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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Immunologie und die
adenovirale Gentherapie. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung
die Immunmodulation durch genetische Veränderung von dendritischen Zellen
und B-Zellen.
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Beschreibung
des verwandten Fachgebiets
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Eine
wachsende Sammlung von Belegen legt nahe, dass dendritische Zellen
(DC) eine herausragende Rolle im Immunsystem spielen (Bancheareau
J. und R. M. Steinmman, Dendritic cells and the control of immunity.
Nature 392 (1998): 245). An erster Stelle wird von dendritischen
Zellen angenommen, dass sie in einer Schlüsselstellung als Vermittler
der auf T-Zellen basierenden Immunität dienen. Ausgehend von ihrer
wichtigen Funktion wurden dendritische Zellen zur Verwendung in
einer Anzahl klinischer Strategien, insbesondere Impfungen, vorgeschlagen.
Es ist klar geworden, dass die genetische Veränderung dieser Zellen die Immunität gegen
sowohl infektiöse
als auch tumorerzeugende, krankheitserregende Einheiten fördern kann
(Reeves M. E. et al., Retroviral transduction of human dendritic
cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56 (1996):
5672–7).
Wichtig ist, dass all diese Strategien auf effizienten Vektoren
für die
Genabgabe an dendritische Zellen beruhen. Zu diesem Zweck wurde
ein Anzahl von Ansätzen,
jedoch im Allgemeinen mit einer schlechten Effizienz des Gentransfers,
verwendet (Arthur J. F. et al., A comparison of gene transfer methods
in human dendritic cells. Cancer Gene Ther. 4 (1997), 17–25; Van
Tendeloo V. F. I. et al., Nonviral transfection of distinct types
of human dendritic cells: high-efficiency gene transfer by electroporation
into hematopoetic progenitor- but not monocyte-derived dendritic
cells. Gene Ther. 5 (1998), 700–7).
Ein Kandidat war ein replikationsdefizienter adenoviraler Vektor.
Für diesen
Vektor wurde vorgeschlagen, dass er aufgrund seines hohen Titers,
der effizienten Genabgabe und hohen Genexpression für klinische
Anwendungen gut geeignet sei.
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Trotz
dieser theoretischen Vorteile hat die relative Resistenz von dendritischen
Zellen gegenüber der
Infektion durch adenovirale Vektoren den Erhalt des gesamten Vorteils
genbasierter Strategien der Immuntherapie vereitelt (Arthur J. F.
et al., A comparison of gene transfer methods in human dendritic cells.
Cancer Gene Ther. 4 (1997), 17–25;
Dietz A. B. und S. Vuk-Pavlovic, High efficiency adenovirus-mediated
gene transfer to human dendritic cells. Blood 91 (1998), 392–8). Das
Phänomen
der Resistenz von dendritischen Zellen gegenüber dem durch Adenoviren vermittelten
Gentransfer kann auf der geringen Zahl von adenoviralen Eintrittsrezeptoren
beruhen. In permissiven Zellen vermittelt das hervorstehende adenovirale
Fiber-Knob-Protein
die Bindung an den Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR) auf der Zelloberfläche, gefolgt
von der Interaktion mit und Internalisation des Virions durch eines
der av-Integrine avb3 oder avb5 (Wickham T. J. et al., Integrins αvβ3 and αvβ5 promote
adenovirus internalization but not virus attachment. 73 (1993),
309–19;
Bergelson J. M. et al., Isolation of a common receptor for Coxsackie B
viruses and adenoviruses 2 and 5. Science 275 (1997), 1320–3). Die
vorliegende Analyse hat ein Fehlen von CAR, jedoch die ausreichende
Expression des av-Integrins αvβ5 aufgezeigt.
In hohem Maße effizienter,
von der Expression von CAR unabhängiger
Gentransfer mittels durch bispezifische Einheiten gegen alternative
zelluläre
Rezeptoren zielausgerichteter Adenoviren wurde früher gezeigt
(Douglas J. T. et al., Targeted gene delivery by tropism modified
adenoviral vectors. Nature Biotech. 14 (1996), 1574–8). Es
wurde postuliert, dass eine ähnliche Strategie,
auf den auf dendritischen Zellen exprimierten Marker CD40 zu zielen,
den Gentransfer in dendritische Zellen verbessern könnte.
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Durch
chemische Konjugation eines monoclonalen neutralisierenden Anti-Fiber-Knob-Antikörpers an
einen monoclonalen Antikörper
mit einer Affinität
für den
Rezeptor CD40 dendritischer Zellen wurde ein bispezifischer Antikörper hergestellt.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass ein mit dieser bispezifischen
Einheit komple xierter Adenovirus dramatische Verbesserungen des
Gentransfers in aus Monozyten gewonnen dendritischen Zellen vermittelt. Noch
wichtiger ist, dass eine Hochregulierung von mehreren Reifungsmarkern
dendritischer Zellen und eine verbesserte Funktion bei Allo-MLR
nach Infektion mit auf CD40 zielgerichtetem Vektor beobachtet wurde,
was aufzeigt, dass der Vektor selbst ausreifende Eigenschaften aufweist.
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Somit
mangelt es dem Stand der Technik an Verfahren zur Transduktion von
dendritischen Zellen und B-Zellen zu Zwecken der Immunmodulation.
Die vorliegende Erfindung erfüllt
diesen lange bestehenden Bedarf und Wunsch im Fachgebiet.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Durch
chemische Konjugation von Antikörpern
mit Affinitäten
für das
Fiber-Knob des Adenovirus
und den Rezeptor CD40 dendritischer Zellen wurde ein bispezifischer
Antikörper
hergestellt. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass auf CD40 zielgerichtetes
Adenovirus dramatische Verbesserungen des Gentransfers in aus Monozyten
gewonnen dendritischen Zellen vermittelt und dass diese Verbesserungen
auf die quantitative Steigerung der Zahl transduzierter Zellen zurückgeführt werden
können.
Zusätzlich
zeigt die vorliegende Erfindung durch erfolgreiche Blockierung mit
dem Ausgangsmonoclonalen G28.5 und das Versagen des Konjugates,
den Gentransfer in für
CD40 negative Linien zu vermitteln, dass diese Verbesserung spezifisch
für das
durch den G28.5-Antikörper
erkannte Epitop ist. Weiterhin wurde eine Hochregulierung von mehreren
gut beschriebenen Reifungsmarkern dendritischer Zellen und eine
verbesserte Allo-MLR durch diese Zellen nach Infektion mit einem
neu zielgerichteten Vektor beobachtet. Die Doppelrolle von CD40
in diesem Szenario sowohl als ein Ersatzrezeptor des Adenovirus
als auch als starker Auslöser
der Reifung dendritischer Zellen kann sich zufällig als Strategie zur neuen
Zielausrichtung für
diese kritische Zellart des Immunsystems erweisen.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen adenoviralen Vektor
bereitzustellen, der fähig
ist, eine Zielfindung auf und Transduktion von Zellen des Immunsystems,
wie dendritische Zellen und B-Zellen, durchzuführen, wobei die Transduktion
von B-Zellen eine Reifung dieser B-Zellen ergibt.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Genabgabesystem zur Transduktion
und Immunmodulation von Immunsystemzellen, die den CD40-Rezeptor
aufweisen bereitgestellt, umfassend:
- a) ein
Adenovirus; und
- b) eine CD40-Antigen-erkennende Komponente, wobei die Komponente
umfasst (1) einen ersten Antikörper
oder ein Antigen-bindendes Fragment von dem ersten Antikörper, der
an das Fiber-Knob-Protein auf dem Adenovirus bindet, und (2) einen
Anti-CD40-Antikörper
G28.5 oder ein Antigen-bindendes Fragment des G28.5-Antikörpers, der/das
an CD40 auf der Oberfläche
von den Immunsystemzellen bindet, wobei der erste Antikörper oder
das Antigen-bindende
Fragment davon an den Anti-CD40-Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment
davon gebunden ist.
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Zusätzlich kann
der bispezifische Antiköper das
Produkt einer Genfusion sein.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann der adenovirale Vektor ein therapeutisches
Gen ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einem Gen, das ein Tumorantigen codiert,
einem Gen, das ein Antigen gegen einen infektiösen Erreger codiert, einem
Gen, das ein zytotoxisches Mittel codiert und einem Gen, das ein
immunmodulatorisches Mittel codiert, exprimieren; die Immunsystemzellen
sind ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus dendritischen Zellen und B-Zellen, genauso
sind Nicht-Immunzellen, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Gefäßendothelzellen, Epithelzellen,
Zellen, die eine chronische Entzündung
aufzeigen, und Zellen und Gefäße von Karposisarkomtumoren;
und die Reifung der Immunzellen zeigt die Modulation der Immunzellen
an.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
wird die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend einen Adenovirus
und eine CD40-Antigen-erkennende Komponente, bei der Herstellung
eines Arzneimittels zur genetischen Manipulation von Immunsystemzellen
in einem Individuum, das einer solchen Behandlung bedarf, bereitgestellt,
wobei die CD40-Antigen-erkennende Komponente umfasst (1) einen ersten
Antikörper
oder ein Antigen-bindendes Fragment des ersten Antikörpers, das/der
an das Fiber-Knob-Protein auf dem Adenovirus bindet, und (2) einen
Anti-CD40-Antikörper G28.5
oder ein Antigen-bindendes Fragment des G28.5-Antikörpers, das an CD40 auf der
Oberfläche
der Immunsystemzellen bindet, wobei der erste Antikörper oder
das Antigen-bindende Fragment davon an den Anti-CD40-Antikörper oder
das Antigen-bindende Fragment davon gebunden ist. Die Immunsystemzellen werden
aus der Gruppe bestehend aus dendritischen Zellen und B-Zellen ausgewählt, genauso
wie Nicht-Immunzellen, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Gefäßendothelzellen,
Epithelzellen, chronische Entzündungen
anzeigenden Zellen und Zellen und Gefäßen von Karposisarkomtumoren.
