DE69921966T2

DE69921966T2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von cytostatika und deren kristallformen

Info

Publication number: DE69921966T2
Application number: DE69921966T
Authority: DE
Inventors: Hans Hofmann; Marion Mahnke; Klaus Memmert; Frank Petersen; Thomas Schupp; Ernst Küsters; Michael Mutz
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2019-02-18
Also published as: SK286517B6; IL137691A; EP1054994A4; US20090326239A1; KR20010041068A; ATE282710T1; SK287677B6; NO322588B1; TR200002431T2; KR20070058021A; DK1054994T3; JP3681109B2; JP2002504346A; CN1286839C; US20020165256A1; EP1428826A2; US6656711B2; EP1428826A3; KR100873526B1; JP2005068156A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues biotechnologisches Herstellungsverfahren, das verwendet werden kann in einem industriellen Maßstab für die Herstellung von Epothilonen, insbesondere ein Verfahren zur Konzentration dieser Verbindungen in dem Kulturmedium.
Hintergrund der Erfindung:
Von den existierenden cytotoxisch wirksamen Inhaltsstoffen oder Wirkstoffen zur Behandlung von Tumoren, spielt Taxol^® (Paclitaxel; Bristol-Myers Squibb), ein Mikrotubuli stabilisierendes Mittel, eine wichtige Rolle und weist einen beträchtlichen wirtschaftlichen Erfolg auf. Taxol besitzt jedoch eine Anzahl von Nachteilen. Insbesondere ist seine sehr geringe Löslichkeit in Wasser ein Problem. Es wurde daher notwendig Taxol^® in einer Formulierung mit Cremophor EL^® (polyoxyethyliertes Ricinusöl; BASF, Ludwigshafen, Deutschland) zu verabreichen. Cremophor EL^® weist schwere Nebeneffekte auf; z.B. verursacht es Allergien, die in mindestens einem Fall sogar zum Tod eines Patienten geführt haben.
Obwohl die Taxanklasse der Mikrotubuli stabilisierenden Antikrebsmittel gelobt wurde als "vielleicht der wichtigste Beitrag zu dem pharmazeutischen Kampf gegen Krebs in der letzten Dekade" (s. E. K. Rowinsky, Ann. rev. Med., 48, 353 bis 374 (1997)), und trotz des wirtschaftlichen Erfolges von Taxol^®, stellen diese Verbindungen noch immer keinen tatsächlichen großen Durchbruch dar bei der Chemotherapie von Krebs. Die Behandlung mit Taxol^® ist verbunden mit einer Reihe von beträchtlichen Nebeneffekten, und wenige Primärklassen von kompakten Tumoren, nämlich Kolon- und Prostatatumore antworten auf diese Verbindung nur zu einem geringen Ausmaß (s. E. K. Rowinsky, u.a.). Außerdem kann die Wirksamkeit von Taxol beeinträchtigt werden und sogar vollständig neutralisiert werden durch erworbene Resistenzmechanismen, insbesondere solchen, die auf der Überexpression von Phosphoproteinen basieren, die als Ausflusspumpen für wirksame Inhaltsstoffe wirken, wie z.B. eine „Multidrug-Resistenz" („Multiarzneimittelresistenz") aufgrund der Überexpression des Multidrug-Transportglykoproteins "P-Glykoprotein".
Die Epothilone A und B stellen eine neue Klasse dar von Mikrotubuli stabilisierenden cytotoxischen Wirkstoffen oder wirksamen Inhaltsstoffen (s. K. Gerth et al., J. Antibiot., 49, 560 bis 563 (1966)) der Formel:
worin R für Wasserstoff (Epothilon A) oder Methyl (Epothilon B) steht.
Die Verbindungen weisen die folgenden Vorteile gegenüber Taxol^® auf:

a) Sie weisen eine bessere Wasserlöslichkeit auf und sind daher leichter zugänglich für Formulierungen.
b) Es wurde berichtet, dass sie in Zellkulturexperimenten auch wirksam sind gegen die Proliferation von Zellen, die, aufgrund der Wirksamkeit der P-Glykoproteinausflusspumpe die sie "multidrug-resistent" macht, Resistenz zeigt gegenüber der Behandlung mit anderen chemotherapeutischen Mitteln einschließlich Taxol^® (s. D. M. Bolag et al., "Epothilones, a new class of microtubule-stabilizing agents with a Taxol-like mechanism of action", Cancer Research 55, 2325 bis 2333 (1995)). Und
c) es konnte gezeigt werden, dass sie immer noch sehr wirksam sind in vitro gegenüber einer Taxol^®-resistenten Ovarialkarzinom-Zelllinie mit modifiziertem β-Tubulin (s. R. J. Kowalski et al., J. Biol. Chem. 272(4), 2534–2541 (1997)).

Die pharmazeutische Anwendung der Epothilone, z.B. für eine Tumorbehandlung, ist möglich auf eine analoge Art und Weise zu der, die für Taxol beschrieben ist, siehe z.B. US 5 641 803 ; US 5 496 804 ; US 5 565 478 ).
Um in der Lage zu sein, die Epothilone auf einem größeren Maßstab für pharmazeutische Zwecke zu verwenden, war es jedoch notwendig, geeignete Mengen dieser Verbindungen zu erhalten. Bis jetzt wurde in der Literatur die Extraktion von natürlichen Substanzen mit Hilfe von Myxobacterien, insbesondere den Epothilonen aus dem Zellstamm Sorangium Cellulosum Soce90 (hinterlegt unter der Nummer 6773 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, siehe WO 93/10121) beschrieben. Um eine ausreichende Konzentration der natürlichen Substanzen, insbesondere der Epothilone, in dem Kulturmedium für die nachfolgende Extraktion zu erhalten, wurde zuvor immer ein Adsorbatharz, basierend auf Polystyrol, zugegeben, z.B. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, Deutschland).
Der Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, dass es bei einem großen Maßstab zu einer Vielzahl von Problemen führt. Ventile werden beeinträchtigt durch den Kunststoff oder das Harz in kugeliger Gestalt, Rohre können verstopfen, und Apparate können größerem Abrieb ausgesetzt werden aufgrund mechanischer Reibung. Der Kunststoff kugeliger Gestalt ist porös und weist daher eine große Innenoberfläche auf (ca. 825 m²/g Kunststoff). Die Sterilisation wird ein Problem, da Luft, die in dem Kunststoff eingeschlossen ist, nicht autoklaviert ist. Daher kann das Verfahren nicht praktikabel in einem großen Maßstab ausgeführt werden durch Anwendung der Zugabe oder Addition von Harz oder Kunststoff.
Andererseits kann ohne die Zugabe von einem Kunststoff in kugeliger Gestalt eine zufriedenstellende oder ausreichende Konzentration von Epothilonen nicht in dem Kulturmedium erreicht werden.
Überraschenderweise wurden nun die Bedingungen gefunden zum Auffinden eines Auswegs aus diesem Dilemma, das es ermöglicht, dass eine ausreichende Konzentration an natürlichen Substanzen erhalten wird aus Mikroorganismen, insbesondere Myxobacterien, die Epothilone herstellen, wie Epothilon A oder B, insbesondere eine Konzentration von Epothilon A und B in dem Kulturmedium ohne die Zugabe von Kunststoffen oder Harzen, und auf diese Weise die Herstellung dieser Verbindungen ermöglichen, insbesondere Epothilonen, um in einem technischen oder industriellen Maßstab ohne die oben genannten Nachteile ausgeführt zu werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ein Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentration von Epothilonen in einem Kulturmedium für die biotechnologische Herstellung dieser Verbindungen, wobei dieses Verfahren Mikroorganismen umfasst, welche diese Verbindungen bildet, wobei das Medium mit ein oder mehr Cyclodextrinen als Komplex bildende Komponente versetzt wird, und die Cyclodextrine ausgewählt sind aus

a) α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin, γ-Cyclodextrin, δ-Cyclodextrin, ε-Cyclodextrin, ζ-Cyclodextrin, η-Cyclodextrin und θ-Cyclodextrin, oder
b) einem Cyclodextrinderivat, das ausgewählt ist aus Derivaten von (1) einem Cyclodextrin, worin ein oder mehr und bis zu alle Hydroxygruppen verethert sind zu einem Alkylether; einem Arylhydroxyalkylether; einem Hydroxyalkylether; einem Carboxyalkylether; einem derivatisierten Carboxyniederalkylether, worin die derivatisierte Carboxygruppe für Aminocarbonyl, Mono- oder Diniederalkylaminocarbonyl, Morpholinocarbonyl, Piperidinocarbonyl, Pyrrolidinocarbonyl, Piperazinocarbonyl oder Alkyloxycarbonyl steht; einem Sulfoalkylether; (2) einem Cyclodextrin, worin ein oder mehr OH Gruppen verethert sind mit einem Rest der Formel -O-[Alk-O-]_n-H worin Alk für Alkyl steht und n eine ganze Zahl von und einschließlich 2 bis zu und einschließlich 12 ist; (3) einem Cyclodextrin, worin ein oder mehr OH Gruppen verethert sind mit einem Rest der Formel
worin R' für Wasserstoff, Hydroxy oder -O-(Alk-O)_z-H steht; Alk in allen Fällen für Alkyl steht; m, n und z eine ganze Zahl von 1 bis 12 sind; und Y für OR₁ oder NR₂R₃ steht, worin R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Niederalkyl stehen oder R₂ und R₃ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, für Morpholino, Piperidino, Pyrrolidino oder Piperazino stehen; oder (4) einem verzweigten Cyclodextrin, worin Veretherungen oder Acetale mit anderen Zuckermolekülen existieren, welche ausgewählt sind aus Glucosyl-, Diglucosyl- (G₂-β-Cyclodextrin), Maltosyl- und Dimaltosylcyclodextrin oder N-Acetylglucosaminyl-, Glucosaminyl-, N-Acetylgalactosaminyl- und Galactosaminylcyclodextrin; und einem Niederalkanoyl-, wie einem Acetylester eines Cyclodextrins; oder
c) Gemischen aus zwei oder mehr dieser Cyclodextrine und/oder Cyclodextrinderivate,

