DE69928264T2

DE69928264T2 - Samen-bevorzugende promotoren

Info

Publication number: DE69928264T2
Application number: DE69928264T
Authority: DE
Inventors: J. Susan MARTINO-CATT; K. Kathryn LAPPEGARD; Xun Wang; A. Benjamin BOWEN
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1998-08-20
Filing date: 1999-08-17
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2019-08-18
Also published as: EP1104469B1; AR022067A1; US6225529B1; AU5489099A; ES2252964T3; CA2332628A1; DE69928264D1; CA2332628C; ATE309362T1; WO2000011177A1; EP1104469A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie, insbesondere die Regulierung der Genexpression in Pflanzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Expression von heterologen DNA-Sequenzen in einem Pflanzenwirt ist vom Vorliegen eines funktionell verknüpften Promotors abhängig, der innerhalb des Pflanzenwirts funktionell ist. Die Wahl der Promotorsequenz wird bestimmen, wann und wo die heterologe DNA-Sequenz innerhalb des Organismus exprimiert wird. Wenn eine kontinuierliche Expression durch die Zelle einer Pflanze gewünscht wird, werden konstitutive Promotoren verwendet. Wenn dagegen eine Genexpression als Reaktion auf einen Stimulus gewünscht wird, sind induzierbare Promotoren das regulatorische Element der Wahl. Wenn eine Expression in spezifischen Geweben oder Organen erwünscht ist, können gewebespezifische Promotoren verwendet werden. D.h., sie können eine Expression in spezifischen Geweben oder Organen steuern. Solche gewebespezifischen Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein. In jedem Fall können zusätzliche regulatorische Sequenzen stromaufwärts und/oder stromabwärts von der Kernpromotorsequenz in Expressionskonstrukten von Transformationsvektoren enthalten sein, um variierende Expressionslevel von heterologen Nucleotidsequenzen in einer transgenen Pflanze zustande zu bringen.
Häufig ist es wünschenswert, eine konstitutive oder induzierbare Expression einer DNA-Sequenz in besonderen Geweben oder Organen einer Pflanze zu haben. Beispielsweise könnte ein erhöhter Nährwert einer Pflanze durch genetische Manipulation des Pflanzengenoms erreicht werden, so dass ein Samen-bevorzugter Promotor funktionell an ein heterologes Gen gebunden enthalten ist, so dass Proteine mit erhöhtem Aminosäuregehalt im Samen der Pflanze produziert werden.
Alternativ könnte es wünschenswert sein, eine Expression einer nativen DNA-Sequenz in Geweben einer Pflanze zu inhibieren, um einen gewünschten Phänotyp zu erreichen. In diesem Fall könnte eine solche Inhibierung mit Transformation der Pflanze, um einen gewebespezifischen Promotor funktionell mit einer Antisense-Nucleotidsequenz verknüpft zu umfassen, erreicht werden, so dass eine Expression der Antisense-Sequenz ein RNA-Transkript produziert, das mit einer Translation der mRNA der nativen DNA-Sequenz interferiert.
Eine Samenentwicklung involviert eine Embryogenese und Reifungsereignisse, wie auch physiologische Anpassungsprozesse, die innerhalb des Samens ablaufen, um ein Überleben der Nachkommenschaft zu sichern. Sich entwickelnde Pflanzensamen akkumulieren und speichern Kohlenhydrat, Lipid und Protein, die anschließend während der Keimung verwendet werden. Eine Expression von Speicherproteingenen in Samen erfolgt in erster Linie in der Embryoachse und in den Kotyledonen und im Endosperm von sich entwickelnden Samen, aber niemals in rei fen vegetativen Geweben. Im Allgemeinen sind die Expressionsmuster von Samenproteinen in hohem Maße reguliert. Diese Regulierung beinhaltet eine räumliche und zeitliche Regulierung während der Samenentwicklung. Eine Vielzahl von Proteinen akkumulieren und nehmen während der Embryogenese und Samenentwicklung ab und stellen ein ausgezeichnetes System zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Genregulation, wie auch zur Bereitstellung regulatorischer Sequenzen zur Verwendung bei der genetischen Manipulation von Pflanzen bereit.
Demnach werden die Isolierung und Charakterisierung von Samen-bevorzugten Promotoren, die als regulatorische Regionen zur Expression von heterologen Nucleotidsequenzen von Interesse in Samen-bevorzugter Art dienen können, zur genetischen Manipulation von Pflanzen benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer neuen Nucleotidsequenz zur Modulierung der Genexpression in einer Pflanze.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines isolierten Promotors, der fähig ist, eine Transkription in Samen-bevorzugter Art zu steuern.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur verbesserten Kontrolle eines endogenen oder exogenen Produktes in Samen einer transformierten Pflanze.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Bereitstellung nützlicher Änderungen im Phänotyp eines Samens einer transformierten Pflanze.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Erzeugung eines neuen Produkts im Samen einer transformierten Pflanze.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Erzeugung einer neuen Funktion im Samen einer transformierten Pflanze.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung nach einem Aspekt:
einen isolierten Promotor, der fähig ist, eine Transkription in Samen-bevorzugter Art zu steuern, wobei der Promotor umfasst:

(a) die in SEQ ID NO: 1 oder 7 angegebene Nucleotidsequenz; oder
(b) eine Sequenz, die wenigstens 60% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1 oder 7 hat, wobei die % Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1 oder 7 auf der gesamten Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder 7 basiert und durch eine GAP-Version 10-Analyse unter Verwendung von Default-Parametern bestimmt wird; oder
(c) eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO: 7 hybridisiert; oder
(d) eine Nucleinsäure, die zu einer Nucleinsäure von (a), (b) oder (c) komplementär ist.

Nach anderen Aspekten bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Expressionskassetten, die den Promotor funktionell mit einer Nucleotidsequenz verknüpft umfassen, Vektoren, die die Expressionskassette enthalten, und Pflanzen, die in stabiler Weise mit wenigstens einer Expressionskassette transformiert sind.
Nach einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Modulieren der Expression im Samen einer stabil transformierten Pflanze, umfassend die Schritte (a) Transformieren einer Pflanze mit einer Expressionskassette, die den Promotor der vorliegenden Erfindung funktionell mit wenigstens einer Nucleotidsequenz verknüpft umfasst; (b) Wachsenlassen der Pflanzenzelle unter Pflanzenwachstumsbedingungen und (c) Regenerieren einer stabil transformierten Pflanze aus der Pflanzenzelle, wobei eine Expression der Nucleotidsequenz den Phänotyp des Samens verändert.
Zusammensetzungen und Verfahren zur Regulierung der Expression von heterologen Nucleotidsequenzen in einer Pflanze werden bereitgestellt. Die Zusammensetzungen sind neue Nucleotidsequenzen für Samen-bevorzugte Pflanzenpromotoren, insbesondere Regionen zur transkriptionalen Initiierung, die aus den Pflanzengenen Cim 1 (Cytokinin-induzierte Message); cZ19B1 (Mais-19KDa-Zein); und mi1ps (Myoinositol-1-phosphat-Synthase) isoliert wurden. Es wird ein Verfahren zum Exprimieren einer heterologen Nucleotidsequenz in einer Pflanze unter Verwendung der Transkriptionsinitiierungssequenzen, die hierin offenbart sind, bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Transformationsvektor, der eine heterologe Nucleotidsequenz funktionell mit einem der Pflanzenpromotoren der vorliegenden Erfindung verknüpft umfasst, und Regenerieren einer stabil transformierten Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle. Auf diese Weise sind die Promotorsequenzen zur Kontrolle der Expression von endogenen wie auch exogenen Produkten in Samen-bevorzugter Weise einsetzbar.
Stromabwärts von der samenspezifischen Region und unter der transkriptionalen Initiierungsregulation wird eine Sequenz von Interesse sein, die für eine Modifikation des Phänotyps des Samens sorgen wird. Eine solche Modifikation beinhaltet Isolieren der Produktion eines endogenen Produktes bezüglich Menge, relativer Verteilung oder dergleichen oder Produktion eines exogenen Expressionsproduktes, um für eine neue Funktion oder ein neues Produkt im Samen zu sorgen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung werden Nucleotidkonstrukte bereitgestellt, die eine Transkriptionsinitiierung in Samen ermöglichen. Konstrukte der Erfindung umfassen regulierte Transkriptionsstartregionen, die mit Samenbildung und Samengewebe assoziiert sind. So umfassen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung neue Nucleotidsequenzen für Pflanzenpromotoren, insbesondere Samen-bevorzugte Promotoren für die Gene Cim 1 (Cytokinin-induzierte Message); cZ19B1 (Mais-19kDa-Zein); und mi1ps (Myoinositol-1-phosphat-Synthase).
Die Promotoren für diese Gene können aus der 5'-untranslatierten Region, die ihre jeweiligen Transkriptionsinitiierungsstellen flankiert, isoliert werden. Verfahren zur Isolierung von Promotorregionen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Mit „isoliert" ist gemeint, dass die Promotorsequenzen durch molekulare Techniken extrahiert oder durch chemische Mittel synthetisiert werden können. In jedem Fall wird der Promotor von mindestens einer seiner flankierenden Sequenzen in seinem nativen Zustand entfernt. Sequenzen für die Promotorregionen werden dargestellt wie oben angegeben.