Im Allgemeinen wird das Verfahren bei der Behandlung eines Individuums
nützlich
sein, welches eine Erkrankung wie Krebs, Infektionserkrankungen,
Allotransplantatabstoßung,
Xenotransplantatabstoßung und
Autoimmunerkrankungen hat. Zusätzlich
wird die Verabreichung des immunmodulatorischen Adenovirus aus der
Gruppe bestehend aus systemisch, intradermal und ex vivo ausgewählt. Andere
und weitere Aspekte, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der zur Zeit
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung ersichtlich werden. Diese Ausführungsformen werden zum Zweck
der Offenbarung angegeben.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Damit
die Art, in welcher die vorstehend genannten Eigenschaften, Vorteile
und Gegenstände der
Erfindung, sowie andere, welche offensichtlich sein werden, erlangt
und im Detail verstanden werden, können genauere Beschreibungen
der vorstehend kurz zusammengefassten Erfindung als Bezug auf bestimmte
Ausführungsformen
davon, welche in den anhängenden
Zeichnungen dargestellt werden, verwendet werden. Diese Zeichnungen
bilden einen Teil der Beschreibung. Es ist jedoch zu beachten, dass
die anhängenden
Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung erläutern
und deshalb nicht als ihren Umfang beschränkend angesehen werden sollen.
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Die 1 zeigt, dass durch Fab-anti-CD40 zielgerichtetes
Adenovirus einen verstärkten
Umfang von Gentransfer vermittelt, welcher für CD40 spezifisch ist. Aus
Monozyten gewonnene dendritische Zellen (1A) oder
die Gliomzelllinie D65 (1B) wurden
vorab in der Anwesenheit oder Abwesenheit von unkonjugiertem Anti-CD40-mAb
inkubiert und entweder mit AdCMVLuc alleine oder komplexiert mit Fab-anti-CD40
infiziert. Nach einer 24-stündigen
Inkubation wurden die Zellen auf die Expression von Luziferase untersucht.
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Die 2 zeigt,
dass die Zielrichtung von Adenoviren auf CD40 die zur Erreichung
eines gegebenen Niveaus der Genexpression nötige virale MOI reduziert.
Virus wurde entweder in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Fab-anti-CD40-Konjugat kurz inkubiert
und anschließend
in Reihe verdünnt,
um einer Multiplizität
von Infektionen (MOIs) von 1000, 100, 10 und 1 zu entsprechen. Aus
Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden infiziert und die Zellen
wurden nach 24 Stunden auf Luziferasexpression getestet.
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Die 3 zeigt, dass auf CD40 zielgerichtetes,
auf β1-Integrin
zielgerichtetes und mit Liposomen komplexiertes Adenovirus einen
vergleichbaren Gentransfer in aus Monozyten gewonnene dendritische
Zellen vermitteln. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden
mit Adenovirus infiziert, welches Green-Fluorescent-Protein (GFP) codiert, vorab
mit einem des folgenden inkubiert: PBS, Fab-anti-CD40, Fab-anti-β1-Integrin-Konjugat, Fab-anti-EGFR-Konjugat
oder Liposomen. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C wurden
die Bedingungen unter Verwendung von Durchflusszytometrie auf die
Expression von GFP untersucht und sind als Prozentanteil GFP-positiver
Zellen basierend auf der Analyse von 10000 Zellen dargestellt.
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Die 4 zeigt,
dass die Zielausrichtung auf CD40 die Expression von Reifungsmarkern
dendritischer Zellen vermittelt. Zellen wurden mit den angegebenen
Bedingungen oder Virus/Konjugaten oder Konjugaten alleine behandelt
und über
24 Stunden inkubiert. Die dargestellten Proben zeigen durch Durchflusszytometrie
die Expression von CD83, HLA-DR, HLA-DQ, CD86 und CD54.
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Die 5 zeigt, dass die Produktion von IL-12
nach der Behandlung mit Anti-CD40-Ab oder dem Fab-anti-CD40 zielausrichtenden
Konjugat verstärkt
ist. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden mit den
angegebenen neu zielgerichteten Adenoviren oder in der Abwesenheit
von Adenoviren mit unkonjugiertem Anti-CD40-Ab oder dem Fab-anti-CD40-Konjugat
behandelt. Nach 48 Stunden wurden die Überstände durch ELISA auf Produktion
von IL-12, einem Marker für
die Reifung dendritischer Zellen, untersucht. Anzumerken ist, dass
Werte unter 8 ng unterhalb des linearen Bereichs des Nachweises
dieses Tests sind.
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Die 6 zeigt,
dass die Zielausrichtung auf CD40 eine Verstärkung in der Fähigkeit
eine allo-gemischte-Lymphozyten-Reaktion auszubilden vermittelt.
Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden mit den angegebenen
Bedingungen behandelt und mit nicht-adhärenten Lymphozyten-Responderzellen
MLR zu den angegebenen Responder/Stimulator Verhältnissen (R : S) gemischt.
Die Zellen wurden anschließend
mit 3H markiert und nach drei Tagen auf
mit Zellen assoziierte CPM untersucht.
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Die 7 zeigt, dass primäre B-Zellen einen Mangel an
CAR (7A) und dem αv-Integrin αvβ5 haben (7B).
Die adenoviralen Eintrittsrezeptoren. Die Zellen wurden mit FACS
unter Verwendung des Anti-CAR-mAb RmcB und des Anti-αvβ5-spezifischen
mAb P1F6 analysiert. (Die Analyse von αvβ3 war ähnlich zu αvβ5).
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Die 8 zeigt,
dass durch Fab-anti-CD40 oder Fab-anti-β1-Integrin zielausgerichtetes
Adenovirus ein verstärktes
Ausmaß des
Gentransfers auf primäre,
normale B-Zellen vermittelt. Gereinigte primäre B-Zellen wurden entweder
mit AdCMVLuc alleine oder wie angegeben komplexiert mit dem nachfolgenden:
Fab, Fab-anti-CD40 oder Fab-anti-β1-Integrine
infiziert. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen auf Expression
von Luziferase untersucht.
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Die 9 zeigt,
dass in der Natur die Aktivierung von dendritischen Zellen durch
auf T-Helferzellen exprimierten CD40-Liganden vermittelt wird, was die
Reifung von dendritischen Zellen ermöglicht, so dass diese zytotoxische
T-Lymphozyten (CTL's)
richtig stimulieren können.
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Die 10 zeigt,
dass auf CD40 zielgerichtetes Adenovirus die CD4+-T-Helferfunktion durch Aktivierung
von CD40 ersetzen kann, was zur Reifung dendritischer Zellen führt. Aus
diesem Grund könnte
auf CD40 zielgerichtetes Adenovirus die Stimulation einer CTL-Antwort
sogar in der Abwesenheit funktionierender T-Helferzellen ermöglichen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Eine
Vielzahl von Studien hat die wichtigen Auswirkungen von genetisch
veränderten
dendritischen Zellen hervorgehoben. Darin wird ein Vektor zur Erreichung
eines effizienten Gentransfers zu dieser Zellart ausschlaggebend
für viele
immunmodulatorische Strategien und doch haben aktuelle Vektorsysteme
das Problem ei nes Gentransfers geringer Effizienz. Das Adenovirus
(Ad) wurde im Zusammenhang der Transduktion dendritischer Zellen
verwendet, aber seine Effizienz der Genabgabe erwies sich als suboptimal.
Mittels bispezifischer Antikörper
zeigt die vorliegende Erfindung durch neue Zielausrichtung des Adenovirus
auf CD40, einem Marker, der verbreitet auf dendritischen Zellen
exprimiert wird, erfolgreich einen verbesserten Gentransfer in aus
Monozyten gewonnene dendritische Zellen. Auf CD40 zielgerichtetes
Virus zeigte verglichen mit nicht zielgerichtetem Virus sowohl dramatische
als auch quantitative Verbesserungen im Gentransfer. Für diesen
Gentransfer wurde gezeigt, dass er spezifisch für CD40 ist, wie dies sowohl
durch die erfolgreiche Blockierung mit dem Ausgangsantikörper als
auch durch die Abwesenheit von Gentransfer in für CD40 negative Zellen gezeigt
wurde. Von diesen Eigenschaften würde man erwarten, dass sie
die benötigte
Dosis von Virus für
ein gegebenes Niveau der Transduktion reduzieren und man würde deshalb
von ihnen erwarten, dass sie die mit dem Vektor zusammenhängende Toxizität reduzieren
und eine ektopische Genabgabe reduzieren.
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Grundlegend
für die
Neuheit dieses Systems ist die Fähigkeit
des Vektors selbst, den immunologischen Status der aus Monozyten
gewonnenen dendritischen Zellen zu beeinflussen. Dieser Vektor löst die Reifung
von dendritischen Zellen aus, wie dies phänotypisch durch gesteigerte
Expression von CD83, MHC und kostimulatorischen Molekülen, ebenso
wie funktionell durch eine verstärkte
allostimulaorische Fähigkeit
in einer gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) gezeigt wurde. Durch
Vergleich dieses Vektors mit anderen auf Adenovirus basierenden
Gentransfer-Vektoren
wurde offensichtlich, dass die bei dendritischen Zellen beobachteten
grundlegenden Wirkungen spezifisch für CD40 sind. Dieser Ansatz
kann nicht nur als hoch-effizienter Gentransfervektor dienen, sondern
kann auch die Notwendigkeit für
zusätzliche
Schritte zur Förderung
der Reifung dendritischer Zellen nach der Genabgabe aufheben.
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Die
vorliegende Erfindung nützt
auf das CD40-Zelloberflächenantigen
auf dendritischen Zellen und B-Zellen zielgerichtete adenovirale
Vektoren. Zielgerichtete adenovirale Vektoren können in Verfahren der Transduktion
von dendritischen Zellen und B-Zellen verwendet werden. Die Reifung
von dendritischen Zellen und B-Zellen kann der Transduktion mit
dem zielgerichteten adenoviralen Vektor folgend ausgelöst werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung können übliche Techniken
der Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinanter DNA im Rahmen
der Durchschnittsfachkenntnis verwendet werden. Solche Techniken
sind vollumfänglich
in der Literatur erklärt. Siehe
zum Beispiel Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (1982); "DNA
Cloning: A Practical Approach," Bände I und
II (D. N. Glover Hrsg. 1985); "Oligonucleotide
Synthesis" (M. J.
Gait Hrsg. 1984); "Nucleic
Acid Hybridization" [B.
D. Hames & S.
J. Higgins Hrsg. (1985)]; "Transcription
and Translation" [B.
D. Hames & S.
J. Higgins Hrsg. (1984)]; "Animal
Cell Culture" [R.