Ein weiterer Gesichtspunkt betrifft das entsprechende Kulturmedium, das einen entsprechenden Komplex bildenden Bestandteil umfasst und Mikroorganismen, insbesondere Myxobacterien, insbesondere des Stamms Sorangium, der geeignet ist zur Herstellung von Epothilonen, insbesondere Epothilon A und/oder B.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Epothilonen, insbesondere Epothilon A und/oder B, insbesondere die zwei reinen Verbindungen, insbesondere Epothilon B, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Epothilone erhalten werden durch Aufarbeitung eines Kulturmediums für die biotechnologische Herstellung dieser Verbindungen, das als Hersteller oder Erzeuger von natürlichen Substanzen Mikroorganismen umfasst, insbesondere Myxobacterien, die diese Verbindungen herstellen, und denen ein Komplex bildender Bestandteil zugesetzt ist, der löslich ist in dem Kulturmedium, und die nachfolgende Reinigung und, wenn es gewünscht ist, die Trennung der Epothilone, z.B. Epothilon A und B.
Ein vierter Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Epothilonen, insbesondere Epothilon A und B voneinander, das gekennzeichnet ist durch eine Chromatographie auf einer Umkehrphasensäule mit einem Elutionsmittel, das ein Niederalkylcyanid umfasst.
Die allgemeinen Begriffe, die oben und im Folgenden in dieser Beschreibung verwendet werden, weisen vorzugsweise die Bedeutungen auf, die im Folgenden angegeben sind:
Die Vorsilbe oder der Vorsatz "Nieder" gibt immer an, dass der entsprechend bezeichnete Rest bis zu maximal 7 Kohlenstoffatome enthält, insbesondere bis zu 4 Kohlenstoffatome, und verzweigt oder unverzweigt ist. Niederalkyl kann z.B. unverzweigt sein oder einmal oder mehr verzweigt, und steht z.B. für Methyl, Ethyl, Propyl, wie Isopropyl oder n-Propyl, Butyl, wie Isobutyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl oder n-Butyl, oder auch Pentyl, wie Amyl oder n-Pentyl.
Ein Kulturmedium für die biotechnologische Herstellung von Epothilonen, das Mikroorganismen enthält, die diese Verbindungen herstellen, insbesondere Myxobacterien, als Hersteller von natürlichen Substanzen, ist in erster Linie ein Medium, das einen entsprechenden (natürlich vorkommenden oder auch durch Kultivierung oder insbesondere durch genetische Modifikation erhältlichen) Mikroorganismus umfasst, insbesondere einen Myxobacterienstamm, der in der Lage ist, diese Verbindungen herzustellen, insbesondere ein Myxobacterium des Stamms Sorangium, vorzugsweise (insbesondere zur Epothilonherstellung) einen Mikroorganismus des Typs Sorangium Cellulosum Soce90 (siehe WO 93/10121), oder ein Biomaterial, das davon abstammt oder daraus abgeleitet ist (z.B. durch Mutagenese oder rekombinante Gentechnologie) oder aus Teilen dieses Myxobacteriums, insbesondere einem entsprechend abgeleiteten oder abstammenden Stamm, insbesondere dem Stamm, der die Bezugnahme BCE33/10 aufweist oder Mutanten davon, und außerdem zusammen mit Wasser, vorzugsweise andere herkömmliche und geeignete Bestandteilen von Kulturmedien, wie z.B. Biopolymere, Zucker, Aminosäuren, Salze, Nukleinsäuren, Vitamine, Antibiotika, Semiochemikalien, Wachstumsmedien, Extrakte aus Biomaterialien, wie z.B. Hefe oder andere Zellextrakte, Sojamehl, Stärke, wie Kartoffelstärke und/oder Spurenelemente, z.B. Eisenionen in komplexgebundener Form oder geeignete Kombinationen von allen oder einigen dieser Inhaltsstoffe und/oder auch analoge Zusätze. Die entsprechenden Kulturmedien sind dem Fachmann bekannt oder können durch bekannte Verfahren hergestellt werden (siehe z.B. die Kulturmedien in den Beispielen der vorliegenden Offenbarung oder in der WO 93/10121). Ein bevorzugtes Myxobacterium ist ein Stamm, der ausgewählt wird durch UV Mutagenese und Auswahl für die verstärkte Bildung von Epothilon A und/oder B über Sorangium Cellulosum Soce90, das hinterlegt ist bei der DSM unter der Nr. 6773, insbesondere die Mutante BCE33/10, die hinterlegt wurde unter der Nummer DSM 11999 am 9. Februar 1998 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland).
Stammkultur und morphologische Beschreibung des Stamms BCE 33/10: Der Stamm kann auf Cellulose als der einzigen Quelle von Kohlenstoff und Energie mit Kaliumnitrat als einzige Quelle von Stickstoff wachsen, z.B. auf Filterpapier über ST21 Mineralsalzagar (0,1 % KNO₃; 0,1 % MgSO₄ × 7 H₂O; 0,1 % CaCl₂ × 2 H₂O; 0,1 % K₂HPO₄; 0,01 % MnSO₄ × 7 H₂O; 0,02 % FeCl₃; 0,002 % Hefeextrakt; Standardspurenelementlösung; 1 % Agar). Auf diesem Medium werden dunkel rötlich-braun bis schwärzlich- braune Fruchtkörper gebildet. Sie bestehen aus kleinen Sporangiolen (ca. 15 bis 30 μm Durchmesser) und existieren in dichten Stapeln oder Haufen und Packungen verschiedener Größe.
Die vegetativen Bacilli weisen die typische Form von Sorangium auf (relativ kompakt, unter dem Phasenkontrastmikroskop dunkel, zylindrische Bacilli mit breiten, abgerundeten Enden, im Durchschnitt 3 bis 6 μm lang und 1 μm dick).
Die Epothilone sind in erster Linie Epothilon A und/oder B, aber auch andere Epothilone, z.B. Epothilon C und D, die genannt wurden in der internationalen Veröffentlichung WO 97/19086 und WO 98/22461, die Epothilone E und F, die genannt wurden in der WO 98/22461 und weitere Epothilone, die erhältlich sind aus entsprechenden Mikroorganismen.
Eine wasserlösliche einen Komplex bildende Komponente ist in erster Linie ein wasserlösliches Oligo- oder Polypeptidderivat oder insbesondere ein Oligo- oder Polysaccharidderivat von cyclischer oder helikaler Struktur, das eine intramolekulare Kavität bildet, die wegen ihrer ausreichenden hydrophoben Eigenschaften in einer Lage ist, Epothilone zu binden, insbesondere Epothilon A und/oder Epothilon B. Eine wasserlösliche einen Komplex bildende Komponente, die besonders bevorzugt ist, ist eine, die ausgewählt ist aus Cyclodextrinen oder (insbesondere) Cyclodextrinderivaten oder Mischungen davon.
Cyclodextrine sind cyclische (α-1,4)-gebundene Oligosaccharide von α-D-Glucopyranose mit einer relativ hydrophoben zentralen Kavität und einer hydrophilen äußeren Oberfläche.
Die folgenden werden insbesondere unterschieden (die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Glucoseeinheiten pro Molekül an): α-Cyclodextrin (6), β-Cyclodextrin (7), γ-Cyclodextrin (8), δ-Cyclodextrin (9), ε-Cyclodextrin (10), ζ-Cyclodextrin (11), η-Cyclodextrin (12) und θ-Cyclodextrin (13). Insbesondere bevorzugt sind δ-Cyclodextrin und ganz besonders α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin oder γ-Cyclodextrin oder Mischungen davon.
Cyclodextrinderivate sind in erster Linie Derivate der oben genannten Cyclodextrine, insbesondere von α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin oder γ-Cyclodextrin, insbesondere solche, in denen ein oder mehr bis zu alle Hydroxygruppen (3 pro Glucoserest) verethert oder verestert sind. Ether sind in erster Linie Alkylether, insbesondere Niederalkylether, wie z.B. Methyl- oder Ethylether, auch Propyl- oder Butylether; die Arylhydroxyalkylether, wie z.B. Phenylhydroxyniederalkylether, insbesondere Phenylhydroxyethylether; die Hydroxyalkylether, insbesondere Hydroxyniederalkylether, insbesondere 2-Hydroxyethylether, Hydroxypropylether, wie 2-Hydroxypropyl- oder Hydroxybutylether, wie 2-Hydroxybutylether; die Carboxyalkylether, insbesondere Carboxyniederalkylether, insbesondere Carboxymethyl- oder Carboxyethylether; derivatisierte Carboxyalkylether, insbesondere derivatisierte Carboxyniederalkylether, bei denen die derivatisierte Carboxygruppe für eine veretherte oder amidierte Carboxygruppe steht (in erster Linie Aminocarbonyl, Mono- oder Diniederalkylaminocarbonyl, Morpholinocarbonyl-, Piperidinocarbonyl-, Pyrrolidinocarbonyl- oder Piperazinocarbonyl oder Alkyloxycarbonyl), insbesondere Niederalkoxycarbonylniederalkylether, z.B. Methyloxycarbonylpropylether oder Ethyloxycarbonylpropylether; die Sulfoalkylether, insbesondere Sulfoniederalkylether, insbesondere Sulfobutylether; Cyclodextrine, in denen ein oder mehr OH Gruppen verethert sind mit einem Rest der Formel -O-[Alk-O-]_n-H worin Alk für Alkyl steht, insbesondere Niederalkyl, und n eine ganze Zahl von 2 bis 12, insbesondere 2 bis 5, insbesondere 2 oder 3, steht; Cyclodextrine, in denen ein oder mehrere OH-Gruppen verethert sind, mit einem Rest der Formel
worin R' für Wasserstoff, Hydroxy, -O-(Alk-O)_z-H, -O-(Alk(-R)-O-)_p-H oder
-O-(Alk(-R)-O-)_q-Alk-CO-Y steht; Alk in allen Fällen für Alkyl, insbesondere Niederalkyl steht; m, n, p, q und z für eine ganze Zahl von 1 bis 12, vorzugsweise 1 bis 5, insbesondere 1 bis 3, stehen; und Y für OR₁ oder NR₂R₃ steht, worin R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Niederalkyl stehen, oder R₂ und R₃ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, für Morpholino, Piperidino, Pyrrolidino oder Piperazino stehen;
oder verzweigte Cyclodextrine, worin Veretherungen oder Acetale mit anderen Zuckermolekülen vorliegen, insbesondere Glucosyl-, Diglukosyl- (G₂-β-cyclodextrin), Maltosyl- oder Dimaltosylcyclodextrin oder N-Acetylglukosaminyl-, Glucosaminyl-, N-Acetylgalactosaminyl- und Galactosaminyl-cyclodextrin.
Ether stehen in erster Linie für Alkanoylester, insbesondere Niederalkanoylester, wie z.B. Acetylester von Cyclodextrinen.
Es ist auch möglich, Cyclodextrine zu nehmen, in denen zwei oder mehrere verschiedene der Ether und Estergruppen gleichzeitig vorliegen.
Mischungen von zwei oder mehreren der Cyclodextrine und/oder Cyclodextrinderivate können auch vorliegen.
Bevorzugt werden insbesondere α-, β- oder γ-Cyclodextrine oder die Niederalkylether davon, wie z.B. Methyl-β-cyclodextrin oder insbesondere 2,6-Di-O-methyl-β-cyclodextrin, oder insbesondere die Hydroxyniederalkylether davon, wie z.B. 2-Hydroxypropyl-α-, 2-Hydroxypropyl-β- oder 2-Hydroxypropyl-γ-cyclodextrin.
Die Cyclodextrine oder Cyclodextrinderivate werden zu dem Kulturmedium vorzugsweise in einer Konzentration von 0,02 bis 10, vorzugsweise 0,05 bis 5, insbesondere 0,1 bis 4, z.B. 0,1 bis 2 Gew.-% (w/v) gegeben.
Cyclodextrine oder Cyclodextrinderivate sind bekannt oder können hergestellt werden durch bekannte Verfahren (s. z.B. US 3 459 731 , US 4 383 992 , US 4 535 152 , US 4 659 696 , EP 0 094 157 , EP 0 149 197 , EP 0 197 571 , EP 0 300 526 , EP 0 320 032 , EP 0 499 322 , EP 0 503 710 , EP 0 818 469 , WO 90/12035, WO 91/11200, WO 93/19061, WO 95/08993, WO 96/14090, GB 2 189 245 , DE 3 118 218 , DE 3 317 064 und die Druckschriften, die darin genannt sind, die sich auf die Synthese von Cyclodextrinen und Cyclodextrinderivaten beziehen, oder auch: T. Loftsson und M. E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation: Journal of Pharmaceutical Science 85 (10): 1017 bis 1025; R. A. Rajewski und V. J. Stella (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: In Vivo Drug Delivery: Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1142 bis 1169).
In der folgenden Beschreibung der Aufarbeitung und Reinigung wird Epothilon verstanden als ein Epothilon, das erhältlich ist aus dem entsprechenden Mikroorganismus, vorzugsweise Epothilon C, D, E, F oder besonders A oder ganz besonders bevorzugt Epothilon B. Sofern es nicht anders angegeben ist, wo "Epothilone" genannt sind, ist dies gedacht als ein allgemeiner Begriff, der einzelne Epothilone oder Mischungen einschließt.
Die Aufarbeitung der Epothilone wird bewirkt durch herkömmliche Verfahren; zu allererst durch Auftrennen einer Kultur in die flüssige Phase (Zentrifugat oder Filtrat) und feste Phase (Zellen) mit Hilfe der Filtration oder Zentrifugation (Tubularzentrifuge oder Separator). Der (Haupt-) Teil der Epothilone, die in dem Zentrifugat oder in dem Filtrat gefunden wird, wird dann direkt gemischt mit einem synthetischen Kunststoff oder Harz, z.B. einem Harz, das auf Polystyrol als Matrix basiert (im Folgenden einfach Polystyrolharz bezeichnet), wie z.B. Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas Deutschland GmbH, Frankfurt] oder Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Mailand] (vorzugsweise in einem Verhältnis von Zentrifugat : Harz-Volumen von ca. 10 : 1 bis 100 : 1, vorzugsweise etwa 50 : 1). Nach einem Zeitraum des Kontakts von vorzugsweise 0,25 bis 50 h, insbesondere 0,8 bis 22 h, wird das Harz abgetrennt, z.B. durch Filtration oder Zentrifugation. Wenn es notwendig ist, wird das Harz, nach Adsorption, mit einem stark polaren Lösemittel gewaschen, vorzugsweise mit Wasser. Die Desorption der Epothilone wird dann bewirkt mit einem geeigneten Lösemittel, insbesondere mit einem Alkohol, insbesondere Isopropanol. Die Lösemittelphase, insbesondere Isopropanolphase, wird dann entfernt von dem Lösemittel, vorzugsweise mit Hilfe von vorhergehender, simultaner oder nachfolgender Zugabe von Wasser, insbesondere in einem zirkulierenden Evaporator oder Rotationsverdampfer, wodurch es konzentriert wird, wenn es notwendig ist, und die erhaltene Wasserphase extrahiert wird mit einem Lösemittel, das geeignet ist zur Ausbildung einer zweiten Phase, wie z.B. einem Ester, z.B. einem Niederalkanolniederalkanoat, typischerweise Ethylacetat oder Isopropylacetat. Die Epothilone werden dadurch in die organische Phase transferiert. Dann wird die organische Phase bis zu dem notwendigen Ausmaß konzentriert, vorzugsweise bis zur Trockne, z.B. unter Verwendung eines Rotationsverdampfers.
Nachfolgend findet die weitere Verarbeitung statt, durch Anwendung der folgenden Stufen oder Schritte, wobei die Reinigungsstufe mit Hilfe einer Umkehrphasenchromatographie mit Elution mit einem Nitril eine erfinderische Stufe ist, und daher obligatorisch, während die anderen Stufen optional sind:

– molekulare Filtration (Gelchromatographie), z.B. auf einer Säule aus einem Material wie Sepahdex LH-20 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit einem Alkohol, wie z.B. Methanol, als Elutionsmittel;
– Trennung der Epothilone durch Umkehrphasenchromatographie, nachdem sie aufgenommen sind in einem geeigneten Lösemittel, und Elution mit einer Mischung von Nitril/Wasser (obligatorisch), vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass die Chromatographie ausgeführt wird auf einer Säule aus einem Material, insbesondere einem RP-18 Material, das beladen ist mit Kohlenwasserstoffketten, wie z.B. Kohlenwasserstoffketten, die 18 Kohlenstoffatome enthalten, und einem Elutionsmittel, das ein Nitril umfasst, insbesondere ein Niederalkylnitril, insbesondere Acetonitril, verwendet wird, insbesondere eine Mischung von Nitril/Wasser verwendet wird, insbesondere eine Mischung von Acetonitril/Wasser, vorzugsweise in einem Verhältnis von Nitril zu Wasser von etwa 1 : 99 bis 99 : 1, in erster Linie zwischen 1 : 9 und 9 : 1, z.B. zwischen 2 : 8 und 7 : 3, z.B. 3 : 7 oder 4 : 6.
– einfache oder mehrfache Extraktion des Rückstands (insbesondere nach Verdampfung) in einem Zweiphasensystem, bestehend aus Wasser und einem Lösemittel, das mit Wasser nicht misch bar ist, vorzugsweise einem Ester, insbesondere einem Niederalkylniederalkanoat, wie z.B. Ethylacetat oder Isopropylacetat;
– Adsorptionschromatographie, insbesondere durch Zugabe einer Säule von Kieselgel und ein Eluieren mit einem geeigneten Lösemittel oder Lösemittelgemisch, insbesondere einem Gemisch von Ester/Kohlenwasserstoff, z.B. Niederalkylalkanoat/C₄-C₁₀-Alkan, insbesondere Ethyl- oder Isopropylacetat/n-Hexan, worin das Verhältnis zwischen dem Ester und Kohlenwasserstoff vorzugsweise in dem Bereich liegt von 99 : 1 bis 1 : 99, vorzugsweise 10 : 1 bis 1 : 10, z.B. 4 : 1;
– Auflösen des Rückstands, der erhalten werden kann nach einer Konzentration, in einem geeigneten Lösemittel, wie einem Alkohol, z.B. Methanol;
– Mischen mit Aktivkohle und Entfernen davon;
– Umkristallisation, z.B. aus geeigneten Lösemitteln oder Lösemittelgemischen, z.B. bestehend aus Estern, Ester/Kohlenwasserstoffmischungen oder Alkoholen, insbesondere Ethyl oder Isopropylacetat : Toluol 1 : 10 bis 10 : 1, vorzugsweise 2 : 3 (Epothilon A) oder Methanol oder Ethylacetat (Epothilon B);

