DE69922312T2

DE69922312T2 - Keramikmaterial zur Osteoinduktion enthaltend Mikroporen an der Öberfläche von Makroporen

Info

Publication number: DE69922312T2
Application number: DE69922312T
Authority: DE
Inventors: Joost Dick De Bruijn; Klaas De Groot; Yuan Huipin; Clemens Antoni Van Blitterswijk
Original assignee: Isotis NV
Current assignee: Isotis NV
Priority date: 1998-09-15
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2019-09-15
Also published as: CA2282075A1; DK0987032T3; US6511510B1; US20020035402A1; EP0987032A1; ATE283713T1; AU4746399A; EP0987032B1; DE69922312D1; JP2000093504A; AU766735B2; ES2248958T3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein osteoinduktives Material und auf ein Verfahren zur Zubereitung dieses Materials.
Calciumphosphate wie Hydroxyapatit sind dafür bekannt, dass sie osteokonduktiv oder bioaktiv sind. Dies bedeutet, dass sie als eine Matrize wirken, entlang derer Knochenwachstum geschehen kann. Weiterhin kann Knochenbildung direkt auf der Oberfläche des Materials stattfinden und es wird mit Knochengewebe eine starke Verbindung erhalten. Osteoinduktivität wird auf der anderen Seite als eine Eigenschaft von Materialien betrachtet, die die Bildung von Knochengewebe induzieren. In der Vergangenheit wurde diese Eigenschaft nur im Zusammenhang mit Materialien beschrieben, die osteoinduktive, proteinartige Faktoren wie knochenmorphogene Proteine (Bone Morphogenetic Protein; BMP) enthalten.
Kürzlich wurde jedoch von etlichen Studien berichtet, die eine mögliche osteoinduktive Kapazität von Calciumphosphaten anzeigen, wenn sie intramuskulär in Hunden oder Pavianen implantiert worden sind. Allgemein wird angenommen, dass die Anwesenheit einer porösen Struktur und einer spezifischen Geometrie des Implantates eine entscheidende Rolle bei dem osteoinduktiven Charakter des Implantates spielt.
Yamasaki et al. beschrieben in Biomaterials 1992, Bd. 13, Nr. 5, 308–312, dass sie heterotopische Knochenbildung um poröse Hydroxyapatitkeramikkörnchen herum gefunden haben, nicht jedoch um dichte Körnchen herum. Die porösen Körnchen hatten eine Größe zwischen 200 und 600 μm und eine fortlaufende und miteinander verbundene Mikroporosität, die sich im Bereich von Durchmessern von 2 bis 10 μm bewegt.
Die europäische Patentanmeldung 0 267 624 offenbart eine poröse, auf Calciumphosphat basierende Knochenprothese mit offenen Poren mit einer durchschnittlichen Größe von 0,01 – 2.000 μm und geschlossenen Poren mit einer durchschnittlichen Größe von 0,01 – 30 μm. Von der Prothese wird gesagt, dass sie eine gute Betriebsfähigkeit und einen angemessenen Grad an Biokompatibilität hat.
Das Patent der Vereinigten Staaten 5,017,518 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Calciumphosphatkeramik mit einer porösen Oberfläche. Das Verfahren umfasst die Zubereitung unbehandelter Calciumphosphatkeramik, welche eine Mischung aus Hydroxyapatit und Tricalciumphosphat umfasst, und die Behandlung dieser unbehandelten Keramik mit einer sauren Lösung, um selektiv das Tricalciumphosphat in der Oberfläche der Keramik aufzulösen.
In Journal of Material Science: Materials in Medicine, Bd. 9, Nr. 7, Juli 1998, Seiten 381 – 384, beschrieben Yokozeki et al. ein Knochentransplantat aus beta-Tricalciumphosphat. Das Transplantat wird durch Sintern bei 900 °C zubereitet und hat Mikroporen von 0,2 – 0,5 μm und Makroporen von 0,15 – 0,4 mm und eine Porosität von 60%.
Die europäische Patentanmeldung 0 410 010 offenbart ein Hydroxyapatitknochenimplantat mit Mikroporen mit einer Größe von unter 5 μm, mit Makroporen mit einer Größe von über 100 μm und mit einer Porosität von bis zu 80%.
Das Patent der Vereinigten Staaten 4,195,366 offenbart eine polykristalline Whitlockit-Keramik in entweder porenfreier oder poröser Form. Die Keramik hat eine Kristallitgröße von 0,3 – 3 μm.
