DE69934312T2

DE69934312T2 - Verfahren zur reinigung von hämoglobin

Info

Publication number: DE69934312T2
Application number: DE69934312T
Authority: DE
Inventors: A. Robert Milford HOUTCHENS; W. Carl Medford RAUSCH
Original assignee: Biopure Corp
Current assignee: Biopure Corp
Priority date: 1998-07-10
Filing date: 1999-06-21
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2019-06-22
Also published as: HK1037643A1; DK1097171T3; ATE347564T1; AU755280B2; DE69934312D1; CN1166689C; WO2000002921A1; JP4581110B2; EP1097171A1; CA2336808C; CA2336808A1; AU4700399A; ES2278450T3; JP2002520338A; EP1097171B1; CN1308636A; US6150507A; NZ509257A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es besteht ein Bedarf nach einem Blutersatzmittel zur Behandlung oder Verhinderung von Sauerstoffmangel, der von einem Blutverlust (z.B. bei einer akuten Blutung oder während chirurgischer Operationen), von einer Anämie (z.B. perniziöser Anämie oder Sichelzellenanämie) oder von einem Schock (z.B. einem Schock infolge eines Volumenverlustes, einem anaphylaktischen Schock, septischen Schock oder allergischen Schock) herrührt. Die Verwendung von Blut und Blutfraktionen in ihrer Eigenschaft als Blutersatzmittel ist voller Nachteile. Der Einsatz von Vollblut geht z.B. oft mit dem Risiko einer Übertragung von Hepatitis erzeugenden Viren und AIDS erzeugenden Viren einher, was die Genesung eines Patienten komplizieren oder beim Patienten zu einem tödlichen Verlauf führen kann. Zusätzlich erfordert der Einsatz von Vollblut die Bestimmung der Blutgruppen sowie die Durchführung von Kreuzproben, um immunohämatologische Probleme und eine Unverträglichkeit unter den Spendern zu vermeiden.
Menschliches Hämoglobin als Blutersatz verfügt über eine osmotische Aktivität und die Fähigkeit, Sauerstoff zu transportieren und zu übertragen, aber es weist den Nachteil einer schnellen Eliminierung aus dem Blutkreislauf über den Nierenweg und über die Gefäßwände auf, was zu einer sehr kurzen und daher typischerweise unbefriedigenden Halbwertszeit führt. Menschliches Hämoglobin ist darüber hinaus häufig mit toxischen Mengen an Endotoxinen, Bakterien und/oder Viren verunreinigt.
Nicht menschliches Hämoglobin weist dieselben Mängel wie menschliches Hämoglobin auf. Darüber hinaus ist Hämoglobin aus nicht menschlichen Quellen auch typischerweise mit Proteinen wie z.B. Antikörpern verunreinigt, was beim Empfänger eine Antwort des Immunsystems auslösen könnte.
Früher sind mindestens vier andere Arten von Blutersatzmitteln eingesetzt worden, nämlich Perfluorchemikalien, synthetisierte Hämoglobinanaloge, in Liposomen verkapseltes Hämoglobin und chemisch modifiziertes Hämoglobin. Viele dieser Blutersatzmittel wiesen jedoch typischerweise kurze intravaskuläre Verweilzeiten auf, wurden vom Kreislaufsystem als Fremdsubstanzen entfernt oder setzten sich in der Leber, der Milz oder anderen Geweben ab. Viele dieser Blutersatzmittel waren auch mit lebenden Systemen biologisch inkompatibel.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft, wie in den Ansprüchen 1–10 beansprucht, ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Hämoglobin-Produkts.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren Das Laden einer Hämoglobin-Lösung auf eine Anionenaustauscher-Chromatographiesäule. In die Säule wird mindestens eine Tris(hydroxymethyl)aminomethanacetat-Pufferlösung injiziert, wobei diese Pufferlösung einen pH-Wert aufweist, der niedriger als derjenige der Säule ist, wodurch ein gereinigtes Hämoglobin-Produkt von der Säule eluiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Hämoglobin-Lösung auf eine Anionenaustauscher-Säule geladen, wobei die Säule am Anfang auf einen pH-Wert über etwa 8,7 äquilibriert wurde. Sodann wird mindestens eine Pufferlösung in die Säule injiziert, wobei die Pufferlösung einen pH-Wert aufweist, der niedriger ist als etwa 8,6, wodurch ein ge- reinigtes Hämoglobin-Produkt von der Säule eluiert wird.
Noch eine andere bevorzugte Ausführungsform umfasst das Laden der Hämoglobin-Lösung auf eine Anionenaustauscher-Säule. Sodann werden mindestens elf Säulenhohlraumvolumina der äquilibrierenden Pufferlösung mit einem pH-Wert im Bereich zwischen etwa 8,2 und etwa 8,6 in die Saule injiziert. Dann wird eine Pufferlösung mit einem pH-Wert unter dem der äquilibrierenden Pufferlösung in die Säule injiziert, wodurch ein gereinigtes Hämoglobin-Produkt von der Säule eluiert wird.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Hämoglobin-Lösung auf eine Anionenaustauscher-Chromatographiesäule aufgetragen, die am Anfang auf einen pH-Wert über etwa 8,7 kalibriert worden ist. Mindestens elf Säulenhohlraumvolumina einer äquilibrierenden Pufferlösung aus Tris(hydroxymethyl)aminomethanacetat mit einem pH im Bereich zwischen etwa 8,2 und etwa 8,6 werden sodann in die Säule injiziert. Eine Pufferlösung aus Tris(hydroxymethyl)aminomethanacetat mit einem pH unter etwa 8,2 werden sodann in die Säule injiziert, wodurch die gereinigte Hämoglobin-Lösung von der Säule eluiert wird.
