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Diese
Erfindung betrifft biokompatible Materialien und vorzugsweise blutkompatible
Materialien. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung von biokompatiblen, vorzugsweise blutkompatiblen, Materialien,
bei denen die Oberfläche
eines Biomaterials mit dem Reaktionsprodukt eines aminofunktionellen
Polysiloxans und eines Biomoleküls
beschichtet ist.
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Die
Entwicklung von Gefäßprothesen
und medizinischen Geräten,
die im Kontakt mit Körperflüssigkeiten
stehen, insbesondere mit Blut, ist ein sich schnell entwickelndes
Gebiet der Medizin. Dies ist bislang jedoch durch einen Mangel an
geeigneten synthetischen Materialien, die beim Kontakt mit solchen
Flüssigkeiten
stabil sind, behindert worden.
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Schädliche Reaktionen
zwischen den Materialien und Blutkomponenten sind die vorherrschenden
Faktoren, die die Verwendung synthetischer Materialien begrenzen,
die in Kontakt mit Körperflüssigkeiten
kommen. Zum Beispiel tendieren Katheter, Gefäßprothesen und dergleichen
dazu, als Nest oder Fokus für
die Bildung von Thromben (Blutgerinnseln) zu dienen. Der erste Kontakt
solcher Materialien mit dem Blut führt zur Ablagerung von Plasmaproteinen wie
z. B. Albumin, Fibrinogen, Immunglobulin, Gerinnungsfaktoren und
Komplementbestandteilen. Die Adsorption von Fibrinogen auf die Oberfläche des Materials
verursacht Thrombozytenadhäsion,
-aktivierung und -aggregation. Auch andere Zelladhäsionsproteine
wie z. B. Fibronektin, Vitronektin und der von-Willebrand-Faktor
(vWF), fördern
die Thrombozytenadhäsion.
Als Ergebnis hiervon ist die fortgesetzte Verwendung von Antikoagulantien
im Zusammenhang mit dem Einbringen solcher Materialien in den Körper oftmals
notwendig.
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Weiterhin
tritt Komplementaktivierung ein, wenn Materialien in das Blut eingebracht
werden. Die Adsorption großer
Mengen von IgG, IgM und C3b auf Oberflächen verursacht die Aktivierung.
Anschließend
können
Komplexe gebildet werden, die zu einer unerwünschten Immunantwort beitragen,
wie z. B. Proteolyse, Zelllyse, Opsonisierung, Anaphylaxis und Chemotaxis.
Als Ergebnis hiervon machen diese Reaktionen solche Materialien
mit dem lebenden Körper
inkompatibel.
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Es
wurde eine Reihe von Ansätzen
vorgeschlagen, um die Biokompatibilität und sogar die Blutkompatibilität medizinischer
Geräte
zu verbessern. Ein Ansatz besteht darin, die Oberfläche des Materials
zu modifizieren, um eine unerwünschte Proteinadhäsion zu
verhindern, indem man das Material mit einer Oberfläche mit
niedriger Polarität,
mit einer Oberfläche
mit negativer Ladung, oder mit einer mit biologischen Materialien
wie z. B. Enzymen, Endothelzellen und Proteinen beschichteten Oberfläche versieht.
Ein anderer Ansatz war, Antikoagulantien an die Oberfläche biologisch
inerter Materialien zu binden, um den Materialien antithrombogene
Eigenschaften zu vermitteln. US-A-5 053 048 beschreibt z. B. die
Bildung einer thromboresistenten Beschichtung, umfassend eine in
hohem Maße
quervernetzte dreidimensionale Matrix mit Ami nogruppen, die eine Verknüpfung mit
einem antithrombogenen Mittel erlauben, auf einem medizinischen
Gerät.
Ein weiterer im Stand der Technik verwendeter Ansatz ist die Copolymerisation
verschiedener Phospholipide, die als Beschichtungsmaterialien für unterschiedliche
Substrate verwendet werden. Auch Beschichtungen mit partiellen Polymerrückgraten
wurden auf ähnliche Weise
verwendet. Jedoch können
viele dieser Verfahren zu einem Auslaugen oder „Abbeizen" der Beschichtung führen.
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Einige
Ansätze
erfordern die Aminierung der Substratoberfläche. Zum Beispiel lehrt US-A-5
342 693 (Winters et al.), dass eine Siloxanoberfläche zuerst
funktionalisiert (z. B. mit Amingruppen) werden muss, um Biomoleküle daran
zu befestigen. Weiterhin hat man quaternäre Amine an Polymeroberflächen gebunden
und dann Heparin daran gebunden. Umgekehrt wurde Heparin mit einem
quaternären Amin
komplexiert, bevor der Komplex als Beschichtung auf eine polymere
Oberfläche
aufgetragen wurde. Beide dieser Verfahren haben den Nachteil, dass die
Systeme nicht-permanent sind oder ausgewaschen werden können, d.
h., dass das Heparin allmählich
von dem Polymermaterial in das umgebende Medium verloren geht. Weiterhin
haben beschichtete Systeme infolge der Instabilität des Antikoagulans eine
allgemein begrenzte Lebensdauer.
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Somit
besteht ein Bedürfnis
nach einem blutkompatiblen Material zur Verwendung in medizinischen
Geräten,
dass über
einen verlängerten
Zeitraum hinweg antithrombogene Eigenschaften, d. h. verringerte
Thrombozytenadhäsion
und Aktivierung, beibehält.
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Es
wurde jetzt gefunden, dass Artikel, die bei ihrer Verwendung in
Kontakt mit Körperflüssigkeiten oder
Geweben stehen, in dieser Hinsicht verbesserte Eigenschaften haben,
wenn sie ein Substrat mit einem über
ein aminofunktionelles Polysiloxan auf die Oberfläche immobilisierten
Biomolekül
umfassen.
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Gemäß einem
Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines
medizinischen Gerätes
mit einem auf einer Substratoberfläche immobilisierten Biomolekül bereit,
wobei man:
- (a) die Substratoberfläche mit
einer Lösung
eines aminofunktionellen Polysiloxans beschichtet; und die aminofunktionelle
Polysiloxanlösung
durch Spülen
der Oberfläche
mit feuchter Luft trocknet, wobei man eine beschichtete Oberfläche mit Amin-Funktionen
erhält;
und
- (b) die beschichtete Oberfläche
mit einem Biomolekül
in Kontakt bringt, wobei man eine bioverträgliche Oberfläche erhält.
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Durch
erfindungsgemäße Verfahren
erhältliche
medizinische Geräte
stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
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Als
Ergebnis der vorliegenden Erfindung, die zu einem aminofunktionellen
Polysiloxan auf einer Substratoberfläche führt, ist das Substrat blutkompatibel,
und vorzugsweise auch biokompatibel.
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Ein „medizinisches
Gerät" kann als ein Gerät definiert
werden, das Oberflächen
besitzt, die im Verlauf ihres Betriebs mit Gewebe, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten
in Kontakt kommen, welche Flüssigkeiten
nachfolgend in Patienten verwendet werden. Hierzu können z.
B. extrakorporale Geräte
zur Verwendung in der Chirurgie wie z. B. Blut-Oxygenatoren, Blutpumpen,
Blutsensoren, Röhren
zur Beförderung
von Blut und dergleichen, die mit Blut in Kontakt kommen, das dann
in den Patienten zurückgeführt wird,
gehören.
Hierzu können
auch Endoprothesen gehören,
die in Kontakt mit Blut in einen menschlichen oder tierischen Körper implantiert
werden, wie z. B. Gefäßprothesen,
Stents, Schrittmacherkontakte, Herzklappen und dergleichen, die
in Blutgefäße oder
in das Herz implantiert werden. Dies kann auch Geräte zur vorübergehenden
intravaskulären
Verwendung wie z. B. Katheter, Führungsdrähte und
dergleichen umfassen, die zu Zwecken der Überwachung oder Reparatur in
den Blutgefäßen oder
im Herzen platziert werden.
