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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Sensoranordnungen, die einen Feldverbund
mit einzelnen Feldern umfassen, um eine gleichzeitige Verarbeitung
einer Anzahl von Proben zuzulassen. Die Erfindung stellt zudem Verfahren
zur Herstellung und Verwendung von Feldverbünden bereit.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Zur
Detektion der Gegenwart und/oder Konzentration von spezifischen
Substanzen in Flüssigkeiten und
Gasen steht eine Reihe von Tests und Sensoren zur Verfügung. Davon
ziehen viele als Detektionsmechanismus spezifische Liganden-/Antiliganden-Reaktionen heran.
Diese beruhen auf der Kenntnis, dass sich Substanzpaare (d.h. Bindungspaare
oder Liganden/Antiliganden) aneinander binden, während sie sich nur wenig oder
gar nicht an andere Substanzen binden. Dieser Umstand stellte den
Schwerpunkt einer Reihe von Verfahren dar, die diese Bindungspaare
zur Detektion von Komplexen einsetzen. Diese werden im Allgemeinen durchgeführt, indem
eine Komponente eines Komplexes irgendwie unter Verwendung von z.B.
Radioisotopen, fluoreszierenden und anderen optisch aktiven Molekülen, Enzymen
und dergleichen markiert wird, sodass der gesamte Komplex detektierbar
wird.
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Bei
diesen Sensoren kommen insbesondere Detektionsmechanismen zum Einsatz,
die Gebrauch von Lumineszenz machen. In jüngster Zeit hat die Verwendung
von optischen Fasern (Glasfasern) und optischen Fasersträngen (Glasfasersträngen) in
Kombination mit lichtabsorbierenden Farbstoffen für chemisch-analytische
Bestimmungen eine rasante Entwicklung erfahren, insbesondere innerhalb
der letzten 10 Jahre. Die Verwendung von optischen Fasern für solche
Zwecke und Verfahren sind in nachstehender Literatur beschrieben: Milanovich
et al., "Novel Optical
Fiber Techniques For Medical Application", Preceedings of the SPIE 28th Annual
International Technical Symposium On Optics and Electro-Optics,
Band 494 (1980); Seitz, W.R., "Chemical
Sensors Based On Immobilized Indicators and Fiber Optics", in C.R.C. Critical
Reviews In Analytical Chemistry, Band 19, 135–173 (1988); Wolfbeis, O.S., "Fiber Optical Fluorosensors
In Analytical Chemistry",
in Molecular Luminescence Spectroscopy, Methods and Applications
(S.G. Schulman, Hg.), Wiley & Sons,
New York (1988); Angel, S.M., Spectroscopy 2(4), 38 (1987); Walt
et al., "Chemical
Sensors and Microinstrumentation", ACS
Symposium Series, Band 403, S. 252 (1989); und Wolfbeis, O.S., Fiber
Optic Chemical Sensors, hrsg. von CRC Press, Boca Raton FL, Band
2 (1991).
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Vor
kurzem sind Glasfasersensoren hergestellt worden, die die Verwendung
von mehrfachen Farbstoffen mit einem einzigen, diskreten Glasfaserbündel zulassen.
In den an Walt et al. ausgegebenen US-Patenten Nr. 5.244.636 und
5.250.264 werden Systeme offenbart, die mehrfache, verschiedene
Farbstoffe am distalen Ende des Bündels anbringen. Die offenbarten
Zusammenstellungen ermöglichen
separaten optischen Fasern eines Bündels den optischen Zugang
zu einzelnen Farbstoffen. Dies verhindert das Problem der Dekonvolution
der separaten Signale im zurückkommenden
Licht jedes einzelnen Farbstoffs, wozu es kommt, wenn die Signale
von zwei oder mehr Farbstoffen kombiniert werden, wobei jeder Farbstoff
auf einen unterschiedlichen Analyten anspricht, und zudem gibt es
im Emissionsspektrum der Farbstoffe signifikante Überlappungen.
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In
der US-Anmeldung Nr. 19970818199, die als Priorität für WO 98/50782
dient, sind Feldanordnungen beschrieben, die auf der Oberfläche eines
Substrats, z.B. an der Endstelle eines optischen Faserbündels, Mikrokügelchen
oder Perlen verwenden, wobei jede einzelne optische Faser eine Perle
umfasst, die eine optische Signatur aufweist. Da die Perlen statistisch
verteilt fallen, wird eine einmalige optische Signatur erforderlich,
um das Feld zu "dekodieren"; das heißt, dass,
nachdem das Feld erstellt wurde, eine Korrelation zwischen der Position
einer einzelnen Stelle auf dem Feld und der Perle oder dem bioaktiven
Wirkstoff an der bestimmten Stelle hergestellt werden kann. Dies
bedeutet, dass die Perlen auf dem Feld statistisch verteilt sein können, was,
verglichen mit der In-situ-Synthese oder dem Spotting-Verfahren
nach dem Stand der Technik, ein rasches und kostengünstiges
Verfahren darstellt. Nachdem das Feld mit den Perlen beladen wurde,
kann das Feld dekodiert oder verwendet werden, wobei es nach dem
Testen zu einem vollständigen
oder teilweisen Dekodieren kommt, wie nachstehend detaillierter
beschrieben wird.
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Zudem
sind im US-Patent 5.545.531 Zusammensetzungen beschrieben, die Siliciumwafer
umfassen, die eine Vielzahl von Sondenfeldern in Mikrotiterplatten
aufweisen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß den obigen
Zielen stellt die vorliegende Erfindung Feldverbund-Anordnungen
bereit, die ein erstes Substrat mit einer Oberfläche umfassen, die eine Vielzahl
von Testpositionen aufweist, wobei jede Testposition eine Vielzahl
von diskreten Stellen umfasst. Das Substrat umfasst zudem eine Mikrokügelchen-Population,
die zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst,
worin jede Unterpopulation einen bioaktiven Wirkstoff aufweist.
Die Mikrokügelchen
sind auf jede der Testpositionen verteilt.
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In
einem weitere Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Feldverbund-Anordnungen
bereit, die ein erstes Substrat mit einer Oberfläche umfassen, die eine Vielzahl
von Testpositionen aufweist, und ein zweites Substrat umfassen,
das eine Vielzahl von Feldpositionen umfasst, wobei jede Feldposition
diskrete Stellen umfasst. Die Anordnungen umfassen zudem eine Mikrokügelchenpopulation,
die zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst,
worin jede Unterpopulation einen bioaktiven Wirkstoff aufweist.
Die Mikrokügelchen
sind auf jede der Testpositionen verteilt.
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In
einem zusätzlichen
Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Dekodieren
einer Feldanordnung bereit, die die Bereitstellung einer wie oben
dargelegten Feldanordnung und das Zusetzen einer Vielzahl von dekodierenden
Bindungsliganden zur Feldverbund-Anordnung umfassen, um die Position
von zumindest einer Vielzahl der bioaktiven Wirkstoffe zu identifizieren.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren
zum Nachweis der Gegenwart eines oder mehrerer Zielanalyten in einer
oder mehreren Proben bereit, die das Kontaktieren der Probe mit
einer wie hier dargelegten Anordnung und das Nachweisen der Gegenwart
oder der Abwesenheit des Zielanalyten umfassen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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Die 1A, 1B, 1C, 1D und 1E stellen
mehrere verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen des "Zweikomponenten"-Systems dar. 1A stellt
ein Perlenfeld dar. Das erste Substrat 10 weist die Feldpositionen 20 mit
den Wells 25 und den Perlen 30 auf. Das zweite
Substrat 40 weist die Testpositionen 45 auf. Eine
optionale Linse oder ein optionaler Filter 60 ist ebenfalls
angeführt;
Fachleuten ist klar, dass diese auch intern im Substrat enthalten
sein können.
Die 1Bist ähnlich,
mit der Ausnahme, dass keine Perlen eingesetzt werden; dafür weisen
die Feldpositionen 20 die diskreten Stellen 21, 22, 23 etc.
auf, die mittels Spotting-, Druck-, Photolithographieverfahren und
dergleichen gebildet werden können.
Die 1C bis 1F stellen
die Verwendung einer Vielzahl von ersten Substraten dar. Die 1C stellt
eine "Perle aus
Perlen" dar, die über eine
zusätzliche
Vermischungsfunktion verfügen
kann. Die 1D stellt eine Vielzahl von Perlenfeldern
und die 1E eine Vielzahl von Nicht-Perlenfeldern
dar. Die 1F stellt die Verwendung von Bindungsfunktionalitäten zur "Abzielung auf" die ersten Substrate 10 auf
Positionen des zweiten Substrats 40; Fachleuten ist klar,
dass dies auf flachen zweiten Substraten oder abgeteilten zweiten
Substraten vorgenommen werden kann. Die 1F verwendet
die Bindungsligandenpaare 70/70', 71/71', 72/72' etc. Diese
können entweder
chemische Funktionalitäten
oder biologische umfassen, wie sie für IBL/DBL-Paare, wie z.B. Oligonucleotide und
dergleichen, beschrieben sind.
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Die 2A und 2B stellen
zwei verschiedene "Einkomponenten"-Systeme dar. Die 2A stellt ein Perlenfeld dar, wobei das
Substrat 50 die Testpositionen 45 mit den Wells 25 umfasst,
die die Perlen 30 aufweisen. Die 2B stellt
eine Nicht-Perlen-Felder
dar; jede Testposition 45 weist die diskreten Stellen 21, 22, 23 etc.
auf.
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Die 3 stellt
Clustering in einem hyperspektralen Alpha-Raum (α1 =
I1/ΣI1, α2 = I2/ΣIi, α3 = I3/ΣIi etc.) dar. Eine Gruppe von 128 verschiedenen,
auf einem Faserbündel
vorliegenden Perlentypen wurden mittels einer Hybridisierungsgruppe
aus komplementären
Oligonucleotiden dekodiert, die mit vier Farbstoffen markiert waren:
Bodipy-493, Bodipy-R6G, Bodipy-TXR und Bod-564 (nur ein Farbstoff
pro Oligonucleotid). Es wird die zweite Stufe einer vierstufigen
Dekodierung gezeigt, worin 4.013 Perlen dekodiert wurden. Die Zonen
mit farbgetönten
Clustern wurden oval eingerahmt.
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Die 4 stellt
ein Zweifarben-Dekodierungsverfahren dar, worin entweder FAM-markierte oder Cy3-markierte
Oligo-Komplemente eingesetzt werden, um die verschiedenen Perlentypen
auf dem Feld "anzumalen" (zu markieren).
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Die 5 stellt
das Dekodieren von 128 verschiedenen Perlentypen mit vier Farben
und vier Dekodierungsstufen dar (die Einfügung stellt einen einzelnen
Dekodierungsschritt dar, bei dem vier verschiedene Farbstoffe zur
Dekodierung von 16 Perlentypen eingesetzt werden).
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Die 6 stellt eine Grauwertskala zur Dekodierung
von 16 verschiedenen Perlentypen dar: (A) umfasst ein kombinatorisches
Pooling-Schema für
komplementäre
Dekodierungs-Oligos. Bei (B) wurden zwei voneinander unabhängige Normierungsbilder
erworben und die resultierenden Perlenintensitäten verglichen. In (C) werden
die Alpha-Werte (Verhältnis
zwischen Perlenintensität
im angeführten
Dekodierungsschritt und Intensität
im Normierungsbild) für
drei in (A) beschriebene Dekodierungsstufen geplottet.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Bildung von Feldern mit sehr
hoher Dichte, die eine gleichzeitige Analyse, und zwar eher eine
parallele als eine aufeinander folgende Verarbeitung, auf einer
Anzahl von Proben ermöglicht.
Dies wird durch Bildung eines "Feldes
aus Feldern" erzielt,
nämlich
mittels eines Feldverbundes, der eine Vielzahl von einzelnen Feldern
umfasst und so angeordnet ist, dass eine Verarbeitung mehrerer Proben
ermöglicht
wird. Beispielsweise liegt jedes einzelne Feld in jedem einzelnen
Well einer Mikrotiterplatte vor. Folglich kann je nach Größe der Mikrotiterplatte
und Größe des einzelnen
Feldes eine sehr große
Anzahl an Tests gleichzeitig durchgeführt werden. Beispielsweise
können
unter Verwendung einzelner Felder mit 2.000 unterschiedlichen Spezies
(mit hohen eingebauten Redundanzwerten) und einer Mikrotiterplatte
mit 96 Wells 192.000 Versuche gleichzeitig durchgeführt werden.
Die gleichen Felder in einer Mikrotiterplatte mit 384 Wells ergeben
768.000 gleichzeitige Versuche und eine Mikrotiterplatte mit 1.536
Wells 3.072.000 Versuche.
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Im
Allgemeinen können
die erfindungsgemäßen Feldanordnungen
auf mehrere Arten hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform,
die nachstehend detaillierter beschrieben wird, wird ein "Einkomponenten"-System verwendet.
Das bedeutet, dass ein erstes Substrat, das eine Vielzahl von Testpositionen (hierin
mitunter auch als "Test-Wells" bezeichnet), wie
z.B. eine Mikrotiterplatte, umfasst, so angeordnet wird, dass jede
Testposition ein einzelnes Feld umfasst. Testposition und Feldposition
sind somit gleich. Das Kunststoffmaterial der Mikrotiterplatte kann
beispielsweise so ausgebildet sein, dass auf dem Boden jedes einzelnen Test-Wells
eine Vielzahl von "Perlen-Wells" enthalten sind.
Bioaktive Wirkstoffe enthaltende Perlen können sodann, wie nachstehend
detailliert beschrieben, in die Perlen-Wells jeder einzelnen Testposition
gefüllt
werden. Es wird angemerkt, dass, während die vorliegende Offenbarung
die Verwendung von Perlen betont, in keiner der erfindungsgemäßen Ausführungsformen
Perlen eingesetzt werden müssen;
die bioaktiven Wirkstoffe können
direkt an die Feldpositionen gebunden werden. Andere Feldtypen sind
beispielsweise allgemein bekannt und können in diesem Format verwendet
werden; durch Spotting-, Druck- oder Photolithographie ausgebildete Felder
sind allgemein bekannt; siehe beispielsweise WO 95/25113; WO 95/35505;
PCT US98/09163; die US-Patente Nr. 5.700.637; 5.807.522 und 5.445.934;
und US-Anmeldung
Nr. 19970851203, die als Priorität für WO 98/50782
dient. Bei Einkomponentensystemen ohne Einsatz von Perlen werden
in bevorzugten Ausführungsformen
Nicht-Siliciumwafer-Substrate eingesetzt.
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Alternativ
dazu kann ein "Zweikomponenten"-System verwendet
werden. In dieser Ausführungsform werden
die einzelnen Felder auf einem zweiten Substrat ausgebildet, die
dann in das erste Mikrotiterplatten-Substrat eingepasst oder "eingetaucht" werden können. Fachleuten
ist klar, dass eine Reihe von Feldformaten und Anordnungen eingesetzt
werden kann. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet als einzelne Felder
optische Faserbündel,
die im Allgemeinen auf der Oberfläche jeder einzelnen Faser einen "Perlen-Well" geätzt haben,
sodass die bioaktiven Wirkstoff enthaltenden Perlen auf das Ende
des optischen Faserbündels beladen
werden. Der Feldverbund umfasst somit eine Anzahl an einzelnen Feldern,
die so angeordnet sind, dass sie in die Wells einer Mikrotiterplatte
passen. Alternativ dazu können
in einem Zweikomponentensystem andere Typen von Feldformaten verwendet
werden. Geordnete Felder, wie z.B. jene durch Spotting-, Druck- oder
Photolithographieverfahren erhaltene, können, wie oben dargelegt, auf
das zweite Substrat platziert werden. Zudem können, wie in den 1C bis 1F angeführt, "Teile" von Feldern, die
statistisch verteilt oder geordnet sind, als erstes Substrat verwendet
werden.
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Die
vorliegende Erfindung basiert im Allgemeinen auf vorherigen Arbeiten,
die ein analytisches Chemiesystem auf Perlenbasis umfassen, worin
die Perlen, auch als Mikrokügelchen
bezeichnet, die unterschiedliche chemische Funktionalitäten aufweisen,
auf einem Substrat verteilt sind, das eine strukturierte Oberfläche aus
diskreten Stellen umfasst, die die einzelnen Mikrokügelchen
binden kann. Die Perlen sind im Allgemeinen statistisch auf dem
Substrat verteilt, womit mehrere verschiedene Verfahren zum "Dekodieren" der Felder angewandt
werden können.
In einer Ausführungsform
werden einmalige optische Signaturen in die Perlen eingeführt, im
Allgemeinen fluoreszierende Farbstoffe, die dazu verwendet werden
könnten,
die chemische Funktionalität
auf einer bestimmten Perle zu identifizieren. Dies ermöglicht,
dass die Synthese der Kandidatenstoffe (das sind Verbindungen wie
z.B. Nucleinsäuren
und Antikörper)
von deren Platzierung auf einem Feld getrennt werden können; das
bedeutet, dass die Kandidatenstoffe auf den Perlen synthetisiert
werden können
und die Perlen anschließend
auf einer strukturierten Oberfläche
statistisch verteilt werden. Da die Perlen zuerst mit einer optischen
Signatur kodiert werden, kann das Feld später "dekodiert" werden, d.h. nachdem das Feld hergestellt
worden ist, kann eine Korrelation zwischen der Position einer einzelnen
Stelle auf dem Feld mit der Perle oder dem Kandidatenstoff an der
bestimmten Stelle hergestellt werden. Dies bedeutet, dass die Perlen auf
dem Feld statistisch verteilt werden können, was, verglichen mit der
In-situ-Synthese oder dem Spotting-Verfahren nach dem Stand der
Technik, ein rasches und kostengünstiges
Verfahren darstellt. Diese Verfahren sind im Allgemeinen in der
PCT US98/05025; PCT US98/21193; PCT US99/20914; PCT US99/14387; und
in
US 19970818199 ,
die als Priorität
für WO
98/50782 dient, dargelegt. Während
die vorliegende Diskussion im Allgemeinen die Verwendung von Perlen
betrifft, können
die gleichen Anordnungen zudem bei Zellen und anderen Teilchen angewandt
werden; siehe beispielsweise PCT US99/04473.
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In
diesen Systemen sind die bioaktiven Wirkstoffe im Allgemeinen statistisch
verteilt, wodurch ein Kodierungs-/Dekodierungssystem zur Identifizierung
der bioaktiven Wirkstoffe an jeder Position im Feld erforderlich
wird. Dies kann, wie nachstehend detaillierter beschrieben, auf
verschiedene Arten durchgeführt
werden und umfasst im Allgemeinen: a) die Verwendung eines dekodierenden
Bindungsliganden (DBL), der im Allgemeinen direkt markiert ist und
sich an den bioaktiven Wirkstoff oder den Identifikator-Bindungsliganden
(IBL) bindet, der an die Perlen gebunden sind; b) das positionelle
Dekodieren durch beispielsweise Targeting auf die Platzierung von
Perlen (z.B. unter Verwendung von fotoaktivierbaren oder fotoabspaltbaren
Gruppierungen, um die selektive Zugabe von Perlen zu einer bestimmten
Position zuzulassen) oder indem, wie nachstehend ausführlicher
beschrieben, entweder Unterbündel
verwendet werden oder die selektive Beladung von Stellen stattfindet;
c) das selektive Dekodieren, worin nur jene Perlen dekodiert werden,
die sich an ein Target binden; oder d) Kombinationen aus allen davon.
In manchen Fällen
kann dieses Dekodieren, wie nachstehend dargelegt, bei jeder der
einzelnen Perlen stattfinden oder nur bei jenen, die sich an einen
bestimmten Zielanalyten binden. Dies kann wiederum entweder vor
oder nach der Zugabe eines Zielanalyten erfolgen.
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Nachdem
die Identität
(d.h. der eigentliche Wirkstoff) und die Position jedes Mikrokügelchens
im Feld bestimmt worden ist, wird das Feld Proben ausgesetzt, die
die Zielanalyten enthalten, obwohl dies auch, wie nachstehend dargelegt,
vor oder wäh rend
der Analyse stattfinden kann. Die Zielanalyten binden sich an die bioaktiven
Wirkstoffe, wie nachstehend ausführlicher
beschrieben wird, was zu einer Veränderung des optischen Signals
einer bestimmten Perle führt.
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In
der vorliegenden Erfindung kann das "Dekodieren" die Verwendung von optischen Signaturen,
von Dekodierungs-Bindungsliganden, die während des Dekodierens zugesetzt
werden, oder eine Kombination dieser Verfahren umfassen. Die Dekodierungs-Bindungsliganden
binden sich entweder an einen bestimmten Identifikator-Bindungsligandenpartner,
der auf den Perlen vorliegt, oder an den bioaktiven Wirkstoff selbst, wenn
die Perlen als bioaktive Wirkstoffe beispielsweise einzelsträngige Nucleinsäuren umfassen.
Die Dekodierungs-Bindungsliganden sind entweder direkt oder indirekt
markiert, wodurch das Dekodieren durch die Detektion der Gegenwart
der Markierung erfolgt. Indem Pools von Dekodierungs-Bindungsliganden
auf sequentielle Weise verwendet werden, ist es möglich, die
Anzahl der erforderlichen Dekodierungsschritte stark zu reduzieren.
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Folglich
stellt die vorliegende Erfindung Feldverbund-Anordnungen bereit,
die zumindest ein erstes Substrat mit einer Oberfläche umfassen,
die eine Vielzahl von Testpositionen umfasst. Mit "Feld" ist hierin eine Vielzahl
von Kandidatenstoffen in einem Feldformat bezeichnet; die Größe des Feldes
hängt von
der Anordnung und der Endverwendung des Feldes ab. Es können Felder
hergestellt werden, die etwa 2 unterschiedliche bioaktive Wirkstoffe
(d.h. unterschiedliche Perlen) bis viele Millionen unterschiedliche
Wirkstoffe aufweisen, wobei sehr große Glasfaserfelder möglich sind.
Im Allgemeinen umfasst das Feld zwei bis zu einer Milliarde oder
mehr Wirkstoffe, je nach Größe der Perlen
und des Substrats sowie der Endverwendung des Feldes, wodurch Felder
mit sehr hohen Dichten, hohen Dichten, mäßigen Dichten, geringen Dichten
und sehr geringen Dichten hergestellt werden können. Die bevorzugten Bereiche
für Felder
mit sehr hohen Dichten liegen etwa bei 10.000.000 bis etwa 2.000.000.000
(wobei alle Zahlen pro Quadratzentimeter sind), wobei ein Bereich
von etwa 100.000.000 bis etwa 1.000.000.000 bevorzugt wird. Felder
mit einer hohen Dichte liegen in einem Bereich von etwa 100.000
bis etwa 10.000.000, wobei ein Bereich von etwa 1.000.000 bis etwa
5.000.000 insbesondere bevorzugt wird.
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Felder
mit einer mäßigen Dichte
liegen vorzugsweise in einem Bereich von etwa 10.000 bis etwa 100.000
und insbesondere in einem Bereich von etwa 20.000 bis etwa 50.000.
Felder mit einer geringen Dichte liegen im Allgemeinen in einem
Bereich von weniger als 10.000, wobei ein Bereich von etwa 1.000
bis etwa 5.000 bevorzugt wird. Felder mit einer sehr geringen Dichte
liegen in einem Bereich von weniger als 1.000, wobei ein Bereich
von etwa 10 bis etwa 1.000 bevorzugt wird und ein Bereich von etwa
100 bis etwa 500 insbesondere bevorzugt wird. In einigen Ausführungsformen
kommen die erfindungsgemäßen Anordnungen nicht
als Feldformat vor; das bedeutet, dass für einige Ausführungsformen
auch Anordnungen erstellt werden können, die einen einzigen bioaktiven
Wirkstoff enthalten. Zudem können
in einigen Feldern mehrfache Substrate verwendet werden, die entweder
unterschiedliche oder gleiche Anordnungen aufweisen. Folglich können große Felder
beispielsweise eine Vielzahl kleinerer Substrate umfassen.