Mit dem Verfahren dieser Erfindung wird vorteilhafterweise ein Hämoglobin-Produkt erhalten, das im Wesentlichen selbst frei von recalcitranten Proteinmaterialien wie Kohlensäureanhydrase ist. Mit dem Verfahren lässt sich auch eine relativ hohe Ausbeute an Hämoglobin aus einer Lösung erhalten, die viele Verunreinigungen enthält. Somit kann das von einer Spezies stammende Hämoglobin erfolgreich in einer davon verschiedenen Spezies als Blutersatz eingesetzt werden, ohne dass die Empfangerspezies unter signifikanten Nebenwirkungen leidet.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Einzelheiten und weitere Details des Verfahrens der Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die anhängenden Zeichnungen und Ausführungen in den Ansprüchen ausführlicher beschrieben. Selbstverständlich dienen die besonderen Ausführungsformen der Erfindung nur der Veranschaulichung und sollen die Erfindung nicht einschränken. Die prinzipiellen Merkmale dieser Erfindung lassen sich in verschiedenen Ausführungsformen verwenden, ohne dass vom Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung abgewichen wird.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Hämoglobin-Produkts, das im Wesentlichen frei von anderen Blutprotein-Bestandteilen und Verunreinigungen ist, indem eine chromatographische Säule verwendet wird. Das Verfahren ist dadurch charakterisiert, dass ein pH-Gradient verwendet wird, um die Hämoglobin-Komponente zu eluieren.
Eine durch Zerstörung, Fraktionierung und/oder Ultrafiltration von roten Blutzellen erhaltene konzentrierte Hb-Lösung wird auf eine oder mehrere parallel angeordnete Chromatographiesäulen aufgetragen, um das Hämoglobin weiter mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie von anderen verunreinigenden Stoffen wie Antikörper. Endo toxinen, Phospholipiden, Enzymen (wie z.B. der Kohlensäureanhydrase), Viren und übertragbaren spongiformen Enzephalopathie-Mitteln abzutrennen. Die Chromatographiesäule enthält ein zur Abtrennung von Hb von Nicht-Hämoglobin-Proteinen geeignetes Anionenaustauscher-Medium. Geeignete Anionenaustauscher-Medien umfassen z.B. Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Titandioxid, vernetztes Dextran, Agarose oder einen derivatisierten Anteil wie z.B. Polyacrylamid, ein Polyhydroxyethymethacrylat oder ein Styroldivinylbenzol, das mit einem kationischen chemischen funktionellen Rest wie z.B. Diethylaminoethyl oder einer quartären Aminoethylgruppe vernetzt worden ist. Ein geeignetes Anionenaustauscher-Medium und entsprechende Elutionsmittel für die selektive Absorption und Desorption von Hb im Vergleich mit anderen Proteinen und Verunreinigungen, die sich wahrscheinlich in einer lysierten RBC-Phase befinden, lassen sich leicht von einem Fachmann bestimmen.
In einer bevorzugteren Ausführungsform wird ein Verfahren eingesetzt, um ein Anionenaustauscher-Medium aus Siliciumdioxid zu bilden, das hydrothermisch behandelt wird, um die Porengröße zu erhöhen, γ-Glycidoxypropylsilan ausgesetzt wird, um aktive Epoxid-Gruppen zu bilden und danach C₃H₇(CH₃)₂NCl ausgesetzt wird, um ein Anionenaustauscher-Medium mit quartärem Ammonium zu bilden. Dieses Verfahren wird im Journal of Chromatography, 120: 321–333 (1976) beschrieben, das hiermit vollständig als Referenz eingeführt wird. In einer Ausführungsform wird oder werden die Chromatographiesäule oder -säulen zunächst auf ein pH von über ca. 8,7 äquilibriert. Vorzugsweise wird die Chromatographiesäule auf ein pH im Bereich zwischen etwa 8,7 und etwa 10,0 äquilibriert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt das pH der Äquilibrierung in einem Bereich zwischen etwa 8,7 und etwa 9,3 und am meisten bevorzugt in einem Bereich zwischen etwa 8,9 und etwa 9,1. Der zur anfänglichen Äquilibrierung der Säule eingesetzte Puffer ist vorzugsweise Tris(hydroxymezhyl)aminomethanacetat (Tris-acetat) und hat eine Konzentration von etwa ca. 20 mMol/Liter (mM/l).