Das Patent der Vereinigten Staaten 4,629,464 offenbart ein Knochenfüllmaterial, das aus einem gesinterten Hydroxyapatit zusammengesetzt ist, mit Mikroporen von 0,02 – 0,1 mm, Makroporen von 0,2 – 2,0 mm und einer Porosität von 40%. Das Material wird durch Sintern eines Hydroxyapatitschlammes in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid bei einer Temperatur von 1100 – 1300 °C zubereitet.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein Material mit einer verbesserten Osteoinduktivität bereitzustellen. Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Material bereitzustellen, das dafür geeignet ist, als ein Implantat in lebenden Organismen verwendet zu werden und als ein (zeitweiliger) Ersatz für Knochengewebe zu dienen. Folglich sollte das Material sowohl biokompatibel als auch bioabbaubar sein.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass diese Aufgabe durch die Bereitstellung eines Keramikmaterials erreicht wird, das sowohl Makroporen als auch Mikroporen spezifischer Größen hat. Folglich bezieht sich die Erfindung auf ein osteoinduktives Biomaterial, welches auf einem keramischen Material basiert und das eine Gesamtporosität von 20 bis 90 % hat, worin Makroporen mit einer Größe im Bereich von 0,1 bis 1,5 mm vorhanden sind und worin Mikroporen in der Oberfläche der Makroporen vorhanden sind, wobei diese Mikroporen eine Größe im Bereich von 0,05 bis 20 μm haben.
Das Material der Erfindung zeigt ein ausgezeichnetes osteoinduktives Verhalten in lebendem Gewebe. Die Bildung von Knochengewebe auf der Oberfläche des Materials der Erfindung unterstützt bei der günstigen Annahme eines Implantates, das aus diesem Material hergestellt ist. Darüber hinaus beschleunigt die Bildung des Knochengewebes die Gesundung von jedem Schaden in der Knochenstruktur, welcher den Grund für die Anwendung des Implantates bildet.
Ein osteoinduktives Biomaterial gemäß der Erfindung wird auf einem keramischen Material basiert. Das Biomaterial kann zum Beispiel ein medizinisches Implantat sein, das aus einem keramischen Material gebildet ist. Es ist auch möglich, dass das Biomaterial ein medizinisches Implantat aus einem unterschiedlichen Material ist wie einem Metall oder einem Polymermaterial, auf welchem das keramische Material in der Form eines Überzugs anwesend ist. Eine weitere Möglichkeit wird beschrieben von M. L. Gaillard und C. A. van Blitterswijk in J. Mater. Sci., Materials in Medicine, 5: 695 – 701 (1994). Diese Möglichkeit betrifft ein Copolymer mit hydrogelähnlichen Eigenschaften, das in der Anwesenheit von Calcium und Phosphationen calcifiziert werden kann.
Im Prinzip kann jedes keramische Material verwendet werden, das sowohl ausreichend biokompatibel als auch ausreichend bioabbaubar ist, um als ein Implantat in lebendem Gewebe verwendet zu werden. Vorzugsweise ist das keramische Material in der Lage, eine Calciumphosphatoberfläche entweder in vitro oder in vivo bereitzustellen, welche die vorliegende spezifische Oberflächenstruktur hat. Es wird weiter bevorzugt, dass das keramische Material in der Lage ist, biologisch aktive Mittel wie Wachstumsfaktoren (BMP etc.) entweder in vitro oder in vivo zu adsorbieren. Geeignete Beispiele an keramischen Materialien schließen Calciumphosphate, Glaskeramik und Materialien, die Calciumphosphate und/oder Glaskeramik enthalten, ein.
Vorzugsweise ist das keramische Material ein Calciumphosphat. Bevorzugte Calciumphosphate sind Oktacalciumphosphat, Apatite wie Hydroxyapatit und Karbonatapatit, Whitlockite wie α-Tricalciumphosphat und β-Tricalciumphosphat und Kombinationen davon.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die physikalische Struktur des osteoinduktiven Biomaterials. Das Material umfasst sowohl Makroporen als auch Mikroporen. Die Gesamtporosität bewegt sich von 20 bis 90 %, vorzugsweise von 40 bis 70 %.
Die Makroporen des Materials haben eine Größe von 0,1 bis 1,5 mm. Vorzugsweise liegt die Größe der Makroporen zwischen 0,2 und 1 mm. Es wurde gefunden, dass die angezeigten Größen der Makroporen einen signifikanten günstigen Einfluss auf den osteoinduktiven Charakter des Materials haben. Weiterhin wird bevorzugt, dass die Makroporen miteinander verbunden sind.
Die Mikroporen des Materials haben eine Größe von 0,05 bis 20 μm. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform wird die Bildung von Knochengewebe stark gefördert. Ein bevorzugter Bereich für die Größe der Mikroporen ist von 0,5 bis 10 μm. Die Mikroporen sind wenigstens in der Oberfläche der Makroporen vorhanden. Die Mikroporosität der Oberfläche des Materials liegt vorzugsweise zwischen 40 und 60 %.
In Übereinstimmung mit der Erfindung besteht das Biomaterial vorzugsweise aus Kristallen. Vorzugsweise ist die Größe der Kristalle ähnlich wie die Größe der Mikroporen. Wenn dies der Fall ist, hat das Biomaterial eine bevorzugte Mikrounebenheit. Folglich liegt die Größe der Kristalle vorzugsweise zwischen 0,05 und 20 μm, bevorzugter zwischen 0,5 und 10 μm.
