DE69928104T2

DE69928104T2 - Medizinische anwendung eines selektiven estrogenrezeptormodulators in kombination mit einer sexualsteroid-vorstufe

Info

Publication number: DE69928104T2
Application number: DE69928104T
Authority: DE
Inventors: Fernand Labrie
Original assignee: Endorecherche Inc
Current assignee: Endorecherche Inc
Priority date: 1998-06-11
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2019-06-11
Also published as: MY157030A; ES2473040T3; CY1115231T1; HUP0103345A2; PT1623712E; US7429576B2; EP1083905A2; ES2463868T3; EP2399582B9; CY1115069T1; ES2458218T3; TR200103455T2; CA2632567C; ES2458218T9; ZA200007297B; HU230495B1; EP2386305A3; ATE308326T1; JP2002517433A; CA2768682A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Behandlung oder zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit des Entstehens von Osteoporose, Hypercholesterinämie, Hyperlipidämie oder Atherosklerose mit einer neuartigen Kombinationstherapie an dafür empfänglichen Warmblütern einschliesslich Menschen. Insbesondere schliesst die Kombination ein, einen selektiven Estrogenrezeptormodulator (SERM) zu verabreichen und das Niveau einer Vorstufe von Sexualsteroiden im Patienten zu erhöhen, wobei die Vorstufe aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Dehydroepiandrosteron (DHEA), Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S) and 5-Androsten-3β,17β-diol (5-Diol) besteht. Die Erfindung bezieht sich auch auf Kits und pharmazeutische Zusammensetzung für die Umsetzung der erwähnten Kombination.
HINTERGRUND DER VERWANDTEN TECHNIK
So ist der Mensch zusammen mit einigen weiteren Primaten einzigartig durch den Besitz von Nebennieren, die grosse Mengen der Steroidvorstufen Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S) und Dehydroepiandrosteron (DHEA) ausscheiden, die in peripheren Geweben zu Androstendion (4-Dion) und dann zu aktiven Androgenen und/oder Estrogenen umgewandelt werden (Labrie und Mitautoren, in: Important Advances in Oncology, hrsg. von V. T. de Vita, S. Hellman, S. A. Rosenberg. J. B. Lippincott, Philadelphia, 193–217, 1985; Labrie, Mol. Cell. Endocrinol. 78: C113–C118, 1991; Labrie und Mitautoren, in: Signal Transduction in Testicular Cells. Ernst Schering Research Foundation Workshop, hrsg. von V. Hansson, F. O. Levy, K. Taskén. Springer-Verlag, Berlin & New York (Suppl. 2), 185–218, 1996; Labrie und Mitautoren, Steroids 62: 148–158, 1997). In einer neueren Untersuchung (Labrie und Mitautoren, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 2403–2409, 1997), haben wir ein dramatisches Absinken der Kreislaufspiegel von Dehydroepiandrosteron (DHEA), DHEA-Sulfat (DHEA-S), 5-Androsten-3β, 17β-diol (5-Diol), 5-Diol-S, 5-Diol-Fettsäureestern und Androstendion in Männern wie auch in Frauen zwischen einem Alter von 20 und 80 Jahren beschrieben.
Trotz des markanten Abfalls der endogenen Androgene in alternden Frauen ist die Anwendung von Androgenen in postmenopausalen Frauen hauptsächlich deshalb beschränkt worden, weil auf der Grundlage älterer Untersuchungen, die ein ungünstiges Lipidprofil im Zusammenhang mit Androgenen zeigten, eine erhöhte Gefahr von Herz-Kreislauf-Erkrankungen gesehen wurde. Neuere Untersuchungen haben aber keine signifikante Auswirkung einer kombinierten Estrogen-Androgen-Therapie auf die Serumspiegel von Cholesterin, Triglyceriden, HDL, LDL und das HDL/LDL-Verhältnis im Vergleich zu Estrogen allein gezeigt (Sherwin und Mitautoren, Am. J. Obstet. Gynecol. 156: 414–419, 1987). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen haben wir gezeigt, dass DHEA, eine Verbindung mit überwiegend androgenem Einfluss, anscheinend keine nachteilige Auswirkung auf das Serumlipidprofil hat (Diamond und Mitautoren, J. Endocrinol. 150: S43–S50, 1996). In ähnlicher Weise wurde nach sechs Monaten einer Therapie mit Estradiol + Testosteron – Implantaten keine Veränderung in den Konzentrationen von Cholesterin, seinen Unterfraktionen oder Triglyceriden gegenüber einer Behandlung mit Estradiol allein beobachtet (Burger und Mitautoren, Br. Med. J. Clin. Res. Ed. 294: 936–937, 1987). Es sollte erwähnt werden, dass eine Untersuchung am Menschen eine umgekehrte Korrelation zwischen Serum-DHEA-S und Lipoproteinen niedriger Dichte aufgezeigt hat (Parker und Mitautoren, Science 208: 512–514, 1980). In jüngerer Zeit ist eine Korrelation zwischen niedrigem Serum-Testosteron und -DHEA und erhöhtem viszeralen Fett gefunden worden, was ein Parameter für hohe Herz-Kreislauf-Risiken ist (Tchernof und Mitautoren, Metabolism 44: 513–519, 1995).
5-Diol ist eine Verbindung, die durch die Wirkung von reduktiver 17β-Hydroxysteroiddehydrogenase (17β-HSD) aus DHEA biologisch synthetisiert wird und ein schwaches Estrogen ist. Es hat eine 85-mal niedrigere Affinität als 17β-Estradiol (E₂) für den Estrogenrezeptor im Cytosol der vorderen Hypophyse von Ratten (Simard und Labrie, J. Steroid Biochem. 26: 539–546, 1987), was eine weitere Bestätigung der Daten ist, die für den gleichen Parameter in Myometrium- und Brustkrebsgewebe im Menschen erhalten worden waren (Kreitmann und Bayard, J. Steroid Biochem. 11: 1589–1595, 1979; Adams und Mitautoren, Cancer Res. 41: 4720–4926, 1981; Poulin und Labrie, Cancer Res. 46: 4933–4937, 1986). Bei Konzentrationen, die sehr wohl im Bereich der bei erwachsenen Frauen gefundenen Plasmaspiegel liegen, verstärkt aber 5-Diol die Zellproliferation und die Progesteronrezeptorniveaus in menschlichen ZR-75-1-Mammatumorzellen (Poulin und Labrie, Cancer Res. 46: 4933–4937, 1986) und erhöht die von Estrogen abhängige Synthese des 52-kDa-Gtykoproteins in MCF-7-Zellen (Adams und Mitautoren, Cancer Res. 41: 4720–4926, 1981).
Wie oben erwähnt, ist bekannt, dass die Serumspiegel von DHEA, DHEA-S und 5-Diol mit zunehmendem Alter sinken und dass dementsprechend eine dramatische, altersabhängige Abnahme der Bildung von Androgenen und Estrogenen in peripheren Zielgeweben stattfindet. Diese Veränderungen in der DHEA-S- und DHEA-Sekretion führen zu einem markanten Absinken in den durch Sexualsteroide stimulierten biochemischen und Zellfunktionen. Daher sind DHEA und DHEA-S neuerdings in der Behandlung einer Vielfalt von Zuständen eingesetzt worden, die mit einem Absinken und/oder einem Ungleichgewicht bei den Sexualhormonspiegeln zusammenhängen.
Osteoporose, ein Zustand, der sowohl Männer als auch Frauen betrifft, ist mit einer Abnahme der Androgene und Estrogene verbunden. Für Estrogene wurde gezeigt, dass sie die Geschwindigkeit des Knochenabbaus verlangsamen, während für Androgene gezeigt wurde, dass sie Knochenmasse aufbauen. Die gegen Osteoporose üblicherweise eingesetzte Estrogen-Ersatztherapie verlangt aber den Zusatz von Gestagenen, um der endometrialen Proliferation und der Gefahr von Endometriumkrebs entgegenzuwirken, die durch Estrogen induziert werden. Da weiterhin angenommen wird, dass Estrogene wie auch Gestagene die Gefahr von Brustkrebs erhöhen (Bardon und Mitautoren, J. Clin. Endocrinol. Metab. 60: 692–697. 1985; Colditz und Mitautoren, N. Engl. J. Med. 332: 1589–1593, 1995), wird der Einsatz der Estrogen-Gestagen-Ersatztherapie von einer begrenzten Anzahl von Frauen und gewöhnlich für zu kurze Zeitabschnitte akzeptiert.
Verschiedene Untersuchungen legen nahe, dass Osteoporose eine klinische Äusserung von Androgenmangel in Männern ist (Baran und Mitautoren, Calcif. Tissue Res. 26: 103–106, 1978; Odell and Swerdloff, West J. Med. 124: 446–475, 1976; Smith und Walker, Calcif. Tissue Res. 22 (Suppl.): 225–228, 1976). Wie an Nandrolondecanoat beobachtet, wurde gefunden, dass eine Androgentherapie die Mineraldichte von Wirbelknochen in postmenopausalen Frauen erhöht (Need und Mitautoren, Arch. Intern. Med. 149: 57–60, 1989). Eine Therapie postmenopausaler Frauen mit Nandrolon erhöhte den korticalen Knochenmineralgehalt (Need und Mitautoren, Clin. Orthop. 225: 273–278, 1987). Androgene Nebenwirkungen wurden aber in 50% der Patienten beobachtet. Solche Daten sind von Interesse, da fast alle derzeitigen Therapien auf eine Verringerung von Knochenverlust beschränkt sind, aber eine Zunahme von Knochenmasse bei Verwendung des anabolen Steroids Nandrolon gefunden wurde. Eine ähnliche Stimulation von Knochenbildung durch Androgene wurde in einem hypogonadalen Mann vorgeschlagen (Baran und Mitautoren, Calcif. Tissue Res. 26: 103, 1978). Über eine Stimulation der Knochenbildung in postmenopausalen Frauen, die während 12 Monaten mit DHEA behandelt wurden, haben Labrie und Mitautoren berichtet (J. Clin. Endocrinol. 82: 3498–3505, 1997).
DHEA (450 mg/kg Körpergew., dreimal pro Woche) hat das Auftreten von Brusttumoren in C3H-Mäusen, die genetisch für eine Entwicklung von Brustkrebs gezüchtet waren, auffallend verzögert (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129–1132, 1979). Ausserdem wurde gefunden, dass die Gefahr der Entwicklung von Blasenkrebs in Männern mit niedrigeren DHEA-Serumspiegeln erhöht ist (Gordon und Mitautoren, Cancer Res. 51: 1366–1369, 1991).
Die Patentanmeldung U.S. 5 550 107 bezieht sich auf ein Verfahren zu Behandlung von Brust- und Endometriumkrebs in empfänglichen Warmblütern, das eine Inhibierung von Ovarialhormonsekretion durch chirurgische Mittel (Ovariektomie) oder chemische Mittel (die Verwendung eines LHRH-Agonisten, z.B. [D-Trp⁶, des-Gly-NH210]LHRH-Ethylamid, oder eines Antagonisten) als Teil einer Kombinationstherapie einschliessen kann. Antiestrogene, Androgene; Gestagene, Inhibitoren der Sexualsteroidbildung (insbesondere der von 17β-Hydroxysteroiddehydrogenase oder Aromatase katalysierten Sexualsteroidproduktion), Inhibitoren der Prolactinsekretion und der Wachstumshormon- und ACTH-Sekretion werden diskutiert. Ein Gegenstück dazu ist unter der internationalen Veröffentlichungsnummer WO 90/10462 veröffentlicht worden.
Ausserdem sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit verminderten Serumspiegeln von DHEA und DHEA-S in Verbindung gebracht worden, und sowohl DHEA als auch DHEA-S sind für eine Verhütung oder Behandlung dieser Zustände vorgeschlagen worden (Barrett-Connor und Mitautoren, N. Engl. J. Med. 315: 1519–1524, 1986).
In alten Sprague-Dawley-Ratten hat Schwartz (in: Kent, Geriatrics 37: 157–160, 1982) beobachtet, dass das Körpergewicht durch DHEA von 600 auf 550 g verringert wurde, ohne die Nahrungsaufnahme zu beeinträchtigen. Schwartz (Cancer 39: 1129–1132, 1979) beobachtete, dass C3H-Mäuse, denen DHEA gegeben wurde (450 mg/kg, dreimal pro Woche), signifikant weniger Gewichtszunahme zeigten und älter als die Kontrolltiere wurden, weniger Körperfett hatten und aktiver waren. Die Körpergewichtsabnahme wurde ohne Appetitsverlust oder Nahrungseinschränkung erreicht. Des Weiteren konnte DHEA eine Gewichtszunahme in Tieren verhindern, die dafür gezüchtet waren, als ausgewachsene Tiere fettleibig zu werden (in Kent, Geriatrics 37: 157–160, 1982).
Eine DHEA-Verabreichung an magere Zucker-Ratten verringerte die Körpergewichtszunahme trotz erhöhter Nahrungsaufnahme. Behandelte Tiere hatten kleinere Fettpolster, was insgesamt gesehen nahelegt, dass DHEA den Stoffwechsel erhöht, was zu geringerer Gewichtszunahme und Fettansammlung führt (Svec und Mitautoren, Proc. 2^nd Int. Conf. Cortisol and Anti-Cortisols, Las Vegas, Nevada, USA, S. 56 Abstrakt, 1997).
Gebesserte Fettleibigkeit wurde in A^vy-Mutantenmäusen (Yen und Mitautoren, Lipids 12: 409–413, 1977) und in der Zucker-Ratte (Cleary und Zisk, Fed. Proc. 42: 536, 1983) gefunden. Mit DHEA behandelte C3H-Mäuse hatten ein jüngeres Aussehen als Kontrolltiere (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129–1132, 1979).
DHEA verringerte das Auftreten von Atherosklerose in mit Cholesterin geführten Kaninchen (Gordon und Mitautoren, J. Clin. Invest. 82: 712–720, 1988; Arad und Mitautoren, Arteriosclerosis 9: 159–166, 1989). Ausserdem wurde berichtet, dass hohe Serumkonzentrationen von DHEA-S gegen einen Tod durch Herz-Kreislauf-Krankheiten im Menschen schützten (Barrett-Connor und Mitautoren, N. Engl. J. Med. 315: 1519–1524, 1986). So wurde gefunden, dass die Kreislaufniveaus von DHEA und DHEA-S in umgekehrter Beziehung zur Mortalität durch Herz-Kreislauf-Krankheiten standen (Barrett-Connor und Mitautoren, N. Engl. J. Med. 315: 1519–1524, 1986) und parallel zur verringerten Immunkompetenz abnahmen (Thoman und Weigle, Adv. Immunol. 46: 221–222, 1989). Eine Untersuchung am Menschen zeigte eine umgekehrte Korrelation zwischen fötalem Serum-DHEA-S und den Spiegeln von Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL: low-density lipoprotein) (Parker und Mitautoren, Science 208: 512, 1980).
Verwendungen von DHEA und die Nützlichkeit einer Androgen-Estrogen-Therapie werden in der Internationalen Patentveröffentlichung WO 94/16709 diskutiert.
Es wird nicht angenommen, dass im Stande der Technik beobachtete Korrelationen eine Behandlung oder prophylaktischen Methoden nahelegen, die ebenso wirksam oder ebenso frei von Nebenwirkungen sind wie die hier offenbarten Kombinationstherapien.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, wirksame Verfahren zur Behandlung von Osteoporose, Hypercholesterinämie, Hyperlipidämie, Atherosklerose, Brustkrebs, Endometriumkrebs, Eierstockkrebs und Gebärmutterkrebs zur Verfügung zu stellen und dabei unerwünschte Nebenwirkungen zu minimieren.
Es ist ein weiteres Ziel, Verfahren zur Verminderung der Gefahr des Entstehens der obigen Krankheiten zur Verfügung zu stellen.
Ein weiteres Ziel besteht darin, Kits und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die in den oben genannten Verfahren verwendbar sind.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Osteoporose, das umfasst, in einem Patienten, der dieser Behandlung oder Verminderung bedarf, die Spiegel einer Sexualsteroid-Vorstufe zu erhöhen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dehydroepiandrosteron (DHEA), Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S) und 5-Androgen-3β,17β-diol (5-Diol) besteht, und das weiter umfasst, dem Patienten als Teil einer Kombinationstherapie eine therapeutisch wirksame Menge eines selektiven Estrogenrezeptormodulators (SERM) zu verabreichen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Hypercholesterinämie zur Verfügung, das umfasst, in einem Patienten, der dieser Behandlung oder Verminderung bedarf, die Spiegel einer Sexualsteroid-Vorstufe zu erhöhen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dehydroepiandrosteron, Dehydroepiandrosteronsulfat und 5-Androsten-3β,17β-diol besteht, und das weiter umfasst, dem Patienten als Teil einer Kombinationstherapie eine therapeutisch wirksame Menge eines selektiven Estrogenrezeptormodulators zu verabreichen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Hyperlipidämie zur Verfügung, das umfasst, in einem Patienten, der dieser Behandlung oder Verminderung bedarf, die Spiegel einer Sexualsteroid-Vorstufe zu erhöhen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dehydroepiandrosteron, Dehydroepiandrosteronsulfat und 5-Androsten-3β,17β-diol besteht, und das weiter umfasst, dem Patienten als Teil einer Kombinationstherapie eine therapeutisch wirksame Menge eines selektiven Estrogenrezeptormodulators zu verabreichen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Atherosklerose zur Verfügung, das umfasst, in einem Patienten, der dieser Behandlung oder Verminderung bedarf, die Spiegel einer Sexualsteroid-Vorstufe zu erhöhen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dehydroepiandrosteron, Dehydroepiandrosteronsulfat und 5-Androsten-3β,17β-diol besteht, und das weiter umfasst, dem Patienten als Teil einer Kombinationstherapie eine therapeutisch wirksame Menge eines selektiven Estrogenrezeptormodulators zu verabreichen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Brustkrebs zur Verfügung, das umfasst, in einem Patienten, der dieser Behandlung oder Verminderung bedarf, die Spiegel einer Sexualsteroid-Vorstufe zu erhöhen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dehydroepiandrosteron, Dehydroepiandrosteronsulfat und 5-Androsten-3β,17β-diol besteht, und das weiter umfasst, dem Patienten als Teil einer Kombinationstherapie eine therapeutisch wirksame Menge eines selektiven Estrogenrezeptormodulators zu verabreichen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Endometriumkrebs zur Verfügung, das umfasst, in einem Patienten, der dieser Behandlung oder Verminderung bedarf, die Spiegel einer Sexualsteroid-Vorstufe zu erhöhen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dehydroepiandrosteron, Dehydroepiandrosteronsulfat und 5-Androsten-3β,17β-diol besteht, und das weiter umfasst, dem Patienten als Teil einer Kombinationstherapie eine therapeutisch wirksame Menge eines selektiven Estrogenrezeptormodulators zu verabreichen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Gebärmutterkrebs zur Verfügung, das umfasst, in einem Patienten, der dieser Behandlung oder Verminderung bedarf, die Spiegel einer Sexualsteroid-Vorstufe zu erhöhen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dehydroepiandrosteron, Dehydroepiandrosteronsulfat und 5-Androsten-3β,17β-diol besteht, und das weiter umfasst, dem Patienten als Teil einer Kombinationstherapie eine therapeutisch wirksame Menge eines selektiven Estrogenrezeptormodulators zu verabreichen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Eierstockkrebs zur Verfügung, das umfasst, in einem Patienten, der dieser Behandlung oder Verminderung bedarf, die Spiegel einer Sexualsteroid-Vorstufe zu erhöhen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dehydroepiandrosteron, Dehydroepiandrosteronsulfat und 5-Androsten-3β,17β-diol besteht, und das weiter umfasst, dem Patienten als Teil einer Kombinationstherapie eine therapeutisch wirksame Menge eines selektiven Estrogenrezeptormodulators zu verabreichen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Kit zur Verfügung, der einen ersten Behälter umfasst, der eine therapeutisch wirksame Menge zumindest einer Sexualsteroid-Vorstufe enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dehydroepiandrosteron, Dehydroepiandrosteronsulfat, 5-Androsten-3β,17β-diol und einem Pro-Pharmakon besteht, das in vivo in eine der vorangehenden Vorstufen umgewandelt wird, und der weiter einen zweiten Behälter umfasst, der eine therapeutisch wirksame Menge zumindest eines selektiven Estrogenrezeptormodulators enthält.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die umfasst: a) ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel, Verdünnungsmittel oder Träger; b) eine therapeutisch wirksame Menge zumindest einer Sexualsteroid-Vorstufe, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dehydroepiandrosteron, Dehydroepiandrosteronsulfat, 5-Androsten-3β,17β-diol und einem Pro-Pharmakon besteht, das in vivo in eine der vorangehenden Sexualsteroid-Vorstufen umgewandelt wird; und c) eine therapeutisch wirksame Menge zumindest eines selektiven Estrogenrezeptormodulators.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verminderung der Gefahr des Entstehens von Brustkrebs zur Verfügung, das umfasst, einem Patienten, der einer solchen Verminderung bedarf, eine prophylaktisch wirksame Menge eines selektiven Estrogenrezeptormodulators zu verabreichen.
