DE69922213T2

DE69922213T2 - Verfahren und testsatz zur bestimmung der analytkonzentration im blut

Info

Publication number: DE69922213T2
Application number: DE69922213T
Authority: DE
Inventors: Falk Fish
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-08-21
Filing date: 1999-08-19
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2019-08-20
Also published as: EP1105727A1; DE69922213D1; IL125880A; EP1105727B1; JP2002523744A; US7060453B1; WO2000011469A1; IL125880A0; ATE283479T1; AU5300199A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen verschiedener Analyten im Blut eines Individuums und Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
STAND DER TECHNIK
Im Folgenden ist eine Liste der Veröffentlichungen des Stands der Technik aufgeführt, auf die in der vorliegenden Beschreibung Bezug genommen wird.

1. Guy und Rao, US-Patent 5,362,307.
2. Sönsken PH,. Acta Endocrinol. Suppl. (Kopenhagen) 23:145-155 (1980).
3. Patrick, A.W., et al., Diabet. Med., 11:62-65 (1994).
4. Forbat, L.N., et al., J.R. Soc. Med., 74:725-728 (1981).
5. Ben-Aryeh, M., et al., J. Diabet. Complications, 2:96-99 ((1988).
6. PCT-Anmeldung Veröffentlichungsnr. WO 99/22639
7. Song, S.J. Forensic Sci. Int., 36:173-7 (1988).
8. Keating, S.M., Allard, J.E., Med. Sci. Law, 34:187-201 (1994).
9. Akbarov, Z.S., Rakhimova, Russisches Patent Nr.2064681.
10. Geigy Scientific Tables, 8. Ausgabe, Ciba-Geigy Publication Basel, Schweiz, ISBN 0-914168-50-9 (1980).
11. Kimes, D.R., et al., J. Forensic Sci., 29:64-66 (1984)
12. Sakita, S., et al., Dermatol. Sci., 7 Suppl: S1-4 (1994).
13. US-Patent Nr. 5,268,148.