Das osteoinduktive Biomaterial gemäß der Erfindung kann vorteilhafterweise in Anwendungen genutzt werden, wo Knochenbildung gewünscht wird. Folglich kann das Material für die Herstellung von medizinischen Implantaten, besonders Implantaten für Knochenersatz verwendet werden. Das Material kann weiter für die Herstellung eines Gerüstes für das Tissue Engineering eines Knochenäquivalentes verwendet werden.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf Verfahren für die Zubereitung eines wie oben beschriebenen osteoinduktiven Biomaterials.
In einer ersten Ausführung kann das osteoinduktive Biomaterial durch Sintern eines Keramikmateriales unter solchen Bedingungen zubereitet werden, dass ein wie oben beschriebenes osteoinduktives Biomaterial erhalten wird. Das Keramikmaterial befindet sich vor dem Sintern in einem calcinierten Zustand. Das Sintern wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 1000 und 1275 °C durchgeführt, mit einer wässrigen Lösung einer organischen Säure behandelt und gewaschen, um die Säure zu entfernen.
Vorzugsweise wird das Sintern bei einer Temperatur zwischen 1150 und 1250 °C durchgeführt. Die Dauer des Sinterschrittes kann geeigneterweise zwischen 6 und 10 Stunden, vorzugsweise zwischen 7 und 9 Stunden gewählt werden. Es wurde ferner als vorteilhaft befunden, das Sintern durchzuführen, während das Keramikmaterial in einem Puder des Keramikmaterials eingetaucht ist. Dies beeinflusst das Reaktionsvermögen der Oberfläche des Materials und folglich auch die Bioaktivität (Auflösung, Umfällung).
Nach dem Sintern wird das Material vorzugsweise mit Sandpapier wie Si-C-Sandpapier geschliffen, um chemische Oberflächenunreinheiten zu entfernen.
Anschließend wird das Material mit einer wässrigen Lösung einer Säure behandelt. Geeignete Säuren in dieser Hinsicht sind alle Ätzsäuren, d. h. alle Säuren, welche zu einer geringfügigen Auflösung des auf Calciumphosphat basierenden Materials führen. Von der Verwendung der folgenden Säuren wurde gefunden, dass sie zu äußerst günstigen Ergebnissen führen: Maleinsäure, Salzsäure, Phosphorsäure und Kombinationen davon. Die Konzentration der Säure in der Lösung wird vorzugsweise so gewählt, dass der pH-Wert der Lösung zwischen 0 und 4, bevorzugter zwischen 1 und 3 liegt.
Nach der Säurebehandlung, welche vorzugsweise zwischen 3 und 15 Minuten dauert, wird das Keramikmaterial gewaschen, um die Säure zu entfernen. Das Waschen kann geeigneterweise unter Verwendung von Ethanol, Wasser oder einer Kombination davon durchgeführt werden.
Schließlich ist es bevorzugt, das erhaltene osteoinduktive Biomaterial einer Sterilisationsbehandlung wie einer Dampfsterilisation zu unterziehen.
In einer zweiten Ausführung wird ein Schlamm eines Pulvers des Keramikmaterials in einer wässrigen Lösung eines einen negativen Abdruck bildenden Mittels, welches während dem Sintern verbrennt oder verdampft, unter solchen Bedingungen gesintert, dass ein wie oben beschriebenes osteoinduktives Biomaterial erhalten wird. Geeignete negative Abdrücke bildende Mittel schließen Wasserstoffperoxid, Backpulver oder Bicarbonat ein. Vorzugsweise wird Wasserstoffperoxid verwendet.
Folglich wird als erstes das Pulver zu einer wässrigen Lösung des negative Abdrücke bildenden Mittels hinzugefügt, um einen Schlamm auszubilden. Die Konzentration des negative Abdrücke bildenden Mittels in dem Schlamm liegt vorzugsweise zwischen 0,5 und 15 Gew.-% , bevorzugter zwischen 1 und 5 Gew.-%., basierend auf dem Gewicht der Lösung. Das Pulver wird in einem Verhältnis von zwischen 0,5 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Gramm pro 1 Milliliter der Lösung zugefügt. Der Schlamm kann dann in eine Form mit einer gewünschten Form und Größe gegossen und gesintert werden. Das Sintern wird vorzugsweise bei einer Temperatur von zwischen 800 und 1300 °C, bevorzugter zwischen 1000 und 1200 °C für einen Zeitraum von bis zu 12 Stunden durchgeführt. Es sollte darauf acht gegeben werden, dass der Sinterzeitraum nicht so lange dauert, dass ein dichtes Material erhalten wird.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele erklärt werden.
BEISPIEL 1
Zubereitung der Materialien
Vier unterschiedliche Arten poröser Hydroxyapatit (HA)-Scheiben (annähernd 6 × 6 × 2 mm groß) wurden zubereitet:

A: HA bei 1300 °C gesintert (1)
B: HA bei 1250 °C gesintert (2)
C: HA bei 1300 °C gesintert und mit Säure behandelt (3 und 5)
D: HA bei 1250 °C gesintert und mit Säure behandelt (4 und 6).

Die 1 – 4 sind 2500-fach vergrößert; die 5 und 6 sind 81,5-fach vergrößert. Zwei Arten poröser Calciumphosphatblöcke (18 × 18 × 25 mm) wurden durch Sintern von Hydroxyapatit bei entweder 1250 °C (HA1250; weiße Farbe) oder bei 1300 °C (HA1300; blaue Farbe) zubereitet. Das HA1300 wurde durch eine nachfolgende Sinterung der HA1250-Blöcke für 8 Stunden bei 1300 °C (die Temperatur wurde von Raumtemperatur um 100 °C pro Stunde erhöht, für 8 Stunden konstant gehalten, und um 100 °C pro Stunde auf Raumtemperatur erniedrigt), während es in HA-Pulver eingetaucht war, zubereitet, um eine reaktive Oberflächenschicht zu erhalten. HA1300 enthielt annähernd 10 – 12 Gew.-% (3-Tricalciumphosphat. Die Seiten aller Blöcke wurden mit Si-C-Sandpapier #220 geschliffen, um chemische Oberflächenunreinheiten zu entfernen und die Blöcke wurden in 4 Teile von annähernd 8 × 8 × 25 mm geschnitten. Insgesamt zwanzig, 2 mm dicke Abschnitte wurden von jeder Materialart zubereitet. Die Ecken jedes Materials (HA1250 und HA1300) wurden in 2,5 % Maleinsäure für 10 Minuten gegeben. Anschließend wurden alle Schnitte (insgesamt 40) mit Ultraschall für 5 Minuten in Alkohol (70 %) bzw. destilliertem Wasser gereinigt/gewaschen, einzeln verpackt und durch Dampfsterilisation sterilisiert.
Experimentgestaltung und chirurgisches Vorgehen
Es wurden vier Taschen in dem Paravertebralmuskel auf dem Rücken von 7 Ziegen (2 Taschen links und 2 Taschen rechts von der Wirbelsäule) für jedes der vier Implantate geschaffen. Die Implantate wurden in einer randomisierten Weise in jede Tasche eingefügt, wobei sichergestellt wurde, dass jeder Implantattyp nur einmal in jeder Ziege anwesend ist. Jede Materialart wurde siebenfach für die statistische Analyse beurteilt, welches die Verwendung von 7 Ziegen notwendig macht.
Sieben erwachsene holländische Milchziegen (annähernd 40 – 60 kg; frei von CAE/CL-Arthritis und von einem Tierchirurgen untersucht) wurden von einem professionellen Viehzüchter erhalten und für 4 Wochen vor dem Experiment in Quarantäne gehalten. Vor der Operation wurden die Ziegen gewogen und es wurde Amphicilin 20 % (2 ml/50 kg Körpergewicht) durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Das chirurgische Vorgehen wurde unter Inhalationsvollnarkose durchgeführt. Nach einer intravenösen Injektion von Thiopental hielt eine Mischung aus Stickstoffoxid, Sauerstoff und Fluothan die Anästhesie aufrecht. Rechts und links, 10 cm von der Wirbelsäule entfernt, wurde der Rücken jeder Ziege an jeweils zwei Stellen geschoren. Für jede der vier intramuskulären Implantationsstellen (in jeder Ziege) wurde ein Einschnitt von annähernd 3 cm gemacht, gefolgt von stumpfer Dissektion bis die Muskelfaszie des Paravertebralmuskels erreicht war. Unter Verwendung einer Mayoschere wurde ein 15 mm langer Einschnitt in die Muskelfaszie gemacht und anschließend wurde eine intramuskuläre Tasche durch stumpfe Dissektion zubereitet, gefolgt von Implantatinsertion. Die Muskelfaszie und die Haut wurden in gesonderten Schichten unter Verwendung von Vicryl-3-0-Faden geschlossen. Sechs Monate nach der Operation wurden die Tiere unter Verwendung einer intravenös verabreichten Überdosis an Thiopental und Kaliumchlorid geopfert.