In einer Ausführungsform zur Verminderung der Wahrscheinlichkeit des Entstehens von Brustkrebs ist es wünschenswert, die Verabreichung eines SERMs mit der Verabreichung einer Sexualsteroid-Vorstufe zu kombinieren. Die Erfindung schliesst aber auch ein, ein SERM allein zu verabreichen, was zum Beispiel 1 und 2 zufolge selbst in Abwesenheit von verabreichten Vorstufen eine signifikante prophylaktische Wirkung liefert. Für diesen Zweck bevorzugte SERM sind die gleichen wie die hier für andere Verwendungen diskutierten. Die bevorzugten Dosierungen und Verabreichungsverfahren sind ebenfalls die gleichen.
Wie hier verwendet, ist ein selektiver Estrogenrezeptormodulator (SERM) eine Verbindung, die entweder direkt oder durch ihren aktiven Metaboliten in Brustgewebe als ein Estrogenrezeptorantagonist (ein „Antiestrogen") wirkt, aber auf Knochengewebe und die Serum-Cholesterinspiegel eine estrogene oder estrogenartige Wirkung hat (indem sie nämlich das Serum-Cholesterin senkt). Nichtsteroidale Verbindungen, die in vitro oder in menschlichem oder Ratten-Brustgewebe als Estrogenrezeptorantagonisten wirken, wirken wahrscheinlich als SERM (insbesondere wenn die Verbindung auf menschliche Brustkrebszellen als ein Antiestrogen wirkt). Umgekehrt tendieren steroidale Antiestrogene dahin, nicht als SERM zu wirken, weil sie nicht dahin tendieren, eine nützliche Wirkung auf Serum-Cholesterin zu zeigen. Nichtsteroidale Antiestrogene, die wir geprüft und als SERM-wirksam befunden haben, sind u.a. EM-800, EM-01538, Raloxifen, Tamoxifen und Droloxifen. Wir haben das steroidale Antiestrogen ICI 182,780 geprüft und gefunden, dass es nicht als SERM wirkt. Erfindungsgemässe SERM können in der gleichen Dosierung verwendet werden, die bei der Verwendung dieser Verbindungen als Antiestrogene fachbekannt sind.
Wir haben ferner eine Korrelation zwischen den nützlichen Wirkungen von SERM auf Serum-Cholesterin und den nützlichen estrogenen oder estrogenartigen Wirkungen auf Knochen und auf Serumlipide bemerkt. SERM, die in unseren Untersuchungen eine nützliche Wirkung auf all diese Parameter gezeigt haben, sind u.a. Knochenmasse, Cholesterin und Triglyceridspiegel. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass SERM, von denen viele bevorzugt zwei aromatische Ringe besitzen, die über ein oder zwei Kohlenstoffatome verknüpft sind, mit dem Estrogenrezeptor durch den vorangehenden Anteil des Moleküls in Wechselwirkung treten, der am besten durch den Rezeptor erkannt wird. Bevorzugte SERM haben Seitenketten, die selektiv antagonistische Eigenschaften im Brustgewebe hervorrufen können, ohne in anderen Geweben signifikante antagonistische Eigenschaften zu besitzen. So können SERM in der Brust erwünscht als Antiestrogene wirken, während sie in Knochen und im Blut (wo die Konzentrationen von Lipid und Cholesterin günstig beeinflusst werden) überraschend und erwünscht als Estrogene wirken (oder eine estrogenartige Wirkung liefern). Die günstige Wirkung auf Cholesterin und Lipid bedeutet eine günstige Wirkung gegen Athero sklerose, die bekanntlich durch ungeeignete Cholesterin- und Lipidspiegel nachteilig beeinflusst wird.
Alle Krankheiten, die durch die Erfindung behandelt werden, wie sie hier diskutiert wird, reagieren günstig auf Androgene. Statt Androgene als solche zu verwenden, setzen die Anmelder Sexualsteroid-Vorstufen wie DHEA. DHEA-S, 5-Diol, oder Pro-Pharmaka ein, die in vivo zu einer dieser Sexualsteriod-Vorstufen umgewandelt werden. DHEA-S wird zu DHEA umgewandelt, das seinerseits zum 5-Diol umgewandelt wird. Es wird angenommen, dass ein Gewebe, das auf eines davon günstig reagiert, auch auf die anderen günstig reagiert. Pro-Pharmakon-Formen aktiver Metaboliten sind im Fach gut bekannt. Siehe zum Beispiel H. Bundgaard, „Auslegung und Anwendung von Pro-Pharmaka" (in: A Textbook of Drug Design and Development, hrsg. von H. Bundgaard und P. Krogsgaard-Larsen; Harwood Academic Publishers GmbH, Chur, Schweiz 1991), dessen Inhalt hier durch Bezugnahme einbezogen wird. Siehe insbesondere Seiten 154 bis 155, wo verschiedene funktionelle Gruppen aktiver Metaboliten und die entsprechenden, passenden Pro-Pharmakon-Gruppen beschrieben werden, die an vivo in die jeweilige funktionelle Gruppe umgewandelt werden. Wo in einem Patienten die Spiegel von Sexualsteroid-Vorstufen erfindungsgemäss erhöht werden, kann dies typisch durch Verabreichung einer solchen Vorstufe oder durch Verabreichung eines Pro-Pharmakons einer solchen Vorstufe erreicht werden. Indem Vorstufen statt der Androgene verwendet werden, vermindert sich die unerwünschte androgene Wirkung in anderen Geweben als dem Zielgewebe. Die Gewebe verwandeln Vorstufen wie DHEA nur durch einen natürlichen, besser regulierten Prozess zu Androgenen. Ein hoher Prozentsatz der Androgene wird lokal in peripheren Geweben erzeugt, und zwar in den verschiedenen Geweben in einem unterschiedlichen Ausmass.
Die erfindungsgemäss behandelten Krebse reagieren ungünstig auf estrogene Aktivität. Andererseits reagieren Osteoporose, Hypercholesterinämie, Hyperlipidämie und Atherosklerose günstig auf estrogene oder estrogenartige Aktivität. Indem SERM erfindungsgemäss verwendet werden, werden erwünschte Wirkungen in Zielgeweben ohne unerwünschte Wirkungen in bestimmten anderen Geweben erzielt. Zum Beispiel kann ein SERM eine günstige estrogene Wirkung in Knochen (oder auf Lipid oder Cholesterin) haben, während eine ungünstige estrogene Wirkung in der Brust vermieden wird.
So bieten sowohl Vorstufe als auch SERM eine günstige Wirkung in Zielgeweben, während ungünstige Wirkungen in bestimmten anderen Geweben vermieden werden. Darüber hinaus gibt es wesentliche Synergien, wenn erfindungsgemäss beide zusammen verwendet werden. Zum Beispiel bieten Estrogene und Androgene eine günstige Wirkung gegen Osteoporose über unterschiedliche Mechanismen (indem Estrogen die Knochenresorption vermindert, während Androgen zur Knochenbildung beiträgt). Die Kombination der vorliegenden Erfindung versieht Knochen durch die Aktivität von SERM mit einer nützlichen estrogenen oder estrogenartigen Wirkung, und sie liefert auch nützliches Androgen durch die lokale Umwandlung der Vorstufe im Knochen zu Androgen. Es wird angenommen, dass auch die Vorstufe Estrogen liefert. Das gleiche gilt bezüglich der Steuerung von Lipid oder Cholesterin (nützlich für die Behandlung oder Verhütung von Atherosklerose). Eine ähnliche Synergie wird gegen Brust-, Endometrium-, Eierstock- oder Gebärmutterkrebs geboten, wo der SERM die erwünschte antiestrogene Wirkung liefert, während die Vorstufe die erwünschte androgene Wirkung liefert (wobei eine zufällige Verwandlung der Vorstufe zu Estrogen durch das Antiestrogen gemässigt wird). Unerwünschte Wirkungen werden ebenfalls in einer synergistischen Weise durch die in der Erfindung verwendete Kombination gemässigt.
Bei allen hier diskutierten Krankheiten wird eine andere Wirkung auf Brustgewebe, die sonst durch Estrogene hervorgerufen werden könnte, die durch die Vorstufe erzeugt werden (wenn die Vorstufe erfindungsgemäss verwendet wird, um androgene Wirkungen zu unterstützen), durch die antiestrogene Wirkung des SERM im Brustgewebe gemässigt.
In einigen Ausführungsformen werden Gestagene hinzugefügt, um eine weitere androgene Wirkung zu bieten. Gestagene können in den im Fach bekannten niedrigen Dosierungen verwendet werden, ohne andere Rezeptoren als die Androgenrezeptoren (zum Beispiel die Glucocorticoidrezeptoren) nachteilig zu beeinflussen. Sie sind auch verhältnismässig frei von unerwünschten androgenen Nebenwirkungen (wie Barthaare bei weiblichen Patienten).
Die hier diskutierten, bevorzugten SERM beziehen sich, 1) auf alle Krankheiten, die als empfänglich gegenüber der Erfindung genannt worden sind; 2) sowohl auf therapeutische als auch auf prophylaktische Anwendungen; und 3) auf die bevorzugten pharmazeutischen Zusammensetzungen und Kits.
In einer Ausführungsform ist die Vorstufe DHEA.
In einer anderen Ausführungsform ist die Vorstufe DHEA-S.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Vorstufe 5-Diol.
Ein Patient, der einer Behandlung oder einer Verminderung der Gefahr des Entstehens einer gegebenen Krankheit bedarf, ist entweder einer, bei dem eine solche Krankheit diagnostiziert worden ist, oder einer, der dafür empfänglich ist, eine solche Krankheit zu erwerben.
Wo nicht anders ausgesagt, ist die bevorzugte Dosierung der aktiven Verbindungen (Konzentrationen und Verabreichungsart) der Erfindung für therapeutische und prophylaktische Zwecke die gleiche. Für jede hier diskutierte aktive Verbindung ist die Dosierung ohne Rück sicht auf die behandelte Krankheit (oder die Krankheit, deren Eintrittswahrscheinlichkeit vermindert wird) die gleiche.
Wo nicht anders vermerkt oder aus dem Zusammenhang erkenntlich, beziehen sich die Dosierungen hierin auf Gewicht von aktiven Verbindungen, unbeeinflusst durch pharmazeutische Vehikel, Verdünnungsmittel, Träger oder andere Bestandteile, obwohl die Einbeziehung solcher Bestandteile erwünscht ist, wie in den Beispielen hierin gezeigt. Jede Dosierungsform (Kapsel, Tablette, Injektion oder dergleichen), die üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie verwendet wird, ist für eine Verwendung hierin geeignet, und die Ausdrücke „Vehikel", „Verdünnungsmittel" oder „Träger" beinhalten nichtaktive Bestandteile, wie sie typischerweise zusammen mit den aktiven Bestandteilen in der Industrie in diese Dosierungsformen eingehen. Zum Beispiel können typische Kapseln, Pillen, enterische Überzüge, feste oder flüssige Verdünnungsmittel oder Vehikel, Geschmacksstoffe, Konservierungsstoffe und dergleichen einbezogen werden.
Alle aktiven Bestandteile, die in einer beliebigen der hierin diskutierten Therapien verwendet werden, können als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden, die auch einen oder mehrere weitere von den anderen aktiven Bestandteilen einbeziehen. Wechselweise kann jeder einzeln, aber genügend gleichzeitig verabreicht werden, damit ein Patient schlussendlich gleichzeitig erhöhte Blutspiegel jedes der aktiven Bestandteile hat oder in anderer Weise von den Vorteilen jedes der aktiven Bestandteile (oder Strategien) Nutzen zieht. In einigen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sollen zum Beispiel ein oder mehrere aktive Bestandteile als eine einzige pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden. In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird ein Kit zur Verfügung gestellt, der zumindest zwei getrennte Behälter enthält, wobei sich der Inhalt von zumindest einem Behälter bezüglich der darin enthaltenen aktiven Bestandteile ganz oder teilweise vom Inhalt von zumindest einem anderen Behälter unterscheidet.
Hier diskutierte Kombinationstherapien schliessen auch die Verwendung eines aktiven Bestandteils (der Kombination) in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung (oder Gefahrenminderung) der betrachteten Krankheit ein, wo die Behandlung oder Verhütung noch einen weiteren aktiven Bestandteil der erfindungsgemässen Kombination einschliesst. In einer Ausführungsform sieht die Erfindung zum Beispiel die Verwendung eines SERM in der Zubereitung eines Medikaments vor, das in Kombination mit einer Sexualsteroid-Vorstufe, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DHEA, DHEA-S, 5-Diol und Pro-Pharmaka besteht, die in vivo zu einer der vorstehenden Sexualsteroid-Vorstufen umgewandelt werden, zur Behandlung einer der Krankheiten verwendet werden soll, für die eine Wirksamkeit der vorliegenden Kombinationstherapie angenommen wird (d.h. Brustkrebs, Endometriumkrebs, Gebärmutterkrebs, Eierstockkrebs, Osteoporose, Hypercholesterinämie, Hyperlipidämie and Atherosklerose). In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung die Verwendung einer Sexualsteroid-Vorstufe, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DHEA, DHEA-S, 5-Diol und Pro-pharmaka besteht, die in vivo zu einer der vorstehenden Sexualsteroid-Vorstufen umgewandelt werden, in der Zubereitung eines Medikaments vor, das in Kombination mit einem SERM zur Behandlung einer der gleichen Krankheiten verwendet werden soll.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird DHEA nicht als die Vorstufe verwendet. In einer anderen Ausführungsform wird EM-800 nicht als der SERM verwendet. In einer weiteren Ausführungsform wird die Kombination von DHEA und EM-800 nicht verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird DHEA in Kombination mit EM-1538 verwendet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Wirkung einer neunmonatigen Behandlung mit DHEA (10 mg, perkutan, einmal täglich) oder EM-800 (75 μg, oral, einmal täglich) allein oder kombiniert auf das Auftreten von durch DMBA induzierten Mammakarzinomen in der Ratte über die Beobachtungszeit von 279 Tagen hinweg. Die Daten sind in Prozent der Gesamtzahl der Tiere in jeder Gruppe ausgedrückt.
2 zeigt die Wirkung einer neunmonatigen Behandlung mit DHEA (10 mg, perkutan, einmal täglich) oder EM-800 (75 μg, oral einmal täglich) allein oder kombiniert auf die durchschnittliche Tumorzahl je tumorbefallenes Tier (A) und auf die durchschnittliche Tumorgrösse je tumorbefallene Ratte (B) über die Beobachtungszeit von 279 Tagen hinweg. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt.
3 zeigt die Wirkung einer neunmonatigen Behandlung mit DHEA (10 mg, perkutan, einmal täglich) oder EM-800 (75 μg, oral, einmal täglich) allein oder kombiniert auf Serum-Triglycerid- (A) und -Cholesterinspiegel (B) in der Ratte. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. **) P < 0.01 experimentell gegen entsprechende Kontrolle.
4 zeigt: A) die Wirkung steigender Dosierungen von DHEA (0,3 mg, 1,0 mg oder 3,0 mg), zweimal täglich perkutan verabreicht, auf die durchschnittliche ZR-75-1-Tumorgrösse in ovariektomierten (OVX), zusätzlich mit Estron versorgten nackten Mäusen. OVX-Kontrollmäuse, die den Träger allein erhalten, werden als zusätzliche Kontrollen verwendet. Die anfängliche Tumorgrösse wurde als 100% genommen. DHEA wurde perkutan (p.c.) in 0,02 ml einer Lösung in 50% Ethanol + 50% Propylenglykol auf die Rückenhaut verabreicht. B) Die Wirkung einer 9,5-monatigen Behandlung mit steigenden Dosierungen von DHEA oder EM-800 allein oder in Kombination auf das Gewicht von ZR-75-1-Tumoren in zusätzlich mit Estron versorgten nackten OVX-Mäusen. **) p < 0,01, behandelt gegen zusätzlich mit Estron versorgte OVX-Kontrollmäuse.
5 zeigt die Wirkung steigender oraler Dosierungen des Antiestrogens EM-800 (15 μg, 50 μg oder 100 μg) (A) oder einer perkutanen Verabreichung steigender Dosierungen von DHEA (0,3, 1,0 oder 3,0 mg) in Kombination mit EM-800 (15 μg) oder von EM-800 allein (B) während 9,5 Monaten auf die durchschnittliche Grösse von ZR-75-1-Tumoren in ovariektomierten (OVX), zusätzlich mit Estron versorgten nackten Mäusen. Die anfängliche Tumorgrösse wurde als 100% angenommen. OVX-Kontrollmäuse, die den Träger allein erhielten, wurden als zusätzliche Kontrollen benutzt. Estron wurde subkutan einmal täglich in einer Dosierung von 0,5 μg verabreicht, während DHEA in 50% Ethanol + 50% Propylenglykol aufgelöst und zweimal täglich in einem Volumen von 0,02 ml auf die Rückenhaut appliziert wurde. Ein Vergleich wurde auch mit OVX-Tieren angestellt, die den Träger allein erhielten.