Verfahren zur Hybridisierung von Nucleinsäuresequenzen sind auf dem Fachgebiet leicht verfügbar. Promotorsequenzen aus anderen Pflanzen können nach gut bekannten Techniken auf der Basis ihrer Sequenzhomologie zu den hierin genannten Promotorsequenzen isoliert werden. Bei diesen Techniken wird die bekannte Promotorsequenz ganz oder ein Teil davon als Sonde verwendet, die selektiv an andere Sequenzen, die in einer Population klonierter genomischer DNA-Fragmente (d.h. genomische Bibliotheken) aus einem ausgewählten Organismus vorliegen, hybridisiert.
Die gesamte Promotorsequenz oder Teile davon können beispielsweise als Sonden verwendet werden, die fähig sind, spezifisch an entsprechende Promotorsequenzen zu hybridisieren. Um eine spezifische Hybridisierung unter einer Vielzahl von Bedingungen zu erreichen, umfassen solchen Sonden Sequenzen, die einzigartig sind, und haben vorzugsweise eine Länge von wenigstens etwa 10 Nucleotiden und am bevorzugtesten eine Länge von wenigstens etwa 20 Nucleotiden. Solche Sonden können eingesetzt werden, um entsprechende Promotorsequenzen aus einem ausgewählten Organismus durch das gut bekannte Verfahren der Polymerasekettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Diese Technik kann eingesetzt werden, um zusätzliche Promotorsequenzen aus einem gewünschten Organismus zu isolieren oder als diagnostischer Assay eingesetzt werden, um das Vorliegen der Promotorsequenzen in einem Organismus zu bestimmen.
Derartige Techniken beinhalten ein Hybridisierungsscreening von plattierten DNA-Bibliotheken (entweder Plaques oder Kolonien; siehe Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Herausg., Academic Press).
Die Ausdrücke "stringente Bedingungen" oder "stringente Hybridisierungsbedingungen" beinhalten eine Bezugnahme auf Bedingungen, unter denen eine Sonde zu einem detektierbar größeren Ausmaß als andere Sequenzen (z.B. wenigstens zweifach im Vergleich zum Hintergrund) an ihre Zielsequenz hybridisieren wird. Stringente Bedingungen sind Sequenz-abhängig und werden unter verschiedenen Umständen verschieden sein. Durch Kontrolle der Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen können Zielsequenzen identifiziert werden, die zu 100% zu der Sonde komplementär sind (homologe Sondierung). Alternativ können Stringenzbedingungen so eingestellt werden, dass sie in Sequenzen Fehlpaarungen zulassen, so dass geringere Ähnlichkeitsgrade detektiert werden (heterologe Sondierung). Im Allgemeinen hat eine Sonde eine Länge von weniger als etwa 1000 Nucleotiden, vorzugsweise weniger als etwa 500 Nucleotiden.
Typischerweise werden stringente Bedingungen solche sein, bei denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,5 M Na-Ion-, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ion-Konzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 ist und die Temperatur wenigstens etwa 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange Sonden (z.B. größer als 50 Nucleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch durch Zusatz von destabilisierenden Agentien, z.B. Formamid, erreicht werden. Beispiele für Bedingungen niedriger Stringenz umfassen eine Hybridisierung mit einer Pufferlösung von 30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und ein Waschen in 1X bis 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Beispielhafte moderate Stringenzbedingungen umfassen Hybridisierung in 40 bis 45% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und ein Waschen in 0,5X bis 1X SSC bei 55 bis 60°C. Beispiele für Bedingungen hoher Stringenz umfassen Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und ein Waschen in 0,1X SSC bei 60 bis 65°C. Hybridisierungszeiten können von etwa vier Stunden bis etwa sechzehn Stunden reichen und definieren nicht die Stringenz des Protokolls.
Spezifität ist typischerweise die Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschgängen, wobei die kritischen Faktoren die Ionenstärke und die Temperatur der Endwaschlösung sind. Für DNA-DNA-Hybride kann die T_m aus der Gleichung von Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138:267–284 (1984): T_m = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61 (% Form) – 500/L genähert werden; worin M die Molarität von einwertigen Kationen ist, %GC der prozentuale Anteil von Guanosin- und Cytosin-Nucleotiden in der DNA ist, %-Form der prozentuale Anteil von Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. Die T_m, ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% einer komplementären Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisiert. T_m wird um etwa 1°C für jedes 1% Fehlpaarung reduziert; auf diese Weise können Tm Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen so eingestellt werden, dass an Sequenzen der gewünschten Identität hybridisiert wird. Wenn z.B. Sequenzen mit >90% Identität gesucht werden, kann die T_m 10°C gesenkt werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH liegen. Allerdings können stark stringente Bedingungen eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 1, 2, 3 oder 4°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) verwenden; moderat stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 6, 7, 8, 9 oder 10°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) verwenden. Bedingungen niedriger Stringenz können eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) verwenden. Unter Verwendung der Gleichung, der Hybridisierungs- und Waschzusammensetzungen und der gewünschten T_m wird der Fachmann erkennen, dass die Reaktionen in der Hybridisierungsstrin genz und/oder bei den Waschlösungen inhärent beschrieben sind. Zu Zwecken der Definition der Erfindung werden stringente Bedingungen solche sein, die ein Waschen bei etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH umfassen. Wenn der gewünschte Grad der Fehlpaarung zu einer T_m von niedriger als 45°C (wässrige Lösung) oder 32°C (Formamidlösung) führt, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration so zu erhöhen, dass eine höhere Temperatur verwendet werden kann. Eine ausführliche Anleitung für die Hybridisierung von Nucleinsäuren wird in Tijsen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); und Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2, Ausubel, et al., Herausg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) gefunden. Siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.). Im Allgemeinen werden Sequenzen, die Promotorsequenzen der Erfindung entsprechen und an die hierin offenbarte Promotorsequenz hybridisieren, wenigstens zu 50% homolog, 70% homolog oder sogar 85% homolog oder noch stärker homolog mit den offenbarten Sequenzen sein. D.h., die Sequenzähnlichkeit von Sequenzen liegt in einem Bereich, in dem wenigstens etwa 50%, etwa 70% und sogar etwa 85% Sequenzähnlichkeit geteilt werden.
Die Promotorregionen der Erfindung können aus einer beliebigen Pflanze isoliert werden; diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Mais (Zea mays), nicht-vegetabile Brassica (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), Luzerne (Medicago sativa), Reis (Oryza sativa), Roggen (Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Sonnenblume (Helianthus annuus), Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Manihot (Manihot esculenta), Kaffee (Cofea spp.), Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Zitrusbaum (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis), Banane (Musa spp.), Avokado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guayave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen und Koniferen. Vorzugsweise umfassen die Pflanzen Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Safflor, Brassica, Weizen, Gerste, Roggen, Luzerne und Sorghum.
Die codierende Sequenz, die durch die Promotoren der Erfindung exprimiert wird, kann zur Veränderung des Phänotyps der Samen verwendet werden. Es sind verschiedene Veränderungen im Phänotyp von Interesse, einschließlich Modifizieren der Fettsäurezusammensetzung in Samen, Verändern des Stärke- oder Kohlenhydratprofils, Ändern des Aminosäuregehalts des Samens und dergleichen. Diese Resultate können erreicht werden, indem die Expression von heterologen Produkten oder eine verstärkte Expression von endogenen Produkten in Samen erreicht wird. Alternativ können die Resultate erreicht werden, indem für eine Verringerung der Expression eines endogenen Produktes oder mehrerer endogener Produkte, insbesondere Enzy me oder Cofaktoren, im Samen gesorgt wird. Diese Veränderungen führen zu einer Veränderung im Phänotyp des transformierten Samens.
Gene von Interesse umfassen im Allgemeinen solche, die in Öl-, Stärke-, Kohlenhydrat- oder Nährstoff-Metabolismus involviert sind, wie auch solche, die die Körnergröße in Saccharosegehalt und dergleichen beeinflussen.
Allgemeine Kategorien von Genen, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung von Interesse sind, umfassen z.B. solche Gene, die bei der Information involviert sind, z.B. Zinkfinger, solche, die bei der Kommunikation involviert sind, z.B. Kinasen, und solche, die bei der „Haushaltsführung" involviert sind, z.B. Hitzeschockproteine. Spezifischere Kategorien von Transgenen z.B. umfassen Gene, die für agronomisch wichtige Merkmale codieren, für Insektenresistenz, Krankheitsresistenz, Herbizidresistenz und für Kommerkmale codieren. Es ist bekannt, dass ein beliebiges Gen von Interesse funktionell mit dem Promotor der Erfindung verknüpft sein kann und im Samen exprimiert werden kann.