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Ein „Biomolekül" ist als ein biologisch
aktives Molekül
definiert.
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Ein „biokompatibles" Material ist eines,
das im Körper
generell keine schädlichen
Reaktionen (z. B. toxische oder antigene Reaktionen) hervorruft,
ob es nun im Körper
abgebaut wird, für
längere
Zeiträume
darin verbleibt oder als Ganzes (d. h. unverändert) ausgeschieden wird.
Idealerweise ruft ein biokompatibles Material als Ergebnis seines
Kontaktes mit Körperflüssigkeiten
oder Geweben keine unerwünschten
Reaktionen im Körper
hervor, wie z. B. Gewebstod, Tumorbildung, allergische Reaktion,
Reaktion auf Fremdkörper
(Abstoßung)
oder Entzündung.
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Ein „blutkompatibles" Material ist eines,
das im Körper
als Ergebnis seines Kontaktes mit Blut keine unerwünschten
Reaktionen wie z. B. Blutgerinnung hervorruft. Dies kann z. B. durch
verringerte Thrombozytenadhäsion
demonstriert werden.
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Die
Biokompatibilität
von in medizinischen Geräten
verwendeten Materialien, wozu implantierbare Materialien und Materialien
gehören,
die nicht notwendigerweise implantiert werden, aber die in Kontakt
mit Körpergeweben
oder -flüssigkeiten
(z. B. Blut) kommen, kann erfindungsgemäß verbessert werden, z. B.
durch kovalente Anheftung eines Biomoleküls, vorzugsweise von Heparin,
unter Verwendung eines aminofunktionellen Polysiloxans. Unter Verwendung
dieses Verfahrens werden Ausmaß und Stärke schädlicher
Reaktionen zwischen dem Substrat und den Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, verringert.
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Die
Blutkompatibilität
ist erheblich komplexer als die Kompatibilität eines Materials mit anderen Körperflüssigkeiten
oder -geweben. Dies ist eine Folge des komplexen Gemisches roter
Blutkörperchen, weißer Blutkörperchen,
Thrombozyten, anorganischer Ionen und Plasmaproteine wie z. B. Albumin, Fibrinogenen
und Globulinen im Blut. Das Blut bildet ein Gerinnsel oder einen
Thrombus, wenn eine Verletzung erfolgt oder wenn es in Kontakt mit
einer fremden Substanz kommt. Fast alle Materialien setzen diesen
Gerinnselbildungsprozess in Gang, und im Allgemeinen werden sie
bald darauf von einem irreversiblen Gerinnsel unterschiedlicher
Größe überzogen.
Solche Gerinnsel können
eine negative Wirkung auf die Verwendbarkeit solcher Materialien
haben. Somit sind besonders bevorzugte Materialien der vorliegenden
Erfindung solche, die keine nennenswerte Gerinnung oder Reaktion
natürlicher
Blutbestandteile, wie sie in vivo eintreten, auslösen, wie z.
B. Thrombozytenadhäsion
und Aktivierung.
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Die
erfindungsgemäßen Geräte umfassen ein
Substrat und ein Biomolekül,
das über
ein aminofunktionelles Polysiloxan auf eine Weise und in einer Orientierung
angeheftet ist, die dahingehend wirken, dass sie ein relativ zum
Substrat ohne das Biomolekül
und das aminofunktionelle Polysiloxan verbesserte nicht-thrombogene
Oberfläche
bereitstellen. Der Kontakt zwischen dem Blut und einer fremden Oberfläche initiiert
einen komplexen Vorgang der Thrombogenese, an dem Thrombozytenadhäsion, Aggregation
und Granulenfreisetzung; Thrombinbildung; und Fibrinbildung beteiligt
sind. Infolgedessen existieren eine Reihe von Parametern, die als
Maß der Thrombogenizität eines
Gerätes
ausgewählt
werden können.
Somit umfasst die Evaluation der Reaktionen an der Berührungsfläche zwischen
Blut und Gerät
typischerweise einen Multi-Parameter-Ansatz (d. h. Multi-Assay-Ansatz),
obwohl schon eines der Assays (z. B. Elektronenmikroskopie für die Thrombozytenadhäsion, Plättchenfaktor
4 (PF4)-Messung für die
Thrombozytenaktivierung, Thrombin-Antithrobin (TAT)-Assay), die
hier verwendet werden, als ausreichend gilt, um die Verbesserungen
zu zeigen, die sich aus dem erfindungsgemäßen Verfahren ergeben.
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Die
Blutkompatibilität
des erfindungsgemäßen Gerätes
zeigt sich hier an einer verringerten Thrombozytenadhäsion bei
der Interaktion mit Blut im Vergleich zu einem Gerät ohne das über ein
aminofunktionelles Polysiloxan angeheftetes Biomolekül. Dies
bedeutet, dass es bei einem Substrat, an das ein Biomolekül wie z.
B. Heparin über
ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftet ist, eine Verringerung
der Anzahl der an die Substratoberfläche angehefteten Thrombozyten
pro Flächeneinheit
im Verhältnis
zu dem gleichen Substrat ohne das daran angeheftete Polysiloxan
und Biomolekül
gibt, wenn es gemäß dem in
den Beispielen umrissenen Verfahren mit menschlichem Blut in Kontakt
gebracht wird. Die erfindungsgemäße Substratoberfläche ist
vorzugsweise im Wesentlichen nicht-thrombogen, d. h. sie verursacht
wenig oder keine Thrombozytenadhäsion. Hier
ist bei einem im Wesentlichen nicht-thrombogenen Substrat weniger
als 1 % der Substratoberfläche mit
Thrombozyten bedeckt. Im Gegensatz hierzu können bei Substraten ohne daran
angeheftetes Polysiloxan und Biomolekül unter den gleichen Bedingungen bis
zu 10–15
% der Oberfläche
mit Thrombozyten bedeckt sein. Dies kann unter Verwendung von Elektronenmikroskopie
gezeigt werden.
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Das
erfindungsgemäße Gerät verursacht vorzugsweise
wenig oder keine Thrombozytenaktivation zusätzlich zu der geringen Thrombozytenadhäsion, wie
anhand der Thrombozytenausbreitung gezeigt werden kann. Das heißt, bei
Substraten, an welche die Thrombozyten adhärieren, bleiben die Thrombozyten
im Allgemeinen abgerundet und zeigen wenig oder keine Ausbreitung.
Die Thrombozytenaktivierung kann auch anhand der Freisetzung des Plättchenfaktors
4 bestimmt werden. Bei einem erfindungsgemäßen Substrat, an das ein Biomolekül wie z.
B. Heparin über
ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftet ist, gibt es eine
Verringerung der Menge des freigesetzten Plättchenfaktors 4 im Verhältnis zu dem
gleichen Substrat ohne daran angeheftetes Polysiloxan und Biomolekül, wenn
es gemäß dem in den
Beispielen umrissenen Verfahren mit menschlichem Blut in Kontakt
gebracht wird. Diese Verringerung ist vorzugsweise in der Größenordnung
von mindestens 15 %, und besonders bevorzugt von mindestens 20 %.
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Die
Blutkompatibilität
des erfindungsgemäßen Geräts zeigt
sich auch an einer verringerten Thrombin-Antithrombin-Bildung (TAT)
bei der Interaktion mit Blut im Vergleich zu dem Gerät ohne das über ein
aminofunktionelles Polysiloxan angeheftetes Biomolekül. Das heißt, dass
es bei einem erfindungsgemäßen Substrat,
an das ein Biomolekül
wie z. B. Heparin über
ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftet ist, im Verhältnis zu
dem gleichen Substrat ohne das daran angeheftete Polysiloxan und
Biomolekül
bei Kontakt mit menschlichem Blut gemäß dem in den Beispielen umrissenen
Verfahren eine Verringerung der Anzahl der gebildeten Thrombin-Antithrombin-Komplexe
(TAT) gibt. Diese Verringerung liegt vorzugsweise in der Größenordnung
von mindestens 10 %, und besonders bevorzugt von mindestens ungefähr 25 %.
