
das Verfahren unter Verwendung von Glucosidase und/oder Protease
des Endopeptidasetyps.
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Die
vorliegende Erfindung zeigt, dass das Abbaumaterial, erzeugt durch
Verwendung sowohl von Glucosidase als auch Proteinase eine potentere
immunomodulatorische Aktivität
aufwies als dasjenige, das durch Verwendung von nur einem der beiden
Enzyme erzeugt wurde. Wenn man die Aktivität vergleicht, die von den beiden
Arten von Enzymen erzeugt wird, wird Glucosidase bevorzugt. Als
Beispiel einer Glucosidase werden Eiweisslysozym, bakterielles Lysozym
und N-Acetylmuramidase SG erwähnt.
Von diesen wird Eiweisslysozym vom Standpunkt der Sicherheit des
Produkts empfohlen, da dieses Enzym als Nahrungsmitteladditiv verwendet
wird.
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Als
Beispiel einer Endopeptidase können
Bromelain, Serratiopeptidase, Protease, erzeugt von Streptomyces
griseus (K-1-Stamm, Pronase®), Protease, erzeugt von
Bacillus subtilis (NagaseR), Seaproze S,
erzeugt von Armillaria mellea (Naratake auf Japanisch), Achromobacter-Protease
1 (Lysylendopeptidase) und Metalloendopeptidase, erzeugt von Grifola
frondosa (Maitake auf Japanisch) erwähnt werden. Von diesen wird Bromelain
im Hinblick auf die Sicherheit des Produkts empfohlen, da dieses
Enzym als Nahrungsmitteladditiv verwendet wird.
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Die
Empfindlichkeit bakterieller Zellen gegenüber einem Glucosidaseverdau
unterscheidet sich abhängig
vom bakteriellen Stamm. Die Empfindlichkeit kann durch Addition
von Penicillin oder Glycin zum Kulturmedium., wie beschrieben in
den Beispielen 1 und 2, verstärkt
werden. Die Enzymbehandlung wird unter fast optimalem pH der jeweiligen
Enzyme durchgeführt.
Die Behandlung durch Glucosidase und Endopeptidase wird bei fast
neutralem pH, d. h. pH 5 bis 8, durchgeführt. Eine Enzymmenge, zugefügt zu 1
g trockener bakterieller Zellen, liegt bei 0,01 bis 10 mg. Die Temperatur
der Enzymbehandlung kann bei Raumtemperatur bis 70°C durchgeführt werden.
DNase und RNase mit Konzentrationen von 10 bis 500 μg/ml können der
Reaktionsmischung zur Reduktion der Viskosität der Mischung zugefügt werden.
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Der
Abbau der bakteriellen Zellen durch eine Induktion von lysogenen
Bacteriophagen kann durch UV-Bestrahlung von jeder bakteriellen
Kultur von Corynebacterium, Brevibacterium und Microbacterium bewirkt
werden. Der Abbau von bakteriellen Zellen durch Autolyse kann durch
Inkubation bakterieller Zellen, suspendiert in gereinigtem Wasser,
bei ungefähr
50°C für 1 bis
3 Tage bewirkt werden.
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Ein
definitives Verfahren für
die Erzeugung des immunomodulatorischen Abbaumaterials der vorliegenden
Erfindung ist z. B. das folgende. Corynebacterium glutamicum wird
in einem geeigneten Medium kultiviert. Die Kultur wird zum Sammeln
der bakteriellen Zellen zentrifugiert. Die Zellen werden in physiologischer isotoner
Lösung,
wie z. B. physiologischer Salzlösung,
suspendiert und dann wird entweder Glucosidase, wie z. B. Eiweisslysozym,
oder Endopeptidase, wie z. B. Bromelain, der Suspension zum Löslichmachen
der bakteriellen Zellwand zugefügt.
Die bakterielle cytoplasmatische Membran und das Cytoplasma, umgeben
von der cytoplasmatischen Membran, werden als Protoplast auf dieser
Stufe der Enzymbehandlung vorliegen. Der Protoplast wird durch Zentrifugation
sedimentiert und verworfen. Dann wird der Überstand, der MDP enthaltende
Zellwandkomponenten enthält,
mit einem anderen Enzym behandelt, d. h. Endopeptidase (wenn das
im ersten Schritt verwendete Enzym Glucosidase ist), wie z. B. Bromelain
oder Glucosidase (wenn das im ersten Schritt verwendete Enzym Endopeptidase
ist), wie z. B. Eiweisslysozym.