Die hier erfolgte Aufführung des vorstehenden Stands der Technik sollte nicht als Hinweis dafür ausgelegt werden, dass dieser Stand der Technik in irgendeiner Weise für die Patentfähigkeit der Erfindung relevant ist, wie in den Patentansprüchen im Anhang definiert.
Die vorstehenden Veröffentlichungen werden im Folgenden durch Angabe ihrer Nummern aus der vorstehenden Liste aufgeführt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es gibt viele Umstände, bei denen es notwendig ist, den Spiegel eines oder mehrer Analyten im Blut eines Individuums zu einem gegebenen Zeitpunkt zu bestimmen. Häufig reicht eine dem Individuum entnommene Blutprobe mit geringem Volumen aus, um die erforderlichen Informationen zu erhalten. Solche Blutproben mit geringem Volumen sind insbesondere geeignet bei Erkrankungen, bei denen es erforderlich ist, häufig eine Blutprobe von einem Individuum zu gewinnen, wie im Falle von Diabetespatienten. Vor mehreren Jahren zeigte eine zehnjährige DCCT-Studie (Diabetes Care and Complication Trial), dass die bevorzugte Behandlungsweise von insulinabhängigem Diabetes (Typ 1) darin bestand, solchen Patienten häufig geringe Insulindosen zu verabreichen und den Glucosespiegel nach jeder derartigen Verabreichung zu bestimmen. Um eine derartige Behandlung zu befolgen, muss ein Diabetespatient mindestens dreimal täglich in seine Haut stechen und einen Blutstropfen für den Glucosetest gewinnen. Ein derartig häufiges und wiederholtes Stechen ist schmerzhaft und führt häufig zu Infektionen und zur Bildung von hartem Narbengewebe und infolgedessen vernachlässigen viele Diabetespatienten das ausreichende Testen ihres Glucosespiegels.
Bei einem Versuch, die Schädigungen oder Schmerzen zu minimieren, die durch verschiedene routinemäßig verwendete Verfahren zum Gewinnen einer Kör perflüssigkeit verursacht werden, wurden durch Gewinnen und Analyse einer Körperflüssigkeit verschiedene minimal-invasive oder nicht invasive Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Substanz im Blut entwickelt, bei denen eine sehr kleine Probe einer Körperflüssigkeit gewonnen wird. Guy und Rao⁽¹⁾ zeigten ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer anorganischen oder organischen Substanz in einem Individuum, indem eine interstitielle Flüssigkeitsprobe von dem Individuum durch einen als Iontophorese bezeichneten Prozess gewonnen wird. Nach diesem Verfahren wird ein elektrisches Feld angelegt, das die Wanderung von Ionen verursacht, die nicht geladene Moleküle z.B. Glucose mit sich nehmen.
Ein weiteres minimal-invasives Verfahren zum Gewinnen einer Körperflüssigkeit ist das von SpecRx, Inc. Norcross, GA, USA. Ein kleines und flaches rundes Loch wird in der Haut erzeugt, das sich genau unter dem Stratum corneum erstreckt, und eine Probe mit interstitieller Flüssigkeit wird durch dieses Loch gesammelt. Jene Flüssigkeit wird dann auf ihren Glucosegehalt durch eines der im Fachgebiet bekannten Verfahren getestet.
Bei derartigen minimal-invasiven Verfahren zeigt die Konzentration der getesteten Substanz in der erhaltenen interstitiellen Flüssigkeit häufig den Spiegel derselben Substanz im Blut des getesteten Individuums zu dem Zeitpunkt, zu dem die Probe gewonnen wurde oder kurz danach, nicht richtig an. Das ist hauptsächlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Konzentration der getesteten Substanz in unterschiedlichen Orten im Körper und an verschiedenen Stunden des Tages variiert und deshalb kann sich gleichzeitig die Konzentration eines bestimmten Analyten in einer Körperflüssigkeit, die nicht das Blut selbst ist, signifikant von seiner Konzentration im Blut unterscheiden. Zudem führen sie, obwohl die Nebenwirkungen der minimal-invasiven Verfahren im Vergleich zu einigen herkömmlichen Verfahren zum Gewinnen einer Blutprobe verringert sind, häufig zu Unbehagen beim getesteten Individuum, und beinhalten die Verletzung der Haut und in einigen Fällen sogar den Riss von Blutgefäßen.
Versuche, den richtigen Glucosespiegel im Blut durch Bestimmung des Glucosespiegels in Flüssigkeiten von Körperproben nachzuweisen, die nicht Blut sind, wie Speichel, Urin oder Tränen, wurden als ungeeignet befunden, da gezeigt wurde, dass die Glucosekonzentration in derartigen Flüssigkeiten variabel war und häufiger die Glucosekonzentration im Blut zum relevanten Zeitpunkt nicht direkt widerspiegelte^(2-6).
Haare wurden ebenfalls verwendet, um das Vorliegen verschiedener Substanzen in einem getesteten Individuum nachzuweisen. Der Nachweis einer bestimmten Substanz in den Haaren, die von einem Individuum erhalten wurden, liefert den Beweis und die Informationen über das Vorliegen derselben Substanz im getesteten Individuum zu einem bestimmten unbekannten Zeitraum, d.h. das Individuum war irgendwann der Substanz ausgesetzt. Verfahren, die auf Haaranalysen basieren, wurden beispielsweise in der Gerichtsmedizin verwendet, um zu bestimmen, ob ein Individuum in der Vergangenheit einige Zeit Drogen ausgesetzt war, zur Bestimmung der AB0-Blutgruppen⁽⁷⁾ (z.B. als Beweis im Falle von sexuellen Übergriffen⁽⁸⁾) etc.
Der Prozentsatz der Proteinglycosylierung (d.h. die Bindung von Glucose an Protein) in Haarproben wurde ebenfalls verwendet, um Informationen über das getestete Individuum zu erhalten, von dem die Haarprobe entnommen wurde. Die Wachstumsrate des Haares ist relativ hoch und deshalb ist es möglich, den Spiegel des glycosylierten Proteins in dem älteren Teil des Haares, der näher am Spiegel des glycosylierten Proteins liegt, in dem neueren Teil des Haares (näher an der Wurzel) zu vergleichen. Ein höherer Spiegel an glycosyliertem Protein in dem neueren Teil des Haares kann in einigen Fällen die Entwicklung von bestimmten Erkrankungen in einem Individuum anzeigen, z.B. um den möglichen Ausbruch von Diabetes vorhersagen⁽⁹⁾.
Alle vorstehenden Verfahren liefern allgemeine Informationen, was die Bestätigung ermöglicht, ob ein getestetes Individuum jemals einer Substanz von Interesse ausgesetzt war. Derartige Verfahren wurden bisher zur Bestimmung des Spiegels einer gewünschten Substanz im Blut des getesteten Individuums zu dem Zeitpunkt, zu dem die Haare erhalten wurden, nicht verwendet.
Es wurde gezeigt, dass einige der vorstehend erwähnten Körperproben, einschließlich Urin, Speichel oder die Haarwurzel, rote Blutkörperchen enthalten^(19-12).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass es möglich sein kann, die Konzentration verschiedener Analyten in einem Körper eines Individuums zu bestimmen, indem man eine Probe von dem Individuum gewinnt, die keine Blut probe ist, die jedoch rote Blutkörperchen enthält, und die Konzentration des Analyten im Blut oder Blutzellen bestimmt, die in einer derartigen Probe vorhanden sind. Erfindungsgemäß wurde zum ersten Mal erkannt, dass derartige Proben eine leicht verfügbare Quelle für Blut oder rote Blutkörperchen sind, die bei der Bestimmung der Analytenspiegel von Interesse im Blut eines Individuums nützlich sind.
Die Konzentration verschiedener Analyten und spezifisch von Glucose im roten Blutkörperchen ist niedriger als ihre Konzentration im Plasma, jedoch liegt sie immer bei einem konstanten Verhältnis zur Konzentration des Analyten im Plasma. Deshalb ist es möglich, durch Bestimmung der Glucosekonzentration oder irgendeines anderen Analyten in den roten Blutkörperchen, die in Körperproben, die kein Blut sind, vorhanden sind, die Konzentrationen des gemessenen Analyten im Blut des Individuums zu bestimmen, von dem diese Proben erhalten wurden.
In ihrem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Bestimmung des Spiegels eines Analyten im Blut eines Individuums bereit, umfassend:

(i) Bestimmen des Blutvolumens in einer Probe, die von dem Individuum erhalten wurde, durch Messen des Spiegels einer Blutkomponente in den Proben, wobei die Probe keine Blutprobe ist, aber Blutkomponenten enthält;
(ii) Bestimmen des Spiegels des Analyten in der Probe oder in den Blutzellen, die in der Probe, die keine Blutprobe ist, vorhanden sind; und
(iii) Berechnen des Spiegels des Analyten im Blut des getesteten Individuums basierend auf den Messungen in (i) und (ii).