Eine Hämoglobin-Lösung, die vorzugsweise gegen gereinigtes Wasser (U.S.P.) dialysiert worden ist und ebenfalls vorzugsweise eine Leitfähigkeit von 280 μS/cm und ein pH zwischen ca. 6,75 und ca. 7,75 aufweist, wird sodann in das Medium auf der Säule injiziert, um dadurch die Säule mit Hämoglobin zu laden. Die Konzentration der Hämoglobin-Lösung, die auf die Säule aufgetragen wird, weist typischerweise eine Konzentration im Bereich von ca. 90 bis ca. 200 Gramm/Liter auf. Vorzugsweise liegt die Konzentration der Hämoglobin-Lösung in einem Bereich zwischen ca. 90 und ca. 110 Gramm/Liter. Vorzugsweise wird nach dem Injizieren der konzentrierten Hb-Lösung die Chromatographiesäule etwa zehn Minuten lang mit dem Tris-acetat gewaschen (4 Säulenhohlraumvolumina), um Nicht-Hämoglobin-Komponenten, welche nicht an die Medien binden zu eluieren und um die starke Bindung von Hämoglobin an die Medien zu erleichtern.
In der Chromatographiesäule wird ein pH-Gradient verwendet, um verunreinigende Proteine wie das Enzym Kohlensäureanhydrase, Phospholipide, Antikörper und Endotoxine vom Hämoglobin abzutrennen. Der pH-Gradient kann ein kontinuierlicher Gradient oder ein schrittweiser Gradient sein. Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten werden nacheinander in die Säule injiziert, um einen pH-Gradienten des Eluats über die Zeit zu erzeugen. Es ist bevorzugt, dass die Puffer vor ihrer Injektion gefiltert werden, z.B. mit einer geeigneten Depyrogenierungsmembran von 10.000 Dalton. Die Pufferlösungen sollten monovalente Puffer sein, die eine niedrige Ionenstärke aufweisen, so dass die Elution des Hb und der verunreinigenden Nicht-Hämoglobin-Komponenten im Allgemeinen vom pH abhängen und nicht signifikant von der Ionenstärke. Typischerweise weisen Puffer mit einer Ionenkonzentration von ca. 50 mM oder darunter geeignete Ionenstärken auf.
Vorzugsweise werden die kontaminierenden Stoffe und die Hämoglobin-Lösung durch Elution von der Säule in einem schrittweisen Gradienten aufgetrennt, wobei ein Puffer eingesetzt wird, der ein pH zwischen dem, bei welchem das Hämoglobin auf die Säule aufgetragen wird und dem pH, bei welchem das Hb am Ende aus der Säule eluiert wird. In einer Ausführungsform umfasst der schrittweise Gradient die Injektion einer geeigneten Pufferlösung in die Säule. Die Pufferlösung weist ein pH auf, das unter dem pH der Säule zu dem Zeitpunkt liegt, wo die Säule am Anfang mit Hämoglobin beschicht wurde. Die Säule wird mit der Pufferlösung äquilibriert. Vorzugsweise werden mindestens etwa sechs Säulenvolumina der Pufferlösung in die Säule injiziert. Ein wie hier definiertes "Säulenvolumen" ist das Volumen der Säule ohne jegliches Packungsmaterial. Typischerweise bewirken geeignete Säulenpackungen, d.h. Austauschermedien, zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, dass die Säule einen Porenanteil von etwa 0,525 des Gesamtvolumens der Säule aufweist. Sechs Säulenvolumina sind daher äquivalent zu etwa 11,7 "Säulenhohlraumvolumina". Im Allgemeinen werden mindestens ca. 11 Säulenhohlraumvolumina an Pufferlösung in die Säule injiziert.
Vorzugsweise liegt das pH der Pufferlösung unter ca. 8,6. Mehr bevorzugt liegt das pH der Pufferlösung in einem Bereich zwischen ca. 8,2 und ca. 8,4. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Pufferlösung Tris(hydroxymethyl)aminomethanacetat (Tris-Acetat). Die kontaminierenden Stoffe der Hämoglobin-Lösung werden auf diese Weise durch Äquilibrieren der Säule aus der Säule eluiert.
Danach wird zur Elution des Hb ein Puffer in die Säule injiziert. Die Pufferlösung besteht vorzugsweise aus Tris(hydruxymethyk)aminomethanacetat. Mehr bevorzugt weist die Tris-acetat-Lösung ein pH im Bereich von ca. 6,5 und ca. 7,5 auf. Das Hb-Eluat ist das gereinigte Hämoglobin-Produkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden sie ersten 3% bis 4% des Hb-Eluats und die letzten 3% bis 4% des Hb-Eluats verworfen, um für die Gewährleistung der Reinheit des Hb-Eluats zu sorgen. Es ist bevorzugt, dass das Hb-Eluat durch einen Sterilfilter geschickt wird. Geeignete Sterilfilter umfassen 0,22 μm Filter wie z.B. einen Sartobran Cat# 5232507 G1PH-Filter von Sartorius.
Da die Chromatographiesäulen wieder verwendet werden sollen, werden die in der Säule verbliebenen kontaminierenden Nicht-Hämoglobin-Proteine und das Endotoxin sodann mit Hilfe eines vierten Puffers eluiert. Ein Beispiel für eine geeignete Pufferlösung ist eine NaCl/Tris-acetat-Lösung (Konzentrationen ca. 1,0 M NaCl und ca. 20 mM Tris-acetat; pH ca. 8,4 bis ca. 9,4, vorzugsweise ca. 8,9 bis ca. 9,1). In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform bestehen alle Pufferlösungen aus Tris(hydroxynethyl)aminomethan-acetat. Typischerweise weisen die benutzten Pufferlösungen eine Temperatur in einem Bereich zwischen ca. 0°C und ca. 50°C auf. Vorzugsweise ist die Puffertemperatur während des Gebrauchs ca. 12,4 ! 1,0°C. Darüber hinaus werden die Puffer typischerweise bei einer Temperatur in einem Bereich zwischen ca. 9°C und ca. 11°C aufbewahrt.