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Ein
bevorzugtes Verfahren ist das folgende. Zunächst wird die bakterielle Zellwand
durch Behandlung mit Glucosidase löslich gemacht und der Protoplast
wird sedimentiert und verworfen und dann wird eine Endopeptidasebehandlung
der Überstandslösung durchgeführt. Eine
Eliminierung des Protoplasten reinigt das aktive Abbaumaterial der
gegenwärtigen
Erfindung, wie in dem Beispiel, effektiv. Das immunomodulatorische aktive
Abbaumaterial kann durch Zugabe von Ethanol oder Aceton zu dem Überstand
ausgefällt
werden.
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Ein
anderes Verfahren der Herstellung der vorliegenden Erfindung ist
das folgende. Corynebacterium glutamicum wird kultiviert und die
bakteriellen Zellen werden geerntet und in gereinigtem Wasser suspendiert. Dann
wird zunächst
eine Glucosidase der Suspension zugeführt und inkubiert, um die Zellwand
zu lysieren und dann wird Endopeptidase der Suspension zugefügt und es
wird inkubiert.
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Der
Abbauprozess der bakteriellen Zellen wird durch Schätzung der
optischen Dichte der bakteriellen Suspension bei einer Wellenlänge von
600 bis 660 nm, wie beschrieben in Beispiel 7, oder durch Hexosaminbestimmung
der Überstandslösung nach
Zentrifugation der bakteriellen Suspension, wie beschrieben in Beispiel
4, gemessen. Die Hexosaminbestimmung kann durch gewöhnliche
Verfahren, wie z. B. das Elson-Morgan-Verfahren und das Reissig,
Strominger und Leloir-Verfahren durchgeführt werden.
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Eine
verstärkte
Aktivität
auf die Immunmodulation aufgrund des Abbaus bakterieller Zellen
wird beobachtet, wenn mindestens 30% der bakteriellen Zellen im
Hinblick auf die gelöste
Hexosaminbestimmung abgebaut wurden. Alternativ wird eine mindestens
25%ige Reduktion der optischen Dichte der bakteriellen Suspension
als bevorzugt für
diesen Zweck, wie im Beispiel 4, aufgefunden.
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Eine
tägliche
Standard-Dosierung für
die orale Verwendung der immunmodulatorischen bakteriellen Zellen
und ihrer Abbaumaterialien der vorliegenden Erfindung liegt zwischen
0,2 und 2 g. Die gewünschte
Dosierung beträgt
ungefähr
1 g, äquivalent
zu getöteten
trockenen Zellen.
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Wenn
das immunmodulatorische Abbaumaterial der vorliegenden Erfindung
als Hauptmittel verwendet wird, kann es oral als Pulver, Tabletten,
Dispersion, Kapseln, Süßigkeit,
Brot, Nudel, Getränk
oder ähnliches
verwendet werden. Diese Produkte können durch die gewöhnlichen
Herstellungsverfahren erzeugt werden.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird genauer durch die folgenden Beispiele
illustriert, worin Prozentzahlen und Teile beide auf einer Gewichtsbasis
ausgedrückt
werden.
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Beispiel 1
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Abbaumaterial durch enzymatische
Behandlung
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Corynebacterium
glutamicum IAM 12435 wurde in ein L-förmiges Röhrchen inokuliert, enthaltend
10 ml Nährbrühe und unter
Schütteln
bei 30°C
7 Stunden inkubiert. 1 ml dieser Kultur wurde in jeden von 10 konischen
Kolben (Erlenmeyer Kolben) mit einer Kapazität von 500 ml und enthaltend
100 ml eines Mediums von Miura et al. (Hakko Kogaku Zasshi, Band
41, Nr. 5, Seiten 275–281,
1963) inokuliert und unter Schütteln
bei 30°C
für 24
Stunden inkubiert. Penicillin G wurde mit einer Konzentration von
0,2 U/ml in der logarithmischen Phase der Kultur zugefügt. Die
Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, um ungefähr 5 g Feuchtzellen
zu erhalten. Die Feuchtzellen wurden durch einmalige Zentrifugation
mit physiologischer Salzlösung
gewaschen. Dann wurde 1 l physiologischer Salzlösung dem Sediment zur Suspension
der Zellen zugefügt.