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Die
Blutkompatibilität
des erfindungsgemäßen Geräts zeigt
sich auch an einer verringerten Bildung des terminalen Komplementkomplexes
bei der Interaktion mit Blut im Vergleich zu dem Gerät ohne das über ein
aminofunktionelles Polysiloxan angeheftetes Biomolekül. Das heißt, dass
es bei einem erfindungsgemäßen Substrat,
an das ein Biomolekül wie
z. B. Heparin über
ein aminofunktionelles Siloxan angeheftet ist, im Verhältnis zu
dem gleichen Substrat ohne das daran angeheftete Polysiloxan und
Biomolekül
eine Verringerung der Anzahl terminaler Komplementkomplexe gibt,
wenn sie in Übereinstimmung
mit dem in den Beispielen umrissenen Verfahren mit menschlichem
Blut in Kontakt gebracht werden. Diese Verringerung liegt vorzugsweise
in der Größenordnung
von mindestens etwa 40 %, und besonders bevorzugt von mindestens
etwa 70 %.
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Die
Blutkompatibilität
des erfindungsgemäßen Geräts zeigt
sich auch an einer verringerten Elastasebildung bei der Interaktion
mit dem Blut im Vergleich zu dem Gerät ohne das über ein aminofunktionelles
Polysiloxan angeheftetes Biomolekül. Das heißt, dass es bei einem erfindungsgemäßen Substrat,
an das ein Biomolekül
wie z. B. Heparin über
ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftet ist, eine Verringerung
der Menge der gebildeten Elastase relativ zu dem gleichen Substrat
ohne daran angeheftetes Polysiloxan und Biomolekül gibt, wenn es gemäß dem in
den Beispielen umrissenen Verfahren mit menschlichem Blut in Kontakt
gebracht wird. Diese Verringerung liegt vorzugsweise in der Größenordnung
von mindestens etwa 20 %, und besonders bevorzugt von mindestens
etwa 25 %.
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Erfindungsgemäß wird die
Substratoberfläche
zuerst mit einem aminofunktionellen Polysiloxan (nachfolgend auch
als Silikon bezeichnet) überzogen,
typischerweise in einem flüssigen
Träger
(z. B. einem organischen Lösungsmittel).
Beispiele für
geeignete aminofunktionelle Polysiloxane sind z. B. in US-A-3 574
673 (Schwelger) offenbart. Ein bevorzugtes solches Material ist
ein von Dow Corning unter dem Handelsnamen „MDX4-4159" erhältliches aminofunktionelles
Polydimethylsiloxan-Copolymer. Dieses Material ist als eine Lösung, die
50 % eines aminofunktionellen Polydimethylsiloxan-Copolymers in
gemischten aliphatischen (z. B. Hexan) und Isopropanol-Lösungsmitteln
enthält,
erhältlich.
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Das
aminofunktionelle Polydimethylsiloxan wird typischerweise so verwendet,
wie es erhalten wird, oftmals in einem flüssigen Träger, und es wird durch Beschichtung
auf ein Substrat aufgetragen. Die Oberfläche wird dann getrocknet (d.
h., dass man die flüssigen
Träger
und einen etwaigen Überschuss an
Siloxan entfernt), und das Siloxan wird gehärtet, indem man die Oberfläche des
Substrates mit feuchter Luft (d. h. mit mehr als 50 % relativer
Luftfeuchte) spült.
Die Luft trocknet den flüssigen
Träger
und entfernt das überschüssige Siloxan.
Die Luftfeuchtigkeit erzeugt Si-OH-Gruppen in dem Siloxan, die dann Kondensation
und Härtungsreaktionen
in der Beschichtung auslösen.
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Das
mit dem aminofunktionellen Polydimethylsiloxan beschichtete Substrat
wird dann mit einem Biomolekül,
das daran angeheftet werden soll, in Kontakt gebracht. Dies kann
durch eine Reihe von dem Fachmann bekannten Verfahren geschehen.
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Ein
besonders bevorzugtes Verfahren ist ein Oxidationsverfahren, das
die Verwendung von Periodat umfasst. Das Biomolekül, vorzugsweise
Heparin, wird mit einem Periodat in einer gepufferten wässrigen
Lösung
in Kontakt gebracht, und man lässt
es reagieren, wodurch ein aldehydfunktionalisiertes Heparin gebildet
wird. Diese kontrollierte Oxidation stellt eine begrenzte Anzahl
reaktiver Aldehydgruppen pro Molekül bereit. Das Periodat ist
vorzugsweise ein wasserlösliches
Periodat, z. B. ein Alkalimetallperiodat, wie z. B. Natriumperiodat.
Wenn das Biomolekül Heparin
ist, ist die verwendete Periodatmenge im Allgemeinen ausreichend,
um mit nicht mehr als zwei der Zuckereinheiten in dem Heparinmolekül (d. h. den
basischen Disaccharid resten, die die Struktur des Glycosaminoglycans
bilden) zu reagieren. Wenn das verwendete Periodat Natriumperiodat
ist und das verwendete Heparin eine kommerziell verfügbare injizierbare
Form des Heparins ist (d. h., sein Natriumsalz mit einer Aktivität von 160
Einheiten/Milligramm), dann sollte das Gewichtsverhältnis von
Heparin zu Periodat ungefähr
30:1 oder weniger betragen, damit nicht mehr als zwei der Zuckereinheiten
in dem Heparinmolekül
reagieren. Der Fachmann erkennt, dass die für andere Periodatverbindungen
und andere Heparinformen benötigten
Periodatmengen durch herkömmliche
Berechnung und empirische Tests bestimmt werden können.
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Die
Reaktion zwischen dem Heparin und dem Periodat findet in einer wässrigen
Pufferlösung statt.
Im Allgemeinen können
Puffer mit einem pH-Wert in einem neutralen bis schwach sauren Bereich
von ungefähr
4,5 bis ungefähr
8 verwendet werden. Ein niedriger pH-Wert (z. B. ein Acetatpuffer
mit pH 4,5) ist bevorzugt, wenn eine schnelle Reaktion erwünscht wird,
während
ein eher neutraler pH-Wert (z. B. ein Phosphatpuffer mit pH 6,88)
für eine
langsamere Reaktion mit einer längeren
Lagerstabilität bevorzugt
wird. In dem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,5 sollte die Reaktion
ungefähr
3 Stunden lang stattfinden. In einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert
von 6,88 sollte die Reaktion ungefähr 16 Stunden lang stattfinden.
Gewünschtenfalls
kann das Reaktionsgemisch dann vor der Verwendung bei ungefähr 5 °C gelagert
werden.
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Das
Gemisch wird nach der Reaktion verdünnt, und der pH-Wert wird eingestellt,
um den pH-Wert des
Gemischs auf einen pH-Wert einzustellen, der für die Kopplungsreaktion zwischen
dem Biomolekül
und dem aminofunktionellen Polysiloxan günstig ist. Typischerweise wird
ein mildes Reduktionsmittel, wie z. B. Natriumcyanoborwasserstoff, dem
verdünnten
Gemisch zugesetzt, um die Reduktion der zwischen den reaktiven Aldehydgruppen
auf dem oxidierten Biomolekül
und den aminofunktionellen Gruppen auf dem Polysiloxanüberzug auf
der Substratoberfläche
zu bewirken. Die zu behandelnde Substratoberfläche wird dann mit dem verdünnten Gemisch über eine
geeignete Zeit und bei einer geeigneten Temperatur, um die Reaktion
abzuschließen,
(d. h. zur Anheftung des Biomoleküls) in Kontakt gebracht (z.