I. Freshney, Hrsg. (1986)]; "Immobilized
Cells And Enzymes" [IRL
Press, (1986)]; B. Perbal, "A
Practical Guide To Molecular Cloning" (1984). Deshalb sollen, wenn sie hier
erscheinen, die folgenden Begriffe die nachstehend ausgeführten Definitionen
haben.
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Ein „DNA-Molekül" bezieht sich auf
die polymere Form von Desoxyribonucleotiden (Adenin, Guanin, Thymin
oder Cytosin) in ihrer entweder einzelsträngigen Form oder einer doppelsträngigen Helix. Dieser
Begriff bezieht sich nur auf die Primär- und Sekundärstruktur
des Moleküls
und begrenzt es nicht auf irgend welche bestimmten Tertiärformen.
Somit schließt
dieser Begriff doppelsträngige
DNA, wie sie unter anderem in linearen DNA-Molekülen (zum Beispiel Restriktionsfragmenten),
Viren, Plasmiden und Chromosomen gefunden wird, ein. Bei der Diskussion
der Struktur wird hier, entsprechend der normalen Konvention, nur
die Sequenz in der 5' nach
3'-Richtung entlang
des nicht transkribierten Stranges der DNA (das heißt, der
Strang der eine zur mRNA homologe Sequenz hat) angegeben.
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Ein „Vektor" ist ein Replikon
wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment
gebunden sein kann, so dass die Replikation des gebundenen Segmentes
bewerkstelligt wird. Ein „Replikon" ist jedes genetische
Element (zum Beispiel ein Plasmid, Chromosom, Virus), das in vivo
als autonome DNA-Replikationseinheit
wirkt, das heißt zur
Replikation unter seiner eigenen Kontrolle fähig ist. Ein „Replikationsursprung" bezieht sich auf
jene DNA-Sequenzen, welche an der DNA-Synthese beteiligt sind. Eine „Expressionskontrollsequenz" ist eine DNA-Sequenz, welche die
Transkription und Translation einer anderen DNA-Sequenz kontrolliert und
reguliert. Eine codierende Sequenz in einer Zelle ist „funktionell
verknüpft" und „unter
der Kontrolle" von
transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen, wenn die
RNA-Polymerase die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, welche
dann in das durch die codierende Sequenz codierte Protein translatiert
wird.
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Im
Allgemeinen werden Vektoren, welche Promotorsequenzen enthalten,
welche die effiziente Transkription und Translation des eingefügten DNA-Fragmentes
ermöglichen,
im Zusammenhang mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise
einen Replikationsursprung, Promotor(en), Terminator(en), genauso
wie spezifische Gene, welche fähig
sind, eine phänotypische
Selektion bei transformierten Zellen bereitzustellen. Die transformierten
Wirte können
entsprechend den im Fachgebiet bekannten Mitteln fermentiert und
gezüchtet
werden, um ein optimales Zellwachstum zu erreichen.
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Eine „codierende
Sequenz" aus DNA
ist eine doppelsträngige
DNA-Sequenz, welche in vivo in ein Polypeptid transkribiert und
translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen
Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden
durch ein Startcodon am 5'(Amino-)-Terminus
und ein Stoppkodon der Translation am 3'(Carboxyl)-Terminus bestimmt. Eine codierende
Sequenz kann prokaryontische Sequenzen, cDNA aus eukaryontischer
mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryontischer (zum Beispiel Säuger-) DNA
und sogar synthetische DNA-Sequenzen einschließen, ist aber nicht auf diese
beschränkt. Ein
Polyadenylierungssignal und eine Terminationssequenz der Transkription
werden sich für
gewöhnlich
3' zu der codierenden
Sequenz befinden. Eine „cDNA" ist als Kopie-DNA
oder komplementäre
DNA definiert und ist ein Produkt einer reversen Transkriptionsreaktion
aus einem mRNA-Transkript. Ein „Exon" ist eine exprimierte Sequenz, welche
von dem Gen-Lokus transkribiert wird, wohingegen ein „Intron" eine nicht-exprimierte
Sequenz ist, die von dem Gen-Lokus stammt.
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Transkriptionelle
und translationelle Kontrollsequenzen sind regulatorische DNA-Sequenzen
wie Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Terminatoren
und Ähnliches,
welche die Expression einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle
ermöglichen.
Ein „cis-Element" ist eine Nucleotidsequenz,
welche auch als „Konsensussequenz" oder „Motiv" bezeichnet wird,
die mit anderen Proteinen wechselwirkt, welche die Expression eines
spezifischen Genlokus heraufregulieren oder herunterregulieren können. Eine „Signalsequenz" kann auch in der
codierenden Sequenz eingeschlossen sein. Diese Sequenz codiert ein
zu dem Polypeptid N-terminales
Signalpeptid, welches mit der Wirtszelle kommuniziert und das Polypeptid
zu der angemessenen zellulären
Position steuert. Signalsequenzen können mit einer Vielfalt von
Proteinen, welche Prokaryonten und Eukaryonten arteigen sind, assoziiert
gefunden werden.
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Eine „Promotorsequenz" ist eine regulatorische
DNA-Region, welche fähig
ist, die RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription
einer stromabwärts
gelegenen (3'-Richtung)
codierenden Sequenz einzuleiten. Zum Zweck der Definition der vorliegenden
Erfindung wird die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus
durch die Initiationsstelle der Transkription begrenzt und erstreckt
sich stromaufwärts
(5'-Richtung), um
eine minimale Zahl von Basen oder Elementen einzuschließen, welche
nötig sind,
um die Transkription auf Niveaus einzuleiten, welche über dem
Hintergrund nachweisbar sind. Innerhalb der Promotorsequenz werden
sich eine Initiationsstelle der Transkription, genauso wie Proteinbindungsdomänen (Konsensussequenzen),
welche für
die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind, finden. Eukaryontische
Promotoren enthalten oft, aber nicht immer, „TATA"-Boxen
und „CAT"-Boxen. Prokaryontische
Promotoren enthalten zusätzlich
zu den -10- und -35-Konsensussequenzen Shine-Dalgarno-Sequenzen.
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Der
Begriff „Oligonucleotid" ist definiert als ein
Molekül,
welches aus zwei oder mehr, bevorzugt mehr als drei, Desoxyribonucleotiden
besteht. Seine genaue Größe wird
von vielen Faktoren abhängen, welche
ihrerseits von der endgültigen
Funktion und Verwendung des Oligonucleotids abhängen. Der Begriff „Primer", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf ein Oligonucleotid, gleich ob natürlich vorkommend
wie in einer aufgereinigten Restriktionsspaltung oder synthetisch
hergestellt, welches fähig
ist, als Startpunkt der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen
gesetzt wird, in denen die Synthese eines Primerextensionsproduktes,
welches komplementär
zu einem Nucleinsäurestrang
ist, eingeleitet wird, das heißt,
in der Anwesenheit von Nucleotiden und einem einleitenden Mittel
wie einer DNA-Polymerase und bei einer geeigneten Temperatur und
geeignetem pH-Wert. Der Primer kann entweder einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein und muss ausreichend lang sein, um die Synthese des gewünschten Extensionsproduktes
in der Anwesenheit des einleiten den Mittels zu starten. Die genaue
Länge des
Primers wird von vielen Faktoren, einschließlich Temperatur, Quelle des
Primers und Verwendung des Verfahrens, abhängen. Zum Beispiel enthält der Oligonucleotidprimer
für diagnostische
Anwendungen, abhängig
von der Komplexität
der Zielsequenz, typischerweise 15–25 oder mehr Nucleotide, obwohl
er weniger Nucleotide enthalten kann.
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Primer
werden ausgewählt,
um „im
Wesentlichen" komplementär zu verschiedenen
Strängen
einer bestimmten DNA-Zielsequenz zu sein. Dies bedeutet, dass Primer
ausreichend komplementär
sein müssen,
um mit ihren jeweiligen Strängen
zu hybridisieren. Deshalb muss die Primersequenz nicht die genaue
Sequenz der Matrize wiederspiegeln. Zum Beispiel kann ein nicht-komplementäres Nucleotidfragment
an das 5'-Ende eines
Primers gebunden sein, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu dem
Strang ist. Alternativ können
nicht-komplementäre
Basen oder längere
Sequenzen in den Primer eingestreut sein, vorausgesetzt, dass die
Primersequenz eine ausreichende Komplementarität mit der Sequenz hat oder
mit ihr hybridisiert und dadurch die Matrize für die Synthese des Verlängerungsprodukts
bildet.
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Wie
hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Restriktionsendonuclease" und „Restriktionsenzym" auf Enzyme, welche
doppelsträngige
DNA an oder nahe einer spezifischen Nucleotidsequenz schneiden.
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„Rekombinante
DNA-Technologie" bezieht sich
auf Techniken zur Verbindung zweier heterologer DNA-Moleküle, für gewöhnlich als
Ergebnis von in vitro-Ligierungen
von DNAs aus verschiedenen Organismen. Rekombinante DNA-Moleküle werden üblicher
Weise durch Experimente der Genmanipulation hergestellt. Gleichbedeutende
Begriffe schließen „Gen-Splicing", „molekulare
Klonierung" und „Genmanipulation" ein. Das Produkt
dieser Manipulationen ergibt eine „Rekombinante" oder ein „rekombinantes
Molekül".
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Eine
Zelle wurde mit exogener oder heterologer DNA „transformiert", „transfiziert" oder „transduziert", wenn solche DNA
in die Zelle eingeführt
wurde. Die transformierende DNA kann dabei (kovalent gebunden) in
das Genom der Zelle integriert sein oder auch nicht. In Prokaryonten,
Hefe und Säugerzellen
kann zum Beispiel die transformierende DNA auf einem episomalen
Element wie einem Vektor oder Plasmid erhalten werden. Im Hinblick
auf eukaryontische Zellen ist eine stabil transfor mierte Zelle eine,
in welcher die transformierende DNA in ein Chromosom integriert
wurde, so dass sie von Tochterzellen durch Replikation des Chromosoms
geerbt werden kann. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit
der eukaryontischen Zellen demonstriert, Zelllinien oder Klone zu
begründen,
welche aus einer Population von die transformierende DNA enthaltenden Tochterzellen
bestehen. Ein „Klon" ist eine Population
von Zellen, welche durch Mitose aus einer einzelnen Zelle oder einem
einzelnen Vorfahren abstammen. Eine „Zelllinie" ist ein Klon einer primären Zelle, welcher
in vitro über
viele Generationen zu stabilem Wachstum fähig ist. Ein Organismus wie
eine Pflanze oder ein Tier, welcher mit exogener DNA transformiert
worden ist, wird als „transgen" bezeichnet.