5 mg Eiweisslysozym wurde unter Rühren hinzugefügt. Nach
einem Rühren
bei 37°C
für eine
Stunde wurden 5 mg Serratiopeptidase zugefügt und dies wurde für eine Stunde
unter Rühren
bei 37°C
inkubiert. So wurde das Abbaumaterial hergestellt. Dies wurde für 30 Minuten
auf 80°C
erwärmt
und gefriergetrocknet. 5 g Trockenmaterial wurden erhalten.
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Beispiel 2
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Abbaumaterial durch die
enzymatischen Verdau und Reinigung
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Corynebacterium
glutamicum IAM 12435 wurde in ein L-förmiges Röhrchen inokuliert, enthaltend
10 ml Nährbrühe und unter
Schütteln
bei 30°C
für 7 Stunden
inkubiert. 1 ml dieser Kultur wurde in einen konischen Kolben (Erlenmeyer
Kolben) mit einer Kapazität
von 500 ml und enthaltend 100 ml Nährbrühe inokuliert und unter Schütteln bei
30°C 8 Stunden
inkubiert. Die gesamte Kultur in dem Kolben wurde in einen Gefäßfermenter
mit einem Innenvolumen von 2 l und enthaltend 1,5 l Mimura's Medium inokuliert
und bei 30°C
für 20
Stunden unter Belüftung
inkubiert. Penicillin G wurde mit einer Konzentration von 0,2 U/ml
in der logarithmischen Phase der Kultur zugefügt. Die Zellen wurden durch
Zentrifugation zum Erhalt von 7,5 g Feuchtzellen geerntet. Nach
einem Waschen der Feuchtzellen mit physiologischer Salzlösung durch
Zentrifugation wurden die Zellen wieder mit 200 ml physiologischer
Salzlösung
suspendiert und 5 mg Eiweisslysozym wurde unter Rühren für eine Stunde
bei 37°C
zugefügt.
Die Bewertung der Lysozymbehandlung wurde durch Schätzung der
optischen Dichte (OD) bei 660 nm für die vor und nach der Behandlung
erhaltenen Proben durchgeführt.
OD-Werte von 40fach
verdünnten
Suspensionen vor und nach Eiweiss-Lysozymbehandlung lagen bei 1,20
bzw. 0,77. Die Reduktion der optischen Dichte wird als 35,8% berechnet.
Die Inkubationsmischung wurde bei 1.300 Upm 30 Minuten zentrifugiert.
Das Sediment, das die Protoplasten enthielt, wurde verworfen und
der Überstand
wurde erhalten. Der Überstand
wurde mit 5 mg Serratiopeptidase versetzt und bei 37°C 1 Stunde
unter Rühren
inkubiert. So wurde das Abbaumaterial hergestellt. Dies wurde auf
80°C 30
Minuten erwärmt,
durch Dialyse entsalzt und gefriergetrocknet, um 0,2 g Trockenmaterial
zu erhalten.
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Beispiel 3
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Abbaumaterial durch enzymatischen
Verdau und Reinigung
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Das
immunmodulatorische Abbaumaterial, erzeugt gemäß dem Verfahren von Beispiel
2, worin 5 mg Bromelain anstelle der selben Menge Serratiopeptidase
verwendet wird. Die Bewertung der Lysozymbehandlung wurde durch
Schätzung
der OD bei 660 nm für
die Proben, erhalten vor und nach der Behandlung, durchgeführt. OD-Werte
von 40fach verdünnten
Suspensionen vor und nach Eiweiss-Lysozymbehandlung lagen bei 1,05
bzw. 0,76. Die Reduktion der optischen Dichte wird als 27,6% berechnet.
So wurden 0,3 g des Trockenmaterials erhalten.
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Beispiel 4
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Abbaumaterial durch enzymatischen
Verdau
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1
kg gefriergetrockneter bakterieller Zellen von Corynebacterium glutamicum
IAM 12435 wurden mit 12 l physiologischer Salzlösung suspendiert. Dann wurden
100 ml physiologische Salzlösung,
enthaltend 5 g des Eiweisslysozyms, der Suspension zugefügt. Nach
Rühren
für eine
Stunde bei 30°C
wurden 200 ml physiologischer Salzlösung, enthaltend 5 g Bromelain,
zugefügt
und es wurde bei 30°C
eine Stunde unter Rühren inkubiert,
um das Abbaumaterial der vorliegenden Erfindung herzustellen. Das
Material wurde sprühgetrocknet,
um 1 kg des Trockenmaterials zu erhalten.