B. darin eingetaucht oder damit gespült). Diese Zeit kann im Bereich
von ungefähr
30 Sekunden bis ungefähr
2 Stunden bei Temperaturen im Bereich von ungefähr 20 °C bis ungefähr 60 °C liegen. Zum Beispiel kann
bei Raumtemperatur (d. h. ungefähr
20 °C bis
ungefähr
25 °C) das
mit dem aminofunktionellen Polydimethylsiloxan beschichtete Substrat
zur effektiven Anheftung von Biomolekülen über einen Zeitraum von 30 Sekunden
bis 5 Minuten hinweg mit einer Biomoleküllösung gespült werden.
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Im
Allgemeinen können
zu den erfindungsgemäß verwendeten
Biomolekülen
z. B. gehören:
antibakterielle und antimikrobielle Mittel; gerinnungshemmende und
antithrombotische Mittel; Thrombozytenmittel; Antiinflammatorika;
Enzyme; Katalysatoren; Hormone; Wachstumsfakto ren; Medikamente; Vitamine;
Antikörper;
Antigene; Nukleinsäuren;
Farbstoffe (die als biologische Liganden fungieren); DNA- und RNA-Abschnitte;
Proteine und Peptide. Die Biomoleküle können synthetisch hergestellt
oder in der Natur vorkommend sein. Zu diesen Biomolekülen gehören Heparin,
Prostaglandin E1 (PGE1), Ticlopidin, Plasmin,
Urokinase, TPA, Polyethylenoxid (PEO) und FUT-175. Heparin behindert
die Blutgerinnung, indem es mit Antithrombin III und Thrombin interagiert und
so die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin hemmt. Ticlopidin und
Prostaglandin E1 inhibieren die Thrombozytenaktivierung.
Plasmin, Urokinase und TPA sind Serinproteasen, die Proteinablagerungen und
-netzwerke auflösen.
Polyethylenoxid minimiert die Proteinadsorption, und FUT-175 inhibiert
die Kontaktaktivierung.
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Zu
den Substraten, die durch das erfindungsgemäße Verfahren modifiziert werden
können,
gehören
Materialien, die in den Körperflüssigkeiten
im Wesentlichen unlöslich
sind, und die im Allgemeinen so konstruiert und entworten sind,
dass sie im oder auf dem Körper
oder im Kontakt mit Körperflüssigkeiten platziert
werden. Die Substrate haben vorzugsweise diejenigen physikalischen
Eigenschaften wie Stärke, Elastizität, Permeabilität und Flexibilität, die erforderlich
sind, um gemäß dem beabsichtigen
Zweck zu funktionieren; sie können
leicht gereinigt, hergestellt und sterilisiert werden; und sie behalten
ihre physikalischen Eigenschaften und Funktionen während des Zeitraums,
währenddessen
sie in dem Körper
implantiert sind oder in Kontakt mit ihm stehen, im Wesentlichen
bei. Zu den Beispielen solcher Substrate gehören: Metalle wie Titan und
Titanlegierungen, TiNi (Formgedächtnislegierung,
Superelastizität),
Aluminiumoxid, Platin und Platinlegierungen, rostfreie Stähle, MP35n,
Elgiloy, Haynes 25, Stellit, pyrolytischer Kohlenstoff, Silber oder
glasiger Kohlenstoff; Polymere wie z. B. Polyurethane, Polycarbonate,
Silikonkautschuk, Polyolefine einschließlich von Polyethylenen oder
Polypropylenen, Polyvinylchloride, Polyether, Polyester, Nylons,
Polyvinylpyrrolidone, Polyacrylate und Polymethacrylate wie z. B.
Polymethylmethacrylate (PMMA), n-Butylcyanoacrylat, Polyvinylalkohol,
Polyisoprene, Gummi, Zellulosederivate, Polyvinylidenfluorid (PVDF),
Polytetrafluorethylen, Ethylentetrafluorethylencopolymer (ETFE),
Acrylnitrilbutadienethylen, Polyamid, Polyimid, Styrol, Acrylnitril
und dergleichen; Minerale oder Keramiken wie z. B. Hydroxyapatit;
menschliches oder tierisches Protein oder Gewebe wie z. B. Knochen,
Haut, Zähne,
Kollagen, Laminin, Elastin oder Fibrin; organische Materialien wie
z. B. Holz, Zellulose oder komprimierter Kohlenstoff; und andere
Materialien wie z. B. Glas oder dergleichen. Unter Verwendung dieser Materialien
hergestellte Substrate können
beschichtet oder unbeschichtet, derivatisiert oder nichtderivatisiert
sein, bevor sie mit dem aminofunktionellen Polysiloxan beschichtet
werden.
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Zu
den medizinischen Geräten,
in die das erfindungsgemäße biokompatible
Material integriert werden kann, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein,
chirurgische Implantate, Prothesen und beliebige Teile oder Geräte, die
einen Teil eines lebenden Körpers
ersetzen oder erweitern oder die mit Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut,
in Kontakt kommen. Die Substrate können jede beliebige Form oder
Gestalt haben, einschließlich
von Röhren,
Platten, Stäben
und passend geformten Artikeln. Verschiedenartige erfindungsgemäß verwendbare
medizinische Geräte
und Ausrüstungsgegenstände sind
aus dem Stand der Technik bekannt. Zu den Beispielen für Geräte gehören Katheter,
Nahtmaterial, Röhren-
und Fasermembranen. Zu den Beispielen für Katheter gehören Zentralvenenkatheter,
Thoraxableitungskatheter und Ballonkatheter für die Angioplastie. Zu den Beispielen
von Röhren
gehören
die für
den extrakorporalen Blutkreislauf verwendeten Röhrensysteme, wie z. B. Blut-Oxygenatoren.
Zu den Beispielen für Membranen
gehören
Polykarbonatmembranen, Hämodialysemembranen
und zur Diagnose oder in biosensorischen Geräten verwendete Membranen. Es gehören auch
Geräte
hierzu, die bei der Diagnose verwendet werden, ebenso Polyestergarn-Nahtmaterial
wie Polyethylenband und Polypropylen-Hohlfasermembranen.
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Zu
den weiteren Illustrationen medizinischer Geräte gehören folgende: Autotransfusionsgeräte, Blutfilter,
Blutpumpen, Bluttemperatursonden, Knochenwachstumsstimulatoren,
Atmungskreislaufanschlüsse,
Bulldog-Klammern, Kanülen,
Transplantate, implantierbare Pumpen, Implantate für Impotenz
und Inkontinenz, intraokuläre
Linsen, Anschlüsse,
Anschlussadapter, Anschlussverbindungen, Nasenknöpfe, Augapfelimplantate, Herzisolationspolster,
Herzumhüllungen,
Klemmen, Abdeckungen, Dialatoren, Dialysevorrichtungen, Einweg-Temperatursonden,
Kuppeln, Drainageprodukte, Draperien, Ohrdochte, Elektroden, Emboliegeräte, Ösophagus-Stethoskope, Vorrichtungen
zur Fixierung von Brüchen, Handschuhe,
Führungsdrähte, Hämofiltrationsgeräte, Naben,
intraarterielle Blutgassensoren, intrakardiäre Sauggeräte, intrauterine Druckgeräte, Nasenscheidewandschienen,
Nasentampons, Nadeln, ophthalmische Geräte, PAP-Abstrichbürsten, periodontale
Faseradhäsiva,
Pessarien, Retentionsmanschetten, Platten, Klammern, Magenzugänge, chirurgische
Instrumente, Messfühlerprotektoren,
Harnröhrenstents,
vaginale Kontrazeptiva, Klappen, Gefäßschleifen, Wasser- und Salzwasserblasen,
Hüftgelenkskapseln,
Annuloplastieringe, Aorta- und Herzkranzgefäß-Lokatoren, künstliche
Bauchspeicheldrüsen,
Batterien, Knochenzement, Brustimplantate, Herzmaterialien wie Gewebe,
Filze, Geflechte, Flicken, Zement-Platzhalter, Cochlearimplantate,
Defibrillatoren, Generatoren, orthopädische Implante, Schrittmacher,
Patellaknöpfe,
Penisimplantate, Pledgets, Stecker, Zugänge, prothetische Herzklappen,
Platten, Shunts, Nabelband, mit Klappen versehene Leitungen und
Gefäßzugänge.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist in besonderem Maße
auf Stents anwendbar. Zum Beispiel kann ein Stent, der ein dem Lumen
exponierte Oberfläche
hat, bereitgestellt werden, wobei diese Oberfläche eine Beschichtung besitzt,
die das Reaktionsprodukt eines aminofunktionellen Polysiloxans und eines
Biomoleküls
umfasst.