Agronomisch wichtige Merkmale, wie Öl-, Stärke- und Proteingehalt, können, außer unter Verwendung traditioneller Züchtungsmethoden, genetisch verändert werden. Modifikationen umfassen eine Erhöhung des Gehalts an Ölsäure, gesättigten und ungesättigten Ölen, eine Erhöhung der Konzentrationen an Lysin und Schwefel und Bereitstellung essentieller Aminosäuren und auch eine Stärkemodifikation. Hordothioninprotein-Modifikationen werden z.B. in den U.S.-Serial Nrn. 08/838,763, eingereicht am 10. April 1997 (U.S. Patent Nr. 5,990,389), 08/824,379, eingereicht am 26. März 1997 (U.S. Patent Nr. 5,885,801); und 08/824,382, eingereicht am 26. März 1997 (U.S. Patent Nr. 5,885,802) beschrieben. Ein anderes Beispiel ist Lysin- und/oder Schwefel-reiches Samenprotein, das durch das Sojabohnen-2S-Albumin codiert wird und in U.S.-Serial Nr. 08/618,911, eingereicht am 20. März 1996, (WO 97/35023) beschrieben wird, und der Chymotrypsininhibitor aus Gerste, Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99–106. Um die Konzentration an vorher ausgewählten Aminosäuren in dem codierten Polypeptid zu erhöhen, können Derivate der folgenden Gene durch ortsspezifische Mutagenese hergestellt werden. Beispielsweise ist das Gen, das für Gerste-Polypeptid mit hohem Lysingehalt (BHL) codiert, vom Gerste-Chymotrypsininhibitor abgeleitet; U.S.-Serial Nr. 08/740,682, eingereicht am 1. November 1996, und PCT/US97/20441, eingereicht am 31. Oktober 1997 (WO 98/20133). Andere Proteine umfassen Methionin-reiche Pflanzenproteine, z.B. aus Sonnenblumenkernen (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs; Applewhite, H. (Herausg.); Amercian Oil Chemists Soc., Champaign, IL:497–502), Mais (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359) und Reis (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123). Andere agronomisch wichtige Gene codieren für Latex, Fluory 2, Wachstumsfaktoren, Samenspeicherfaktoren und Transkriptionsfaktoren.
Agronomische Merkmale in Samen können verbessert werden, indem die Expression von Genen, die die Reaktion von Samenwachstum und -entwicklung während Umweltstress beeinflussen (Cheikh-N et al. (1994) Plant Physiol. 106(1):45–51) und von Genen, die den Kohlenhydratmetabolismus unter Reduzierung der Körnerabortion bei Mais kontrollieren, Zinselmeier et al. (1995) Plant Physiol. 107(2):385–391, verändert wird.
Insektenresistenzgene können für eine Resistenz gegenüber Schädlingen, die starke Ernteeinbußen nach sich ziehen, z.B. Wurzelnematogen, Erdraupe, Maiszünsler und dergleichen, codieren. Solche Gene umfassen z.B. Bacillus thuringiensis-Endotoxin-Gene (U.S. Pat. Nrn. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593;881; Geiser et al. (1986) Gene 48:109); Lectine (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825) und dergleichen.
Gene, die für Krankheitsresistenzmerkmale codieren, können Detoxifizierungsgene, z.B. gegen Fumonosin U.S. Patentanmeldung Nr. 08/484,815, eingereicht am 7. Juni 1995; Avirulenz (avr)- und Krankheitsresistenz (R)-Gene (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1989) und dergleichen umfassen Die Kornqualität spiegelt sich in Merkmalen, z.B. Konzentrationen und Typen an Ölen, gesättigten und ungesättigten, Qualität und Quantität von essentiellen Aminosäuren und Cellulosekonzentrationen wider. In Mais liefern modifizierte Hordothionin-Proteine, die in U.S.-Serial Nr. 08/838,763 (U.S. Patent Nr. 5,990,389), eingereicht am 10. April 1997; 08/824,379, eingereicht am 26. März 1997 (U.S. Patent Nr. 5,885,801); und 08/824,382, eingereicht am 26. März 1997 (U.S. Patent Nr. 5,885,802) beschrieben sind, Beispiele für Modifikationen von Proteinen für gewünschte Zwecke.
Kommerzielle Merkmale können auch auf einem Gen (auf Genen) codiert sein, das (die) z.B. Stärke für die Produktion von Papier, Textilien und Ethanol verändern oder erhöhen kann (können), oder eine Expression von Proteinen mit anderen kommerziellen Verwendungen bereitstellen kann (können). Eine andere wichtige kommerzielle Verwendung von transformierten Pflanzen ist die Produktion von Polymeren und Biokunststoffen, wie sie z.B. im U.S. Patent Nr. 5,602,321, erteilt am 11. Februar 1997, beschrieben ist. Gene, wie z.B. β-Ketothiolase, PHBase (Polyhydroxybutyratsyntase) und Acetoacetyl-CoA-Reduktase (siehe Schubert et al. (1988) J. Bacteriol 170(12):5837–5847) erleichtern eine Expression von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs).
Exogene Produkte umfassen Pflanzenenzyme und -produkte, wie auch solche aus anderen Quellen, einschließlich Prokaryoten und anderer Eukaryoten. Solche Produkte umfassen Enzyme, Cofaktoren, Hormone und dergleichen. Die Konzentration an Samenproteinen, insbesondere modifizierten Samenproteinen mit verbesserter Aminosäureverteilung zur Vebesserung des Nährwerts des Samens, kann erhöht werden. Dies wird durch die Expression von Proteinen mit erhöhtem Aminosäuregehalt erreicht.
Wie erwähnt wurde, kann die heterologe Nucleotidsequenz, die funktionell mit einem der hierin offenbarten Promotoren verknüpft ist, eine Antisense-Sequenz für ein targetiertes Gen sein. Mit „Antisense-DNA-Nucleotidsequenz" ist eine Sequenz gemeint, die in umgekehrter Orientierung zu der normalen 5'-zu-3'-Orientierung jener Nucleotidsequenz ist. Bei Abgabe in eine Pflanzenzelle verhindert eine Expression der Antisense-DNA-Sequenz eine normale Ex pression der DNA-Nucleotidsequenz für das targetierte Gen. Die Antisense-Nucleotidsequenz codiert für ein RNA-Transkript, das komplementär zu der endogenen Messenger-RNA (mRNA) ist, welche durch Transkription der DNA-Nucleotidsequenz für das targetierte Gen produziert wird, und fähig ist, an diese zu hybridisieren. In diesem Fall wird eine Produktion des nativen Proteins, das durch das targetierte Gen codiert wird, inhibiert, um eine gewünschte phänotypische Antwort zu erreichen. Auf diese Weise können die hierin offenbarten Promotorsequenzen funktionell mit Antisense-DNA-Sequenzen verknüpft sein, um eine Expression eines nativen Proteins in Pflanzensamen zu reduzieren oder zu inhibieren.
Mit „Promotor" oder „Transkriptionsstartregion" ist eine regulatorische Region von DNA gemeint, die üblicherweise eine TATA-Box umfasst, welche fähig ist, RNA-Polymerase II zu steuern, um eine RNA-Synthese an der geeigneten Transkriptionsinitiierungsstelle für eine bestimmte codierende Sequenz zu initiieren. Ein Promotor kann zusätzlich andere Erkennungssequenzen umfassen, die im Allgemeinen stromaufwärts oder 5' zu der TATA-Box positioniert sind, die als stromaufwärts-Promotor-Elemente bezeichnet werden, welche die Transkriptionsinitiierungsrate beeinflussen. Es wird erkannt, dass, wenn die Nucleotidsequenzen für die hierin offenbarten Promotorregionen identifiziert sind, es im Rahmen des Standes der Technik liegt, weitere regulatorische Elemente in der 5'-untranslatierten Region stromaufwärts von den bestimmten hierin identifizierten Promotorregionen zu isolieren und zu identifizieren. Demnach werden die hierin offenbarten Promotorregionen im Allgemeinen weiter dadurch definiert, dass sie stromaufwärts gelegene regulatorische Elemente umfassen, z.B. solche, die für eine Gewebe- und temporale Expression der codierenden Sequenz, der Enhancer und dergleichen verantwortlich sind. Auf die gleiche Weise können die Promotorelemente, die eine Expression in dem gewünschten Gewebe, z.B. dem Samen, ermöglichen, identifiziert, isoliert und mit anderen Kernpromotoren verwendet werden, um eine Samen-bevorzugte Expression zu bestätigen.
Die regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung ermöglichen, wenn sie funktionell mit einer heterologen Nucleotidsequenz von Interesse verknüpft sind und in einen Transformationsvektor insertiert sind, eine Samen-bevorzugte Expression der heterologen Nucleotidsequenz in den Samen einer Pflanze, die mit diesem Vektor stabil transformiert ist. Mit „Samenbevorzugt" ist eine Expression in Samen, einschließlich wenigstens einem von Embryo, Kern bzw. Korn, Pericarp, Endosperm, Kern, Aleuron, Pedicel und dergleichen, gemeint.
Mit „heterologe Nucleotidsequenz" ist eine Sequenz gemeint, die natürlicherweise nicht mit der Promotorsequenz auftritt. Obgleich diese Nucleotidsequenz für die Promotorsequenz heterolog ist, kann sie für den Pflanzenwirt homolog oder nativ oder heterolog oder fremd sein.
Es wird erkannt, dass die Promotoren mit ihren nativen codierenden Sequenzen verwendet werden können, um eine Expression zu verstärken oder zu verringern, was in einer Änderung des Phänotyps im transformierten Samen resultiert.
Die isolierten Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können modifiziert werden, um für eine Reihe von Expressionsleveln der heterologen Nucleotidsequenz zu sorgen. So können weniger als die gesamten Promotorregionen genutzt werden und die Fähigkeit, eine Samen-bevorzugte Expression zu steuern, beibehalten werden. Es wird allerdings erkannt, dass Expressionslevel von mRNA durch Deletionen von Teilen der Promotorsequenzen gesenkt werden können. Im Allgemeinen werden wenigstens etwa 20 Nucleotide einer isolierten Promotorsequenz verwendet werden, um eine Expression einer Nucleotidsequenz zu steuern.