Die Aufarbeitung und Reinigung werden vorzugsweise ausgeführt wie folgt: Nach der Ernte wird eine Kultur getrennt in die flüssige Phase (Zentrifugat) und feste Phase (Zellen) mit Hilfe der Zentrifugation (Tubularzentrifuge oder Separator). Der Hauptteil der Epothilone wird in dem Zentrifugat gefunden, das dann direkt gemischt wird mit einem Polystyrolharz, wie z.B. Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas Deutschland GmbH, Frankfurt] oder Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Mailand] (vorzugsweise in einem Verhältnis von Zentrifugat : Harz-Volumen von ca. 10 : 1 bis 100 : 1, vorzugsweise etwa 50 : 1) und gerührt in einem Agitator oder einer Rührapparatur. Bei diesem Schritt werden die Epothilone von dem Cyclodextrin in den Kunststoff transferiert. Nach einem Zeitraum des Kontakts von ca. 1 h, wird der Kunststoff oder das Harz durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Die Adsorption der Epothilone auf dem Kunststoff oder Harz kann auch bewirkt werden in einer Chromatographiesäule, durch Hineingeben des Kunststoffs oder Harzes in die Säule und ein Durchlaufen des Zentrifugats durch oder über den Kunststoff oder das Harz. Nach der Adsorption wird der Kunststoff oder das Harz mit Wasser gewaschen. Die Desorption der Epothilone aus dem Kunststoff oder Harz wird mit Isopropanol bewirkt. Die Isopropanolphase wird dann von Isopropanol befreit, vorzugsweise durch die Zugabe von Wasser, insbesondere in einem zirkulierenden Evaporator oder Rotationsverdampfer, und die erhaltene Wasserphase wird mit Ethylacetat extrahiert. Die Epothilone werden aus der Wasserphase in die Ethylacetatphase transferiert. Dann wird der Ethylacetatextrakt bis zur Trockne konzentriert, durch Verwendung eines Rotationsverdampfers. Eine Anfangskonzentration des Epothilons wird dann erreicht mit Hilfe einer Molekularfiltration (z.B. Sephadex LH-20 [Pharmacia, Uppsala, Schweden] mit Methanol als Elutionsmittel). Die Peak- oder Bandenfraktionen aus der Molekularfiltration enthalten Epothilon A und B und weisen einen gesamten Epothilongehalt von > 10 % auf. Die Trennung dieser Spitzen oder Bandenfraktionen, die Epothilon A und B in einer Mischung enthalten, in die einzelnen Bestandteile folgt dann mit Hilfe einer Chromatographie auf einer "Umkehrphase" ("Reversed-Phase"), z.B. einer RP-18-Phase (die Phase ist modifiziert durch Alkylreste, die 18 Kohlenstoffatome pro Kette enthalten), mit einem geeigneten Elutionsmittel, vorzugsweise einem, das ein Nitril, wie Acetonitril (dies gibt bessere Trennung als z.B. Alkohole, wie Methanol) enthält. Epothilon A eluiert vor Epothilon B. Die Spitzen- oder Bandenfraktionen mit Epothilon B können noch geringe Mengen an Epothilon A enthalten, das entfernt werden kann durch weitere Trennung auf RP-18. Schließlich wird die Epothilon A-Fraktion direkt kristallisiert aus Ethylacetat : Toluol = 2 : 3, und die Epothilon B-Fraktion aus Methanol oder Ethylacetat.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein Verfahren zur Konzentration von Epothilonen, insbesondere Epothilon A und/oder B, insbesondere Epothilon B, in einem Kulturmedium für die biotechnologische Herstellung dieser Verbindung(en), das einen Mikroorganismus enthält, der geeignet ist, für diese Herstellung, insbesondere einen Sorangium-Stamm, insbesondere des Typs Sorangium Cellulosum Soce90, oder eine Mutante, die daraus entsteht, insbesondere den Stamm, der die Bezeichnung BCE 33/10 aufweist, Wasser und andere geeignete Bestandteile von Kulturmedien, wobei ein Cyclodextrin oder ein Cyclodextrinderivat, oder eine Mischung von zwei oder mehreren von diesen Verbindungen zu dem Medium gegeben wird, insbesondere ein oder mehrere, vorzugsweise ein oder zwei oder mehrere Cyclodextrine, die ausgewählt sind aus α-Cyclodextrin (6), β-Cyclodextrin (7), γ-Cyclodextrin (8), δ-Cyclodextrin (9), ε-Cyclodextrin (10), ζ-Cyclodextrin (11), η-Cyclodextrin (12), θ-Cyclodextrin (13), insbesondere α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin oder γ-Cyclodextrin; oder in erster Linie ein Cyclodextrinderivat oder eine Mischung von Cyclodextrinderivaten, die ausgewählt sind aus Derivaten eines Cyclodextrins, in dem ein oder mehr bis zu alle Hydroxygruppen verethert sind mit einem Alkylether, insbesondere einem Niederalkylether, wie z.B. Methyl- oder Ethylether, auch Propyl- oder Butylether; einem Arylhydroxyalkylether, wie Phenylhydroxyniederalkylether, insbesondere Phenylhydroxyethylether; einem Hydroxyalklyether, insbesondere Hydroxyniederalkylether, insbesondere 2-Hydroxyethylether, Hydroxypropylether, wie z.B. 2-Hydroxypropyl- oder Hydroxybutylether, wie z.B. 2-Hydroxybutylether; einem Carboxyalkylether, insbesondere Carboxyniederalkylether, insbesondere Carboxymethyl- oder Carboxyethylether; einem derivatisierten Carboxyalkylether, insbesondere einem derivatisierten Carboxyniederalkylether, in dem die derivatisierte Carboxygruppe Aminocarbonyl, Mono- oder Diniederalkylaminocarbonyl, Morpholinocarbonyl, Piperidinocarbonyl, Pyrrolidinocarbonyl oder Piperazinocarbonyl ist oder Alkyloxycarbonyl, insbesondere Niederalkyloxycarbonyl, wie z.B. vorzugsweise einem Niederalkoxycarbonylniederalkylether, z.B. Methyloxycarbonylpropylether oder Ethyloxycarbonylpropylether; einem Sulfoalkylether, insbesondere Sulfoniederalkylether, insbesondere Sulfobutylether; einem Cyclodextrin, bei dem ein oder mehr OH Gruppen verethert sind mit einem Rest der Formel -O-[Alk-O-]_n-H worin Alk für Alkyl, insbesondere Niederalkyl, steht, und n für eine ganze Zahl zwischen 2 bis 12, insbesondere 2 bis 5, insbesondere 2 oder 3, steht; einem Cyclodextrin, bei dem ein oder mehr OH Gruppen verethert sind mit einem Rest der Formel
worin R' für Wasserstoff, Hydroxy, -O-(Alk-O)_z-H, -O-(Alk(-R)-O-)_p-H oder
-O-(Alk(-R)-O-)_q-Alk-CO-Y steht; Alk in allen Fällen für Alkyl, insbesondere Niederalkyl steht; m, n, p, q und z für eine ganze Zahl von 1 bis 12, vorzugsweise 1 bis 5, insbesondere 1 bis 3, stehen; und Y für OR₁ oder NR₂R₃ steht, worin R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Niederalkyl stehen, oder R₂ und R₃ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, für Morpholino, Piperidino, Pyrrolidino oder Piperazino stehen;
oder einem verzweigten Cyclodextrin, worin Veretherungen oder Acetale mit anderen Zuckermolekülen existieren, und die ausgewählt sind aus Glucosyl-, Diglukosyl- (G₂-β-cyclodextrin), Maltosyl- oder Dimaltosylcyclodextrin oder N-Acetylglukosaminyl-, Glucosaminyl-, N-Acetylgalactosaminyl- und Galactosaminyl-cyclodextrin; oder einem Niederalkanoyl, wie einem Acetylester eines Cyclodextrins.
Besondere Bevorzugung wird einem Verfahren gegeben, bei dem Cyclodextrin und/oder das Cyclodextrinderivat zu dem Kulturmedium in einer Konzentration von 0,02 bis 10, vorzugsweise 0,005 bis 10, ganz besonders bevorzugt 0,05 bis 5, am meisten bevorzugt 0,1 bis 4, z.B. 0,1 bis 2, Gew.-% (w/v) gegeben wird.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß einem der zwei vorhergehenden Absätze, bei dem das Cyclodextrinderivat ausgewählt ist aus einem Cyclodextrin, insbesondere β-Cyclodextrin, und einem Hydroxyniederalkyl-Cyclodextrin, insbesondere 2-Hydroxypropyl-α-, -β- oder -γ-Cyclodextrin; oder Mischungen von ein oder mehreren davon; wobei 2-Hydroxyrpropyl-β-cyclodextrin selbst besonders bevorzugt ist.
Die Erfindung betrifft auch insbesondere ein Kulturmedium, das ein Cyclodextrin umfasst, ein Cyclodextrinderivat oder eine Mischung von zwei oder mehr Komplex bildenden Komponenten, die ausgewählt sind aus Cyclodextrinen und Cyclodextrinderivaten, insbesondere einem Cyclodextrin oder Cyclodextrinderivat, wie es in dem drittletzten Absatz definiert ist, insbesondere wie in dem zweitletzten Absatz, oder eine Mischung zweier oder mehrerer dieser Verbindungen, und einen Mikroorganismus, der geeignet ist zur Herstellung von Epothilonen, insbesondere Epothilon A und/oder B, vorzugsweise einen Stamm der Gattung Sorangium, insbesondere einen Stamm von Sorangium Cellulosum, z.B. den Stamm Soce90 oder eine Mutante, die daraus entsteht, insbesondere den Stamm BCE 33/10.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Epothilon A und/oder B, insbesondere der zwei reinen Verbindungen, insbesondere Epothilon B, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Epothilone getrennt werden, z.B. durch Zentrifugation in die feste und die flüssige Phase (Zentrifugat) durch Aufarbeitung eines Kulturmediums für die biotechnologische Herstellung dieser Verbindungen, wie oben beschrieben, dem eine Komplex bildende Komponente zugesetzt worden ist, die löslich ist in dem Kulturmedium, insbesondere ein Cyclodextrin, ein Cyclodextrinderivat oder eine Mischung von zwei oder mehr Cyclodextrinen und/oder Cyclodextrinderivaten; das Zentrifugat gemischt wird mit einem Kunststoff oder Harz, insbesondere einem Polystyrolharz, oder durch eine Säule laufen gelassen wird, die gefüllt ist mit einem solchen Kunststoff oder Harz; sofern es notwendig ist, wird das Harz oder der Kunststoff gewaschen mit Wasser; das oder die Epothilon(e) wird oder werden von dem Kunststoff oder Harz desorbiert unter Verwendung eines polaren Lösemittels, insbesondere eines Alkohols, in erster Linie einem Niederalkanol, wie z.B. Isopropanol; wenn es notwendig ist, konzentriert mit Hilfe von vorhergehender, gleichzeitiger oder nachfolgender Zugabe von Wasser; ein organisches Lösemittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, z.B. ein Ester, wie z.B. Ethylacetat, wird zugegeben, und das oder die Epothilone) wird oder werden in die organische Phase transferiert, z.B. durch kräftiges Hin- und Herbewegen oder Rühren, wobei, wenn es notwendig ist, die organische Phase konzentriert wird; die Epothilone, die aus der organischen Lösung erhalten werden, werden konzentriert durch ein Molekularsieb für Verbindungen von niedrigem Molekulargewicht; und dann durchlaufen die Fraktionen, die die Epothilone enthalten, insbesondere Epothilon A und/oder B, eine Trennung durch eine Umkehrphasensäule, vorzugsweise unter Elution mit einem Elutionsmittel, das ein Nitril enthält, wie z.B. Acetonitril (oder stattdessen ein Elutionsmittel, das einen Alkohol enthält, wie z.B. Methanol); wobei die Epothilone A und B getrennt extrahiert werden, und, wenn es gewünscht ist, weiter konzentriert werden können durch Umkristallisation.