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Darüber hinaus
ist ein Vorteil der vorliegenden Anordnung, dass insbesondere durch
die Verwendung von Faseroptiktechnologien Felder mit extrem hohen
Dichten hergestellt werden können.
Da z.B. Perlen mit einer Größe von 200 μm oder weniger
(wobei Perlen mit 200 nm möglich
sind) verwendet werden können
und sehr kleine Fasern bekannt sind, ist es möglich, dass 40.000 bis 50.000
oder mehr (in manchen Fällen
1 Million) unterschiedliche Fasern und Perlen in einem 1 mm2 großen
optischen Faserbündel
vorliegen, wobei eine Dichte von mehr als 15.000.000 einzelnen Perlen
und Fasern (in einigen Fällen
sogar 25 bis 50 Millionen) pro 0,5 cm2 erhältlich ist.
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Mit "Feldverbund" oder "Kombinationsfeld" oder grammatikalischen
Entsprechungen davon wird hierin, wie oben dargelegt, eine Vielzahl
an einzelnen Feldern bezeichnet. Im Allgemeinen wird die Anzahl
der einzelnen Felder durch die Größe der verwendeten Mikrotiterplatte
bestimmt; folglich verwenden Mikrotiterplatten mit 96 Wells, 384
Wells und 1.536 Wells Feldverbünde,
die 96, 384 und 1.536 einzelne Felder umfassen, wobei, wie Fachleuten
klar sein wird, nicht jeder Mikrotiter-Well ein einzelnes Feld aufweisen
muss. Es wird angemerkt, dass die Feldverbünde einzelne Felder umfassen
können,
die gleich, ähnlich
oder unterschiedlich sind. Das bedeutet, dass es in manchen Ausführungsformen
erwünscht
sein kann, die gleichen 2.000 Tests auf 96 unterschiedlichen Proben
durchzuführen.
Alternativ dazu kann es erwünscht
sein, 192.000 Versuche auf der gleichen Probe (d.h. die gleiche
Probe in jedem der 96 Wells) durchzuführen. Alternativ dazu könnte jede
Reihe oder Spalte des Feldverbunds zur Redundanz- oder Qualitätskontrolle
gleich sein. Wie Fachleute verstehen werden, gibt es eine Vielzahl
an Wegen, das System zu konfigurieren. Darüber hinaus kann die statistische
Natur der Felder bedeuten, dass die gleiche Perlenpopulation zu
zwei unterschiedlichen Oberflächen zugesetzt
werden kann, was zu im Wesentlichen ähnlichen, jedoch mitunter nicht
identischen Feldern führt.
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Mit "Substrat" oder "fester Träger" oder anderen grammatikalischen
Entsprechungen wird hierin jedes beliebige Material bezeichnet,
das modifiziert werden kann, um einzelne diskrete Stellen zu enthalten,
die sich zur Bindung oder Assoziation von Perlen eignen, und welches
auf zumindest ein Detektionsverfahren anspricht. Für Fachleute
ist es klar, dass die Anzahl der möglichen Substrate sehr groß ist. Mögliche Substrate umfassen,
jedoch nicht ausschließlich,
Glas und modifiziertes oder funktionalisiertes Glas, Kunststoffe
(einschließlich
Acryle, Polystyrol und Copolymere von Styrol und anderen Materialien,
Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polyurethane, TeflonJ etc.),
Polysaccharide, Nylon oder Nitrocellulose, Harze, Silica oder Silica-basierte Materialien,
einschließlich
Silicium und modifiziertes Silicium, Kohlenstoff, Metalle, anorganisches Glas,
Kunststoffe, optische Faserbündel
und eine Reihe von anderen Polymeren. Im Allgemeinen ermöglichen die
Substrate die optische Detektion and fluoreszieren selber nicht
merklich.
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Im
Allgemeinen ist das Substrat flach (planar), wobei Fachleuten klar
ist, dass andere Anordnungen von Substraten ebenfalls verwendet
werden können.
Beispielsweise können
dreidimensionale Anordnungen verwendet werden, indem z.B. die Perlen
in einen porösen
Block aus Kunststoff eingebettet werden, der einen Probenzugang
zu den Perlen ermöglicht,
und zur Detektion ein Konfokalmikroskop verwendet wird. Auf ähnliche
Weise können
die Perlen zur Durchflussprobenanalyse auf die Innenoberfläche eines
Rohrs platziert werden, um das Probenvolumen zu minimieren. Bevor zugte
Substrate umfassen wie nachstehend erläutert optische Faserbündel und
flache planare Substrate, wie z.B. Glas, Polystyrol sowie andere
Kunststoffe und Acrylstoffe. In einigen Ausführungsformen werden Siliciumwafer-Substrate
nicht bevorzugt.
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Das
erste Substrat umfasst eine Oberfläche, die eine Vielzahl von
Testpositionen umfasst, und zwar jene Position, bei welcher der
Test zur Detektion eines Zielanalyten stattfindet. Die Testpositionen
sind im Allgemeinen physisch voneinander getrennt, z.B. als Test-Wells
in einer Mikrotiterplatte, wobei andere Anordnungen (Hydrophobie/Hydrophilie
etc.) zur Trennung der Testpositionen verwendet werden können.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das zweite Substrat, wie in den US-Anmeldungen mit der Seriennummer 08/944.850
und 08/519.062 sowie in PCT US98/05025 und PCT US98/09163 beschrieben, ein
optisches Faserbündel
oder ein Feld. Bevorzugte Ausführungsformen
verwenden vorgeformte einheitliche Glasfaser-Felder. Mit "vorgeformtem einheitlichem Faseroptik-Feld" wird hierin ein
Feld einzelner diskreter Faseroptik-Stränge bezeichnet, die koaxial
angeordnet und ihrer Länge
nach verbunden sind. Die Faserstränge sind im Allgemeinen einzeln
verkleidet. Was jedoch ein vorgeformtes einheitliches Feld von anderen
Faseroptik-Formaten unterschied, war die Tatsache, dass die Fasern
nicht einzeln physisch manipulierbar waren; und zwar kann ein Strang
an seiner Länge
entlang für
gewöhnlich
an keiner Stelle physisch von einem anderen Faserstrang getrennt
werden.
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In
einigen "Zweikomponenten"-Ausführungsformen
ist das zweite Substrat jedoch kein Faseroptik-Feld.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfassen die Testpositionen (des "Einkomponenten-Systems") oder die Feldpositionen
(des "Zweikomponenten-Systems") eine Vielzahl von
diskreten Stellen. Folglich ist die Testposition in ersterem Fall,
wie hierin beschrieben, die gleiche wie die Feldposition. In letzterem
Fall wird die Feldposition getrennt in die Testposition eingepasst.
In diesen Ausführungsformen
wird zumindest eine Oberfläche
des Substrats modifiziert, damit einzelne diskrete Stellen zur späteren Assoziation
von Mikrokügelchen (oder,
wenn keine Mikrokügelchen
verwendet werden, zur Bindung von bioaktiven Wirkstoffen) vorliegen.
Diese Stellen können
physisch veränderte
Stellen umfassen, und zwar physische Anordnungen, wie z.B. Wells oder
kleine Vertiefungen im Substrat, welche die Perlen so aufbewahren
können,
dass ein Mikrokügelchen
im Well zum Liegen kommt, oder die Verwendung von anderen Kräften (magnetische
Kräfte
oder Druckkräfte)
sowie chemisch veränderte
oder chemisch aktive Stellen umfassen, wie z.B. chemisch funktionalisierte
Stellen, elektrostatisch veränderte
Stellen, hydrophob oder hydrophil funktionalisierte Stellen, Haftmittelstellen
etc.
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Die
Stellen können
ein Muster sein, und zwar ein regelmäßiges Baumuster oder eine regelmäßige Anordnung
oder eine statistische Anordnung. Eine bevorzugte Ausführungsform
verwendet ein regelmäßiges Muster
von Stellen, und zwar so, dass die Stellen in einer XY-Koordinatenebene
angesprochen werden können.
Die Bezeichnung "Muster" umfasst in diesem
Sinne eine Grundeinheitszelle, vorzugsweise eine, die auf dem Substrat
Perlen mit hoher Dichte ermöglicht.
Es wird jedoch angemerkt, dass diese Stellen mitunter keine diskreten
Stellen sind. Das bedeutet, dass es möglich ist, eine einheitliche
Oberfläche
von haftenden oder chemischen Funktionalitäten zu verwenden, die z.B.
die Bindung von Perlen an jeder beliebigen Position ermöglicht;
und zwar wird die Substratoberfläche
modifiziert, um die Bindung von Mikrokügelchen an einzelnen Stellen
zu ermöglichen,
unabhängig
davon, ob diese Stellen an andere Stellen angrenzen oder nicht.
Folglich kann die Substratoberfläche
so modifiziert werden, dass diskrete Stellen ausgebildet werden,
die nur eine einzige assoziierte Perle enthalten, oder alternativ
dazu wird die Substratoberfläche
so modifiziert, dass die Perlen beliebig fallen, wobei sie jedoch
an den diskreten Stellen aufgefangen werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Substratoberfläche
modifiziert, damit Wells, nämlich Vertiefungen
in der Substratoberfläche,
vorliegen. Dies wird dadurch erreicht, indem, wie allgemein auf
dem Gebiet der Erfindung bekannt, eine Reihe von Verfahren, einschließlich, jedoch
nicht ausschließlich,
Photolithographie, Stanz verfahren, Formverfahren und Mikroätzverfahren
angewandt werden. Fachleuten ist klar, dass die verwendeten Verfahren
von der Anordnung und Form des Substrats abhängen. Wenn das erste Substrat
sowohl die Testpositionen als auch die einzelnen Felder umfasst,
wird in einem bevorzugten Verfahren ein Formverfahren herangezogen,
das die Perlen-Wells auf dem Boden der Test-Wells in einer Mikrotiterplatte ausbildet.
Auf ähnliche
Weise wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein formgepresstes
zweites Substrat verwendet, das "Finger" bzw. Projektionen
in einem Feldformat umfasst, wobei jeder der Finger Perlen-Wells umfasst.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden auf einer Substratoberfläche
zur Herstellung der Stellen physische Veränderungen vorgenommen. In einer
bevorzugten Ausführungsform
ist die Substratoberfläche,
wie in der US-Anmeldung Nr. 19970818199, die als Priorität für WO 98/50782
dient, allgemein beschrieben, ein terminales Ende des Faserbündels, wenn
beispielsweise das zweite Substrat ein optisches Faserbündel ist.
In dieser Ausführungsform
werden an einem endständigen
oder distalen Ende des optischen Faserbündels, das einzelne Fasern
umfasst, Wells erstellt. In dieser Ausführungsform werden die Kerne
der einzelnen Fasern unter Rücksichtnahme
auf die Verkleidung geätzt,
sodass an einem Ende der Fasern kleine Wells oder Vertiefungen entstehen.
Die erforderliche Tiefe der Wells hängt von der Größe der den
Wells zuzusetzenden Perlen ab.
-
In
dieser Ausführungsform
sind die Mikrokügelchen
in den Wells im Allgemeinen nichtkovalent assoziiert, obwohl die
Wells, wie nachstehend allgemein beschrieben, zusätzlich chemisch
funktionalisiert sein können,
Vernetzer eingesetzt werden können
oder eine physische Barriere, nämlich
ein Film oder eine Membran über
den Perlen, verwendet werden kann.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Substratoberfläche
modifiziert, um modifizierte Stellen aufzuweisen, insbesondere chemisch
modifizierte Stellen, die dazu verwendet werden können, die
erfindungsgemäßen Mikrokügelchen
an die diskreten Stellen oder Positionen auf dem Substrat entweder
kovalent oder nichtkovalent zu binden. Der Ausdruck "chemisch modifizierte
Stellen" umfasst
in diesem Zusam menhang, jedoch nicht ausschließlich, die Zugabe einer Struktur
aus chemischen funktionellen Gruppen, einschließlich Aminogruppen, Carboxygruppen,
Oxogruppen und Thiolgruppen, die dazu verwendet werden können, die
Mikrokügelchen
kovalent anzubinden, die im Allgemeinen auch entsprechende reaktive
funktionelle Gruppen aufweisen; das Hinzufügen einer Haftmittelstruktur,
die dazu verwendet werden kann, die Mikrokügelchen (entweder durch vorherige
chemische Funktionalisierung zur Zugabe des Haftmittels oder durch
direkte Zugabe des Haftmittels) zu binden; das Hinzufügen einer
Struktur aus geladenen Gruppen (ähnlich
den chemischen Funktionalitäten)
zur elektrostatischen Bindung der Mikrokügelchen, nämlich wenn die Mikrokügelchen
geladene Gruppen aufweisen, die den Stellen gegenüber liegen;
das Hinzufügen
einer Struktur von chemischen funktionellen Gruppen, die die Stellen
differentiell hydrophob oder hydrophil machen, sodass die Zugabe
von ähnlich
hydrophoben oder hydrophilen Mikrokügelchen unter geeigneten Versuchsbedingungen
basierend auf Wasseraffinität
zur Assoziation der Mikrokügelchen
an die Stellen führt.
Die Verwendung von hydrophoben Stellen mit hydrophoben Perlen in
einem wässrigen
System ergibt beispielsweise, dass die Bindung der Perlen vorzugsweise
an die Stellen geführt
wird.
-
Zudem
können
zur Bindung der Perlen an das Substrat biologisch modifizierte Stellen
verwendet werden. Beispielsweise können hierin allgemein beschriebene
Bindungsligandenpaare eingesetzt werden; dabei liegt ein Partner
auf der Perle und der auf dem Substrat vor. Insbesondere bevorzugt
werden in dieser Ausführungsform
komplementäre
Nucleinsäurestränge und
Antigen/Antikörper-Paare.
-
Darüber hinaus
ermöglicht
diese Art der Verwendung von biologischen Gruppierungen auch die
Bildung von Feldverbünden.
Dies entspricht dem in 1F dargestellten System, mit
der Ausnahme, dass das Substrat 10 fehlt. In dieser Ausführungsform
umfassen Perlen-Populationen einen einzigen Bindungspartner, und
Unterpopulationen dieser Population weisen unterschiedliche bioaktive
Wirkstoffe auf. Indem unterschiedliche Populationen mit unterschiedlichen
Bindungspartnern und ein Substrat, das unterschiedliche Test- oder Feldpositionen
mit räumlich
getrennten Bindungspartnern aufweist, verwendet werden, kann ein
Feldverbund erzielt werden. In dieser Ausführungsform kommt es auch zu
Wiederverwendungen von Codes, wie nachstehend allgemein beschrieben,
da jedes einzelne Feld des Feldverbundes die gleichen Codes verwenden
kann.
-
Wie
oben erläutert,
umfasst der Ausdruck "Muster" in diesem Zusammenhang
die Verwendung einer einheitlichen Behandlung der Oberfläche, um
die Bindung von Perlen an diskrete Stellen sowie die Behandlung
der Oberfläche
zu ermöglichen,
was zu diskreten Stellen führt.
Fachleuten ist klar, dass dies auf verschiedene Arten durchgeführt werden
kann.
-
Fachleuten
ist klar, dass es eine Anzahl an möglichen Systemanordnungen gibt,
wie allgemein in den Figuren dargestellt. Zusätzlich zu den hierin beschriebenen
Standardformaten kann eine Reihe von anderen Formaten verwendet
werden. Beispielsweise können,
wie in den 1C bis 1F dargestellt, "Teile" von Substraten verwendet
werden, die nicht miteinander verbunden sind. Diese können wiederum
die gleichen oder unterschiedliche Felder umfassen. Diese Teile
können
einzeln oder als große
Einheit auf einem einzigen Substrat erstellt werden, wonach das
Substrat geschnitten oder in unterschiedliche einzelne Substrate
geteilt wird. Die 1C und 1D beispielsweise
stellen somit eine Vielzahl von Perlen-Feldern dar, die zu den Wells
des zweiten Substrats zugesetzt werden; 1C stellt
eine "Perle aus
Perlen" dar, die
zur Maximierung der Vermischung angeordnet ist. 1D verwendet
eine Vielzahl von planaren ersten Substraten; Fachleuten ist klar,
dass diese an das zweite Substrat gebunden oder nicht gebunden sein
können.
In einer Ausführungsform
wird kein bestimmtes Bindungsverfahren angewandt; alternativ dazu
wird eine Reihe von Bindungsverfahren eingesetzt. Wie beispielsweise
zur Bindung von Perlen an Substrate dargelegt, können kovalente oder nichtkovalente
Kräfte
eingesetzt werden, einschließlich
Haftmittel, Chemie, hydrophobe/hydrophile Wechselwirkungen etc.
Zudem kann das Substrat magnetisch sein und auch magnetisch an der
Stelle gehalten (und optional gemischt) werden. Folglich können, wie
in 1F dargestellt, beispielsweise Bindungsgruppierungen verwendet
werden; diese können
kovalente oder nichtkovalente Bindungen umfassen. Sie können einfach
nur zur Bindung oder zum Targeting der ersten Substratfelder auf
bestimmte Positionen im oder auf dem zweiten Substrat verwendet
werden. Somit können
beispielsweise verschiedene Oligonucleotide zum Targeting auf und
Binden des ersten Substrats an das zweite verwendet werden.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Substrat zur Bilderzeugung mit optischen Eigenschaften versehen.
Folglich kann das Substrat beispielsweise über "Linsen"-Eigenschaften, entweder in einem Einkomponenten-
oder Zweikomponentensystem, verfügen.
Beispielsweise kann in einem Einkomponentensystem der Boden einer
oder mehrerer Testpositionen mit einmaligen oder speziellen optischen
Komponenten, wie z.B. Linsen, Filter etc., versehen sein.
-
Darüber hinaus
verwenden bevorzugte Ausführungsformen
Anordnungen, die das Vermischen der Testreaktion erleichtern.
-
Beispielsweise
verwenden bevorzugte Ausführungsformen
Zweikomponentensysteme, die das Vermischen ermöglichen. Das bedeutet, dass
in manchen Ausführungsformen
die Felder aus dem Block hervorstehen und als "Stäbe" zum Rühren der
Reaktion verwendet werden können,
um ein gutes Vermischen der Testkomponenten zu erleichtern, die
Kinetik der Reaktion zu erhöhen
etc. Fachleuten ist klar, dass dies auf verschiedene Arten vorgenommen
werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die ersten
und zweiten Substrate so angeordnet, dass diese in Bezug zueinander
bewegt werden können,
entweder in einer X-Y-Koordinatenebene, einer X-Z-Koordinatenebene,
einer Y-Z-Koordinatenebene oder in drei Dimensionen (X-Y-Z). In
bevorzugten Ausführungsformen
wird eine Blockhaltevorrichtung verwendet, die es ermöglicht,
den Block entweder in der Ebene der Platte oder im rechten Winkel
dazu frei zu bewegen. Dies ist insbesondere nützlich, wenn die Reaktionsvolumina
gering sind, da Standardmischungsbedingungen in solchen Situationen häufig nicht
gut funktionieren.
-
Zusätzlich dazu
oder stattdessen können
zusätzliche
Mischkomponenten als Teil des Systems vorliegen. Beispielsweise
können
exogene Mischteilchen zugesetzt werden; in einer Ausführungsform
werden beispielsweise magnetische Teilchen ver wendet, die über einen
Magneten verfügen,
der bewegt wird, um das Vermischen zu bewirken; es können beispielsweise
kleine magnetische Mischstäbe
und magnetische Rührplatten
eingesetzt werden.
-
Alternativ
dazu kann das Vermischen in Einkomponenten- oder Zweikomponentensystemen
durch Versiegelung des Systems und anschließendes Schütteln unter Verwendung von
Standardverfahren, gegebenenfalls unter Verwendung von Mischteilchen,
erzielt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfassen die erfindungsgemäßen Anordnungen
eine Population von Mikrokügelchen.
Mit "Population" wird hierin, wie
oben für
die Felder dargelegt, eine Vielzahl von Perlen bezeichnet. Innerhalb
der Population liegen getrennte Unterpopulationen vor, die ein einziges
Mikrokügelchen
oder mehrere idente Mikrokügelchen
umfassen können.
Das bedeutet, dass, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, im Feld
für jeden
Wirkstoff nur eine einzige Perle vorliegt; in bevorzugten Ausführungsformen
wird eine Vielzahl von Perlen von jedem dieser Typen verwendet.
-
Mit "Mikrokügelchen" oder "Perlen" oder "Teilchen" oder grammatikalischen
Entsprechungen werden hierin kleine diskrete Teilchen bezeichnet.
Die Anordnung der Perlen ändert
sich je nach Wirkstoffklasse und Syntheseverfahren. Geeignete Perlenzusammensetzungen
umfassen jene, die zur Synthese von Peptiden, Nucleinsäuren und
organischen Gruppierungen verwendet werden, einschließlich, jedoch
nicht ausschließlich, Kunststoffe,
Keramiken, Glas, Polystyrol, Methylstyrol, Acrylpolymere, paramagnetische
Materialien, Thoriumdioxidsol, Kohlenstoffgraphit, Titandioxid,
Latex oder vernetzte Dextrane, wie z.B. Sepharose, Cellulose, Nylon,
vernetzte Mizellen und Teflon. "Microsphere
Detection Guide" von
Bangs Laboratories, Fishers, IN, dient hierbei als nützliches
Nachschlagewerk.
-
Die
Perlen müssen
nicht kugelförmig
sein. Es können
auch unregelmäßige Teilchen
verwendet werden. Außerdem
können
die Perlen porös
sein, wodurch die Oberfläche
der Perle, die entweder zur Bindung von bioaktiven Wirkstoffen oder
zur IBL- Bindung
verfügbar
ist, erhöht
wird. Die Perlengrößen reichen
vom Nanometerbereich, nämlich
100 nm, bis zum Millimeterbereich, d.h. 1 mm, wobei Perlen mit etwa
0,2 μm bis
etwa 200 μm
bevorzugt und Perlen mit etwa 0,5 μm bis etwa 5 μm insbesondere
bevorzugt werden, wobei jedoch in manchen Ausführungsformen kleinere Perlen
verwendet werden können.
-
Es
wird angemerkt, dass eine Hauptkomponente der Erfindung die Verwendung
einer Substrat/Perlen-Paarung darstellt, die die Assoziation oder
Bindung der Perlen an diskrete Stellen auf der Substratoberfläche so ermöglicht,
dass sich die Perlen während
des Tests nicht bewegen.
-
Jedes
Mikrokügelchen
umfasst einen bioaktiven Wirkstoff, wobei es auch, wie Fachleuten
klar ist, je nach Syntheseverfahren einige Mikrokügelchen
gibt, die keinen bioaktiven Wirkstoff enthalten. Mit "Kandidatwirkstoffen" oder "bioaktiven Wirkstoffen" oder "chemischer Funktionalität" oder "Bindungsligand" wird hierin jedes
beliebige Molekül
bezeichnet, z.B. Proteine, Oligopeptide, kleine organische Moleküle, Koordinationskomplexe,
Polysaccharide, Polynucleotide etc., die an erfindungsgemäße Mikrokügelchen
gebunden werden können.
Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zwei
Hauptverwendungen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform
werden, wie nachstehend genauer beschrieben, die Zusammensetzungen
zur Detektion der Gegenwart eines bestimmten Zielanalyten verwendet;
beispielsweise zur Detektion der Gegenwart oder der Abwesenheit
einer bestimmten Nucleotidsequenz eines bestimmten Proteins, wie
z.B. eines Enzyms, eines Antikörpers
oder eines Antigens. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform
werden die Zusammensetzungen zum Screenen von bioaktiven Wirkstoffen,
d.h. Arzneimittelkandidaten, zum Binden an einen bestimmten Zielanalyten
verwendet.
-
Bioaktive
Wirkstoffe umfassen unzählige
chemische Klassen, wobei sie üblicherweise
organische Moleküle,
vorzugsweise kleine organische Verbindungen, sind, die ein Molekulargewicht
von mehr als 100 und weniger als etwa 2.500 Dalton aufweisen.
-
Bioaktive
Wirkstoffe umfassen funktionelle Gruppen, die für die strukturelle Wechselwirkung
mit Proteinen, insbesondere zur Wasserstoffbrückenbindung, erforderlich sind,
und weisen üblicherweise
zumindest eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe auf,
vorzugsweise zumindest zwei der funktionellen chemischen Gruppen.
Die bioaktiven Wirkstoffe umfassen häufig zyklische Kohlenstoffstrukturen
oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische
Strukturen, die mit einer oder mehreren der obigen funktionellen
Gruppen substituiert sind. Bioaktive Wirkstoffe finden sich unter
auch Biomolekülen,
einschließlich
Peptiden, Nucleinsäuren,
Sacchariden, Fettsäuren,
Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, Strukturanaloga oder
Kombinationen davon. Insbesondere bevorzugt sind Nucleinsäuren und
Proteine.
-
Bioaktive
Wirkstoffe können
aus einer Vielzahl von verschiedenen Quellen erhalten werden, einschließlich Sammlungen
von synthetischen oder natürlichen
Verbindungen. Beispielsweise gibt es unzählige Verfahren für Zufallssynthesen
oder gerichtete Synthesen einer breiten Vielzahl von organischen
Verbindungen und Biomolekülen,
einschließlich
Expression von randomisierten Oligonucleotiden. Alternativ dazu
sind Bibliotheken von natürlichen
Verbindungen in Form von bakteriellen und pilzartigen Extrakten
sowie Pflanzen- und Tierextrakten verfügbar oder leicht herzustellen.
Darüber
hinaus können
natürliche
oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen mittels
herkömmlicher
chemischer, physikalischer oder biochemischer Verfahren leicht modifiziert
werden. Bekannte pharmakologische Wirkstoffe können gerichteten oder zufälligen chemischen
Modifizierungen wie z.B. Acylierungen, Alkylierungen, Veresterungen
und/oder Amidierungen unterzogen werden, um Strukturanaloga herzustellen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die bioaktiven Wirkstoffe Proteine. Mit "Protein" werden hierin zumindest zwei kovalent
gebundene Aminosäuren
bezeichnet, die Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide
umfassen. Das Protein kann aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und
Peptidbindungen oder synthetischen peptidomimetischen Strukturen
bestehen. Folglich sind hierin unter "Aminosäure" oder "Peptidrest" sowohl natürlich vorkommende als auch
synthetische Ami nosäuren
zu verstehen. Beispielsweise werden Homophenylalanin, Citrullin
und Norleucin für
den Zeck der Erfindung als Aminosäuren angesehen. Die Seitenketten
können
entweder in (R)- oder in (S)-Konfiguration vorliegen. In einer bevorzugten
Ausführungsform
liegen die Aminosäuren
in (S)-Konfiguration oder in L-Konfiguration vor. Wenn nicht natürlich vorkommende
Seitenketten verwendet werden, können
Nichtaminosäure-Substituenten
eingesetzt werden, um beispielsweise In-vivo-Abbau zu verhindern
oder zu verlangsamen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die bioaktiven Wirkstoffe natürlich vorkommende Proteine oder
Fragmente natürlich
vorkommender Proteine. Folglich können beispielsweise proteinhältige zelluläre Extrakte
oder Zufallsverdaue oder gerichtete Verdaue von proteinhältigen zellulären Extrakten
verwendet werden. Auf diese Weise können Bibliotheken prokaryotischer
und eukaryotischer Proteine zum Screenen in den hierin beschriebenen
Systemen erstellt werden. Insbesondere bevorzugt werden in dieser
Ausführungsform Bibliotheken
von bakteriellen, pilzlichen, viralen Proteinen und Säugetierproteinen,
wobei die letzteren bevorzugt und menschliche Proteine insbesondere
bevorzugt sind.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die bioaktiven Wirkstoffe Peptide mit etwa 5 bis etwa 30 Aminosäuren, wobei
etwa 5 bis etwa 20 Aminosäuren
bevorzugt und etwa 7 bis etwa 15 Aminosäuren insbesondere bevorzugt
sind. Die Peptide können,
wie oben dargelegt, Verdaue von natürlich vorkommenden Proteinen,
Zufallspeptiden, oder "einseitigen" Zufallspeptiden
sein. Unter "randomisiert" oder grammatikalischen Entsprechungen
davon wird hierin verstanden, dass jede Nucleinsäure und jedes Peptid im Wesentlichen
aus Zufallsnucleotiden bzw. Zufallsaminosäuren besteht. Da diese Zufallspeptide
(oder, wie nachstehend erläutert, -Nucleinsäuren) chemisch
synthetisiert werden, können
sie an jeder Position jedes beliebige Nucleotid oder jede beliebige
Aminosäure
inkorporieren. Das Syntheseverfahren kann darauf abzielen, randomisierte
Proteine oder Nucleinsäuren
zu bilden, um über
die Sequenzlänge
die Bildung aller oder der meisten möglichen Kombinationen zu ermöglichen,
wodurch eine Bibliothek von randomisierten proteinhältigen Wirkstoffen
ausgebildet wird.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine Bibliothek von bioaktiven Wirkstoffen eingesetzt. Die Bibliothek
sollte eine ausreichend strukturell vielfältige Population von bioaktiven
Wirkstoffen bereitstellen, um eine probabilistisch zufrieden stellende
Anzahl an Bindungen an Zielanalyten zu bewirken. Folglich muss eine Wechselwirkungs-Bibliothek
groß genug
sein, damit zumindest eines ihrer Elemente eine Struktur aufweist,
die dem Element eine Affinität
zum Zielanalyten verleiht. Obwohl die Beurteilung der erforderlichen
absoluten Größe einer
Wechselwirkungs-Bibliothek schwierig ist, stellt die Natur anhand
der Immunantwort einen Hinweis bereit: eine Diversität von 107 bis 108 unterschiedlichen
Antikörpern
stellt zumindest eine Kombination bereit, die über eine ausreichende Affinität zur Wechselwirkung
mit den wirksamsten Antigenen verfügt, denen ein Organismus ausgesetzt
ist. Veröffentlichte
Invitro-Auswahlverfahren haben ebenfalls gezeigt, dass eine Bibliotheksgröße von 107 bis 108 ausreicht,
um Strukturen mit einer Affinität
zum Target zu finden. Folglich werden in einer bevorzugten Ausführungsform
bei den vorliegenden Verfahren zumindest 106,
vorzugsweise zumindest 107, noch bevorzugter
zumindest 108, insbesondere zumindest 109, unterschiedliche bioaktive Wirkstoffe gleichzeitig
analysiert. Bei bevorzugten Verfahren kommt es zu einer Maximierung
der Bibliotheksgröße und -diversität.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Sammlung vollständig
randomisiert, wobei an keiner Position Sequenzpräferenzen oder -konstanten vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Sammlung "einseitig". Das bedeutet, dass
einige Positionen innerhalb der Sequenz entweder konstant gehalten
werden oder aus einer eingeschränkten
Anzahl an Möglichkeiten
ausgewählt
werden. Beispielsweise werden in einer bevorzugten Ausführungsform
die Nucleotide oder Aminosäurereste
innerhalb einer definierten Klasse von z.B. hydrophoben Aminosäuren, hydrophilen
Resten, sterisch beeinflussten (entweder kleinen oder großen) Resten,
zur Bildung von Cysteinen, zum Vernetzen, Proline für SH-3-Domänen, Serine,
Threonine, Tyrosine oder Histidine für Phosphorlierungsstellen etc.
oder an Purine etc. randomisiert.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die bioaktiven Wirkstoffe Nucleinsäuren (allgemein als "DNA-Sonde" oder hierin als "Kandidatensonde" bezeichnet). Unter "Nucleinsäure" oder "Oligonucleotid" oder grammatikalischen
Entsprechungen davon werden hierin zumindest zwei kovalent aneinander
gebundene Nucleotide verstanden. Eine erfindungsgemäße Nucleinsäure weist
im Allgemeinen Phosphodiesterbindungen auf, wobei in manchen Fällen, wie
nachstehend erläutert,
Nucleinsäureanaloga
umfasst sind, die alternierende Hauptketten aufweisen können und
beispielsweise Folgendes umfassen: Phosphoramid (Beaucage et al.,
Tetrahedron 49(10), 1925 (1993), und Verweise darin; Letsinger,
J. Org. Chem. 35, 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem.
81, 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14, 3487 (1986);
Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem.
Soc. 110, 4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta 26, 141 (1986)),
Thiophosphat (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19, 1437 (1991); und
das US-Patent Nr. 5.644.048), Dithiophosphat (Briu et al., J. Am.
Chem. Soc. 111, 2321 (1989)), O-Methylphosphoramiditbindungen
(siehe Eckstein, Oligonucleotide und Analoga: A Practical Approach,
Oxford University Press) und Peptidnucleinsäurehauptketten und -bindungen
(siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992); Meier et al.,
Chem. Int. Ed. Engl. 31, 1008 (1992); Nielsen, Nature 365, 566 (1993);
Carlsson et al., Nature 380, 207 (1996), wobei alle hierin durch
Verweis aufgenommen sind). Andere analoge Nucleinsäuren umfassen
jene mit positiven Hauptketten (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92, 6097 (1995)); nichtionische Hauptketten (US-Patente Nr. 5.386.023;
5.637.684; 5.602.240; 5.216.141; und 4.469.863; Kiedrowshi et al.,
Angew. Chem. Intl. Ed. English 30, 423 (1991); Letsinger et al.,
J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleosides & Nucleotides 13,
1597 (1994); Kapitel 2 und 3 aus der ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications
in Antisene Research",
hrsg. von Y.S. Sanghui und P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem.
Lett. 4, 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34, 17 (1994);
Tetrahedron Lett. 37, 743 (1996)) und Nichtribose-Hauptketten, einschließlich jener,
die in den US-Patenten Nr. 5.235.033 und 5.034.506 und den Kapitel
6 und 7 aus der ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisene
Research", hrsg.
von Y.S. Sanghui und P. Dan Cook, beschrieben sind. Nucleinsäuren, die
einen oder mehrere carbozyklische Zucker aufweisen, fallen eben falls
in die Definition der Nucleinsäuren
(siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., S. 169–176 (1995)). Mehrere Nucleinsäureanaloga
sind in Rawls, C & E
News, 2. Juni 1997, S. 35, beschrieben. Diese Modifizierungen der
Ribose-Phosphat-Hauptkette können
stattfinden, um das Hinzufügen von
zusätzlichen
Gruppierungen, wie z.B. Markierungen, zu erleichtern oder die Stabilität und die
Halbwertszeit solcher Moleküle
in physiologischen Umgebungen zu erhöhen; beispielsweise wird PNA
insbesondere bevorzugt. Darüber
hinaus können
Gemische aus natürlich
vorkommenden Nucleinsäuren
und Analoga erstellt werden.
-
Alternativ
dazu können
Gemische aus unterschiedlichen Nucleinsäureanaloga und Gemische aus
natürlich
vorkommenden Nucleinsäuren
und Analoga erstellt werden. Die Nucleinsäuren können wie angeführt einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein oder Abschnitte von sowohl einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Sequenzen
enthalten. Die Nucleinsäure
kann eine DNA, sowohl eine genomische DNA als auch eine cDNA, RNA
oder ein Hybrid sein, worin die Nucleinsäure jede beliebige Kombination
von Desoxyribo- und Ribonucleotiden und jede beliebige Kombination
aus Basen, einschließlich
Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Inosin, Xanthanin, Hypoxanthanin,
Isocytosin, Isoguanin und Basenanaloga, wie z.B. Nitropyrrol und
Nitroindol etc., umfassen kann.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die bioaktiven Wirkstoffe Bibliotheken von klonalen Nucleinsäuren, einschließlich DNA
und RNA. In dieser Ausführungsform
werden einzelne Nucleinsäuren
hergestellt, indem im Allgemeinen herkömmliche Verfahren (einschließlich, jedoch
nicht ausschließlich,
Vermehrung in Plasmid- oder
Phagenvektoren, Amplifikationsverfahren einschließlich PCR
etc.) angewandt werden. Die Nucleinsäuren werden vorzugsweise in
irgendeinem Format, wie z.B. in einem Mikrotiterplattenformat, angeordnet,
und Perlen werden zur Bindung der Bibliotheken zugesetzt.
-
Die
Bindung der klonalen Bibliotheken (oder jede der hierin dargelegten
Nucleinsäuren)
kann, wie Fachleuten klar ist, auf verschiedene Weisen erfolgen,
einschließlich,
jedoch nicht ausschließlich,
mittels chemischen Einfangens oder Affinitätseinfangens (z.B. einschließlich Inkorporation
derivatisierter Nucleotide, wie z.B. AminoLink, oder biotinylierte
Nucleotide, die anschließend
zur Bindung von Nucleinsäuren
an eine Oberfläche
verwendet werden können,
sowie Affinitätseinfangen
mittels Hybridisierung), Vernetzung und elektrostatischer Bindung
etc.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Affinitätseinfangverfahren
zur Bindung von klonalen Nucleinsäuren an die Perlen verwendet.
Beispielsweise können
klonierte Nucleinsäuren
z.B. mit einem Element eines Bindungspaares und die Perlen mit einem
anderen Element des Bindungspaares derivatisiert werden. Geeignete
Bindungspaare sind wie hierin für
IBL/DBL-Paare beschrieben. Beispielsweise können die klonierten Nucleinsäuren biotinyliert
sein (z.B. unter Verwendung enzymatischer Inkorporation von biotinylierten Nucleotiden
für das
fotoaktivierte Vernetzen von Biotin). Biotinylierte Nucleinsäuren können dann,
wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, mit Streptavidin beschichteten
Perlen eingefangen werden. Ähnlich
können
andere Hapten/Rezeptor-Kombinationen, wie z.B. Digoxigenin- und
Anti-Digoxigenin-Antikörper, verwendet
werden. Alternativ dazu können
chemische Gruppen in Form von derivatisierten Nucleotiden zugesetzt
werden, die sodann zum Hinzufügen
der Nucleinsäure
zur Oberfläche
verwendet werden können.
-
Bevorzugte
Bindungen sind kovalent, wobei jedoch relativ schwache Wechselwirkungen
(d.h. nichtkovalent) ausreichen können, um eine Nucleinsäure an eine
Oberfläche
zu binden, wenn es für
jede der Nucleinsäuren
mehrfache Stellen zur Bindung gibt. Somit können beispielsweise elektrostatische
Wechselwirkungen zur Bindung verwendet werden, indem z.B. Perlen
die zum bioaktiven Wirkstoff entgegengesetzte Ladung aufweisen.
-
Ähnlich kann
das Affinitätseinfangverfahren
unter Verwendung von Hybridisierung dazu verwendet werden, klonierte
Nucleinsäuren
an Perlen zu binden. Beispielsweise wird, wie auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt, polyA+RNA gewöhnlich
mittels Hybridisierung von den oligo-dT-Perlen eingefangen; dies
kann ein oligo-dT-Einfangen,
gefolgt von einer Vernetzung, wie z.B. Psoralen-Vernetzung, umfassen.
Wenn die Nucleinsäuren
von Interesse keinen polyA–Trakt
aufweisen, kann einer mittels Polymerisation mit terminaler Transferase
oder durch Ligation eines oligoA-Linkers
gebunden werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
-
Alternativ
dazu kann eine chemische Vernetzung durchgeführt werden, beispielsweise,
wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, mittels fotoaktiviertem
Vernetzen von Thymidin mit reaktiven Gruppen.
-
Im
Allgemeinen werden zur Dekodierung von klonalen Feldern, wie nachstehend
ausführlicher
beschrieben wird, spezielle Verfahren erfordert.
-
Wie
oben allgemein für
Proteine beschrieben, können
Wirkstoffe natürlich
vorkommende Nucleinsäuren,
statische Nucleinsäuren
oder "einseitige" statistische Nucleinsäuren sein.
Beispielsweise können,
wie oben für
Proteine angeführt,
Verdaue prokaryotischer oder eukaryotischer Genome verwendet werden.
-
Im
Allgemeinen sind Sonden der vorliegenden Erfindung so konstruiert,
dass sie zu einer Zielsequenz komplementär sind (entweder der Zielanalytensequenz
der Probe oder zu anderen Sondensequenzen, wie hierin beschrieben),
sodass es zu einer Hybridisierung des Ziels und der Sonden der vorliegenden
Erfindung kommt. Dies muss hinsichtlich Komplementarität nicht
perfekt sein; es kann zu beliebig vielen Basenfehlpaarungen kommen,
die die Hybridisierung zwischen Zielsequenz und den einzelsträngigen Nucleinsäuren der vorliegenden
Erfindung stören.
Wenn die Anzahl an Mutationen jedoch so groß ist, dass unter sogar geringst stringenten
Hybridisierungsbedingungen keine Hybridisierungen stattfinden, ist
die Sequenz keine komplementäre
Zielsequenz. Somit wird hierin unter "im Wesentlichen komplementär" verstanden, dass
die Sonden ausreichend komplementär zu den Zielsequenzen sind,
um unter den ausgewählten
Reaktionsbedingungen zu hybridisieren. Hohe Stringenzbedingungen
sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt; siehe z.B. Maniatis et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989),
und Short Protocols in Molecular Biology, hrsg. von Ausubel et al.,
die beide hierin durch Verweis aufgenommen sind. Stringente Bedingungen
sind sequenzabhängig
und unterscheiden sich bei unterschiedlichen Bedingungen. Längere Sequenzen
hybridisieren ins besondere bei höheren
Temperaturen. Eine ausführliche
Anleitung zur Hybridisierung von Nucleinsäuren findet sich in Tijssen,
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with
Nucleic Acid Probes, "Overview
of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid
assays" (1993).
Im Allgemeinen werden die stringenten Bedingungen so ausgewählt, dass
sie etwa 5 bis 10 °C
unter dem Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische
Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH
liegen. Der Tm ist jene Temperatur (bei
definierter Ionenstärke,
definiertem pH und Nucleinsäurekonzentration),
bei der 50 % der Sonden, die zum Ziel komplementär sind, an die Zielsequenz
im Gleichgewicht hybridisieren (da die Zielsequenzen im Überschuss
vorliegen, sind bei der Tm 50 % der Sonden
bei Gleichgewicht besetzt). Stringente Bedingungen sind jene, worin
die Salzkonzentration weniger als etwa 1,0 M Natriumion beträgt, üblicherweise
eine Natriumionenkonzentration (oder andere Salze) von etwa 0,01
bis 1,0 M bei einem pH von 7,0 bis 8,3 aufweist, wobei die Temperatur
für kurze
Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) zumindest etwa 30 °C und für lange
Sonden (z.B. länger
als 50 Nucleotide) zumindest etwa 60 °C beträgt. Stringente Bedingungen
können
auch durch Zugabe von Destabilisatoren, wie z.B. Formamid, erzielt
werden. In einer anderen Ausführungsform
werden weniger stringente Hybridisierungsbedingungen verwendet;
beispielsweise können
wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt mäßig oder gering stringente
Bedingungen ausgewählt
werden; siehe Maniatis und Ausubel, oben, und Tijssen, oben.
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Mit "Zielsequenz" oder grammatikalischen
Entsprechungen davon wird hierin eine Nucleinsäuresequenz auf einer einzelsträngigen Nucleinsäure bezeichnet.
Die Zielsequenz kann ein Abschnitt eines Gens, eine Regulationssequenz,
eine genomische DNA, eine cDNA, eine RNA, einschließlich mRNA
und rRNA, sowie andere umfassen. Diese kann jede beliebige Länge aufweisen,
wobei klar ist, dass längere
Sequenzen spezifischer sind. Für
Fachleute versteht es sich, dass die komplementäre Zielsequenz jede beliebige
Form aufweisen kann. Beispielsweise kann diese unter anderem in
einer größeren Nucleinsäuresequenz,
d.h. vollständig
oder als Teil eines Gens oder einer mRNA, einem Restriktionsfragment
eines Plasmids oder einer genomischen DNA enthalten sein. Wie nachstehend
ausführlicher
beschrieben wird, werden Sonden zur Hybridisierung an Zielsequenzen
hergestellt, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Zielsequenzen
in einer Probe festzustellen. Allgemein gesagt verstehen Fachleute,
was mit dieser Bezeichnung gemeint ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfassen die bioaktiven Wirkstoffe organisch-chemische Gruppierungen,
wovon eine breite Vielfalt in der Literatur besprochen ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst jede der Perlen einen einzigen Wirkstofftyp, obwohl vorzugsweise
eine Vielzahl von einzelnen bioaktiven Wirkstoffen an jede der Perlen
gebunden ist. Ähnlich
wird in bevorzugten Ausführungsformen
mehr als ein Mikrokügelchen
verwendet, das einen einmaligen bioaktiven Wirkstoff enthält; dies
bedeutet, dass in das System unter Verwendung von Mikrokügelchen-Unterpopulationen
Redundanzen eingeführt
sind, wobei jedes der Mikrokügelchen
in der Unterpopulation den gleichen bioaktiven Wirkstoff aufweist.
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Fachleuten
ist klar, dass die bioaktiven Wirkstoffe entweder direkt auf den
Perlen synthetisiert werden können
oder hergestellt und nach der Synthese gebunden werden können. In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden zur Bindung der bioaktiven Wirkstoffe an die Perlen Linker
verwendet, um sowohl eine gute Bindung als auch eine ausreichende
Flexibilität
für eine
gute Wechselwirkung mit dem Zielmolekül zu ermöglichen und unerwünschte Bindungsreaktionen
zu verhindern.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die bioaktiven Wirkstoffe direkt auf den Perlen synthetisiert.
Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, werden gegenwärtig viele
chemische Verbindungsklassen, wie z.B. Peptide, organische Gruppierungen
und Nucleinsäuren,
auf festen Trägern
einschließlich
Perlen synthetisiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die bioaktiven Wirkstoffe zuerst synthetisiert und anschließend kovalent
an die Perlen gebunden. Fachleuten ist klar, dass dies je nach Zusammensetzung
der bioaktiven Wirkstoffe und der Perlen erfolgt. Die Funktionalisierung
der festen Trägeroberflächen, wie
z.B. bestimmter Po lymere, mit chemisch reaktiven Gruppen, wie z.B.
Thiolen, Aminen, Carboxylen etc., ist auf dem Gebiet der Erfindung
allgemein bekannt. Folglich können "leere" Mikrokügelchen
verwendet werden, die über eine
Oberflächenchemie
verfügen,
welche die Bindung der vom Verwender gewünschten Funktionalitäten erleichtert.
Einige Beispiele für
eine solche Oberflächenchemie
bei leeren Mikrokügelchen
umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Aminogruppen, einschließlich aliphatischer
und aromatischer Amine, Carbonsäuren,
Aldehyde, Amide, Chlormethylgruppen, Hydrazid, Hydroxylgruppen,
Sulfonate und Sulfate.