6 zeigt die Wirkung einer 12-monatigen Behandlung mit Dehydroepiandrosteron (DHEA) allein oder in Kombination mit Flutamid oder EM-800 auf das trabekuläre Knochenvolumen in ovariektomierten Ratten. Unversehrte Tiere wurden als zusätzliche Kontrollen hinzugefügt. Die Daten werden als Mittelwerte f SEM dargestellt. **) p < 0.01 gegen OVX-Kontrolle.
7 zeigt die Wirkung einer 12-monatigen Behandlung mit Dehydroepiandrosteron (DHEA) allein oder in Kombination mit Flutamid oder EM-800 auf die Trabekelzahl in ovariektomierten Ratten. Unversehrte Tiere wurden als zusätzliche Kontrollen hinzuge fügt. Die Daten werden als Mittelwerte + SEM dargestellt. **) p < 0.01 gegen OVX-Kontrolle.
8 zeigt proximale Schienbeinmetaphysen von unversehrten Kontroll- (A), ovariektomierten Kontroll- (B) und ovariektomierten Ratten, die mit DHEA allein (C) oder in Kombination mit Flutamid (D) oder EM-800 (E) behandelt worden waren. Man bemerke die verringerte Menge an trabekulärem Knochen (T) in den ovariektomierten Kontrolltieren (B) und den signifikanten Anstieg des trabekulären Knochenvolumens (T), der nach DHEA-Verabreichung induziert wurde (C). Der Zusatz von Flutamid zu DHEA blockierte die Wirkung von DHEA auf das trabekuläre Knochenvolumen teilweise (D), während die Kombination von DHEA und EM-800 vollkommenen Schutz gegen den mit Ovariektomie verbundenen Knochenverlust lieferte. Modifizierte Masson-Goldner-Trichromfärbung, vergr. 80 x. T: Trabekeln, GP: Wachstumsplatte.
9 zeigt die Wirkung steigender Dosierungen (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 und 1 mg/kg) von EM-800, EM-1538 und Raloxifen (EM-1105), täglich während vier Tagen per os verabreicht, auf den Cholesterinspiegel ovariektomierter Ratten.
10 zeigt die Wirkung einer 34-wöchigen Behandlung mit Dehydroepiandrosteron (DHEA) allein oder in Kombination mit EM-1538 (EM-652·HCl) auf Lendenwirbelsäulen-BMD in ovariektomierten Ratten. Unversehrte Tiere wurden als zusätzliche Kontrollen hinzugefügt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. **) p < 0.01 gegen OVX-Kontrollen.
11 zeigt die kombinierte Wirkung von SERM (EM-652) und DHEA auf Menopausen-Parameter. Keine negative Wirkung wird erwartet.

12 zeigt die Plasmakonzentration von DHEA (ng/ml) (Y-Achse) in Anhängigkeit von der Zeit (X-Achse) nach einer einzelnen oralen Aufnahme bevorzugter Sexualsteroid-Vorstufen der Erfindung (150 μmol/Ratte) in männlichen Ratten. Im Einsatz wird die Fläche unter der Kurve (AUC: area under the curve) über 24 h für das durch diese Verbindungen induzierte DHEA gezeigt.

EM-760	Dehydroepiandrosteron
EM-900	5-Androsten-3β,17β-diol
EM-1304	5-Androsten-3β,17β-diol-3-acetat
EM-1305-CS	5-Androsten-3β,17β-diol-diacetat
EM-1397	5-Androsten-3β,l7β-diol-3-acetat-l7-benzoat
EM-1400	5-Androsten-3β,17β-diol-dibenzoat
EM-1410	5-Androsten-3β,17β-diol-dipropionat
EM-1474-D	5-Androsten-3β,17β-diol-dihemisuccinat

13 zeigt die Plasmakonzentration von 5-Androgen-3β,17β-diol (ng/ml) (Y-Achse) in Abhängigkeit von der Zeit (X-Achse) nach einer einzelnen oralen Aufnahme bevorzugter Sexualsteroid-Vorstufen der Erfindung (150 μmol/Ratte) in männlichen Ratten. Im Einsatz wird die Fläche unter der Kurve (AUC) über 24 h für das durch diese Verbindungen induzierte DHEA gezeigt.

DETAILBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist bekannt, dass Estrogene die Proliferation von Brustepithelzellen stimulieren, und es wird angenommen, dass die Zellproliferation selbst die Gefahr von Krebs erhöht, indem zufällige genetische Fehler angesammelt werden, die zu Neoplasien führen können (Preston Martin und Mitautoren, Cancer Res. 50: 7415–21, 1990). Von dieser Auffassung ausgehend sind zur Verhütung von Brustkrebs Antiestrogene mit dem Ziel eingeführt worden, die Geschwindigkeit der durch Estrogene stimulierten Zellteilung zu verringern.
Der Verlust der zyklischen Eierstockaktivität bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten nach dem zehnten Lebensmonat wird von erhöhten Serum-Estrogen- und -Prolactin-Spiegeln und verringerten Serum-Androgen- und -Progesteron-Konzentrationen begleitet (Lu und Mit autoren, 61^st Annual Meeting of the Endocrine Society 106 (Abstrakt Nr. 134), 1979; Tang und Mitautoren, Biol. Reprod. 31: 399–413, 1984; Russo und Mitautoren, Monographs on Pathology of Laboratory Animals: Integument and Mammary Glands [Monografien zur Pathologie von Labortieren: Integument und Milchdrüsen] 252–266, 1989; Sortino und Wise, Endocrinology 124: 90–96, 1989; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139–145, 1991). Diese hormonalen Veränderungen, die spontan in alternden weiblichen Ratten eintreten, sind mit multifokaler Proliferation und erhöhter sekretorischer Aktivität des azinären und alveolären Gewebes sowie mit einer Gangerweiterung der Milchdrüsen und Zystenbildung verbunden (Boorman und Mitautoren, 433, 1990; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139–145, 1991). Es sollte erwähnt werden, dass hyperplastische und neoplastische Veränderungen der Milchdrüsen bei der Ratte oft von erhöhten Estrogen- und Prolactinspiegeln begleitet werden (Meites, J. Neural. Transm. 48: 25–42, 1980). Die Behandlung mit EM-800, einem SERM der vorliegenden Erfindung, induziert Milchdrüsenarophie, die durch eine Abnahme der Grösse und Anzahl der lobulären Strukturen, aber keinerlei Anzeichen für sekretorische Aktivität gekennzeichnet ist, was auf die potente antiestrogene Aktivität von EM-800 in den Milchdrüsen hinweist (Luo und Mitautoren, Endocrinology 138: 4435–4444, 1997).
Die Behandlung mit DHEA, einer Sexualsteroid-Vorstufe der vorliegenden Erfindung, führt zu einem Anstieg des Serum-DHEAs und -5-Diols, während die Serum-4-Dion-, -Testosteron-, -Dihydrotestosteron- und -Estradiolspiegel nur mässig ansteigen oder eher unverändert bleiben, was die intrazelluläre biologische Umformung dieses Steroid-Vorläufers in peripheren Geweben bestätigt (Labrie und Mitautoren, Mol. Cell. Endocrinol. 78: C113–C118, 1991). Die stimulierende Wirkung von oral verabreichtem DHEA auf Serumandrogene wie Testosteron and Dihydrotestosteron hat aber eine grössere Amplitude als die Wirkung auf Serumestrogene, was nahe legt, dass DHEA in diesen Tieren vorwiegend zu Androgenen umgewandelt wird. Diese Beobachtung stimmt mit den Daten überein, die in Frauen erhalten wurden, bei denen die Bildung von Androgenen aus DHEA eine wichtigere Route als die Umwandlung von DHEA zu Estrogenen war (Morales und Mitautoren, J. Clin. Endocrinol. Metab. 78: 1360–1367, 1994; Labrie und Mitautoren, Ann. N. Y. Acad. Sci. 774: 16–28, 1995; Labrie und Mitautoren, Steroids 62: 148–158, 1997).
In Kenntnis der oben beschriebenen, potenten antiestrogenen Aktivität, die zu Milchdrüsenatrophie führt, und der vorwiegend androgenen Wirkung von DHEA auf die Milchdrüsen lassen sich die histomorphologischen Veränderungen, die bei Tieren beobachtet werden, die mit der Kombination eines SERMs mit einer Sexualsteroid-Vorstufe behandelt wurden, am besten als eine unwidersetzte Wirkung von DHEA in den Milchdrüsen von Ratten erklären.
Die wichtigste Beobachtung bestand darin, dass Androgene eine direkte antiproliferative Aktivität bezüglich des in-vitro-Wachstums menschlicher ZR-75-1-Brustkrebszellen ausüben und dass diese hemmende Wirkung von Androgenen zur Wirkung eines Antiestrogens additiv ist (Poulin und Labrie, Cancer Res. 46: 4933–4937, 1986; Poulin und Mitautoren, Breast Cancer Res. Treat. 12: 213–225, 1988). Ähnliche Hemmwirkungen sind in vivo an ZR-75-1-Xenoimplantaten in nackten Mäusen beobachtet worden (Dauvois und Mitautoren, Cancer Res. 51: 3131–3135, 1991). Es konnte auch gezeigt werden, dass Androgene das Wachstum von durch DMBA induzierten Mammakarzinomen in Ratten hemmen, wobei sich diese Hemmung bei einer gleichzeitigen Verabreichung des reinen Antiandrogens Flutamid umkehrt (Dauvois und Mitautoren, Breast Cancer Res. Treat. 14: 299–306, 1989). Zusammengenommen deuten die vorliegenden Daten auf die Beteiligung des Androgenrezeptors an der hemmenden Wirkung von DHEA auf Brustkrebs hin.
Da Antiestrogene und Sexualsteroid-Vorstufen ihre hemmenden Wirkungen auf Brustkrebs über unterschiedliche Mechanismen ausüben, zeigt die vorliegende Erfindung, dass die Kombination eines SERMs (EM-800) und einer Sexualsteroid-Vorstufe (DHEA) potentere Hemmwirkungen auf die Entwicklung von durch DMBA induzierten Mammakarzinomen bei Ratten ausübt als jede Verbindung allein, wie in 1 und 2 gut veranschaulicht. Tatsächlich ist am Ende des Versuchs in Tieren, die sowohl DHEA als auch EM-800 empfangen hatten, kein durch DMBA induzierter Tumor gefunden worden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt, dass die Kombination einer Sexualsteroid-Vorstufe (DHEA) und eines SERMs (EM-800) die stimulierende Wirkung von DHEA auf die Knochenbildung bewahrte und die hemmende Wirkung von SERM (EM-800) allein auf Knochenumsatz und -resorption potenzierte, wie durch das weitere Absinken des Harn-Hydroxyprolins und der Calciumausscheidung im Harn bei Kombination der beiden Verbindungen belegt wird.
Wir konnten zeigen, dass DHEA nützliche Wirkungen auf Knochen sowohl in der weiblichen Ratte (Luo und Mitautoren, Endocrinology 138: 4435–4444, 1997) als auch in postmenopausalen Frauen besitzt (Labrie und Mitautoren, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 3498–3505, 1997). So steigert in unversehrten weiblichen Ratten eine Behandlung mit DHEA die Knochenmineraldichte (BMD: bone mineral density) des ganzen Skeletts, der Lendenwirbelsäule und des Oberschenkelknochens (Luo und Mitautoren, Endocrinology 138: 4435, 1997).
Andererseits hatte eine Behandlung mit EM-800 keine signifikante Wirkung auf BMD in unversehrten Tieren, obwohl potente stimulierende Wirkungen in ovariektomierten Ratten beoachtet werden (Martel und Mitautoren, unveröffentliche Daten). Da EM-800 eine solche stimulierende Wirkung auf BMD des Gesamtskeletts, der Lendenwirbelsäule und des Oberschenkelknochens in ovariektomierten Ratten ausübt, könnte das Fehlen einer signifikanten stimulierenden Wirkung von EM-800 in unversehrten Tieren dadurch bedingt sein, dass die in unversehrten weiblichen Ratten vorhandenen Sexualsteroide eine maximale Wirkung auf BMD ausüben (Luo und Mitautoren, Endocrinology 138: 4435–4444, 1997). In ähnlicher Weise ist das Fehlen einer signifikanten Wirkung von EM-800 in ovariektomierten Ratten, die bereits DHEA empfangen, wahrscheinlich durch die maximalen stimulierenden Wirkungen bedingt, die durch die Androgene (und möglicherweise die Estrogene) ausgeübt werden, die aus exogener DHEA in Knochenzellen synthetisiert werden.
Bekanntlich senken Estrogene Serum-Cholesterin, aber sie erhöhen oder sind ohne Wirkung auf die Serum-Triglycerid-Spiegel (Love und Mitautoren, Ann. Intern. Med. 115: 860–864, 1991; Walsh und Mitautoren, New Engl. J. Med. 325: 1196–1204, 1991; Barrett-Connor, Am. J. Med. 95 (Suppl. 5A): 40S–43S, 1993; Russell und Mitautoren, Atherosclerosis 100: 113–122, 1993; Black und Mitautoren, J. Clin. Invest. 93; 63–69, 1994; Dipippo und Mitautoren, Endocrinology 136: 1020–1033, 1995; Ke und Mitautoren, Endocrinology 136: 2435–2441, 1995). 3 zeigt, dass EM-800 in Ratten sowohl hypocholesterinämische als auch hypotriglyceridämische Wirkungen hat, also seine einzigartige Wirkung auf das Serumlipidprofil ausübt, die sich anscheinend von der anderer SERM wie Tamoxifen (Bruning und Mitautoren, Br. J. Cancer 58: 497–499, 1988; Love und Mitautoren, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1327–1332, 1990; Dipippo und Mitautoren, Endocrinology 136: 1020–1033, 1995; Ke und Mitautoren, Endocrinology 136: 2435–2441, 1995), Droloxifen (Ke und Mitautoren, Endocrinology 136: 2435–2441, 1995) und Raloxifen (Black und Mitautoren, J. Clin. Invest. 93: 63–69, 1994) unterscheidet. In der Kombination von DHEA und EM-800 wurden die hypocholesterinämischen und hypotriglyceridämischen Wirkungen von EM-800 bewahrt, was nahe legt, dass eine solche Kombination nützliche Wirkungen auf die Serumlipide haben könnte.
Es sollte erwähnt werden, dass sich Ratten und Menschen im Serumlipidprofil markant unterscheiden. Da aber an der hypocholesterinämischen Wirkung der Estrogene wie auch der Antiestrogene ein von Estrogenrezeptoren vermittelter Mechanismus beteiligt ist (Lundeen und Mitautoren, Endocrinology 138: 1552–1558, 1997), bleibt die Ratte ein nützliches Modell für Untersuchungen der Cholesterin senkenden Wirkung von Estrogenen und „Antiestrogenen" im Menschen.
Kurz gesagt werden durch die oben beschriebenen Daten die Wirkungen der Kombination eines SERM (EM-800) mit einer Sexualsteroid-Vorstufe (DHEA) auf die Entwicklung von DMBA-induzierten Mammakarzinomen wie auch die Schutzwirkungen einer solchen Kom bination auf Knochenmasse und Serumlipide deutlich aufgezeigt. Solche Daten legen die zusätzlichen nützlichen Wirkungen einer solchen Kombination für die Behandlung und Verhütung von Osteoporose bei verbessertem Lipidprofil nahe.
Wir haben auch die potentielle Wechselwirkung der hemmenden Wirkungen des neuartigen Antiestrogens (EM-800) und der Sexualsteroid-Vorstufe (DHEA) auf das Wachstum menschlicher ZR-75-1-Brustkrebs-Xenoimplantate in nackten Mäusen bei kombinierer Verabreichung der beiden Wirkstoffe untersucht. 4 und 5 zeigen, dass bei den verwendeten Dosierungen DHEA selbst eine 50- bis 80-prozentige Hemmung des Tumorwachstums hervorruft, während die fast vollständige Hemmung des Tumorwachstums, die durch eine niedrige Dosis des Antiestrogens erreicht wurde, durch DHEA nicht beeinträchtigt wurde.
Die Grenzen von Messungen der Knochenmineraldichte (BMD) sind gut bekannt. Zum Beispiel zeigten BMD-Messungen keine Veränderung bei Ratten, die mit dem steroidalen Antiestrogen ICI 182780 behandelt worden waren (Wakeling, Breast Cancer Res. Treat. 25: 1–9, 1993), während hemmende Veränderungen durch Histomorphometrie aufgezeigt wurden (Gallagher und Mitautoren, Endocrinology 133: 2787–2791, 1993). Über ähnliche Unterschiede wurde bei Tamoxifen berichtet (Jordan und Mitautoren, Breast Cancer Res. Treat. 10: 31–35, 1987; Sibonga und Mitautoren, Breast Cancer Res. Treatm. 41: 71–79, 1996).
Es sollte darauf hingewiesen werden, dass verringerte Knochenmineraldichte nicht die einzige mit verminderter Knochenstärke einhergehende Abnormalität ist (Guidelines for preclinical and clinical evaluation of agents used in the prevention or treatment of postmenopausal osteoporosis [Richtlinien für die präklinische und klinische Bewertung von Mitteln, die in der Verhütung oder Behandlung von postmenopausaler Osteoporose verwendet werden], Division of Metabolism and Endocrine Drug Products, FDA, Mai 1994). Es ist daher wichtig, die durch verschiedene Verbindungen und Behandlungen induzierten Veränderungen in biochemischen Parametern des Knochenmetabolismus zu analysieren, um bessere Erkenntnisse über ihre Wirkung zu gewinnen.
Es ist besonders wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Kombination von DHEA und EM-800 unerwartete nützliche Auswirkungen auf wichtige biochemische Parameter des Knochenmetabolismus hatte. Tatsächlich hatte DHEA allein keine Auswirkung auf das Hydroxyprolin/Kreatinin-Verhältnis im Harn, das ein Anzeiger für Knochenresorption ist. Ausserdem konnte keine Auswirkung von DHEA auf die tägliche Ausscheidung von Calcium oder Phosphor im Harn nachgewiesen werden (Luo und Mitautoren, Endocrinology 138: 4435–4444, 1997). Auf der anderen Hand senkte EM-800 das Hydroxyprolin/Kreatinin-Verhältnis im Harn um 48%, während ähnlich wie bei DHEA keine Auswirkung von EM-800 auf die Ausscheidung von Calcium oder Phosphor im Harn zu sehen war. Ausserdem hatte EM-800 keine Auswirkung auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase im Serum, die ein Anzeiger für Knochenbildung ist, während DHEA den Wert dieses Parameters um ewa 75% erhöhte (Luo und Mitautoren, Endocrinology 138: 4435–4444, 1997).