Es ist bekannt, dass zur Erhöhung von Transkriptionsleveln Enhancer in Kombination mit den Promotorregionen der Erfindung verwendet werden können. Enhancer sind Nucleotidsequenzen, die wirken, um die Expression einer Promotorregion zu erhöhen. Enhancer sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen die SV40-Enhancerregion, das 35S-Enhancerelement und dergleichen.
Modifikationen der isolierten Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können für einen Expressionsbereich der heterologen Nucleotidsequenz sorgen. So können sie modifiziert sein, so dass sie schwache Promotoren oder starke Promotoren sind. Unter einem „schwachen Promotor" versteht man im Allgemeinen einen Promotor, der eine Expression einer codierenden Sequenz bei niedrigem Level steuert. Mit „niedrigem Level" sind Level von etwa 1/10.000 Transkripte bis 1/100.000 Transkripte bis etwa 1/500.000 Transkripte gemeint. Umgekehrt steuert ein starker Promotor die Expression einer codierenden Sequenz auf einem hohen Level oder mit etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/00 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten.
Promotorfragmente, z.B. die, die aus einer ortsspezifischen Mutagenese resultieren, werden von den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mit umfasst.
Biologisch aktive Varianten der Promotorsequenzen werden vom erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls mit umfasst. Solche Varianten sollten Promotoraktivität, insbesondere die Fähigkeit, eine Expression in Samen oder Samengeweben zu steuern, beibehalten. Biologisch aktive Varianten umfassen z.B. die nativen Promotorsequenzen der Erfindung, die eine oder mehrere Nucleotidsubstitution(en), -deletion(en) oder -insertion(en) haben. Promotoraktivität kann durch Northern Blot-Analyse, Reporteraktivitätsmessungen, wenn transkriptionale Fusionen verwendet werden, und dergleichen gemessen werden. Siehe z.B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.).
Die folgenden Ausdrücke werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuren oder Polynucleotiden zu beschreiben: (a) „Referenzsequenz", (b) „Vergleichsfenster", (c) „Prozentwert der Sequenzidentität" und (d) „substantielle Identität".

(a) Wie hierin verwendet ist der Ausdruck „Referenzsequenz" eine definierte Sequenz, die als Basis zum Sequenzvergleich verwendet wird. Eine Referenzsequenz kann ein Teilstück oder die Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz sein, z.B. ein Segment einer Volllängen-Promotorsequenz oder die vollständige Promotorsequenz.
(b) Der hierin verwendete Ausdruck „Vergleichsfenster" bezieht sich auf ein fortlaufendes und spezifiziertes Segment an der Polynucleotidsequenz, in dem die Polynucleotidsequenz mit einer Referenzsequenz verglichen werden kann und worin der Teil der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) zur optimalen Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen hat das Vergleichsfenster eine Länge von wenigstens 20 fortlaufenden Nucleotiden und kann optional eine Länge von 30, 40, 50, 100 oder mehr fortlaufenden Nucleotiden haben. Der Fachmann weiß, dass zur Vermeidung einer hohen Ähnlichkeit mit einer Referenzsequenz infolge des Einschlusses von Lücken (gaps) in die Polynucleotidsequenz typischerweise ein „gap penalty" eingeführt wird und von der Zahl der Übereinstimmungen abzogen wird.

Methoden zur Anordnung von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Eine optimale Anordnung von Sequenzen zum Vergleich kann durch den Homologie-Anordnungs-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, durchgeführt werden. Eine Durchführung dieses Algorithmus mittels Computer beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf, GAP und BLAST im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG)(575 Science Drive, Madison, Wisconsin). Ein Beispiel für Programme der BLAST-Familie, die zum Suchen nach Database-Sequenzähnlichkeit zu Zwecken der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfasst das BLASTN-Programm zur Abfrage von Nucleotidsequenzen aus der Nucleotidsequenz-Datei. Siehe Ausubel et al., Herausg. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Der BLAST-Homologie-Anordnungs-Algorithmus ist zum Vergleich von Fragmenten der Referenz-Nucleotid- oder Aminosäuresequenz mit Sequenzen aus öffentlichen Dateien bzw. Datenbanken einsetzbar. Es ist dann erforderlich, eine Methode der Anordnung der vollständigen Referenzsequenz an die Datenbank-Sequenzen anzuwenden, um den Prozentwert der Identität (im Fall von Polynucleotiden) oder den Prozentwert der Ähnlichkeit (im Fall von Polypeptiden) zu entwickeln. Der GAP-Algorithmus ist eine derartige Methode.
GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch (T. Mol. Biol. 48:443–453, 1970), um die Anordnung von zwei vollständigen Sequenzen, die die Anzahl der Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl von Lücken minimiert, zu finden. GAP zieht alle möglichen Anordnungen und Lücken-Positionen in Betracht und erzeugt die Anordnung mit der größten Zahl von übereinstimmenden Basen und den wenigsten Lücken. Es ermöglicht die Bereitstellung eines „gap creation penalty" und eines „gap extension penalty" in Einheiten von gepaarten Basen. GAP muss für die „gap creation penalty" mit der Anzahl der Übereinstimmungen, für jede Lücke, die insertiert wird, einen numerischen Gewinn machen. Wenn ein „gap extension penalty" von größer als null gewählt wird, muss GAP zusätzlich für jede eingefügte Lücke einen numerischen Gewinn mit dem Wert Länge der Lücke mal der „gap extension penalty" machen. Default gap creation penalty-Werte und gap extension penalty-Werte in Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package für Proteinsequenzen sind 8 bzw. 2. Für Nucleotidsequenzen ist die default gap creation penalty 50, während die default gap extension penalty 3 ist. Die gap creation und gap extension penalties können als ganze Zahl ausgedrückt werden, die aus der Gruppe ganzer Zahlen, die von 0 bis 200 reicht, ausgewählt wird. So können beispielsweise die gap creation und gap extension penalties 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder größer sein.
GAP präsentiert ein Mitglied der Familie bester Anordnungen. Es können viele Mitglieder dieser Familie sein, aber kein anderes Mitglied hat eine bessere Qualität. GAP zeigt vier Leistungspunkte zur Anordnung: Qualität, Verhältnis, Identität und Ähnlichkeit. Qualität ist das Maß, das zur Anordnung der Sequenzen maximiert wird. Verhältnis ist die Qualität, dividiert durch die Anzahl der Basen im kürzeren Segment. Prozentwert der Identität ist der prozentuale Anteil der Symbole, die tatsächlich übereinstimmen. Prozentwertähnlichkeit ist der Prozentsatz der Symbole, die ähnlich sind. Symbole, die Lücken gegenüberliegen, werden ignoriert. Ähnlichkeit wird bewertet, wenn der Scoring-Matrix-Wert für ein Symbolpaar größer oder gleich 0,50, die Schwellenähnlichkeit, ist. Die in Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package verwendete Scoring Matrix ist BLOSUM62 (siehe Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
Wenn nichts anderes angegeben ist, so ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die bevorzugte Methode zur Bestimmung des Prozentwerts der Sequenzidentität die durch den GAP Version 10-Algorithmus unter Verwendung von Default-Parametern.

(c) Der Ausdruck „Prozentwert Sequenzidenität", wie er hierin verwendet wird, meint den Wert, der durch Vergleich von zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt wird, wobei der Teil der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster in Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) für eine optimale Anordnung der zwei Sequenzen Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) umfassen kann. Der Prozentwert wird errechnet, indem die Anzahl von Positionen bestimmt wird, bei der in beiden Sequenzen die identische Nucleinsäurebase auftritt, um die Anzahl von übereinstimmenden Positionen zu erhalten, die Anzahl von übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl von Positionen im Vergleichsfenster dividiert wird und das Resultat mit 100 multipliziert wird, wodurch der Prozentwert der Sequenzidentität erhalten wird.
(d) Der Ausdruck „substantielle Identität" von Polynucleotidsequenzen bedeutet, dass ein Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die wenigstens 70% Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens 80%, bevorzugter mindestens 90% und am bevorzugtesten mindestens 95% Sequenzidentität bei Vergleich mit einer Referenzsequenz hat, wobei eines der beschriebenen Anordnungsprogramme unter Verwendung von Standardparametern eingesetzt wird.

Ein weiterer Hinweis dafür, dass Nucleotidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, wenn zwei Nucleinsäuremoleküle unter stringenten Bedingungen aneinander hybridisieren. Im Allgemeinen werden stringente Temperaturbedingungen so gewählt, dass sie bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH etwa 5°C bis etwa 2°C unter dem Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz liegen. Die Denaturierung oder das Schmelzen von DNA tritt über einen engen Temperaturbereich auf und stellt die Spaltung der Doppelhelix in ihre komplementären Einzelstränge dar. Das Verfahren wird üblicherweise durch die Temperatur des Übergangsmittelpunkts T_m charakterisiert, die manchmal als die Schmelztemperatur beschrieben wird. Auf dem Fachgebiet sind Formeln zur Bestimmung von Schmelztemperaturen verfügbar. Typischerweise sind stringente Waschbedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration bei pH 7 etwa 0,02 molar ist und die Temperatur 50, 55 oder 60°C ist.