Der Begriff „Spiegel", wie er im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung zu verstehen ist, betrifft entweder eine Menge oder die Konzentration des getesteten Analyten.
Der Analyt kann jede Substanz oder Komponente sein, die man im Blut findet, beispielsweise Zucker, Proteine, organische Verbindungen etc., die in nachweisbaren Mengen in der Flüssigkeit oder Probe, die kein Blut ist, vorliegt.
Das Volumen des Blutes in der erhaltenen Körperprobe wird als Basis für die Berechnung der Konzentration des Analyten im Blut gemessen. Die Messung des Blutvolumens basiert auf der Bestimmung der Menge einer Blutkomponente in der Probe.
Der Begriff „Probe" bezieht sich auf jegliche Flüssigkeit oder Nicht-Flüssigkeit (z.B. Gewebe oder Zellen), die von einem Individuum erhalten wird, und die rote Blutkörperchen enthält.
Die Probe, die kein Blut ist, wird durch nicht invasive Verfahren gewonnen. Der Begriff „nicht invasiv" bezieht sich auf jegliches Verfahren zum Gewinnen einer Körperflüssigkeit, das nicht das Durchdringen der inneren Hautschichten des Individuums mit einem scharfen Werkzeug oder mit Verdampfungsstrahlung (z.B. Laserstrahlung) beinhaltet.
Durch eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform wird das Blutvolumen durch Messen der Hämoglobinmenge in der erhaltenen Probe durch irgendeines der im Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt (z.B. Piazza et al., Boll Soc. Ital. Biol. Sper 67:1047-1052, 1991; Piazza et al, JAMA 261:244-245, 1989). Beispiele derartiger Verfahren sind Verfahren, die auf der Peroxidaseaktivität von Hämoglobin beruhen, die ein chromogenes oder lumineszierendes Signal inkorporieren, das eine hohe Sensitivität besitzt (vgl. Beispiel 2 nachstehend). Hämoglobin in Körperflüssigkeiten kann auch durch im Handel erhältliche trockenchemische Teststreifen nachgewiesen und quantifiziert werden, die auf der colorimetrischen Reaktion von Hämoglobin mit Peroxiden beruhen, wie diejenigen, die in den US-Patenten 4,615,982, 3,975,161 und 4,017,261, übertragen an Lachema a.s., Brno, Tschechische Republik, und im US-Patent Nr. 5,089,420, übertragen an Miles, Elkhart, IN, USA, beschrieben werden. Andere Verfahren zur Bestimmung des Hämoglobinspiegels können Drabkin's Reagenz (z.B. von Sigma Chemical Co. Kat # 525-A) beinhalten. Das Blutvolumen, das in der erhaltenen Probe vorliegt, kann auch auf der Basis des gemessenen Spiegels von irgendeiner anderen Blutkomponente bestimmt werden, wie diejenigen, die vorstehend erwähnt werden.
Die Menge an getestetem Analyten in der erhaltenen Probe wird unter Verwendung von irgendeinem der im Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt, die zur Bestimmung des Spiegels des spezifischen zu testenden Analyten geeignet sind. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der getestete Analyt Glucose. Der Glucosespiegel in der Körperprobe kann unter Verwendung jeglicher bekannter hochsensitiver Glucosebestimmungsverfahren bestimmt werden, die auf Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Biolumineszenz basieren. Bei spiele derartiger Verfahren sind die kontinuierliche Überwachung von Reaktionen, die NADH und NADPH unter Verwendung von immobilisierter Luciferase und Oxidoreduktasen aus Beneckea harveyi (Haggerty, C. et al., Anal. Biochem., 88:162-173, 1978 oder Jablonski, E., et al., Clin. Chem., 25:1622-1627, 1979) produzieren. Zusätzlich können zur Bestimmung des Glucosespiegels in der Probe auch jegliche im Fachgebiet bekannte colorimetrischen oder elektrochemischen Verfahren verwendet werden, bei denen Glucoseoxidase oder Glucosedehydrogenase oder Hexokinase verwendet wird (vgl. beispielsweise Sigma Kat #: 315, 115-A, 510-A).
Die Berechnung der Konzentration des getesteten Analyten beruht auf dem Verhältnis der Konzentration des Analyten, der in der erhaltenen Probe gemessen wurde, zur Konzentration der Blutkomponente, die in derselben Probe gemessen wurde, und dem durchschnittlichen Gehalt derselben Blutkomponente in menschlichem Blut. Wenn beispielsweise der getestete Analyt Glucose ist und die gemessene Blutkomponente Hämoglobin ist, wird die Glucosekonzentration im Blut des getesteten Individuums aus dem Verhältnis der Glucose zum Hämoglobin, das in der erhaltenen Probe gemessen wurde, und dem durchschnittlichen Hämoglobingehalt in menschlichem Blut berechnet.
Die Menge des Analyten im Blut des getesteten Individuums wird auf der Basis der Messungen des Blutvolumens und dem Spiegel des getesteten Analyten in der erhaltenen Probe berechnet. Kalibrierungswerte der Blutkomponente und des getesteten Analyten werden typischerweise durch Testen von verdünnten Standardlösungen dieser Komponenten durch im Fachgebiet bekannte Verfahren erhalten, wie diejenigen, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben werden. Typischerweise erfolgt dies durch Teilen einer von einem getesteten Individuum erhaltenen Körperprobe in mehrere Aliquots; wobei einige auf den Spiegel des getesteten Analyten (z.B. Glucose) durch einen oder mehrere im Fachgebiet bekannte Tests getestet werden und die restlichen Aliquots auf den Spiegel desselben Analyten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens getestet werden. Die Ergebnisse, die unter Verwendung der bekannten Verfahren erhalten werden, und die Ergebnisse, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, werden dann korreliert, indem eine Standardregressionsanalyse verwendet wird, aus der man eine Regressionsgleichung mit der folgenden Formel erhält: Spiegel des getesteten Analyten im Blut = (Spiegel des getesteten Analyten, gemessen durch das erfindungsgemäße Verfahren) × (Steigung) + (Schnittpunkt);wobei die Steigungs- und Schnittpunktwerte von der Regressionsanalyse stammen. Die Regressionsanalyse kann leicht durch im Fachgebiet bekannte Verfahren unter Verwendung von dem Fachmann bekannter Software, wie beispielsweise Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA), Lotos 123, Quattro Pro etc., durchgeführt werden. Statistische Softwarepakete, wie beispielsweise das SPSS-Programm, stehen ebenfalls zur Verfügung. Zusätzlich können auch Regressionsfunktionen in verschiedene Taschenrechner wie beispielsweise diejenigen, die von Texas Instruments, U.S.A., Hewlett-Packard, USA, Casio, Japan, Sharp, Japan etc. hergestellt werden, einprogrammiert werden.