Eine der unerwarteten Auswirkungen der Kombination von DHEA und EM-800 bezieht sich auf das Hydroxyprolin/Kreatinin-Verhältnis im Harn, das ein Anzeiger für Knochenresorption ist und um 69% verringert war, wenn DHEA und EM-800 kombiniert vorlagen, wobei sich dieser Wert statistisch von der durch EM-800 allein erreichten 48-%igen Hemmung unterscheidet (p < 0,01), während DHEA allein keinerlei Wirkung hatte. Somit erhöht der Zusatz von DHEA zu EM-800 die hemmende Wirkung von EM-800 auf die Knochenreabsorption um 50%. Sehr wichtig war eine weitere unerwartete Auswirkung des Zusatzes von DHEA zu EM-800, nämlich eine ungefähr 84-%ige Abnahme von Calcium im Harn (von 23,17 ± 1.55 auf 3,71 ± 0,75 μmol/24 h/100 g (p < 0,01) und eine 55-%ige Abnahme von Phosphor im Harn (von 132,72 ± 6,08 auf 59,06 ± 4,76 μmol/24 h/100 g (p < 0,01) (Luo und Mitautoren, Endocrinology 138: 4435–4444, 1997).
Tabelle 1
Es ist auch interessant zu vermerken, dass die potente hemmende Wirkung von EM-800 auf Serum-Cholesterin durch eine gleichzeitige Behandlung mit DHEA nicht verhindert wird (Luo und Mitautoren, Endocrinology 138: 4435–4444, 1997).
Während Raloxifen und ähnliche Verbindungen Knochenverlust und eine Abnahme von Serum-Cholesterin verhindern (wie Estrogene), sollte erwähnt werden, dass bei einem Vergleich der Wirkung von Raloxifen mit Premarin auf die BMD die Wirkung von Raloxifen auf die BMD weniger potent war als die von Premarin (Minutes of the Endocrinology and Metabolism Drugs Advisory Committee, FDA, Donnerstag-Sitzung Nr. 68, 20. November 1997).
Die vorliegenden, an Ratten gewonnenen Ergebnisse zeigen deutlich, dass DHEA die nützlichen Auswirkungen liefern kann, die bei der alleinigen Verwendung eines selektiven Estrogenrezeptormodulators (SERM) wie EM-800, Raloxifen usw. fehlen. Während ein SERM auf die Hemmung von Knochenresorption beschränkte Auswirkungen hat, wird angenommen, dass der Zusatz von DHEA, 5-Diol, DHEA-S die Knochenbildung stimuliert (eine bei einem SERM oder Estrogen nicht zu findende Auswirkung) und des Weiteren die Knochenresorption über die mit EM-800 erreichte Wirkung hinaus verringert.
Es ist wichtig, dass die Kombination von EM-800 und DHEA in ovariektomierten Ratten, die während zwölf Monaten behandelt worden waren, nützliche Auswirkungen auf die Knochenmorphometrie hat. Das trabekuläre Knochenvolumen ist für Knochenfestigkeit und die Verhütung von Knochenbrüchen besonders wichtig. So erhöhte sich in der oben erwähnten Untersuchung das trabekuläre Knochenvolumen des Schienbeins in ovariektomiertem Ratten von 4,1 ± 0,7% auf 11,9 ± 0,6% (p < 0,01) mit DHEA allein, während der Zusatz von EM-800 zu DHEA das trabekuläre Knochenvolumen weiter auf 14,7 ± 1,4% erhöhte, was ein Wert ist, der dem in unversehrten Kontrollen gefundenen ähnlich ist (6).
In ovariektomierten Ratten erhöhte die Behandlung mit DHEA den Wert von 0,57 + 0,08 pro mm für die trabekuläre Knochenzahl um 137% gegenüber ovariektomierten Kontrollen. Die stimulierende Wirkung von DHEA erreichte somit 1,27 ± 0,1 pro mm, während eine gleichzeitige Behandlung mit EM-800 und DHEA zu einer zusätzlichen Erhöhung der trabekulären Knochenzahl um 28% (p < 0,01) gegenüber der mit DHEA allein erreichten führte (7). Ähnlich führte der Zusatz von EM-800 zur DHEA-Behandlung zu einer zusätzlichen Abnahme des trabekulären Knochenabstands um 15% (p < 0,05) gegenüber der mit DHEA allein erreichten, führte also zu Werten, die sich von den in unversehrten Kontrollen beobachteten nicht unterschieden.
Als eine Ergänzung zu den in 6 und 7 vorgestellten Zahlenwerten veranschaulicht 8 die durch DHEA induzierte Erhöhung des trabekulären Knochenvolumens in der proximalen Schienbeinmetaphyse in ovariektomierten, behandelten Tieren (C) im Vergleich zu ovariektomierten Kontrollen (B) sowie die teilweise Hemmung der stimulierenden Wirkung von DHEA nach einem Zusatz von Flutamid zur DHEA-Behandlung (D). Andererseits führte die Verabreichung von DHEA in Kombination mit EM-800 zu einer völligen Verhütung der durch Ovariektomie induzierten Osteopenie (E), indem das trabekuläre Knochenvolumen dem in unversehrten Kontrollen beobachteten (A) vergleichbar war.
Der bei der Menopause in Frauen beobachtete Knochenverlust steht vermutlich mit einer Erhöhung der Knochenresorption in Beziehung, die durch die sekundäre Erhöhung der Knochenbildung nicht voll kompensiert wird. Tatsächlich sind bei Osteoporose die Parameter der Knochenbildung wie auch die der Knochenresorption erhöht, und Knochenresorption wie auch Knochenbildung wird durch die Estrogenersatztherapie gehemmt. Es wird daher angenommen, dass die hemmende Wirkung des Estrogenersatzes auf Knochenbildung aus einem gekoppelten Mechanismus zwischen Knochenresorption und Knochenbildung entsteht, so dass die primäre, durch Estrogen induzierte Verringerung der Knochenresorption eine Verringerung der Knochenbildung nach sich zieht (Parfitt, Calcified Tissue International 36 Suppl. 1: S37–S45, 1984).
Die Festigkeit spongiöser Knochen und die daraus folgende Bruchresistenz hängen nicht nur von der Gesamtmenge des spongiösen Knochens ab, sondern auch von der trabekulären Mikrostruktur, wie sie durch die Anzahl, Grösse und Verteilung der Trabekeln bestimmt wird. Der Verlust der Eierstockfunktion in postmenopausalen Frauen wird von einer signifikanten Abnahme des trabekulären Knochengesamtvolumens begleitet (Melsen und Mitautoren, Acta Pathologica & Microbiologica Scandinavia 86: 70–81, 1978; Vakamatsou und Mitautoren, Calcified Tissue International 37: 594–597, 1985), hauptsächlich verbunden mit einer Abnahme der Anzahl, zu einem geringeren Grade der Breite der Trabekeln (Weinstein und Hutson, Bone 8: 137–142, 1987).
In der vorliegenden Untersuchung wurde die stimulierende androgene Wirkung von DHEA an fast allen untersuchten histomorphometrischen Knochenparametern beobachtet. So führte DHEA zu einer signifikanten Erhöhung des trabekulären Knochenvolumens wie auch der Trabekelzahl, aber senkte die intertrabekuläre Fläche.
Um den kombinationstherapeutischen Aspekt der Erfindung für alle hier diskutierten Indikationen zu befördern, werden pharmazeutische Zusammensetzungen durch die Erfindung in Betracht gezogen, die sowohl den SERM oder die Bisphosphonatverbindung als auch die Sexualsteroid-Vorstufe (DHEA, DHEAS, 5-Diol) zur gleichzeitigen Verabreichung in einer einzigen Zusammensetzung enthalten. Die Zusammensetzung kann sich für eine Verabreichung in jeder herkömmlichen Weise eignen, einschliesslich, aber nicht beschränkt auf eine orale Verabreichung, subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion oder perkutane Verabreichung. In anderen Ausführungsformen wird ein Kit zur Verfügung gestellt, der einen oder mehrere SERM oder Bisphosphonat und Sexualsteroid-Vorstufen in getrennten Behältern oder einem Behälter enthält. Der Kit kann geeignete Materialien für eine orale Verabreichung, zum Beispiel Tabletten, Kapseln, Sirupe und dergleichen und für eine transdermale Verabreichung zum Beispiel Salben, Lotionen, Gele, Cremes, Pflaster für eine langzeitige Freisetzung usw. enthalten.
Die Anmelder nehmen an, dass eine Verabreichung von SERM und Sexualsteroid-Vorstufen in der Behandlung und/oder Verhütung der Entwicklung von Osteoporose, Brustkrebs, Hypercholesterinämie, Hyperlipidämie oder Atherosklerose nützlich ist. Die aktiven Bestandteile der Erfindung (ob SERM oder Vorstufe oder Bisphosphonat oder sonstige) können auf vielfältige Art formuliert und verabreicht werden.
Ein aktiver Bestandteil für transdermal oder transmukosal liegt bevorzugt in einer Menge von 0,5 bis 20 Gewichts-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zusammensetzung, vor, stärker bevorzugt in einer Menge zwischen 2 und 10%. DHEA oder 5-Diol sollten für eine perkutane Verabreichung in einer Konzentration von mindestens 7% vorliegen. Als eine Alternative kann der aktive Bestandteil in ein transdermales Pflaster eingebracht werden, das die fachbekannten Strukturen hat, zum Beispiel Strukturen wie die in EP 0 279 982 vorgestellten.
Wenn als eine Salbe, Lotion, ein Gel oder eine Creme formuliert, wird die aktive Verbindung mit einem geeigneten Träger vermischt, der mit der menschlichen Haut oder Schleimhaut verträglich ist und das transdermale Eindringen der Verbindung durch die Haut oder Schleimhaut verstärkt. Geeignete Träger sind im Fach bekannt und schliessen Klucel HF und Glaxal-Base ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Einige sind im Handel erhältlich, zum Beispiel Glaxal-Base von Glaxal Canada Ltd. Co. Andere geeignete Träger sind bei Koller und Buri, S. T. P. Pharma 3(2), 115–124, 1987, zu finden. Der Träger ist bevorzugt einer, in dem der/die aktiven Bestandteile bei Umgebungstemperatur in der Konzentration des aktiven Bestandteils löslich sind, die verwendet wird. Der Träger sollte eine genügend hohe Viskosität besitzen, um den Inhibitor auf einer eingegrenzten Haut- oder Schleimhautfläche zu halten, auf die die Zusammensetzung aufgetragen worden ist, ohne innerhalb einer Zeitdauer, die ein weitgehendes Eindringen der Vorstufe durch die eingegrenzte Haut- oder Schleimhautfläche und in den Blutstrom ermöglicht, wo sie eine erwünschte klinische Wirkung entfaltet, zu verlaufen oder zu verdampfen. Der Träger ist typischerweise eine Mischung mehrerer Komponenten, zum Beispiel pharmazeutisch annehmbarer Lösungsmittel und eines Verdickungsmittels. Eine Mischung von organischen und anorganischen Lösungsmitteln, zum Beispiel Wasser und ein Alkohol wie Ethanol, kann zu hydrophiler und lipophiler Löslichkeit beitragen.
Bevorzugte Sexualsteroid-Vorstufen sind Dehydroepiandrosteron (DHEA) (erhältlich von Diosynth Inc., Chicago, Illinois, USA), seine Pro-Pharmaka (erhältlich von Steraloids, Wilton, New Hampshire, USA), 3-Androsten-3β,17β-diol und seine Pro-Pharmaka EM-1304 und EM-01474-D (erhältlich von Steraloids, Wilton, New Hampshire USA).
EM-1304
EM-01474-D
Es wird bevorzugt, dass die Sexualsteroid-Vorstufe als ein alkoholisches Gel formuliert wird, das 2,0 bis 10% Caprylsäure/Caprinsäure-Triglycerid (Neobee M-5); 10 bis 20% Hexylenglycol; 2,0 bis 10% Diethylenglykolmonomethylether (Transcutol); 2,0 bis 10% Cyclomethicone (Dow Corning 345); 1,0 bis 2% Benzylalkohol und 1,0 bis 5,0% Hydroxypropylcellulose (Klucel HF) enthält.
Der Träger kann auch verschiedene Zusatzstoffe enthalten, die üblicherweise in Salben und Lotionen verwendet werden und in der Kosmetik und Medizin wohl bekannt sind. Zum Beispiel können Duftstoffe, Antioxidantien, Parfüme, Geliermittel, Verdickungsmittel wie Carboxymethylcellulose, Tenside, Stabilisatoren, Emollienten, Farbstoffe und weitere, ähnliche Mittel gegenwärtig sein. Bei einer Verwendung zur Behandlung von systemischen Erkrankungen sollte der Ort der Anwendung auf der Haut wechseln, um eine übermässige lokale Konzentration des aktiven Bestandteils und eine mögliche Überstimulation der Haut und Talgdrüsen durch androgene Metaboliten der Sexualsteroid-Vorstufe zu vermeiden.
In einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die orale Verabreichung liegen DHEA oder eine andere Vorstufe bevorzugt in einer Konzentration zwischen 5 und 98 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, stärker bevorzugt zwischen 50 und 98% und besonders bevorzugt zwischen 80 und 98% vor. Eine einzige Vorstufe wie DHEA kann der alleinige aktive Bestandteil sein, alternativ kann eine Mehrzahl von Vorstufen und/oder ihren Analogen verwendet werden (zum Beispiel eine Kombination von DHEA, DHEA-S, 5-Diol oder eine Kombination von zwei oder mehr Verbindungen, die in vivo zu DHEA, DHEA-S oder 5-Diol umgewandelt werden, oder eine Kombination von DHEA oder 5-Diol und einem oder mehreren ihrer Analogen, die in vivo zu DHEA oder 5-Diol umgewandelt werden, usw. Der Blutspiegel von DHEA ist das endgültige Kriterion für eine angemessene Dosierung, bei der die invididuellen Unterschiede in der Absorption und im Metabolismus berücksichtigt werden.
Bevorzugtermassen wird der behandelnde Arzt vor allem am Anfang der Behandlung die Gesamtreaktion des einzelnen Patienten auf DHEA und seine DHEA-Serumspiegel (im Vergleich zu den oben diskutierten, bevorzugten Serumkonzentrationen) sowie die Gesamtreaktion des Patienten auf die Behandlung überwachen und die Dosierung wie erforderlich anpassen, sofern der Metabolismus oder die Reaktion eines Patienten auf die Behandlung atypisch ist.
Eine erfindungsgemässe Behandlung ist für eine unbegrenzte Fortsetzung geeignet. Es wird erwartet, dass die DHEA- und/oder 5-Diol-Behandlung einfach die DHEA-Spiegel innerhalb eines Bereichs hält, die dem ähneln, der in Frauen vor der Menopause (Serumkonzentration zwischen 4 und 10 Mikrogramm pro Liter) oder in jungen erwachsenen Männern (Serumkonzentration zwischen 4 und 10 Mikrogramm pro Liter) natürlich vorkommt.
Die SERM-Verbindung oder das Bisphosphonat und/oder die Sexualsteroidvorstufe können auch auf oralem Wege verabreicht werden und zur oralen Verabreichung mit herkömmlichen pharmazeutischen Vehikeln, zum Beispiel mit sprühgetrockneter Lactose, mikrokristalliner Cellulose und Magnesiumstearat, zu Tabletten oder Kapseln formuliert werden.
Die aktive Substanz kann durch Vermischen mit festen, pulverförmigen Trägersubstanzen wie Natriumcitrat, Calciumcarbonat oder Dicalciumphosphat und Bindemitteln wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine oder Celluloseabkömmlingen zu Tabletten oder Drageekernen verarbeitet werden, möglicherweise auch unter Zusatz von Schmierstoffen wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat, „Carbowax" oder Polyethylenglykol. Im Falle von oralen Verabreichungsformen können natürlich geschmacksverbessernde Substanzen hinzugefügt werden.
Als weitere Formen können Steckkapseln zum Beispiel aus Hartgelatine sowie geschlossene Weichgelatinekapseln verwendet werden, die einen Weichmacher wie Glycerin enthalten. Die Steckkapseln enthalten die aktive Substanz bevorzugt in Gestalt von Granulat, zum Beispiel im Gemisch mit Füllstoffen wie Lactose, Saccharose, Mannit, Stärken wie Kartoffelstärke oder Amylopectin, Celluloseabkömmlingen oder hochdispersen Kieselsäuren. In Weichgelatinekapseln ist die aktive Substanz bevorzugt in geeigneten Flüssigkeiten wie Pflanzenölen oder flüssigen Polyethylenglykolen aufgelöst oder aufgeschlämmt.
Die Lotion, Salbe, das Gel oder die Creme sollten gründlich so in die Haut eingerieben werden, dass kein Überschuss offen sichtbar ist, und die Haut in diesem Bereich sollte nicht gewaschen werden, ehe der grösste Teil des transdermalen Eindringens stattgefunden hat, bevorzugt während mindestens vier Stunden und stärker bevorzugt während mindestens sechs Stunden.
Ein transdermales Pflaster kann verwendet werden, um die Vorstufe nach bekannten Methoden abzugeben. Es wird typischerweise während einer viel längeren Zeitdauer angewendet, zum Beispiel ein bis vier Tage, aber bringt den aktiven Bestandteil typischerweise mit einer kleineren Oberfläche in Berührung und ermöglicht eine langsame, konstante Zufuhr des aktiven Bestandteils.
Eine Anzahl transdermaler Arzneiabgabesysteme, die entwickelt worden und im Gebrauch sind, eignen sich für die Abgabe des aktiven Bestandteils der vorliegenden Erfindung. Die Freisetzungsgeschwindigkeit wird typischerweise durch eine Matrixdiffusion oder durch den Durchgang des aktiven Bestandteils durch eine begrenzende Membran geregelt.
Mechanische Aspekte transdermaler Vorrichtungen sind in der Ratte gut bekannt und werden zum Beispiel in den US-Patenten 5 162 037, 5 154 922, 5 135 480, 4 666 441, 4 624 665, 3 742 951, 3 797 444, 4 568 343, 5 064 654, 5 071 644, 5 071 657 erklärt, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme einbezogen werden. Zusätzlicher Hintergrund wird im europäischen Patent 0 279 982 und in der britischen Patentanmeldung 2 185 187 geliefert.
Die Vorrichtung kann eine von den allgemeinen, fachbekannten Typen sein, darunter die transdermalen Abgabevorrichtungen vom Klebermatrix- und Reservoirtyp. Die Vorrichtung kann Arzneimittel enthaltende Einbettungsmaterialien mit Fasern umfassen, die den aktiven Inhaltsstoff und/oder Träger absorbieren. In einer Vorrichtung vom Reservoirtyp kann das Reservoir durch eine Polymermembran definiert sein, die für den Träger und den aktiven Bestandteil undurchdringlich ist.