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Der
Ausdruck „Stent" bezeichnet ein beliebiges
Gerät,
das durch einen Katheter abgegeben werden kann. 1 ist
eine Illustration eines Stents 10 (um einen Ballon 15 herum
darge stellt), der erfindungsgemäß mit dem
aminofunktionellen Polysiloxan und Biomolekül behandelt worden ist. Der
Stent 10 umfasst die die Gefäßwand kontaktierende Oberfläche 12 und
eine dem Lumen exponierte Oberfläche
(nicht dargestellt). Wo der Stent insgesamt als röhrenartige
Struktur geformt ist, einschließlich
einer diskontinuierlichen Röhre
oder einer ringartigen Struktur, ist die die Gefäßwand kontaktierende Oberfläche die äußere Oberfläche der
Röhre,
und die dem Lumen exponierte Oberfläche ist die innere Oberfläche der
Röhre.
Wenn der Stent an seinem Platz ist, steht die äußere Oberfläche in Kontakt mit einem Teil einer
Wand eines Gefäßes, und
die innere Oberfläche
steht mit Blut in Kontakt. Der Stent 10 ist mit dem aminofunktionellen
Polysiloxan, mit einem Biomolekül
verbunden, beschichtet, wodurch die blutkompatible Oberfläche 14 gebildet
wird. Typischerweise sind sowohl die die Gefäßwand kontaktierende Oberfläche 12 als
auch die dem Lumen exponierte Oberfläche mit dem aminofunktionellen
Polysiloxan und Biomolekülen
beschichtet, obwohl es in Abhängigkeit von
den zur Herstellung des Stents verwendeten Materialien lediglich
notwendig sein kann, die dem Lumen exponierte Oberfläche zu beschichten.
Der Ballon 15 wird angrenzend an die dem Lumen exponierte
Oberfläche
des Stents positioniert, um die Abgabe des Stents zu ermöglichen.
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Zu
anderen geeigneten Stents gehören
ein verformbarer Metalldraht-Stent, der als Stent-Rahmen verwendbar
ist, wie z. B. der in US-A-4 886 062, wo bevorzugte Verfahren zur
Herstellung eines Draht-Stents offenbart werden, beschriebene Stent (Wiktor).
Zu anderen verwendbaren metallischen Stents gehören die in US-A-4 733 655 (Palmaz)
und US-A-4 800 882 (Gianturco) beschriebenen Stents. Zu anderen
geeigneten Stents gehören
der Palmaz-Schatz-Herzkranzgefäß-Stent
(Johnson & Johnson
Interventional, Warren, NJ) und aus Formgedächtnismetallen hergestellte
Stents wie z. B. selbstexpandierende Nitinostents, einschließlich des unter
dem Handelsnamen CARDIOCOIL von Medtronic, Eden Prairie, MN erhältlichen
und in US-A-5 372 600 offenbarten Stents. Zur erfindungsgemäßen Verwendung
bevorzugte Stents sollten flexibel sein, um während des Einsetzens Gefäße zu durchqueren,
ferner biokompatibel und imstande, sich verlässlich auszudehnen und in die
Gefäßwand einzubetten.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist auch in besonderem Maße
auf Blutgasaustauschgeräte
anwendbar, z. B. auf Oxygenatoren. Hierzu gehören sowohl die Blatt- als auch
die Röhrenform
von Membranoxygenatoren, wie sie aus dem Stand der Technik wohlbekannt
sind. In einem Membranoxygenator wird das Blut vom direkten Kontakt
mit dem Sauerstoff spendenden Gas durch eine Membran getrennt, die
in einem hohlen Gehäuse
untergebracht ist. Diese Membran ist mikroporös oder semipermeabel, d. h.
imstande, den Durchtritt von Kohlendioxid und Sauerstoff zu erlauben,
während
sie gleichzeitig das Blut daran hindert, selber hindurch zu treten.
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Gegenwärtig existieren
zwei Arten von Membranoxygenatoren. Eine Art, als Flachplatten-Membranoxygenator
bezeichnet, verwendet eine oder mehrere dünne, flache Blätter mikroporöser Membran.
In der einfachsten Form besitzt der Flachplattenoxygenator ein einzelnes
Blatt mik roporöser
Membran, das in einem Gehäuse
eingesiegelt ist, so dass es in dem Gehäuse ein erstes Kompartiment
(das „Blutkompartiment") für den Blutstrom
und ein zweites Kompartiment (das „Gaskompartiment") für den Durchstrom
eines oxygenierenden Gases bereitstellt. Jedes der Kompartimente
ist mit einer Zustromöffnung
und einer Ausstromöffnung
versehen. Das Blut strömt
in das Blutkompartiment hinein und aus ihm hinaus, und das oxygenierende
Gas fließt
in das Gaskompartiment hinein und aus ihm hinaus. Sauerstoff geht
von dem oxygenierenden Gas über
die Membran in das durch das Blutkompartiment fließende Blut über. Kohlendioxid
geht von dem einströmenden
Blut über
die Membran über,
um von dem oxygenierenden Gas mitgerissen zu werden. Das ausströmende Blut,
jetzt an Kohlendioxid verringert und mit Sauerstoff angereichert,
wird in den Patienten zurückgeleitet.
Die Membran kann dadurch blutkompatibel gemacht werden, dass man
die gesamte Oberfläche
der Membran einer geeigneten aminofunktionellen Polysiloxanverbindung
aussetzt; sie durch Spülen
dieser Oberfläche
mit feuchter Luft zur Entfernung von Lösungsmitteln und überschüssiger Verbindung
trocknet; und sodann über
einen Zeitraum einem Biomolekül
aussetzt, der ausreichend ist, das Biomolekül an das Silikon zu koppeln
und eine biokompatible Membran zu bilden.
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Die
andere Art eines Membranoxygenators wird als Hohlfaseroxygenator
bezeichnet und ist in US-A-4 239 729 (Hasegawa et al.) dargestellt.
Ein Hohlfaseroxygenator verwendet eine große Anzahl (typischerweise mehrere
Tausend) von mikroporösen oder
semipermeablen Hohlfasern, die in einem Gehäuse untergebracht sind. Diese
Hohlfasern sind in die abschließenden
Wände des
Gehäuses
eingebettet; die abschließenden
Wände sind
dann mit Verschlusskappen mit Dichtlippen ausgestattet. Eine Endkappe
ist mit einer Einströmöffnung und
die andere mit einer Ausströmöffnung versehen.
In dem Oxygenator nach Hasegawa et al. sind die Hohlfasern so in
dem Gehäuse
angeordnet, dass ihre Längsachsen
insgesamt parallel zur Längsachse
des Gehäuses
verlaufen. Bei diesem Gerät
tritt das Blut durch die Einlassöffnung
der Kappe am einen Ende ein, strömt
durch die Lumina der Hohlfasern und verlässt das Gerät durch die Kappe am anderen
Ende. Das oxygenierte Gas tritt in das Gerät durch die Einlassöffnung in
der Außenwand
in der Nähe
eines Endes des Geräts
ein, strömt über die äußeren Oberflächen der
Hohlfasern und verlässt
das Gerät
durch die Auslassöffnung
in der Außenwand
in der Nähe
des anderen Endes des Gerätes.