Implantatverarbeitung und Histologie
Nach dem Opfern der Tiere wurden die Implantate herausgeschnitten. Sechs Implantate jeder Materialart wurden in Karnovskys Fixativ für wenigstens eine Woche gegeben (4 °C), während das siebte Implantat bei -70 °C für die biochemische Analyse gelagert wurde. Die fixierten Implantate wurden anschließend durch eine Ethanolreihe dehydratisiert und in Methylmethacrylat eingebettet. Halbdünne Schnitte wurden auf einer modifizierten Innenschnittdiamantsäge rechtwinklig zu der Längsebene der Implantate geschnitten und durch Lichtmikroskopie hinsichtlich der de-novo-Knochenbildung untersucht.
Ergebnisse
Nach der sechsmonatigen Implantationszeit zeigte die Histologie, dass eine dünne faserige Gewebekapsel die HA-Proben umgab. Das benachbarte Muskelgewebe hatte ein normales Erscheinungsbild. Keine der HA1250- und HA1300-Proben zeigte Abbauzeichen. Bei den säurebehandelten HA1250-Proben konnten einige abgelöste HA-Partikel an der Peripherie des Implantates beobachtet werden, während reichlicher Oberflächenabbau bei dem säurebehandelten HA1300 beobachtet wurde. Besonders an der äußeren Oberfläche dieser Implantate waren viele abgelöste HA-Partikel in den umgebenden Geweben vorhanden. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass insbesondere bei sowohl der äußeren Oberfläche als auch den Porenoberflächen der säurebehandelten HA1250-Implantate zahlreiche einzelne einkernige und vielkernige Riesenzellen vorhanden waren, die mehr oder weniger in der Morphologie kubisch waren. Weiterhin war bei den säurebehandelten HA1250-Proben die de-novo-Knochenbildung offensichtlich. Dieses Knochengewebe war im Erscheinungsbild normal und enthielt Osteoblasten und Osteozyten. Keines der anderen Materialien zeigte irgendwelche Knochenbildung.
BEISPIEL 2
Zubereitung der Materialien
Eine 2,0 M Lösung (A) Calciumnitrat-Tetrahydrat (AR) in destilliertem Wasser (AD) wurde zubereitet. Eine 2,0 M zweite Lösung (B) wurde aus Diammoniumhydrogenphosphat (AR) zubereitet in destilliertem Wasser (AD) zubereitet. Unter Rühren und Anpassen des pH-Wertes unter Verwendung von Ammoniak (AR) gerade über 8,0 wurde die zweite Lösung (B) langsam zu der ersten Lösung (A) in einem Verhältnis von 1,63 : 1 (Vol/Vol) hinzugefügt.
Die erhaltene vermischte Lösung wurde über Nacht in einem Schrank bei Umgebungstemperatur gehalten. Am nächsten Tag wurde der pH-Wert der Lösung auf über 10,0 unter Verwendung von Ammoniak angepasst. Die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur belassen, um zu altern.
Nach 30 Tagen wurde die klare Lösung abgegossen um einen Schlamm zurückzulassen, welcher fünfmal mit destilliertem Wasser (AD) gewaschen wurde. Als nächstes wurde der Schlamm über 3 Filterpapiere (2-mal #3 und 1-mal #1) unter negativem Druck gefiltert. Der Kuchen in dem Filter wurde dreimal mit destilliertem Wasser (AD) gewaschen, während darauf geachtet wurde, dass zwischen jedem Waschzyklus der Filterkuchen trocken, jedoch nicht gebrochen war. Der Kuchen wurde dann in einem Ofen bei 50 °C getrocknet und zu einem Pulver vermahlen. Das resultierende Pulver wurde über einen Siebapparat mit einer 140er Maschengröße gesiebt, um ein biphasisches Calciumphosphat (BCP)-Pulver zu erhalten.