Die Nucleotidsequenzen für die Samen-bevorzugten Promotoren, die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, wie auch Varianten und Fragmente davon, sind in der genetischen Manipulation einer beliebigen Pflanze einsetzbar, wenn sie funktionell mit einer heterologen Nucleotidsequenz verknüpft sind, deren Expression kontrolliert werden soll, um eine gewünschte Phänotypantwort zu erhalten. Mit „funktionell verknüpft" ist gemeint, dass die Transkription oder Translation der heterologen Nucleotidsequenz unter dem Einfluss der Promotorsequenz ist. Auf diese Weise können die Nucleotidsequenzen für die Promotoren der Erfindung in Expressionskassetten zusammen mit heterologen Nucleotidsequenzen zur Expression in der Pflanze von Interesse, insbesondere im Samen der Pflanze, bereitgestellt werden.
Solche Expressionskassetten werden eine Transkriptionsstartregion umfassen, die eine der Promotor-Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung oder Varianten oder Fragmente davon funktionell mit der heterologen Nucleotidsequenz, deren Expression durch die hierin offenbarten Samen-bevorzugten Promotoren zu kontrollieren ist, verknüpft, umfasst. Eine solche Expressionskassette ist mit einer Vielzahl von Restriktionsstellen zur Insertion der Nucleotidsequenz, die unter der Transkriptionsregulation der regulatorischen Regionen sein soll, ausgestattet. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Markergene enthalten.
Die Expressionskassette wird in der 5'-zu-3'-Transkriptionsrichtung eine Transkriptions- und Translationsstartregion, eine heterologe Nucleotidsequenz von Interesse und eine Transkriptions- und Translationsterminierungsregion, die in Pflanzen funktionell sind, umfassen. Die Terminierungsregion wird mit der Transkriptionsstartregion, die eine der Promotor-Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst, nativ sein, kann mit der DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann aus einer anderen Quelle stammen. Zweckdienliche Terminierungsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens verfügbar, z.B. die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminerungsregionen. Siehe auch Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141–144; Proudfoot (1991) Cell 64:671–674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141–149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261–1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151–158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891–7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627–9639.
Die Expressionskassette, die die Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung funktionell an eine heterologe Nucleotidsequenz verknüpft umfasst, kann auch wenigstens eine zusätzliche Nucleotidsequenz für ein Gen, das in den Organismus cotransformiert werden soll, enthalten. Alternativ kann (können) die zusätzliche(n) Sequenze(n) auf einer anderen Expressionskassette bereitgestellt werden.
Wenn es passend ist, können die heterologe Nucleotidsequenz, deren Expression unter der Kontrolle der Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung erfolgen soll, und eine beliebige zusätzliche Nucleotidsequenz (zusätzliche Nucleotidsequenzen) für eine verstärkte Expression in der transformierten Pflanze optimiert werden. D.h., diese Nucleotidsequenzen können unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Codons für eine verbesserte Expression synthetisiert werden. Zur Synthese von Pflanzen-bevorzugten Nucleotidsequenzen stehen Methoden auf dem Fachgebiet zur Verfügung. Siehe z.B. U.S. Patente Nrn. 5,380,831 und 5,436,391 und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477–498, die hierin durch Referenz eingearbeitet gelten.
Es ist bekannt, dass zusätzliche Sequenzmodifikationen die Genexpression in einem cellulären Wirt erhöhen. Diese umfassen Eliminierung von Sequenzen, die für Pseudo-Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Splicestellensignale Transposon-artige Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen codieren, welche für die Genexpression schädlich sein können. Der G-C-Gehalt der heterologen Nucleotidsequenz kann auf Level eingestellt werden, die für einen gegebenen cellulären Wirt durchschnittlich sind, wie sie durch Referenz auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, errechnet werden. Wenn möglich wird die Sequenz so modifiziert, dass vorausgesagte Haarnadel-sekundär-mRNA-Strukturen vermieden werden.
Die Expressionskassetten können zusätzlich 5'-Leadersequenzen im Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Solche Leadersequenzen können zur Verstärkung der Translation wirken. Translationsleader sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, z.B. EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5'-nichtcodierende Region)(Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126–6130); Potyvirus-Leader, z.B. TEV-Leader (Tabakätzvirus)(Allison et al. (1986)); MDMV-Leader (Mais-Verzwergungs-Mosaik-Virus)(Virology, 154:9–20); humanes Immunglobulin-schwere-Kette-Bindungsprotein (BiP)(Macejak et al. (1991) Nature 353:90–94); untranslatierte Leader aus Hüllprotein mRNA von Luzerne-Mosaik-Virus (AMV RNA 4)(Jobling et al. (1987) Nature 325:622–625); Tabakmosaikvirus-Leader (TMV)(Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, Seiten 237–256); und Mais-Scheckungs-Virus-Leader (MCMV)(Lommel et al. (1991) Virology 81:382–385). Siehe auch Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965–968. Andere Methoden, von denen bekannt ist, dass sie die Translation und/oder mRNA-Stabilität erhöhen, können ebenfalls eingesetzt werden, z.B. Introns und dergleichen.
In solchen Fällen, wo es erwünscht ist, das exprimierte Produkt der heterologen Nucleotidsequenz auf eine bestimmte Organelle, insbesondere das Plasmid, den Amyloplast oder die Vacuole oder in das endoplasmatische Retikulum gesteuert zu haben oder an der Zelloberfläche oder extracellulär sezerniert zu haben, kann die Expressionskassette außerdem eine codierende Sequenz für ein Transitpeptid umfassen. Solche Transitpeptide sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, das Transitpeptid für das Acylträgerprotein, die kleine Untereinheit von RUBISCO, Planzen-ESP-Synthase und dergleichen.
Bei der Herstellung der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente manipuliert werden, um so dafür zu sorgen, dass die DNA-Sequenzen in der geeigneten Orientierung und dementsprechend im passenden Leserahmen vorliegen. Dazu können Adapter oder Linker verwendet werden, um die DNA-Fragmente zu verbinden, oder es können andere Manipulationen involviert werden, um für zweckdienliche Restriktionsstellen, Entfernung von überflüssiger DNA, Entfernung von Restriktionsstellen oder dergleichen zu sorgen. Zu diesem Zweck können eine in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, Annealing, Resubstitutionen, z.B. Transitionen oder Transversionen, involviert werden.
Reportergene oder selektierbare Markergene können in den Expressionskassetten enthalten sein. Beispiele für geeignete Reportergene, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können z.B. in Jefferson et al. (1991) in Plant Molecular Biology Manual, Herausg. Gelvin et al. Kluwer Academic Publishers), S. 1–33; DeWet et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725–737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517–2522; Kain et al. (1995) BioTechniques 19:650–655; und Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325–330 gefunden werden.
Selektierbare Markergene zur Selektion von transformierten Zellen oder Geweben können Gene umfassen, die Antibiotikaresistenz oder Resistenz gegenüber Herbiziden verleihen. Beispiele für geeignete selektierbare Markergene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Gene, die für Resistenz gegenüber Chloramphenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987–992); Methotrexat (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209–213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807–820); Hygromycin (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103–108; Zhijan et al. (1995) Plant Science 108:219–227); Streptomycin (Jones et al. (1987) Mol. Genet. 210:86–91); Spectinomycin (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131–137); Bleomycin (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171–176); Sulfonamid (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127–136); Bromoxynil (Stalker et al. (1988) Science 242:419–423); Glyphosat (Shaw et al. (1986) Science 233:478–481); Phosphinothricin (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513–2518) codieren.
Andere Gene, die bei der Gewinnung von transgenen Ereignissen nützlich sein könnten, im Endprodukt aber nicht erforderlich sind, würden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Beispiele, wie GUS (Glucuronidase; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (grünes Fluoreszenzprotein; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), Luziferase (Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15(19):8115; Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol. 216:397–414) und Maisgene, die für Anthocyaninproduktion codieren (Ludwig et al. (1990) Science 247:449).
Transformationsprotokolle, wie auch Protokolle zur Einführung von Nucleotidsequenzen in Pflanzen, können in Abhängigkeit vom Typ der Pflanze oder der Pflanzenzelle, d.h. Monocotyle oder Dicotyle, die Ziel der Transformation ist, variieren. Geeignete Methoden zur Einführung von Nucleotidsequenzen in Pflanzenzellen und anschließende Insertion in das Pflanzengenom umfassen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320–344), Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. US 83:5602–5606), Agrobacterium vermittelte Transformation (Townsend et al., U.S. Patent Nr. 5,563,055; Zhao et al. WO US98/01268), direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717–2722) und Beschleunigung von ballistischen Partikeln (siehe z.B. Sanford et al., U.S. Patent Nr. 4,945,050; Tomes et al. (1995) „Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardement" in Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Herausg. Gamborg und Philipps (Springer-Verlag Berlin); und McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923–926). Siehe auch Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421–477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27–37 (Zwiebel); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671–674 (Sojabohne); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923–926 (Sojabohne); Finer und Mc-Mullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175–182 (Sojabohne); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319–324 (Sojabohne); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736–740 (Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305–4309 (Mais); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559–563 (Mais); Tomes, U.S. Patent Nr. 5,240,855; Buising et al., U.S. Patent Nrn. 5,322,783 und 5,324,646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardement" in Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Herausg. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin)(Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440–444 (Mais); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833–839 (Mais); Hooykaas-Van Slogeteren et al. (1984) Nature (London) 311:763–764; Bowen et al., U.S. Patent Nr. 5,736,369 (Getreide); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345–5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Exprimental Manipulation of Ovule Tissues, Herausg. Chapman et al. (Longman, New York), S. 197–209 (Pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415–418 und Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560–566 (Wedel (Whisker)-vermittelte Transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495–1505 (Elektroporation); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250–255 und Christou und Ford (1995) Annals of Botany 75:407–414 (Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745–750 (Mais via Agrobacterium tumefaciens).