Der hier verwendete Ausdruck Blutersatz ist eine auf Hämoglobin basierende, Sauerstoff tragende Zusammensetzung zur Verwendung Bei Menschen, Säugern und anderen Vertebraten, welche mindestens in der Lage ist, Sauerstoff zu lebenswichtigen Organen und Geweben zu transportieren und zu übertragen und in den Gefäßen einen ausreichenden onkotischen Druck aufrechtzuerhalten. Ein Vertebrat entspricht der klassischen Definition und umfasst Menschen oder jedes andere Wirbeltier, das Blut in einem Kreislaufsystem dazu benutzt, um Sauerstoff an ein Gewebe zu übertragen. Zusätzlich entspricht ein Kreislaufsystem der klassischen Definition und besteht aus dem Herzen, Arterien, Venen und einem Minikreislauf mit kleineren Gefäßstrukturen wie z.B. Kapillaren.
Ein nach dem Verfahren der Erfindung gebildetes Blutersatzmittel wird nach einer Ausführungsform der Erfindung hergestellt und muss über gewisse Mengen an Endotoxinen, Phospholipiden, Fremdproteinen und anderen kontaminieren Stoffen verfügen, welche zu keiner signifikanten Antwort des Immunsystems führen und welche für den Empfänger nicht toxisch sind. Ein Blutersatzmittel ist vorzugsweise ultrarein. Der hier verwendete Ausdruck "ultrarein" bedeutet, dass weniger als 0,5 EE/ml Endotoxin, weniger als 3,3 nM/ml Phospholipide und geringe bis nicht nachweisbare Mengen an Nicht-Hämoglobin-Proteinen wie z.B. Serumalbumin oder Antikörper enthalten sind.
Der Ausdruck "Endotoxin" bezieht sich auf zellgebundene Lipopolysaccharide, welche als ein Teil der Außenschicht der Zellwände von gram-negativen Bakterien produziert werden, die unter vielen Bedingungen toxisch sind. Endotoxine können Fieber, Diarrhö, hämorrhagischen Schock und andere Gewebsschäden verursachen, wenn sie in Tiere injiziert werden. Eine Endotoxin-Einheit (EE) ist von der United States Pharmacopeial Convention of 1983, Seite 3014 als die Aktivität definiert worden, welche in 0,1 Nanogramm des US Reference Standards tot EC-5 enthalten sind. Eine Phiole EC-5 enthält 10.000 EE. Beispiele für geeignete Mittel zur Bestimmung von Endotoxin-Konzentrationen in einem Blutersatzmittel umfassen das von Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachusetts entwickelte Verfahren "Kinetic/Turbidimetric Limuus Amebocytic Lystate (LAL) 5000 Methodology".
Der hier verwendete Ausdruck "stabiles polymerisiertes Hämoglobin" bezieht sich auf eine auf Hämoglobin basierende Sauerstoff tragende Zusammensetzung, welche in ihrer Molekulargewichtsverteilung und/oder in ihrem Methämoglobin-Gehalt während ihrer Lagerungszeiten bei geeigneten Lagerungstemperaturen über Zeiträume von zwei Jahren oder mehr und vorzugsweise bei Lagerung in einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt über Zeiträume von zwei Jahren oder mehr im Wesentlichen nicht zu- oder abnimmt. Geeignete Lagerungstemperaturen für eine Lagerung von einem Jahr oder mehr liegen zwischen etwa 0°C und etwa 40°C. Der bevorzugte Bereich für die Lagerungstemperatur liegt zwischen ca. 0°C und ca. 25°C.
Eine geeignete Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt oder eine Umgebung, die im Wesentlichen frei von Sauerstoff ist, wird definiert als die Gesamtmenge an Sauerstoff in Kontakt mit dem Blutersatzmittel über einen Lagerzeitraum von mindestens ca. zwei Monaten, vorzugsweise von mindestens ca. einem Jahr oder mehr bevorzugt von mindestens ca. zwei Jahren, was im Bluteratzmittel zu einer Konzentration an Methämoglobin von weniger als ca. 15 Gew.-% führt. Die Gesamtmenge an Sauerstoff umfasst das Eindringen von Sauerstoff in die Verpackung des Blutersatzmittels sowie den ursprünglichen Sauerstoff-Gehalt des Blutersatzmittels und der Verpackung.
Durch das ganze Verfahren hindurch, vom Sammeln der roten Blutzellen (RBC) bis zur Polymerisation des Hämoglobins, werden die Blutlösung, die RBCs und das Hämoglobin unter Bedingungen gehalten, die genügen, das mikrobielle Wachstum oder die biologische Belastung möglichst klein zu halten, wie z.B. das Halten der Temperatur bei weniger als etwa 20°C und über 0°C. Die Temperatur wir vorzugsweise bei ca. 15°C oder darunter gehalten. Mehr bevorzugt wird die Temperatur bei 10° ! 2°C gehalten.