In einer transdermalen Vorrichtung hält die Vorrichtung selbst den aktiven Bestandteil mit der gewünschten, eingegrenzten Hautoberfläche in Berührung. In einer solchen Vorrichtung ist die Viskosität des Trägers für den aktiven Bestandteil weniger kritisch als bei einer Creme oder einem Gel. Ein Lösungsmittelsystem für eine transdermale Vorrichtung kann zum Beispiel Ölsäure, lineares Alkohollactat und Dipropylenglykol oder andere, fachbekannte Lösungsmittelsysteme enthalten. Der aktive Bestandteil kann im Träger aufgelöst oder aufgeschlämmt sein.
Zur Befestigung auf der Haut kann das transdermale Pflaster auf ein medizinisches Klebeband mit einem in der Mitte ausgestanzten Loch montiert werden. Der Klebstoff wird bevorzugt mit einer Abziehfolie abgedeckt, um ihn vor der Verwendung zu schützen. Typische geeignete Abziehmaterialien sind u.a. Polyethylen und mit Polyethylen beschichtetes Papier, zur leichten Entfernung bevorzugt mit Silicon beschichtet. Um die Vorrichtung anzubringen, wird die Folie einfach abgezogen und der Klebstoff auf die Haut des Patienten aufgebracht. Im US-Patent 5 135 480, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme einbezogen wird, beschreiben Bannon und Mitautoren eine alternative Vorrichtung mit nichtklebenden Mitteln zur Befestigung der Vorrichtung auf der Haut.
Das perkutane oder transmukosale Abgabesystem der Erfindung kann auch als ein neuartiges und verbessertes Abgabesystem für die Verhütung und/oder Behandlung von Osteoporose oder anderen Krankheiten verwendet werden, die günstig auf eine Behandlung mit Androgenen und/oder Estrogenen ansprechen.
Ein selektiver Estrogenrezeptormodulator der Erfindung besitzt eine Molekülformel mit den folgenden Merkmalen:

a) zwei durch ein bis zwei dazwischenliegende Kohlenstoffatome beabstandete aromatische Ringe, wobei die beiden aromatischen Ringe entweder nicht substituiert oder mit einer Hydroxylgruppe oder einer in vivo in Hydroxyl umgewandelten Gruppe substituiert sind; und b) eine Seitenkette, die einen aromatischen Ring sowie eine tertiäre Aminfunktion oder deren Salz besitzt.

Ein bevorzugter SERM der Erfindung ist EM-800, beschrieben in PCT/CA96/00097 (WO 96/26201). Die Molekülstruktur von EM-800 ist:
Ein weiterer bevorzugter SERM der Erfindung ist EM-01538:
EM-1538 (auch als EM-652.HCl bezeichnet) ist das Hydrochloridsalz des potenten Antiestrogens EM-652. Verglichen mit EM-800 ist EM-1538 ein einfacher und leichter zu synthetisierendes Salz. Es war auch einfach zu isolieren, zu reinigen, ist kristallisierbar und wies eine gute Stabilität im festen Zustand auf. Bei der Verabreichung entweder von EM-800 oder von EM-1538 wird angenommen, dass in vivo die gleiche aktive Verbindung entsteht.
Weitere bevorzugte SERM der Erfindung sind u.a. Tamoxifen ((Z)-2-[4-(1,2-Diphenyl-1-butenyl)]-N,N-dimethylethanamine) (erhältlich von Zeneca, UK), Toremifen (erhältlich von Orion-Farmos Pharmaceuticals, Finnland, oder Schering-Plough), Droloxifen und CP-336 156 (cis-1R-[4'-Pyrrolidino-ethoxyphenyl]-2S-phenyl-6-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydronapthalin D-(–)-Tartratsalz) (Pfizer Inc., USA), Raloxifen (Eli Lilly and Co., USA), LY 335563 and LY 353381 (Eli Lilly and Co., USA), Iodoxifen (SmithKline Beecham, USA), Levormeloxifen (3,4-trans-2,2-Dimethyl-3-phenyl-4-[4-(2-(2-(pyrrolidin-1-yl)ethoxy)phenyl]-7-methoxychroman) (Novo Notdisk A/S, Denmark), das in Shalmi und Mitautoren, WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037, WO 97/25038; und Korsgaard und Mitautoren, WO 97/25036, offenbart wird, GW5638 (beschrieben von Willson und Mitautoren, Endocrinology, 138(9), 3901–3911, 1997), und Indolabkömmlinge (offenbart von Miller und Mitautoren, EP 0 802 183 A1 ) und TSE 424, entwickelt von Wyeth Avers (USA) und offenbart in JP 10 036347 (American Home Products Corporation), sowie in WO 97/32837 beschriebene nichtsteroidale Estrogenabkömmlinge.
Jeder SERM, der für Wirksamkeit nach Empfehlung des Herstellers verwendet wird, kann verwendet werden. Geeignete Dosierungen sind im Fach bekannt. Jedes andere nichtsteroidale Antiestrogen, das im Handel erhältlich ist, kann erfindungsgemäss verwendet werden. Jede Verbindung, die eine den SERM ähnliche Aktivität besitzt (Beispiel: Raloxifen kann verwendet werden).
Erfindungsgemäss verabreichte SERM werden bevorzugt in einer Dosierung im Bereich von 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag (bevorzugt 0,05 bis 1,0 mg/kg) verabreicht, wobei 5 mg pro Tag und insbesondere 10 mg pro Tag, unterteilt in zwei gleiche Dosierungen, bei einer Person von durchschnittlichem Körpergewicht bevorzugt werden, wenn oral verabreicht, oder in einer Dosierung im Bereich von 0,003 bis 3,0 mg/kg Körpergewicht pro Tag (bevorzugt 0,015 bis 0,3 mg/ml), wobei 1,5 mg pro Tag und insbesondere 3,0 mg pro Tag, unterteilt in zwei gleiche Dosierungen, bei einer Person von durchschnittlichem Körpergewicht bevorzugt werden, wenn parenteral (d.h. intramuskulär, subkutan oder perkutan) verabreicht. Bevorzugt werden die SERM zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger verabreicht, wie unten beschrieben.
Bevorzugte Bisphosphonate der Erfindung sind u.a. Alendronat [(4-Amino-1-hydroxybutyliden)bisphosphonsäure Dinatriumsalz-Hydrat], erhältlich von Merck Sharp and Dohme unter der Handelsbezeichnung Fosamax, Etidronat [(1-Hydroxyethyliden)bisphosphonsäure-2,2'iminobisethanol], erhältlich von Procter and Gamble unter den Handelsbezeichnungen Didrocal und Didronel, Clodronat [(Dichlormethylen)bisphosphonsäure Dinatriumsalz], erhältlich von Rhône-Poulenc Rorer unter der Handelsbezeichnung Bonefos oder von Boehringer Mannheim unter der Handelsbezeichnung Ostac sowie Pamidronat (3-Amino-1-hydroxypropyliden)bisphosphonsäure Dinatriumsalz), erhältlich von Geigy unter der Handelsbezeichnung Aredia. Risedronat (1-Hydroxy-2-(3-pyridinyl)ethylidenbisphosphonsäure Mononatriumsalz) befindet sich in der klinischen Entwicklung. Alle anderen, im Handel erhältlichen Bisphosphonate können erfindungsgemäss verwendet werden, sämtlich in der von den Herstellern empfohlenen Dosierung. Gleichermassen können Sexualsteroid-Vorstufen in Dosierungen verwendet werden, die im Stande der Technik empfohlen werden, bevorzugt in Dosierungen, die die Kreislaufspiegel auf die von gesunden Männern im Alter von 20 bis 30 Jahren oder die von prämenopausalen erwachsenen Frauen zurückführen.
Hinsichtlich aller hier empfohlenen Dosierungen sollte der behandelnde Arzt die Reaktion des einzelnen Patienten überwachen und die Dosierung entsprechend anpassen.
BEISPIELE
Beispiel 1
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Tiere
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten [Crl:CD(SD)Br] wurden im Alter von 44 bis 46 Tagen von Charles River Canada Inc. (St. Constant, Quebec) bezogen und zu zweit in Käfigen in einer bezüglich Licht (12 h Licht/Tag; Licht an um 07:15 Uhr) und Temperatur (22 ± 2°C) kontrollierten Umgebung gehalten. Die Tiere erhielten Punna-Nagetierfutter und Leitungswasser nach Belieben. Die Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit dem CCAC-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren in einer vom Canadian Council on Animal Care (CCAC) genehmigten Einrichtung durchgeführt.
Induktion von Milchdrüsentumoren durch DMBA
Mammakarzinome wurden im Alter von 50 bis 52 Tagen durch eine einzelne intragastrische Verabreichung von 20 mg DMBA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 1 ml Maiskeimöl induziert. Zwei Monate später wurden zweiwöchentlich Tumormessungen durchgeführt. Die beiden grössten zueinander senkrechten Durchmesser jedes Tumors wurden mit dem Tastzirkel ermittelt, um die Tumorgrösse wie beschrieben abzuschätzen (Asselin und Mitautoren, Endocrinology 101: 666–671, 1977). Ort, Grösse und Anzahl der Tumoren wurden notiert.
Behandlung
Die Tiere wurden wahllos in Gruppen mit je 20 Ratten unterteilt, mit Ausnahme der Kontrollgruppe mit 40 Tieren. Die Tiere wurden während 282 Tagen mit den folgenden behandelt: 1) Kontrollvehikel sowohl für DHEA als auch für EM-800; 2) EM-800 ((+)-7-Pivaloyloxy-3-(4'-pivaloyloxyphenyl)-4-methyl-2-(4''-(2'''-piperidinoethoxy)phenyl)-2H-benzopyran) (75 μg, oral, einmal täglich) in 0,5 ml einer Aufschlämmung mit 4% Ethanol, 4% Polyethylenglykol-600, 1% Gelatine und 0,9% NaCl; 3) DHEA (10 mg, percutan, einmal täglich) in 0,5 ml 50% Ethanol, 50% Propylenglykol; und 4) mit EM-800 und DHEA. Die Behandlung wurde drei Tage vor der oralen Verabreichung von DMBA begonnen. EM-800 wurde in der Arzneimittelchemischen Abteilung unseres Labors synthetisiert, während DHEA von Steraloids Inc.,Wilton, NH gekauft wurde.
Viele der Kontrolltiere und einige der mit EM-800 oder DHEA behandelten Tiere wurden wegen übergrosser Tumoren sechs Monate nach der DMBA-Verabreichung unter durch Isofluran induzierter Anästhesie durch Halsausrenken getötet. Die Grösse und Anzahl der Tumoren dieser Ratten beim Tod wurden zusammen mit den in späteren Zeitintervallen an überlebenden Tieren gemessenen zur späteren Analyse des Auftretens von Tumoren, der durchschnittlichen Anzahl von Tumoren je tumorbefallener Ratte und der durchschnittlichen Tumorgrösse je tumorbefallenem Tier verwendet. Die übrig gebliebenen Tiere (neun Ratten von der Kontrollgruppe und 13 bis 19 Ratten von jeder anderen Gruppe) erhielten die Behandlung für weitere drei Monate, um die Langzeit-Schutzwirkung von DHEA und EM-800 allein bzw. in Kombination zu beobachten. Die Ratten wurden 279 Tage nach der Verabreichung von DMBA getötet. Die Gebärmütter, Vaginen und Eierstöcke wurden sofort entfernt, von Binde- und Fettgewebe getrennt und gewogen.
Mustergewinnung und -verarbeitung
Urinmuster über 24 Stunden wurden am Ende des Versuchs nach Überführung in metabolische Käfige (Allentown Caging Equipment Co., Allentown, NJ) von den ersten neun Ratten jeder Gruppe gewonnen. Zwei Harnmuster wurden an unterschiedlichen Tagen für jedes Tier gewonnen und analysiert, um den Einfluss der täglichen Schwankung zu minimieren. Daher stellt jeder gezeigte Wert den Mittelwert aus zwei an unterschiedlichen Tagen durchgeführten Messungen dar. Jeweils 0.5 ml Toluol wurde den Harnsammelröhrchen zugesetzt, um Harnverdampfung und Bakterienwachstum zu verhindern, und das Harnvolumen wurde aufgezeichnet. Rumpfblut wurde bei Tötung aufgefangen und über Nacht bei 4°C gerinnen lassen, ehe es während 30 min bei 3000 U/min zentrifugiert wurde.
Analyse der biochemischen Harn- und Serumparameter
Frische Muster wurden für die Prüfung auf Kreatinin, Calcium und Phosphor im Harn und auf alkalische Phosphatse-Gesamtaktivität (tALP), Cholesterin und Triglyceride im Serum verwendet. Diese biochemischen Parameter wurden mit einem Monarch 2000 Chemistry System (Instrumentation Laboratory Co. Lexington, MA) unter GLP-Bedingungen automatisch gemessen. Hydroxyprolin im Harn wurde wie beschrieben gemessen (Podenphant und Mitautoren, Clinica Chimica Acta 142: 145–148, 1984).
Knochenmassemessungen
Ratten wurden mit einer i.p.-Injektion von Ketamin-Hydrochlorid und Diazepam in Dosierungen von 50 bzw. 4 mg/kg Körpergewicht anästhetisiert. Das gesamte Skelett und der rechte Oberschenkelknochen wurden mit Doppelenergie-Röntgenabsorptiometrie (DEXA; QDR 2000-7.10C, Hologic, Waltham, MA) gescannt, die mit einer regional hochauflösenden Software ausgerüstet war. Die Scanfeldgrössen betrugen 28,110 × 17,805 cm and 5,0 × 1,902 cm, die Auflösungen betrugen 0,1511 × 0,0761 cm and 0,0254 × 0,0127 cm, während die Scangeschwindigkeiten 0,3608 bzw. 0,0956 mm/s für das Gesamtskelett bzw. den Oberschenkelknochen betrugen. Sowohl der Knochenmineralgehalt (BMC: bone mineral content) als auch die Knochenmineraldichte (BMD: bone mineral density) des Gesamtskeletts, der Lendenwirbelsäule und des Oberschenkelknochens wurden an den Scanbildern des Gesamtskeletts und des Oberschenkelknochens gemessen.
Statistische Analysen
Die statistische Signifikanz wurde in Übereinstimmung mit dem multiplen Spannweitentest von Duncan und Kramer gemessen (Biometrics 12: 307–310, 1956). Das Auftreten von Mammatumoren wurde mit Fishers exaktem Test analysiert (Conover, Practical Non parametric Statistics [Praktische parameterfreie Statistik], 2. Auflage, 153–170, 1980). Die Daten werden als Mittelwerte ± S. E. M. (standard error of the mean: Standardabweichung des Mittelwertes) dargestellt.
ERGEBNISSE
Wirkung auf die Entwicklung von durch DMBA induzierten Mammakarzinomen
Wie in 1 veranschaulicht, entwickelten 95% der Kontrolltiere fühlbare Mammatumoren innerhalb von 279 Tagen nach der Verabreichung von DMBA. Eine Behandlung mit DHEA oder EM-800 verhinderte teilweise die Entwicklung von durch DMBA induzierten Mammakarzinomen, das Auftreten verringerte sich so auf 57% (p < 0,01) bzw. 38% (p < 0,01). Interessanterweise führte die Kombination der beiden Verbindungen zu einer signifikant höheren Hemmwirkung als die durch jede Verbindung allein erreichte (p < 0,01 gegen DHEA oder EM-800 allein). Tatsächlich verschwanden die einzigen beiden Tumoren, die sich in der Gruppe der mit beiden Verbindungen behandelten Tiere entwickelt hatten, vor dem Ende des Versuchs.
Eine Behandlung mit DHEA oder EM-800 verringerte die durchschnittliche Anzahl von Tumoren je tumorbefallenem Tier von 4.7 ± 0.5 Tumoren in den Kontrolltieren auf 3.4 ± 0.7 (ns: nicht signifikant) und 1.4 ± 0.3 (p < 0,01) Tumoren/Tier, während in den Tieren, die beide Arzneimittel empfangen hatten, am Ende des Versuchs kein Tumor gefunden wurde (p < 0,01 gegen die drei anderen Gruppen) (2A). Einer der beiden Tumoren, die später verschwanden, existierte von Tag 79 bis Tag 201 nach DMBA-Verabreichung, während der andere Tumor von Tag 176 bis Tag 257 fühlbar war. Es ist aus 2B ersichtlich, dass DHEA oder EM-800 allein die durchschnittliche Tumorfläche je tumorbefallenem Tier am Ende des Versuchs von 12,8 ± 1,3 cm² auf 10,2 ± 2,1 cm² (ns) bzw. 7,7 ± 1,8 cm² (ns) senkten, während die Kombinationsbehandlung einen Nullwert ergab (p < 0,01 gegen die anderen drei Gruppen). Die beiden Tumoren, die sich in der Gruppe von Tieren entwickelten, die mit DHEA und EM-800 behandelt wurden, wuchsen nicht grösser als 1 cm². Es sollte erwähnt werden, dass die wirklichen Werte der durchschnittlichen Tumorfläche und die durchschnittliche Tumorzahl je tumorbefallenes Tier in der Kontrollgruppe höher als die in 2 dargestellten Werte sein sollten, da viele der Ratten wegen der übermässigen Grösse der Tumoren vor Ende des Versuchs getötet werden mussten. Die zur Zeit der Tötung gemessenen Werte wurden daher als solche in die in späteren Zeitintervallen ausgeführten Berechnungen einbezogen, um eine Verzerrung in der Kontrollgruppe zu minimieren, die jedenfalls signifikant über den anderen Gruppen blieb.
Wirkung auf Knochen
Eine langzeitige perkutane Verabreichung von DHEA an weibliche Ratten induzierte Erhöhungen der Knochenmineraldichte (BMD) des Gesamtskeletts, der Lendenwirbelsäule und des Oberschenkelknochens um 6,9% (p < 0,01), 10,6% (p < 0,05) bzw. 8,2% (p < 0,01) (Tabelle 2). Andererseits wurde keine signifikante Veränderung in den mit EM-800 behandelten Tieren gefunden. Wenn beide Verbindungen gleichzeitig verabreicht wurden, waren die erhaltenen Werte vergleichbar mit den mit DHEA allein erreichten.
Eine Behandlung mit DHEA erhöhte die alkalische Phosphatase-Gesamtaktivität (tALP) im Serum um 74% (p < 0,05), aber hatte keine Auswirkung auf die tägliche Ausscheidung von Calcium und Phosphor im Harn und auf das Verhältnis von Hydroxyprolin zu Kreatinin im Harn (Tabelle 3). Andererseits senkte eine Behandlung mit EM-800 das Verhältnis von Hydroxyprolin zu Kreatinin im Harn um 48% (p < 0,01), aber hatte keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die tägliche Ausscheidung von Calcium und Phosphor mit dem Harn oder auf die tALP-Serumaktivität. Die Kombination von DHEA und EM-800 führte zu einem Anstieg in der tALP-Serumaktivität (p < 0,01) ähnlich dem mit DHEA allein erreichten und senkte das Verhältnis von Hydroxyprolin zu Kreatinin im Harn um 69%, was ein signifikant niedrigerer Wert (p < 0,01) als der mit EM-800 allein erreichte ist. Ausserdem senkte die Kombination der beiden Arzneien die tägliche Ausscheidung von Calcium und Phosphor im Harn signifikant um 84% (p < 0,01) bzw. 56% (p < 0,01), während mit jeder Arznei allein keine signifikante Veränderung beobachtet wurde (Tabelle 3).