Die Zellen, die transformiert wurden, können auf herkömmlichen Wegen zu Pflanzen wachsengelassen werden. Siehe z.B. McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81–84. Diese Pflanzen können dann wachsen gelassen werden und entweder mit demselben transformierten Stamm oder unterschiedlichen Stämmen bestäubt werden und die resultierende Hybride mit konstitutiver Expression mit gewünschtem phänotypischen Merkmal identifiziert werden. Es können zwei oder mehr Generationen wachsen gelassen werden, um sicherzustellen, dass eine konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals in stabiler Weise aufrechterhalten wird und vererbt wird, dann werden Samen gesammelt, um sicherzustellen, dass eine konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals erreicht wurde.
Die Expressionskassette, die die bestimmte Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung funktionell mit einer heterologen Nucleotidsequenz von Interesse verknüpft umfasst, kann zum Transformieren einer beliebigen Pflanze verwendet werden. Auf diese Weise können gene tisch modifizierte Pflanzen, Pflanzenzellen, genetisch modifiziertes Pflanzengewebe, genetisch modifizierter Pflanzensamen und dergleichen erhalten werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung angeführt.
EXPERIMENTELLES
Promotorregionen für die Maisgene Cim 1 (Cytokinin-induzierte Message)(Genbank-Zugangsnr. U03860); cZ19B1 (Mais-19KDa-Zein)(Genbank-Zugangsnr. M12143); und mi1ps (Myoinositol-1-phosphat-Synthase)(Genbank-Zugangsnr. U32511) wurden aus Maispflanzen isoliert und geklont. Diese Gene wurden als Quellen für Samen-bevorzugte Promotoren auf der Basis der räumlichen Expression ihrer Genprodukte ausgewählt. Das Verfahren zu ihrer Isolierung wird unten beschrieben.
Beispiel 1: Isolierung von Promotorsequenzen
Das Verfahren zur Promotorisolierung wird im Benutzerhandbuch für den Genome Walker-Kit, verkauft von Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, Kalifornien, beschrieben. Genomische DNA aus der Maislinie V3-4-A63 wurde hergestellt, indem Blätter von 10 Tage alten Keimlingen in flüssigem Stickstoff vermahlen wurden und die DNA präpariert wurde, wie es von Chen und Dellaporta (1994) in The Maize Handbook, Herausg. Freeling und Walbot (Springer-Verlag, Berlin) beschrieben ist, allerdings mit wenigen kleineren Modifikationen. Präzipitierte DNA wurde unter Verwendung einer Impföse entnommen und in ein 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen überführt, das 500 l TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) enthielt. Die DNA wurde sich bei Raumtemperatur über 15 Minuten auflösen gelassen, mit Phenol extrahiert und mit 2-Propanol in 700 l präzipitiert. Das Präzipitat wurde isoliert und mit 70% Ethanol gewaschen. Die DNA wurde dann in ein sauberes 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen gegeben, an der Luft getrocknet und in 200 l TE resuspendiert. RNase A wurde zu 10 g/ml zugesetzt und das Gemisch wurde für mehrere Stunden bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde dann einmal mit Phenol-Chloroform, dann Chloroform extrahiert, danach mit Ethanol präzipitiert und in TE resuspendiert. Die DNA wurde dann genau wie im Genome Walker-Benutzerhandbuch (Clontech PT3042-1 Version PR68687) beschrieben, verwendet. Kurz gesagt, die DNA wurde getrennt mit den Restriktionsenzymen DraI, EcoRV, PvuII, ScaI und StuI, alle Schneidemittel für stumpfe Enden, verdaut. Die DNA wurde mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert, danach mit Ethanol präzipitiert. Die Genome Walker-Adapter wurden an die Enden der restringierten DNA ligiert. Die resultierende DNA wird als DL1–DL5 bezeichnet.
Zur Isolierung von spezifischen Promotorregionen wurden zwei nichtüberlappende genspezifische Primer (Länge 27–30 bp) vom 5'-Ende der Maisgene, die aus Sequenzdatenbanken identifiziert worden waren, entwickelt. Die Primer wurden entwickelt, um die Region stromaufwärts der codierenden Sequenz, d.h. die 5'-untranslatierte Region und Promotor des gewählten Gens, zu amplifizieren. Die Sequenz der Primer wird unten für jeden Promotor beschrieben. Die erste Runde der PCR wurde an jeder DNA-Probe (DL1–5) mit dem Clontech-Primer AP1 und den genspezifischen Primern (gsp)1 mit den in SEQ ID NO: 1, 5 oder 8 angegebenen Sequenzen durchgeführt.
Die PCR wurde in einem Thermal Cycler, Modell PTC-100, mit HotBonnet von MJ Research (Watertown, MA) durchgeführt, wobei Reagentien verwendet wurden, die mit dem Genome Walker-Kit geliefert wurden. Es wurden die folgenden Zyklusparameter verwendet: 7 Zyklen bei 94°C für 2 Sekunden, dann 72°C für 3 Minuten, gefolgt von 32 Zyklen bei 94°C für 2 Sekunden und 67°C für 3 Minuten. Schließlich wurden die Proben für 4 Minuten bei 67°C gehalten und dann bei 4°C bis zur weiteren Analyse.
Wie im Benutzerhandbuch beschrieben ist, wurde die DNA aus der ersten PCR-Runde dann verdünnt und als Matrize in einer zweiten PCR-Runde unter Verwendung des Clontech-AP2-Primers und genspezifischer Primer (gsp)2 mit den in SEQ ID NO: 3, 6 oder 9 gezeigten Sequenzen verwendet.
Die Zyklusparameter für die zweite Runde waren: 5 Zyklen bei 94°C für 2 Sekunden, dann 72°C für 3 Minuten. Schließlich wurden die Proben für 4 Minuten bei 67°C gehalten und dann bei 4°C gehalten. Etwa 10 l jeder Reaktion wurden an einem 0,8% Agarosegel laufen gelassen und Banden (üblicherweise 500 bp oder größer) wurden ausgeschnitten, mit dem Sephaglas BandPrep-Kit (Pharmacia, Piscataway, NJ) gereinigt und in den TOPOTO-Vektor pCR2.1 (Invitrogen, Karlsbad, CA; www.invitrogen.com) kloniert. Klone wurden zur Bestätigung sequenziert.
Beispiel 2: Expressionsdaten unter Verwendung von Promotorsequenzen
Drei Promotor::GUS-Fusionskonstrukte wurden durch die unten beschriebenen Verfahren hergestellt. Alle Vektoren wurden unter Verwendung von Standard-Molekularbiologie-Techniken (Sambrook et al., a.a.O.) konstruiert. Ein Reportergen und ein selektierbares Markergen zur Genexpression und Selektion wurden zwischen die Mehrfach-Klonierungsstellen des pBluescript-Klonierungsvektors (Stratagene Inc., 11011 N. Torrey Pines Rd., La Jolla, CA; www.stratagene.com) insertiert. Das Reportergen war das Glucuronidase (GUS)-Gen (Jefferson, R. A. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83:8447–8451), in dessen codierende Region das zweite Intron aus dem Kartoffel-ST-LS1-Gen (Vancanneyt et al., Mol. Gen. Genet. 220:245–250, 1990) insertiert war, um Intron-GUS zu produzieren, um eine Expression des Gens im Agrobacterium zu verhindern (siehe Ohta, S. et al., 1990, Plant Cell Physiol. 31(6):805–813). Die jeweiligen Promotorregionen wurden im Raster an Stellen 5' zu dem GUS-Gen ligiert. Ein Fragment, das die Basen 2 bis 310 aus dem Terminator des Kartoffel-Proteinaseinhibitors (pinII)-Gen (An et al., Plant Cell 1:115–122, 1989) enthielt, wurde am stumpfen Ende stromabwärts der GUS-codierenden Sequenz ligiert, um so die GUS-Expressionskassette zu erzeugen. Das 3'-Ende des Terminators trug eine NotI-Restriktionsstelle.
cZ19B1::GUS::pinII wurde unter Verwendung des obigen Plasmids konstruiert, mit NcoI verdaut, mit Klenow-Enzym aufgefüllt und dann mit NotI verdaut, um Insertionsstellen für den Promotor bereitzustellen. Das Plasmid mit dem isolierten cZ19B1-Promotor im TOPOTA- Klonierungsvektor wurde mit BsaI verdaut, mit Klenow gefüllt und mit NotI verdaut. Das Fragment wurde in die verdaute Expressionskassette ligiert und eine erfolgreiche Subklonierung wurde durch Restriktionsverdau mit EcoRI und Sequenzierung bestätigt.
cim1::GUS::pinII wurde unter Verwendung der GUS::pinII-Kassette konstruiert. Die Kassette wurde mit NcoI verdaut, mit Klenow gefüllt und erneut mit BamHI verdaut. Der Cim1-Promotor, der im TOPOTA-Klonierungsvektor enthalten war, wurde durch Verdau mit BssHII isoliert, mit Klenow gefüllt und anschließend zweifach mit BamHI/PvuI verdaut. Das Fragment wurde in den Vektor ligiert und es erfolgte eine Bestätigung durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung.
mi1ps::GUS::pinII wurde unter Verwendung der GUS::pinII-Kassette, verdaut mit NcoI, hergestellt, mit Klenow gefüllt und mit XbaI erneut verdaut. Der mi1ps-Promotor in TOPOTA wurde mit BsmI verdaut, aufgefüllt und dann mit XbaI geschnitten. Das Fragment wurde dann in den Vektor ligiert und es erfolgte eine Bestätigung durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung.