Ein weiterer bevorzugter Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Epothilonen, insbesondere der Epothilone A und B voneinander, das gekennzeichnet ist durch Chromatographie auf einer Umkehrphasensäule mit einem Elutionsmittel, das ein Niederalkylcyanid enthält, wobei die Chromatographie auf einem Säulenmaterial ausgeführt wird, insbesondere einem RP-18 Material, das mit Kohlenstoffketten beladen ist, wie solchen, die 18 Kohlenstoffatome enthalten, und einem Einsetzen eines Lösemittels, das ein Nitril enthält, insbesondere ein Niederalkylnitril, insbesondere Acetonitril, insbesondere eine Mischung von Nitril/Wasser, insbesondere eine Mischung von Acetonitril/Wasser, vorzugsweise in einem Verhältnis von Nitril : Wasser von ca. 1 : 99 bis 99 : 1, hauptsächlich 1 : 9 bis 9.1, z.B. zwischen 2 : 8 und 7 : 3, z.B. 3 : 7 oder 4 : 6. Diese Trennung kann auf eine Filtration mit einem Molekularsieb folgen, oder wird vorzugsweise direkt bewirkt unter. Verwendung des Rückstands nach Adsorption der Epothilone von dem Kulturmedium, das eine Komplex bildende Komponente auf einem Kunststoff oder Harz enthält. Ein Vorteil der Trennung mit einem Elutionsmittel, das ein Niederalkylcyanid enthält gegenüber solchen, die Alkohole einsetzten, wie z.B. Methanol, ist die bessere Trennung von Epothilonen A und B.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein Verfahren zur Herstellung von Epothilonen, das a) umfasst ein Verfahren zur Konzentration von Epothilonen, insbesondere Epothilon A und/oder Epothilon B, insbesondere Epothilon B, in einem Kulturmedium für die biotechnologische Herstellung dieser Verbindung(en), das einen Mikroorganismus enthält, der geeignet ist für diese Herstellung, insbesondere einen Sorangium-Stamm, insbesondere von dem Typ Sorangium Cellulosum Soce90, oder eine Mutante, die daraus entsteht, insbesondere den Stamm, der die Bezeichnung BCE 33/10 aufweist, Wasser und andere geeignete Bestandteile von Kulturmedien, wobei ein Cyclodextrin oder ein Cyclodextrinderivat, oder eine Mischung von zwei oder mehr von diesen Verbindungen zu dem Medium gegeben wird, insbesondere ein oder mehr, vorzugsweise ein oder zwei oder mehr Cyclodextrine, die ausgewählt sind aus α-Cyclodextrin (6), β-Cyclodextrin (7), γ-Cyclodextrin (8), δ-Cyclodextrin (9), ε-Cyclodextrin (10), ζ-Cyclodextrin (11), η-Cyclodextrin (12), θ-Cyclodextrin (13), insbesondere α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin oder γ-Cyclodextrin; oder in erster Linie ein Cyclodextrinderivat oder eine Mischung von Cyclodextrinderivaten, die ausgewählt sind aus Derivaten eines Cyclodextrins, worin ein oder mehr bis zu alle Hydro xygruppen verethert sind mit einem Alkylether, insbesondere Niederalkylether, wie z.B. Methyl- oder Ethylether, auch Propyl- oder Butylether; einem Arylhydroxyalkylether, wie Phenylhydroxyniederalkylether, insbesondere Phenylhydroxyethylether; einem Hydroxyalklyether, insbesondere einem Hydroxyniederalkylether, insbesondere 2-Hydroxyethyl-, Hydroxypropylether, wie z.B. 2-Hydroxypropyl- oder Hydroxybutylether, wie z.B. 2-Hydroxybutylether; einem Carboxyalkylether, insbesondere Carboxyniederalkylether, insbesondere Carboxymethyl- oder Carboxyethylether; einem derivatisierten Carboxyalkylether, insbesondere einem derivatisierten Carboxyniederalkylether, worin die derivatisierte Carboxygruppe für Aminocarbonyl, Mono- oder Diniederalkylaminocarbonyl, Morpholinocarbonyl, Piperidinocarbonyl, Pyrrolidinocarbonyl oder Piperazinocarbonyl oder Alkyloxycarbonyl steht, insbesondere Niederalkyloxycarbonyl, wie z.B. vorzugsweise einen Niederalkoxycarbonylniederalkylether, z.B. Methyloxycarbonylpropylether oder Ethyloxycarbonylpropylether; einem Sulfoalkylether, insbesondere Sulfoniederalkylether, insbesondere Sulfobutylether; einem Cyclodextrin, bei dem ein oder mehr OH-Gruppen verethert sind mit einem Rest der Formel -O-[Alk-O-]_n-H worin Alk für Alkyl, insbesondere Niederalkyl, steht, und n für eine ganze Zahl zwischen 2 bis 12, insbesondere 2 bis 5, insbesondere 2 oder 3, steht; einem Cyclodextrin, bei dem ein oder mehrere OH Gruppen verethert sind mit einem Rest der Formel
worin R' für Wasserstoff, Hydroxy, -O-(Alk-O)_z-H, -O-(Alk(-R)-O-)_p-H oder
-O-(Alk(-R)-O-)_q-Alk-CO-Y steht; Alk in allen Fällen für Alkyl, insbesondere Niederalkyl steht; m, n, p, q und z für eine ganze Zahl von 1 bis 12, vorzugsweise 1 bis 5, insbesondere 1 bis 3, stehen; und Y für OR₁ oder NR₂R₃ steht, worin R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Niederalkyl stehen, oder R₂ und R₃ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, für Morpholino, Piperidino, Pyrrolidino oder Piperazino stehen;
oder einem verzweigten Cyclodextrin, worin Veretherungen oder Acetale mit anderen Zuckermolekülen existieren, und die ausgewählt sind aus Glucosyl-, Diglukosyl- (G₂-β-cyclodextrin), Maltosyl- oder Dimaltosylcyclodextrin oder N-Acetylglukosaminyl-, Glucosaminyl-, N-Acetylgalactosaminyl- und Galactosaminylcyclodextrin; oder einem Niederalkanoyl, wie z.B. Acetylester eines Cyclodextrins; und
b) einen Schritt zur Trennung der Epothilone umfasst, insbesondere der Epothilone A und B voneinander, das gekennzeichnet ist durch eine Chromatographie auf einer Umkehrphasensäule mit einem Elutionsmittel, das ein Niederalkylcyanid enthält, wobei die Chromatographie ausgeführt wird auf einem Säulenmaterial, insbesondere einem RP-18 Material, das beladen ist mit Kohlenwasserstoffketten, wie solchen, die 18 Kohlenstoffatome enthalten, und einen Einsatz eines Elutionsmittels, das ein Niederalkylnitril enthält, insbesondere Acetonitril, insbesondere eine Mischung von Niederalkylnitril/Wasser, vorzugsweise eine Mischung von Acetonitril/Wasser, vorzugsweise in einem Verhältnis von Niederalkylnitril zu Wasser von ca. 1 : 99 bis 99 : 1, in erster Linie 1 : 9 bis 9 : 1, z.B. zwischen 2 : 8 und 7 : 3, z.B. 3 : 7 bis 4 : 6, wobei es, wenn es gewünscht ist, möglich ist, weitere Schritte zur Aufarbeitung und Reinigung zu verwenden.
Die Erfindung betrifft insbesondere die einzelnen Verfahrensschritte oder Verfahrensstufen, die in den Beispielen genannt sind oder irgendeine Kombination davon und die Kulturmedien, die darin genannt sind.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen, ohne den Schutzbereich zu beschränken.
Achtung: Wenn Epothilone gehandhabt werden, müssen geeignete Schutzmaßnahmen getroffen werden, wo es notwendig ist, wegen deren hohen Toxizität.
Der 750-l-Fermenter, der im Folgenden verwendet wird ist ein Edelstahlfermenter von der Firma Alpha AG, Nidau, Schweiz.
Referenzbeispiel 1: Herstellung des Stamms BCE 33/10 mit Hilfe von Mutation und Selektion
Der Stamm, der eingesetzt wird, ist die Mutante BCE 33/10 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen unter der Nr. DSM 11999 am 9. Februar 1998), die abstammt von dem Stamm Sorangium Cellulosum Soce90 durch Mutation und Selektion wie unten beschrieben. In flüssigen Medien bildet die Mutante BCE 33/10 Bacilli die typisch sind für Sorangia, mit abgerundeten Enden und einer Länge von 3 bis 6 μm, sowie einer Breite von ca. 1 μm. Sorangium Cellulosum Soce90 wurde erhalten von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 6773.
Die Herstellung der Mutante BCE 33/10 umfasst drei Mutationsschritte mit UV-Licht und der Selektion von individuellen oder einzelnen Kolonien. Das Verfahren in Einzelheiten wird ausgeführt gemäß den folgenden Arbeitsschritten oder -stufen.
Kultivierung aus der Ampulle: Die Zellen der DSM 6773 Ampulle werden in 10 ml G52 Medium in einem 50 ml Erlenmeyer-Kolben transferiert und 6 Tage inkubiert in einem Agitator oder einer Rüttel oder Rührapparatur bei 30°C und bei 180 Umdrehungen pro Minute (U/min). 5 ml dieser Kultur werden in 50 ml eines G52 Mediums (in einem 200 ml Erlenmeyer-Kolben) transferiert und 3 Tage lang bei 180 U/min in einem Rührer bei 30°C inkubiert.
Erster UV-Mutationsschritt und Selektion: Portionen von 0,1 ml der obigen Kultur werden auf mehreren Petrischalen, die Agarmedium S42 enthalten, als Platten oder Schichten aufgebracht. Die Platten werden dann UV-Licht (maximaler Strahlungsbereich von 250–300 nm) 90 oder 120 s lang ausgesetzt bei 500 μW/cm². Die Platten werden dann 7 bis 9 Tage lang bei 30°C inkubiert, bis einzelne Kolonien von 1 bis 2 mm erhalten werden. Die Zellen von 100 bis 150 Kolonien werden dann jeweils von einer individuellen Kolonie mit Hilfe einer Plastikschleife in Sektoren auf Petrischalen, die S42 Agar enthielten, als Platten aufgebracht (4 Sektoren pro Platte) und 7 Tage lang bei 30°C inkubiert wurden. Die Zellen, die auf einer Fläche von ca. 1 cm² Agar gewachsen sind, werden mit einer Plastikschlaufe transferiert zu 10 ml eines G52 Mediums in einem 50 ml Erlenmeyer-Kolben und 7 Tage lang bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C inkubiert. 5 ml dieser Kultur werden in 50 ml eines G52 Mediums transferiert (in einem 200 ml Erlenmeyer-Kolben) und bei 180 U/min 3 Tage lang in einem Agitator bei 30°C inkubiert. 10 ml dieser Kultur werden transferiert in 50 ml eines 23B3 Mediums und 7 Tage lang bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C inkubiert.
Um die Mengen an Epothilon A und Epothilon B zu bestimmen, die in dieser Kultur gebildet werden, wird das folgende Verfahren befolgt. Die 50 ml Kulturlösung wird durch ein Nylonsieb (150 μm Porengröße) filtriert, und das Polystyrolharz Amberlite XAD16, das an diesem Sieb zurückgehalten wird, wird mit wenig Wasser gewaschen und nachfolgend zusammen mit dem Filter zu einem 50-ml-Zentrifugenrohr gegeben (Falcon Labware, Becton Dickinson AG, Immengasse 7, 4056 Basel). 10 ml Isopropanol (> 99 %) werden zu dem Rohr mit dem Filter gegeben. Danach wird das gut verschlossene Röhrchen 1 h lang bei 180 U/min geschüttelt, um das Epothilon A und B in dem Isopropanol zu lösen, die an den Kunststoff oder das Harz gebunden sind. Nachfolgend werden 1,5 ml der Flüssigkeit zentrifugiert, und ca. 0,8 ml des Überstands werden zugegeben unter Verwendung einer Pipette zu einem HPLC Rohr. Die HPLC Analyse dieser Proben wird bewirkt wie unten beschrieben unter HPLC Analyse in dem Abschnitt Produktanalyse. Die HPLC Analyse bestimmt, welche Kultur den höchsten Gehalt an Epothilon B enthält. Aus der oben beschriebenen Sektorplatte der entsprechenden Kolonie (die Platten wurden bei 4°C in der Zwischenzeit gelagert) werden Zellen aus ca. 1 cm² der Agarfläche durch eine Plastikschleife transferiert zu 10 ml eines G52 Mediums in einem 50-ml-Erlenmeyer Kolben und 7 Tage bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C inkubiert. 5 ml dieser Kultur werden transferiert in 50 ml eines G52 Mediums (in einem 200-ml-Erlenmeyer-Kolben) und 3 Tage lang bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C inkubiert.
Zweite und dritte UV-Mutationsstufe und Selektion: Das Verfahren ist genau das gleiche wie das oben für den ersten UV-Mutationsschritt beschriebene, wobei die ausgewählte oder selektierte Kultur der besten Kolonien aus der ersten UV-Mutation verwendet wird für die zweite Mutagenese. Für die dritte Mutagenese wird die Kultur der besten Kolonie aus der zweiten Mutagenese dementsprechend verwendet. Die beste Kolonie nach diesem dritten Zyklus der UV-Mutationsschritte, gefolgt von einer Selektion der erhaltenen Stämme für die verbesserte Epothilon B-Produktion entspricht der Mutante BCE 33/10.
Konservierung des Stamms
10 ml einer 3 Tage alten Kultur in einem G52 Medium (50 ml Medium in einem 200 ml Erlenmeyer-Kolben, 30°C und 180 U/min) werden transferiert in 50 ml eines 23B3 Mediums (in einem 200 ml Erlenmeyer-Kolben) und 3 Tage lang mit 180 U/min in einem Agitator bei 30°C inkubiert. 1 ml Portionen dieser Kultur werden entfernt in einer Form, die so homogen wie möglich ist (vor jeder Entfernung wird die Kultur per Hand in dem Erlenmeyer-Kolben geschüttelt) zusammen mit dem Polystyrolharz Amberlite XAD16 (Polystyroladsorptionsharz, Rohm & Haas, Frankfurt, Deutschland), dann in 1,8 ml Nunc Cryotubes (A/S Nunc, DK 4000 Roslide, Dänemark) gefüllt und entweder bei –70°C oder in flüssigem Stickstoff gelagert.