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Diese
funktionellen Gruppen können
dazu verwendet werden, zu den Perlen jede beliebige Anzahl an unterschiedlichen
Kandidatenstoffen hinzuzufügen,
wobei im Allgemeinen bekannte Chemien verwendet werden. Beispielsweise
können
kohlenhydrathältige
Kandidatenstoffe an einen aminofunktionalisierten Träger gebunden
werden, wobei der Aldehyd des Kohlenhydrats anhand von Standardverfahren
hergestellt wird, wonach der Aldehyd mit einer Aminogruppe auf der
Oberfläche
umgesetzt wird. In einer alternativen Ausführungsform kann ein Sulfhydryl-Linker
verwendet werden. Auf dem Gebiet der Erfindung sind eine Reihe von reaktiven
Sulfhydryl-Linkern
bekannt, wie z.B. SPDP, Maleinimide, α-Halogenacetyle und Pyridyldisulfide
(siehe z.B. Katalog der Pierce Chemical Company, technischer Teil über Vernetzer,
S. 155–200
(1994); hierin durch Verweis aufgenommen), die dazu verwendet werden
können,
Cystein enthaltende proteinhältige
Wirkstoffe an den Träger
zu binden. Alternativ dazu kann eine Aminogruppe auf dem Kandidatenstoff
zur Bindung an eine Aminogruppe auf der Oberfläche verwendet werden. Beispielsweise
ist auf dem Gebiet der Erfindung eine große Anzahl an stabilen bifunktionellen
Gruppen bekannt, einschließlich
homobifunktioneller und heterobifunktioneller Linker (siehe Katalog
und Handbuch der Pierce Chemical Company, S. 155 bis 200). In einer zusätzlichen
Ausführungsform
können
Carboxylgruppen (entweder aus der Oberfläche oder dem Kandidatenstoff)
unter Verwendung allgemein bekannter Linker (siehe Pierce-Katalog) derivatisiert
werden. Beispielsweise aktivieren Carbodiimide Carboxylgruppen zum
Angriff durch gute Nucleophile, wie z.B. Amine (siehe Torchilin
et al., Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 7(4), 275–308 (1991);
ausdrücklich
hierin aufgenommen). Proteinhältige
Kandidatenstoffe können
auch unter Verwendung anderer auf dem Gebiet der Erfindung bekannter
Verfahren gebunden werden; zur Bindung von Antikörpern an Polymere siehe beispielsweise Slinkin
et al., Bioconj. Chem. 2, 342–348
(1991); Torchilin et al., oben; Trubetskoy et al., Bioconj. Chem.
3, 323–327
(1992); King et al., Cancer Res. 54, 6176–6185 (1994); und Wilbur et
al., Biconjugate Chem. 5, 220–235
(1994). Es versteht sich, dass die Kandidatenstoffe auf verschiedene
Arten, einschließlich
jener oben angeführten,
gebunden werden können.
Vorzugsweise ändert
die Art der Bindung die Funktionalität des Kandidatenstoffes nicht
signifikant; das bedeutet, dass der Kandidatenstoff in einer so
flexiblen Art gebunden werden sollte, dass dessen Wechselwirkung
mit einem Ziel ermöglicht
wird. Zudem können
diese Typen von chemischen oder biologischen Funktionalitäten verwendet
werden, um, wie in 1F dargestellt, Feldpositionen an
Testpositionen oder einzelne Reihen von Perlen zu binden.
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Spezifische
Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen auf Mikrokügelchen
sind nach dem Stand der Technik bekannt. In einem Fall werden Mikrokügelchen
mit einer NH2-Oberfächenchemie verwendet. Die Oberflächenaktivierung
wird mit einem 2,5%igen Glutaraldeyhd in phosphatgepufferter Salzlösung (10
mM) erzielt, was einen pH von 6,9 ergibt (138 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
Dies wird auf einem Rührbett
etwa 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mikrokügelchen
werden sodann mit ultrareinem Wasser plus 0,01%igem bis 0,02%igem
Tween 20 (Tensid) gespült
und erneut mit einem PBS mit einem pH von 7,7 plus 0,01%igem Tween
20 gespült.
Schließlich
wird ein Enzym zur Lösung
zugesetzt, vorzugsweise nach einer Vorfiltrierung unter Verwendung
eines Amicon-Micropure-Filters mit 45 μm.
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In
manchen Ausführungsformen
können
die Mikrokügelchen
zusätzlich
Identifikator-Bindungsliganden zur
Verwendung in bestimmten Dekodierungssystemen umfassen. Mit "Identifikator-Bindungsliganden" oder "IBL" ist hierin eine
Verbindung gemeint, die sich spezifisch an einen entsprechenden
Dekodierungs-Bindungsliganden (DBL) bindet, um die Aufklärung der
Identität
des an die Perle gebundenen Wirkstoffs zu erleichtern. Das bedeutet,
dass der IBL und der entsprechende DBL Bindungspart nerpaare bilden.
Mit "spezifisch
binden" ist hierin
gemeint, dass der IBL seinen DBL mit einer Spezifizität bindet,
die ausreicht, um zwischen dem entsprechenden DBL und anderen DBL
(nämlich
DBL für
andere IBL) oder anderen Komponenten oder Verunreinigern des Systems
zu unterscheiden. Die Bindung sollte ausreichen, um unter den Bedingungen
während
des Dekodierens, einschließlich
der Waschungsschritte zur Entfernung von nicht-spezifischen Bindungen,
gebunden zu bleiben. In einigen Ausführungsformen, beispielsweise
wenn die IBL und die entsprechenden DBL Protein oder Nucleinsäuren sind,
betragen die Dissoziationskonstanten des IBL zu seinem DBL weniger
als etwa 10–4 bis
10–6 M–1,
wobei weniger als etwa 10–5 bis 10–9 M–1 bevorzugt
und weniger als etwa 10–7 bis 10–9 M–1 insbesondere
bevorzugt wird.
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IBL-DBL-Bindungspaare
sind bekannt oder können
unter Verwendung von bekannten Verfahren leicht gefunden werden.
Wenn der IBL beispielsweise ein Protein ist, umfassen die DBL Proteine
(insbesondere einschließlich
Antikörper
oder Fragmenten davon (FAbs etc.)) oder kleine Moleküle, oder
umgekehrt (der IBL ist ein Antikörper
und der DBL ein Protein). Metallionen-Metallionen-Liganden-Paare
oder Chelatbildnerpaare sind ebenfalls geeignet. Antigen-Antikörper-Paare,
Enzyme und Substrate oder Hemmer, andere Protein-Protein-Wechselwirkungspaare,
Rezeptor-Liganden, komplementäre
Nucleinsäuren
(einschließlich
Nucleinsäuremoleküle, die
Tripelhelices bilden) sowie Kohlenhydrate und deren Bindungspartner
sind ebenfalls geeignete Bindungspaare. Nucleinsäure-Nucleinsäure-Bindungsproteinpaare
sind ebenfalls hilfreich, einschließlich einzelsträngiger oder
doppelsträngiger
Nucleinsäurebindungsproteine
und niedermolekularer Nucleinsäurebindungsmittel. Ähnlich können, wie
allgemein in den US-Patenten Nr. 5.270.163, 5.475.096, 5.567.588, 5.595.877,
5.637.459, 5.683.867, 5.705.337 und verwandten Patenten beschrieben,
Nucleinsäure-"Aptamere" zum Binden an praktisch
jedes beliebige Ziel entwickelt werden, wobei ein solches Aptamer-Ziel-Paar
als IBL-DBL-Paar verwendet werden kann. Ähnlich gibt es einen großen Bestand
an Literatur, die sich mit der Entwicklung von Bindungspaaren beschäftigt, die
auf kombinatorischen Chemieverfahren beruhen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der IBL ein Molekül,
dessen Farb- oder Lumineszenzeigenschaften sich in Gegenwart eines
selektiv bindenden DBL verändern.
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In
einer Ausführungsform
kann der DBL an eine Perle, nämlich
eine "Dekodier-Perle", gebunden sein, die
eine Markierung wie z.B. ein Fluorophor aufweisen kann.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das IBL-DBL-Paar im Wesentlichen die komplementären einzelsträngigen Nucleinsäuren. In
dieser Ausführungsform
können
die Bindungsliganden als "Identifikator-Sonden" und "Dekodier-Sonden" bezeichnet werden.
Im Allgemeinen liegen die Identifikator- und Dekodier-Sonden in
einem Längenbereich
von etwa 4 bis etwa 1.000 Basenpaaren, wobei etwa 6 bis etwa 100
bevorzugt und etwa 8 bis etwa 40 insbesondere bevorzugt werden.
Wichtig ist, dass die Sonden lange genug sind, um spezifisch zu
sein, d.h. um zwischen unterschiedlichen IBL-DBL-Paaren zu unterscheiden,
jedoch kurz genug sind, um sowohl a) eine Dissoziation, wenn erforderlich,
unter geeigneten Versuchsbedingungen und b) eine effiziente Hybridisierung
zu ermöglichen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
binden sich die IBL nicht an die DBL, wie nachstehend genauer dargelegt
wird. Stattdessen werden die IBL eher als Identifikator-Gruppierungen
("IM") verwendet, die
beispielsweise anhand von Massenspektroskopie direkt identifiziert
werden.
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Alternativ
dazu weisen in einer bevorzugten Ausführungsform der IBL und der
bioaktive Wirkstoff die gleiche Gruppierung auf; somit kann der
bioaktive Wirkstoff, beispielsweise wie hierin dargelegt, insbesondere wenn
keine optische Signatur verwendet wird, sowohl als Identifikator
als auch als Wirkstoff dienen. Beispielsweise kann die Perlen-gebundene
Sonde (die als bioaktiver Wirkstoff dient) im Fall von Nucleinsäuren auch Dekodier-Sonden
binden, um die Sondensequenz auf der Perle zu identifizieren. Folglich
binden sich die DBL in dieser Ausführungsform an die bioaktiven
Wirkstoffe. Dies stellt sich als insbesondere geeignet heraus, da diese
Ausführungsform
zusätzlich
zum Dekodieren Informationen über
das Feld oder den Test liefern kann. Beispielsweise ermöglicht die
Verwendung des DBL, wie nachstehend ausführlicher dargelegt, eine Feldkalibrierung
sowie eine Testentwicklung. Dies kann erfolgen, auch wenn die DBL
als solche nicht verwendet werden; beispielsweise kann die Verwendung
dieser Sondenanordnungen bei nicht statistischen Feldern eine Feldkalibrierung
und eine Testentwicklung ermöglichen,
sogar wenn keine Dekodierung erforderlich ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
weisen die Mikrokügelchen
keine optische Signatur auf. Das bedeutet, dass, wie in der US-Anmeldung
Nr. 19970818199, die als Priorität
für WO
98/50782 dient, dargelegt, bei vorherigen Arbeiten jede der Mikrokügelchen-Unterpopulationen
eine einmalige optische Signatur oder eine optische Markierung aufwies,
die dazu verwendet wurde, um den einmaligen bioaktiven Wirkstoff
jener Mikrokügelchen-Unterpopulation
zu identifizieren; das bedeutet, dass beim Dekodieren optische Eigenschaften
der Perlen so verwendet werden, dass eine Perle mit einer einmaligen
optischen Signatur von Perlen an anderen Positionen mit unterschiedlichen
optischen Signaturen unterschieden werden kann. Folglich wurde bei
vorherigen Arbeiten jedem bioaktiven Wirkstoff eine einmalige optische
Signatur zugeschrieben, sodass jede der Mikrokügelchen mit jenem bioaktiven
Wirkstoff aufgrund der Unterschrift identifizierbar war. Diese optischen
Signaturen umfassten Farbstoffe, üblicherweise Chromophore oder
Fluorophore, die von den Perlen eingefangen oder an die Perlen selbst
gebunden waren. Zur Erzielung verschiedener optischer Signaturen wurden
unterschiedliche Fluorochrome, unterschiedliche Verhältnisse
der Fluorochromgemische und unterschiedliche Konzentrationen (Intensitäten) der
Fluorochrome verwendet.
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Folglich
muss die vorliegende Erfindung nicht ausschließlich auf die Verwendung von
optischen Eigenschaften zur Dekodierung der Felder vertrauen, obwohl
dies in einigen Fällen
vorkommen kann. Dennoch ist es in einigen Ausführungsformen möglich, wie
Fachleuten klar ist, optische Signaturen als zusätzliches Kodierungsverfahren
zusammen mit dem vorliegenden System zu verwenden. Folglich kann
die Größe des Feldes, wie
nachstehend ausführlicher
beschrieben, effektiv erhöht
werden, während
eine einzige Anordnung von Dekodier-Gruppierungen auf verschiedene Weisen
verwendet wird, wobei eine die Verwendung in Kombination mit den
optischen Signaturen auf Perlen darstellt. Somit ermöglicht beispielsweise
die Verwendung einer "Anordnung" von Dekodier-Molekülen, die
Verwendung von zwei Populationen von Perlen, eine mit und die andere ohne
optische Signatur, die effektive Verdoppelung der Feldgröße. Die
Verwendung von mehrfachen optischen Signaturen erhöht auf ähnliche
Weise die mögliche
Größe des Feldes.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst jede der Perlen-Unterpopulationen eine Vielzahl unterschiedlicher
IBL. Unter Verwendung einer Vielzahl verschiedener IBL zur Kodierung
der jeweiligen bioaktiven Wirkstoffe wird die Anzahl der möglichen
einmaligen Codes wesentlich erhöht.
Das bedeutet, dass unter Verwendung eines einmaligen IBL pro Wirkstoff
die Größe des Feldes
der Anzahl der einmaligen IBL (unter der Annahme, dass, wie nachstehend
dargelegt, keine "Wiederverwendung" stattfindet) entspricht.
Dennoch kann unter Verwendung einer Vielzahl unterschiedlicher IBL
pro Perle, n, die Größe des Feldes
auf 2n erhöht werden, wenn die Gegenwart
oder Abwesenheit der jeweiligen IBL als Indikator herangezogen wird.
Beispielsweise kommt es bei der Zuordnung von 10 IBL pro Perle zu
einem binären
Code mit 10 Bit, worin jedes der Bit als "1" (IBL
liegt vor) oder "0" (IBL ist abwesend)
bezeichnet werden kann. Ein binärer
Code mit 10 Bit weist 210 mögliche Varianten
auf. Dennoch kann, wie nachstehend ausführlicher besprochen, die Feldgröße zusätzlich vergrößert werden,
wenn ein anderer Parameter, wie z.B. Konzentration oder Intensität, miteingeschlossen wird;
wenn somit z.B. zwei unterschiedliche Konzentrationen von IBL verwendet
werden, wird die Feldgröße auf 3n erhöht.
Folglich wird in dieser Ausführungsform
jedem einzelnen bioaktiven Wirkstoff im Feld eine IBL-Kombination
zugeordnet, die zu den Perlen vor der Zugabe eines bioaktiven Wirkstoffs,
nach oder während
der Synthese des bioaktiven Wirkstoffs zugesetzt werden kann, d.h.
es kommt zu einer gleichzeitigen Zugabe von IBL und bioaktiven Wirkstoffkomponenten.
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Alternativ
dazu kann die Kombination unterschiedlicher IBL verwendet werden,
um die Sequenz des Proteins oder der Nucleinsäure aufzuklären, wenn der bioaktive Wirkstoff
ein Polymer mit unterschiedlichen Resten ist, d.h. wenn der Wirkstoff
ein Protein oder eine Nucleinsäure
ist.
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Folglich
kann beispielsweise durch Verwendung zweier unterschiedlicher IBL
(IBL1 und IBL2) die erste Position einer Nucleinsäure aufgeklärt werden;
Adenosin kann beispielsweise durch die Gegenwart von sowohl IBL1
als auch IBL2 dargestellt werden; Thymidin kann durch die Gegenwart
von IBL1, jedoch nicht IBL2 dargestellt werden; Cytosin kann durch
die Gegenwart von IBL2, jedoch nicht IBL1 dargestellt werden; und
Guanin kann durch die Abwesenheit von beiden dargestellt werden.
Die zweite Position der Nucleinsäure
kann auf ähnliche
Weise unter Verwendung von IBL3 und IBL4 aufgeklärt werden; folglich wird durch
die Gegenwart von IBL1, IBL2, IBL3 und IBL4 die Sequenz von AA erhalten;
IBL1, IBL2 und IBL3 weist auf die Sequenz AT; durch IBL1, IBL3 und
IBL4 wird die Sequenz TA erhalten etc. Die dritte Position verwendet
IBL5 und IBL6 etc. Auf diese Weise kann die Verwendung 20 unterschiedlicher
Identifikatoren einen einmaligen Code für jedes mögliche 10-mer ergeben.
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Das
System ist für
Proteine ähnlich,
wobei dieses, je nach erlaubter Diversität an der jeweiligen Position,
eine größere Anzahl
unterschiedlicher IBL zur Identifizierung jeder der Positionen erfordert.
Folglich werden fünf
unterschiedliche IBL für
die jeweilige Position erforderlich, wenn jede Aminosäure an jeder
Position zugelassen wird. Wie jedoch oben angeführt, kann im System eine Einseitigkeit
eingeführt
werden, wenn beispielsweise statistisch verteilte Peptide als bioaktive
Wirkstoffe verwendet werden; mitunter liegen nicht alle Aminosäuren an
allen Positionen vor, und manche Positionen sind mitunter vorher
festgelegt. Demzufolge ist es mitunter möglich, für jede der Aminosäuren vier
unterschiedliche IBL zu verwenden.
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Auf
diese Weise kann für
jede der Sequenzen eine Art "Barcode" erstellt werden,
wobei die Gegenwart oder Abwesenheit jedes bestimmten IBL die Identifikation
der einzelnen bioaktiven Wirkstoffe ermöglicht.
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Zudem
ermöglicht
die Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen oder Dichten von
IBL eine Art "Wiederverwendung" dieser. Wenn beispielsweise
jene Perle, die einen ersten Wirkstoff aufweist, über eine 1-malige
Konzentration von IBL verfügt
und eine zweite Perle, die einen zweiten Wirkstoff aufweist, über eine 10-malige
Konzentration von IBL verfügt,
ermöglicht
die Verwendung gesättigter
Konzentrationen der entsprechenden markierten DBL den Verwendern
eine Unterscheidung zwischen den zwei Perlen.
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Nachdem
die Mikrokügelchen,
die die Kandidatenstoffe und die einmaligen IBL umfassen, gebildet wurden,
werden diese zur Bildung eines Feldes dem Substrat zugesetzt. Es
wird angemerkt, dass, während es
in den meisten hierin beschriebenen Verfahren zu einer Zugabe der
Perlen zum Substrat vor dem Test kommt, die Reihenfolge des Herstellens,
Verwendens und Dekodierens des Feldes unterschiedlich sein kann. Beispielsweise
kann das Feld hergestellt und dekodiert und erst dann dem Test unterzogen
werden.
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Alternativ
dazu kann das Feld hergestellt, in einem Test verwendet und dann
dekodiert werden; dies kann insbesondere dann vorkommen, wenn nur
einige wenige Perlen dekodiert werden müssen. Alternativ dazu können die
Perlen dem Testgemisch, und zwar der Probe, die die Zielanalyten
aufweist, vor der Zugabe der Perlen zum Substrat zugesetzt werden;
nach der Zugabe und dem Test kann das Feld dekodiert werden. Dies
wird insbesondere bevorzugt, wenn die Probe, die die Perlen aufweist,
gerührt
oder gemischt wird; dies kann zu einer Erhöhung der Menge an Zielanalyten,
die an die Perlen pro Zeiteinheit gebunden sind, führen und
demzufolge (im Falle von Nucleinsäuretests) die Hybridisierungskinetik
steigern. Dies kommt insbesondere in Fällen zum Tragen, worin die
Konzentration des Zielanalyten in der Probe gering ist; im Allgemeinen
müssen
bei geringen Konzentrationen lange Bindungszeiten verwendet werden.
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Zusätzlich kann
die Zugabe der Perlen zum Testgemisch eine Sortierung oder Auswahl
ermöglichen. Beispielsweise
kann eine große
Sammlung von Perlen zu einer Probe zugesetzt werden, wobei nur jene
Perlen zum Substrat zugesetzt werden können, die die Probe binden.
Wenn der Zielanalyt beispielsweise fluoreszierend markiert ist (entweder
direkt (z.B. durch Aufnahme von Markierungen in die Nucleinsäureamplifikationsreaktionen)
oder indirekt (beispielsweise durch die Verwendung von Sandwich-Tests)),
können
Perlen, die als Ergebnis der Zielanalytenbindung eine Fluoreszenz
aufweisen, mittels fluoreszenzaktivierten Zellsortierern (FACS)
sortiert werden, und nur diese Perlen zu einem Feld zugesetzt und
anschließend
dekodiert werden. Ähnlich
kann die Sortierung durch Affinitätsverfahren erzielt werden;
es können
Affinitätssäulen erstellt
werden, die die Zielanalyten umfassen, wobei nur bindende Perlen
auf dem Feld verwendet werden können.
Auf ähnliche
Weise können
Zwei-Perlen-Systeme verwendet werden; beispielsweise können magnetische
Perlen, die die Zielanalyten aufweisen, verwendet werden, um jene
Perlen "herauszuziehen", die sich an die
Ziele binden, gefolgt von einer anschließenden Freisetzung der magnetischen
Perlen (beispielsweise mittels Temperaturerhöhung) und einer Zugabe zu einem
Feld.
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Im
Allgemeinen werden Verfahren zur Erstellung der Felder und Dekodieren
der Felder durchgeführt, um
die Anzahl der unterschiedlichen Kandidatenstoffe, die einmalig
kodiert werden können,
zu maximieren. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
können
auf unterschiedliche Art und Weise hergestellt werden. Im Allgemeinen
werden die Felder hergestellt, indem eine die Perlen enthaltende
Lösung
oder Aufschlämmung zu
einer Oberfläche
zugesetzt wird, die die Stellen zur Assoziation der Perlen enthält. Dies
kann mittels unterschiedlicher Puffer, einschließlich wässriger und organischer Lösungsmittel,
und Gemische erfolgen. Das Lösungsmittel
kann verdampfen, und überschüssige Perlen
können
entfernt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein neuartiges Verfahren zur Beladung der Perlen auf ein Feld
verwendet, wenn nichtkovalente Verfahren verwendet werden, um die
Perlen an die Felder zu assoziieren. Dieses Verfahren umfasst das
Aussetzen des Feldes gegenüber
einer Lösung
von Teilchen (einschließlich Mikrokügelchen
und Zellen) und das anschließende
Anlegen von Energie, z.B. durch Rühren oder Vibrierenlassen des
Gemischs. Dies führt
zu einem Feld, das dichter assoziierte Teilchen umfasst, da das
Rühren
mit einer Energie vorgenommen wird, die aus reicht, dass schwach
assoziierte Perlen herunterfallen (oder im Falle der Wells herausfallen).
Diese Stellen sind sodann verfügbar,
um eine unterschiedliche Perle zu binden. Auf diese Weise werden
Perlen ausgewählt,
die eine hohe Affinität
für die
Stellen aufweisen. Auf diese Weise hergestellte Felder weisen, verglichen
mit einer statischeren Beladung, zwei Hauptvorteile auf: zuerst
eine höhere Prozentzahl
an Stellen, die leicht zu füllen
sind, und zweitens weisen die so beladenen Felder eine wesentliche Verringerung
des Perlenverlusts während
der Tests auf. Folglich werden in einer bevorzugten Ausführungsform
diese Verfahren angewandt, um Felder zu erstellen, deren Stellen
zu zumindest 50 % befüllt
sind, wobei zumindest etwa 75 % bevorzugt und zumindest etwa 90
% insbesondere bevorzugt sind. Auf ähnliche Weise verlieren auf
diese Weise hergestellte Felder vorzugsweise weniger als etwa 20
% an Perlen während
eines Tests, wobei weniger als etwa 10 % bevorzugt und weniger als
etwa 5 % insbesondere bevorzugt sind.