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Wie
hier verwendet, soll der Begriff „Wirt" nicht nur Prokaryonten, sondern auch
Eukaryonten wie Hefe-, Pflanzenzellen und tierische Zellen einschließen. Ein
rekombinantes DNA-Molekül
oder Gen kann unter Verwendung jeglicher dem Durchschnittsfachmann üblicherweise
bekannten Techniken verwendet werden, um einen Wirt zu transformieren.
Eine bevorzugte Ausführungsform
ist die Verwendung eines Vektors zu Zwecken der prokaryontischen
Transformation. Prokaryontische Wirte können E. coli, S. typhimurium,
Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Eukaryontische
Wirte schließen
Hefen wie Pichia pastoris, Säugerzellen und
Insektenzellen und stärker
bevorzugt Pflanzenzellen wie Arabidopsis thaliana und Tobaccum nicotiana
ein.
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Zwei
DNA-Sequenzen sind „weitgehend
homolog", wenn wenigstens
etwa 75% (bevorzugt wenigstens etwa 80% und am stärksten bevorzugt
wenigstens etwa 90% oder 95%) der Nucleotide über die bestimmte Länge der
DNA-Sequenzen übereinstimmen.
Sequenzen, welche weitgehend homolog sind, können durch Vergleich der Sequenzen
unter Verwendung von Standardsoftware, welche in Sequenzdatenbanken
erhältlich
ist, oder in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter zum
Beispiel stringenten Bedingungen, wie sie für dieses bestimmte System definiert
sind, identifiziert werden. Das Definieren geeigneter Hybridisierungsbedingungen
liegt in der Durchschnittsfachkenntnis. Siehe zum Beispiel Maniatis
et al., vorstehend; DNA Cloning, Bände I & II, vorstehend; Nucleic Acid Hybridization,
vorstehend.
-
Eine „heterologe" Region des DNA-Konstruktes
ist ein identifizierbarer DNA-Abschnitt
in einem größeren DNA-Molekül, welcher
in der Natur nicht in Assoziation mit dem größeren DNA-Molekül gefunden
wird. So wird das Gen, wenn die heterologe Region ein Säugergen
codiert, für
gewöhnlich
von DNA flankiert sein, welche die genomische Säuger-DNA im Genom des Ausgangsorganismus
nicht flankiert. In einem anderen Beispiel ist die codierende Sequenz
ein Konstrukt, wobei die codierende Sequenz selbst nicht in der
Natur vorgefunden wird (zum Beispiel eine cDNA, wobei die genomische
codierende Sequenz Introns enthält,
oder synthetische Sequenzen, welche von denen des natürlichen
Gens verschiedene Codons haben). Allelische Variationen oder natürlich auftretende
Mutationsereignisse bedingen keine heterologe Region, wie sie hier
definiert ist.
-
Wie
hier verwendet, wird ein „Fragment" angewendet auf einen
Antikörper
für gewöhnlich wenigstens
10 Reste, typischer wenigstens 20 Reste und bevorzugt wenigstens
30 (zum Beispiel 50) Reste, aber weniger als die gesamte, intakte
Sequenz, lang sein. Antikörperfragmente
können
durch dem Fachmann bekannte Verfahren, zum Beispiel enzymatische
Spaltung von natürlich
vorkommenden oder rekombinanten Antikörpern, durch rekombinante DNA-Techniken
unter Verwendung eines Expressionsvektors, welcher ein definiertes
Fragment eines Antikörper
codiert, oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Die Fähigkeit
eines Fragmentkandidaten eines Antikörpers, Bindung an ein Antigen
zu zeigen, kann durch hier beschriebene Verfahren untersucht werden.
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Ein üblicher
Nothern-Blot-Test kann verwendet werden, um die relativen Mengen
von mRNA in einer Zelle oder einem Gewebe, welche/welches aus einer
Pflanze oder einem transgenen Gewebe gewonnen wurde, in Übereinstimmung
mit konventionellen Techniken der Nothern-Hybridisierung, welche dem
Durchschnittsfachmann bekannt sind, zu ermitteln. Alternativ kann
ein üblicher
Southern-Blot-Test verwendet werden, um die Anwesenheit und die
Kopienzahl eines Gens in transgenen Systemen in Übereinstimmung mit konventionellen
Techniken der Southern-Hybridisierung,
welche dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, zu bestätigen. Sowohl
der Nothern-Blot als auch der Southern-Blot verwenden eine Hybridisierungssonde,
zum Beispiel radioaktiv markierte cDNA oder ein Fragment dieser
DNA-Sequenz mit
einer Länge
von wenigstens 20 (bevorzugt wenigstens 30, stärker bevorzugt wenigstens 50
und am stärksten
bevorzugt wenigstens 100 aufeinanderfol genden Nucleotiden). Die
DNA-Hybridisierungssonde kann durch jegliches der vielen verschiedenen,
dem Fachmann bekannten Verfahren markiert werden.
-
Die
am häufigsten
für diese
Untersuchungen verwendeten Markierungen sind radioaktive Elemente,
Enzyme, Chemikalien, welche fluoreszieren, wenn sie ultraviolettem
Licht ausgesetzt werden, und andere. Eine Anzahl von fluoreszierenden
Materialien sind bekannt und können
als Markierungen verwendet werden. Diese schließen zum Beispiel Fluorescein,
Rhodamin, Auramin, Texas Red, AMCA-Blue und Lucifer-Yellow ein.
Ein besonderes Nachweismittel ist ein in Ziegen hergestellter und
mit Fluorescein über
ein Isothiocyanat konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper. Proteine
können
auch mit radioaktiven Elementen oder mit einem Enzym markiert werden.
Die radioaktive Markierung kann durch jegliches der zur Zeit verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen
werden. Das bevorzugte Isotop kann aus 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I und 186Re ausgewählt werden.
-
Enzymmarkierungen
sind gleichfalls nützlich und
können
durch jegliche der zur Zeit verwendeten colorimetrischen, spektrophotometrischen,
fluorospektrophotometrischen, amperometrischen oder gasometrischen
Techniken nachgewiesen werden. Das Enzym wird an das ausgewählte Partikel
durch Reaktion mit brücken-bildenden Molekülen wie
Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und ähnlichen konjugiert. Viele
Enzyme, welche in diesen Verfahren verwendet werden können, sind
bekannt und können
genutzt werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase,
Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase.
Auf die U.S. Pat. Nr. 3,654,090, 3,850,752, und 4,016,043 wird wegen
ihrer Offenbarung von alternativen Markierungsmaterialien und Verfahren
beispielhaft Bezug genommen.
-
Wie
hier verwendet, soll sich der Begriff immunmodulatorisch auf die
Fähigkeit
beziehen, die Immunität
gegen Krebs, infektiöse
Erreger, Autoimmunantigene, oder Allo-/Xenotransplantationen zu fördern oder
zu unterdrücken.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff Reifung, wenn er sich auf
Immunsystemzellen bezieht, auf die Expression spezifischer Oberflächenmarker,
die Produktion definierter löslicher
Faktoren oder die verbesserte Leistung in einer gemischten Lymphozytenreaktion,
wobei all dies als für
eine Zelle charakteristisch bekannt ist, welche in ihrer Fähigkeit,
eine Antwort von Effektorzellen, wie T-Zellen, auszulösen, effizienter
geworden ist.
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Wie
hier verwendet, soll sich der Begriff „CD40-Antigen" auf ein Mitglied
der TNF-Rezeptor(TNFR)-Familie beziehen. Es dient als Rezeptor für den CD40-Liganden (gp39).
Von diesem Molekül ist
bekannt, dass es auf B-Lymphozyten, Monozyten, dendritischen Zellen,
Endothel, epithelialen Zellen und Fibroblasten exprimiert wird.
Bemerkenswert ist, dass von diesem Molekül bekannt ist, dass es besonders
häufig
in Gebieten mit aktiviertem Endothel (wie chronischer Entzündung) und
auf den Gefäßen des Kaposisarkoms
vorkommt.
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Es
wird spezifisch erwogen, dass Arzneimittel unter Verwendung des
neuen, hier beschriebenen adenoviralen Vektors hergestellt werden
können.
In solch einem Fall umfasst das Arzneimittel den neuen, erfindungsgemäßen adenoviralen
Vektor und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Ein Durchschnittsfachmann
wäre leicht
fähig,
ohne unangebrachtes Experimentieren, die geeigneten Dosierungen
und Verabreichungswege dieses erfindungsgemäßen adenoviralen Vektors zu
bestimmen. Wenn in vivo zur Therapie verwendet, wird der erfindungsgemäße adenovirale
Vektor dem Patienten oder einem Tier in therapeutisch wirksamen
Mengen, das heißt, in
Mengen, welche die Tumorlast aufgrund eines immunmodulatorischen
Effektes eliminieren oder verringern, verabreicht. Er wird normalerweise
parenteral, bevorzugt intravenös,
verabreicht, es werden aber auch, wo angemessen, andere Verabreichungswege
verwendet. Die Dosis und das Dosierungsschema wird von der Natur
der Krankheit und ihrem Bestand, den Eigenschaften des bestimmten
Vektors, zum Beispiel seines therapeutischen Indexes, dem Patienten,
der Vorgeschichte des Patienten und anderen Faktoren abhängen. Die
verabreichte Menge des erfindungsgemäßen adenoviralen Vektors wird
typischerweise im Bereich von 0,001 bis etwa 500 mg/kg des Gewichts
des Patienten sein. Der Plan wird fortgesetzt, um die Wirksamkeit
zu optimieren, während
gegen die negativen Auswirkungen der Behandlung abgewogen wird.
Siehe Remington's Pharmaceutical
Science, 17. Ausgabe (1990) Mark Publishing Co., Easton, Penn.;
und Goodman und Gilman's:
The Pharmacological Basis of Therapeutics 8. Ausgabe (1960) Pergamon
Press.