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Die
Bewertung des Abbaus wurde durch Bestimmung von löslich gemachtem
Hexosamin von bakteriellen Zellen durchgeführt. 2/10 ml einer bakteriellen
Suspension wurden 5fach mit gereinigtem Wasser verdünnt und
bei 16.000 Upm 10 Minuten zentrifugiert und eine Überstandslösung wurde
abgetrennt. Der Hexosamingehalt der 5fach verdünnten Suspension und derjenige
in der Überstandslösung vor
und nach Lysozym- und Bromelainbehandlung wurden durch das Verfahren
von Reissig, Strominger und Leloir analysiert. Die Ergebnisse der Schätzung von
der bakteriellen Suspension, den Überständen vor der Lysozymbehandlung
und nach Bromelainbehandlung lagen bei 1.820,0 bzw. 535 μl/ml. Die
Menge der abgebauten Bakterien wird als 29,4% aus 535/1820 berechnet.
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Beispiel 5
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Abbaumaterial durch enzymatischen
Verdau
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Das
selbe Verfahren wie in Beispiel 4 wurde wiederholt, außer dass
gefriergetrocknete bakterielle Zellen von Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032 anstelle derjenigen von Corynebacterium glutamicum IAM 12435
verwendet wurden, um 1 kg des oben erwähnten trockenen Abbaumaterials
zu erhalten.
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Beispiel 6
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Abbaumaterial durch Autolyse
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1
kg gefriergetrockneter bakterieller Zellen von Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032 wurden in 20 l gereinigtem Wasser suspendiert und die
Suspension wurde bei 50°C
24 Stunden für
eine Autolyse der bakteriellen Zellen gehalten. Das Autolysat wurde
sprühgetrocknet
und 1 kg des trockenen Abbaumaterials wurde erhalten.
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Beispiel 7
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Abbaumaterial durch Zellyse
gemäß der lysogenen
Bacteriophagen-Induktion
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Eine
bakterielle Zellyse durch Induktion lysogener Bacteriophagen von
Corynebacterium wurde wie folgt durchgeführt.
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Corynebacterium
glutamicum ATCC 31830 wurde in einem konischen Kolben (Erlenmeyer
Kolben) mit einer Kapazität
von 500 ml und enthaltend 100 ml Nährbrühe inokuliert und unter Schütteln bei
30°C 24
Stunden inkubiert. Nach Ernte der bakteriellen Zellen durch Zentrifugation
wurden die Zellen in phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung suspendiert.
20 ml der bakteriellen Zellsuspension wurden in eine Petrischale
mit einem Durchmesser von 9 cm gegossen und mit UV-Licht 20 Sekunden
unter Rühren
unter Verwendung einer 15 W germiziden UV-Lampe in einer Entfernung
von 40 cm belichtet. Nach der Bestrahlung wurde die Suspension mit
20 ml Nährbrühe einer
2fachen Konzentration einer gewöhnlichen
Brühe versetzt
und 2 Stunden bei 30°C
unter Schütteln
kultiviert. Die optische Dichte bei 660 nm der bakteriellen Suspension
zu Beginn der Kultivierung betrug 5,0 und nach 2 Stunden Inkubation
betrug sie 2,2, was die bakterielle Lyse anzeigte.
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Beispiel 8
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Abbaumaterial durch enzymatischen
Verdau
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Corynebacterium
glutamicum ATCC 15354 wurde in 20 konische Kolben, enthaltend je
100 ml einer Nährbrühe, inokuliert
und unter Schütteln
bei 30°C
18 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet,
um ungefähr
3 g Feuchtzellen zu erhalten. Die Feuchtzellen wurden einmal durch
Zentrifugation mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Dann wurden
500 ml der physiologischen Salzlösung
dem Sediment zugefügt,
um die Zellen zu suspendieren. 4 mg Eiweisslysozym wurden hinzugefügt und zwar
unter Rühren.
Nach einem Rühren
bei 37°C
für 2 Stunden
wurden 4 mg Serratiopeptidase zugefügt und es wurde weiter 2 Stunden
bei 37°C
unter Rühren
inkubiert, um das Abbaumaterial der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Dies
wurde 30 Minuten auf 80°C
erhitzt und gefriergetrocknet, um 3 g des Trockenmaterials zu erhalten.