-
In
dieser Ausführungsform
wird das Substrat, das die Oberfläche mit den diskreten Stellen
umfasst, in eine Lösung
eingetaucht, die die Teilchen (Perlen, Zellen etc.) umfasst. Die
Oberfläche
kann, wie hierin beschrieben, Wells umfassen oder andere Typen von
Stellen auf einer strukturierten Oberfläche, sodass es für die Stellen
unterschiedliche Affinitäten
gibt. Diese unterschiedliche Affinität führt zu einem kompetitiven Prozess,
sodass die sich stärker
assoziierenden Teilchen ausgewählt
werden. Vorzugsweise ist die gesamte mit Perlen zu "beladende" Oberfläche in Fluid-Kontakt
mit der Lösung.
Diese Lösung
ist im Allgemeinen eine Aufschlämmung,
die in einem Bereich von etwa 10.000:1 Perlen:Lösung (Vol.:Vol.) bis 1:1 liegt.
Im Allgemeinen kann die Lösung
jede beliebige Anzahl an Reagenzien umfassen, einschließlich wässriger
Puffer, organischer Lösungsmittel,
Salzen, anderen Reagenskomponenten etc. Zudem umfasst die Lösung vorzugsweise
einen Überschuss
an Perlen; das bedeutet, es gibt mehr Perlen als Stellen auf dem
Feld. In bevorzugten Ausführungsformen
kommt ein zweifacher bis milliardenfacher Überschuss an Perlen zum Einsatz.
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Das
Eintauchen kann Testbedingungen nachahmen; wenn das Feld beispielsweise
von oben in eine die Proben enthaltende Mikrotiterplatte "eingetaucht" werden soll, kann
diese Anordnung für
das Beladen wiederholt werden, wodurch jene Perlen minimiert werden,
die aufgrund der Schwerkraft zum Herausfallen neigen.
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Nachdem
die Oberfläche
eingetaucht worden ist, werden das Substrat, die Lösung oder
beides einem kompetitiven Prozess unterzogen, wodurch die Teilchen
mit geringer Affinität
vom Substrat getrennt werden können
und durch Teilchen mit höherer
Affinität
zur Stelle ersetzt werden. Dieser kompetitive Prozess findet mittels
Einführung
von Energie statt, und zwar in Form von Hitze, Beschallung, Rühren oder
Mischen, Vibrierenlassen oder Schütteln der Lösung oder des Substrats oder
beiden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Rühren
oder Vibrierenlassen eingesetzt. Im Allgemeinen wird die Anzahl
der Manipulationen des Substrats minimiert, um das Feld vor Schädigungen
zu schützen; folglich
wird bei bevorzugten Ausführungsformen
eher das Rühren
der Lösung
statt des Feldes ausgeführt,
wobei beides funktioniert. Fachleuten ist klar, dass dieses Rühren auf
verschiedene Arten erfolgen kann, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform
Mikrotiterplatten verwendet werden, die Perlenlösungen enthalten, die unter
Verwendung von Mikrotiterplattenschüttlern gerührt werden.
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Das
Rühren
findet so lange statt, bis das Feld auf eine gewünschte Beladung gefüllt ist.
Je nach Größe und Konzentration
der Perlen und der Größe des Feldes
kann diese Zeit von 1 Sekunde bis zu Tagen variieren, wobei ein
Zeitraum von etwa 1 Minute bis etwa 24 Stunden bevorzugt ist.
-
Es
wird angemerkt, dass nicht alle Stellen eines Feldes eine Perle
enthalten; das bedeutet, es kann einige Stellen auf der Substratoberfläche geben,
die leer sind. Zudem kann es einige Stellen geben, die mehr als
eine Perle enthalten, wobei dies nicht bevorzugt wird.
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In
einigen Ausführungsformen,
z.B. wenn eine chemische Bindung erfolgt ist, ist es möglich, die
Perlen in einer nichtzufälligen
Verteilung oder in geordneter Weise zu assoziieren. Unter Verwendung
von beispielsweise fotoaktivierbaren Bindungs- Linkern oder fotoaktivierbaren Klebstoffen
oder Masken können
ausgewählte
Stellen auf dem Feld nacheinander so gemacht werden, dass sie sich
zum Binden eignen, sodass definierte Perlen-Populationen abgelegt
werden.
-
Die
Felder der vorliegenden Erfindung sind so angeordnet, dass Informationen über die
Identität
der Kandidatenstoffe in die Felder eingebaut sind, sodass die zufällige Anordnung
der Perlen in den Faser-Wells "dekodiert" werden kann, um
eine Identifikation der Kandidatenstoffe an allen Positionen zu
ermöglichen.
Dies kann auf verschiedene Weisen durchgeführt werden, und zwar entweder
vor, während
oder nach der Verwendung des Feldes zur Detektion von Zielmolekülen.
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Folglich
wird das Feld, nachdem es erstellt worden ist, "dekodiert", um die Stelle eines oder mehrerer bioaktiver
Wirkstoffe, d.h. jede Perlen-Unterpopulation der Perlen, auf der
Substratoberfläche
zu identifizieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein selektives Dekodierungssystem verwendet. In diesem Fall
werden nur jene Mikrokügelchen
dekodiert, die, resultierend aus dem Binden eines Zielanalyten,
eine Veränderung
des optischen Signals aufweisen. Dies wird herkömmlich gemacht, wenn die Anzahl
an "Treffern", d.h. die Anzahl
der zu dekodierenden Stellen, im Allgemeinen gering ist. Das heißt, dass
das Feld zuerst unter Versuchsbedingungen in Abwesenheit des Zielanalyten
gescannt wird. Die Probe, welche die Zielanalyten enthält, wird
zugesetzt, und es werden nur jene Stellen dekodiert, die eine Veränderung
des optischen Signals aufweisen. Die Perlen an entweder den positiven
oder negativen Signalstellen können
beispielsweise entweder selektiv markiert oder aus dem Feld freigesetzt
werden (beispielsweise indem fotoabspaltbare Linker verwendet werden)
und anschließend
sortiert oder in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS)
angereichert werden. Das bedeutet, dass entweder alle negativen
Perlen freigesetzt werden und dann die positiven Perlen entweder
freigesetzt oder in situ analysiert werden, oder alternativ dazu
alle positiven Perlen freigesetzt und analysiert werden. Alternativ
dazu können
die Markierungen halogenierte aromatische Verbindungen umfassen,
und die Detektion der Markierung wird vorgenommen, indem beispielsweise
Gaschromatographie, chemi sche Markierungen, isotope Markierungen
oder massenspektrometrische Markierungen angewendet werden.
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Fachleuten
ist klar, dass dies auch in Systemen erfolgen kann, worin das Feld
nicht dekodiert ist; und zwar muss es nie eine Wechselbeziehung
zwischen Perlenanordnung und Stelle geben. In dieser Ausführungsform
werden die Perlen auf dem Feld angeordnet und der Test durchgeführt. Die "positiven", nämlich jene Perlen,
die, wie nachstehend ausführlicher
beschrieben, eine Veränderung
des optischen Signals aufweisen, werden sodann "markiert", um sie von den "negativen" Perlen zu unterscheiden oder zu trennen.
Dies kann auf verschiedene Arten stattfinden, vorzugsweise unter
Verwendung von Faseroptik-Feldern. In einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
jede der Perlen einen fluoreszierenden Farbstoff. Nach dem Test
und der Identifikation der "positiven" oder "aktiven Perlen" wird entweder nur
entlang der positiven Fasern oder nur entlang der negativen Fasern
ein Licht angezeigt, im Allgemeinen in Gegenwart eines fotoaktivierten
Reagens (üblicherweise
gelöster
Sauerstoff). In ersterem Fall werden alle aktiven Perlen fotogebleicht.
Somit können die
nichtfluoreszierenden aktiven Perlen aus den fluoreszierenden negativen
Perlen sortiert werden, und zwar nach der nichtselektiven Freisetzung
aller Perlen mit anschließendem
Sortieren unter Verwendung von beispielsweise einem fluoreszenzaktivierten
Zellsortierer (FACS). Alternativ dazu sind alle negativen nichtfluoreszierend
und die positiven fluoreszierend, wenn entlang den negativen Fasern
ein Licht angezeigt wird, und das Sortieren kann fortfahren. Die
Charakterisierung des gebundenen bioaktiven Wirkstoffs kann direkt
unter beispielsweise Einsatz von Massenspektroskopie erfolgen.
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Alternativ
dazu kann die Identifikation durch die Verwendung von Identifikator-Gruppierungen ("IM"), die den IBL ähnlich sind,
sich jedoch nicht zwingend an DBL binden, erfolgen. Das bedeutet,
dass statt einer direkten Aufklärung
der Struktur des bioaktiven Wirkstoffs die Anordnung der IM als
Identifikator dienen kann. Folglich kann beispielsweise eine spezifische
Kombination von IM zur Kodierung der Perle dienen und dazu verwendet
werden, den Wirkstoff auf der Perle nach der Freisetzung von der
Perle zu identifizieren, gefolgt von einer anschließenden Analyse,
bei spielsweise unter Verwendung eines Gaschromatographen oder eines
Massenspektroskops.
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Alternativ
dazu umfasst jede der Perlen einen nichtfluoreszierenden Vorläufer zu
einem fluoreszierenden Farbstoff, statt dass jede der Perlen einen
fluoreszierenden Farbstoff aufweist. Beispielsweise kann eine Fotoaktivierung
des Fluorochroms erfolgen, wenn beispielsweise fotoabspaltbare Schutzgruppen,
wie bestimmte ortho-Nitrobenzylgruppen,
auf einem fluoreszierenden Molekül
verwendet werden. Nach dem Test zeigt sich wieder entlang der "positiven" oder "negativen" Fasern ein Licht,
um diese Populationen zu unterscheiden. Die erleuchteten Vorläufer werden
chemisch zu einem fluoreszierenden Farbstoff überführt. Jede der Perlen wird anschließend mittels
Sortieren aus dem Feld freigesetzt, um Populationen von fluoreszierenden
und nichtfluoreszierenden Perlen (entweder positive oder negative
oder umgekehrt) zu bilden.
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In
einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Assoziationsstellen
der Perlen (z.B. die Wells) ein fotopolymerisierbares Reagens, oder
der fotopolymerisierbare Wirkstoff wird zum zusammengestellten Feld
zugesetzt. Nach der Durchführung
des Tests zeigt sich wieder entlang der "positiven" oder "negativen" Fasern ein Licht, um diese Populationen
zu unterscheiden. Als Ergebnis der Bestrahlung werden entweder alle
positiven oder alle negativen polymerisiert und eingefangen oder
an die Stellen gebunden, während die
andere Perlen-Population aus dem Feld freigesetzt werden kann.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Stelle jedes der bioaktiven Wirkstoffe unter Verwendung
von Dekodierungs-Bindungsliganden (DBL) bestimmt. Wie oben dargelegt,
umfassen DBL Bindungsliganden, die sich entweder an Identifikator-Bindungsliganden,
wenn diese vorliegen, binden oder an die bioaktiven Wirkstoffe selbst,
vorzugsweise wenn der bioaktive Wirkstoff eine Nucleinsäure oder
ein Protein ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
bindet sich der DBL, wie oben dargelegt, an den IBL.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die bioaktiven Wirkstoffe einzelsträngige Nucleinsäuren, und
der DBL ist eine im Wesentlichen komplementäre einzelsträngige Nucleinsäure, die
sich an den bioaktiven Wirkstoff bindet (hybridisiert) und hierein
als Dekodier-Sonde bezeichnet wird. Es wird eine Dekodier-Sonde hergestellt
und zur Dekodierung des Feldes verwendet, die im Wesentlichen komplementär zu jeder
Kandidatensonde ist. In dieser Ausführungsform sollten die Kandidatensonden
und die Dekodier-Sonden eine ausreichende Länge aufweisen (und das Dekodieren
unter geeigneten Bedingungen stattfinden), um eine Spezifizität zu ermöglichen;
und zwar bindet sich jede Kandidatensonde mit ausreichender Spezifizität an ihre
entsprechende Dekodier-Sonde, um die Unterscheidung der jeweiligen
Kandidatensonden zu ermöglichen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die DBL entweder direkt oder indirekt markiert. Unter "markiert" wird hierin verstanden,
dass eine Verbindung zumindest ein Element, Isotop oder eine chemische
Verbindung aufweist, die gebunden sind, um die Detektion der Verbindung
zu ermöglichen.
Im Allgemeinen fallen Markierungen in drei Klassen: a) isotope Markierungen,
die radioaktive oder schwere Isotope sein können; b) magnetische, elektrische
und thermische Markierungen; und c) gefärbte oder lumineszierende Farbstoffe,
wobei Markierungen Enzyme und Teilchen, wie z.B. magnetische Teilchen,
ebenfalls umfassen. Bevorzugte Markierungen umfassen lumineszierende
Markierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der DBL direkt
markiert, d.h. der DBL umfasst eine Markierung. In einer weiteren
Ausführungsform
wir der DBL indirekt markiert, d.h. es wird ein Markierungs-Bindungsligand (LBL)
verwendet, der sich an den DBL bindet. In dieser Ausführungsform
kann das Markierungs-Bindungsligand-DBL-Paar das gleiche wie oben
für IBL-DBL-Paare beschriebene
sein. Geeignete Markierungen umfassen, jedoch nicht ausschließlich, fluoreszierende
Lanthanoidkomplexe, einschließlich
jene von Europium und Terbium, Fluorescein, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Eosin,
Erythrosin, Cumarin, Methylcumarine, Pyren, Malachitgrün, Stilben,
Lucifergelb, Cascade BlueTM, Texasrot, FITC,
PE, cy3, cy5 und andere, die in der hierin ausdrücklich als Verweis aufgenommen
sechsten Auflage des Molecular Probes Handbook von Richard P. Haugland
beschrieben sind.
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In
einer Ausführungsform
umfasst die Markierung ein Molekül,
dessen Farbe oder Lumineszenzeigenschaften sich in der Gegenwart
des IBL aufgrund einer Veränderung
der lokalen Umgebung verändern.
Beispielsweise kann die Markierung Folgendes sein: (1) ein fluoreszierender
pH-Indikator, dessen Emissionsintensität sich mit dem pH-Wert ändert; (2)
ein fluoreszierender Ionen-Indikator, dessen Emissionseigenschaften sich
mit der Ionenkonzentration ändern;
oder (3) ein fluoreszierendes Molekül, wie z.B. ein Ethidiumsalz,
dessen Fluoreszenzintensität
sich in hydrophoben Umgebungen erhöht.
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Demzufolge
findet die Identifizierung der Stelle der einzelnen Perlen (oder
Perlen-Unterpopulationen) unter
Verwendung eines oder mehrerer Dekodierungsschritte statt, die eine
Bindung zwischen dem markierten DBL und entweder dem IBL oder dem
bioaktiven Wirkstoff (d.h. eine Hybridisierung zwischen der Kandidatensonde
und der Dekodierungs-Sonde, wenn der bioaktive Wirkstoff eine Nucleinsäure ist)
umfassen. Nach dem Dekodieren können
die DBL entfernt und das Feld verwendet werden; unter manchen Umständen ist,
wenn z.B. der DBL sich an den IBL und nicht an den bioaktiven Wirkstoff
bindet, die Entfernung des DBL jedoch nicht erforderlich (obwohl
dies unter manchen Bedingungen erwünscht sein kann). Zudem kann
das Dekodieren, wie hierin dargelegt, entweder vor der Verwendung
des Feldes in einem Test, während
des Tests oder nach dem Test stattfinden.
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In
einer Ausführungsform
wird ein einziger Dekodierungsschritt durchgeführt. In dieser Ausführungsform
wird jeder der DBL mit einer einmaligen Markierung markiert, sodass
die Anzahl der einmaligen Markierungen der Anzahl an bioaktiven
Wirkstoffen entspricht oder größer ist
(wobei in manchen Fällen,
wie hierin beschrieben, eine "Wiederverwendung" der einmaligen Markierungen
vorgenommen werden kann; ähnlich können kleinere
Varianten von Kandidatensonden den gleichen Dekodierer aufweisen,
wenn die Varianten in einer anderen Dimension, nämlich in Perlengröße oder
Markierung, kodiert sind). Für
jeden bioaktiven Wirkstoff oder IBL wird ein DBL hergestellt, der
sich spezifisch daran bindet und eine einmalige Markierung aufweist,
beispielsweise ein oder mehr Fluorochrome. Folglich ist die Identität der jeweiligen
DBL, sowohl dessen Anordnung (d.h. dessen Sequenz, wenn es sich
um eine Nucleinsäure
handelt) als auch dessen Markierung bekannt. Anschließend kann
die Stelle der jeweiligen DBL aufgeklärt werden, indem die DBL zum
Feld zugesetzt werden, das die bioaktiven Wirkstoffe enthält, und
zwar unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen (die als Hybridisierungskomplexe
bezeichnet werden, wenn es sich bei den Komponenten um Nucleinsäuren handelt)
zwischen den DBL und entweder den bioaktiven Wirkstoffen oder den
IBL ermöglichen.
Dies ermöglicht
die Identifikation der Stelle jedes der bioaktiven Wirkstoffe, wobei
das zufallsveränderte
Feld dekodiert worden ist. Die DBL können sodann falls erforderlich
entfernt und die Zielprobe angewandt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
beträgt
die Anzahl einmaliger Markierungen weniger als die Anzahl einmaliger
bioaktiver Wirkstoffe; folglich wird eine aufeinander folgende Reihe
von Dekodierungsschritten angewandt. Zur leichteren Darlegung wird
diese Ausführungsform
für Nucleinsäuren erklärt, wobei
andere Typen von bioaktiven Wirkstoffen und DBL ebenfalls geeignet
sind. In dieser Ausführungsform
werden die Dekodierungs-Sonden zum Dekodieren in n Gruppen unerteilt.
Die Anzahl der Gruppen entspricht der Anzahl der einmaligen Markierungen.
Jede der Dekodierungs-Sonden wird in n getrennten Reaktionen mit
n bestimmten Markierungen markiert. Jede der Dekodierungs-Sonden
weisen die gleichen n Markierungen auf. Jeder Pool an Dekodierern
enthält
nur eine Version der n Markierungen für jeden Dekodierer, wobei in
sämtlichen
Pools keine zwei Dekodierungs-Sonden die gleiche Markierungssequenz
aufweisen. Die Anzahl an Pools, die erforderlich ist, damit dies
stimmt, wird durch die Anzahl der Dekodierungs-Sonden und n bestimmt.
Die Hybridisierung des jeweiligen Pools zum Feld erzeugt bei jeder
Erkennungsstelle, die ein IBL umfasst, ein Signal. Die sequentielle
Hybridisierung der jeweiligen Pools führt wiederum zu einem einmaligen
sequenzspezifischen Code für
jede Kandidatensonde. Dadurch wird die Kandidatensonde an jeder
Erkennungsstelle im Feld identifi ziert. Wenn beispielsweise 4 Markierungen
verwendet werden, dann können
4 × n
Sequenzhybridisierungen idealerweise zwischen 4n-Sequenzen
unterscheiden, wobei in manchen Fällen mehrere Schritte erforderlich sein
können.
Nach der Hybridisierung der jeweiligen Pools werden die Hybride
denaturiert und die Dekodierungs-Sonden
entfernt, sodass die Sonden für
die nächste
Hybridisierung einzelsträngig
gemacht werden (wobei es auch möglich
ist, limitierende Mengen von Zielen so zu hybridisieren, dass die
verfügbare
Sonde nicht gesättigt
wird; sequenzielle Hybridisierung kann durchgeführt und analysiert werden,
indem ein bereits bestehendes Signal von der vorigen Hybridisierung
abgezogen wird).
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Ein
Beispiel zur Veranschaulichung: angenommen wird ein Feld mit 16
Sonden-Nucleinsäuren (Nummer
1 bis 16) und vier einmaligen Markierungen (z.B. vier unterschiedliche
Fluophore; Markierungen A bis D). Es werden Dekodierungs-Sonden
1 bis 16 hergestellt, die den Sonden auf den Perlen entsprechen.
Der erste Schritt umfasst die Markierung der Dekodierungs-Sonden
1 bis 4 mit Markierung A, der Dekodierungs-Sonden 5 bis 8 mit Markierung
B, der Dekodierungs-Sonden 9 bis 12 mit Markierung C und der Dekodierungs-Sonden 13
bis 16 mit Markierung D. Die Sonden werden vermischt, und der Pool
wird mit dem Feld kontaktiert, das die Perlen mit den gebundenen
Kandidatensonden enthält.
Sodann wird die Stelle für
jede Markierung (und somit jedes Dekodierungs- und Kandidatensondenpaar)
bestimmt. Die erste Gruppe Dekodierungs-Sonden wird anschließend entfernt.
Eine zweite Gruppe wird zugesetzt, wobei dieses Mal die Dekodierungs-Sonden
1, 5, 9 und 13 mit der Markierung A, die Dekodierungs-Sonden 2,
6, 10 und 14 mit der Markierung B, die Dekodierungs-Sonden 3, 7,
11 und 15 mit der Markierung C und die Dekodierungs-Sonden 4, 8, 12 und
16 mit der Markierung D markiert werden. Somit enthalten jene Perlen,
die die Markierung A in beiden Dekodierungsschritten aufweisen,
die Kandidatensonde 1; die Markierung A aus dem ersten Dekodierungsschritt
und die Markierung B aus dem zweiten Dekodierungsschritt enthalten
die Kandidatensonde 2; die Markierung A aus dem ersten Dekodierungsschritt
und die Markierung C aus dem zweiten Schritt enthalten die Kandidatensonde
3 etc. Fachleuten ist klar, dass die Dekodierungs-Sonden in jeder
beliebigen Reihenfolge hergestellt und zugesetzt werden können.
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In
einer Ausführungsform
werden die Dekodierungs-Sonden in situ markiert. Das bedeutet, dass
diese vor der Dekodierungsreaktion nicht markiert werden müssen. In
dieser Ausführungsform
ist die ankommende Dekodierungs-Sonde kürzer als die Kandidatensonde,
was zu einem 5'-"Überhang" auf der Dekodierungs-Sonde führt. Die
Zugabe von markierten ddNTP (alle mittels einmaliger Markierung
markiert) und einer Polymerase ermöglicht das Hinzufügen der
Markierungen auf sequenzspezifische Weise, wodurch ein sequenzspezifisches
Muster von Signalen erzeugt wird. Ähnlich können andere Modifikationen
vorgenommen werden, einschließlich
Ligierung etc.
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Darüber hinaus
ist es möglich,
eine Gruppe einmaliger DBL "wiederzuverwenden", da die Größe des Feldes
durch die Anzahl an einmaligen Dekodierungs-Bindungsliganden bestimmt wird, um eine
größere Anzahl
an Teststellen zu ermöglichen.
Dies kann auf verschiedene Weisen erfolgen; beispielsweise indem
einige Unterpopulationen verwendet werden, die optische Signaturen
umfassen; auf ähnliche
Weise, indem ein positionelles Kodierungsschema innerhalb eines
Feldes verwendet wird, wobei unterschiedliche Unter-Bündel die Gruppe
der DBL wiederverwenden können. Ähnlich wird
in einer Ausführungsform
die Perlengröße als Kodierungsmodalität verwendet,
wodurch die Wiederverwendung der Gruppe einmaliger DBL für jede Perlengröße ermöglicht wird.
Alternativ dazu kann das sequentielle teilweise Befüllen der
Felder mit Perlen ebenfalls die Wiederverwendung von DBL ermöglichen.