-
Zur
parenteralen Verabreichung wird der adenovirale Vektor am typischsten
in Form einer injizierbaren Dosiseinheit (Lösung, Suspension, Emulsion)
assoziiert mit einem pharmazeutisch verträglichen parenteralen Träger formuliert
sein. Solche Träger
sind bevorzugt nicht-toxisch und nicht-therapeutisch. Beispiele
für solche
Träger
sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ringerlösung, Traubenzuckerlösung und
5%iges menschliches Serumalbumin. Nichtwässrige Träger wie fixierte Öle, und
Ethyloleat können
auch verwendet werden. Liposomen können als Träger verwendet werden. Der Träger kann
geringfügige
Mengen von Zusätzen
wie Substanzen, welche die Isotonizität und chemische Stabilität verbessern,
zum Beispiel Puffer und Konservierungsstoffe, enthalten. Der adenovirale
Vektor wird typischerweise in solchen Trägern mit Konzentrationen von
etwa 0,001 mg/ml bis 500 mg/ml formuliert sein.
-
Ein
Genabgabesystem zur Transduktion und Immunmodulation von Immunsystemzellen,
welche den CD40-Rezeptor aufweisen, umfassend:
- a)
ein Adenovirus; und
- b) eine CD40-Antigen-erkennende Komponente, wobei die Komponente
umfasst (1) einen ersten Antikörper
oder ein Antigen-bindendes Fragment von dem ersten Antikörper, der
an das Fiber-Knob-Protein auf dem Adenovirus bindet, und (2) einen
Anti-CD40-Antikörper
G28.5 oder ein Antigen-bindendes
Fragment des G28.5-Antikörpers,
der/das an CD40 auf der Oberfläche
von den Immunsystemzellen bindet, wobei der erste Antikörper oder
das Antigen-bindende Fragment davon an den Anti-CD40-Antikörper oder
das Antigen-bindende Fragment davon gebunden ist.
-
In
einem Aspekt können
der erste Antikörper und
der zweite Antikörper
genetisch miteinander verbunden sein. Weiterhin kann dieses System
auch ein therapeutisches Gen umfassen. Beispielhafte therapeutische
Gene schließen
ein ein Tumorantigen codierendes Gen, ein ein Antigen für einen
infektiösen Erreger
codierendes Gen, ein ein Autoimmun-Antigen codierendes Gen, ein
immunmodulatorisches Gen und ein ein cytotoxisches Mittel codierendes Gen
ein. Beispielhafte Immunsystemzellen, welche unter Verwendung dieses
Systems transduziert und immunmoduliert werden können, schließen dendritische
Zellen und B-Zellen ein. In einem Aspekt werde die B-Zellen dem
Kontakt mit diesem System folgend gereift.
-
Die
vorliegende Erfindung ist auch auf die Verwendung einer Zusammensetzung,
umfassend ein Adenovirus und eine CD40-Antigen-erkennende Komponente, bei
der Herstellung eines Arzneimittels zur genetischen Manipulation
von Immunsystemzellen in einem Individuum, das einer solchen Behandlung
bedarf, gerichtet, wobei die CD40-Antigen-erkennende Komponente
umfasst (1) einen ersten Antikörper
oder ein Antigen-bindendes Fragment des ersten Antikörpers, das/der
an das Fiber-Knob-Protein
auf dem Adenovirus bindet, und (2) einen Anti-CD40-Antikörper G28.5
oder ein Antigen-bindendes Fragment des G28.5-Antikörpers, der/das
an CD40 auf der Oberfläche
der Immunsystemzellen bindet, wobei der erste Antikörper oder
das Antigen-bindende Fragment davon an den Anti-CD40-Antikörper oder
das Antigen-bindende
Fragment davon gebunden ist. Diese Zusammensetzung kann nützlich sein,
wenn das Individuum eine Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Krebs, einer Infektionserkrankung, Allotransplantatabstoßung, Xenotransplantatabstoßung und
Autoimmunerkrankungen, hat. Beispielhafte Immunsystemzellen, welche
unter Verwendung dieses Systems transduziert und immunmoduliert
werden können, schließen dendritische
Zellen und B-Zellen ein. Gemäß einem
Aspekt erfolgt die Reifung der B-Zellen nach dem Kontakt mit diesem
System.
-
Die
Zusammensetzung kann weiterhin ein therapeutisches Gen umfassen.
-
Die
folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Darstellung verschiedener
Ausführungsformen der
Erfindung gegeben und sind nicht dazu gedacht, die vorliegende Erfindung
in irgendeiner Weise zu begrenzen.
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BEISPIEL 1
-
Züchtung von aus Monozyten gewonnenen
dendritischen Zellen (MoDC)
-
Mononucleäre Zellen
des peripheren Blutes (PBMC) wurden durch Dichtegradientenzentrifugation über Lymphoprep
(Nycomed AS, Oslo, Norwegen) aus heparinisiertem, peripheren Blut
isoliert und in mit 12,5% DMSO und 25% FKS ergänztem RPMI 1640-Medium, was
zuvor als das optimale Kryokonservierungsmedium für aus Monozyten
gewonnene dendritische Zellen und ihre Vorläufer beschrieben wurde (Makino
und Baba), kryokonserviert. Frische oder kryokonservierte PBMC wurden
mit einer Konzentration von 3 bis 5 Millionen Zellen pro ml in Iscoves
modifiziertem Dulbeccos Medium, welches 50 U/ml Penicillin-Streptomycin,
1,6 mM L-Glutamin, 0,01 mM β-Mercaptoethanol
(komplettes Medium) und 10% FKS enthielt, suspen diert und ihnen
wurde erlaubt, sich an den Boden von Plastikkulturflaschen (NUNC,
Intermed, Dänemark)
anzuheften. Nach 2 Stunden bei 37°C
wurden nicht anhaftende Zellen durch Spülen mit PBS entfernt. Die adhärenten Zellen
wurden für
weitere 6 Tage in komplettem Medium mit 10% FKS, ergänzt mit
1000 U/ml rIL-4 (CLB, Amsterdam, Niederlande) und 100 ng/ml GM-CSF, gezüchtet. Locker
adhärente
Zellen mit typischer Morphologie dendritischer Zellen wurden geerntet (adhärente Zellen
wurden durch Inkubation mit 0,5 mM EDTA in PBS abgelöst) und
für eine
FACS-Analyse oder
durch Adenovirus vermittelten Gentransfer verwendet.
-
BEISPIEL 2
-
Gemischte Lymphozytenreaktion
-
Für eine allogene
oder autologe gemischte Lymphozytenreaktion wurden aus Monozyten
gewonnene dendritische Zellen als Stimulatorzellen zu Rundbodenzellkulturplatten
mit 96 Vertiefungen (Nunclon Delta, Intermed, Dänemark) in abgestuften Dosen
hinzugefügt.
Nicht-adhärente
Lymphozytenfraktionen wurden als eine Quelle für Responderzellen verwendet.
Pro Vertiefung wurden 1 × 105 Lymphozyten den allogenen oder autologen
aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen in dem angegebenen
Responder/Stimulator-Verhältnissen
(R : S) hinzugefügt.
Die Zellen wurden über
3 Tage in komplettem Medium mit 10% gepooltem menschlichem Serum
(CLB, Amsterdam, Niederlande) gezüchtet. Während der letzten 18 Stunden
wurde [3H]-Thymidin hinzugefügt (0,4
mCi pro Vertiefung) (Amersham, Aylesbury, UK), wonach die Zellen
auf Glasfaserfilter geerntet wurden und der Einbau von [3H]-Thymidin unter Verwendung eines Flachbett-Flüssigscintillationszählers (Wallac,
Turku, Finnland) bestimmt wurde.
-
BEISPIEL 3
-
Phänotypische Untersuchungen
-
Eine
Zellfärbung
wurde unter Verwendung von direkt mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)
oder mit Phycoerythrin (PE) konjugierten monoclonalen Antikörpern (MoAbs)
durchgeführt.
Die verwendeten Antikörper
waren HB15 (CD83), BL6 (CD1a), BU15 (CD11c), MAB89 (CD40), (Immunotech,
Marseille, Frankreich), SK7 (CD3), 4G7 (CD19), B73.1 (CD16), MoP9
(CD14), NCAM 16.2 (CD56), L243 (HLA-DR), 2A3 (CD25) (Becton Dickinson,
San Jose, Kalifornien), 2331 (CD86), G46-2.6 (HLA A, B, C), HA58 (CD54),
and TU169 (HLA-DQ) (Pharmingen, San Diego, Kalifornien). Die Proben
wurden mit einem FACStar unter Verwendung der Cellquest FACS-Analysensoftware
(Becton Dickinson) untersucht.
-
Wenn
die Zellen vor der Analyse mit Adenovirus infiziert wurden, wurden
alle Werte für
Konjugat oder Virus, welche in Kleinstmaßstab-Luciferasetests verwendet
wurden, proportional für
die größere Zahl von
zu infizierenden Zellen erhöht.
Zellen wurden in Chargen von 1 Million Zellen unter Verwendung von AdCMVLuc
infiziert. Zellen wurden in einer ähnlichen Weise infiziert, wie
jener, welche für
die Analyse des Luciferasegentransfers verwendet wurde, mit der einzigen
Ausnahme, dass die Zellen nach dem Waschen und der Zugabe von komplettem
Medium über die
gesamte 24-stündige
Inkubation in den Mikrozentrifugenröhrchen belassen wurden. Nach
24 Stunden wurden die Zellen durch Durchflusszytometrie auf die Expression
von mit Reifung assoziierten Oberflächenmarkern analysiert.