Die Kultivierung der Stämme aus diesen Ampullen wird bewirkt durch Erwärmen an Luft bis auf Raumtemperatur und nachfolgend durch Übertragung des gesamten Inhalts in das Cryotube oder das Gefrierrohr in 10 ml G52 Medium in einem 50 ml Erlenmeyer-Kolben und durch Inkubierung bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C über einen Zeitraum von 5 bis 7 Tagen. Medien G52 Medium:

Hefeextrakt mit geringem Salzgehalt (Springer, Maison Alfort, Frankreich)	2 g/l
MgSO₄ (7 H₂O)	1 g/l
CaCl₂ (2 H₂O)	1 g/l
entfettetes Sojamehl (Mucedoia S.r.I., Settimo Mailand, Italien)	2 g/l
Kartoffelstärke Noredux (Blattmann, Wädenswil, Schweiz)	8 g/l
Wasserfreie Glucose	2 g/l

Fe-EDTA 8g/l (Produkt Nr. 03625, Fluka Chemie AG, Schweiz)	1 ml/l
pH 7,4, korrigiert mit KOH
Sterilisation: 20 min, 120°C

S42 Agar-Medium:

wie beschrieben von S. Jaoua et al. Plasmid 28, 157 bis 165 (1992) 23B3 Medium:

Glucose	2 g/l
Kartoffelstärke Noredux (Blattmann, Wädenswil, Schweiz)	20 g/l
entfettetes Sojamehl (Mucedola S.r.I., Settimo Mailand, Italien)	16 g/l
Fe-EDTA (Produkt Nr. 03625, Fluka Chemie AG, Schweiz)	8 g/l
HEPES Fluka, Buchs, Schweiz	5 g/l
Polystyrolharz XAD16 (Rohm & Haas)	2 % v/v
deionisiertes H₂O
Korrektur des pH auf 7,8 mit NaOH
Sterilisation über 20 min bei 120°C

(HEPES = 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure)

Beispiel 2: Kultivierung, um die Epothilone herzustellen
Stamm:

Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10 (Referenzbeispiel 1)

Konservierung des Stamms:

in flüssigem N₂, wie in Referenzbeispiel 1. Medien:

Vorkulturen und Zwischenproduktkulturen:	G52
Hauptkultur:	1B12

G52 Medium:

Hefeextrakt mit wenig Salz (BioSpringer, Maison Alfort, Frankreich)	2 g/l
MgSO₄ (7 H₂O)	1 g/l
CaCl₂ (2 H₂O)	1 g/l
entfettetes Sojamehl Soyamine 50T (Lucas Meyer, Hamburg, Deutschland)	2 g/l
Kartoffelstärke Noredux A-150 (Blattmann, Wädenswil, Schweiz)	8 g/l
Wasserfreie Glucose	2 g/l
EDTA-Fe(III)-Natriumsalz (8g/l)	1 ml/l
pH 7,4, korrigiert mit KOH
Sterilisation: 20 min, 120°C

1B12 Medium:

Kartoffelstärke Noredux A-150 (Blattmann, Wädenswil, Schweiz)	20 g/l
entfettetes Sojamehl Soyamine 50T (Lucas Meyer, Hamburg, Deutschland)	11 g/l
EDTA-Fe(III)-Natriumsalz	8 mg/l