Zudem kann es zum "Teilen
von Codes" kommen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
können
die DBL wiederverwendet werden, indem einigen Perlen-Unterpopulationen
optische Signaturen verliehen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die optische Signatur im Allgemeinen ein Gemisch von, vorzugsweise
fluoreszierenden, Reporterfarbstoffen. Indem sowohl die Zusammensetzung
des Gemischs (nämlich
das Verhältnis
zwischen den Farbstoffen) als auch die Konzentration des Farbstoffs
(was zu unterschiedlichen Signalintensitäten führt) verändert wird, können Matrizen
mit einmaligen optischen Signaturen erzielt werden. Dies kann erfolgen,
indem die Farbstoffe kovalent an die Perlenoberflächen gebunden
werden, oder alternativ dazu, indem die Farbstoffe innerhalb der Perle
eingeschlossen werden. Die Farbstoffe können Chromophore oder Phosphore
sein, wobei sie vorzugsweise fluoreszierende Farbstoffe sind, die
aufgrund der starken Signale ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zum
Dekodieren bereitstellen. Als geeignete Farbstoffe zur Verwendung
in vorliegender Erfindung kommen jene in Frage, die oben zum Markieren
der DBL angeführt
wurden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann das Kodieren in einem Verhältnis
von zumindest zwei Farbstoffen erzielt werden, obgleich mehr Kodierungsdimensionen
beispielsweise in Perlengröße zugesetzt werden
können.
Darüber
hinaus unterscheiden sich die Markierungen voneinander, wodurch
zwei unterschiedliche Markierungen unterschiedliche Moleküle (nämlich zwei
unterschiedliche Fluophore) oder alternativ dazu eine Markierung
mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen oder Intensitäten umfassen
können.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Farbstoffe kovalent an die Perlenoberfläche gebunden. Dies kann, wie
allgemein zur Bindung von bioaktiven Wirkstoffen dargelegt, durchgeführt werden,
und zwar indem auf den Perlenoberflächen funktionelle Gruppen verwendet
werden. Fachleuten ist klar, dass diese Bindungen zur Minimierung
der Wirkung auf den Farbstoff gemacht werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Farbstoffe nichtkovalent an die Perlen gebunden, im Allgemeinen
indem die Farbstoffe in den Perlenporen eingeschlossen werden.
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Zudem
wird das Kodieren in Verhältnissen
von zwei oder mehr Farbstoffen statt einer einzigen Farbstoffkonzentration
bevorzugt, da dies Unempfindlichkeit gegenüber der Lichtintensität, die verwendet
wird, um die Signatur der Reporterfarbstoffe zu erhalten, und Detektorempfindlichkeit
bereitstellt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein räumliches
oder positionelles Kodierungssystem angewandt. In dieser Ausführungsform
werden Unter-Bündel
oder Unterfelder (nämlich
Abschnitte des Gesamtfeldes) verwendet. Analog zum Telefonsys tem
stellt jedes Unterfeld den "Ortscode" dar, das die gleichen
Markierungen (d.h. Telefonnummern) anderer Unterfelder aufweisen
kann, die aufgrund der Position des Unterfeldes getrennt sind. Folglich
kann die Verwendung 50 einmaliger Markierungen in Kombination mit
100 unterschiedlichen Unterfeldern ein Feld mit 5.000 unterschiedlichen
bioaktiven Wirkstoffen ausbilden. In dieser Ausführungsform ist es wichtig,
ein Bündel
von einem anderen zu unterscheiden. Im Allgemeinen erfolgt dies
entweder manuell oder durch die Verwendung von Markierungsperlen;
diese können
Perlen, die für
jedes Unterfeld einmalige Markierungen aufweisen, oder die Verwendung
der gleichen Markierungsperle in unterschiedlichen Mengen oder die
Verwendung zweier oder mehrerer Markierungsperlen in unterschiedlichen
Verhältnissen
umfassen.
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In
alternativen Ausführungsformen
können
zusätzliche
Kodierungsparameter zugesetzt werden, wie z.B. Mikrokügelchengröße. Die
Verwendung von Perlen mit unterschiedlichen Größen kann beispielsweise die Wiederverwendung
von DBL-Gruppen ermöglichen.
Das bedeutet, dass es möglich
ist, Mikrokügelchen
verschiedener Größen zu verwenden,
um die Kodierungsdimensionen der Mikrokügelchen zu erweitern. Es können Glasfaser-Felder
hergestellt werden, die Pixel mit unterschiedlichen Faserdurchmessern
oder Querschnitten aufweisen. Alternativ dazu können zwei oder mehr optische
Faserbündel,
wobei jedes unterschiedliche Querschnitte der einzelnen Fasern aufweist,
zugesetzt werden, um ein größeres Bündel zu
bilden; oder es können
optische Faserbündel
mit Fasern der gleichen Querschnittsgröße, die unterschiedlich große Perlen aufweisen,
verwendet werden. Aufgrund der unterschiedlichen Durchmesser können die
größten Wells
mit den größten Mikrokügelchen
und nach und nach die kleineren Wells mit kleineren Mikrokügelchen
befüllt
werden, bis alle Wellgrößen befüllt sind.
Auf diese Weise konnte das gleiche Farbstoffverhältnis verwendet werden, um die
Mikrokügelchen
mit unterschiedlichen Größen zu kodieren,
wodurch die Anzahl der unterschiedlichen im Feld vorliegenden Oligonucleotidsequenzen
oder chemischen Funktionalitäten
erweitert wurde. Obwohl dieses sowie andere hierin angeführte Verfahren
für Glasfasersubstrate
dargelegt wurden, können
diese mit anderen Substraten sowie mit anderen Bindungsmodalitäten verwendet
werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Kodieren und Dekodieren durch sequentielles Befüllen der
Mikrokügelchen
in das Feld erzielt. Wie oben beim räumlichen Kodieren dargelegt,
können
die optischen Signaturen in dieser Ausführungsform "wiederverwendet" werden. In dieser Ausführungsform
ist die Sammlung der Mikrokügelchen,
die jeweils unterschiedliche bioaktive Wirkstoffe umfasst (oder
die Unterpopulationen weisen jeweils unterschiedliche bioaktive
Wirkstoffe auf), in eine Vielzahl von Unterbibliotheken geteilt. Beispielsweise
können
je nach Größe des gewünschten
Feldes und der Anzahl an einmaligen Markierungen 10 Unterbibliotheken
erstellt werden, die jeweils etwa 10 % der Gesamtbibliothek umfassen,
wobei jede der Unterbibliotheken etwa die gleichen einmaligen Markierungen
umfasst. Sodann wird die erste Unterbibliothek zum optischen Faserbündel, das
die Wells enthält,
zugesetzt und die Position der jeweiligen bioaktiven Wirkstoffe üblicherweise
unter Verwendung von DBL bestimmt. Anschließend wird die zweite Unterbibliothek
zugesetzt und die Position der jeweiligen bioaktiven Wirkstoffe
erneut bestimmt. Das Signal umfasst in diesem Fall das Signal aus
dem "ersten" DBL und dem "zweiten" DBL. Indem die zwei
Matrizen verglichen werden, kann die Position der jeweiligen Perle
in der jeweiligen Unterbibliothek bestimmt werden. Ähnlich ermöglicht die
sequentielle Zugabe einer dritten, vierten etc. Unterbibliothek
die Befüllung
des Feldes.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
können
Codes auf verschiedene Weisen "geteilt" werden. In einer
ersten Ausführungsform
kann ein einziger Code (d.h. IBL-DBL-Paar) zwei oder mehr Wirkstoffen zugeordnet
werden, wenn die Zielanalyten sich ausreichend in ihren Bindungsstärken unterscheiden.
Zwei in einem mRNA-Mengenbestimmungstest
verwendete Nucleinsäure-Sonden
können
beispielsweise den gleichen Code teilen, wenn sich die Bereiche
ihrer Hybridisierungssignalintensitäten nicht überlappen. Dazu kann es kommen,
wenn beispielsweise eine der Zielsequenzen immer in einer viel höheren Konzentration
vorliegt als die andere. Alternativ dazu könnten die zwei Zielsequenzen
immer in ähnlicher
Konzentration, jedoch in unterschiedlichen Hybridisierungseffizienzen
vorliegen.
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Alternativ
dazu kann ein einziger Code einer Vielzahl von Wirkstoffen zugeordnet
werden, wenn die Wirkstoffe funktionell gleichwertig sind. Wenn
beispielsweise eine Gruppe von Oligonucleotid-Sonden den gemeinsamen
Zweck zur Detektion bestimmter Gene aufweisen, sind die Sonden funktionell
gleichwertig, auch wenn diese eine unterschiedliche Sequenz aufweisen
können. Ähnlich könnten alle
Sonden unterschiedlicher Elemente einer Klasse, wie etwa Kinasen
oder G-Protein-gebundene Rezeptoren einen Code teilen, wenn Klassen
oder "Familien" von Analyten gewünscht sind. Ähnlich könnte ein
Feld von diesem Typ verwendet werden, um Homologe bekannter Gene
zu detektieren. In dieser Ausführungsform
wird jedes Gen durch eine heterologe Gruppe von Sonden dargestellt,
die an unterschiedliche Bereiche des Gens hybridisiert (und sich
somit hinsichtlich Sequenz unterscheidet). Die Sondengruppe teilt
einen gemeinsamen Code. Wenn ein Homolog vorliegt, kann dieses an
einige, jedoch nicht alle Sonden hybridisieren. Der Anteil an hybridisierenden
Sonden sowie die mittlere Hybridisierungsintensität könnten auf
den Grad der Homologie hinweisen. Ähnlich könnten mehrere Antikörper gegen
dasselbe Protein den gleichen Code teilen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Dekodierung der sich selbst organisierenden zufälligen Felder
auf der Basis von pH-Titration durchgeführt. In dieser Ausführungsform
umfassen die Perlen zusätzlich zu
den bioaktiven Wirkstoffen optische Signaturen, worin die optischen
Signaturen durch die Verwendung von auf pH reagierenden Farbstoffen
(manchmal hierin als "pH-Farbstoffe" bezeichnet), wie
etwa Fluorophore, erzeugt werden. Diese Ausführungsform gleicht der in PCT
US98/05025 und der in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 09/151.877
dargelegten Ausführungsform,
die beide ausdrücklich
durch Verweis aufgenommen sind, mit der Ausnahme, dass die in der
vorliegenden Erfindung verwendeten Farbstoffe Änderungen der Fluoreszenzintensität (oder
anderer Eigenschaften) aufweisen, wenn der pH der Lösung von
unter dem pKa-Wert bis über
den pKa-Wert (oder umgekehrt) eingestellt wird. In einer bevorzugten
Ausführungsform
wird eine Gruppe von pH-Farbstoffen verwendet, wobei jeder einen
unterschiedlichen pKa-Wert aufweist, vorzugsweise durch zumindest
0,5 pH-Einheiten getrennt. In bevorzugten Ausführungsform wird eine pH-Farbstoffgruppe
mit pKa-Werten von 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0,
6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11 und 11,5 verwendet.
Jede Perle kann jede beliebige Untergruppe von pH-Farbstoffen aufweisen, und
auf diese Weise wird ein einmaliger Code für den bioaktiven Wirkstoff
erzeugt. Folglich wird das Dekodieren eines Feldes durch Titration
des Feldes von einem pH-Wert
von 1 bis 13 und dem Messen des Fluoreszenzsignals aus jeder Perle
als Funktion des pH-Werts der Lösung
erzielt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
gibt es zusätzliche
Möglichkeiten,
die Anzahl an einmaligen oder bestimmten Markierungen zu erhöhen. Das
bedeutet, der Einsatz von bestimmten Merkmalen auf jeder Perle kann
dazu verwendet werden, die Anzahl der Codes zu erhöhen. Zudem
ermöglicht
das sequentielle Dekodieren eine Wiederverwendung der Codes auf
neue Weise. Diese Merkmale sind unabhängig voneinander, was ein exponentielles
Wachstum der Anzahl an Codes als Funktion der Anzahl an Dekodierungsschritten
und der Anzahl an Merkmalen (z.B. bestimmte Codes) ermöglicht.
Indem jedoch die Menge der in einem einzigen Dekodierungsschritt
erhaltenen Dekodierungsinformation erhöht wird, kommt es zu einer
deutlichen Verringerung der Anzahl an Dekodierungsschritten. Alternativ
dazu wird die Anzahl an bestimmten Codes deutlich erhöht. Indem
die Anzahl an Merkmalen pro Dekodierungsschritt erhöht wird,
werden weniger Dekodierungsschritte für eine bestimmte Anzahl an
Codes erforderlich. Somit werden in einer bevorzugten Ausführungsform eine
Reihe von Verfahren verwendet, um eine Anzahl von Codes zur Verwendung
bei der Dekodierung der Felder zu bilden, während die erforderlichen Dekodierungsschritte
minimiert werden. Es kann beispielsweise eine Reihe von unterschiedlichen
Kodierungsstrategien kombiniert werden: somit können unterschiedliche "Farben", Farbkombinationen
("Farbtöne"), unterschiedliche
Intensitäten
der Farben oder Farbtöne
oder beides etc. kombiniert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
stützen
sich die DBL auf die Bindung oder Einbettung einer quantitativen
oder diskreten Gruppe physikalischer Merkmale an die Perle; d.h.
Markierung der Perle. Bevorzugte physikalische Merkmale einer Perle
umfassen, jedoch nicht ausschließlich: Oberflächen-"Glätte" oder -"Rauheit", Farbe (fluoreszierend
oder anders), Farbintensität,
Größe, detektierbare
chemische Gruppierungen, chemisches Reaktionsvermögen, Magnetisierung,
pH-Empfindlichkeit, Energietransfereffizienz zwischen vorliegenden
Farbstoffen, Hydrophobie, Hydrophilie, Absorptionsvermögen, Ladung,
pH-Empfindlichkeit etc.
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Ein
Perlendekodierungsschema umfasst das Zuweisen bzw. Verleihen eines
einzigen quantifizierbaren Merkmals zu bzw. an jedem/jeden Perlentyp,
worin sich jeder Perlentyp hinsichtlich quantifizierbarem Wert dieses
Merkmals unterscheidet. Beispielsweise kann eine bestimmte Anzahl
an Fluorophoren an eine Perle gebunden werden und die Anzahl an
gebundenen Fluorophoren im Dekodierungsverfahren quantifiziert werden.
In der Praxis erweist sich die Bindung einer "bestimmten Menge" eines Merkmals an eine Perle und das genaue
Messen des Merkmals jedoch als problematisch. Im Allgemeinen ist
das Ziel, den Variationskoeffizienten (CV) zu reduzieren. Unter
Variationskoeffizient wird die Variabilität bei der Markierung einer
Perle bei nacheinander stattfindenden Markierungen verstanden. Dieser
CV kann bestimmt werden, indem Perlen mit einer definierten bestimmten
Anzahl an Markierungen (z.B. Fluorophor) in mehrfachen Tests markiert
werden und das von der Perle emittierte Signal gemessen wird. Ein
hoher CV schränkt
die Anzahl an verwendbaren und auflösbaren "Graden" für
jedes beliebige Merkmale ein.
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In
einem robusteren Dekodierungsschema werden eher ratiometrische als
absolute Messungen zur Segmentierung eines quantitativen Merkmals
in Codes angewandt. Unter ratiometrischer Dekodierung wird das Markieren
einer Perle mit einem Markierungsverhältnis (nämlich 1:10, 1:1 und 10:1) verstanden.
Theoretisch kann eine beliebige Anzahl an Verhältnissen verwendet werden,
sofern die Differenz der Signale zwischen den Verhältnissen
detektierbar ist. Dieses Verfahren führte zu einem geringeren CV
und ermöglichte eine
höhere
Merkmalssegmentierung innerhalb eines bestimmten dynamischen Bereichs.
Somit reduziert in einer bevorzugten Ausführungsform die Verwendung von
ratiometrischer Dekodierung den Variationskoeffizienten.
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Darüber hinaus
kann das ratiometrische Dekodieren, wie Fachleuten klar ist, auf
unterschiedliche Weise durchgeführt
werden. Statt eine bestimmte Anzahl an DBL mit einer ersten Farbstoffintensität (oder
einer Farbstoffkombinationsintensität) in der ersten Dekodierungsreaktion
und eine zweite Anzahl mit einer zweiten Farbstoffintensität in der
sequentiellen zweiten Dekodierungsreaktion zuzusetzen, kann in dieser
Ausführungsform
diese ratiometrische Analyse unter Verwendung eines Verhältnisses
von markierten:unmarkierten DBL erfolgen. Das bedeutet, dass bei
einer vorbestimmten gesättigten
Konzentration von Dekodierungs-Perlen, z.B. 100.000 DBL pro Reaktion,
der erste Intensitätsdekodierungsschritt
erfolgen kann, indem 100.000 markierte DBL zugesetzt werden, und
der zweite Schritt wird durchgeführt,
indem 10.000 markierte DBL und 90.000 unmarkierte DBL zugesetzt
werden. Das Gleichgewicht bestimmt, dass der zweite Schritt ein
Zehntel der Signalintensität
ergeben wird.
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Aufgrund
der Streuung der Werte eines quantitativ gemessenen Merkmalswerts
ist die Anzahl an bestimmten Codes praktisch auf weniger als ein
Dutzend oder so Codes eingeschränkt.
Indem eine Perle der Reihe nach mit unterschiedlichen Merkmalswerten "bemalt" (d.h. an die Perle
wird temporär
ein Merkmalsgrad gebunden) und "abgezogen" (Entfernung der
Merkmalsgrade) wird, wächst
die Anzahl an möglichen
Codes exponentiell mit der Anzahl der sequentiellen Phasen im Dekodierungsverfahren.
-
Ein
Beispiel zur Veranschaulichung: beispielsweise 9 unterschiedliche
Perlentypen und drei unterscheidbare Merkmalsverteilungen (Tabelle
1). Das "Bemalen" (Markieren) der
Perlen mit unterschiedlichen Merkmalswerten in einer bestimmten
kombinatorischen Struktur in den zwei unterschiedlichen Phasen ergibt für jeden
Perlentyp einen einmaligen Code, d.h. es kommt zu neun unterschiedlichen
Codes. Somit werden in einer bevorzugten Ausführungsform die Perlen mit unterschiedlichen
Merkmalen in einer bestimmten kombinatorischen Struktur in einer
Vielzahl von Schritten markiert. Dies erzeugt einmalige Codes für jeden
Perlentyp. Beispiele für
die unterschiedlichen Merkmale sind oben beschrieben. Das Markieren
der Perlen mit unterschiedlichen Merkmalen wird mittels Verfahren
durchgeführt,
die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
-
-
- Anzahl der einmaligen Codes = Anzahl der Merkmale^Anzahl
der Phasen
-
Tabelle
1 Sequentielle Dekodierung führt
zu einmaligen Codes unter Verwendung einer geringen Anzahl an Merkmalsgraden.
-
Fluoreszierende
Farben stellen ein insbesondere geeignetes Merkmal bei der Verwendung
in einem Dekodierungsschema dar. Fluoreszierende Farben können an
jeden beliebigen Wirkstoff, der einen IBL erkennt, gebunden werden,
um einen markierten DBL zu bilden. Die Diskussion richtet sich dabei
auf Oligonucleotide (einschließlich
Nucleinsäureanaloga)
als DBL. Ein fluoreszierend markiertes Oligonucleotid ist ein insbesondere
geeigneter DBL, da es jede beliebige gewünschte Perlen-Untergruppe mit einer
bestimmten Farbe spezifisch und reversibel, einfach mittels Hybridisierung
und Dehybridisierung (und zwar an den DBL mit einer komplementären Seguenz) "bemalen" kann. Zudem kann
Fluoreszenz unter Verwendung von optischer Standardhardware und
-software einfach sichtbar gemacht und quantifiziert werden. Um
einen bestimmten Perlentyp mit einer bestimmten Farbe zu "bemalen", muss der Perlentyp
mit einer einmaligen hybridisierbaren DNA-Sequenz (IBL) markiert
werden, und die Dekodierungslösung
muss das farbmarkierte Komplement jener Sequenz enthalten.
-
Eine Überlegung
zur Durchführung
eines Dekodierungsschemas umfasst die Minimierung der Anzahl an
erhaltenen Abbildungen. In einem farbbasierten Schema stellt die
Anzahl an erhaltenen Abbildungen das Produkt der Anzahl an Farben
und der Anzahl an Phasen dar. Die Anzahl an Abbildungen kann reduziert
werden, indem eine Perle für
jede bestimmte Phase mit mehreren Farben "bemalt" wird. Indem einer Perle mehrere Farben
zugewiesen werden, wird die Anzahl an effektiven Codes erhöht. Beispielsweise
kann in einem bei Computern angewandten Farbverfahren mittels 24-Bit-Dreifarbenschema
(z.B. rot, grün,
blau) eine Gesamtzahl von 256·256·256 =
16,7 Millionen unterschiedlichen "Farbtönen" aus nur drei Farben (rot, grün, blau) erzielt
werden.
-
Somit
werden die DBL in einer bevorzugten Ausführungsform mit einer Kombination
aus gefärbten Fluorophoren
markiert. Als solches wird dieses Verfahren zur Erhöhung der
Anzahl an verfügbaren
Codes zur Markierung von DBL unter Verwendung von nur einer handvoll
unterschiedlicher Farbstoffe (Farben) eingesetzt. Die Erhöhung der
Anzahl an verfügbaren
Codes bei jedem Dekodierungsschritt erhöht stark die Anzahl an Dekodierungsschritten,
die in einem bestimmten Dekodierungsverfahren erforderlich ist.
-
In
einer Ausführungsform
wird die Oligonucleotid-Population, die für einen einzigen DBL kodiert,
mit einem definierten Verhältnis
von Farben so markiert, dass jede Perle, an die sich der DBL bindet,
bezogen auf einen charakteristischen "Farbton", der aus der Kombination der gefärbten Fluorophore
formuliert ist, identifiziert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform
werden zwei unterschiedliche Farben verwendet. In einer bevorzugten
Ausführungsform
sind drei oder mehr bestimmte Farbstoffe (Farben) zur Verwendung
verfügbar.
In diesem Fall beträgt
die Anzahl an unterscheidbaren Codes, die durch Markieren einer
Oligonucleotid-Population, die für
einen einzelnen DBL kodiert, mit einer beliebigen Farbe gebildet
werden, drei. Indem jedoch das Kombinieren von Farben und Farbgraden
beim Markieren zugelassen wird, können viel mehr Codes hergestellt
werden.
-
Zum
Dekodieren mittels Hybridisierung beträgt die bevorzugte Anzahl an
unterscheidbaren Farbschattierungen 2 bis 2.000, wobei eine bevorzugtere
Anzahl an unterscheidbaren Farbschattierungen 2 bis 200 und eine
insbesondere bevorzugte Anzahl an unterscheidbaren Farbschattierungen
2 bis 20 beträgt.
Indem drei unter schiedliche Farbschattierungen (Intensitäten) und
drei Farben verwendet werden, beträgt die Anzahl der unterschiedlichen
Farbtöne
34 = 81. Das Kombinieren des Farbstoffs
mit sequentieller Dekodierung ermöglicht die Bildung einer praktisch
uneingeschränkten
Anzahl an Codes.
-
Wie
zuvor beschrieben, kann der DBL jeder beliebigen Wirkstoff sein,
der sich an den IBL bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein einziger DBL mit einem vorbestimmten Farbenverhältnis markiert. Dieses
Verhältnis
wird bei jedem DBL variiert, was einen einmaligen "Farbton" für jeden
so markierten DBL ermöglicht.
Nach Behandlung der Perlen mit dem DBL wird die Perle analysiert,
um den mit jeder Perle assoziierten "Farbstoff' zu analysieren, wodurch die Perle mit
ihrem assoziierten bioaktiven Wirkstoff identifiziert wird.