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Beispiel 9
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Supprimierende Aktivitäten auf
die IgE-Produktion von wärmegetöteten Zellen,
wärmegetöteten und
enzymatisch abgebauten Zellen und wärmegetöteten, enzymatisch abgebauten
und dann gereinigten Fraktionen
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Eine
Gruppe bestand aus 6 weiblichen Balb/c-Mäusen, die 6 Wochen alt waren,
und wurde mit Nahrungsmitteln gefüttert, die jeweils wärmegetötete, bakterielle
Zellen von Corynebacterium glutamicum enthielten, Präparationen
der vorliegenden Erfindung, wie erwähnt in den Beispielen 3 und
4. Nach 2 Wochen Fütterung
wurden die Mäuse
mit 0,1 ml physiologischer Salzlösung,
enthaltend 10 μg
Ei-Albumin und 1 mg Alaun immunisiert. Dann wurde jeder Maus durch
retroorbitale Punktur 14 Tage nach der Immunisierung Blut entnommen
und das Serum wurde abgetrennt. 6 Seren von jeder Gruppe wurden
gesammelt und der IgE-Antikörpertiter
der gesammelten Seren wurde durch Ratten-PCA-Reaktion gemessen.
Kurz gefasst, wurden 15 bis 20 Wochen alte männliche SD-Ratten auf dem Rücken rasiert und 0,1 ml Serum,
das vorher mit physiologischer Salzlösung verdünnt worden war, wurde intradermal
in den Rücken
von zwei Empfänger-Ratten
unter Pentobarbital-Anästhesie
injiziert. Nach 24 Stunden einer intradermalen Injektion von Seren
wurde 1 ml einer physiologischen Salzlösung-haltigen 1 mg Ei-Albumin-
und 10 mg Evans Blau-Farbstofflösung
intravenös
den Ratten unter Pentobarbital-Anästhesie injiziert. 30 Minuten
nach der intravenösen
Injektion wurden die Durchmesser von blauen Flecken, die auf dem
Rücken
an der Stelle der Seruminjektion auftraten, gemessen. Ein mittlerer
Durchmesser, der mehr als 5 mm betrug, wurde als positive Reaktion
bewertet. Ein Antikörpertiter
wurde als reziproker Wert der Serumverdünnung ausgedrückt. Von
den zwei Antikörpertitern,
die von den beiden Empfänger-Ratten
erhalten wurden, wurde der höhere
als Antikörpertiter
für jedes
der gesammelten Seren angenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle
1 dargestellt. In der Tabelle war die Bewertung der immunomodulatorischen
Aktivität signifikant,
wenn eine Differenz von mehr als zwei seriellen Verdünnungen
zwischen der Kontrollgruppe und der gefütterten Gruppe vorlag und ein
+ wurde für
die Differenz von jeder seriellen Verdünnung zugefügt.
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Wie
in Tabelle 1 dargestellt, unterdrückte eine Verabreichung an
Mäuse von
wärmegetöteten Zellen oder
ihrer abgebauten Materialien vor einer Antigenstimulierung die IgE-Antikörperproduktion.
Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Verabreichung die immunologische
Reaktivität
des Körpers
oder die Konstitution beeinflusste. Das Ergebnis, dass die stärkere Wirkung
bei einer Verabreichung des Abbaumaterials gemäß Beispiel 4 im Vergleich mit
getöteten
Zellen allein beobachtet wurde, zeigte, dass die enzymatische Behandlung der
bakteriellen Zellen die supprimierende Aktivität verstärkte, weiterhin, dass die supprimierende
Aktivität
für die
IgE-Antikörperproduktion
am stärksten
in Gruppen ausgeprägt
war, denen das Abbaumaterial gemäß Beispiel
3 verabreicht wurde, und dies zeigte, dass das aktive Abbaumaterial
im wesentlichen aus Bestandteilen der bakteriellen Zellwand bestand.