Es ist ersichtlich, dass Kohlendioxid von dem in den Hohl-fasern
strömenden
Blut durch die Faserwände
in den Strom des oxygenierenden Gases diffundiert. Gleichzeitig
diffundiert Sauerstoff aus dem oxygenierenden Gas, das über die äußeren Oberflächen der
Hohlfasern strömt, durch
die Wände
der Hohlfasern in deren Lumina, um das durch sie fließende Blut
zu oxygenieren.
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Seit
der Entwicklung dieser Art von Oxygenator wurden andere Oxygenatoren,
die Hohlfasern umfassen, entwickelt. Diese Oxygenatoren umfassen
typischerweise eine Vielzahl von Hohlfasern, die in einem hohlen
Gehäuse
untergebracht und so angeordnet sind, dass das Blut typischerweise über die Hohlfasern
strömt
und die Gase typischerweise durch die Hohlfasern strö men. Im
Hinblick auf die Richtung des Flüssigkeitsstromes
und die Anordnung der Fasern sind viele Konfigurationen möglich. Die
Fasern können
z. B. linear, kreisförmig
oder spiralförmig
angeordnet sein, oder sie können
in verschiedenen Konfigurationen um ein Kernteil gewunden oder gewickelt
sein. Hohlfaser-Membranoxygenatoren sind z. B. in US-A-4 975 247
(Badolato et al.) und US-A-5 395 468 (Juliar et al.) beschrieben.
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Zur
Verwendung in Oxygenatoren geeignete Hohlfasern werden typischerweise
blutkompatibel gemacht, indem man die gesamte Oberfläche (d.
h. die innere und die äußere Oberfläche) der
Hohlfasern einem geeigneten aminofunktionellen Polysiloxan aussetzt;
mit feuchter Luft spült,
um das Lösungsmittel
und überschüssige Verbindungen
zu entfernen; und sie dann über
einen Zeitraum hinweg einem Biomolekül aussetzt, der ausreichend
ist, das Biomolekül
an das Silikon zu koppeln und blutkompatible Hohlfasern zu bilden.
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Somit
kann auch ein Gerät
zur Behandlung von Blut, umfassend:
ein hohles Gehäuse; und
eine
in dem Gehäuse
untergebrachte Membran;
wobei die Membran mit einer das Reaktionsprodukt eines
aminofunktionellen Polysiloxans und eines Biomoleküls umfassenden
Beschichtung bereitgestellt wird,
bereitgestellt werden.
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Des
Weiteren kann ein Gerät
zur Behandlung von Blut, umfassend:
ein hohles Gehäuse; und
eine
Vielzahl von hohlen Fasern, die in dem Gehäuse untergebracht sind;
wobei
die Hohlfasern mit einer das Reaktionsprodukt eines aminofunktionellen
Polysiloxans und eines Biomoleküls
umfassenden Beschichtung bereitgestellt werden,
bereitgestellt
werden.
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2A illustriert
ein vereinfachtes Diagramm eines Blut-Oxygenators 20, in
dem eine Vielzahl von Hohlfasern 22 in dem hohlen Gehäuse 24 untergebracht
sind. Dies ist so zu verstehen, dass die Fasern, obwohl in einer
linearen Anordnung dargestellt, in einer Vielzahl von Konfigurationen
angeordnet sein könnten,
einschließlich
einer kreisförmigen oder
spiralförmige
Anordnung, und ebenso auch um einen Kern oder dergleichen gewunden
sein könnten.
Die Fasern werden von dem Gehäuse 24 gestützt. Die
Blutstromeinlassöffnung 28 erlaubt
den Durchstrom von Blut durch die Fasern 22. Das Blut strömt durch
die Fasern und durch die Blutstrom-Auslassöffnung 29 hinaus.
Obwohl diese Figur den Blutstrom durch die Fasern darstellt, ist
es so zu verstehen, dass, in Abhängigkeit
von den gewünschten
Merkmalen des Oxygenators, das Blut entweder durch die Hohlfasern
hindurch oder über
sie hinweg strömen
kann. 2B illustriert schematisch die durch
die oder über
die erfindungsgemäß mit einer Beschichtung 36 versehenen
Hohlfasern möglichen Blutstrommuster.
Gas (z. B. Sauerstoff) strömt über die
Gas einlassöffnung 31 in
das Gehäuse 24.
Das Gas strömt über die
Fasern und aus dem Gehäuse 24 durch
die Gasauslassöffnung 32 hinaus.
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Das
Verfahren und die Materialien der Erfindung werden jetzt weiter
durch Illustration unter Bezug auf die folgenden nicht-beschränkenden
Beispiele und die sie begleitenden Zeichnungen dargestellt, wobei:
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1 eine
schematische Illustration eines Stents ist;
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2 eine schematische Illustration eines Blut-Oxygenators
ist;
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3 ein
Diagramm der TAT-Komplex-Bildung (in ng/ml; n = 3) zeigt, nachdem
heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang verschiedenen
behandelten und unbehandelten LDPE-Oberflächen ausgesetzt worden war;
-
4 ein
Diagramm der Freisetzung von Plättchenfaktor
4 zeigt (in IU/ml), nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches
Blut 90 Minuten lang verschiedenen behandelten und unbehandelten
LDPE-Oberflächen
ausgesetzt worden war;
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5 elektronenmikroskopische Aufnahmen von
blutexponierten Polyethylenoberflächen zeigt: (a) unmodifizierte
Oberfläche;
(b) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtete Oberfläche; (c)
mit aminofunktionalisierten Polysiloxan beschichtete und mit Heparin
gekoppelte Oberfläche;
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6 die
Bildung von SC5b-9-Komplexen (in ng/ml; n = 3) zeigt, nachdem heparinisiertes
(1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang verschiedenen behandelten
und unbehandelten LDPE-Oberflächen
ausgesetzt worden war;
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7 die
Bildung von PMN-Elastase (in ng/ml) zeigt, nachdem heparinisiertes
(1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang verschiedenen behandelten
und unbehandelten LDPE-Oberflächen ausgesetzt
worden war.
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Obwohl
die nachfolgend beschriebenen Beispiele eine Behandlung auf Polymerfilm
oder Gewebekulturplatten als Substratoberflächen involvieren, ist die Erfindung
nicht als hierauf beschränkt
zu verstehen.
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Beispiele
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Immobilisierung eines
Biomoleküls
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Unter
Verwendung einer peristaltischen Pumpe wurden die Innenoberflächen einer
Röhre aus
Niederdruckpolyethylen (LDPE) (Goodfellow, Cambridge, England; Länge 5 m,
Wandstärke
1,1 mm, Außendurchmesser
6,4 mm) fünf
Minuten lang durch Rezirkulation von 100 ml Isopropylalkohol (IPA)
gereinigt. Nachdem der IPA aus der Röhre abgesaugt worden war, wurde
das Innenlumen ungefähr
10 Minuten lang vorsichtig mit Luft gespült.
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Das
Beschichtungsverfahren wurde fortgesetzt, indem man 100 ml einer
Lösung
von 1,5 Gew.-% von aminofunktionellem Polydimethylsiloxan (MDX4-4159,
von Dow Corning, Midland, Michigan, USA, erhältlich) in Hexan (Merck, Darmstadt, Deutschland)
60 Sekunden lang durch die Röhre pumpte.
Das Innenlumen der Röhre
wurde zwei Stunden lang unter Umgebungsbedingungen mit feuchter
Luft (relative Luftfeuchte = 50 ± 10 %) gespült.
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Eine
Periodat-Heparin-Stammlösung
wurde am Tag, bevor die Heparinkopplung durchgeführt wurde (mindestens 16 Stunden
zuvor), hergestellt. Licht wurde aus dem Reaktionsgefäß ausgeschlossen.
Heparin-Natrium (5 mg/ml) (von Diosynth, Oss, Niederlande, erhältlich)
wurde mit 0,165 mg/ml NaIO4 (von Aldrich,
Bornem, Belgien) in einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH = 6,88; 0,025
M Na2HPO4 und 0,025
M KH2PO4; beide
von Merck erhältlich)
gemischt.