Das cim1::GUS::pinII-Agrobacterium-Transformationsplasmid wurde konstruiert, indem die GUS-Expressionskassette als ein HindIII/NotI-Fragment und die BAR-Expressionskassette als ein NotI/SacI-Fragment zwischen die rechte und linke T-DNA-Grenze in pSB11 an HindIII- und SacI-Stellen insertiert wurde. Die GUS-Kassette wurde neben der rechten T-DNA-Grenze insertiert. Das Plasmid pSB11 wurde von Japan Tobacco Inc. (Tokio, Japan) erhalten. Die Konstruktion von pSB11 aus pSB21 und die Konstruktion von pSB21 aus Ausgangsvektoren ist von Komari et al. (1996, Plant J. 10:165–174) beschrieben. Die T-DNA des Plasmids wurde durch homologe Rekombination zwischen beiden Plasmiden in das superbinäre Plasmid pSB1 integriert. Das Plasmid pSB1 wurde auch von Japan Tobacco Inc. erhalten. E. coli-Stamm HB101, der die Expressionskassetten enthielt, wurde mit dem Agrobacterium-Stamm LBA4404, der pSB1 beherbergt, gepaart, um das Cointegrationsplasmid in Agrobacterium zu bilden, wobei die Methode von Ditta et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347–7351, 1980) verwendet wurde. Die erfolgreiche Rekombination wurde durch einen SalI-Restriktionsverdau des Plasmids verifiziert.
Beispiel 3: Transformation und Regeneration von Maiscallus über Agrobacterium Herstellung von Agrobacteriumsuspension:
Agrobacterium wurde aus einem bei –80° gefrorenen Aliquot auf einer Platte ausgestrichen, die PHI-L-Medium enthielt, und bei 28°C im Dunkeln für 3 Tage kultiviert. PHI-L-Medium umfasst 25 ml/l Stammlösung A, 25 ml/l Stammlösung B, 450,9 ml/l Stammlösung C und Spectinomycin (Sigma Chemicals), das zu einer Konzentration von 50 mg/l in sterilem ddH2O zugesetzt war (Stammlösung A: K2HPO4 60,0 g/l, NaH2PO4 20,0 g/l, eingestellt auf pH 7,0 w/KOH und autoklaviert; Stammlösung B: NH4Cl 20,0 g/l, MgSO4·7 H2O 6,0 g/l, KCl 3,0 g/l, CaCl2 0,20 g/l, FeSO4·7H2O 50,0 mg/l, autoklaviert; Stammlösung C: Glucose 5,56 g/l, Agar 16,167 g/l (#A-7049, Sigma Chemicals, St. Louis, MO) und autoklaviert).
Die Platte kann bei 4°C gelagert werden und üblicherweise für etwa 1 Monat verwendet werden. Aus der Masterplatte wurde eine Einzelkolonie herausgenommen und auf einer Platte ausgestrichen, die PHI-M-Medium enthielt [Hefeextrakt (Difco) 5,0 g/l; Pepton (Difco) 10,0 g/l; NaCl 5,0 g/l; Agar (Difco) 15,0 g/l; pH 6,8, enthaltend 50 mg/l Spectinomycin] und bei 28°C im Dunkeln für 2 Tage inkubiert.
Fünf ml entweder PHI-A [CHU(N6)-Basalsalze (Sigma C-1416) 4,0 g/l, Eriksson's-Vitamin-Mischung (1000X, Sigma 1511) 1,0 ml/l; Thiamin·HCl 0,5 mg/l (Sigma); 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D, Sigma) 1,5 mg/l; L-Prolin (Sigma) 0,69 g/l; Saccharose (Mallinckrodt) 68,5 g/l; Glucose (Mallinckrodt) 36,0 g/l; pH 5,2] für das PHI-Basismediumsystem oder PHI-I [MS-Salze (GIBCO BRL) 4,3 g/l; Nicotinsäure (Sigma) 0,5 mg/l; Pyridoxin·HCl (Sigma) 0,5 mg/l; Thiamin·HCl 1,0 mg/l; Myoinositol (Sigma) 0,10 g/l; Vitaminassay-Casaminosäuren (Difco Lab) 1,0 g/l; 2,4-D 1,5 mg/l; Saccharose 68,50 g/l; Glucose 36,0 g/l; pH eingestellt auf 5,2, w/KOH und Filter-sterilisiert] für das PHI-System mit kombiniertem Medium und 5 ml 100 mM (3'-5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenon, Aldrich Chemicals) wurden in ein 14 ml-Falcon-Rohr unter einer Haube gegeben. Etwa 3 volle Ösen (5 mm Ösengröße) Agrobacterium wurden von der Platte gesammelt und in Röhrchen suspendiert, dann wurde das Röhrchen in einem Vortex-Gerät behandelt, um eine einheitliche Suspension herzustellen. Ein ml der Suspension wurde in ein Spektralphotometerröhrchen übertragen und die OD der Suspension entweder durch Zugabe von mehr Agrobacterium oder mehr desselben Suspensionsmediums bei 550 nm auf 0,72 eingestellt, um eine Agrobacterium-Konzentration von etwa 0,5 × 109 kbE/ml bis 1 × 109 kbE/ml zu erhalten. Die End-Agrobacterium-Suspension wurde in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen als Aliquots verteilt, von denen jedes 1 ml der Suspension enthielt. Die Suspensionen wurden dann möglichst schnell verwendet.
Embryo-Isolierung, Infektion und Co-Kultivierung:
Etwa 2 ml desselben Mediums (hier PHI-A oder PHI-I), das für die Agrobacterium-Suspension verwendet wurde, wurden in ein 2 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Unreife Embryos wurden aus einer sterilisierten Ähre mit einem sterilen Spatel (Baxter Scientific Products S1565) isoliert und direkt in das Medium in Röhrchen gegeben. Insgesamt wurden etwa 100 Embryos in das Röhrchen gegeben. Die optimale Größe der Embryos war etwa 1,0–1,2 mm. Die Kappe wurde dann auf dem Röhrchen verschlossen und das Röhrchen wurde mit einem Vortex-Mischer (Baxter Scientific Products 58223-1) für 5 s bei maximaler Geschwindigkeit verwirbelt. Das Medium wurde entfernt und es wurden 2 ml frisches Medium zugesetzt und das Verwirbeln wurde wiederholt. Das gesamte Medium wurde abgezogen und 1 ml Agrobacterium-Suspension wurde den Embryos zugesetzt und das Röhrchen wurde für 30 s einer Vortex-Behandlung unterzogen. Das Röhrchen wurde für 5 min unter der Abdeckung stehengelassen. Die Suspension von Agrobacterium und Embryos wurde in eine Petri-Schale gegossen, die entweder PHI-B-Medium [CHU(N6)-Basalsalze (Sigma C-1416) 4,0 g/l; Eriksson's-Vitamin-Mischung (1000X, Sigma-1511) 1,0 ml/l; Thiamin·HCl 0,5 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; L-Prolin 0,69 g/l; Silbernitrat 0,85 mg/l; Gelrite (Sigma) 3,0 g/l; Saccharose 30,0 g/l; Acetosyringon 100 mM; pH 5,8] für das PHI-Basismediumsystem oder PHI-J-Medium [MS-Salze 4,3 g/l; Nicotinsäure 0,50 mg/l; Pyridoxin·HCl 0,50 mg/l; Thiamin·HCl 1,0 mg/l; Myoinositol 100,0 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; Saccharose 20,0 g/l; Glucose 10,0 g/l; L-Prolin 0,70 g/l; MES (Sigma) 0,50 g/l; 8,0 g/l Agar (Sigma A-7049, gereinigt) und 100 mM Acetosyringon mit einem End-pH von 5,8 für das PHI-System mit kombiniertem Medium. Embryos, die im Röhrchen geblieben waren, wurden unter Verwendung eines sterilen Spatels auf die Platte übertragen. Die Agrobacterium-Suspension wurde abgezogen und die Embryos wurden mit der Achse nach unten auf das Medium gelegt. Die Platte wurde mit Parafilm-Band oder Pylon Vegetative Combine Tape (Produkt mit dem Namen „E.G.CUT", das in Größen von 18 mm × 50 m erhältlich ist; Kyowa Ltd., Japan) dicht versiegelt und im Dunkeln für etwa 3 Tage Co-Kultivierung bei 23–25°C inkubiert.
Ruhe-, Selektions- und Regenerierungsschritte:
Für den Ruheschritt wurden alle Embryos auf eine neue Platte transferiert, die PHI-C-Medium [CHU(N6)-Basalsalze (Sigma C-1416) 4,0 g/l; Eriksson's Vitamin-Mischung (1000X Sigma-1511) 1,0 ml/l; Thiamin·HCl 0,5 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; L-Prolin 0,69 g/l; Saccharose 30,0 g/l; MES-Puffer (Sigma) 0,5 g/l; Agar (Sigma A-7049, gereinigt) 8,0 g/l; Silbernitrat 0,85 mg/l; Carbenicillin 100 mg/l; pH 5,8] enthielt. Die Platte wurde mit Parafilm oder Pylon-Band versiegelt und im Dunkeln bei 28°C für 3–5 Tage inkubiert.