pH 7,8, korrigiert mit KOH
Sterilisation: 20 min, 120°C

Zugabe von Cyclodextrinen und Cyclodextrinderivaten:
Cyclodextrine (Fluka, Buchs, Schweiz, oder Wacker Chemie, München, Deutschland) in verschiedenen Konzentrationen werden getrennt, sterilisiert und zu dem 1B12 Medium vor dem animpfen gegeben.
Kultivierung: 1 ml der Suspension von Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10 aus einer flüssigen N₂-Ampulle wird transferiert in 10 ml eines G52 Mediums (in einem 50 ml Erlenmeyer-Kolben) und 3 Tage lang bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C inkubiert, 25 mm Versetzung. 5 ml dieser Kultur werden zugegeben zu 45 ml eines G52 Mediums (in einem 200 ml Erlenmeyer-Kolben) und 3 Tage lang bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C inkubiert, 25 mm Versetzung. 50 ml dieser Kultur werden dann zugegeben zu 450 ml eines G52 Mediums (in einem 2l Erlenmeyer-Kolben) und 3 Tage lang bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C inkubiert, 50 mm Versetzung.
Pflegekultur: Die Kultur wird alle 3 bis 4 Tage überimpft, durch Zugabe von 50 ml der Kultur zu 450 ml des G52 Mediums (in einem 2-l-Erlenmeyer-Kolben). Alle Experimente und Fermentationen werden ausgeführt durch Beginn oder Start mit dieser Pflegekultur.
Tests in einem Kolben:
(I) Vorkultur in einem geschüttelten Kolben:
Beginnend mit den 500 ml der Pflegekultur werden 1 × 450 ml G52 Medium beimpft mit 50 ml der Pflegekultur und inkubiert bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C über einen Zeitraum von 4 Tagen, 50 mm Versetzung.
(ii) Hauptkultur in dem geschüttelten Kolben:
40 ml eines 1B12 Mediums plus 5 g/l 4-Morpholinpropansulfonsäure- (= MOPS) Pulver (in einem 200 ml Erlenmeyer-Kolben) werden gemischt mit 5 ml einer 10-fach konzentrierten Cyclodextrinlösung, beimpft mit 10 ml einer Vorkultur und 5 Tage inkubiert bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C, 50 mm Versetzung.
Fermentation: Fermentationen werden ausgeführt in einem Maßstab von 10 l, 100 l und 500 l. 20-l- und 100-l-Fermentationen dienen als Zwischenkulturstufe. Während die Vorkulturen und Zwischenkulturen beimpft werden wie die Pflegekultur 10 % (v/v), werden die Hauptkulturen beimpft mit 20 % (v/v) der Zwischenkultur. Wichtig: Im Gegensatz zu den geschüttelten Kulturen werden die Inhaltsstoffe der Medien für die Fermentation berechnet, bezogen auf das Endkulturvolumen einschließlich des Inokulums. Wenn z.B. 18 l des Mediums + 2 l des Inokulums kombiniert werden, dann erfolgt die Einwaage der Substanzen für 20 l, werden aber nur gemischt mit 18 l!
Vorkultur in einem geschüttelten Kolben:
Beginnend mit 500 ml Pflegekultur werden 4 × 450 ml eines G52 Mediums (in einem 2 l Erlenmeyer-Kolben) jeweils mit 50 ml davon beimpft, und 4 Tage lang bei 180 U/min in einem Agitator bei 30°C inokuliert, 50 mm Versetzung.
Zwischenproduktkultur, 20 l oder 100 l:
20 l: 18 l eines G52 Mediums in einem Fermenter, der ein Gesamtvolumen von 30 l aufweist, werden mit 2 l der Vorkultur beimpft. Die Kultivierung dauert 3 bis 4 Tage, und die Bedingungen sind: 30°C, 250 U/min, 0,5 l Luft pro Liter Flüssigkeit pro min, 0,5 bar Überdruck, keine pH-Kontrolle.
100 l: 90 l eines G52 Mediums in einem Fermenter, der ein Gesamtvolumen von 150 l aufweist werden beimpft mit 10 l der 20 l Zwischenproduktkultur. Die Kultivierung dauert 3 bis 4 Tage und die Bedingungen sind: 30°C, 150 U/min, 0,5 l Luft pro Liter Flüssigkeit pro min, 0,5 bar Überdruck, keine pH-Kontrolle.
Hauptkultur, 10 l, 100 l oder 500 l:
10 l: Die Mediensubstanzen für 10 l eines 1B12 Mediums werden sterilisiert in 7 l Wasser, dann wird 1 l einer sterilen 10 % 2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrinlösung zugegeben, und mit 2 l einer 20 l Zwischenproduktkultur beimpft. Die Dauer der Hauptkultur beträgt 6 bis 7 Tage, und die Bedingungen sind: 30°C, 250 U/min, 0,5 l Luft pro Liter Flüssigkeit pro min, 0,5 bar Überdruck, pH-Kontrolle mit H₂SO₄/KOH auf pH 7,6 +/– 0,5 (d.h. keine Kontrolle zwischen pH 7,1 und 8,1).
100 l: Die Mediensubstanzen für 100 l des 1B12 Mediums werden sterilisiert in 70 l Wasser, dann werden 10 l einer sterilen 10 % 2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrinlösung zugegeben und mit 20 l einer 20 l Zwischenproduktkultur beimpft. Die Dauer der Hauptkultur beträgt 6 bis 7 Tage, und die Bedingungen sind: 30°C, 200 U/min, 0,5 l Luft pro Liter Flüssigkeit pro min, 0,5 bar Überdruck, pH-Kontrolle mit H₂SO₄/KOH auf pH 7,6 +/– 0,5. Die Kette des Impfens für eine 100 l Fermentation ist schematisch gezeigt wie folgt:
500 l: Die Mediensubstanzen für 500 l des 1B12 Mediums werden sterilisiert in 350 l Wasser, dann werden 50 l einer sterilen 10 % 2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrinlösung zugegeben und mit 100 l einer 100 l Zwischenproduktkultur beimpft. Die Dauer der Hauptkultur beträgt 6 bis 7 Tage, und die Bedingungen sind: 30°C, 120 U/min, 0,5 l Luft pro Liter Flüssigkeit pro min, 0,5 bar Überdruck, pH-Kontrolle mit H₂SO₄/KOH auf pH 7,6 +/– 0,5.
Produktanalyse:
Herstellung der Probe:
50-ml-Proben werden gemischt mit 2 ml des Polystyrolharzes Amberlite XAD16 (Rohm & Haas, Frankfurt, Deutschland) und bei 180 U/min bei 30°C eine Stunde lang geschüttelt. Das Harz wird nachfolgend filtriert unter Verwendung eines 150 μm Nylonsiebs, mit wenig Wasser gewaschen und dann zusammen mit dem Filter in ein 15 ml Nunc-Rohr (Nunc tube) gegeben.
Elution des Produkts aus dem Harz:

10 ml Isopropanol (> 99%) werden zu dem Rohr mit dem Filter und dem Harz gegeben. Danach wird das versiegelte Rohr 30 min bei Raumtemperatur auf einem Rota-Mixer (Labinco BV, Niederlande) geschüttelt. Dann werden 2 ml der Flüssigkeit abzentrifugiert, und der Überstand wird unter Verwendung einer Pipette zu HPLC-Rohren gegeben. HPLC Analyse:

Säule:	Waters-Symetry C18, 100 × 4 mm, 3,5 μm WAT066220 + Vorsäule 3,9 × 20 mm WAT054225
Lösemittel:	A: 0,02 % Phosphorsäure B: Acetonitril (HPLC-Qualität)
Gradient:	41 % B von 0 bis 7 min 100 % B von 7,2 bis 7,8 min 41 % B von 8 bis 12 min
Ofentemperatur:	30°C
Detektion:	250 nm, UV-DAD Detektion
Injektionsvolumen:	10 μl
Retentionszeit:	Epo A: 4,30 min Epo B: 5,38 min

Beispiel 2A: Effekt der Zugabe von Cyclodextrin und Cyclodextrinderivaten zu den erhaltenen Epothilonkonzentrationen.
Alle der hier getesteten Cyclodextrinderivate kommen von der Firma Fluka, Buchs, Schweiz. Die Tests werden durchgeführt in geschüttelten 200-ml-Kolben mit 50 ml Kulturvolumen. Als Kontrolle werden Kolben mit Adsorberharz Amberlite XAD-16 (Rohm & Haas, Frankfurt, Deutschland) und ohne irgendeine Zugabe eines Adsorbers verwendet. Nach einer Inkubation von 5 Tagen können die folgenden Epothilon-Titer durch HPLC bestimmt werden:
Tabelle 1:
Wenige der getesteten Cyclodextrine (2,6-Di-o-methyl-β-cyclodextrin, Methyl-β-cyclodextrin) zeigen keinen Effekt oder einen negativen Effekt auf die Epothilonherstellung bei den verwendeten Konzentrationen. 1 bis 2 % 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin und β-Cyclodextrin erhöhen die Epothilonproduktion in den Beispielen um das 6- bis 8-fache verglichen mit der Herstellung ohne Verwendung von Cyclodextrinen.
Beispiel 2B: 10 l Fermentation mit 1 % 2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin:
Die Fermentation wird in einem 15 l Glasfermenter ausgeführt. Das Medium enthält 10 g/l 2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin der Wacker Chemie, München, Deutschland. Der Fortschritt der Fermentation wird veranschaulicht in Tabelle 2. Die Fermentation wird nach 6 Tagen beendet und Aufarbeitung folgt.
Tabelle 2: Fortschritt einer 10 l Fermentation
Beispiel 2C: 100 l Fermentation mit 1 % 2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin
Die Fermentation wird in einem 150 l Fermenter ausgeführt. Das Medium enthält 10 g/l 2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin. Der Fortschritt der Fermentation wird veranschaulicht in der Tabelle 3. Die Fermentation wird nach 7 Tagen geerntet und aufgearbeitet.
Tabelle 3: Fortschritt einer 100 l Fermentation
Beispiel 2D: 500 l Fermentation mit 1 % 2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin
Die Fermentation wird in einem 750-l-Fermenter ausgeführt. Das Medium enthält 10 g/l 2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin. Der Fortschritt der Fermentation wird veranschaulicht in Tabelle 4. Die Fermentation wird nach 7 Tagen geerntet und aufgearbeitet.
Tabelle 4: Fortschritt einer 500 l Fermentation
Beispiel 2E: Vergleichsbeispiel 10 l Fermentation ohne Zusatz eines Adsorbers
Die Fermentation wird in einem 15-l-Glasfermenter ausgeführt. Das Medium enthält kein Cyclodextrin oder irgendeinen anderen Adsorber. Der Fortschritt oder das Fortschreiten der Fermentation wird in Beispiel 5 veranschaulicht. Die Fermentation wird nicht geerntet und aufgearbeitet.
Tabelle 5: Fortschritt einer 10 l Fermentation ohne Adsorber
Beispiel 3: Aufarbeitung der Epothilone: Isolierung aus einer 500 l Hauptkultur