Das BCP-Pulver wurde mit einer 3 % wässrigen Wasserstoffperoxidlösung in einem Verhältnis von 1 g Pulver in 1 ml Lösung vermischt. Der resultierende Schlamm wurde in eine Form gegossen, die aus einem Plastikbehälter (Durchmesser 38 mm, Höhe 60 mm) bestand. Die Form wurde in einen Ofen bei 60 °C zum Schäumen und Trocknen gestellt. Als nächstes wurden die trockenen porösen Blöcke vorsichtig aus dem Container entfernt und bei 1100 °C für 10 Stunden gesintert (die Temperatur wurde von Raumtemperatur auf 1100 °C in 10 Stunden erhöht und nach dem Sintern wurde die Temperatur auf Raumtemperatur in demselben Zeitrahmen abgesenkt).
Tierversuche
Um die Osteoinduktivität des oben zubereiteten biphasischen Calciumphosphates (BCP) zu untersuchen, wurden BCP-Zylinder in die Oberschenkelmuskeln von Hunden für 90 Tage implantiert. Durch BCP induzierte Knochenbildung wurde durch Histologie, zurückgestreute Elektronenmikroskopie (BSE) und energiedispersive Röntgen (EDX)-Mikroanalyse analysiert.
1. Zubereitung der Implantate
BCP-Blöcke, maschinell aus wie oben erhaltenem BCP-Keramik-Körper hergestellt, wurden zu Zylindern (5 mm Durchmesser, 6 mm lang) geschliffen. Die Implantate wurden unter Ultraschall mit 70 % Ethanol für 15 Minuten und mit entmineralisiertem Wasser zweimal (jeweils 15 Minuten) gewaschen, bei 50 °C getrocknet und dann für 30 Minuten vor der Implantation dampfsterilisiert (121 °C).
2. Tiervorbereitung
Acht gesunde Hunde (männlich und weiblich, 2 – 6 Jahre alt, 10 – 15 kg) wurden ausgewählt und verwendet, um die Osteoinduktivität von BCP zu untersuchen.
3. Chirurgisches Vorgehen
Das chirurgische Vorgehen wurde unter Vollnarkose (30 mg Pentobarbital-Natrium/kg Körpergewicht) und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Nach dem Rasieren wurde die Haut mit Iod und 70 % Ethanol sterilisiert. Mit einem Skalpell wurde ein Längsschnitt in der Haut gemacht. Durch eine stumpfe Abtrennung wurde der Oberschenkelmuskel beseitigt. Wiederum mit einem Skalpell wurde ein schmaler Längsschnitt in dem Oberschenkelmuskel gemacht und eine Muskeltasche wurde durch stumpfe Abtrennung erhalten. Ein BCP-Zylinder wurde in die Muskeltasche eingeführt (ein BCP-Implantat wurde in jeden Hund implantiert). Das chirurgische Vorgehen wurde durch Vernähen der Muskeltasche und der Haut in Schichten mit Seidenfaden beendet. Den Tieren wurden intramuskulär 1,6 Millionen Einheiten Penicillin dreimal in 3 Tagen injiziert.
4. Probenernte
Neunzig Tage nach der Operation wurden die Tiere durch eine Überdosis Pentobarbital-Natrium geopfert und die implantierten Proben mit den umgebenden Geweben wurden gesammelt und unmittelbar in 4 % gepuffertem (pH = 7,4) Formaldehyd fixiert. Insgesamt 8 Proben wurden aus insgesamt 8 Hunden gesammelt.
5. Histologische Vorbereitung
Die fixierten Proben wurden mit PBS gewaschen (3 PBS-Wechsel, je 2 Tage), dann mit Reihen an Ethanollösung (70 %, 80 %, 90 %, 96 % und 100 % × 2) dehydratisiert und in MMA eingebettet. Dünne, nicht entkalkte Schnitte (10 – 20 Mikrometer) wurden gemacht und mit Methylenblau und basischem Fuchsin für die histologische Beobachtung gefärbt. Etliche Schnitte wurden mit Kohlenstoff überzogen und mit BSE und EDX beobachtet.
6. Ergebnisse
Anzeichen von Knochenbildung:

– Knochenbildung wurde in sämtlichen Proben (8 von 8) gefunden

Identifizierung des indizierten Knochens:

– Histologisch wurde Knochen in den Poren innerhalb der Implantate gefunden. Mineralisierte Knochenmatrix, Osteoblastensäume und Osteozyten waren ersichtlich. Die BSE-Beobachtung zeigte, dass das Knochengewebe mineralisiert war und Osteozytenlakunen enthielt; die EDX-Analyse zeigte, dass die mineralisierten Gewebe aus Ca und P zusammengesetzt waren.

7. Schlussfolgerung
Weichgewebeimplantation (sowohl intramuskulär als auch subkutan) ist das Studienmodell der Osteoinduktion. Die Knochenbildung in BCP-Keramik nach intramuskulärer Implantation zeigte, dass das untersuchte BCP osteoinduktiv ist.
BEISPIEL 3
Zubereitung der Materialien
Aus SiO₂ (relative Menge 29,4 Gew.-%, AR, Partikelgröße 0,5 – 10 Mikrometer), NaHCO₃ (relative Menge 34,1 Gew.-%, AR), CaCO₃ (relative Menge 28,6 Gew.-%, AR) und Na₂HPO₄ (relative Menge 7,9 Gew.-%, AR) wurde eine Mischung zubereitet. Diese Mischung wurde für 10 Stunden bei 1000 °C und für 2 Stunden bei 1300 °C gesintert. Nach dem Abkühlen wurde ein Glaskeramikmaterial erhalten.
Die Glaskeramik wurde mechanisch in kleine Partikel gebrochen, welche anschließend mit einer Kugelmühle zu einem feinen Pulver gemahlen wurden. Das Pulver wurde durch ein Filter mit einer 200er Maschengröße gesiebt. Das Glaskeramikpulver wurde mit einer 3 % wässrigen Wasserstoffperoxidlösung im Verhältnis von 2,4 g Pulver in 1 ml Lösung gemischt. Der resultierende Schlamm wurde in einen Plastikbehälter (Durchmesser 38 mm, Höhe 60 mm) gegossen. Die Form wurde in einen Ofen bei 50 °C zum Schäumen und Trocknen gestellt. Als nächstes wurden die trockenen porösen Blöcke bei 800 – 1000 °C für 2 Stunden gesintert (der Temperaturanstieg betrug 5 °C/min). Schließlich wurde den Blöcken ermöglicht, im Ofen natürlich abzukühlen.
Tierversuche
Um die Osteoinduktivität der oben zubereiteten Glaskeramik zu untersuchen, wurden Glaskeramikzylinder in die Oberschenkelmuskeln von Hunden für 90 Tage implantiert. Die durch Glaskeramik induzierte Knochenbildung wurde mit Histologie, zurückgestreuter Elektronenmikroskopie (BSE) und energiedispersiver Röntgen (EDX)-Mikroanalyse analysiert.
1. Zubereitung der Implantate:
Aus wie oben zubereiteten Glaskeramikkörpern maschinell hergestellte Glaskeramikblöcke wurden zu Zylindern (5 mm Durchmesser, 6 mm lang) geschliffen. Die Implantate wurden unter Ultraschall mit 70 % Ethanol für 15 Minuten, mit entmineralisiertem Wasser zweimal (jeweils 15 Minuten) gewaschen, bei 50 °C getrocknet und dann für 30 Minuten vor der Implantation dampfsterilisiert (121 °C).
2. Tiervorbereitung:
Acht gesunde Hunde (männlich und weiblich, 2 – 6 Jahre alt, 10 – 15 kg) wurden ausgewählt und verwendet, um die Osteoinduktivität von Glaskeramik zu testen.
3. Chirurgisches Vorgehen:
Die Operation wurde unter Vollnarkose (30 mg Pentobarbital-Natrium/kg Körpergewicht) und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Nach dem Rasieren wurde die Haut mit Iod-Ethanol und 70 % Ethanol sterilisiert. Mit einem Skalpell wurde ein Längsschnitt in der Haut gemacht. Durch eine stumpfe Abtrennung wurde der Oberschenkelmuskel beseitigt. Wiederum mit einem Skalpell wurde ein schmaler Längsschnitt in dem Oberschenkelmuskel gemacht, eine Muskeltasche wurde durch stumpfe Abtrennung erhalten. Ein Glaskeramikrylinder wurde in die Muskeltasche eingeführt (ein Implantat wurde in jeden Hund implantiert). Das chirurgische Vorgehen wurde durch Vernähen der Muskeltasche und der Haut mit Seidenfaden in Schichten beendet. Den Tieren wurden intramuskulär 1,6 Millionen Einheiten Penicillin für 3 Tage injiziert.
4. Probenernte:
Neunzig Tage nach der Operation wurden die Hunde durch eine Überdosis Pentobarbital-Natrium geopfert und die implantierten Proben wurden mit umgebenden Geweben gesammelt und unmittelbar in 4 % gepuffertem (pH = 7,4) Formaldehyd fixiert. Insgesamt 8 Proben wurden von 8 Hunden gesammelt.
5. Histologische Vorbereitung:
Die fixierten Proben wurden mit PBS gewaschen (3 PBS-Wechsel, je 2 Tage), dann mit Reihen an Ethanollösung (70 %, 80 %, 90 %, 96 % und 100 % × 2) dehydratisiert und in MMA eingebettet. Dünne, nicht entkalkte Schnitte (10 – 20 Mikrometer) wurden gemacht und mit Methylenblau und basischem Fuchsin für die histologische Beobachtung gefärbt. Etliche Schnitte wurden mit Kohlenstoff überzogen und mit BSE und EDX beobachtet.
6. Ergebnisse:
Anzeichen von Knochenbildung:

– Knochenbildung wurde in 6 von 8 Proben gefunden

Identifizierung des induzierten Knochens:

– Histologisch wurde Knochen in den Poren innerhalb der Implantate gefunden. Mineralisierte Knochenmatrix, Osteoblastensaum und Osteozyten waren ersichtlich. Die BSE-Beobachtung zeigte, dass die Knochengewebe mit Osteozytenlakunen mineralisiert waren; die EDX-Analyse zeigte, dass die mineralisierten Gewebe aus Ca und P zusammengesetzt waren.

7. Schlussfolgerung:
Weichgewebeimplantation (sowohl intramuskulär als auch subkutan) ist das Studienmodell der Osteoinduktion. Die Knochenbildung in Glaskeramik nach intramuskulärer Implantation zeigte, dass die untersuchte Glaskeramik osteoinduktiv ist.

Claims

Osteoinduktives Biomaterial, das auf einem keramischen Material basiert und das eine Gesamtporosität von 20 bis 90 % aufweist, worin Makroporen mit einer Größe im Bereich von 0,1 bis 1,5 mm vorhanden sind und worin Mikroporen in der Oberfläche der Makroporen anwesend sind, wobei besagte Mikroporen eine Größe im Bereich von 0,05 bis 20 μm haben.
Osteoinduktives Biomaterial nach Anspruch 1, worin die Makroparosität zwischen 0,2 und 1 mm ist.
Osteoinduktives Biomaterial nach Anspruch 1 oder 2, worin die Mikroporosität zwischen 0,5 und 10 μm liegt.
Osteoinduktives Biomaterial nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Gesamtporosität zwischen 40 und 70 % liegt.
Osteoinduktives Biomaterial nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das aus Kristallen mit einer Kristallgröße zwischen 0,05 und 20 μm, vorzugsweise zwischen 0,5 und 10 μm zusammengesetzt ist.
Osteoinduktives Biomaterial nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das keramische Material Calciumphosphat, Glaskeramik oder ein Material, enthaltend Calciumphosphat und/oder Glaskeramik, ist.
Osteoinduktives Biomaterial nach Anspruch 6, worin das keramische Material Calciumphosphat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Octacalciumphosphat, Apatiten wie Hydroxyapatit und Apatitcarbonat, Whitlockiten wie β-Tricalciumphosphat und α-Tricalciumphosphat, und Kombinationen derselben, ist.
Osteoinduktives Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Mikroporosität der Oberfläche des Materials zwischen 40 und 60 % ist.
Verfahren für die Herstellung eines osteoinduktiven Biomaterials nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin ein keramisches Material bei einer Temperatur zwischen 1000 und 1275°C gesintert, mit der wässrigen Lösung einer Säure behandelt und gewaschen wird, um die Säure zu entfernen.
Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Säure ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Maleinsäure, Salzsäure, Phosphorsäure und Kombinationen derselben.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin der pH-Wert der wässrigen Lösung zwischen 0 und 4 liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 9 bis 11, worin das Waschen ausgeführt wird unter Verwendung von Ethanol, Wasser oder Kombinationen derselben.
Verfahren zur Herstellung eines osteoinduktiven Biomaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin eine Aufschlämmung hergestellt wird aus einem Pulver eines keramischen Materials in einer wässrigen Lösung eines eine Negativkopie bildenden Mittels, wobei die Aufschlämmung bei einer Temperatur von 800 bis 1200°C gesintert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das die Negativkopie bildende Mittel Wasserstoffperoxid ist.
Verfahren nach Anspruch 9 bis 14, worin das osteoinduktive Biomaterial sterilisiert wird.
Osteoinduktives Biomaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 8, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15.
Medizinisches Implantat, umfassend ein osteoinduktives Biomaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 16.
Gerüst für die künstliche Gewebeherstellung eines Knochenersatzstückes, umfassend ein osteoinduktives Biomaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 16.
Verwendung eines Biomaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 16 in der Herstellung eines Medikaments für die induktive Bildung von Knochengewebe in einem lebendigen Organismus, vorzugsweise einem Säugetier.