Längere Co-Kultivierungsperioden können das Fehlen eines Ruheschritts kompensieren, da der Ruheschritt wie der Co-Kultivierungsschritt einen Zeitraum für den Embryo zur Kultivierung in Abwesenheit eines selektiven Mittels bereitstellt. Der Fachmann auf diesem Gebiet kann leicht Kombinationen aus Co-Kultivierung und Ruhezeiten testen, um die Transformation zu optimieren oder zu verbessern.
Zur Selektion wurden alle Embryos aus dem PHI-C-Medium auf neue Platten transferiert, die PHI-D-Medium als Selektionsmedium enthielten [CHU(N6)-Basalsalze (SIGMA C-1416) 4,0 g/l; Eriksson's Vitamin-Mischung (1000X, Sigma-1511) 1,0 ml/l; Thiamin·HCl 0,5 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; L-Prolin 0,69 g/l; Saccharose 30,0 g/l; MES-Puffer 0,5 g/l; Agar (Sigma A-7049, gereinigt) 8,0 g/l; Silbernitrat 0,85 mg/l; Carbenicillin (ICN, Costa Mesa, CA) 100 mg/l; Bialaphos (Meiji Seika K. K, Tokio, Japan) und zwar 1,5 mg/l für die ersten zwei Wochen, danach 3 mg/l für die restliche Zeit; pH 5,8], wobei etwa 20 Embryos auf jede Platte gelegt wurden. Die Platten wurden wie oben beschrieben versiegelt und im Dunkeln bei 28°C für die ersten zwei Selektionswochen inkubiert. Die Embryos wurden in Zwei-Wochen-Intervallen auf frisches Selektionsmedium transferiert. Das Gewebe wurde subkultiviert, indem es für insgesamt etwa 2 Monate auf frisches Selektionsmedium übertragen wurde. Die Herbizid-resistenten Calli wurden dann „in der Masse vermehrt" (bulked-up), indem sie für weitere zwei Wochen auf demselben Medium wachsen gelassen wurden, bis der Durchmesser der Calli etwa 1,5–2 cm war.
Zur Regeneration wurden die Calli dann auf PHI-E-Medium [MS-Salze 4,3 g/l; Myoinositol 0,1 g/l; Nicotinsäure 0,5 mg/l; Thiamin·HCl 0,1 mg/l, Pyridoxin·HCl 0,5 mg/l, Glycin 2,0 mg/l, Zeatin 0,5 mg/l, Saccharose 60,0 g/l, Agar (Sigma, A-7049) 8,0 g/l, Indolessigsäure (IAA, Sigma) 1,0 mg/l, Abscisinsäure (ABA, Sigma) 0,1 mM, Bialaphos 3 mg/l, Carbenicillin 100 mg/l, eingestellt auf pH 5,6] im Dunkeln bei 28°C für 1–3 Wochen kultiviert, um somatische Embryos reifen zu lassen. Die Calli wurden dann auf PHI-F-Medium (MS-Salze 4,3 g/l; Myoinositol 0,1 g/l; Thiamin·HCl 0,1 mg/l, Pyridoxin·HCl 0,5 mg/l, Glycin 2,0 mg/l, Nicotinsäure 0,5 mg/l; Saccharose 40,0 g/l; Gelrite 1,5 g/l; pH 5,6] bei 25°C mit einem Lichtprogramm von 16 h Licht (270 uE m-2s-1) und 8 h Dunkelheit kultiviert, bis sich Keimlinge und Wurzeln entwickelt hatten. Jedes kleine Pflänzchen wurde dann in ein 25 × 150 mm-Röhrchen, das PHI-F-Medium enthielt, transferiert und unter denselben Bedingungen für etwa eine weitere Woche wachsen gelassen. Die Pflänzchen wurden in Töpfe mit Erdgemisch in einem Gewächshaus umgetopft. GUS+-Ereignisse wurden im Callus-Stadium oder im Stadium der regenerierten Pflanze bestimmt.
Für Hi-II war ein optimiertes Protokoll 0,5 × 109 kbE/ml Agrobacterium, ein 3–5 Tage-Ruheschritt und kein AgNO3 im Infektionsmedium (PHI-A-Medium).
Beispiel 4: In situ-Lokalisierung von Cim1-mRNA in 5 DAP-Maiskörnern.
Eine in situ-Hybridisierung wurde unter Verwendung des Protokolls von Jackson, D. P. (1991) In situ Hybridization in Plants, Molecular Plant Pathology: A Practical Approach, D. J. Bowles, S. J. Gurr und M. McPherson, Herausg. Oxford University Press, England, S. 63–74 durchgeführt. Es wurde sowohl eine Sense- als auch eine Antisense-Sonde, die einem Protein der Cim1-cDNA entspricht, verwendet. Sonden wurden nicht-isotypisch mit Digoxigenin markiert und mit verschiedenen Abschnitten von 5 DAP (Tage nach Bestäubung)-Maiskörnern, die fixiert und eingebettet worden waren, inkubiert. Nach extensivem Waschen zur Entfernung nicht-gebundener Sonde wurden Schnitte mit Anti-Digoxigenin-alkalischer Phosphatase inkubiert, um Bereiche der Sondenhybridisierung zu detektieren. Für Cim1 wurde mRNA spezifisch mit der Antisense-Sonde detektiert und auf Nucellus-Gewebe beschränkt. Die Sense-Kontrollsonde hybridisierte nicht.
Beispiel 5: Northern Analyse der Genexpression in vegetativem Gewebe und sich entwickelnden Körnern
Gesamt-RNA (10 g) wurde der Größe nach an einem 1% Formaldehyd-Agarosegel fraktioniert und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Membranen wurden unter stringenten Bedingungen mit 32P-markierten Sonden hybridisiert, welche cDNA-Fragmente der verschiedenen Gene darstellen. Nach extensivem Waschen zur Entfernung nicht-gebundener Sonde wurden Membranen auf einem Röntgenfilm belichtet. RNA-Proben wurden aus vegetativen Geweben, wie auch aus sich entwickelnden Maiskörnern erhalten.
Das Cim1-Expressionsmuster zeigt keine Expression in vegetativen Geweben oder in isoliertem Embryo oder Endosperm von sich entwickelnden Körnern. Cim1 wurde vornehmlich im frühen (5 DAP) ganzen Korn exprimiert. Das Gen für mi1ps wurde vornehmlich im Embryo von sich entwickelnden Körnern (13–40 DAP) exprimiert, während cZ19B1 im Endosperm der mittleren oder späteren Körnerentwicklung (13–40) exprimiert wurde. Weder milps noch cZ19B1 wurden in vegetativen Geweben exprimiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierter Promotor, der fähig ist, eine Transkription in Samen-bevorzugter Art zu steuern, wobei der Promotor umfasst: (a) die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO. 1 oder 7 angegeben ist; oder (b) eine Sequenz, die wenigstens 60% Sequenzidentität zu SEQ ID NO. 1 oder 7 hat, wobei die %-Sequenzidentität zu SEQ ID NO. 1 oder 7 auf der gesamten Sequenz von SEQ ID NO. 1 oder 7 basiert und durch eine GAP-Version 10-Analyse unter Verwendung von Default-Parametern bestimmt wird; oder (c) eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO. 7 hybridisiert; oder (d) eine Nukleinsäure, die zu einer Nukleinsäure von (a), (b) oder (c) komplementär ist.
Expressionskassette, die einen Promotor nach Anspruch 1 und eine mit dem genannten Promotor funktionell verknüpfte Nucleotidsequenz umfasst.
Transformationsvektor, der eine Expressionskassette nach Anspruch 2 umfasst.
Pflanze, die mit einer Expressionskassette nach Anspruch 2 stabil transformiert ist.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei die Pflanze eine Monokotyle ist.
Pflanze nach Anspruch 5, wobei die Monokotyle Mais, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum oder Roggen ist.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei die Pflanze eine Dikotyle ist.
Samen der Pflanze nach einem der Ansprüche 4 bis 7, der die Expressionskassette nach Anspruch 2 enthält.
Verfahren zum selektiven Exprimieren einer Nucleotidsequenz in einem Pflanzensamen, wobei das Verfahren Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Transformationsvektor nach Anspruch 3 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, das außerdem Regenerieren einer stabil transformierten Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle umfasst, wobei eine Expression einer Nucleotidsequenz unter der Kontrolle eines Promotors nach Anspruch 1 den Phenotyp des genannten Pflanzensamens verändert.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die heterologe Nucleotidsequenz für ein Gen codiert, das bei der Fettsäuresynthese involviert ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die genannte heterologe Nucleotidsequenz für ein Protein codiert, das einen erhöhten Aminosäuregehalt in dem Sinne hat, dass das Protein eine Aminosäureverteilung hat, die den Nährwert des Samens verbessert.
Pflanzenzelle, die stabil mit einer Expressionskassette nach Anspruch 2 transformiert ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 13, wobei die Pflanzenzelle aus einer monokotylen Pflanze stammt.
Pflanzenzelle nach Anspruch 14, wobei die Pflanze Mais, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum oder Roggen ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 13, wobei die Pflanzenzelle aus einer dikotylen Pflanze stammt.