In einer Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspekts ist die Körperprobe, die kein Blut ist, welche von einem zu testenden Individuum erhalten wurde, Urin oder Speichel, der rote Blutkörperchen enthält und der verschiedene Analyten in seiner Flüssigkeit, einschließlich nachweisbarer Glucosemengen, umfasst. Das Gewinnen von Urin- und Speichelproben fügt dem getesteten Individuum keinen Schaden zu und verhindert mögliche vorstehend erwähnte Nebenwirkungen. Daher können derartige Proben häufig und wiederholt gewonnen werden, ohne dem Individuum Schaden zuzufügen.
Wenn die erhaltenen Körperproben leicht verfügbare Körperflüssigkeiten sind, wie Blut oder Speichel, kann der getestete Analyt von zwei Quellen stammen: (a) Flüssigkeit, die von einer Drüse oder einem Gewebe sekretiert wird oder (b) von Blut, das die Flüssigkeiten in den Proben kontaminiert. Daher wird in solchen Fällen zur Bestimmung des Spiegels des getesteten Analyten (z.B. Glucose) im Blut des getesteten Individuums der interzelluläre Spiegel des getesteten Analyten in den roten Blutkörperchen gemessen, die in der Probe vorhanden sind. Die Menge der Blutkomponente (typischerweise Hämoglobin) in der Probe wird auch gemessen und beide werden als Basis zur Bestimmung des Volumens der roten Blutkörperchenflüssigkeit verwendet.
Um den Spiegel des getesteten Analyten in der erhaltenen Urin- oder Speichelprobe sowie die Menge der Blutkomponente in der Probe zu bestimmen, werden typischerweise die in den erhaltenen Proben vorhandenen roten Blutkörperchen zuerst abgetrennt.
Die Abtrennung der roten Blutkörperchen aus den erhaltenen Proben kann durch irgendeines der im Fachgebiet bekannten Verfahren wie Zentrifugation oder Filtration durchgeführt werden. Alternativ können die Proben auf einen Filter aufgebracht werden, der für das Einfangen von roten Blutkörperchen konstruiert wurde. Mehrere nicht einschränkende Beispiele derartiger Filter sind der PlasmaSep^TM-Filter, bezogen von Whatman^®, Fairfield, NJ, USA, der CytoSep^®-Filter, bezogen von Ahlstrom Filtration, Mt. Holly Springs, PA, USA oder der HemaSep^®-Filter, bezogen von Pall, East Hills, NY, USA. Die eingefangenen roten Blutkörperchen werden dann auf den Spiegel des Analyten und der Blutkomponente getestet. Fakultativ können die roten Blutkörperchen vor dem Testen ihres Inhalts lysiert werden. Einige dieser Verfahren werden in den nachstehenden Beispielen beschrieben, sollten jedoch nicht als einschränkend ausgelegt werden.
Vor der Abtrennung der roten Blutkörperchen kann der Probe ein Agglutinationsmittel wie beispielsweise Weizenkeim-Agglutinin zugegeben werden, welches die Agglutination der roten Blutkörperchen verursacht, die dann durch irgendeines der vorstehend erwähnten Verfahren abgetrennt werden können. Der intrazelluläre Spiegel des getesteten Analyten wird dann im roten Blutkörperchen bestimmt. Nach einer Ausführungsform werden die abgetrennten roten Blutkörperchen zuerst einem Lyseschritt unterzogen, um ihren Inhalt freizusetzen.
Obwohl in den meisten Fällen bevorzugt wird, die roten Blutkörperchen zuerst von der Probe abzutrennen, kann zuweilen bevorzugt werden, die Zellen zu lysieren, ohne sie zuerst abzutrennen. In einem derartigen Fall wird die Probe in zwei Proben aufgeteilt. Der ersten Probe wird ein Lysemittel zugegeben, das die Lyse der roten Blutkörperchen verursacht, deren Inhalt sich in die Probe ergießt. Durch Subtrahieren der gemessenen Konzentration des getesteten Analyten in der zweiten Probe, dem kein Lysemittel zugegeben wurde, von der gemessenen Konzentration des Analyten in der ersten Probe, in der die roten Blutkörperchen lysiert wurden, ist es möglich, die intrazelluläre Konzentration des Analyten in den roten Blutkörperchen zu bestimmen (vgl. Beispiel 3 nachstehend).
Typischerweise wird das Lysemittel der Körperprobe in einem der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zugegeben, zuweilen kann es jedoch möglich sein, die intrazelluläre Konzentration des Analyten in den roten Blutkörperchen, die in der Probe vorhanden sind, ohne Zugabe eines Lysemittels zu bestimmen. Wenn die Probe beispielsweise zuerst durch einen Filter geschickt wird, kann die Fixierung der Zellen an den Filter Risse in der Zellmembran der roten Blutkörperchen verursachen, und folglich kann ihr Inhalt aus den Zellen heraus fließen und der Spiegel des getesteten Analyten wird dann bestimmt.
Die Lyse der in den Proben vorhandenen roten Blutkörperchen kann durch irgendeines der im Fachgebiet bekannten Verfahren unter Verwendung von bekannten, rote Blutkörperchen lysierenden Mitteln wie beispielsweise Saponin, Ammoniumsalze, verschiedene Detergenzien, hypotonische Lösungen, Schlangengifte etc. erfolgen.
Nach dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Spiegels eines Analyten im Blut des Individuums bereit, umfassend