In diesem Verfahren werden Anteile der Komponenten für das Verfahren zur Herstellung eines Blutersatzmittels aus stabilem polymerisiertem Hämoglobin ausreichend keimfrei gemacht, um ein steriles Produkt herzustellen. Steril entspricht der Definition im Stand der Technik und speziell, dass die Lösung den in USP XXII, Sektion 71, Seiten 1483–1488 wiedergegebenen Anforderungen der United States Pharmacopeia für Sterilität genügt. Ferner werden Anteile von Komponenten, die dem Strom des Verfahrens ausgesetzt sind, gewöhnlich mit einem Material gefertigt oder umhüllt, das nicht mit dem Verfahrensstrom reagiert oder ihn kontaminiert. Derartige Materialien können rostfreien Stahl und andere Stahllegierungen wie Inconel umfassen.
Geeignete Quellen für RBCs umfassen Menschenblut, Rinderblut, Schafsblut, Schweineblut, Blut von anderen Wirbeltieren sowie transgen hergestelltes Hämoglobin, wie z.B. das in BIO/TECHNOLOGY, 12: 55–59 (1994) beschriebene transgene Hb.
Das Blut kann von lebenden oder frisch geschlachteten Spendern gesammelt werden. Ein Verfahren zum Sammeln von Rindervollblut wird in den an Rauch et al. erteilten US- Patenten 5,084,558 und 5,296,465 beschrieben. Es ist bevorzugt, dass das Blut auf hygienische Weise gesammelt wird.
Beim oder bald nach dem Sammeln wird das Blut mit mindestens eine Antikoagulans vermischt, um eine signifikante Verklumpung des Blutes zu vermeiden. Geeignete Antikoagulantien für Blut sind die klassisch im Stand der Technik bekannten und umfassen z.B. Natriumcitrat, Ethylendiamintetraessigsäure und Heparin. Wenn das Antikoagulans mit Blut vermischt wird, kann es in fester Form wie z.B. als Pulver oder in wässriger Lösung vorliegen.
Selbstverständlich kann die Quelle für die Blutlösung eine frisch gesammelte Probe uder eine alte Probe sein, wie z.B. verfallenes menschliches Blut aus einer Blutbank. Ferner könnte die Blutlösung zuvor in gefrorenem und/oder flüssigem Zustand gehalten worden sein. Es ist bevorzugt, dass die Blutlösung vor ihrer Verwendung in diesem Verfahren nicht eingefroren wird.
In einer anderen Ausführungsform wird die Blutlösung vor ihrer Einführung in Antikoagulantien auf ihren Antibiotika-Spiegel hin untersucht. Die Antibiotika-Spiegel werden ermittelt, um für einen gewissen Grad an Gewährleistung zu sorgen, dass die Blutprobe nicht mit einem infizierenden Organismus belastet ist, indem festgestellt wird, dass der Spender der Blutprobe nicht mit einem Antibiotikum behandelt wurde. Die Beispiele für geeignete Assays für Antibiotika umfassen einen Penicillin-Assay-Kit (Difco, Detroit, Mn, in welchem ein Verfahren mit dem Titel "Rapid Detection of Penicillin in Milk" Verwendung findet. Es ist bevorzugt, dass die Blutlösungen einen Penicillin-Spiegel von kleiner oder gleich ca. 0,008 Einheiten/ml aufweisen. Alternativ kann ein Programm zur Haltung von Herden eingesetzt werden, um das Fehlen von Krankheiten in oder eine Antibiotika-Behandlung bei dem Vieh anzuzeigen.
Vorzugsweise wird die Blutlösung vor oder während des Antikoagulierungsschritts z.B. mittels einer Filtration gefiltert, um große Aggregate und Teilchen zu entfernen. Ein Sieb von 600 Mesh stellt z.B. einen geeigneten Filter dar.
Die RBCs in der Blutlösung werden sodann mit Hilfe geeigneter Mittel gewaschen, wie z.B. mittels Diafiltration oder mittels einer Kombination von diskreten Verdünnungs- und Konzentrierungsschritten mit mindestens einer Lösung wie z.B. einer isotonischen Lösung, um die RBCs von extrazellulären Plasmaproteinen wie Serumalbumin oder Antikörpern (z.B. Immunglobulinen (IgG)) abzutrennen. Selbstverständlich können die RBCs batchweise oder unter kontinuierlicher Zugabe der Waschlösung gewaschen werden.
Brauchbare isotonische Lösungen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen Lösungen wie z.B. eine Citrat/Saline-Lösung mit einem pH und einer Osmolarität, welche die Zellmemebranen der RBCs nicht aufbricht und welche den Plasmaanteil des Vollbluts ersetzt. Eine bevorzugte isotonische Lösung weist ein neutrales pH und eine Osmolarität von etwa 285–315 mOsm auf. In einer bevorzugten Ausführungsform setzt sich die isotonische Lösung aus einer wässrigen Lösung aus Natriumcitrat-Dihydrat (6,0 g/l) und Natriumchlorid (8,0 g/l) zusammen.