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BEISPIEL 4
-
Viren und Zelllinien
-
AdCMVLuc,
ein für
E1 und E3 deletierter Vektor der ersten Generation, welcher Leuchtkäferluciferase
vom CMV-Immediate-Early-Promotor exprimiert, wurde von Robert Gerard
(Universität
von Leuven, Leuven, Belgien) erhalten. Viren wurden auf der permissiven
Linie 293 vermehrt und über
Plaquebildung titriert und durch doppelte Zentrifugation auf CsCl-Gradienten
aufgereinigt. Alle Virusaliquots wurden bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
Der monoclonale Antikörper
RmcB aus der Maus gegen den menschlichen Coxsackie/Adenovirusrezeptor
(von Dr. Robert Finberg, Dana Farber Cancer Institute) wurde zuvor
beschrieben. Die monoclonalen Antikörper aus der Maus LM609 gegen
avb3 und P1F6 gegen avb5-Integrin wurden jeweils von Chemicon (Temecula,
CA) und Gibco BRL (Gaithersburg, MD) erworben. Der neutralisierende
monoclonale Antikörper
1D6.14 aus der Maus, spezifisch für die carboxyterminale, rezeptorbindende
Domäne
des Adenovirus Serotyps 5, wurde beschrieben. Die Hybridome G28.5,
welches monoclonale Anti-CD40 Antikörper herstellt (ATCC#: 9110-HB),
und TS2/16.2.1 (ATCC#: 243-HB; „TS-2"), welches monoc lonale Antikörper gegen
das β1-Integrin
herstellt, wurden von ATCC erworben. Beide Hybridome wurden verwendet,
um Ascites in SCID-Mäusen
herzustellen.
-
Antikörper wurden
auf einem FPLC-Chromatographiesystem unter Verwendung einer HiTrap Protein
A-Säule
(Pharmacia) und des MAPS-Bindungspuftersystems
(Bio-Rad) aufgereinigt. Der Monoclonale 1D6.14 wurde unter Verwendung
immobilisierten Papains (Pierce) zu einem Fab-Fragment gespalten
und Fragmente wurden durch negative Selektion von Fc-Fragmenten
unter Verwendung von HiTrap Protein A-Säulen aufgereinigt.
-
BEISPIEL 5
-
Antikörper und Konjugate
-
Sowohl
1D6.14-Fab als auch die monoclonalen Antikörper G28.5 und TS2 wurden in
Boratpuffer auf 10 mg/ml konzentriert. Die chemische Konjugation
des Fab zu dem mAb in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 wurde wie beschrieben
[Segal, D. M. und B. J. E. G. Bast. Production of bispecific antibodies.
Herausgeber: Coligan J. E., A. M. Kruisbeek, D. A. Marguiles, E.
M. Shevach, W. Strober. Current Protocols in Immunology. John Wiley
and Sons, New York. Band 1 (1994). Abschnitte 2.13.1–2.13.16]
durchgeführt.
Das Konjugat wurde auf einer HR 10/30 Superose 12-Säule unter
Verwendung von FPLC (Pharmacia, Piscataway, NJ) in Boratpuffer pH
8,5 aufgereinigt, wobei die Fraktionen, welche einem 1 : 1-Verhältnis des
Anti-Rezeptor-Antikörpers zu
dem Fab bei einem ungefähren
Molekulargewicht von 200 kDa entsprachen, vereinigt wurden.
-
BEISPIEL 6
-
Protokoll für die Ad-Infektion
und die Luciferaseanalyse
-
Nicht-adhärente aus
Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden gesammelt und mit
der durch 0,5 mM EDTA freigesetzten Fraktion adhärenter Zellen gemischt, gefolgt
von Waschen mit 2,5% FKS enthaltendem kompletten RPMI. Vierundzwanzigtausend
Zellen wurden in Triplikaten für
jede Testbedingung in einem Volumen von 50 μl auf einzelne Mikrozentrifugenröhrchen verteilt.
Die Verwendung von Mikrozentrifugenröhrchen ermöglichte eine vereinfachte Infektion
und ein vereinfachtes Waschen von Zellen, welche sowohl die adhärenten als
auch die nicht-adhärenten Fraktionen
darstellten. Konjugat und Virus wurden über 30 Minuten bei Raumtemperatur
in einem minimalen Volumen von weniger als 10 μl für die Menge von Virus jeder
Testbedingung inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Mischung
so verdünnt,
dass 100 μl
verwendet wurden, um die Zellen eines jeden Mikrozentrifugenröhrchens
zu infizieren. Die Menge von Virus in diesem Volumen entsprach einer
Multiplizität
der Infektion von 100. Mikrozentrifugenröhrchen, welche die Infektionsmischung enthielten,
wurden für
1 Stunde bei 37°C
gehalten. Nachfolgend wurden die Zellen, um ungebundenen Virus zu
entfernen, in den Röhrchen
mit PBS gewaschen, zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Sedimentierte
Zellen wurden in 1 ml RPMI 10% FKS resuspendiert und für eine Inkubation über Nacht
in einzelne Vertiefungen einer mit Polylysin beschichteten Platte
mit 24 Vertiefungen gebracht. Die Verwendung von mit Polylysin beschichteten
Vertiefungen erlaubte die einfachere Verarbeitung in nachfolgenden
Luciferasetests durch Verankerung sowohl von anhaftenden als auch
von Suspensionsfraktionen an die Vertiefungsoberfläche. Nach
24 Stunden Inkubation nach der Infektion wurde der Überstand
von allen Vertiefungen abgesaugt und die Zellen wurden unter Verwendung
des Promega-Luciferase-Assay-Kits verarbeitet.
Kurz gesagt wurden die Zellen direkt auf der Platte lysiert und
einem Einfrier-Auftau-Zyklus unterzogen. Die Lysate wurden durch
Vermischung mit Luciferasesubstrat und unmittelbarer Auswertung auf
einem Lumat Luminometer analysiert.
-
Für Blockierungsexperimente
wurden die Zellen vor der Infektion mit dem (unkonjugierten) Ausgangsmonoclonalen
G28.5 blockiert. Aufgrund der schnellen Internalisierungskinetiken,
welche zuvor für
diesen Monoclonalen berichtet wurden, wurden alle Blockierungen
bei 4°C
durchgeführt,
um die Modulation des Rezeptors von der Zelloberfläche zu minimieren.
Nach 30 Minuten Inkubation der Zellen mit dem Blockierungsmittel
wurde den Zellen direkt mit der optimalen Menge von Fab-G28.5 komplexierter
Virus hinzugefügt
und vor dem Waschen und Überführen auf
die Platte mit 24 Vertiefungen bei 37°C für eine Dauer von 30 min weiter
inkubiert. Für die
Blockierung mit Fab wurde Virus vorab mit einem Überschuss von vorher bestimmter
neutralisierender Konzentration von 1D6.14 Fab inkubiert. In dieser Hinsicht
wurde Fab nur als Ersatz anstatt des Konjugates für die angegebenen
Bedingungen eingesetzt.
-
BEISPIEL 7
-
Ermittlung
der optimalen Menge von Konjugat zur neuen Zielausrichtung
-
Um
die Menge des für
die optimale Beschichtung eines Adenovirus benötigten Konjugates zur neuen
Zielausrichtung zu bestimmen, wurde das Konjugat auf eine vorab
bestimmte Zahl viraler Partikel mit einer MOI von 100 titriert,
wobei der Gentransfer in Form der Luciferaseexpression als relative Lichteinheiten,
RLU, in aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen gemessen wurde.
Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden mit AdCMVLuc
infiziert, welches vorab mit ansteigenden Konzentrationen von Fab-G28.5
inkubiert worden war. Weitere Zunahmen im Konjugat : Virus-Verhältnis erwiesen
sich, vermutlich verursacht durch die Konkurrenz um die Bindung
an CD40 durch einen Überschuss
von Fab-G28.5-Konjugat,
als den Umfang des neu zielausgerichteten Gentransfers reduzierend.
Diese Titration testete nach einer Inkubation mit 2,4 × 106 Virionen gegebene Massen von Konjugat,
die im Bereich von 0,01 ng bis 2000 ng/Vertiefung mit Abständen über jeden
halben Log10 der Masse lagen. Die Masse
des Konjugates, welche den höchsten
Niveaus der Luciferasegenexpression entsprach, wurde als eine „optimale
Dosis" bezeichnet und
wurde in allen nachfolgenden Experimenten verwendet.
-
BEISPIEL 8
-
GFP-Reportergen zur Demonstration
des quantitativen Gentransfers
-
Um
sicherzustellen, dass der mit Luciferase beobachtete Gentransfer
mit einer tatsächlich
gesteigerten Zahl an transduzierten Zellen korrelierte, wurden Zellen
auch mit einem das Gen für
GFP tragenden Adenovirus infiziert. Für Zellen die einer auf Durchflusszytometrie
basierenden Markeranalyse unterzogen wurden, wurden aus Monozyten
gewonnene dendritische Zellen reihenweise unter Verwendung von mit
dem optimalen Verhältnis
von Fab-G28.5-Konjugat komplexiertem AdGFP infiziert. 24 Stunden
nach der Infektion wurden positive Zellen unter Verwendung der Durchflusszytometrie
sichtbar gemacht.
-
BEISPIEL 9
-
Analyse der unterschiedlichen
MOI zwischen auf CD40 zielgerichtetem und nicht-zielgerichtetem Ad
-
Zellen
wurden reihenweise mit verschiedenen MOIs von auf CD40 zielgerichtetem
und nicht-zielgerichtetem Virus infiziert. Fab-G28.5 wurde mit AdCMVLuc
in einer 1000 MOI entsprechenden Konzentration komplexiert. Nachfolgend
wurde diese Mischung in Serie auf MOIs von 500, 100, 50, 10 und 1
verdünnt.
Gleichzeitig wurden Proben von Adenovirus ohne Konjugat zur neuen
Zielausrichtung mit den gleichen MOIs zum Vergleich mit den zielgerichteten
Proben hergestellt. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen
wurden dann infiziert und auf Luciferase analysiert, wie dies in
den Experimenten zum Luciferasegentransfer getan wurde.
-
BEISPIEL 10
-
Validierung
von aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen
-
Aus
Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden durch die Behandlung
von aus peripherem Blut isolierten Monozyten mit IL-4 und GM-CSF
erzeugt. Die Identität
dieser Zellen wurde auf zwei Arten validiert. Die Reinheit wurde
durch Durchflusszytometrie auf das Fehlen der Expression von CD14,
CD3 und CD19 gezeigt. Weiter zeigten die Zellen einen Phänotyp dendritischer
Zellen mit einigen Schleierzellen und einer Mischung aus adhärenten und
nicht-adhärenten
Fraktionen, welche in vielzelligen Verbänden assoziiert waren. Diese
aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen waren negativ für die Expression
von Reifungsmarkern dendritischer Zellen, wie CD83 und waren somit
unreif.