(i) die Bereitstellung einer Urin- oder Speichelprobe von dem Individuum;
(ii) Messen des Spiegels des Analyten in den roten Blutkörperchen, die in der Probe vorhanden sind;
(iii) Messen der Menge einer Blutkomponente in den roten Blutkörperchen in der Probe und auf der Basis dieser Messung Berechnung des Volumens der Blutzellen oder der Anzahl der Blutzellen in den Proben; und
(iv) Berechnung des Spiegels des Analyten im Blut des getesteten Individuums, basierend auf den Messungen in (ii) und (iii).

Wenn die Körperprobe Speichel ist, ist es möglich, vor Gewinnen der Probe Mittel wie Abstriche, Bürsten, Zahnstocher oder verschiedene Nahrungsmittel zu verwenden, die den Blutfluss in den Speichel stimulieren. Außerdem kann es bei erhaltenen Speichelproben vor Beginn der Messungen der verschiedenen Substanzen in der erhaltenen Probe zuweilen vorteilhaft sein, die in der Probe vorlie genden schleimhauthaltigen Materialen durch eines der im Fachgebiet beschriebenen Verfahren (wie beispielsweise US-Patent Nr. 5,268,148) zu entfernen oder abzubauen.
Der Begriff „Speichel" umfasst erfindungsgemäß unter anderem Speichel, verdünnten Speichel, Flüssigkeit, die aus der Mundhöhle oder von der Haut, die die Mundhöhle umgibt, gewonnen wurde, abgekratztes Material, das an der Oberfläche der Mundhöhle haftet, Exudate oder Transudate, die aus der Mundhöhle gewonnen wurden, und ausgespuckte oder entnommene Mundspülung, die aus der Mundhöhle gewonnen wurde.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält das vorstehende Verfahren einen zusätzlichen Schritt, bei dem die roten Blutkörperchen durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren zuerst von der Probe abgetrennt werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren einen zusätzlichen Schritt, bei dem der Probe ein Lysemittel zugegeben wird, bevor die Menge der Blutkomponente und der getestete Analyt gemessen werden.
Nach einem zusätzlichen erfindungsgemäßen Aspekt besteht die erhaltene Körperprobe aus Haarwurzeln.
Erfindungsgemäß erkannte man, dass es eine leicht verfügbare natürlich erhältliche und ausreichende Quelle an frischem Kapillarblut in der Haarwurzelprobe gibt, die zur Bestimmung des Spiegels eines getesteten Analyten in der Haarwurzel als Basis zur Bestimmung seines Spiegels im Blut des Individuums, von dem die Haarwurzeln erhalten wurden, verwendet werden kann. Der Haarfollikel schließt ein ausgedehntes Netzwerk an Blutgefäßen ein, die den schnell sich teilenden Haarwurzelzellen Nahrung liefern. Ein Komplex von ineinander verschlungenen Blutkapillaren (Papillen) durchdringt die breite Haarwurzel am unteren Ende des Haares und wenn das Haar ausgezupft wird, ist die Papille, die reich an Blut ist, und manchmal die ganze oder ein Teil der Follikelscheide noch an den Haarschaft gebunden, und stellt daher eine Kapillarblutprobe bereit. Die Kapillarblutversorgung umfasst Blut, das das Haarfollikel erst kürzlich erreicht hat, und deshalb entspricht der Spiegel der Substanz im Kapillarblut ganz genau demjenigen derselben Substanz in dem Blut des Individuums. Gelegentlich kann man eine Gewebeprobe, die interstitielle Flüssigkeit enthält, auch auf dem aus zupften Haar finden, und es kann als Quelle zur Bestimmung des Spiegels eines Analyten im Blut verwendet werden. Da sich die interstitielle Flüssigkeit in der Nähe zahlreicher und aktiver Blutgefäße der Haarwurzel befindet, sagt der Spiegel des Analyten, der in dieser interstitiellen Flüssigkeit bestimmt wird, gleichzeitig viel über den Spiegel desselben Analyten im Blut aus.
Wenn die erhaltene Körperprobe aus Haarwurzeln besteht, erwartet man aufgrund des ausgedehnten Netzwerks an Blutgefäßen in der Haarwurzel und Haarscheide, dass die gesamte Menge des getesteten Analyten, z.B. Glucose, in einer derartigen Probe von dem frischen Blut in der Haarwurzel stammt. Zusätzlich kann der Ursprung der gemessenen Blutkomponente, die typischerweise Hämoglobin ist, im Haar ausschließlich das Blut in der Haarwurzel sein. Da die Konzentration der Blutkomponente eines Individuums relativ konstant ist, entspricht die Konzentration der Blutkomponente, die im frischen Blut in der Haarwurzel gemessen wird, ihrer Konzentration im Blut des getesteten Individuums. Deshalb wird es möglich, die Konzentration des getesteten Analyten (z.B. Glucose) im Blut des getesteten Individuums auf der Basis der Menge des freien Analyten und der Menge der Blutkomponente, die beide von den Haarwurzeln extrahiert werden, zu bestimmen.
Im Gegensatz zu den Schwierigkeiten, die durch wiederholtes Stechen der Haut verursacht werden, erzeugt das wiederholte Auszupfen der Haare keine Wunden oder Narben, und die Nebenwirkungen sowie das individuelle Unbehagen sind minimal, insbesondere wenn eine geringe Anzahl von Haarschäften gesammelt wird. Außerdem fällt eine große Fraktion der Haare natürlich aus oder wird z.B. durch Kämmen leicht entfernt, und solche Haare können kurz nach ihrer Entfernung ebenfalls zur erfindungsgemäßen Verwendung gewonnen werden.
Daher wird nach einer zusätzlichen Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspekts der Spiegel eines getesteten Analyten im Blut eines Individuums auf der Basis des Spiegels des Analyten in einer Haarprobe bestimmt, die von dem Individuum erhalten wurde. Nach dieser Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Bestimmung des Spiegels eines Analyten im Blut eines Individuums bereit, umfassend:

(i) Gewinnen einer Haarprobe von dem Individuum;
(ii) Bestimmen des Blutvolumens und des interstitiellen Flüssigkeitsvolumens, falls vorhanden, in der erhaltenen Probe und gegebenenfalls Korrigieren der Variationen zwischen verschiedenen Haarproben;
(iii) Bestimmen des Spiegels des Analyten im Blut und in der interstitiellen Flüssigkeit, falls vorhanden; und
(iv) Berechnen des Spiegels des Analyten im Blut des getesteten Individuums, basierend auf den Messungen in (ii) und (iii).