Wässer, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden können, umfassen destilliertes Wasser, entionisiertes Wasser, Wasser für Injektionszwecke (WFI) und/oder Wasser mit niedrigem Pyrogengehalt (LPW). WFI, das bevorzugt ist, ist entionisiertes destilliertes Wasser, das den US Pharmacological Specifications für Wasser zu Injektionszwecken genügt. WFI wird ferner in Pharmaceutical Engineering, 11: 15–23 (1991) beschrieben. LPW, das bevorzugt ist, ist entionisiertes Wasser mit weniger als 0,002 EE/ml.
Es ist bevorzugt, dass die isotonische Lösung vor ihrer Zugabe zur Blutlösung gefiltert wird. Beispiele für geeignete Filter sind eine Millipore-Ultrafiltrationsmembran für 10.000 Dalton, wie z.B. ein Cat # CDUF 050 G1-Filter von Mollipore oder die Hohlfaser (Cat # UPF-10-C-85) für 10.000 Dalton von A/G Technology.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die RBCs in der Blutlösung mittels Diafiltration gewaschen. Geeignete Diafilter sind mikroporöse Membranen mit Porengrößen, welche die RBCs von wesentlich kleineren Komponenten in der Blutlösung abtrennen, wie z.B. ein Filter von 0,1 bis 0,5 μm (z.B. ein 0,2 μm Hohlfaserfilter, Microgon Krosflo II Mikrofiltrationskartusche). Gleichzeitig wird eine filtrierte isotonische Lösung kontinuierlich (oder batchweise) als Makeup mit einer Rate zugesetzt, die gleich der Rate (oder dem Volumen) des durch den Diafilter verlorenen Filtrats ist. Während des Waschens der RBCs treten die Komponenten der Blutlösung, die im Durchmesser signifikant kleiner sind als die RBCs oder die Flüssigkeiten wie z.B. das Plasma sind durch die Wände des Diafilters hindurch in das Filtrat. Die RBCs, die Blutplättchen und die größeren Körper der verdünnten Blutlösung, wie z.B. die weißen Blutkörperchen, werden zurückgehalten und mit isotonischer Lösung vermischt, die kontinuierlich oder batchweise zugesetzt wird, um eine dialysierte Blutlösung zu bilden.
In einer bevorzugteren Ausführungsform wird das Volumen der Blutlösung im Diafiltrationsbehälter anfangs durch Zusatz eines Volumens einer gefilterten isotonischen Lösung zum Diafiltrationsbehälter verdünnt. Vorzugsweise ist das Volumen der zugesetzten isotonischen Lösung gleich dem Anfangsvolumen der Blutlösung.
In einer alterntiven Ausführungsform werden die RBCs durch eine Reihe aufeinander folgender (oder umgekehrt aufeinander folgender) Verdünnungs- und Konzentrierungsschritte gewaschen, wobei die Blutlösung durch Zugabe von mindestens einer isotonischen Lösung verdünnt und durch das Fließen durch einen Filter aufkonzentriert wird, wodurch eine dialysierte Blutlösung gebildet wird.
Das Waschen der RBCs ist fertig, wenn der Gehalt an die RBCs kontaminierenden Plasmaproteinen beträchtlich verringert ist (typischerweise um mindestens ca. 90%). Typischerweise ist das Waschen der RBCs fertig, wenn das Volumen des aus dem Diafilter 34 geflossenen Filtrats etwa gleich 300% oder mehr des Volumens der im Diafiltrationsbehälter vor dem Verdünnen der Blutlösung mit filtrierter isotonische Lösung enthaltenen Blutlösung ist. Ein zusätzliches Waschen der RBCs kann extrazelluläre Plasmaproteine von den RBCs weiter abtrennen. Beispielsweise kann eine Diafiltration mit 6 Volumen isotonischer Lösung mindestens etwa 99% der IgG aus der Blutlösung entfernen.
Die dialysierte Blutlösung wird sodann Mitteln wie z.B. einer Zentrifugation ausgesetzt, um die RBCs in der dialydierten Blutlösung von den weißen Blutkörperchen und den Blutplättchen abzutrennen.
Selbstverständlich lassen sich auch andere im Stand der Technik allgemein bekannte Verfahren zur Abtrennung der RBCs von den anderen Komponenten des Blutes einsetzen. Z.B. eine Sedimentation, bei welcher das Trennungsverfahren vor der Abtrennung der RBCs von den anderen Blutbestandteilen die Zellmembranen einer signifikanten Menge von RBCs, wie z.B. weniger als etwa 30% der RBCs, nicht aufreißt.
Nach Abtrennung der RBCs werden die RBCs mit einem Mittel zur Lyse von RBCs lysiert, um zur Bildung einer Hämoglobin enthaltenden Lösung aus den RBCs Hämoglobin freizusetzen, Lyse bedeutet, dass man verschiedene Lyseverfahren wie eine mechanische Lyse, eine chemische Lyse, eine hypotonische Lyse oder andere bekannte Lyseverfahren einsetzen kann, welche Hämoglobin freisetzen, ohne die Fähigkeit des Hb zum Transport und der Freigabe von Sauerstoff signifikant zu schädigen.