-
BEISPIEL 11
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Die beobachtete Verbesserung
im Gentransfer ist spezifisch für
CD40
-
Um
die Menge des für
die optimale Beschichtung eines Adenovirus benötigten Konjugates zur neuen
Zielausrichtung zu bestimmen, wurde das Konjugat auf eine vorab
bestimmte Zahl viraler Partikel mit einer MOI von 100 titriert,
wobei der Gen transfer in Form der Luciferaseexpression in aus Monozyten
gewonnenen dendritischen Zellen gemessen wurde. Aus Monozyten gewonnene
dendritische Zellen wurden mit AdCMVLuc infiziert, welches vorab mit
ansteigenden Konzentrationen von Fab-G28.5 inkubiert worden war.
Auf CD40 zielgerichteter Gentransfer erreichte ein Maximum mit einem Fab-G28.5-Konjugat-Virus-Verhältnis von
30 ng Fab-G28.5 pro 2,4 × 106 pfu (1,75 × 108 Partikel/ml, wie
durch OD260 bestimmt). Weitere Zunahmen
im Konjugat : Virus-Verhältnis
erwiesen sich, vermutlich verursacht durch die Konkurrenz um die
Bindung an CD40 durch einen Überschuss
von Fab-G28.5-Konjugat, als den Umfang des neu zielgerichteten Gentransfers
reduzierend. Beim optimalen Verhältnis
von Konjugat zu Virus zeigte auf CD40 zielgerichteter Adenovirus
eine Verstärkung
des Gentransfers in aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen von
zwei log10, wie dies durch Expression des
Luciferasereportergens bestimmt wurde. Diese optimale Dosis wurde
in verschiedenen Weisen auf ihre Spezifität für CD40 analysiert.
-
Um
den Anti-CD40 Antikörper
als grundlegend mit den beobachteten Verbesserungen im Gentransfer
in Zusammenhang zu bringen, wurden Zellen vorab mit dem Anti-CD40-Ausgangsantikörper G28.5
inkubiert. Wenn die Zellen in dieser Art blockiert wurden, wurde
eine erwartete Verringerung im neu zielausgerichteten Gentransfer
von 95% beobachtet. Um die Möglichkeit,
dass der G28.5 mAb selbst einen verbesserten Gentransfer durch Adenovirus,
unabhängig
von seiner Verbindung mit dem Virion, vermittelte, auszuschließen, wurden
Zellen vor der Infektion mit dem nicht-zielgerichteten Adenovirus
vorab mit unkonjugiertem G28.5-mAb inkubiert, wobei die Vorbehandlung
von Zellen mit dem G28.5-Monoclonalen vernachlässigbare Verbesserungen im
Gentransfer ergab.
-
Um
die Möglichkeit
auszuschließen,
dass das bispezifische Konjugat nichtspezifische Zellbindung vermittelte
(oder spezifischer, durch Wechselwirkung von bispezifischem Antikörper mit
Fc-Rezeptoren auf dendritischen Zellen), wurde ein irrrelevantes
Konjugat mit Affinität
für den
auf dendritischen Zellen abwesenden Marker (EGFR) getestet. Das
irrelevante Konjugat versagte bei der Vermittlung von Verbesserungen
im Gentransfer, was weiter die Spezifität der beobachteten neuen Zielausrichtung
auf CD40 zeigt. Als stringenter Test der Spezifität des Vektors
wurden die vorstehenden Bedingungen auf der für CD40 negativen Gliomzelllinie
D65 getes tet. Das Versagen des durch Fab-G28.5 zielgerichteten Adenovirus,
die Genexpression in D65 zu verbessern, zeigt weiter die Spezifität dieses
Vektors für CD40.
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BEISPIEL 12
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Verbesserungen
im Gentransfer sind durch quantitativ erhöhte Zahlen transduzierter Zellen
begründet
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Während der
Luciferasegentransfer eine allgemeine Steigerung der Genexpression
durch auf CD40 zielgerichtetes Adenovirus gezeigt hatte, konnte
die Art dieses Tests anzeigen, ob tatsächlich eine erhöhte Zahl
von Zellen transduziert worden war. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass
wenige transduzierte Zellen als Ergebnis der neuen Zielausrichtung
bloß eine
mehr überschießende Genexpression zeigten,
wurde ein einen quantitativen Marker, Green-Fluorescent-Protein,
GFP, enthaltendes Adenovirus verwendet. Die Zahl der transduzierten
Zellen wurde durch die Verwendung der Durchflusszytometrie überwacht.
Es wurde festgestellt, dass verglichen mit mit nicht-zielgerichtetem
Adenovirus infizierten Zellen auf CD40 zielgerichtetes Adenovirus quantitativ
mehr Zellen transduzierte. Vergleichbare Niveaus von Gentransfer
wurden mit zwei anderen Verfahren beobachtet, auf b1-Integrin zielgerichtetes Adenovirus
und mit Liposomen komplexiertes Adenovirus. Dieser verbesserte Gentransfer
war wiederum abwesend, wenn ein irrelevantes Konjugat mit EGFR verwendet
wurde.
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BEISPIEL 13
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Fab-G28.5 verbessert den
durch Adenovirus vermittelten Gentransfer in verschiedenen Spendern
und eine solche neue Zielausrichtung kann die Virusdosis verringern,
welche benötigt
wird, um ein gegebenes Niveau der Transgenexpression zu erreichen
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Um
die Wirksamkeit dieser Strategie zur neuen Zielausrichtung gleichzeitig
in verschiedenen Spendern zu vergleichen, wurde auf CD40 zielgerichtetes
Adenovirus mit nicht zielgerichtetem Adenovirus bei mehreren MOIs
auf aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen verglichen. Diese
Ergebnisse zeigen auch, dass bei einer gegebenen MOI, neu zielgerichtetes
Adenovirus einen Umfang von Gentransfer liefert, welcher bei nicht
zielgerichtetem Adenovirus nur bei einer 100-fach höheren MOI
beobachtet wird. Diese Ergebnisse heben einen signifikanten Vorteil
von neu zielgerichtetem Adenovirus hervor, insofern als bei einem
gegebenen Niveau des Gentransfers signifikant weniger infektiöse Virionen pro
Zelle benötigt
werden, wenn ein auf CD40 neu zielgerichtetes Adenovirus verwendet
wird. Da höhere
Virusdosen mit einer größeren durch
Virus vermittelten direkten Zytotoxizität, genauso wie mit einer stärkeren Anti-Adenovirus
Immunantwort, verbunden sind, hat die Möglichkeit, die verabreichte
Virusdosis zu verringern, wichtige Auswirkungen auf die Verringerung
der mit der Verwendung von adenoviralen Vektoren assoziierten Toxizitäten.
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BEISPIEL 14
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Durch auf CD40 zielgerichtetes
Ad transduzierte MDCC zeigen phänotypische
und funktionelle Eigenschaften von reifen dendritischen Zellen
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Nachdem
die verbesserte Effizienz des Gentransfers gezeigt wurde, wurde
die Auswirkung von Virus auf dendritische Zellen, bezogen auf ihre
phänotypischen
und funktionellen Fähigkeiten
untersucht. Um die Wirkungen von neu zielgerichteten adenoviralen
Vektoren oder den Konjugaten zur neuen Zielausrichtung alleine auf
die Reifung von dendritischen Zellen zu bestimmen, wurden mehrere
Marker unter Verwendung der Durchflusszytometrie analysiert. 24
Stunden zuvor behandelte Zellen wurden auf die Expression von CD86,
CD83, CD80, ICAM-1, MHC II (HLA-DR, HLA-DQ) und MHC I analysiert. Während keine
Veränderungen
im Phänotyp
der dendritischen Zellen beobachtet wurden, wenn Adenovirus alleine
verwendet wurde, wurden bei allen drei hocheffizienten adenoviralen
Genabgabesystemen eindeutige Veränderungen,
einschließlich
der verstärkten
Expression von CD86, HLA-DR und HLA-DQ beobachtet. Durch die Behandlung
mit entweder Fab-Anti-CD40-Konjugat oder mit auf CD40 zielgerichtetem
Adenovirus verliehene, einzigartige Eigenschaften schlossen jene
Veränderungen,
nämlich
gesteigerte Expression von CD83 und I-CAM-1, ein, die am engsten mit der Reifung
von dendritischen Zellen verbunden sind.
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Ein
strengeres Kriterium für
die Reifung von dendritischen Zellen ist die gemischte Lymphozytenreaktion.
Unter Verwendung mehrerer Vektoren oder Konjugate behandelte MDDC
wurden mit Responderzellen von einem allogenen Spender kombiniert und
auf ihre Fähigkeit
getestet, eine Vermehrung von Responderzellen auszulösen. Während Adenovirus alleine
keine Verstärkung
in der MLR vermittelte, waren jegliche Behandlungen in der Anwesenheit
oder Abwesenheit von Adenovirus fähig, die Reaktivität der MDDC
in der Allo-MLR dramatisch zu fördern (6).
Zudem war die Wirkung von Konjugat alleine vergleichbar zu der,
welche mit dem Konjugat mit Virus beobachtet wurde, während die
Wirkung von unkonjugiertem mAb signifikant geringer war als jene, welche
mit dem Fab-Anti-CD40-Konjugat in der Anwesenheit von Adenovirus
beobachtet wurde. Eine mögliche
Erklärung
für die
mit der Zielausrichtung auf CD40 beobachtete Reifungswirkungen könnte eine durch
Virus vermittelte Wirkung durch den hocheffizienten Eintritt von
adenoviralen Partikeln in dendritische Zellen sein. Aus diesem Grund
wurden dendritische Zellen, welche mit den alternativen hocheffizienten
adenoviralen Vektoren auf β1-Integrin
zielgerichtetes Adenovirus oder mit Liposomen komplexiertes Adenovirus
infiziert wurden, ebenfalls in einer MLR getestet. Das Versagen
dieser alternativen Vektoren, bedeutsame Verbesserungen zu vermitteln legt
nahe, dass das Reifungsphänomen
mit CD40 assoziiert ist.
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Als
weiterer Beleg für
funktionelle Reifung wurden Überstände von
MDCC nach 48 Stunden auf die Produktion von IL-12, einem Zytokin,
bei welchem die Expression charakteristisch für die Reifung von dendritischen
Zellen ist (Cella M et al., Ligation of CD40 on dendritic cells
riggers production of high levels of IL-12 and enhances T-cell stimulatory
capacity: T-T help via APC activation. J. of Exp. Med. 184 (1996),
747–52)
getestet (5). Die Ergebnisse zeigen
auf, dass Spiegel von IL-12
in Überständen von
Zellen dramatisch mehrfach erhöht
waren, welche mit unkonjugiertem G28.5-mAb behandelt wurden, und
dies sogar stärker
mit neu zielausrichtendem Fab-Anti-CD40-Kojugat alleine oder mit
auf CD40 neu zielgerichtetem Adenovirus.