-
Beispielsweise
sind mit vier Grundfarben und zwei Intensitätsgraden (Farbe ist anwesend
oder abwesend) fünfzehn
unterschiedliche Farbtöne
bzw. Phasen möglich.
Wenn vier Farbstoffe und drei unterschiedliche Intensitätsgrade
verwendet werden (abwesend, halb anwesend, ganz anwesend), sind
73 unterschiedliche Farbtöne
bzw. Phasen möglich.
In diesem Fall reicht der Erhalt von 4 Farbabbildungen aus, um Informationen über 73 unterschiedliche
Kodierungsfarbtöne
zu erhalten.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung Feldanordnungen bereit, die ein erstes
Substrat enthalten, wobei eine Oberfläche diskrete Stellen aufweist.
In bevorzugten Ausführungsformen wird
eine auf den Stellen verteilte Mikrokügelchen-Population verwendet,
wobei die Population zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation
umfasst. Jede der Unterpopulationen umfasst einen bioaktiven Wirkstoff und
zusätzlich
zumindest einen optischen Farbstoff mit einem bestimmten pKa-Wert.
Die pKa-Werte unterschiedlicher optischer Farbstoffe unterscheiden
sich voneinander.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
gibt es mehrere Verfahren, die zum Dekodieren der Felder herangezogen
werden können,
wenn das Feld beispielsweise klonierte Nucleinsäuren umfasst. In einer bevorzugten
Ausführungsform
können,
wie hierin dargelegt, bei vorhandener Sequenzinformation über die
klonierten Nucleinsäuren
spezifische Dekodierungs-Sonden hergestellt werden.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
können "zufällige" Dekodierungs-Sonden
hergestellt werden. Durch wie oben dargelegte sequentielle Hybridisierungen
oder durch die Verwendung von mehreren Markierungen kann eine einmalige
Hybridisierungsstruktur für
jedes Sensorelement erzeugt werden. Dies ermöglicht, dass alle Perlen, die
einen bestimmten Klon repräsentieren,
als zur gleichen Gruppe gehörend
identifiziert werden. Im Allgemeinen wird dies unter Verwendung
von zufälligen
oder teilweise degenerierten Dekodierungs-Sonden vorgenommen, die
sich auf sequenzabhängige,
jedoch nicht sonderlich sequenzspezifische Weise binden. Das Verfahren
kann mehrere Male wiederholt werden, wobei jedes Mal eine unterschiedliche Markierungsentität verwendet
wird, um eine unterschiedliche Signalstruktur, bezogen auf die quasispezifischen
Wechselwirkungen, zu erzeugen. Auf diese Weise baut sich für jedes
Sensorelement nach und nach eine einmalige optische Signatur auf.
Indem die optischen Signaturen einer Strukturwiedererkennung oder Clustering-Algorithmen unterzogen
werden, können
die Perlen in Gruppen eingeteilt werden, die die gleiche Signatur
aufweisen (d.h. die gleiche Sonde tragen).
-
Zur
Identifizierung der eigentlichen Klonsequenz sind zusätzliche
Verfahren erforderlich; beispielsweise kann eine direkte Sequenzierung
durchgeführt
werden. Indem ein geordnetes Feld verwendet wird, das die Klone
aufweist, wie z.B. ein spotted-cDNA-Feld,
kann ein "Schlüssel" erstellt werden,
der eine Hybridisierungsstruktur mit einem spezifischen Klon verbindet,
dessen Position in der Gruppe bekannt ist. Auf diese Weise kann
der Klon gewonnen und weiter charakterisiert werden.
-
Alternativ
dazu können
Klonfelder unter Verwendung von binärem Dekodieren mit Vektormarkierungen
dekodiert werden. Beispielsweise werden teilweise randomisierte
Oligos in einen Nucleinsäurevektor
(z.B. Plasmid, Phage etc.) kloniert. Jede Oligonucleotidsequenz
besteht aus einer Untergruppe aus einer limitierten Gruppe von Sequenzen.
Wenn beispielsweise die limitierte Gruppe 10 Sequenzen umfasst,
kann jedes Oligonucleotid einige (oder ale 10) Untergruppensequenzen
aufweisen. Somit kann im Oligonucleotid jede der 10 Sequenzen vorliegen
oder abwesend sein. Deshalb gibt es 210 oder
1.024 mögliche
Kombinationen. Die Sequenzen können
sich überlappen,
und kleine Varianten können
ebenfalls vorliegen (z.B. A-, C-, T- und G-Substitutionen), um die Anzahl an möglichen
Kombinationen zu erhöhen.
Eine Nucleinsäurebibliothek
wird in einen Vektor kloniert, der die zufälligen Codesequenzen enthält. Alternativ
dazu können
zur Zugabe der Markierungen andere Verfahren, wie etwa PCR, angewandt
werden. Auf diese Weise ist es möglich,
eine geringe Anzahl Oligo-dekodierender Sonden zur Dekodierung eines
Klonfeldes zu verwenden.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden Diskriminanzanalysen, Clusteralgorithmen und Computervorrichtungen
zur Analyse der Dekodierungs-Daten aus den erfindungsgemäßen Feldern
verwendet. Die potentiell große
Anzahl an in dieser Erfindung verwendeten Codes erfordert zusammen
mit der Verwendung unterschiedlicher Intensitäten und "Farbtönen" von Fluorophoren in Mehrschrittdekodierungsverfahren
eine gute Klassifizierung der Daten. Die Daten, insbesondere die
Intensitätsdaten,
werden in einem Mehrschrittverfahren erhalten, bei dem die Perlen
reversibel markiert werden (beispielsweise durch Hybridisieren von
farbstoffmarkierten komplementären
Dekodierungs-Oligonucleotiden an die IBL-Sonden auf den Perlen oder durch
die Bildung von Bindungsligandenpaaren für Nichtnucleinsäure-IBL-DBL-Paare), wobei in
jeder Phase unterschiedliche Farben oder Farbengemische ("Farbtöne") eingesetzt werden.
Die Herausforderung liegt darin, eine Perle hinsichtlich der Farbe,
mit der sie bei den jeweiligen Schritten bemalt wurde, genau zu
klassifizieren. Je näher
die Markierungen miteinander verwandt sind (wie mittels optischem
Abbildungssystem bestimmt), desto schwieriger wird die Klassifizierung.
-
Die
Nähe der
Farbstoffe, wie durch das Abbildungssystem dargestellt, wird durch
die spektralen Eigenschaften der Dekodierungs-Farbstoffe und die
spektrale Kanaltrennung des Abbildungssystems bestimmt. Eine bessere
Farbtrennung wird durch Anwendung fluoreszierender Farbstoffe mit
engem Emissionsspektrum erzielt und indem ein optisches System mit
engem Bandpassanregungs- und -emissionsfilter angewandt wird, der
so konstruiert ist, dass der Farbstoff "auf dem Peak" angeregt und dessen Emission "auf dem Peak" gemessen wird. Das
Verfahren der optischen Ab bildung der Farbstoffe auf den Perlen
gleicht dem menschlichen Sehprozess, worin das Gehirn Farbe durch
Messung des Anregungsverhältnisses
in den drei unterschiedlichen Zapfentypen im Auge erfasst. Bei einem
optischen Abbildungssystem ist die Anzahl an praktischen Farbkanälen jedoch
viel größer als
die drei im menschlichen Auge vorliegenden. Abbildungssysteme auf
CCD-Basis können
Farbe in einem Bereich von 350 nm bis 850 nm "sehen", während
die Zapfen im Auge auf das sichtbare Spektrum von 500 bis 600 nm
eingestellt sind.
-
Das
Problem beim Dekodieren von Perlen-Feldern ist im Wesentlichen ein
Problem, das die Diskriminanzanalyseklassifizierung umfasst. Folglich
wird in einer bevorzugten Ausführungsform
eine Varianzanalyse in einem hyperspektralen Alpha-Raum auf einer
bekannten Gruppe von Perlenfarben oder -farbtönen durchgeführt. Das
Zentrum der Perlen-Cluster im Alpha-Raum werden als Zentren der
Cluster bezeichnet, und die Streuung der Punkte innerhalb eines
Clusters bestimmt die Cluster-Streuung.
Ein robustes Klassifizierungsschema erfordert, dass die Distanz
zwischen den Zentren der unterschiedlichen Perlenklassen (Farbtöne) viel größer als
die Streuung einer beliebigen Cluster-Klasse ist. Zudem sollte die
Position der Zentren von Faser zu Faser und von Versuch zu Versuch
invariant bleiben.
-
Folglich
wird in einer bevorzugten Ausführungsform
die Farbton-"Zone" als ein Bereich
im Alpha-Raum definiert, der das Farbtonzentrum umgibt und sich
auf den Streuungsradius des Clusters ausweitet. Durch Angabe einer
Referenzgruppe von Farbtonzentren und Streuungsradien, die empirisch
bestimmt werden, kann die Klassifizierung einer neuen Datengruppe
vorgenommen werden, indem die Fragestellung lautet, ob ein bestimmter
Perlenpunkt am nächsten
zur oder in die "Zone" eines Farbton-Clusters
fällt.
Dies wird erreicht, indem die Mahalanobis-Distanz des Perlenpunkts
aus den Zentren der unterschiedlichen Farbtonklassen berechnet wird
(in diesem Fall einfach eine euklidische Distanzmetrik). Für die in 3 angeführten Daten ist
die Position der Zentren und deren Distanzen voneinander in Tabelle
2 angeführf.
-
-
Zur
Klassifizierung der unterschiedlichen Perlen in eine bestimmte Farbtonklasse
wurde ein euklidischer Distanz-Cut-Off von 0,3 gewählt. Die
am nähesten
beieinander liegenden Zentren, Bod-R6G und Bod-564 (Distanz = 0,55),
weisen in ihren Dekodierungs-Zonen bei der Verwendung einer euklidischen
Distanz oder einer Mahalanobis-Distanz von 0,3 eine leichte Überlappung
auf. Eine Verbesserung der Klassifizierung kann erzielt werden,
indem diese Distanz verringert wird und indem die unterschiedlichen
Koordinatenachsen passend gewichtet werden.
-
Demzufolge
stellt die vorliegende Erfindung Computerverfahren zur Analyse und
Klassifizierung von Perlenfarben bereit. Die Klassifizierung der
Farbe einer Perle wird durchgeführt,
indem die Perle in einem hyperspektralen "Alpha"-Raum (a1 =
I1/Sl1, a2 = I2/Sli, a3 = I3/Sli etc.) geprüft wird,
worin jede Koordinatenachse den Abschnitt der Perlenintensität innerhalb
eines bestimmten Abbildungskanals darstellt. Wenn beispielsweise
vier Abbildungskanäle
zur Abbildung der Perlen verwendet werden, kann die Farbe oder der
Farbton einer Perle mittels eines Punktes im dreidimensionalen Alpha-Raum
dargestellt werden (die vierte Dimension ist nicht erforderlich,
da Sai = 1). Wenn eine Gruppe unterschiedlicher
Grundfarbstoffe vorliegt, mit denen die Perlen markiert werden,
ist die Anzahl der aus diesen Farbstoffen erzielten Farbtöne uneingeschränkt, da
die Farbstoffe in veränderlichen
Verhältnissen
und in veränderlichen
kombinatorischen Strukturen kombiniert werden können. Die Anzahl der geeigneten
Farbtöne
wird experimentell mittels Trennung der unterschiedlichen Farbton-Cluster
im hyperspektralen Alpha-Raum bestimmt.
-
3 umfasst
eine graphische Darstellung des hyperspektralen Alpha-Raums von
Perlen, die mit vier unterschiedlichen Farbtönen markiert sind, die in vier
getrennten Abbildungskanälen
abgebildet sind. Es wird angemerkt, dass die Perlen vier unterschiedliche
Cluster bilden. Die Tatsache, dass diese vier Cluster gut getrennt
sind, ermöglicht
die Durchführung
eines robusten Dekodierungsklassifikationsschemas.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine Qualitätskontrolle-Analyse
des Dekodierungsverfahrens vorgenommen. Dies wird erreicht, indem
in jeder Dekodierungsphase eine Cluster-Analyse des Alpha-Raums
durchgeführt
wird. Die Anzahl der bestimmten Cluster wird durch die erwartete
Anzahl an Farbtönen
fixiert. Die Positionen der Cluster-Zentren wird überwacht
und jegliche Abweichungen von der erwarteten Position aufgezeichnet.
-
Folglich
stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zum Dekodieren
von erfindungsgemäßen Feldern
bereit. Zusätzlich
zu den hierin angeführten
Anordnungen umfasst die Vorrichtung eine zentrale Verarbeitungseinheit,
die mit einem Speicher und einer Gruppe von Eingabe/Ausgabegeräten (z.B.
Tastatur, Maus, Monitor, Drucker etc.) mittels Bus kommuniziert.
Die allgemeine Wechselwirkung zwischen einer CPU, einem Speicher,
Eingabe/Ausgabegeräten
und einem Bus ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Ein Aspekt
der vorliegenden Erfindung betrifft das im Speicher gespeicherte
hyperspektrale "Alpha"-Raum-Klassifizierungssystem.
-
Das
Klassifizierungssystemprogramm umfasst ein Datenerwerbsmodul, das
Daten aus dem optischen Leser oder dem Konfokalmikroskop (oder anderen
Abbildungssystem) erhält.
Im Allgemeinen umfasst das Klassifizierungsprogramm auch ein Analysemodul,
das die Varianz im hyperspektralen Alpha-Raum analysieren, die Zentren
der Cluster berechnen, die Streuung der Cluster (Abweichung) berechnen
sowie die Farbtonzone und den Distanz-Cut-Off definieren kann. Im
Allgemeinen bestimmt das Analysemodul durch Ermittlung der Mahalanobis-Distanz
außerdem,
ob ein Datenpunkt in die Farbtonzone fällt.
-
Zuletzt
analysiert das Analysemodul die unterschiedliche sequentielle Dekodierungsinformation,
um der Perlenposition schließlich
ihren bioaktiven Wirkstoff zuzuordnen.
-
Auf
diese Weise werden sequentielle Dekodierungsschritte durchgeführt, wobei
in jedem Schritt Diskriminanzanalyseberechnungen verwendet werden,
um den jeweiligen Perlen im Feld in jedem Schritt einen Farbton-Cluster
zuzuordnen. Der Aufbau der sequentiellen Dekodierungsinformation
ermöglicht
eine Wechselbeziehung zwischen der Perlen-Position und der darin
enthaltenen Chemie.
-
Bei
Fertigstellung werden die Anordnungen der vorliegenden Erfindung
in einer Reihe von Anwendungen eingesetzt. In einer bevorzugten
Ausführungsform
werden die Anordnungen verwendet, um eine Probenlösung auf
Gegenwart oder Abwesenheit eines Zielanalyten zu untersuchen, einschließlich der
Quantifizierung der an Zielanalyten vorliegenden Menge. Unter "Zielanalyt" oder "Analyt" oder grammatikalischen
Entsprechungen davon werden beliebige Atome, Moleküle, Ionen,
Molekülionen,
Verbindungen oder Teilchen verstanden, die entweder detektiert oder
für Bindungspartner
bewertet werden. Fachleuten ist klar, dass in der vorliegenden Erfindung
eine große
Anzahl an Analyten verwendet werden kann; im Grunde kann jeder beliebige Zielanalyt
verwendet werden, der einen bioaktiven Wirkstoff bindet oder für den ein
Bindungspartner (z.B. Arzneimittelkandidat) gesucht wird.
-
Geeignete
Analyten umfassen organische und anorganische Moleküle, einschließlich Biomoleküle. Bei
erfolgter Detektion eines Zielanalyten umfassen geeignete Zielanalyten,
jedoch nicht ausschließlich,
einen Umweltschadstoff (einschließlich Pestizide, Toxine etc.);
eine Chemikalie (einschließlich
Lösungsmittel,
Polymere, organische Materialien etc.); therapeutische Moleküle (einschließlich Therapeutika
und Drogen, Antibiotika etc.); Biomoleküle (einschließlich Hormone,
Cytokine, Proteine, Nucleinsäuren,
Lipide, Kohlenhydrate, Zellmembranantigene und -rezeptoren (neurale
und hormonale Rezeptoren sowie Nährstoff-
und Zelloberflächenrezeptoren)
oder deren Liganden etc.); ganze Zellen (einschließlich prokaryotische
(wie z.B. pathogene Bakterien) und eukaryotische Zellen, einschließlich Säugetiertumorzellen);
Viren (einschließlich
Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, Lentiviren etc.); und Sporen;
etc. Insbesondere bevorzugte Analyten umfassen Nucleinsäuren und
Proteine.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Zielanalyt ein Protein. Fachleuten ist klar, dass es eine große Anzahl
an möglichen
proteinhältigen
Zielanalyten gibt, die unter Verwendung vorliegender Erfindung für Bindungspartner
detektiert oder überprüft werden
können.
Geeignete Proteinzielanalyten umfassen, jedoch nicht ausschließlich, (1)
Immunoglobine; (2) Enzyme (und andere Proteine); (3) Hormone und
Cytokine (wovon viele als Liganden für zelluläre Rezeptoren dienen); und
(4) andere Proteine.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Zielanalyt eine Nucleinsäure.
Diese Tests kommen in einer Vielzahl von Anwendungen zum Einsatz.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Sonden zur genetischen Diagnose verwendet. Sonden können beispielsweise
unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren erstellt werden,
und zwar zur Detektion von Zielsequenzen, wie z.B. des Gens für nicht-polypösen Dickdarmkrebs,
des BRCA1-Brustkrebsgens, P53, ein mit einer Vielzahl von Krebsen
in Verbindung gebrachtes Gen, des Apo-E4-Gens, das auf ein größeres Risiko
für eine
Alzheimer-Erkrankung hinweist, wodurch ein einfaches präsymptomatisches
Screening von Patienten ermöglicht
wird, sowie zur Detektion von Mutationen im Gen für zystische
Fibrose, in Zytochromen-P-450 oder anderen auf dem Gebiet der Erfindung
allgemein bekannten.
-
In
einer zusätzlichen
Ausführungsform
erfolgt die virale und bakterielle Detektion unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Komplexe.
In dieser Ausführungsform
sind die Sonden so konstruiert, dass sie Zielsequenzen aus einer
Vielzahl von Bakterien und Viren detektieren. Beispielsweise stützen sich
gegenwärtige Blut-Screening-Verfahren auf die
Detektion von Anti-HIV-Antikörpern.
Die hierin offenbarten Verfahren ermöglichen ein direktes Screening
von klinischen Proben, um HIV-Nucleinsäuresequenzen zu detektieren,
insbesondere hochkonservierte HIV-Sequenzen. Zudem ermöglicht dies
eine direkte Überwachung
des zirkulierenden Virus in Patienten als verbessertes Verfahren
zur Beurteilung der Wirksamkeit von antiviralen Therapien. Ähnlich können mit
Leukämie
in Verbindung gebrachte Viren, HTLV-I und HTLV-II, auf diese Weise
detektiert werden. Bakterielle Infektionen, wie z.B. Tuber kulose,
Chlamydia und andere sexuell übertragene
Krankheiten, können
ebenfalls detektiert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
kommen die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren als
Sonden für toxische
Bakterien beim Screening von Wasser und Lebensmittelproben zum Einsatz.
Beispielsweise können Proben
zur Lyse von Bakterien behandelt werden, um deren Nucleinsäure freizusetzen,
und Sonden können zur
Erkennung von bakteriellen Strängen
konstruiert sein, einschließlich,
jedoch nicht ausschließlich,
solcher pathogener Stränge,
wie z.B. Salmonella, Campylobacter, Vibrio cholerae, Leishmania,
enterotoxischer Stränge
von E. coli, und Bakterien der Legionärskrankheit. Auf ähnliche
Weise können
Strategien der biologischen Sanierung unter Verwendung von Zusammensetzungen
der Erfindung beurteilt werden.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
werden die Sonden für
forensische "DNA-Fingerabdrücke" verwendet, um die
DNA am Tatort mit den von Opfern und Verdächtigen entnommenen Proben
zu vergleichen.
-
In
einer zusätzlichen
Ausführungsform
werden die Sonden in einem Feld zur Sequenzierung mittels Hybridisierung
verwendet.
-
Die
vorliegende Erfindung findet auch Anwendung als Methodik zur Detektion
von Mutationen oder fehlenden Übereinstimmungen
bei Zielnucleinsäuresequenzen.
In jüngster
Zeit lag der Forschungsschwerpunkt in der Analyse der Beziehung
zwischen genetischer Variabilität
und Phänotyp,
indem polymorphe DNA-Markierungen eingesetzt wurden. Bei vorherigen
Arbeiten wurden kurze tandemartige Wiederholungen (STR) als polymorphe
Positionsmarkierungen verwendet. Der gegenwärtige Schwerpunkt liegt jedoch
in der Verwendung von einfachen Nukleotid-Polymorphismen (SNP),
die bei einer mittleren Häufigkeit
von mehr als 1 pro Kilobase in der menschlichen genomischen DNA
auftreten. Einige SNP, insbesondere jene in und um die Kodierungssequenzen,
können
wahrscheinlich der direkte Grund therapeutisch relevanter Phänotyp-Varianten sein.
Es gibt eine Reihe allgemein bekannter Polymorphismen, die klinisch
wichtige Phänotypen
verursachen; beispielsweise werden die apoE2/3/4-Varianten mit verschiedenen
relativen Risiken für
Alzheimer-Erkrankungen
und andere Erkrankungen (siehe Cordor et al., Science, 261 (1993))
in Verbindung gebracht. Multiplex-PCR-Amplifikationen von SNP-Loci
mit anschließender
Hybridisierung an Oligonucleotid-Felder erwiesen sich als genaue
und verlässliche
Verfahren zur gleichzeitigen Genotypisierung von zumindest Hunderten
von SNP; siehe Wang et al., Science 280, 1077 (1998); siehe auch
Schafer et al., Nature Biotechnology 16, 33–39 (1998). Die Anordnungen
der vorliegenden Erfindung können
leicht für
die Felder nach dem Stand der Technik substituiert werden; insbesondere
sind Einbasenverlängerungen
(SBE) und Pyrosequenzierungsverfahren insbesondere in den Anordnungen
der vorliegenden Erfindung nützlich.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die erfindungsgemäßen Anordnungen
zum Screening von bioaktiven Wirkstoffen verwendet, um einen Wirkstoff
zu finden, der sich an ein Zielmolekül bindet und vorzugsweise die
Funktion eines Zielmoleküls
modifiziert. Wie oben angeführt
und für
Fachleute klar ist, kann eine Vielzahl verschiedener Testformate
durchgeführt
werden. Im Allgemeinen wird der Zielanalyt markiert, für den ein
Bindungspartner erwünscht
wird. Das Binden des Zielanalyten mittels bioaktiven Wirkstoffs
führt,
gefolgt von einer Detektion, zu einem Recruitment der Markierung
zur Perle.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Binden des bioaktiven Wirkstoffes und des Zielanalyten spezifisch.
Das bedeutet, dass der Wirkstoff sich spezifisch an den Zielanalyten
bindet. Unter "spezifisch
Binden" wird hierin
verstanden, dass der Wirkstoff den Analyten binden, und zwar mit
einer Spezifizität,
die ausreicht, um zwischen dem Analyten und anderen Komponenten
oder Verunreinigern der Testprobe zu unterscheiden. Wie Fachleuten
klar ist, ist es jedoch möglich,
Analyten unter Verwendung eines Bindungsverfahrens zu detektieren,
das nicht hochspezifisch ist; beispielsweise können die Systeme unterschiedliche
Bindungsliganden verwenden, z.B. ein Feld mit unterschiedlichen
Liganden, und die Detektion jedes bestimmten Analyten erfolgt mittels
dessen "Signatur" zum Binden an ein
Feld aus Bindungsliganden, ähnlich
der Funktionsweise von "elektronischen
Nasen". Dies eignet
sich insbesondere zur Detektion von chemischen Analyten. Das Binden
sollte ausreichen, um unter den Testbedingungen gebunden zu bleiben,
einschließlich
der Waschschritte, um nichtspezifische Bindungen zu entfernen, obgleich
in einigen Ausführungsformen
die Waschschritte nicht erwünscht
sind, und zwar bei der Detektion von Bindungspartnern mit geringer
Affinität.