Nach dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die Haarprobe durch irgendeines der zahlreichen Verfahren gewonnen werden, z.B. durch Verwendung eines Gerätes zur Haarentfernung, von Klebestreifen, einer Pinzette, durch Kämmen etc.
Vor der Bestimmung der Blutmenge oder der interstitiellen Flüssigkeitsmenge im Haarfollikel können diese aus dem Haarfollikel extrahiert werden, indem das gewonnene Haar in einem geeigneten Verdünnungsmittel wie beispielsweise gepufferter Salzlösung inkubiert wird. Das Verdünnungsmittel kann Komponenten einschließen, die seine Extraktionskapazität verstärken wie beispielsweise Antikoagulantien (z.B. Heparin, Citrat, EDTA), Enzyme (z.B. Proteasen, Neuraminidasen), keratolytische Mittel (Benzoesäure und/oder Salicylsäure oder deren Salze) und Detergentien.
Die restlichen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, die bei der Haarwurzelprobe erfolgen, ähneln den vorstehend beschriebenen Schritten hinsichtlich anderer Arten von Körperproben und Flüssigkeiten. Jedoch ist in diesem Fall ein Abtrennungsschritt der roten Blutkörperchen nicht erforderlich, da der einzige Ursprung des getesteten Analyten in dem Blut liegt, das aus der Haarwurzel extrahiert wird. Ungeachtet des Vorstehenden kann es zuweilen vorteilhaft sein, der aus der Haarwurzel extrahierten Probe ein Lysemittel hinzuzufügen, um die Messung des getesteten Analyten und der Blutkomponente in der Probe zu erleichtern.
In einem zusätzlichen erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Kit zur Bestimmung des Spiegels eines Analyten im Blut eines getesteten Individuums bereitgestellt, umfassend

(i) Mittel zum Entnehmen einer Probe von dem Individuum, wobei die Probe keine Blutprobe ist, jedoch Blutkomponenten enthält;
(ii) Mittel zum Messen des Spiegels einer Blutkomponente in der Probe, um das Blutvolumen in der erhaltenen Probe zu bestimmen;
(iii) Mittel zum Messen des Spiegels des getesteten Analyten in der erhaltenen Probe;
(iv) Mittel zum Berechnen des Spiegels des getesteten Analyten im Blut des getesteten Individuums auf der Basis der Messungen, die vorstehend in (ii) und (iii) erhalten wurden.

In einer Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspekts umfasst der vorstehende Kit auch Mittel zur Abtrennung der roten Blutkörperchen von der Probe, die irgendeines von denjenigen sein können, die vorstehend diskutiert wurden. In einer zusätzlichen Ausführungsform kann der Kit auch Mittel zur Lyse der roten Blutkörperchen in der Probe umfassen, wie beispielsweise diejenigen, die vorstehend detailliert beschrieben wurden.
Der vorstehende Kit kann auch einen Teststreifen umfassen, der die Reagenzien oder Strukturen umfasst, die notwendig sind, um die Messungen des getesteten Analyten sowie der Blutkomponente durchzuführen. In einem derartigen Fall ist ein Gerät, in das der Teststreifen eingebracht werden kann, oder mit dem der Teststreifen verbunden werden kann, auch in den Kit eingeschlossen. Ein derartiges Gerät, das tragbar sein kann, kann das Signal nachweisen und analysieren, das von den Teststreifen emittiert wird und kann sie fakultativ direkt in gängige Einheiten übersetzen.
Wenn die erhaltene Körperflüssigkeit Speichel ist, kann der vorstehende Kit auch Mittel zur Stimulierung des Blutflusses in den Speichel wie Abstriche, Bürsten, Zahnstocher oder stimulierende Nahrungsmittel einschließen, die beim getesteten Individuum angewandt werden, bevor eine Körperprobe gewonnen wird. Der vorstehende Kit kann dann auch Reagenzien und Mittel einschließen, die schleimhauthaltige Materialien entfernen oder spalten können, die zur Behandlung der Speichelprobe vor der Analyse oder dem Testen im Speichel vorhanden sind (wie diejenigen, die vorstehend erwähnt wurden).
Wenn der getestete Analyt Glucose ist, kann der vorstehende Kit auch einen metabolischen Inhibitor wie beispielsweise Natriumfluorid umfassen, der die Glucoseverwertung von jeglicher lebenden Zelle, die in der Probe enthalten ist, verhindern kann.
Gemäß den erfindungsgemäßen Ausführungsformen, bei denen die erhaltene Körperprobe eine Haarprobe ist, umfasst der erfindungsgemäße Kit folgendes:

(i) Gerät zum Entfernen von Haaren;
(ii) ein geeignetes Verdünnungsmittel, in dem das Blut und die interstitielle Flüssigkeit, falls vorhanden, von dem erhaltenen Haar gesammelt werden;
(iii) Mittel zur Bestimmung des Spiegels einer Blutkomponente im Blut und in der interstitiellen Flüssigkeitsprobe;
(iv) Mittel zur Bestimmung des Spiegels des Analyten in der Probe im Blut und in der interstitiellen Flüssigkeitsprobe; und
(v) Mittel zum Berechnen des Spiegels des untersuchten Analyten im Blut des getesteten Individuums auf der Basis der Messungen, die vorstehend in (iii) und (iv) erhalten wurden.