In noch einer anderen Ausführungsform kann rekombinant produziertes Hämoglobin wie das rekombinant produzierte Hämoglobin, das in Nature, 356: 258–260 (1992) beschrieben wird, in dem Verfahren der Erfindung an Stelle der RBCs weiterverarbeitet werden. Die das Hämoglobin enthaltenden Bakterienzellen werden gewaschen und wie oben beschrieben von den kontaminierenden Stoffen abgetrennt. Diese Bakterienzellen werden dann mit im Stand der Technik bekannten Mitteln wie z.B. einer Kugelmühle mechanisch aufgebrochen, u, Hb aus den Zellen freizusetzen und eine lysierte Zellphase zu bilden. Diese lysierte Zellphase wird dann wie die lysierte RBC-Phase weiterbehandelt.
Nach der Lyse wird die lysierte RBC-Phase ultrafiltriert, um größere Zelltrümmer wie Proteine mit einem Molekulargewicht über etwa 100.000 zu entfernen. Im Allgemeinen umfassen die Zelltrümmer alle ganzen und fragmentierten Zellbestandteilemit Ausnahme von Hb, kleineren Zellproteinen, Elektrolyten, Coenzymen und organischen Stoffwechsel-Zwischenprodukten. Brauchbare Ultrafilter umfassen z.B. 100.000 Dalton Filter, die von Millipore (Cat # CDUF 050 H1) und von A/G Technology (Needham, MA.; Modell-Nr. UPF100E55) hergestellt werden.
Es ist bevorzugt, dass die Ultrafiltration fortgeführt wird, bis die Konzentration an Hb in der lysierten RBC-Phase unter 8 Gramm/Liter (g/l) zu liegen kommt, um die Ausbeute an für die Polymerisation verfügbarem Hb zu maximieren. Andere Verfahren zur Abtrennung von Hb aus der lysierten RBC-Phase können verwendet werden, einschließlich eine Sedimentation, Zentrifugation oder Mikrofiltration.
Das Hb-Ultrafiltrat kann dann ultrafiltriert werden, um kleinere Zelltrümmer wie z.B. Elektrolyte, Coenzyme, Stoffwechselzwischenprodukte und Proteine mit einem Molekulargewicht unter etwa 30.000 Dalton sowie Wasser aus dem Hb-Ultrafiltrat zu entfernen. Ge eignete Ultrafilter sind ein 30.000 Dalton Ultrafilter (Millipore Cat # CDUF 050 T1 und/oder Amicon # 540 430).
Die konzentrierte Hb-Lösung kann dann, wie oben genauer beschrieben, auf eine oder mehrere parallel angeordnete aufgetragen werden.
Das aus dem Chromatographieschritt erhaltene Hb-Eluat wird dann vor seine Polymerisation zu Bildung einer deoxygenierten Hb-Lösung (im Folgenden als Deoxy-HB bezeichnet), mit Mitteln vorzugsweise deoxygeniert, ohne dass die Fähigkeit des Hb in dem Hb-Eluat signifikant beeinträchtigt wird, Sauerstoff zu transportieren und freizusetzen, wie es bei einer Denaturierung oder Bildung von oxidiertem Hb (Met-Hb) der Fall wäre.
In einer Ausführungsform wird das Hb-Eluat mittels Transfer eines inerten Gases über eine Phasenmembran deoxygeniert. Derartige Inertgase umfassen z.B. Stickstoff, Argon und Helium. Selbstverständlich können auch andere im Stand der Technik bekannte Mittel zur Deoxygenierung einer Hb-Lösung zur Deoxygenierung des Hb-Eluats verwendet werden. Solche anderen Mittel können z.B. das Durchblasen des Hb-Eluats mit Stickstoff, ein chemisches Reinigen mit Reduktionsmitteln wie N-Acetyl-L-cystein (NAC), Cystein, Natriumdithionit oder Ascorbat oder eine Photolyse mit Licht sein.
Nach der Elution aus der Chromatographiesäule wird das Hb-Eluat vorzugsweise aufkonzentriert, um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern. Das Hb-Eluat wird zum Aufkonzentrieren des Hb-Eluats durch ein Ultrafilter umgewälzt, um eine konzentrierte Hb-Lösung zu bilden. Geeignete Ultrafilter umfassen z.B. Ultrafilter für 30.000 oder weniger Dalton (z.B. Millipore Helcon, Cat # CDUF050G1 oder Amicon Cat # 540430). Typischerweise ist das Aufkonzentrieren des Hb-Eluats fertig, wenn die Konzentration des Hb zwischen etwa 100 bis etwa 120 g/l liegt. Beim Aufkonzentrieren des Hb-Eluats wird die Temperatur des Hb-Eluats bei etwa 8–12°C gehalten.
Ein Puffer wird dann in die Hb-Lösung eingeleitet, die vorzugsweise konzentriert ist, um zur Steigerung der Hb-Deoxygenierung die Ionenstärke der Hb-Lösung einzustellen. Es ist bevorzugt, dass die Ionenstärke zwischen etwa 1501 meq/l und ca. 200 meq/l eingestellt wird, um die Sauerstoff-Affinität des Hb in der Hb-Lösung herabzusetzen. Geeignete Puffer umfassen Puffer mit einem pH, der nicht zu einer signifikanten Denaturierung des Hb- Proteins führt, sondern über eine ausreichende Ionenstärke verfügt, um die Hb-Deoxygenierung voranzutreiben. Beispiele für geeignete Puffer sind Saline-Lösungen mit einem pH-Bereich von etwa 6,5 bis etwa 8,9. Ein bevorzugter Puffer ist eine 1,0 M NaCl-, 20 mM Tris-acetat-Lösung mit einem pH von ca. 8,9.