Auswirkung auf Serumlipidspiegel
Eine Langzeitbehandlung mit EM-800 senkte die Serum-Triglycerid- und -Cholesterinspiegel um 72% (p < 0,01) bzw. um 45% (p < 0,01), während eine Langzeitverabreichung von DHEA die Serum-Triglyceridspiegel um 60% (p < 0,01) senkte, wobei die Cholesterinspiegel unbeeinflusst blieben. Ausserdem wurden Abnahmen um 42% (p < 0,01) bzw. 52% (p < 0,01) in den Serumkonzentrationen von Triglyceriden und Cholesterin in Tieren gemessen, die sowohl mit EM-800 als auch mit DHEA behandelt wurden (3).
Tabelle 2
Tabelle 3
Beispiel 2
ZUSAMMENFASSUNG
In der Milchdrüse werden Androgene aus der Steroidvorstufe Dehydroepiandrosteron (DHEA) gebildet. Klinisches Beweismaterial deutet darauf hin, dass Androgene eine inhibierende Wirkung auf Brustkrebs haben. Andererseits stimulieren Estrogene die Entwicklung und das Wachstum von Brustkrebs. Wir haben die Auswirkung von DHEA allein oder kombiniert mit dem neuerdings beschriebenen reinen Antiestrogen EM-800 auf das Wachstum von Tumor- Xenoimplantaten untersucht, die sich aus der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie ZR-75-1 in ovariektomierten nackten Mäusen gebildet haben.
Die Mäuse erhielten unmittelbar nach der Ovariektomie tägliche subkutane Injektionen von 0,3 μg Estron (einem estrogenen Hormon). EM-800 (15, 50 oder 100 μg) wurde oral einmal täglich gegeben. DHEA wurde zweimal täglich (Gesamtdosis 0,3, 1,0 oder 3,0 mg) auf die Rückenhaut aufgebracht, entweder allein oder kombiniert mit einer täglichen oralen Dosis von 15 μg EM-800. Die Veränderungen in der Tumorgrösse, die als Reaktion auf die Behandlungen eintraten, wurden periodisch im Vergleich zu am ersten Tag gemachten Messungen abgeschätzt. Am Ende der Experimente wurden die Tumoren seziert und gewogen.
In ovariektomierten Mäusen, die lediglich Estrom erhielten, wurde innerhalb von 9,5 Monaten eine 9,4-fache Vergrösserung der Tumoren gegenüber Mäusen beobachtet, die kein Estron erhielten. Die Verabreichung von 15, 50 oder 100 μg EM-800 an die zusätzlich mit Estron versorgten, ovariektomierten führte zu Hemmungen von 88%, 93% bzw. 94% in der Tumorgrösse. Auf der anderen Seite hemmte DHEA bei Dosierungen von 0,3, 1,0 oder 3,0 mg das Endgewicht der Tumoren um 67%, 82% bzw. 85%. Vergleichbare Inhibierungen der Tumorgrösse wurden mit einer täglichen oralen Dosis von 15 μg EM-800 mit unterschiedlichen Dosierungen von perkutanem DHEA oder ohne DHEA erhalten.
DHEA und EM-800 unterdrückten unabhängig voneinander das Wachstum von durch Estron stimulierten ZR-75-1-Mäuse-Xenoimplantat-Tumoren in nackten Mäusen. Eine Verabreichung von DHEA in den definierten Dosierungen bewirkte keine Änderung der hemmenden Wirkung von EM-800.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
ZR-75-1-Zellen
Menschliche ZR-75-1-Brustkrebszellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) bezogen und routinemässig als Monoschichten in einer befeuchteten Atmosphäre von 95% Luft/5% CO₂ bei 37°C in einem RPMI-1640-Medium kultiviert, das mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 IE Penicillin/ml, 100 μg Streptomycin/ml und 10% fötalem Rinderserum angereichert war, wie beschrieben (Poulin und Labrie, Cancer Res. 46: 4933–4937, 1986; Poulin und Mitarbeiter, Breast Cancer Res. Treat. 12: 213–225, 1988). Die Zellen wurden wöchentlich nach einer Behandlung mit 0,05% Trypsin/0,02% EDTA (Gew/Vol) passagiert. Die für die in diesem Bericht beschriebenen Experimente verwendeten Zellkulturen waren von der Passage Nr. 93 der Zelllinie ZR-75-1 abgeleitet.
Tiere
Weibliche homozygote athymische Harlan-Sprague-Dawley- (nu/nu) Mäuse (28 bis 42 Tage alt) wurden von HSD (Indianapolis, Indiana, USA) bezogen. Die Mäuse wurden in Vinylkäfigen mit Luftfilteroberteil in Abzugsschränken mit laminarer Luftströmung untergebracht und unter pathogenarmen Bedingungen gehalten. Die Käfige, die Einstreu und das Futter wurde vor Gebrauch autoklaviert. Das Wasser wurde autoklaviert, auf pH 2,8 angesäuert und nach Belieben bereitgestellt.
Zelleninokulierung
Unter einer durch intraperitoneale Injektion von 0,25 ml Avertin (Amylalkohol: 0,8 g/100 ml 0,9% NaCl; und Tribromethanol: 2 g/100 ml 0,9% NaCl) je Tier erreichte Anästhesie wurden Mäuse eine Woche vor der Tumorzelleninokulierung beidseitig ovariektomiert (OVX). 1,5 × 10⁶ ZR-75-1-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden nach einer Behandlung der Monoschicht mit 0,05% Trypsin/0,02% EDTA (Gew/Vol) geerntet, in 0,1 ml eines 25% Matrigel enthaltenden Kulturmediums suspendiert und subkutan an beiden Flanken des Tieres mit einer Nadel (1 Zoll lang, Nadelmass 20) inokuliert, wie früher beschrieben (Dauvois und Mitautoren, Cancer Res. 51: 3131–3135, 1991). Um das Wachstum der Tumoren zu befördern, erhielt jedes Tier täglich während fünf Wochen eine subkutane Injektion von 10 μg Estradiol (E₂) in einem Vehikel, das aus 0,9% NaCl, 5% Ethanol und 1% Gelatine bestand. Nach dem Erscheinen fühlbarer ZR-75-1-Tumoren wurde der Tumordurchmesser mit einem Tastzirkel gemessen, und Mäuse, die Tumordurchmesser zwischen 0,2 und 0,7 cm hatten, wurden für diese Untersuchung ausgewählt.
Hormonale Behandlung
Alle Tiere ausser denen in der OVX-Kontrollgruppe erhielten tägliche subkutane Injektionen von 0,5 μg Estron (E₁) in 0,2 ml 0,9% NaCl 5% Ethanol 1% Gelatine. In den gekennzeichneten Gruppen wurde DHEA zweimal täglich perkutan in Dosierungen von 0,3, 1,0 oder 3,0 mg/Tier verabreicht, und zwar in einem Volumen von 0,02 ml auf die Rückenhautfläche ausserhalb des Gebiets des Tumorwachstums aufgebracht. DHEA wurde in 50% Ethanol 50% Propylenglykol aufgelöst. EM-800, ((+)-7-Pivaloyloxy-3-(4'-pivaloyloxyphenyl)-4-methyl-2-(4''-(2'''-piperidinoethoxy)phenyl)-2H-benzopyran), wurde wie früher beschrieben (Gauthier und Mitautoren, J. Med. Chem. 40: 2117–2122, 1997) in der arzneimittelchemischen Abteilung des Labors für Molekulare Endokrinologie des CHUL-Forschungszentrums synthetisiert. EM-800 wurde in 4% (Vol/Vol) Ethanol 4% (Vol/Vol) Polyethylenglykol (PEG) 600 1% (Gew/Vol) Gelatine 0,9% (Gew/Vol) NaCl aufgelöst. Die Tiere der gekennzeichneten Gruppen erhielten tägliche orale Dosen von 15 μg, 50 μg oder 100 μg EM-800 allein oder kombiniert mit DHEA, während die Tiere der OVX-Gruppe lediglich das Vehikel (0,2 ml 4% Ethanol 4% PEG 600 1% Gelatine 0,9% NaCl) erhielten. Die Tumoren wurden einmal wöchentlich mit einer Schublehre gemessen. Zwei zueinander senkrechte Durchmesser wurden in cm (L und W: Länge und Breite) notiert, und die Tumorfläche (cm²) wurde mit der Gleichung berechnet: L/2 × W/2 × π (Dauvois und Mitautoren, Cancer Res. 51: 3131–3135, 1991). Die am ersten Tag der Behandlung gemessene Fläche wurde als 100% angenommen, und Veränderungen der Tumorgrösse wurden in Prozent der anfänglichen Tumorfläche ausgedrückt. Im Falle subkutaner Tumoren ist es allgemein nicht möglich, das dreidimensionale Volumen des Tumors genau zu erfassen, daher wurden nur die Tumorflächen gemessen. Nach 291 Tagen (oder 9,5 Monaten) der Behandlung wurden die Tiere getötet.
Die Reaktionskategorien wurden wie beschrieben bewertet (Dauvois und Mitautoren, Breast Cancer Res. Treat. 14: 299–306, 1989; Dauvois und Mitautoren, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 891–897, 1989; Labrie und Mitautoren, Breast Cancer Res. Treat. 33: 237–244, 1995). Kurz gesagt, entspricht eine partielle Regression den Tumoren, die um 50% ihrer ursprünglichen Grösse oder mehr zurückgingen; eine stabile Reaktion bezieht sich auf Tumoren, die um weniger als 50% ihrer ursprünglichen Grösse zurückgingen oder um weniger als 50% ihrer ursprünglichen Grösse zunahmen, während vollständige Regression sich auf jene Tumoren bezieht, die am Ende der Behandlung nicht auffindbar waren. Progression bezieht sich auf Tumoren, die um mehr als 50% ihrer ursprünglichen Grösse zunahmen. Am Ende des Experiments wurden alle Tiere durch Köpfen getötet. Tumoren, Gebärmütter und Vaginen wurden sofort entfernt, von Binde- und Fettgewebe befreit und gewogen.
Statistische Analyse
Die statistische Signifikanz der Auswirkungen von Behandlungen auf die Tumorgrösse wurde unter Benutzung einer Abweichungsanalyse (ANOVA: analysis of variance) abgeschätzt, indem die durch DHEA, EM-800 und die Zeit verursachten Wirkungen bewertet und wiederholte Messungen an den gleichen Tieren zu Beginn und am Ende der Behandlung (Faktor von Subjekten innerhalb einer Gruppe) ausgeführt wurden. Die wiederholten Messungen zur Zeit Null und nach 9,5 Monaten der Behandlung stellen zufällig zusammengestellte Blöcke von Tieren dar. Zeit wird somit als ein Effekt innerhalb des Blocks analysiert, während die beiden Behandlungen als Effekte zwischen Blöcken abgeschätzt werden. Alle Wechselwirkungen zwischen Haupteffekten wurden in das Modell einbezogen. Die Signifikanz der Behandlungsfaktoren und ihrer Wechselwirkungen wurde mit Subjekten innerhalb der Gruppe als Fehlerglied analysiert. Die Daten wurden log-transformiert. Die der ANOVA zugrunde liegenden Annahmen sind Normalität der Residuen und Homogenität der Abweichung.
Unter Benutzung des Fisher-Tests auf kleinste signifikante Unterschiede wurden a posteriori paarweise Vergleiche angestellt. Die Haupteffekte und die Wechselwirkung der Behandlung auf Körper- und Organgewicht wurden mit einer normalen zweiseitigen ANOVA mit Wechselwirkungen analysiert. Alle ANOVA wurden unter Verwendung von SAS-Programm ausgeführt (SAS Institute, Gary, NC, USA). Die Signifikanz von Unterschieden wurde auf Grund eines zweiseitigen Tests mit einem Gesamtniveau von 5% ausgesprochen.
Kategorische Daten wurden mit einem Kruskall-Wallis-Test für geordnete kategorische Reaktionsvariablen analysiert (vollständige Reaktion, teilweise Reaktion, stabile Reaktion, Progression des Tumors). Nach einer Gesamtbewertung eines Behandlungseffekts wurden Teilmengen der in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse analysiert, indem der kritische p-Wert für mehrfache Vergleiche angepasst wurde. Die exakten p-Werte wurden mit dem StatXact-Programm (Cytel, Cambridge, MA, USA) berechnet.
Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung vom Mittelwert (SEM: standard error of the mean) von 12 bis 15 Mäusen in jeder Gruppe ausgedrückt.
ERGEBNISSE
Wie in 4A veranschaulicht, vergrösserten sich menschliche ZR-75-1-Tumoren über eine Zeitdauer von 291 Tagen (9,5 Monaten) um einen Faktor von 9,4 in ovariektomierten nackten Mäusen, die mit einer täglichen Dosis von 0,5 μg subkutan verabreichten Estrons behandelt wurden, während in OVX-Kontrollmäusen, die lediglich das Vehikel erhielten, die Tumorgrösse im Verlaufe der Untersuchung auf 36,9% des anfänglichen Wertes sank.
Eine Behandlung mit steigenden Dosierungen perkutan verabreichter DHEA bewirkte eine progressive Hemmung des E₁-stimulierten ZR-75-1-Tumorwachstums. Inhibitionen von 50,4%, 76,8% und 80,0% wurden bei 9,5 Monaten der Behandlung mit täglichen DHEA-Dosen von 0,3 mg, 1,0 mg bzw. 3,0 mg je Tier erzielt (4A). In Übereinstimmung mit der Abnahme der Gesamttumorbelastung führte die Behandlung mit DHEA zu einer markanten Verringerung des Durchschnittsgewichts der Tumoren, die am Ende des Experiments verblieben. Das durchschnittliche Tumorgewicht verringerte sich nämlich von 1,12 ± 0,26 g in zusätzlich mit E₁ versorgten, ovariektomierten nackten Kontrollmäusen auf 0,37 ± 0,12 g (P = 0.005), 0,20 ± 0,06 g (P = 0,001) und 0,17 ± 0,06 g (P = 0,0009) in den Gruppen von Tieren, die die täglichen Dosen von 0,3, 1,0 bzw. 3,0 mg DHEA erhielten (4B).
Bei täglichen Dosen von 15 μg, 50 μg und 100 μg inhibierte das Antiestrogen EM-800 die Grösse der durch Estrogen stimulierten Tumoren um 87,5% (P < 0,0001), 93,5% (P < 0.0001) bzw. 94.0% (P = 0,0003) (5A), verglichen mit der Tumorgrösse in Kontrolltieren bei 9,5 Monaten.
Die Tumorgrössenverringerungen, die mit den drei EM-800-Dosierungen erzielt wurden, unterscheiden sich nicht signifikant voneinander. Wie in 4B veranschaulicht, sank das Tumorgewicht am Ende der 9,5-monatigen Untersuchung von 1,12 + 0,26 g in zusätzlich mit Ei versorgten OVX-Kontrollmäusen auf 0,08 ± 0,03 g, 0,03 ± 0,01 g und 0,04 ± 0,03 g in Tieren, die mit Tagesdosen von 15 μg, 50 μg bzw. 100 μg EM-800 behandelt worden waren (P < 0,0001 bei allen EM-800-Dosierungen gegen zusätzlich mit E₁ versorgte OVX).
Wie oben erwähnt, verursachte das Antiestrogen bei der oralen Tagesdosis von 15 μg eine nach 9,5 Monaten gemessene 87,5-%ige Inhibierung des durch Estron stimulierten Tumorwachstums. Der Zusatz von DHEA in den drei verwendeten Dosierungen hatte keine signifikante Auswirkung auf die bereits markante, mit einer Tagesdosis des Antiestrogens EM-800 von 15 μg erreichte Inhibierung der Tumorgrösse (5B). So verringerte sich das durchschnittliche Tumorgewicht dramatisch von 1,12 ± 0,26 g in zusätzlich mit Estron versorgten Kontrollmäusen auf 0,08 ± 0,03 g (P < 0,0001), 0,11 ± 0,04 g (P = 0,0002), 0,13 ± 0,07 g (P = 0,0004) und 0,08 ± 0,05 g (P < 0,0001) in den Tieren, die die Tagesdosis von 15 μg des Antiestrogens allein oder in Kombination mit den DHEA-Dosen von 0,3, 1,0 bzw. 3,0 mg erhielten (kein signifikanter Unterschied wurde zwischen den vier Gruppen bemerkt) (4B).
Es war des Weiteren von Interesse, die mit den oben angegebenen Behandlungen erzielten Reaktionskategorien zu untersuchen. So verringerte eine Behandlung mit steigenden Dosierungen von DHEA die Anzahl fortschreitender Tumoren von 87,5% in zusätzlich mit Estron versorgten OVX-Kontrolltieren auf Werte von 50,0%, 53,3% und 66,7%, allerdings nicht auf einem Niveau statistischer Signifikanz (P = 0,088), in Tieren, die mit Tagesdosen von 0,3, 1,0 bzw. 3,0 mg DHEA behandelt wurden (Tabelle 4). Die vollen Reaktionen stiegen andererseits von 0% in den zusätzlich mit Estron versorgten Mäusen auf 28,6%, 26,7% und 20,0% in Tieren, die perkutane Tagesdosen von 0,3, 1,0 und 3,0 mg DHEA erhielten. Stabile Reaktionen wurden andererseits bei 12,5%, 21,4%, 20,0% und 13,3% in den zusätzlich mit E₁ versorgten Kontrollmäusen und in den drei Gruppen von Tieren gemessen, die die oben angegebenen DHEA-Dosierungen erhielten. In den ovariektomierten Kontrollmäusen wurden die Verhältnisse der vollen, partiellen und stabilen Reaktion zu 68,8%, 6,2% und 18,8% gemessen, während eine Progression nur in 6,2% der Tumoren beobachtet wurde (Tabelle 4).
Volle Reaktionen bzw. ein Verschwinden der Tumoren wurde in 29,4%, 33,3%, 26,7% und 35,3% der Tumoren in Tieren erzielt, die das Antiestrogen EM-800 (P = 0,0006) allein (15 μg) oder in Kombination mit den 0,3 mg, 1,0 mg bzw. 3,0 mg DHEA erhielten (Tabelle 4). Progression wurde andererseits in 35,3%, 44,4%, 53,3% bzw. 17,6% der Tumoren in den gleichen Gruppen von Tieren beobachtet. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den mit EM-800 entweder allein oder in Kombination mit DHEA behandelten Gruppen.