Das Volumen der Ernte aus der 500 l Hauptkultur von Beispiel 2D beträgt 450 l und wird getrennt unter Verwendung eines Westfalia Klärseparators vom Typ SA-20-06 (U/min = 6500) in die flüssige Phase (Zentrifugat + Spülwasser = 650 l) und eine feste Phase (Zellen = ca. 15 kg). Der Hauptteil der Epothilone wird in dem Zentrifugat gefunden. Der zentrifugierte Zellbrei enthält < 15 % des bestimmten Epothilonanteils und wird nicht weiter verarbeitet. Das 650 l Zentrifugat wird dann in einen 4000 l Rührkessel gegeben, mit 10 l Amberlite XAD-16 (Zentrifugat : Harzvolumen = 65 : 1) gemischt und gerührt. Nach einem Zeitraum des Kontakts von ca. 2 h wird das Harz in einer Heine-Überlaufzentrifuge (Korbgehalt 40 l; U/min = 2800) zentrifugiert. Das Harz wird aus der Zentrifuge genommen und mit 10 bis 15 l deionisiertem Wasser gewaschen. Eine Desorption wird bewirkt durch zweimaliges Rühren des Harzes, jedes Mal in Portionen mit 30 l von Isopropanol in 30 l Glasrührgefäßen über einen Zeitraum von 30 min. Die Trennung der Isopropanolphase von dem Harz findet statt unter Verwendung eines Absaugfilters. Das Isopropanol wird dann entfernt aus den vereinigten Isopropanolphasen durch Zugabe von 15 bis 20 l an Wasser in einem mit Vakuum betriebenen Zirkulationsevaporator (Schmid-Verdampfer), und die erhaltene Wasserphase von ca. 10 l wird dreimal, jedes mal mit 10 l, Ethylacetat extrahiert. Die Extraktion wird bewirkt in 30 l Glasrührgefäßen. Der Ethylacetatextrakt wird konzentriert auf 3 bis 5 l in einem mit Vakuum betriebenen Zirkulationsevaporator (Schmid-Verdampfer) und danach konzentriert bis zur Trockne in einem Rotationsverdampfer (Büchi-Typ) unter Vakuum. Das Ergebnis ist ein Ethylacetatextrakt von 50,2 g. Der Ethylacetatextrakt wird in 500 ml Methanol gelöst, die unlöslichen Bestandteil abfiltriert unter Verwendung eines Faltenfilters, und die Lösung zugegeben zu einer 10 kg Sephadex LH 20 Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) (Säulendurchmesser 20 cm, Füllwert ca. 1,2 m). Die Elution wird bewirkt mit Methanol als Elutionsmittel. Epothilon A und B liegen überwiegend in den Fraktionen 21 bis 23 vor (bei einer Fraktionsgröße von 1 Liter). Diese Fraktionen werden konzentriert bis zur Trockne in einem Vakuum auf einem Rotationsverdampfer (Gesamtgewicht 9,0 g). Diese Sephadex Spitzenfraktionen (9,0 g) werden daraufhin gelöst in 92 ml Acetonitril : Wasser : Methylenchlorid = 50 : 40 : 2, die Lösung filtriert durch ein Faltenfilter und zugegeben zu einer RP Säule (Ausrüstung Prepbar 200, Merck; 2,0 kg LiChrospher RP-18 Merck, Korngröße 12 μm, Säulendurchmesser 10 cm, Füllhöhe 42 cm; Merck, Darmstadt, Deutschland). Die Elution wird bewirkt mit Acetonitril : Wasser = 3 : 7 (Flussrate = 500 ml/min; Retentionszeit von Epothilon A = ca. 51 bis 59 min; Retentionszeit von Epothilon B = ca. 60 bis 69 min). Die Fraktionierung wird beobachtet mit einem UV-Detektor bei 250 nm. Die Fraktionen werden konzentriert bis zur Trockne unter Vakuum in einem Büchi-Rotavapor Rotationsverdampfer. Das Gewicht der Epothilon A Peakfraktion beträgt 700 mg, und gemäß HPLC (externer Standard) besitzt sie einen Gehalt von 75,1 %. Das der Epothilon B-Bandenfraktion beträgt 1980 mg, und der Gehalt gemäß HPLC (externer Standard) beträgt 86,6 %. Schließlich wird die Epothilon A-Fraktion (700 mg) aus 5 ml Ethylacetat : Toluol = 2 : 3 kristallisiert und ergibt 170 mg eines Epothilon A-Kristallisats [Gehalt gemäß HPLC (% der Fläche) = 94,3 %]. Die Kristallisation der Epothilon B-Fraktion (1980 mg) wird bewirkt aus 18 ml Methanol und ergibt 1440 mg eines reinen Epothilon B Kristallisats [Gehalt gemäß HPLC (% der Fläche) = 99,2 %). Schmelzpunkt (Epothilon B): z.B. 124 bis 125°C; ¹H-NMR Daten für Epothilon B: 500 MHz-NMR, Lösemittel: DMSO-d6. Chemische Verschiebung δ in ppm bezogen auf TMS. s = Singulett; d = Duplett; m = Multiplett.

δ (Multiplizität)	Integral (Anzahl an H)
7,34 (s)	1
6,50 (s)	1
5,28 (d)	1
5,08 (d)	1
4,46 (d)	1
4,08 (m)	1
3,47 (m)	1
3,11 (m)	1
2,83 (dd)	1
2,64 (s)	3
2,36 (m)	2
2,09 (s)	3
2,04 (m)	1
1,83 (m)	1
1,61 (m)	1
1,47–1,24 (m)	4
1,18 (s)	6
1,13 (m)	2
1,06 (d)	3
0,89 (d + s, überlappend)	6
	Σ = 41

In diesem Beispiel (Beispiel 3) wird Epothilon B erhalten in der Kristallmodifikation A, die gekennzeichnet ist durch das Röntgenbeugungsdiagramm der Modifikation A.

Claims

Verfahren zur Konzentration von Epothilonen in einem Kulturmedium für die biotechnologische Herstellung dieser Verbindungen, wobei dieses Verfahren Mikroorganismen umfasst, welche diese Verbindungen bildet, das Kulturmedium mit ein oder mehr Cyclodextrinen als Komplex bildende Komponente versetzt wird und diese Cyclodextrine ausgewählt sind aus a) α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin, γ-Cyclodextrin, δ-Cyclodextrin, ε-Cyclodextrin, ζ-Cyclodextrin, η-Cyclodextrin und θ-Cyclodextrin, oder b) einem Cyclodextrinderivat, das ausgewählt ist aus Derivaten von (1) einem Cyclodextrin, worin ein oder mehr und bis zu alle Hydroxygruppen verethert sind zu einem Alkylether; einem Arylhydroxyalkylether; einem Hydroxyalkylether; einem Carboxyalkylether; einem derivatisierten Carboxyniederalkylether, worin die derivatisierte Carboxygruppe für Aminocarbonyl, Mono- oder Diniederalkylaminocarbonyl, Morpholinocarbonyl, Piperidinocarbonyl, Pyrrolidinocarbonyl, Piperazinocarbonyl oder Alkyloxycarbonyl steht; oder einem Sulfoalkylether; (2) einem Cyclodextrin, worin ein oder mehr OH Gruppen verethert sind mit einem Rest der Formel -O-[Alk-O-]_n-H worin Alk für Alkyl steht und n eine ganze Zahl von und einschließlich 2 bis zu und einschließlich 12 ist; (3) einem Cyclodextrin, worin ein oder mehr OH Gruppen verethert sind mit einem Rest der Formel
worin R' für Wasserstoff, Hydroxy oder -O-(Alk-O)_z-H steht; Alk in allen Fällen für Alkyl steht; m, n und z eine ganze Zahl von 1 bis 12 sind; und Y für OR₁ oder NR₂R₃ steht, worin R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Niederalkyl stehen oder R₂ und R₃ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, für Morpholino, Piperidino, Pyrrolidino oder Piperazino stehen; oder (4) einem verzweigten Cyclodextrin, worin Veretherungen oder Acetale mit anderen Zuckermolekülen existieren, welche ausgewählt sind aus Glucosyl-, Diglucosyl- (G₂-β-Cyclodextrin), Maltosyl- und Dimaltosylcyclodextrin oder N-Acetylglucosaminyl-, Glucosaminyl-, N-Acetylgalactosaminyl- und Galactosaminylcyclodextrin; und einem Niederalkanoyl-, wie einem Acetylester eines Cyclodextrins; oder c) Gemischen aus zwei oder mehr dieser Cyclodextrine und/oder Cyclodextrinderivate, und worin die Vorsilbe Nieder bedeutet, dass dieser Rest bis zu maximal 7 Kohlenstoffatome enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, welches Myxobacterien als Produzenten für natürliche Substanzen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kulturmedium einen zur Herstellung von Epothilonen geeigneten des Stamms Sorangium, Wasser und sonstige geeignete herkömmliche Komponenten von Kulturmedien mit Resten der folgenden Formel umfasst
Verfahren nach Anspruch 3, worin das Cyclodextrin und/oder das Cyclodextrinderivat dem Kulturmedium in einer Konzentration von 0,05 bis 10 Gew.-% (Gewicht/Volumen) zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Cyclodextrin und/oder das Cyclodextrinderivat in einer Konzentration von 0,1 bis 2 Gew.-% zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das Cyclodextrinderivat ausgewählt ist aus einem Cyclodextrin und einem Hydroxyniederalkylcyclodextrin, worin die Vorsilbe Nieder bedeutet, dass dieser Rest bis zu maximal 7 Kohlenstoffatome enthält, oder aus Gemischen aus ein oder mehr dieser Cyclodextrine.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Komplex bildende Komponente 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin ist.
Kulturmedium, umfassend ein oder mehr Cyclodextrine gemäß Definition von Anspruch 1 und einen zur Bildung von Epothilonen geeigneten Mikroorganismus.
Kulturmedium nach Anspruch 8, worin der Mikroorganismus ein Myxobacterium ist.
Verfahren zur Herstellung von Epothilonen, wobei die Epothilone erhalten werden durch Aufarbeitung eines Kulturmediums für die biotechnologische Herstellung dieser Verbindungen, das Kulturmedium Mikroorganismen umfasst, welche zur Herstellung von Epothilonen als Produzenten für natürliche Substanzen geeignet sind, durch Zusatz eines oder mehrerer Cyclodextrine gemäß Definition von Anspruch 1 zum Kulturmedium und anschließende Reinigung und gewünschtenfalls Abtrennung der Epothilone.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Kulturmedium ein Myxobacterium des Genus Sorangium enthält und das Kulturmedium aufgetrennt wird in die feste und die flüssige Phase (Zentrifugat) durch Zentrifugation; das Zentrifugat mit einem Harz vermischt wird oder durch eine mit einem solchen Harz gefüllte Säule geschickt wird, das Epothilon vom Harz mit einem polaren Lösemittel desorbiert wird, ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösemittel zugesetzt und das Epothilon in die organische Phase übertragen wird, die Epothilone aus der erhaltenen organischen Lösung durch ein Molekularsieb für Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht konzentriert werden und die die Epothilone enthaltenden Fraktionen dann in einer Säule mit Umkehrphase aufgetrennt werden, wodurch die Epothilone A und B getrennt erhalten werden und gewünschtenfalls durch Umkristallisation weiter konzentriert werden können.
Verfahren zur Herstellung von Epothilonen, das a) ein Verfahren zur Konzentration von Epothilonen in einem Kulturmedium zur biotechnologischen Herstellung dieser Verbindungen ist, wobei das Kulturmedium einen zur Herstellung dieser Verbindungen geeigneten Mikroorganismus, Wasser und sonstige geeignete herkömmliche Komponenten von Kulturmedien enthält, und das Kulturmedium mit einem Cyclodextrin oder einem Cyclodextrinderivat oder einem Gemisch aus zwei oder mehr dieser Verbindungen versetzt wird, und das b) eine Stufe zur Auftrennung von Epothilonen umfasst, die gekennzeichnet ist durch Chromatographie auf einer Säule mit Umkehrphase mit einem ein Niederalkylcyanid enthaltenden Elutionsmittel, wobei diese Chromatographie mit einem Säulenmaterial durchgeführt wird, das mit Kohlenwasserstoffketten beladen ist, und ein ein Niederalkylnitril enthaltendes Elutionsmittel verwendet wird.