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Die
Heparinkopplung erfolgte, indem man 100 ml einer aus 40 Vol.-% der
Periodat-Heparin-Stammlösung und
60 Vol.-% eines 0,4 M Azetatpuffers, pH = 4,66 (0,2 M Eisessigsäure, 0,2
M Natriumazetat; beide von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI,
USA, erhältlich)
hindurchpumpte. Nach einer ungefähr
10 Minuten langen Rezirkulation wurde 0,1 mg/ml NaCNBH3 (Aldrich)
zugesetzt. Die Kopplung erfolgte 2 Stunden lang bei 50 °C. Danach
wurde das Innenlumen mit deionisiertem Wasser gespült, wonach
eine 1 M NaCl (Merck)-Lösung
10 Minuten lang durchgepumpt wurde, wonach das Innenlumen abermals
mit deionisiertem Wasser gespült wurde.
Schließlich
wurde überschüssiges Wasser aus
der Röhre
abgesaugt, und die Röhre
wurde unter Umgebungsbedingungen 16 Stunden lang mit Luft durchspült.
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Überprüfung mit Blut
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Überprüfung mit Blut in einer dynamischen
Schleife
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Kontroll-
und oberflächenmodifizierte
LDPE-Rohrstücke
von jeweils 50 cm wurden einzeln zu Schleifen geschlossen, indem
die Enden mit einem 2 cm langen Tygon-Rohr (Cole Palmer Nr. 6408-03) verbunden
wurden; das Tygon-Rohr wurde so montiert, dass es nicht in Kontakt
mit dem Blut kam. Danach wurden die Schleifen mit einer 0,9 Gew.-% NaCl-Lösung gefüllt.
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Eine
10 ml Spritze wurde mit frisch abgenommenem menschlichem Blut (1
IU/ml Heparin) gefüllt,
und danach wurde das Blut in die Schleife gefüllt (das Endvolumen der Schleife
beträgt
ungefähr
6,3 ml), wodurch die Salzlösung
verdrängt
wurde. Die geschlossenen Schleifen wurden auf horizontal ausgerichteten
Acrylscheiben in einen gewärmtes
(37 °C)
0,9 Gew.-% NaCl enthaltenden Tank fixiert. Der Blutstrom wurde durch
motorisierte schrittweise Rotation (in der horizontalen Ebene) der
Acrylscheiben ausgelöst.
Nach 90 Minuten wurde das Blut in EDTA enthaltende Gefäße abgenommen.
Die Gefäße wurden
10 Minuten lang bei 1500 g (bei 4 °C) zentrifugiert, um das Plasma
zu erhalten, wonach Aliquots von 100 μl bis zur weiteren Analyse bei –20 °C eingefroren
wurden.
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Untersuchung mit dem Rasterelektronenmikroskop
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Nach
der Untersuchung mit Blut wurde ein 2 cm-Stück von der Röhre entfernt
und 3 mal mit Phosphatpuffer, pH = 7,4, gespült, wonach die Röhrenstücke in 2
ml Polypropylengefäßen, enthaltend
2,5 % Glutaraldehyd, bei ungefähr
4 °C gelagert
wurden. Die abschließende
Präparation
der Probe umfasste es, die Rohrproben einer Reihe abgestufter Ethanol/Wasser-Gemische
auszusetzen, um das Wasser zu entfernen, wonach sie nach dem Critical-Point-Verfahren
getrocknet und mit Gold überzogen
wurden. Die Elektronenmikroskopie fand unter Verwendung eines JEOL
JSM 6301F statt. In allen Proben wurde eine Oberfläche von
ungefähr
1 cm2 untersucht.
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Untersuchung der Bildung
des Thrombin-Antithrombin III-Komplexes (TAT)
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Typischerweise
wurde das Blut auf gebildeten TAT-Komplex gemäß dem mit dem Reagenzien-Kit zur Bestimmung
von menschlichem Thrombin/Antithrombin III-Komplex bereitgestellten
Protokoll (ENZYGNOST TAT Micro; Behringwerke AG Diagnostica, Marburg,
Deutschland, Produkt Nr. OWMG 15) untersucht. In diesem Protokoll
wurde das Blut nach der Inkubation abgezapft und den Näpfen einer
Mikrotiterplatte zugesetzt, die mit dem Antikörper gegen Thrombin beschichtet
waren; in der Probe vorliegendes TAT bindet dann an die Antikörper. In
einer zweiten Reaktion binden sich Peroxidase-konjugierte Antikörper gegen
menschliches AT III an das AT III des Komplexes. Danach werden das Chromogen
o-Phenyldiaminhydrochlorid und dann Wasserstoffperoxid zugesetzt.
Die enzymatische Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und dem Chromogen
wird durch die Zugabe verdünnter schwefliger
Säure beendet,
nach welcher die optische Dichte bei 492 Nanometern (nm) gemessen wird.
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Enzym-Immunassay für SC5b-9
(TCC)
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Typischerweise
wurde das Blut gemäß dem mit
dem Reagenzien-Kit zur Bestimmung des SC5b-9-Komplexes (QUIDEL SC5b-9
(TCC) Enzymimmunoassay; Quidel, San Diego, CA, USA) bereitgestellten
Protokoll auf gebildeten terminalen Komplementkomplex (TCC) untersucht.
In diesem Protokoll wird das Blut nach der Inkubation abgezapft und
Mikrotiterplatten zugesetzt, die mit dem monoklonalen Antikörper gegen
den SC5b-9-Komplex beschichtet wa ren. Das eingefangene SCSb-9 wird
anschließend
mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten
Antikörpern
detektiert, die an die Antigene des SC5b-9-Komplexes binden. In
einem dritten Schritt wird ein chromogenes Enzymsubstrat (2-2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolen-Sulfonsäure)-Diammoniumsalz)
zugesetzt; dieses Salz reagiert mit dem HRP-Konjugat und bildet
eine grüne
Farbe. Die enzymatische Reaktion wird durch die Zugabe von Oxalsäure beendet,
und anschließend
wird die optische Dichte bei 405 nm gemessen.
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Messung der Elastasebildung
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Typischerweise
wurde das Blut gemäß dem mit
dem Reagenzien-Kit zur Bestimmung von PMN-Elastase (Merck, Darmstadt,
Deutschland; Produkt Nr. 12589) bereitgestellten Protokoll auf gebildete
Elastase untersucht. In diesem Protokoll wird Blut nach der Inkubation
abgezapft und in Näpfen
von Mikrotiterplatten zugesetzt, die mit dem Antikörper gegen
menschliche granulozytische Elastase beschichtet waren; der vorliegende
PMN Elastase-α1-Proteinaseinhibitor-Komplex bindet dann an die Antikörper. In
einem zweiten Schritt werden mit alkalischer Phosphatase markierte
Antikörper
zugesetzt, die an das α1-PI-Ende des Komplexes binden. Danach wird
das Chromogen 4-Nitrophenylphosphat zugesetzt. Die enzymatische
Reaktion wird durch die Zugabe von NaOH beendet, wonach die optische
Dichte bei 405 nm gemessen wird.
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Enzym-Immunoassay des
Plättchenfaktors
4
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Typischerweise
wurde das Blut gemäß den mit
dem Reagenzien-Kit (ASSERACHROM PF4 Enzymimmunoassay, Diagnostica
Stago, Asnières-sur-Seine,
Frankreich) bereitgestellten Protokoll auf gebildetem Plättchenfaktor
4 (PF4) untersucht. In diesem Protokoll wird Blut nach der Inkubation
abgezapft und in Näpfen
von Mikrotiterplatten zugesetzt, die mit dem Antikörper gegen
den PF4 beschichtet waren. Das eingefangene PF4 wird anschließend mit Anti-PF4-Peroxidase detektiert,
die an die freien Antigene der Terminanten des PF4 binden. In einem dritten
Schritt wird ein Chromogen des Enzymsubstrats (Ortho-phenylendiaminhydrochlorid)
zugesetzt, dann Wasserstoffperoxid. Die enzymatische Reaktion zwischen
dem Wasserstoffperoxid und dem Chromogen wird durch die Zugabe von
verdünnter schwefliger
Säure beendet,
wonach die optische Dichte bei 492 nm gemessen wird.