Keine signifikante Auswirkung einer DHEA- oder EM-800-Behandlung wurde bei dem bezüglich des Tumorgewichts korrigierten Körpergewicht beobachtet. Eine Behandlung von OVX-Mäusen mit Estron erhöhte das Gebärmuttergewicht von 28 ± 5 mg in OVX-Kontrollmäusen auf 132 ± 8 mg (P < 0,01), während steigende DHEA-Dosen eine progressive, aber verhältnismässig kleine Hemmung der stimulierenden Wirkung von Estron bewirkten, die bei der höchsten verwendeten DHEA-Dosis einen Wert von 26% erreichte (P = 0,0008). Aus der gleichen Figur ist ersichtlich, dass das durch Estron stimulierte Gebärmuttergewicht von 132 ± 8 mg in zusätzlich mit Estron versorgten Kontrollmäusen mit oralen Tagesdosen von 15 μg, 50 μg bzw. 100 μg EM-800 (insgesamt P < 0,0001) auf 49 ± 3 mg, 36 ± 2 mg und 32 ± 1 mg (P < 0,0001 bei allen Dosierungen, gegen die Kontrolle) abnahm. Bei 15 μg EM-800 in Kombination mit den 0,3 mg, 1,0 mg bzw. 3,0 mg einer Tagesdosis von DHEA wurden Gebärmuttergewichte von 46 ± 3 mg, 59 ± 5 mg bzw. 69 ± 3 mg gemessen.
Anderseits erhöhte eine Behandlung mit Estron das Scheidengewicht von 14 ± 2 mg in den OVX-Tieren auf 31 ± 2 mg (P < 0,01), während der Zusatz von DHEA keine signifikante Wirkung hatte. Das Scheidengewicht verringerte sich dann auf 23 ± 1 mg, 15 ± 1 mg bzw 11 ± 1 mg infolge der Behandlung mit Tagesdosen von 15 μg, 50 μg bzw. 100 μg EM-800 (Gesamt-p und paarweise P < 0,0001 bei allen Dosierungen gegen die Kontrolle). In Kombination mit den 0,3 mg, 1,0 mg bzw. 3,0 mg DHEA-Dosen und EM-800 wurden Scheidengewichte von 22 ± 1 mg, 25 ± 2 mg bzw. 23 ± 1 mg gemessen (ns für alle Gruppen gegen 15 μg EM-800). Es sollte erwähnt werden, dass EM-800 bei der höchsten verwendeten Dosierung, nämlich von 100 μg täglich, das Gebärmuttergewicht in zusätzlich mit Estron versorgten OVX-Tieren auf einen Wert verringerte, der sich nicht von den OVX-Kontrollen unterschied, während das Scheidengewicht auf einen Wert unter dem in OVX-Kontrollen gemessenen sank (P < 0,05). DHEA wirkte wahrscheinlich wegen seiner androgenen Effekte der Wirkung von EM-800 auf das Gebärmutter- und Scheidengewicht teilweise entgegen.
Tabelle 4
Beispiel 3
Wirkung der bevorzugten Verbindung der Erfindung auf die Cholesterinspiegel in ovariektomierten weiblichen Ratten
Tiere und Behandlung
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada) in einem Alter von 50 bis 60 Tagen, die zum Zeitpunkt der Ovariektomie etwa 190 g wogen, wurden benutzt. Die Tiere wurden während einer Woche vor der Operation an die Umgebungsbedingungen (Temperatur: 22 ± 3°C; Luftfeuchte: 50 ± 20%; Zyklen mit 12 Stunden Licht, 12 Stunden Dunkelheit, Licht an 07:15 Uhr) akklimatisiert. Die Tiere wurden zu dritt in den Käfigen untergebracht und hatten freien Zugang zu Leitungswasser und zu ver bürgtem Nagetier-Trockenfutter (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO). Das Experiment wurden in Übereinstimmung mit dem CCAC-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren in einer vom Canadian Council on Animal Care (CCAC) genehmigten Einrichtung durchgeführt.
Einhundertsechsunddreissig weibliche Ratten wurden am Tag null der Studie unter Isofluran-Anäesthesie ovariektomiert und zufallsbedingt in 17 Gruppen von Tieren eingeteilt, um die unten umrissene Untersuchung auszuführen:
Gruppe 1: OVX CONT
Gruppe 2: OVX + EM-800 (0,01 mg/kg, po, ID)
Gruppe 3: OVX + EM-800 (0,03 mg/kg, po. ID)
Gruppe 4: OVX + EM-800 (0,1 mg/kg, po, ID)
Gruppe 5: OVX + EM-800 (0,3 mg/kg, po. ID)
Gruppe 6: OVX + EM-800 (1 mg/kg, po. ID)
Gruppe 7: OVX + EM-01538 (0,01 mg/kg, po, ID)
Gruppe 8: OVX + EM-01538 (0,03 mg/kg, po. ID)
Gruppe 9: OVX + EM-01538 (0,1 mg/kg, po. ID)
Gruppe 10: OVX + EM-01538 (0,3 mg/kg, po. ID)
Gruppe 11: OVX + EM-01538 (1 mg/kg, po. ID)
Gruppe 12: OVX + Raloxifen (EM-1105)(0,01 mg/kg, po. ID)
Gruppe 13: OVX + Raloxifen (EM-1105)(0,03 mg/kg, po, ID)
Gruppe 14: OVX + Raloxifen (EM-1105)(0,1 mg/kg, po, ID)
Gruppe 15: OVX + Raloxifen (EM-1105)(0,3 me/kg, po, ID)
Gruppe 16: OVX + Raloxifen (EM-1105)(1 mg/kg, po, ID)
Gruppe 17: INT CONT
Die Verabreichung von Behandlungen begann am Tag 10 der Studie und erfolgte einmal täglich durch orale Gabe bis zum Tag 13 der Studie. Dosieraufschlämmungen wurden in 0,4% Methylcellulose zubereitet, die Konzentration wurde dem mittleren Körpergewicht der Gruppe angepasst, das am Tag 10 der Studie notiert worden war, um je Ratte 0,5 ml der Aufschlämmung zuzuteilen. Ungefähr 24 Stunden nach der letzten Zuteilung wurden die Tiere, die über Nacht fasteten, unter Isofluran-Anästhesie durch Ausbluten über die Bauchaorta getötet, und Blutmuster wurden zur Serumzubereitung verarbeitet. Die Gebärmütter wurden entfernt, von verbleibendem Fett befreit und gewogen.
Serum-Cholesterin- and -Triglyceridprüfungen
Die Serum-Gesamtcholesterin- und -triglyceridspiegel wurden mit den Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems) bestimmt.
Beispiel 4
Androsten-3β,17β-diol(5-Diol) besitzt innewohnende estrogene Aktivität. Ausserdem kann es als eine Sexualsteroid-Vorstufe in peripheren intrakrinen Geweben in aktive Androgene und/oder andere Estrogene umgewandelt werden. Um die relative Bedeutung der androgenen und estrogenen Komponenten der Wirkung von 5-Diol auf die Knochenmasse abzuschätzen, wurden 21 Wochen alte Ratten ovariektomiert und während 12 Monaten einmal täglich perkutan mit 2, 5 bzw. 12,5 mg 5-Diol allein oder in Kombination mit dem Antiandrogen Flutamid (FLU, 10 mg, s.c., einmal täglich) und/oder dem Antiestrogen EM-800 (100 μg, s.c., einmal täglich) behandelt. Die Knochenmineraldichte (BMD) wurde nach elf Monaten der Behandlung gemessen. Ovariektomie (OVX) führte zu einem 12,8-%igen Abfall der Oberschenkelknochen-BMD (p < 0,01), während eine Behandlung mit der höchsten Dosierung von 5-Diol 34,3% der Oberschenkelknochen-BMD, die während der elf Monate nach Ovariektomie verloren gingen, zurückbrachte (p < 0,01). Eine gleichzeitige Verabreichung von FLU verhinderte die stimulierende Wirkung des 5-Diols auf die Oberschenkelknochen-BMD vollständig, während der Zusatz von EM-800 zu einer zusätzlichen 28,4-%igen Stimulierung gegenüber der alleinigen Wirkung des 5-Diols führte. Bei gleichzeitiger Verabreichung von 5-Diol, FLU und EM-800 war nur die Wirkung von EM-800 zu sehen (27%), während die Wirkung des 5-Diols durch FLU völlig blockiert war. Vergleichbare Ergebnisse wurden an der BMD der Lendenwirbelsäule erhalten, obwohl die Lendenwirbelsäulen-BMD in OVX-Ratten, die lediglich 12,5 mg 5-Diol, 12,5 mg 5-Diol + EM-800 oder 5-Diol + FLU + EM-800 erhielten, auf Werte zurückgebracht wurde, die sich nicht signifikant von den Werten unversehrter Tiere unterschieden. Die histomorphometrische Analyse zeigt, dass die stimulierenden Auswirkungen des 5-Diols auf das Knochenvolumen, die Zahl der Trabekeln und die inhibierende Wirkung auf den trabekulären Abstand der sekundären Spongiosa der proximalen Schienbeinmetaphysenfläche durch FLU zunichte gemacht, aber durch EM-800 weiter verstärkt werden. Die markante Stimulierung der alkalischen Phosphatase-Serumaktivität, die nach der Behandlung mit 5-Diol erzielt wird (57% gegen 12,5 mg 5-Diol allein, mit p < 0,01), kehrt sich bei der gleichzeitigen Verabreichung von FLU um. Die Behandlung mit 5-Diol hatte keine statistisch signifikante inhibierende Wirkung auf das Calcium/Kreatinin-Verhältnis im Harn. Die höchste 5-Diol-Dosis bewirkte eine signifikante 23-%ige Verringerung (p < 0,01) des Serum-Cholesterins, während der Zusatz von EM-800 das Serum-Cholesterin um 62% verringerte (p < 0,01).
Die vorliegenden Daten zeigen deutlich die stimulierende Wirkung von 5-Diol auf die Knochenbildung und legen nahe, obwohl 5-Diol ein schwaches Estrogen ist, dass seine stimulierende Wirkung auf die Knochenbildung vorwiegend durch einen androgenen Effekt vermittelt wird. Ausserdem demonstrieren die additiven stimulierenden Wirkungen von EM-800 und 5-Diol auf die Knochenmasse die knochenschonende Wirkung des Antiestrogens EM-800 in der Ratte. Die Cholesterin senkende Aktivität sowohl von 5-Diol als auch von EM-800 könnte interessante Nützlichkeit für die Verhütung von Herz-Kreislauf-Krankheiten haben.
Beispiel 6 Beispiel der Synthese der bevorzugten Verbindung der Erfindung Synthese von (S)-(+)-7-Hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4''-(2'''-piperidinoethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyran-Hydrochlorid EM-01538 (EM-652, HCl)

Schritt A: BF₃·Et₂O, Toluol; 100°C; 1 Stunde.
Schritt C: 3,4-Dihydropyran, p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat, Ethylacetat; 25°C unter Stickstoff, 16 Stunden, dann Kristallisation aus Isopropanol.
Schritte D, E und F: 1) Piperidin, Toluol, Dean & Stark-Apparat, Rückfluss unter Stickstoff; 2) 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]undec-7-en, DMF, Rückfluss 3 h; 3) CH₃MgCl, THF, –20 bis 0°C, dann Raumtemperatur während 24 h;
Schritte G, H: (1S)-(+)-10-Camphersulfonsäure, Aceton, Wasser, Toluol, Raumtemperatur, 48 h.
Schritt HH: 45% Ethanol, 70°C, dann Raumtemperatur 3 Tage.
Schritt HHR: Rückführung der Mutterlauge und Waschflüssigkeit aus Schritt HH (S)-10-Camphersulfonsäure, Rückfluss; 36 h, dann Raumtemperatur während 16 h.
Schritt I:

1) DMF aq, Na₂CO₃, Ethylacetat;
2) Ethanol, verdünnte HCl;
3) Wasser.

Synthese von 2-Tetrahydropyranyloary-4-hydrogy-2'-(4''-tetrahydropyranyloxyphenyl)acetophenon (4). Eine Aufschlämmung von 2,4-Dihydroxy-2'-(4''-hydroxyphenyl)acetophenon 3 (97,6 g, 0,4 mol) (erhältlich von Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) in 3,4-Dihydropyran (218 ml, 3,39 mol) und Ethylacetat (520 ml) wurde bei etwa 25°C mit p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat (0,03 g, 0,158 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde während etwa 16 Stunden unter Stickstoff ohne äussere Erwärmung gerührt. Das Gemisch wurde dann mit einer Lösung von Natriumbicarbonat (1 g) und Natriumchlorid (5 g) in Wasser (100 ml) gewaschen. Die Phasen wurden getrennt, die organische Phase wurde mit Salzsole (20 ml) gewaschen. Jede Waschflüssigkeit wurde mit 50 ml Ethylacetat rückextrahiert. Alle organischen Phasen wurden vereinigt und durch Natriumsulfat filtriert.
Lösungsmittel (etwa 600 ml) wurde bei Atmosphärendruck abdestilliert, und Isopropanol (250 ml) wurde hinzugefügt. Weiteres Lösungsmittel (etwa 300 ml) wurde bei Atmosphärendruck abdestilliert, und Isopropanol (250 ml) wurde hinzugefügt. Weiteres Lösungsmittel (etwa 275 ml) wurde bei Atmosphärendruck abdestilliert, und Isopropanol (250 ml) wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde unter Rühren bei etwa 25°C gekühlt, nach etwa 12 h wurde der feste kristalline Stoff abfiltriert, mit Isopropanol gewaschen und getrocknet (116,5 g, 70%).
Synthese von 4-Hydroxy-4-methyl-2-(4'-[2''-piperidino]ethoxy)phenyl-3-(4'''-tetrahydropyranyloxy)phenyl-7-tetrahydropyranyloxychroman (10). Eine Lösung von 2-Tetrahydropyranyloxy-4-hydroxy-2'-(4''-tetrahydropyranyloxyphenyl)acetophenon 4 (1 kg, 2,42 mol), 4-[2-(1-Piperidino)ethoxy]benzaldehyd 5 (594 g, 2,55 mol) (erhältlich von Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) und Piperidin (82,4 g, 0,97 mol) (erhältlich von Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.) in Toluol (8 Liter) wurde mit einem Dean & Stark-Apparat unter Stickstoff und Rückfluss erhitzt, bis sich ein Äquivalent Wasser (44 ml) gesammelt hatte.
Toluol (6,5 Liter) wurde bei Atmosphärendurck aus der Lösung abdestilliert. Dimethylformamid (6,5 Liter) und 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]undec-7-en (110,5 g, 0,726 mol) wurden hinzugefügt. Die Lösung wurde während etwa 8 h bei Raumtemperatur gerührt, um das Chalkon 8 zu Chromanon 9 zu isomerisieren, dann zu einem Gemisch aus Wasser und Eis (8 Liter) und Toluol (4 Liter) hinzugefügt. Die Phasen wurden getrennt, die Toluolschicht wurde mit Wasser (5 Liter) gewaschen. Die vereinigten wässrigen Waschflüssigkeiten wurden mit Toluol (3 × 4 Liter) extrahiert. Die vereinigten Toluolauszüge wurden schliesslich mit Salzsole (3 × 4 Liter) gewaschen, bei Atmosphärendruck auf 5,5 Liter eingeengt und dann auf –10°C abgekühlt.
Unter anhaltendem Kühlen von aussen und Rühren unter Stickstoff wurde eine 3 M Methylmagnesiumchloridlösung in THF (2,5 Liter, 7,5 mol) (erhältlich von Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.) hinzugefügt, während die Temperatur unter 0°C gehalten wurde. Nach Zugabe der gesamten Grignard-Verbindung wurde die äussere Kühlung entfernt, das Gemisch konnte sich auf Raumtemperatur erwärmen. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur während etwa 24 h gerührt.
Das Gemisch wurde wieder auf etwa –20°C abgekühlt, dann wurde unter anhaltender äusserer Kühlung und Rühren langsam gesättigte Ammoniumchloridlösung (200 ml) hinzugefügt, während die Temperatur unter 20°C gehalten wurde. Das Gemisch wurde während 2 h gerührt, dann gesättigte Ammoniumchloridlösung (2 Liter) und Toluol (4 Liter) hinzugefügt und während 5 min gerührt. Die Phasen wurden getrennt, die wässrige Schicht wurde mit Toluol (2 × 4 Liter) extrahiert. Die vereinigten Toluolauszüge wurden mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure gewaschen, bis die Lösung homogen wurde, und dann mit Salzsole (3 × 4 Liter). Die Toluollösung wurde schliesslich bei Atmosphärendruck auf 2 Liter eingeengt. Diese Lösung wurde direkt im nächsten Schritt eingesetzt.
Synthese von (2R,S)-7-Hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4''-[2'''-piperidino]ethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyran (1S)-10-Camphersulfonsäuresalz (±12). Zur Toluollösung von 4-Hydroxy-4-methyl-2-(4'-[-2''-piperidino]ethoxy)phenyl-3-(4'''-tetrahydropyranyloxy)phenyl-7-tetrahydropyranyloxychroman (10) wurden Aceton (6 Liter), Wasser (0,3 Liter) und (S)-10-Camphersulfonsäure (561 g, 2,42 mol) (erhältlich von Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.) hinzugegeben. Die Mischung wurde während 48 Stunden unter Stickstoff gerührt, wonach das feste (2R,S)-7-Hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4''-[2'''-piperidino]ethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyran (1S)-10-Camphersulfonsäuresalz (12) abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet wurde (883 g). Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt (HH) eingesetzt.
Synthese von (2S)-7-Hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4''-(2'''-piperidino]ethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyran (1S)-10-Camphersulfonsäuresalz (13, (+)-EM-652(1S)-CSA-Salz). Eine Aufschlämmung von (2R,S)-7-Hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4''-[2'''-piperidino]ethoxy)phenyl)-2H-benzopyran (1S)-10-Camphersulfonsäuresalz = 12 (759 g) in 95% Ethanol wurde unter Rühren auf etwa 70°C erwärmt, bis der feste Körper sich aufgelöst hatte. Die Lösung konnte dann unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen und wurde mit einigen Kristallen von (2S)-7-Hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4''-[2'''-piperidino]ethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyran (1S)-10-Camphorsulfonsäuresalz 13 geimpft. Die Lösung wurde während insgesamt etwa drei Tagen bei Raumtemperatur gerührt. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit 95% Ethanol gewaschen und getrocknet (291 g, 76%). Der de des Produkts betrug 94,2%, die Reinheit 98,8%.