BEISPIELE
Die Erfindung wird nun mittels der folgenden nicht einschränkenden Beispiele dargestellt.
Beispiel 1 Bestimmung des Glucose- und Hämoglobinspiegels in einer Probe, die erfindungsgemäß von einem Haarfollikel gewonnen wurde
Gewinnen einer Probe aus dem Haar eines getesteten Individuums
Etwa 5-10 Haarsträhnen werden durch Herausziehen auf irgendeinem behaarten Hautbereich (Kopfhaut, Hände, Beine, Gesicht, Nase, Ohren etc.) ausgezupft. Das Haar wird dann in Wasser gewaschen und in 500 μl rote Blutkörperchen lysierendes Mittel (Kat # R1129) von Sigma Chemical Co. (St. Louis. MO, USA) eingetaucht.
Das Haar wird in der vorstehenden Lösung während eines Zeitraumes inkubiert, der für das Gewinnen des maximalen Volumens an Blut und seiner interstitiellen Flüssigkeit von dem Haar geeignet ist. Die flüssige Probe wird dann in folgende zwei Proben aufgeteilt:
a. Eine Probe, die für die Bestimmung des Glucosespiegels in dem erhaltenen Blut oder der interstitiellen Flüssigkeit verwendet wird
In einem Mikrozentrifugenteströhrchen („Eppendorf"-Typ) werden 25 μl der vorstehenden Probe mit 100 μl Glucoseoxidase, Meerettichperoxidase-Gemisch, hergestellt aus der Enzymkapsel im colorimetrischen Glucose-Testkit von Sigma Chemicals (Kat # 510-A oder 510-DA), gemischt. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur (18-30°C) werden dann 100 μl 1:1 verdünnter Pierce (Rockford, IL, USA) PowerSignal^TM Luminol/Verstärker (der von Kat # 37075 stammt) zugegeben und die Inkubation eine weitere Minute fortgesetzt. Das Teströhrchen wird dann in ein Labsystems-Luminoskan-Luminometer gegeben und die Lumineszenz wird aufgezeichnet.
b. Probe 2 wird zur Bestimmung des Hämoglobinspiegels im Blut und in der interstitiellen Flüssigkeit verwendet, das/die aus dem Haar des getesteten Individuum gewonnen wird
In einem Mikrozentrifugenteströhrchen („Eppendorf"-Typ) werden 25 μl der vorstehenden Probe mit 100 μl Pierce PowerSignal^TM ELISA-Chemilumineszenz-Substrat-Arbeitslösung, hergestellt nach den Anweisungen von Produkt # 37075, gemischt. Nach 1-minütiger Inkubation wird das Teströhrchen dann in den Labsystems-Luminoskan-Luminometer gegeben und die Lumineszenz wird aufgezeichnet.
c. Die Glucose- und Hämoglobinspiegel in der aus dem Haar des getesteten Individuums gewonnen Probe werden folgendermaßen berechnet:
Die Netto-Glucosereaktion wird aus der vorstehenden Glucoselumineszenz minus der Hämoglobinlumineszenz abgeleitet. Der tatsächliche Glucose- und Hämoglobingehalt der Haarprobe wird unter Anwendung der Kalibrierungsgleichung berechnet. Die Glucosekonzentration im Blut wird aus dem Verhältnis der Glucose zum Hämoglobin in der Probe und dem durchschnittlichen Hämoglobingehalt von menschlichem Blut berechnet.
d. Die Glucose- und Hämoglobinwerte wurden folgendermaßen kalibriert:
Die Glucose- und Hämoglobinkalibrierungswerte wurden erhalten, indem verdünnte Standardglucose- und Hämoglobinlösungen getestet wurden, wobei die vorstehenden Verfahren eingesetzt wurden. Eine Kalibrierungsgleichung wird von den Ergebnissen abgeleitet und in den vorstehenden Berechnungen verwendet.
Beispiel 2 Bestimmung des Glucose- und Hämoglobinspiegels in einer Urin- oder Speichelkörperprobe unter Verwendung eines Lumineszenzverfahrens mit Zentrifugation
Etwa 500 μl Urin oder Speichel werden mit 500 μl 0,85%-iger Salzlösung gemischt und 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge (Eppendorf oder andere) zentrifugiert, um die roten Blutkörperchen zu sedimentieren. Der Überstand wird verworfen und das Zellsediment wird in Salzlösung gewaschen und dann in einer Pufferlösung resuspendiert, die ein rote Blutkörperchen lysierendes Mittel oder das rote Blutkörperchen lysierende Mittel (Kat # R1129) von Sigma Chemical Co. (St. Louis. MO, USA) enthält.
Nach der erforderlichen Inkubationszeit werden zwei Aliquots entfernt. Eines der Aliquots wird einer Glucoseanalyse unterzogen und das andere einer Hämoglobinanalyse.
Der Glucosespiegel im ersten Aliguot wird dann folgendermaßen bestimmt:
In einem Mikrozentrifugenteströhrchen („Eppendorf"-Typ) werden 25 μl der vorstehenden Probe mit 100 μl Glucoseoxidase, Meerettichperoxidase-Gemisch, hergestellt aus der Enzymkapsel im colorimetrischen Glucose-Testkit von Sigma Chemicals (Kat # 510-A oder 510-DA), gemischt. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur (18-30°C) werden dann 100 μl 1:1 verdünter Pierce (Rockford, IL, USA) PowerSignal^TM Luminol/Verstärker (der von Kat # 37075 stammt) zugegeben und die Inkubation eine weitere Minute fortgesetzt. Das Teströhrchen wird dann in ein Labsystems-Luminoskan-Luminometer gegeben und die Lumineszenz wird aufgezeichnet.
Der Hämoglobinspiegel im zweiten Aliguot wird dann folgendermaßen bestimmt:
In einem Mikrozentrifugenteströhrchen („Eppendorf"-Typ) werden 25 μl der vorstehenden Probe mit 100 μl Pierce PowerSignal^TM ELISA-Chemilumineszenz-Substrat-Arbeitslösung, hergestellt nach den Anweisungen von Produkt # 37075, gemischt. Nach 1-minütiger Inkubation wird das Teströhrchen dann in den Labsystems Luminoskan Luminometer gegeben und die Lumineszenz wird aufgezeichnet.
Die Kalibrierungswerte und Berechnungen werden bestimmt, wie im vorstehenden Beispiel 1 erklärt.
Beispiel 3 Bestimmung des Glucose- und Hämoglobinspiegels in einer Urin- oder Speichelkörperprobe unter Verwendung des Lyseverfahrens
Gleichgroße Aliquots werden aus der Urin- oder Speichelprobe gewonnen. Eines der Aliquots wird mit einem Reagenz gemischt, das die Lyse der roten Blutkörperchen verursacht wie beispielsweise Saponin. Ein weiteres Aliquot wird mit demselben Volumen eines nicht lysierenden Reagenz gemischt. Die Glucose- und Hämoglobinspiegel werden in beiden Aliquots bestimmt. Die Glucose- und Hämoglobinmenge in der roten Blutkörperchenflüssigkeit wird durch Subtrahieren der Werte des nicht lysierten Aliquots von dem lysierten erhalten.
Beispiel 4 Bestimmung des Glucose- und Hämoglobinspiegels in einer Urin- oder Speichelkörperprobe unter Verwendung eines Filtrationsverfahrens
Die Urin- oder Speichelprobe wird auf einen Filter aufgebracht, der so konstruiert ist, dass er rote Blutkörperchen einfängt. Die Probe wird durch den Filter gesaugt, z.B. durch Anlegen eines Vakuums oder Anbringen einer absorbieren den Unterlage unter dem Filter (derartige absorbierende Materialien sind im Fachgebiet gut bekannt: Polyfiltronics, AFC (American Filtrona Corp. Der Filter wird dann Glucose- und Hämoglobintests unterzogen. Das Endpunktsignal der Tests kann colorimetrisch, fluorometrisch, lumineszent, elektrochemisch, radioaktiv (nicht einschränkende Liste der Endpunkte) sein, die alle gut im Fachgebiet bekannt sind.
Alternative Ausführungsformen des Filtrationsverfahrens:

A. Der Filter kann mit Reagenzien für Hämoglobin (z.B. wie bei den Urinteststreifen, vertrieben von Bayer Corp. (US-Patent Nr. 5,089,420) oder Lachema a.s., Brno, Tschechische Republik, US-Patente 3,975,161 und 4,017,261) und für Glucose imprägniert sein.
B. Einzelne rote Blutkörperchen können auf dem Filter sichtbar gemacht werden (wie bei den vorstehend erwähnten Urinteststreifen) und das Signal, das sich bei jeder Zelle entwickelt, kann individuell untersucht werden, z.B. mit einem Mikroskop oder einer Kamera mit Makrolinse.

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Menge eines Analyten im Blut eines Individuums, umfassend: (i) Bestimmen des Volumens an Blut in einer Probe, die von dem Individuum erhalten wurde, durch Messen der Menge einer Blutkomponente in den Proben, wobei die Probe keine Blutprobe ist, aber Blutkomponenten enthält; (ii) Bestimmen der Menge des Analyten in der Probe oder in den Blutzellen, die in der Probe, die keine Blutprobe ist, anwesend sind; und (iii) Berechnen der Menge des Analyten im Blut des untersuchten Individuums basierend auf den Messungen in (i) und (ii).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Blutkomponente Hämoglobin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe, die keine Blutprobe ist, eine von dem Individuum erhaltene Haarprobe ist, wobei das Verfahren umfasst: (i) Gewinnen einer Haarprobe von dem Individuum; (ii) Bestimmen des Volumens an Blut und interstitieller Flüssigkeit, sofern vorhanden, in der erhaltenen Probe und, sofern notwendig, Korrigieren der Variationen zwischen verschiedenen Haarproben; (iii) Bestimmen der Menge des Analyten im Blut und in der interstitiellen Flüssigkeit, sofern vorhanden; und (iv) Berechnen der Menge des Analyten im Blut des untersuchten Individuums basierend auf den Messungen in (ii) und (iii).
Verfahren nach Anspruch 3, wobei vor Schritt (ii) das Blut und die interstitielle Flüssigkeit, sofern vorhanden, zunächst aus dem Haarfollikel des erhaltenen Haares extrahiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Analyt Glucose ist.
Kit zum Bestimmen der Menge eines Analyten im Blut eines untersuchten Individuums, umfassend: (i) Mittel zum Entnehmen einer Probe von dem Individuum, wobei die Probe keine Blutprobe ist, aber Blutkomponenten enthält; (ii) Mittel zum Messen der Menge einer Blutkomponente in der Probe, um das Volumen an Blut in der erhaltenen Probe zu bestimmen; (iii) Mittel zum Messen der Menge des untersuchten Analyten in der erhaltenen Probe; (iv) Mittel zum Berechnen der Menge des untersuchten Analyten im Blut des untersuchten Individuums auf der Basis der Messungen, die in (ii) und (iii) erhalten wurden.
Kit nach Anspruch 6, des weiteren umfassend Mittel zum Trennen der roten Blutzellen von der Probe.
Kit nach Anspruch 6 oder 7, des weiteren umfassend Mittel für die Lyse der roten Blutzellen.
Kit nach Anspruch 6, des weiteren umfassend einen Teststreifen, der Reagenzien oder Strukturen umfasst, die notwendig sind, um die Messung des untersuchten Analyten und der Blutkomponente durchzuführen, und ein Instrument, in das der Teststreifen eingeführt werden kann oder mit dem der Teststreifen verbunden werden kann, wobei das Instrument in der Lage ist, ein von den Teststreifen ausgesandtes Signal nachzuweisen und zu analysieren und gegebenenfalls diese Signale in gängige Einheiten umzurechnen.
Kit nach Anspruch 6, wobei die erhaltene Körperprobe eine Haarprobe ist und der Kit das Folgende umfasst: (i) Mittel zum Entfernen von Haar; (ii) ein geeignetes Verdünnungsmittel, in dem das Blut und die interstitielle Flüssigkeit, sofern vorhanden, von dem erhaltenen Haar gesammelt werden; (iii) Mittel zur Bestimmung der Menge einer Blutkomponente in der Probe, die Blut und interstitielle Flüssigkeit, sofern vorhanden, enthält; (iv) Mittel zur Bestimmung der Menge des Analyten in der Probe, die Blut und interstitielle Flüssigkeit, sofern vorhanden, enthält; und (v) Mittel zum Berechnen der Menge des untersuchten Analyten im Blut des untersuchten Individuums auf der Basis der Messungen, die in (iii) und (iv) erhalten wurden.
Kit nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei der untersuchte Analyt Glucose ist.
Kit nach Anspruch 11, des weiteren umfassend einen metabolischen Inhibitor, der in der Lage ist, die Verwertung von Glucose durch lebende Zellen, die in der Probe anwesend sind, zu verhindern.