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Ergebnisse
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Die
heparinisierte aminofunktionelle polysiloxanbeschichtete PE-Oberfläche erhöht eindeutig
die Hämokompatibilität der Oberfläche und
verringert ihre Entzündungsneigung.
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3 zeigt
ein Diagramm der Thrombin-Antithrombin (TAT)-Komplexbildung (in
ng/ml; n = 3), nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90
Minuten lang LDPE-Oberflächen
ausgesetzt worden war: (a) nicht-modifiziert; (b) mit aminofunktionalisiertem
Polysiloxan beschichtet; und (c) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan
beschichtet und mit Heparin gekoppelt. Die Thrombinbildung ist die
Folge einer Serie von Reaktionen, die von dem Kontakt zwischen dem
Blut und einer fremden Oberfläche
in Gang gesetzt wird. Thrombin selbst wird durch den Proteaseinhibitor
Antithrombin III schnell deaktiviert, so dass es nicht detektierbar
sein kann; jedoch zeigt die Menge des stabilen Thrombin-Antithrombin
III (TAT)-Komplexes, wie viel Thrombin gebildet worden ist. Die
heparinisierte aminofunktionelle Polydimethylsiloxan-beschichtete
Oberfläche
der vorliegenden Erfindung zeigte eine erhebliche Verringerung der
Thrombinbildung, wie durch das TAT-Assay gemessen.
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4 zeigt
ein Diagramm der Freisetzung von Plättchenfaktor 4 (in IU/ml),
nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang LDPE-Oberflächen ausgesetzt
worden war: (a) nicht-modifiziert; (b) mit aminofunktionalisiertem
Polysiloxan beschichtet; und (c) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan
beschichtet und mit Heparin gekoppelt. Die Thrombozyten-Hyperaktivität führt zur Freisetzung
der Inhaltsstoffe der α-Granulen,
insbesondere der thrombozytenspezifischen Proteine: β-Thromboglobulin
und Plättchenfaktor
4 (PF4). Diese Thrombozytenaktivierung kann sich aus der Interaktion
mit künstlichen
Oberflächen
ergeben, aber auch gebildetes Thrombin spielt bei der Aktivierung der
Thrombozyten eine wichtige Rolle. PF4 unterstützt wiederum das gebildete
Thrombin bei der Verhinderung der Zusammenlagerung von Heparin mit Antithrombin
III, wodurch es einer wirksamen Inaktivierung des Thrombins im Wege
steht. Es wurde gezeigt, dass die beschichteten Oberflächen weniger stark
thrombozytenaktivierend waren, wie im PF4-Assay gemessen, wobei
die heparinisierte Oberfläche
die thrombozytenfreundlichste Oberfläche war.
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5 zeigt elektronenmikroskopische Bilder blutexponierter
Polyethylenoberflächen:
(a) nicht-modifiziert;
(b) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet; und (c)
mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet und mit Heparin
gekoppelt. Die Thrombozytenadhäsion
ist das erste Ereignis, das bei der Thrombusbildung stattfindet.
Die adhärierenden
Thrombozyten werden prokoagulant, d. h. die äußere Membran dient als ein
Ort, an dem sich die enzymatischen Gerinnungskomplexe zusammensetzen.
In Abwesenheit solcher Oberflächen setzt
sich die Blutgerinnung nicht fort. Daher ist die Thrombozytenadhäsion ein
empfindlicher Parameter bei der Bewertung der thrombogenen Eigenschaften einer
künstlichen
Oberfläche.
Die Thrombozytenadhäsion
wurde durch eine elektronenmikrospkopische Analyse der blutexponierten
Oberflächen
untersucht. Während
die Kontroll-LDPE-Oberfläche
ungefähr
15 % Oberflächenbedeckung
mit Thrombozyten (was weniger als üblich ist) zeigte, mit offenbarer
Gegenwart aktivierter und ausgebreiteter Thrombozyten (5a);
verringerte die aminofunktionalisierte polysiloxanbeschichtete LDPE-Oberfläche die
Thrombozytenadhäsion
in erheblichem Maß:
Es wurde weniger als 1 % Oberflächenbedeckung
beobachtet, ohne erkennbare aktivierte oder ausgebreitete Thrombozyten
(5b). Eine zusätzliche
Kopplung mit Heparin zeigte die gleichen günstigen Ergebnisse (5c).
Die beobachtete Senkung adhärierender Thrombozyten
zeigt, dass die mit heparinisierten Polysiloxan beschichteten Oberflächen weniger
thrombogen sind, was wiederum mit den Befunden der anderen Tests übereinstimmt.
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6 zeigt
ein Diagramm der Bildung von SC5b-9-Komplexen (in ng/ml; n = 3),
nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang
LDPE-Oberflächen
ausgesetzt worden war: (a) nicht-modifiziert; (b) mit aminofunktionalisiertem
Polysiloxan beschichtet; und (c) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan
beschichtet und mit Heparin gekoppelt. Das Komplementsystem umfasst
ungefähr 20
Proteine, die im Blutstrom zirkulieren. Der terminate Komplementkomplex
(TCC) wird durch die Zusammenlagerung von C5 bis C9 infolge der
Aktivierung des Komplementsystems entweder durch den klassischen
oder durch den alternativen Weg gebildet. Der Membranangriffskomplex
(MAC), der eine Form des TCC ist, ist ein stabiler Komplex und vermittelt
den irreversiblen Schaden an den Zielzellmembranen, der mit der
Komplementaktivierung einhergeht. In Abwesenheit einer Zielmembran
gebildete Komplexe binden an ein natürlich vorkommendes S-Protein.
Das S-Protein bindet an die entstehenden C5b-9-Komplexe im C5b-7-Schritt der Zusammenlagerung.
Der SC5b-9-Komplex ist die lösliche, nicht-lytische Form des
TCC. Die Resultate, die erhalten wurden, nachdem Blut den (nicht-)
modifizierten LDPE-Oberflächen
ausgesetzt worden war, zeigen, dass die Oberflächenmodifikation als solche
die Komplementaktivierung verringert hatte; jedoch in erheblich
größerem Maße mit der
zusätzlichen
Heparinkopplung (siehe 6). Diese Ergebnisse sind in Anbetracht
der möglichen
Produktanwendung dieser Beschichtung, z. B. in kardiopulmonären Bypass-Systemen, als sehr
günstig
anzusehen.
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7 zeigt
ein Diagramm der PMN-Elastase-Bildung (in ng/ml), nachdem heparinisiertes
(1 l U/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang verschiedenen behandelten
und unbehandelten LDPE-Oberflächen
ausgesetzt worden war: (a) nicht-modifiziert; (b) mit aminofunktionalisiertem
Polysiloxan beschichtet; und (c) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan
beschichtet und mit Heparin gekoppelt. Elastase, eine neutrale Proteinase,
die in peripheren Granulozyten enthalten ist, ist ein weiterer Marker,
der mit der materialbezogenen entzündlichen Antwort in einem engen
Verhältnis
steht. Es ist bekannt, dass eine starke und andauernde entzündliche
Reaktion einen Anstieg der stationären mRNA-Spiegel für IL-1,
TNF und bestimmte andere Zytokine in den peripheren Blutmonozyten
auslöst,
was potentiell zum Versagen entfernter Organe oder sogar zum Tode
führen
kann. In diesem Hinblick ist die beobachtete Senkung der Elastase-Bildung bei den MDX-Oberflächen einschließlich der
heparinisierten MDX-Oberflächen
als sehr günstig
anzusehen (7).