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Beispiel 10
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Verstärken der Aktivitäten auf
die IgG-Produktion von wärmegetöteten Zellen,
wärmegetöteten und
enzymatisch abgebauten Zellen und wärmegetöteten, enzymatisch abgebauten
und dann gereinigten Fraktionen
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Die
Wirkung des immunomodulatorischen Abbaumaterials auf die IgG-Antikörperproduktion
wurde durch ELISA von Anti-Ei-Albumin
IgG-Antikörperschätzung in
den Seren von Mäusen
gemäß Beispiel
9 überprüft. Zu den
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (eine Flachboden-ELISA-Platte
mit 96 Vertiefungen, Coster, Cambridge, MA, USA) wurden 50 μl einer Ei-Albumin-Lösung (0,1
mg/ml in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,5) zugefügt, was dann bei 4°C über Nacht
gehalten wurde. Nach einem Waschen der Vertiefungen mit einer Lösung, enthaltend
0,9% NaCl und 0,05% Tween 20, wurden 200 μl der bovinen Albuminlösung (1
mg/ml BSA in phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung (PBS
Nissui Pharmaceutical Co.)) den Vertiefungen zugefügt und es
wurde eine Stunde bei 37°C
inkubiert, um jede nicht-spezifische Bindung zu blockieren. Als
nächstes
wurde nach einem Waschen 50 μl
von Seren von Mäusen,
wie hergestellt in Beispiel 9, vorher mit PBS-Lösung, enthaltend 10 mg/ml BSA,
0,05% Tween 20 und 3% NaCl (Lösung
A) verdünnt,
den Vertiefungen zugefügt
und dies wurde eine Stunde bei 37°C
gehalten. Dann wurden nach Waschen der Vertiefungen zu den Vertiefungen
50 μl von
Peroxidasemarkierten Anti-Maus IgG Ziegenseren, vorher 10.000fach
mit Lösung
A verdünnt,
zugefügt.
Der Inhalt der Vertiefungen wurde dann eine Stunde bei 37°C inkubiert
und gewaschen. Dann wurden zu jeder der Vertiefungen 100 μl einer Substratlösung (o-Phenylendiamin
40 mg, 20 μl
30%iges Wasserstoffperoxid in 100 ml Citrat-Natriumphosphatpuffer)
zugefügt.
Der Inhalt der Vertiefungen wurde dann bei Raumtemperatur gehalten.
Die optische Dichte bei 492 nm des Inhalts der Vertiefungen wurde
gemessen.
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Die
Antikörpermenge
wurde durch eine Kalibrierungskurve gemessen, hergestellt durch
Verwendung von Anti-Ovalbumin-Maus
IgG-Antikörper,
der durch eine Ovalbumin-gebundene Sepharose 4B-Säulen-Affinitätschromatographie
von Antiseren, erhalten von Mäusen,
immunisiert mit Ovalbumin und Freund's komplettem Adjuvans, gereinigt worden
war.
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Die
Ergebnisse der Antikörpermessung
in den Serumproben, verwendet in Beispiel 9, wurden in Tabelle 2
dargestellt.
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Die
Ergebnisse zeigten, dass die Verabreichung bakterieller Zellen von
Corynebacterium glutamicum oder ihrer enzymatisch abgebauten Materialien
die Produktion von IgG-Antikörpern
erhöhte.
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Beispiel 11
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Sicherheitsstudien an
dem Immunmodulator
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Die
Sicherheit des immunmodulatorischen abgebauten Materials mit einer
unterdrückenden
Aktivität der
IgE-Antikörperproduktion.
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Als
eine orale Toxizitätsstudie
einer einzelnen Dosis wurden an eine Gruppe von 5 männlichen
Ratten, die 4 Wochen alt waren und dem SD-Stamm angehörten, enzymatisch
abgebaute Materialien verabreicht, hergestellt durch das in Beispiel
4 beschriebene Verfahren, mit einer Dosis von 2 g/kg Körpergewicht.
Im Hinblick auf eine wiederholte orale Toxizität wurden einer Gruppe von 10
männlichen
Ratten, die 4 Wochen alt waren und dem SD-Stamm angehörten, Nahrungsmittel
gefüttert,
die eine Konzentration von 5% enthielten und zwar über 4 Wochen.
Beide Gruppen von Ratten wurden mit Ratten von respektiven Kontrollgruppen
verglichen. Es gab keine Toxizitätszeichen
nach einer einzelnen oralen Dosis der Testprobe und wie dargestellt
in Tabelle 3 gab es keine Veränderungen
im Anstieg des Körpergewichts
und des Verhaltens zwischen der Testgruppe und der Kontrolle.