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Trotz
enormem klinischen Potential wurde die verbreitete Anwendung genetisch
veränderter dendritischer
Zellen durch mehrere Hindernisse aufgehalten. Unter diese fallen
die aufwändige
Handhabung, welche für
die Transduktion ex vivo benötigt wird,
die schlechte Effizienz des Gentransfers durch bestehende Vektoren
und die Notwendigkeit, dendritische Zellen in der Folge des Gentransfers
zu einem immunologischen wirksamen Zustand zu reifen [Bancheareau
J. und R. M Steinman, Dendritic cells and the control of immunity.
Nature 392 (1998), 245]. Im Prozess der Antigenaufnahme aktive periphere
dendritische Zellen werden als „unreife dendritische Zellen" bezeichnet. Trotz
aktiver Antigenaufnahme exprimieren diese Zellen nicht das geeignete
Arsenal kostimulatorischer Moleküle
und Zytokine, welche notwendig sind, um Eftektorzellen wie zytotoxische T-Lymphozyten
(CTLs) zu aktivieren. Als solche müssen unreife dendritische Zellen
durch die Aktivierung von CD40 in einen immunologisch wirksamen „reifen" Zustand differenziert
werden (Bennett S. R. M. et al., Help for cytotoxic-T-cell responses
is mediated by CD40 signaling. Nature 393 (1998), 478–480; Ridge J.
P. et al., A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge
between a CD4+ T-helper and a T-killer cell. Nature 393 (1998),
474–7;
Schoenberger S. P. et al., Nature 393 (1998), 478–80; Ridge
J. P. et al., T-cell help for cytotoxic T-lymphocytes is mediated
by cd40-cd40L interactions. 393 (1998), 480–3). Aus diesem Grund wurden
die Wirkungen untersucht, welche die auf CD40 zielgerichteten Vektoren
auf den Reifungszustand dendritischer Zellen haben.
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Die
Fähigkeit
der Anti-CD40-Konjugate, und in einem geringeren Ausmaß des monomeren
Antikörpers,
die Reifung dendritischer Zellen in der Abwesenheit von Virus zu
vermitteln, zeigt klar, dass das Reifungsphänomen vom Adenovirus unabhängig ist.
Weiterhin scheint es, basierend auf der Expression von CD83 und
ICAM-1, Produktion
von IL-12 und der verbesserten MLR, welche fast ausschließlich bei der
Behandlung von MDDC mit CD40 mAb, Fab-Anti-CD40-Konjugat und auf
CD40 zielgerichtetem Adenovirus, aber nicht mit anderen getesteten
adenoviralen Vektoren beobachtet wurde, ziemlich sicher, dass dieses
Reifungsphänomen
ein direktes und spezifisches Ergebnis der Zielausrichtung auf CD40 ist.
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Die
vorliegende Erfindung zeigt, dass die neue Zielausrichtung der adenoviralen
Genabgabe auf CD40 dramatische Steigerungen im Umfang des Gentransfers
und Reifungseffekte, welche spezifisch für CD40 sind, vermittelt. Daraus
folgt, dass trotz der vergleichbaren Verbesserungen ex vivo durch
durch auf Konjugat zielgerichtetes Adenovirus und mit Liposomen
komplexiertes Adenovirus, die stärker
zellspezifische Zielausrichtung und das Reifungspotential von auf
CD40 zielausgerichtetem Adenovirus sich theoretisch zuverlässiger für in vivo
Ansätze
eignen würde.
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Im
scharfen Kontrast zu vorherigen Untersuchungen, welche eine gesteigerte
Expression von CD40 bei der Reifung von dendritischen Zellen dokumentiert
haben, zeigte die FACS-Analyse in allen Fällen, bei Verwendung eines
CD40 mAb oder auf CD40 basierender Konjugate, eine Verminderung
in der Oberflächenexpression
von CD40 nach 24 Stunden. Da das Konjugat 48 Stunden nach der Behandlung auf
der Zelloberfläche
nachgewiesen wurde, ist es möglich,
dass das zurückgehaltene
Konjugat den nachfolgenden Nachweis von CD40 gestört haben könnte.
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Die
vorliegende Erfindung zeigt, dass das Fab-Anti-CD40-Konjugat dramatischere
MLR-Reaktivität
in MDDCs vermittelt, als dies mit unkonjugiertem Anti-CD40 mAb gesehen
wird. Vorhergehende Berichte implizieren die Vernetzung von CD40
als Mittel, um den CD40-Reaktionsweg zu aktivieren, und hier werden
zwei Wege vorgeschlagen, durch welche das vorliegende System die
Vernetzungskinetiken dieses Antikörpers geändert hat. Als erstes eignet
sich die innewohnende Trimereigenschaft des Fiber-Knob zur Bindung
von bis zu drei Konjugatmolekülen
an den zwölf
Capsidspitzen. Das zweite ist die halbzufällige Natur des chemischen
Vernetzungsverfahrens, welches Heterodimere mit Verhältnissen abseits
eines einfachen 1 : 1 Fab zu Anti-CD40 mAb ergeben kann.
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Zusammenfassend
scheint es, dass das Adenovirus geringe Wirkungen auf den Phänotyp dendritischer
Zellen vermittelt, diese Wirkungen aber nur gesehen werden, wenn
eine ausreichende Zahl von Partikeln in jede Zelle eintreten, so
wie bei den hocheffizienten durch Antikörper zielgerichteten oder mit
Liposomen komplexierten auf Adenovirus basierenden Gentransfervektoren.
Es ist interessant darüber
zu spekulieren, ob die verstärkte
Expression kostimulatorischer Moleküle, welche mit dem auf β1-Integrin
zielgerichteten oder mit Liposomen komplexierten Adenovirus beobachtet
werden, eine Folge des in die Zelle eintretenden Capsids selbst,
der Expression des Transgens oder der Hintergrundexpression adenoviraler
Gene ist. Die doppelte Rolle von CD40 in diesem Szenario als sowohl
ein Ersatzrezeptor für
das Adenovirus und auch als ein starker Auslöser der Reifung dendritischer
Zellen wird als Strategie für
die neue Zielausrichtung auf diesen zentralen Zelltyp des Immunsystems
nützlich
sein.
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Ein
Vorteil eines auf CD40 neu zielgerichteten adenoviralen Vektors
ist, dass durch Abgabe eines Antigen-codierenden Gens ein größerer Pool von
dendritischen Zellen erzeugt werden kann, welcher das Potential
hat, Effektorzellen gegen ein interessierendes Antigen zu primen,
besonders wichtig im Fall kryptischer Antigene, welche ansonsten
für das
Immunsystem unzugänglich
sein könnten.
Gründend
auf der wichtigen Rolle von CD40 in der Aktivierung von dendritischen
Zellen durch T-Helfer, könnte ein
solches System auch Anwendungen durch Umgehung der Notwendigkeit
für die
Hilfe von CD4+ T-Zellen bei der Aktivierung von CTL haben. Während die
Nützlichkeit
von auf bispezifischen Antikörpern
basierender Zielausrichtung von Adenovirus für klinische Zwecke zuvor vorgeschlagen
wurde, wurden die Einschränkungen
dieser auf Antikörpern
basierenden Strategie für
intensive klinische Anwendungen erkannt. Aus diesem Grund ist eine
Strategie der genetischen Fusion zwischen der trimeren Fiber des
Adenovirus und dem natürlichen
Liganden von CD40, trimerem CD40L, nützlich.
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BEISPIEL 15
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Transduktion von B-Zellen
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Es
wurde schon vor einiger Zeit erkannt, dass Lymphozyten eine schwierige
Zellart sind, in welche Gene abgegeben werden können. Von mehreren Arten von
hämatopoetischen
Zellen wurde das Versagen der Vermittlung einer Bindung und/oder
Internalisierung von adenoviralen Partikeln dokumentiert (Silver
L. und C. W. Anderson, Nonpermissivity of human peripheral blood
lymphocytes to adenovirus type 2 infection. J. of Virology 62 (1988),
341–5; Mentel
R. et al., Adenovirusreceptor interaction with human lymphocytes.
J. of Med. Virology 51 (1997), 252– 7; Wattel E. et al., Differential
efficacy of adenoviral mediated gene transfer into cells from hematological
cell lines and fresh hematological maligancies. Leukemia 10 (1996),
171–4).
Ein Versagen von primären
B-Zellen, sowohl den primären
adenoviralen Rezeptor CAR als auch die sekundären Rezeptoren, die av-Integrine,
zu exprimieren wurde erkannt (7A und 7B).
Dies würde
das Versagen des Adenovirus erklären,
diese Zellen effizient zu infizieren.
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Um
diese Unzulänglichkeit
zu überwinden, wurden
die Konjugate Fab-Anti-CD40
und Fab-Anti-β-1-Integrine,
welche jeweils gegen die B-Zell-Marker CD40 und β-1-Integrine gerichtet sind,
verwendet. Von beiden Konjugaten wurde erwartet, dass sie die Bindung
wiederherstellen, um die Abwesenheit von CAR zu ersetzen und ein
alternatives Verfahren für
die Internalisierung von Virionen in diese Zellen bereitzustellen.
Aufgrund der zuvor beschriebenen internalisierenden Funktion dieser
Rezeptoren, wurde von diesen Konjugaten auch erwartet, die internalisierende
Funktion der av-Integrine wiederherzustellen. Durch Verwendung einer
dieser Strategien zur neu en Zielausrichtung wurde der Gentransfer
in primäre
B-Zellen um wenigstens das 10-fache
gegenüber
dem nicht zielgerichteten Adenovirus verbessert (8).
Diese Ergebnisse sind besonders interessant, weil es scheint, dass
die Zielausrichtung von Adenovirus auf CD40 oder die β-1-Integrine
gleichzeitig die Unzulänglichkeit
sowohl des primären
Bindungsrezeptors als auch des sekundären internalisierenden Rezeptors überwunden
hat.