In einigen Ausführungsformen,
beispielsweise bei der Detektion von bestimmten Biomolekülen, betragen
die Dissoziationskonstanten des Analyten zum Bindungsliganden weniger
als etwa 10–4 bis
10–6 M–1,
wobei weniger als 10–5 bis 10–9 M–1 bevorzugt
und weniger als 10–7 bis 10–9 M–1 insbesondere
bevorzugt wird.
-
Im
Allgemeinen wird dem Feld eine Probe zugesetzt, die einen Zielanalyten
enthält
(entweder zur Detektion des Zielanalyten oder zum Screening für Bindungspartner
des Zielanalyten), und zwar unter Bedingungen, die sich zum Binden
eines Zielanalyten an zumindest einen der bioaktiven Wirkstoffe
eignen, d.h. im Allgemeinen physiologische Bedingungen. Die Gegenwart
oder Abwesenheit von Zielanalyten wird sodann detektiert. Fachleuten
ist klar, dass dies auf eine Reihe unterschiedlicher Arten, im Allgemeinen
jedoch mittels einer Veränderung
des optischen Signals, erfolgen kann. Diese Veränderung kann mittels vieler
verschiedener Mechanismen stattfinden. Einige Beispiele umfassen
das Binden eines farbstoffmarkierten Analyten an eine Perle, die
Herstellung einer Farbstoffspezies auf oder in der Nähe von Perlen,
die Zerstörung
einer vorliegenden Farbstoffspezies, eine Veränderung der optischen Signatur
nach einer Analytenwechselwirkung mit dem Farbstoff auf der Perle
oder andere optische Abtastverfahren.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
findet die Veränderung
des optischen Signals als Ergebnis des Bindens eines entweder direkt
oder indirekt markierten Zielanalyten mit einer detektierbaren Markierung
statt, die vorzugsweise eine optische Markierung, wie z.B. ein Fluorochrom,
ist. Somit kann bei Verwendung eines proteinhältigen Zielanalyten dieser
beispielsweise entweder direkt mit einem Fluophor oder indirekt,
z.B. durch die Verwendung eines markierten Antikörpers, markiert werden. Ähnlich werden
Nucleinsäuren
einfach mittels Fluorochromen markiert, beispielsweise, wie auf
dem Gebiet der Erfindung bekannt, während der PCR-Amplifikation.
Alternativ dazu kann nach dem Binden der Zielsequenzen ein Hybridisierungsindikator
als Markierung verwendet werden. Hybridisierungsindikatoren binden
sich vorzugsweise an doppelsträngige
Nucleinsäuren, üblicherweise
reversibel. Hybridisierungsindikatoren umfassen Interkalatoren und
kleine Furche und/oder große
Furche bindende Gruppierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform
können
Interkalatoren verwendet werden. Da Interkalationen nur in Gegenwart
von doppelsträngigen
Nucleinsäuren
stattfinden, leuchtet die Markierung in Gegenwart einer Zielhybridisierung
auf. Nach dem Binden des Zielanalyten an einen bioaktiven Wirkstoff
wird an dieser Stelle ein neues optisches Signal erzeugt, das dann
detektiert werden kann.
-
Alternativ
dazu bilden, wie oben erläutert,
Zielanalyten wie z.B. Enzyme eine Spezies, die entweder direkt oder
indirekt optisch detektierbar ist.
-
Zudem
kann eine Veränderung
der optischen Signatur in einigen Ausführungsform die Basis des optischen
Signals darstellen. Beispielsweise kann die Wechselwirkung einiger
chemischer Zielanalyten mit einigen fluoreszierenden Farbstoffen
auf den Perlen das optische Signal verändern, wodurch ein unterschiedliches
optische Signal erzeugt wird.
-
Fachleuten
ist klar, dass die Gegenwart oder Abwesenheit von Zielanalyten in
einigen Ausführungsformen
durch Veränderungen
anderer optischer oder nichtoptischer Signale erzielt werden kann,
einschließlich,
jedoch nicht ausschließlich,
oberflächenverbesserter
Raman-Spektroskopie, Oberflächen-Plasmonresonanz,
Radioaktivität
etc.
-
Die
Tests können,
wie Fachleuten klar ist, unter einer Reihe unterschiedlicher Versuchsbedingungen durchgeführt werden.
Eine Vielzahl anderer Reagenzien kann in den Screeningtests enthalten
sein. Diese umfassen Reagenzien wie Salz, neutrale Proteine, z.B.
Albumin, Detergenzien etc., die verwendet werden können, um
die optimale Protein-Protein-Bindung zu erleichtern und/oder nichtspezifische
Wechselwirkungen oder Hintergrundwechselwirkungen zu reduzieren.
Es können
auch Reagenzien verwendet werden, die herkömmlich die Effizienz von Tests
verbessern, wie z.B. Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel
etc. Das Komponen tengemisch kann in einer beliebigen Reihenfolge
zugesetzt werden, die das erforderliche Binden ermöglicht.
Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, können verschiedene Blockierungs- und
Waschschritte angewandt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden kompetitive Zweifarben-Hybridisierungstests
durchgeführt.
Diese Tests können
auf herkömmlichen
Sandwich-Tests basieren. Die Perlen enthalten eine Einfangsequenz,
die sich auf einer Seite (stromauf oder stromab) des SNP befindet,
um die Zielsequenz einzufangen. Es werden zwei Allel-spezifische
SNP-Sonden, die jeweils mit einem unterschiedlichen Fluorophor markiert sind,
an die Zielsequenz hybridisiert. Der Genotyp kann aus dem Verhältnis der
zwei Signale erhalten werden, wobei die korrekte Sequenz im Allgemeinen
bessere Bindung aufweist. Dies hat den Vorteil, dass die Zielsequenz
an sich nicht markiert werden muss. Zudem bedeutet dies, da die
Sonden konkurrieren, dass die Bindungsbedingungen nicht optimiert
werden müssen.
Unter Bedingungen, bei denen eine fehlgepaarte Sonde stabil gebunden
werden würde,
könnte
diese dennoch von einer gepaarten Sonde ersetzt werden. Deshalb kann
ein kompetitiver Test unter diesen Bedingungen bessere Diskriminierungen
bereitstellen. Da viele Tests parallel durchgeführt werden, können die
Bedingungen nicht für
jede Sonde gleichzeitig optimiert werden. Deshalb kann ein kompetitives
Testsystem verwendet werden, um nichtoptimale Bedingungen bei Fehlpaarung-Unterscheidung
auszugleichen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird unter Verwendung der erfindungsgemäßen Anordnungen eine Didesoxynucleotid-Kettenabbruchssequenzierung
durchgeführt.
In dieser Ausführungsform
wird eine DNA-Polymerase zur Verlängerung eines Primers unter
Einsatz von fluoreszierend markierten ddNTP verwendet. Das 3'-Ende des Primers
befindet sich neben der SNP-Stelle. Auf diese Weise ist die Einbasenverlängerung
komplementär
zur Sequenz an der SNP-Stelle. Indem vier unterschiedliche Fluorophore,
pro Base ein Fluorophor, verwendet werden, kann die SNP-Sequenz durch Vergleich
der vier basenspezifischen Signale ermittelt werden. Dies kann auf
mehrere Arten erfolgen. In einer ersten Ausführungsform kann die Einfangsonde verlängert werden.
Bei dieser Herangehensweise muss die Sonde entweder 5' bis 3' an der Perle synthetisiert oder
an das 5'-Ende gebunden
werden, um eine freies 3'-Ende
zur Polymerasen-Verlängerung
bereitzustellen. Alternativ dazu kann ein Test vom Sandwich-Typ
angewandt werden. In dieser Ausführungsform
wird das Ziel auf der Perle mittels Sonde eingefangen, wonach ein
Primer-Annealing und eine Primer-Verlängerung stattfinden. Wiederum
muss die Zielsequenz in letzterem Fall nicht markiert sein. Da Sandwich-Tests
zwei spezifische Wechselwirkungen erfordern, wird zudem erhöhte Stringenz
bereitgestellt, was sich insbesondere zur Analyse der komplexen
Proben eignet.
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Darüber hinaus
ist es möglich,
wenn sowohl der Zielanalyt als auch der DBL an den Wirkstoff binden, eine
Detektion von nichtmarkierten Zielanalyten mittels Dekodierungskonkurrenz
durchzuführen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
eignen sich die erfindungsgemäßen Verfahren
zur Qualitätskontrolle
der Felder. Vor dieser Erfindung sind keine Verfahren beschrieben
worden, die einen positiven Test der Leistung der einzelnen Sonden
auf den jeweiligen Feldern bereitstellen. Das Dekodieren der Felder
stellt nicht nur diesen Test bereit, sondern tut dies unter Verwendung
der Daten, die während
des Dekodierens selbst erhalten wurden. Deshalb ist keine zusätzliche
Versuchsarbeit erforderlich. Die Erfindung benötigt nur eine Gruppe von Datenanalysealgorithmen,
die Software-kodierbar sind.
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Im
Qualitätskontroll-Verfahren
können
eine Reihe unterschiedlicher systematischer und zufälliger Probleme
in einem Feld identifiziert werden. Beispielsweise können zufällige Staubkörner oder
andere Verunreiniger bei einigen Sensoren dazu führen, dass diese ein falsches
Signal abgeben – dies
kann während
des Dekodierens detektiert werden. Das Weglassen eines oder mehrerer
Wirkstoffe in mehreren Feldern kann ebenfalls detektiert werden.
Ein Vorteil dieses Qualitätskontroll-Verfahrens
liegt darin, dass dieses unmittelbar vor dem Test selbst durchgeführt werden
kann und einen zuverlässigen
funktionellen Test für
jeden einzelnen Sensor darstellt. Deshalb kann jedes Problem, das
zwischen der Feldzusammenstellung und der eigentlichen Verwendung
auftreten kann, detektiert werden. Bei Anwendungen, worin sehr hohe Vertrauenswerte
erforderlich sind und/oder bei denen während des Versuchverlaufs die
signifikante Möglichkeit
eines Sondendefekts besteht, kann das Dekodieren und die Qualitätskontrolle
sowohl vor als auch nach der eigentlichen Probenanalyse durchgeführt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
können
die Felder dazu verwendet werden, Reagenzienqualitätskontrollen
durchzuführen.
In vielen Fällen
werden biologische Makromoleküle
als Reagenzien verwendet und müssen
einer Qualitätskontrolle
unterzogen werden. Beispielsweise können große Gruppen von Oliognucleotid-Sonden
als Reagenzien bereitgestellt sein. Es ist üblicherweise schwierig, bei
einer großen
Anzahl von unterschiedlichen biologischen Makromolekülen eine
Qualitätskontrolle
durchzuführen.
Die hierin beschriebene Herangehensweise kann dazu verwendet werden,
dies zu tun, indem die Reagenzien (als DBL formuliert) statt der
Felder als Variable eingesetzt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die hierin dargelegten Verfahren zur Feldkalibration verwendet.
Bei vielen Anwendungen, z.B. bei einer mRNA-Quantifizierung, ist es erwünscht, über ein
Signal zu verfügen,
das eine lineare Antwort auf die Konzentration des Zielanalyten
darstellt, oder alternativ dazu die Beziehung zwischen Konzentration
und Signal bei Nichtlinearität
zu bestimmen, sodass die Konzentration des Zielanalyten geschätzt werden
kann. Folglich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur parallelen
Schaffung von Kalibrierungskurven für mehrere Perlen in einem Feld
bereit. Die Kalibrierungskurven können unter Bedingungen geschaffen
werden, die die Komplexität
der zu analysierenden Probe simulieren. Jede Kurve kann unabhängig von
den anderen konstruiert werden (z.B. für einen unterschiedlichen Konzentrationsbereich),
jedoch gleichzeitig wie alle anderen Kurven für das Feld. Somit wird das
sequentielle Dekodierungsschema in dieser Ausführungsform mit unterschiedlichen
Konzentrationen, die als Code-"Markierungen" dienen, durchgeführt, statt
unterschiedliche Fluorophore zu verwenden. Auf diese Weise kann
ein Signal als Antwort auf eine Konzentration für jede der Perlen gemessen
werden. Diese Kalibrierung kann unmittelbar vor der Verwendung des Feldes
durchgeführt
werden, sodass jede Sonde auf jedem Feld je nach Bedarf einzeln
kalibriert wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
können
die erfindungsgemäßen Verfahren
auch zur Feldentwicklung herangezogen werden. Somit ermöglichen
die Verfahren beispielsweise die Identifizierung von guten und schlechten
Sonden. Wie Fachleuten klar ist, funktionieren manche Sonden nicht
gut, weil sie nicht gut hybridisieren oder weil diese mit mehr als
einer Sequenz kreuzhybridisieren. Diese Probleme können während des
Dekodierens leicht detektiert werden. Die Fähigkeit, Sondenleistungen rasch
zu erfassen, hat das Potenzial, Zeit und Kosten der Testentwicklung
stark zu reduzieren.
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Ähnlich eignen
sich die erfindungsgemäßen Verfahren
in einer bevorzugten Ausführungsform
zur Quantifizierung der Testentwicklung. Eine große Herausforderung
vieler Tests stellt die Fähigkeit
dar, Unterschiede in Analytenkonzentrationen zwischen den Proben
zu detektieren, die Fähigkeit,
diese Unterschiede zu quantifizieren und absolute Konzentrationen
von Analyten zu messen, und zwar in Gegenwart eines komplexen Gemischs
von verwandten Analyten. Ein Beispiel dieses Problems umfasst die
Quantifizierung einer spezifischen mRNA in Gegenwart der gesamten
zellulären
mRNA. Eine Herangehensweise, die als Basis zur mRNA-Quantifizierung
entwickelt worden ist, wendet mehrfache Paarungs- und Fehlpaarungssondenpaare
an (Lockhart et al., 1996), hierin vollständig als Verweis aufgenommen.
Während
diese Herangehensweise einfach ist, wird dabei eine relativ große Anzahl
von Sonden benötigt.
In dieser Herangehensweise wird eine quantitative Antwort auf die
Konzentration erhalten, indem die Signale aus einer Gruppe unterschiedlicher Sonden
auf das Gen oder die Sequenz von Interesse gemittelt werden. Dies
ist erforderlich, weil nur einige Sonden quantitativ antworten,
und es ist nicht möglich,
diese Sonden mit Bestimmtheit vorauszusagen. Ohne vorherige Kenntnis
wird nur die mittlere Antwort einer geeignet ausgewählten Gruppe
von Sonden als quantitativ erachtet. Dies kann in der vorliegenden
Erfindung jedoch im Allgemeinen auf Nucleinsäure-basierte Tests sowie auf
andere Tests angewandt werden. Im Grunde dient diese Herangehensweise
dazu, die Sonden, welche in einem bestimmten Test quantitativ antworten,
zu identifizieren, statt diese mit anderen Sonden zu mitteln. Dies
wird unter Verwendung des oben erläuterten Kalibrierungsschemas
durchgeführt,
worin konzentrationsbasierte Codes eingesetzt werden. Vorteile dieser
Herangehensweise umfassen: weniger benötigte Sonden; die Genauigkeit
der Messung hängt
weniger von der Anzahl verwendeter Sonden ab; und die Antwort der Sensoren
ist mit ziemlicher Sicherheit bekannt, da jede einzelne Sequenz
auf effiziente Art und Weise getestet werden kann. Es ist zu beachten,
dass leistungsstarke Sonden empirisch ausgewählt werden, womit Schwierigkeiten
und Unsicherheiten hinsichtlich Vorhersage der Sondenleistung verhindert
werden können,
insbesondere bei komplexen Sequenzgemischen. Im Gegensatz dazu wird
in bisher beschriebenen Versuchen mit geordneten Feldern eine relativ
geringe Anzahl von Sequenzen mittels Durchführung quantitativer Spiking-Experimente überprüft, worin
eine bekannte mRNA zu einem Gemisch zugesetzt wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden cDNA-Felder zum Profiling für RNA-Expressionen erstellt. In dieser Ausführungsform
werden einzelne cDNA-Klone aus cDNA-Bibliotheken amplifiziert (beispielsweise
mittels PCR), die in einem Wirts-Vektor-System
vermehrt werden. Jede amplifizierte DNA wird an eine Perlen-Population gebunden.
Unterschiedliche Populationen werden miteinander vermischt, um eine
Perlenkollektion zu bilden, die die cDNA-Bibliothek darstellt. Die
Perlen werden angeordnet, wie oben erläutert dekodiert und in einem
Test eingesetzt (wobei das Dekodieren, wie hierin dargelegt, auch
nach dem Test stattfinden kann). Der Test wird unter Verwendung
von RNA-Proben durchgeführt
(Ganzzellen oder mRNA), die extrahiert, bei Bedarf markiert und
an das Feld hybridisiert werden. Die vergleichende Analyse ermöglicht die
Detektion von Unterschieden in den Expressionswerten einzelner RNA.
Der Vergleich mit einer geeigneten Gruppe von Kalibrierungsstandards
ermöglicht
die Quantifizierung absoluter RNA-Mengen.
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Das
cDNA-Feld kann auch zur Kartierung verwendet werden, um beispielsweise
Deletionen bzw. Insertionen oder Kopienzahlveränderungen im Genom zu kartieren,
z.B. aus Tumoren oder anderen Gewebeproben. Dies kann mittels Hybridisierung
genomischer DNA erfolgen. Statt cDNA (oder EST etc.) können auch andere
STS (sequenzmarkierte Stellen), einschließlich zufälliger genomischer Fragmente,
für diesen
Zweck angeordnet werden.
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Die
nachstehenden Beispiele dienen zur ausführlicheren Beschreibung der
Verwendungsweise oben beschriebener Erfindung sowie zur Darlegung
der besten Art der Durchführung
der verschiedenen erfindungsgemäßen Aspekte.
Es versteht sich, dass diese Beispiele den wahren Umfang der vorliegenden
Erfindung in keinster Weise einschränken, sondern für darstellerische
Zwecke angeführt
werden. Alle hierin zitierten Verweise sind hierin vollständig durch
Verweise aufgenommen.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Es
wurden sechzehn Mikrokügelchen
(Perlen) kombinatorisch mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren
(FAM und Cy3) markiert. In einem ersten Markierungsdurchgang wurden
entweder FAM- oder Cy3-markierte Oligonucleotide, die auf dem Mikrokügelchen
komplementär
zum Oligonucleotid (IBL) waren, mit dem Mikrokügelchen hybridisiert. Das Markieren
der Oligonucleotide wurde wie auf dem Gebiet der Erfindung allgemein
bekannt durchgeführt.
Die Hybridisierungsbedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt.
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Nach
einem ersten Hybridisierungsdurchgang wurden die zwei Mikrokügelchen-Pools in jeweils
zwei Pools unterteilt und jeweils mit entweder FAM- oder Cy3-markierten Oligonucleotiden
markiert. Dieses Verfahren wurde zwei zusätzliche Male wiederholt. Somit
wurde jedes der Mikrokügelchen
nach vier aufeinander folgenden Markierungsdurchgängen mit
einem einmaligen Code markiert (siehe 1).
Die Identität
der einzelnen Mikrokügelchen
wurde durch Bestimmung der Identität der einzelnen Fluorophore
der Reihe nach aufgeklärt.
Das Endfluorophor wurde bestimmt und anschließend entfernt, um die Identifizierung
des nächsten
Fluorophors zu ermöglichen.
Auf diese Weise wurde in nur vier Dekodierungsschritten die Identität von sechzehn Mikrokügelchen
bestimmt.
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Beispiel 2
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Zum
Vierfarbendekodieren wurde ein dem in Beispiel 1 beschriebenen ähnliches
Dekodierungsschema durchgeführt.
In diesem Beispiel wurden die Perlen wie in Beispiel 1 beschrieben
markiert, mit der Ausnahme, dass bei jedem Schritt vier Markierungen
verwendet wurden. Es wurden 4.013 Perlen unter Verwendung von Bod-493-, Bod-R6G-, Bod-564-
und Bod-TXR-markierten Oligonucleotiden markiert. Basierend auf
der aufeinander folgenden Dekodierung der vier Farben wurden 128
unterschiedliche Perlentypen identifiziert.
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Beispiel 3
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Ein
alternatives Verfahren zur Verwendung mehrfacher Farben umfasst
die Verwendung ratiometrischer Intensitäten als Kodierungsschema. Ein
Normierungsbild wurde erhalten, worin jede der Perlen ihre "vollständige" Intensität aufweist.
Darauf folgende Dekodierungsschritte erzeugen Intensitätscodes
durch Hybridisierung von Gemischen aus "markierten":"nichtmarkierten" komplementären Oligonucleotiden.
Beispielsweise sind in 1 drei unterschiedliche
Intensitätsabstufungen
(gering, mittel, hoch) dargestellt, deren Verhältnis so auf eine Stufe eingestellt
werden kann, bei der alle Komplementen in "hohen" Abstufungswerten vorliegen. In 3 wird
ein Versuch dargestellt, bei dem eine Grauwertskala-Dekodierung
auf sechzehn unterschiedlichen Perlentypen verwendet wurde.
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3A zeigt das kombinatorische Pooling-Schema
zum Markieren von Perlen mit unterschiedlichen Verhältnissen
von markierten Oligonucleotiden. Ein bestimmtes Oligo liegt entweder
in einem Anteil von 100 % Cy3-markiert, 40 % Cy3-markiert (60 unmarkiert)
oder 10 % Cy3-markiert (90 % unmarkiert) vor. Dekodierungsoligos
wurden 2 Minuten lang bei einer Konzentration von 50 nM an ein Feld
hybridisiert. Anschließend wurden
zwei voneinander unabhängige
Normierungsbilder (alle Oligokomplemente liegen als 100 % Cy3-markierte
Spezies vor) erhalten und die resultierenden Perlenintensitäten verglichen.
Dies ist in 3B dargestellt, worin
die normierten Werte gegeneinander geplottet sind. Schließlich werden
zur Identifizierung oder Dekodierung der Perlen die Alphawerte (Verhältnis zwischen
Perlenintensität
in angeführtem
Dekodierungsschritt und Intensität
im Normierungsbild) für
drei in (A) beschriebene Dekodierungsschritte geplottet. In Schritt
1 werden nur zwei Peaks im Alphawert-Histogramm beobachtet, da nur
sechzehn Perlentypen im Feld vorliegen. Im zweiten und dritten Dekodierungsschritt
werden drei unterscheidbare Peaks beobachtet, was auf die Durchführbarkeit
der Grauwertskala-Dekodierung schließen lässt.
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Physikalische
Merkmale und unterschiedliche "Grade" von Merkmalen können als
Codes verwendet werden, wodurch die Perlentypen voneinander unterschieden
werden können.
Sofern ein Merkmal als robuster Code gelten soll, sollte es möglich sein,
einer Perle unterschiedliche "Grade" eines bestimmten
Merkmals zu verleihen. Jeder der "Grade" eines Merkmals sollte quantitativ gut
von anderen "Graden" getrennt sein. Ein wichtiger
Punkt ist, den dynamischen Bereich der Merkmalsmessung zu maximieren
und die Streuung der Messung zu minimieren.