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Beispiel 12
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Tablettenartiges Nahrungsmittel,
enthaltend den Immunmodulator
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90
mg des immunmodulatorischen Abbaumaterials von Corynebacterium glutamicum
bakteriellen Zellen unter Verwendung von Eiweisslysozym und Bromelain,
wie erhalten in Beispiel 4, 30 mg Stärke, 180 mg Avicell (Cellulose)
wurden gemischt und ein tablettenartiges Nahrungsmittel wurde auf
gewöhnliche
Weise hergestellt, so dass eine Tablette 300 mg wog.
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Beispiel 13
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Getränk, enthaltend den Immunmodulator
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Gereinigtes
Wasser wurde zu 2 Teilen eines Abbaumaterials von Corynebacterium
glutamicum bakteriellen Zellen zugefügt unter Verwendung von Eiweisslysozym
und Bromelain, erhalten wie in Beispiel 4, 10 Teilen Kakaobutter,
7 Teilen granulierter Zucker, 7 Teilen Milch und 0,05 Teilen eines
Emulgators, um die Gesamtmenge auf 100 Teile einzustellen und ein
Kakaogetränk
wurde auf gewöhnliche
Weise hergestellt.
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Beispiel 14
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Tablettenartiges Nahrungsmittel,
enthaltend den Immunmodulator
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90
mg eines enzymatisch abgebauten Materials von Corynebacterium ammoniaphilum
bakteriellen Zellen, erhalten unter Verwendung von Eiweisslysozym
und Bromelain wie in Beispiel 8, 30 mg Stärke, 180 mg Avicell (Cellulose,
Asahi Chemical Industry Co. Ltd.) wurden gemischt und ein tablettenartiges
Nahrungsmittel wurde auf gewöhnliche
Weise hergestellt, so dass eine Tablette 300 mg wog.
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Beispiel 15
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Getränk, enthaltend den Immunmodulator
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Gereinigtes
Wasser wurde zu 2 Teilen enzymatisch abgebautem Material von Corynebacterium
ammoniaphilum bakteriellen Zellen, erhalten unter Verwendung von
Eiweisslysozym und Bromelain wie in Beispiel 8, 10 Teilen Kakaobutter,
7 Teilen granuliertem Zucker, 7 Teilen Milch und 0,05 Teilen Emulgator
zugefügt, um
die Gesamtmenge auf 100 Teile einzustellen und ein Kakaogetränk wurde
auf gewöhnliche
Weise hergestellt.
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Beispiel 16
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Behandlung einer allergischen
Störung
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Patienten mit einem Alter von 18 bis 47 Jahren, 16 männlich und
8 weiblich, die an einem Heuschnupfen litten, wurden in 2 Gruppen
eingeteilt, die aus 12 Personen bestanden. 100 g eines Kakaogetränks, erhalten
in Beispiel 13, wurden täglich
für 6 Monate
in einer Gruppe verabreicht. Die andere Gruppe diente als Kontrolle.
Jede Person von jeder Gruppe durfte eine Baumwollmaske tragen und
die zeitweise Einnahme von Medikamenten, verschrieben von den Ärzten der
gegenwärtigen
klinischen Studie war erlaubt. Der allergische Status wurde alle
2 Monate für
jeden Patienten durch den selben Arzt bewertet und die Grundsymptome über nasale,
okulare, Haut und respiratorische Zeichen wurden bewertet. Die Bewertung
der klinischen Merkmale war normal (0), schwach (1), moderat (2)
und schwer (3). Das Gesamt-IgE-Niveau in dem zu Beginn und zum Ende
der Studie erhaltenen Serum wurde durch RIST- (Radioimmunosorbenttest)
Verfahren gemessen.
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Der
Unterschied in den Durchschnittswerten der Gesamtsummen der klinischen
Bewertungen zwischen beiden Gruppen wurde durch einen einfach Ausläufer-t-Test überprüft. Die
Unterschiede der IgE-Niveaus während
6 Monaten vor und nach der Behandlung wurden für jede Gruppe durch den Doppelausläufer-T-Test
verglichen. Die Signifikanz wurde bei p < 0,05 akzeptiert. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 4 zusammengefasst.
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Die
klinische Bewertung in der Gruppe, die den Immunmodulator aß, war deutlich
geringer als die der Kontrollgruppe. IgE-Niveaus dieser Gruppe waren ebenfalls
signifikant erniedrigt. Es wurde jedoch keine signifikante Abnahme
des IgE-Niveaus der Kontrollgruppe beobachtet.
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