Synthese von (S)-(+)-7-Hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4''-(2'''-piperidinoethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyran-Hydrochlorid EM-01538 (EM-652, HCl). Eine Aufschlämmung der Verbindung 13 (EM-652-(+)-CSA-Salz, 500 mg, 0,726 mmol) in Dimethylformamid (11 μl, 0,15 mmol) wurde mit einer 0,5 M wässrigen Natriumcarbonatlösung (7,0 ml, 3,6 mmol) behandelt und während 15 min gerührt. Die Aufschlämmung wurde mit Ethylacetat (7,0 ml) behandelt und während 4 h gerührt. Die organische Phase wurde dann mit einer gesättigten wässrigen Natriumcarbonatlösung (2 × 5 ml) und mit Salzsole (1 × 5 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Eine Lösung des anfallenden rosa Schaumes (EM-652) in Ethanol (2 ml) wurde mit 2 N Chlorwasserstoffsäure (400 μl, 0,80 mmol) behandelt, während 1 h gerührt, mit destilliertem Wasser (5 ml) behandelt und während 30 min gerührt. Die anfallende Aufschlämmung wurde filtriert, mit destilliertem Wasser (5 ml) gewaschen, in Luft und unter Hochvakuum (65°C) getrocknet und ergab ein cremiges Pulver (276 mg, 77%): Feines, gebrochen weisses Pulver; dynamische Differenz-Kalorimetrie: Beginn des Schmelzpeaks bei 219°C, ΔH = 83 J/g; [α]²⁴D = 154° in Methanol 10 mg/ml; ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ (ppm) 1,6 (breit, 2H, H-4'''), 1,85 (breit, 4H, H-3'''' und 5''''), 2,03 (s, 3H, CH₃), 3,0 und 3,45 (breit, 4H, H-2'''' und 6''''), 3,47 (t, J = 4,9 Hz, 2H, H-3'''), 4,26 (t, J = 4,9 Hz, 2H, H-2'''), 5,82 (s, 1H, H-2), 6,10 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-8), 6,35 (dd, J = 8,4, 2,43 Hz, 1H, H-6), 6,70 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-3' und H-5'), 6,83 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-3'' und H-5''), 7,01 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2' und H-6'), 7,12 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5), 7,24 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-2'' und H-6''); ¹³C RMN (CD₃OD, 73 MHz): δ ppm 14,84, 22,50, 23,99, 54,78, 57,03, 62,97, 81,22, 104,38, 109,11, 115,35, 116,01, 118,68, 125,78, 126,33, 130,26, 130,72, 131,29, 131,59, 134,26, 154,42. 157,56, 138,96, 159,33. Elementarzusammensetzung: C, H, N, Cl, Theorie: 70,51, 6,53, 2,84, 7,18%, gefunden: 70,31, 6,75, 2,65, 6,89%.
BEISPIEL 7
In Vivo-Prüfungen der biologischen Verfügbarkeit der Pro-Pharmaka von 5-Androsten-3β,17β-diol
1) Prinzip
Die Prüfungen der biologischen Verfügbarkeit von Pro-Pharmaka der Sexualsteroid-Vorstufen wurden an männlichen Sprague-Dawley-Ratten ausgeführt, indem die Plasmakonzentrationen der Verbindungen nach einer einzelnen oralen Verabreichung der Verbindungen gemessen wurden.
a) Tiere und Behandlung
Männliche Sprague-Dawley-Ratten [Crl:CD(SD)Br] mit einem Gewicht von 275 bis 350 g wurden von Charles-River Canada Inc. bezogen und während der Akklimatisierungszeit zu zweit, während der Untersuchungszeit einzeln in Käfigen untergebracht. Die Tiere wurden unter Bedingungen von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit gehalten (Licht an 08:00 Uhr). Die Tiere erhielten verbürgtes Nagetierfutter (Lab Diet Nr. 5002, Trockenfutter) und Leitungswasser nach Belieben. Vom Abend vor der Verabreichung an erhielten die Ratten kein Futter (Zugang nur zu Wasser).
Jede zu prüfende Verbindung wurde drei Tieren oral als eine Aufschlämmung in 0,4% Methylcellulose in einer Menge von 150 μmg/Ratte verabreicht. Jeweils ein Blutmuster von etwa 0,7 ml wurde 1, 2, 3, 4 und 7 Stunden nach der Verabreichung unter durch Isofluran induzierter Anästhesie aus der Drosselvene entnommen. Die Blutmuster wurden sofort in einen gekühlten, EDTA enthaltenden 0,75-ml-Microtainer überführt und bis zum 10-minütigen Zentrifugieren bei 3000 U/min in einem Eis-Wasser-Bad gehalten. Die Plasmatrennung erfolgte rasch (innerhalb von weniger als 50 min) nach der Blutentnahme. Ein aliquoter Teil von 0,25 ml des Plasmas wurde dann in ein Borsilikatröhrchen (13 × 100) überführt und auf Trockeneis rasch gefroren. Die Plasmamuster wurden bis zur Messung der Plasmakonzentration des Sexualsteroids oder der Sexualsteroid-Vorstufen mit GC-MS bei –80°C aufbewahrt.
Ergebnisse:
Die orale Aufnahme und die Flächen unter den Kurven (AUC) werden in 12 und 13 vorgestellt.
PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIELE
Beispielhaft und nicht eingrenzend werden nachstehend mehrere pharmazeutische Zusammensetzungen vorgestellt, in denen EM-800 oder EM-1538 als der bevorzugte aktive SERM und DHEA, EM-1304 oder EM-01474-D als die bevorzugten aktiven Sexualsteroid-Vorstufen eingesetzt werden. Andere Verbindungen der Erfindung oder deren Kombination können anstelle von (oder zusätzlich zu) EM-800 oder EM-1538, DHEA, EM-1304 oder EM-01474-D verwendet werden. Die Konzentration des aktiven Bestandteils kann über einen breiten Bereich variiert werden, wie hierin diskutiert. Die Mengen und Typen anderer Bestandteile, die eventuell einbezogen werden, sind im Fach gut bekannt.
Beispiel A
Beispiel B
KITBEISPIELE
Beispielhaft und nicht eingrenzend werden nachstehend mehrere Kits vorgestellt, in denen EM-800 oder EM-1538 als bevorzugte aktive SERM und DHEA, EM-1304 oder EM-01474-D als die bevorzugten aktiven Sexualsteroid-Vorstufen eingesetzt werden. Andere Verbindungen der Erfindung oder deren Kombination können anstelle von (oder zusätzlich zu) EM-800 oder EM-1538, DHEA, EM-1304 oder EM-01474-D verwendet werden. Die Konzentration des aktiven Bestandteils kann über einen breiten Bereich variiert werden, wie hierin diskutiert. Die Mengen und Typen anderer Bestandteile, die eventuell einbezogen werden, sind im Fach gut bekannt.
Beispiel A
Der SERM wird oral verabreicht, während die Sexualsteroid-Vorstufe perkutan verabreicht wird.
Zusammensetzung der Sexualsteroid-Vorstufe zur topischen Verabreichung (Gel)
Beispiel B
Der SERM und die Sexualsteroid-Vorstufe werden oral verabreicht.
Nichtsteroidale Antiestrogenzusammensetzung für die orale Verabreichung (Kapseln)
Sexualsteroid-Vorstufenzusammensetzung zur oralen Verabreichung (Gelatinekapseln)
Andere SERM können statt EM-800 oder EM-01538 in den obigen Formulierungen eingesetzt werden, ebenso wie andere Sexualsteroid-Inhibitoren statt DHEA, EM-1304 oder EM-01474-D eingesetzt werden können. Mehr als ein SERM und mehr als eine Vorstufe können einbezogen werden, in welchem Falle der kombinierte Gewichtsprozentsatz bevorzugt der Gewichtsprozentsatz der einzelnen Vorstufe oder des einzelnen SERM ist, die in den obigen Beispielen angegeben sind.
Die Erfindung ist anhand von bevorzugten Ausführungsformen und Beispielen beschrieben worden, aber wird dadurch nicht eingeschränkt. Der Fachmann wird leicht die breitere Anwendbarkeit und Reichweite der Erfindung erkennen, die nur durch die Patentansprüche hierin begrenzt wird.

Claims

Verwendung einer Sexualsteroid-Vorstufe, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 5-Androsten-3β,17β-diol, 4-Androsten-3, 17-dion, einem Pro-Pharmakon von 5-Androsten-3β,17β-diol und einem Pro-Pharmakon von 4-Androsten-3,17-dion besteht, wobei das Pro-Pharmakon in vivo in die Vorstufe umgewandelt wird, sowie einer therapeutisch wirksamen Menge eines selektiven Estrogenrezeptor-Modulators in der Herstellung von Medikamenten für eine Kombinationstherapie zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Osteoporose, wobei der selektive Estrogenrezeptor-Modulator die folgende Formel besitzt:
worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyl oder eine in vivo zu Hydroxyl umgewandelte Einheit sind; worin Z eine zweiwertige ringschliessende Einheit ist; worin R₁₀₀ eine zweiwertige Einheit ist, die L vom B-Ring durch vier bis zehn dazwischenliegende Atome trennt; worin L eine aus der Gruppe von -SO-, -CON-, N< und -SON< ausgewählte zwei- oder dreiwertige polare Einheit ist; worin G₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, einem C₁- bis C₅-Kohlenwasserstoff oder einer zweiwertigen Einheit, die G₂ und L zu einem fünf- bis siebengliedrigen heterocyclischen Ring verbindet, sowie Halogen- oder ungesättigten Abkömmlingen der vorstehenden besteht; worin G₂ entweder abwesend ist oder aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, einem C₁- bis C₅-Kohlenwasserstoff oder einer zweiwertigen Einheit, die G₁ und L zu einem fünf- bis siebengliedrigen heterocyclischen Ring verbindet, sowie Halogen- oder ungesättigten Abkömmlingen der vorstehenden besteht; worin G₃ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Methyl und Ethyl besteht; und wobei das in vivo zu der Sexualsteroid-Vorstufe umgewandelte Pro-Pharmakon die folgende allgemeine Formel besitzt:
worin X aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus H-, ROC-, RCO₂CHR_a und R_bSO₂- besteht (wobei R aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, gerad- oder verzweigtkettigem C₁- bis C₁₈-Alkyl, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkenyl, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkinyl, Aryl, Furyl, gerad- oder verzweigtkettigem C₁- bis C₁₈-Alkoxy, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkenyloxy, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkinyloxy, Aryloxy, Furyloxy sowie Halogen- oder Carboxylanalogen der vorstehenden besteht; R_a Wasserstoff oder C₁- bis C₆-Alkyl ist; und R_b aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hydroxyl (oder dessen Salzen), Methyl, Phenyl und p-Toluyl besteht); worin Y ein Carbonylsauerstoff ist oder Y ein α-H und ein β-OX darstellt (wobei X die gleiche Bedeutung wie oben besitzt) und worin Y kein Carbonylsaüerstoff ist, wenn X=H-.
Verwendung nach Anspruch 1, weiter die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Biphosphonats zur Herstellung von Medikamenten für die benannte Kombinationstherapie umfassend.
Verwendung nach Anspruch 1, weiter die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Gestagens zur Herstellung von Medikamenten für die benannte Kombinationstherapie umfassend.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 3, wobei die Vorstufe nicht 4-Androsten-3,17-dion ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 4, wobei Z im selektiven Estrogenrezeptor-Modulator aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -O-, - NH-, -S- und -CH₂-besteht.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der selektive Estrogenrezeptor-Modulator ein Benzopyranabkömmling der folgenden allgemeinen Struktur ist:
worin D = -OCH₂CH₂N(R₃)R₄ (wobei R₃ und R₄ entweder unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus C₁- bis C₄-Alkyl besteht, oder R₃, R₄ und das Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, zusammen eine Ringstruktur bilden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pyrrolidino, Dimethyl-1-pyrrolidino, Methyl-1-Pyrrolidinyl, Piperidino, Hexamethylenimino und Morpholino besteht), und worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff Hydroxyl und einer in vivo zu Hydroxyl umgewandelten Einheit besteht.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Benzopyranabkömmling eine optisch aktive Verbindung mit einer absoluten Konfiguration S am Kohlenstoff 2 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist, und wobei diese Verbindung die molekulare Struktur
besitzt, worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxyl und einer in vivo in Hydroxyl umwandelbaren Einheit besteht; worin R₃ eine Spezies ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus gesättigtem, ungesättigtem oder substituiertem Pyrrolidinyl, gesättigtem, ungesättigtem oder substituiertem Piperidino, gesättigtem, ungesättigtem oder substituiertem Piperidinyl, gesättigtem, ungesättigtem oder substituiertem Morpholino, einer Stickstoff enthaltenden cyclischen Einheit, einer Stickstoff enthaltenden polycyclischen Einheit und NR_aR_b besteht (wobei R_a und R_b unabhängig voneinander Wasserstoff, gerad- oder verzweigtkettiges C₁- bis C₆-Alkyl, gerad- oder verzweigtkettiges C₂- bis C₆-Alkenyl oder gerad- oder verzweigtkettiges C₂- bis C₆-Alkinyl sind).
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die benannte Verbindung bzw. deren Salz im Wesentlichen frei von (2R)-Enantiomer ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der selektive Estrogenrezeptor-Modulator aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus EM-800
EM-01520
EM-01533
und EM-01518
besteht.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Benzopyranabkömmling ein Salz einer Säure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Essigsäure, Adipinsäure, Benzolsulfonsäure, Benzoesäure, Camphorsulfonsäure, Citronensäure, Fumarsäure, Iodwasser stoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Chlorwasserstoffsäure, Hydrochlorothiazidsäure, Hydroxynaphthoesäure, Milchsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, Methylschwefelsäure, 1,5-Naphthalindisulfonsäure, Salpetersäure, Palmitinsäure, Pivalinsäure, Phosphorsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Schwefelsäure, Weinsäure, Terephthalsäure, p-Toluolsulfonsäure und Valeriansäure besteht.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Säure Chlorwasserstoffsäure ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 3 bis 6, wobei der selektive Estrogenrezeptor-Modulator EM-1538
ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das in vivo zur Sexualsteroid-Vorstufe umgewandelte Pro-Pharmakon aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus EM-1304
und EM-01474
besteht.
Verwendung einer Sexualsteroid-Vorstufe, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 5-Androsten-3 (3β,17β-diol, 4-Androsten-3,17-dion, einem Pro-Pharmakon von 5-Androsten-3β,17β-diol und einem Pro-Pharmakon von 4-Androsten-3,17-dion besteht, wobei das Pro-Pharmakon in vivo in die Vorstufe umgewandelt wird, in der Herstellung von Medikamenten für eine Kombinationstherapie zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Osteoporose, wobei die Kombinationstherapie weiter die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines selektiven Estrogenrezeptor-Modulators einschliesst, wobei der Estrogenrezeptor-Modulator die folgende Formel besitzt:
worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyl oder eine in vivo zu Hydroxyl umgewandelte Einheit sind; worin Z eine zweiwertige ringschliessende Einheit ist; worin R₁₀₀ eine zweiwertige Einheit ist, die L vom B-Ring durch vier bis zehn dazwischenliegende Atome trennt; worin L eine aus der Gruppe von -SO-, -CON-, N< und -SON< ausgewählte zwei- oder dreiwertige polare Einheit ist; worin G₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, einem C₁- bis C₅-Kohlenwasserstoff oder einer zweiwertigen Einheit, die G₂ und L zu einem fünf- bis siebengliedrigen heterocyclischen Ring verbindet, sowie Halogen- oder ungesättigten Abkömmlingen der vorstehenden besteht; worin G₂ entweder abwesend ist oder aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, einem C₁- bis C₅-Kohlenwasserstoff oder einer zweiwertigen Einheit, die G₁ und L zu einem fünf- bis siebengliedrigen heterocyclischen Ring verbindet, sowie Halogen- oder ungesättigten Abkömmlingen der vorstehenden besteht; worin G₃ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Methyl und Ethyl besteht; und wobei das in vivo zu der Sexualsteroid-Vorstufe umgewandelte Pro-Pharmakon die folgende allgemeine Formel besitzt:
worin X aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus H-, ROC-, RCO₂CHR_a- und R_bSO₂-besteht (wobei R aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, gerad- oder verzweigtkettigem C₁- bis C₁₈-Alkyl, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkenyl, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkinyl, Aryl, Furyl, gerad- oder verzweigtkettigem C₁- bis C₁₈-Alkoxy, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkenyloxy, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkinyloxy, Aryloxy, Furyloxy sowie Halogen- oder Carboxylanalogen der vorstehenden besteht; R_a Wasserstoff oder C₁- bis C₆-Alkyl ist; und R_b aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hydroxyl (oder dessen Salzen), Methyl, Phenyl und p-Toluyl besteht); worin Y ein Carbonylsauerstoff ist oder Y ein α-H und ein β-OX darstellt (wobei X die gleiche Bedeutung wie oben besitzt) und worin Y kein Carbonylsauerstoff ist, wenn X=H-.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines selektiven Estrogenrezeptor-Modulators zur Herstellung von Medikamenten für eine Kombinationstherapie zur Behandlung oder Verminderung der Gefahr des Entstehens von Osteoporose, wobei die Kombinationstherapie weiter die Verwendung einer Sexualsteroid-Vorstufe einschliesst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 5-Androsten-3β,17β-diol, 4-Androsten-3,17-dion, einem Pro-Pharmakon von 5-Androsten-3β,17β-diol und einem Pro-Pharmakon von 4-Androsten-3,17-dion besteht, wobei das Pro-Pharmakon in vivo in die Vorstufe umgewandelt wird und wobei der selektive Estrogenrezeptor-Modulator die folgende Formel besitzt:
worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyl oder eine in vivo zu Hydroxyl umgewandelte Einheit sind; worin Z eine zweiwertige ringschliessende Einheit ist; worin R₁₀₀ eine zweiwertige Einheit ist, die L vom B-Ring durch vier bis zehn dazwischenliegende Atome trennt; worin L eine aus der Gruppe von -SO-, -CON-, N< und -SON< ausgewählte zwei- oder dreiwertige polare Einheit ist; worin G₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, einem C₁- bis C₅-Kohlenwasserstoff oder einer zweiwertigen Einheit, die G₂ und L zu einem fünf- bis siebengliedrigen heterocyclischen Ring verbindet, sowie Halogen- oder ungesättigten Abkömmlingen der vorstehenden besteht; worin G₂ entweder abwesend ist oder aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, einem C₁- bis C5-Kohlenwasserstoff oder einer zweiwertigen Einheit, die G₁ und L zu einem fünf- bis siebengliedrigen heterocyclischen Ring verbindet, sowie Halogen- oder ungesättigten Abkömmlingen der vorstehenden besteht; und worin G₃ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Methyl und Ethyl besteht; und wobei das in vivo zu der Sexualsteroid-Vorstufe umgewandelte Pro-Pharmakon die folgende allgemeine Formel besitzt:
worin X aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus H-, ROC-, RCO₂CHR_a und R_bSO₂-besteht (wobei R aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, gerad- oder verzweigtkettigem C₁- bis C₁₈-Alkyl, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkenyl, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkinyl, Aryl, Furyl, gerad- oder verzweigtkettigem C₁- bis C₁₈-Alkoxy, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkenyloxy, gerad- oder verzweigtkettigem C₂- bis C₁₈-Alkinyloxy, Aryloxy, Furyloxy sowie Halogen- oder Carboxylanalogen der vorstehenden besteht; R_a Wasserstoff oder C₁- bis C₆-Alkyl ist; und R_b aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hydroxyl (oder dessen Salzen), Methyl, Phenyl und p-Toluyl besteht); worin Y ein Carbonylsauerstoff ist oder Y ein α-H und ein β-OX darstellt (wobei X die gleiche Bedeutung wie oben besitzt) und worin Y kein Carbonylsauerstoff ist, wenn X=H-.