Die erhaltene gepufferte Hb-Lösung wird sodann zur erneuten Aufkonzentrierung der Hb-Lösung vorzugsweise durch den Ultrafilter umgewälzt, um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Aufkonzentrieren beendet, wenn die Konzentration des Hb ca. 100 g/l bis ca. 120 g/l beträgt.
Während der Deoxygenierung wird die Hb-Lösung durch eine geeignete Phasentransfermembran umgewälzt. Geeignete Phasentransfermembranen sind z.B. ein Mikrofilter aus einer 0,05 μm Polypropylen-Hohlfaser (z.B. Hoechst-Celanese Cat # SPCM-107). Gleichzeitig wird ein Gegenstrom eines Inertgases über die Phasentransfermembran geleitet. Geeignete Inertgase sind z.B. Stickstoff, Argon und Helium. Der Gasaustausch über die Phasentransfermembran strippt dabei Sauerstoff aus der Hb-Lösung.
Mit der Deoxygenierung wird fortgefahren bis der pO₂ der Hb-Lösung auf ein Niveau reduziert ist, bei welchem der Gehalt an oxygeniertem Hb (Oxyhämoglobin oder HbO₂) in der Hb-Lösung ungefähr 20% oder weniger ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Gehalt an HbO₂ in der Hb-Lösung etwa 10% oder weniger.
Während der Deoxygenierung wird die Temperatur der Hb-Lösung typischerweise bei einem Wert gehalten, bei dem die Deoxygenierungsrate gegenüber der Rate für den Methämoglobingehalt im Gleichgewicht gehalten wird. Die Temperatur wird aufrechterhalten, um den Gehalt an Methämoglobin auf unter 20% zu drücken. Bei einem Gehalt von Methämoglobin unter ca. 5% und vorzugsweise unter ca. 2,5% erhält man eine optimale Temperatur, während die Hb-Lösung immer noch deoxygeniert wird. Typischerweise wird die Temperatur der Hb-Lösung während der Deoxygenierung zwischen etwa 19°C und etwa 31!C gehalten.
Während der Deoxygenierung und danach während der ganzen restlichen Schritte des Verfahrens der Erfindung wird das Hb in einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt gehalten, um eine Absorption des Sauerstoffs durch das Hämoglobin möglichst gering zu halten und einen HbO₂-Gehalt von unter ca. 20%, vorzugsweise von unter ca. 10% beizubehalten.
Das deoxygenierte Hb wird dann vorzugsweise mit einem Lagerpuffer mit niedrigem Sauerstoffgehalt äquilibriert, der eine Sulfhydrylgruppe enthält, um ein gegen Oxidation stabilisiertes Deoxy-Hb zu bilden. Geeignete Sulfhydryl-Verbindungen sind nicht toxische Reduktionsmittel wie N-Acetyl-L-cystein (NAC), D,L-Cystein, γ-Glutamyleystein, Glutathion, 2,3-Dimercapto-1-propanol, 1,5-Butandithiol, Thioglykolat und andere biologisch kompatible Sulfhydryl-Verbindungen. Der Sauerstoffgehalt eines Lagerpuffers mit niedrigem Sauerstoffgehalt muss niedrig genug sein, um die Konzentration der Sulfhydryl-Verbindung in dem Puffer nicht zu senken und den Gehalt an Oxyhämoglobin im gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb auf etwa 20% oder darunter, vorzugsweise auf weniger als ca. 10% zu drücken. Typischerweise hat der Lagerpuffer einen pO₂ von weniger als ca. 50 Torr.
In einer bevorzugten Ausführungsform sollte der Lagerpuffer ein pH aufweisen, das geeignet ist, die Hb-Polymerisation und die Bildung von Methämoglobin auszubalancieren, typischerweise zwischen ca. 7,6 und ca. 7,9.
Die Menge einer mit dem Deoxy-Hb vermischten Sulfhydryl-Verbindung ist eine Menge, die groß genug ist, die intramolekulare Vernetzung des Hb während der Polymerisation zu vermehren und klein genug, die intermolekulare Vernetzung der Hb-Moleküle in Folge einer hohen Ionenstärke nicht signifikant herabzusetzen, Typischerweise werden etwa ein Mol an funktionellen Sulfhydrylgruppen (-SH) benötigt, um zwischen ca. 0,25 Mol bis ca. 0,5 Mol Deoxy-Hb gegen eine Oxidation zu stabilisieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Lagerpuffer annähernd 25–35 mM Natriumphosophatpuffer (pH 7,7–7,8) und enthält eine solche Menge an NAC, dass die Konzentration an NAC in dem gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb zwischen etwa 0,003 Gew.-% und etwa 0,3 Gew.-% liegt. Mehr bevorzugt liegt die NAC-Konzentration in gegen Oxidation stabilisiertem Deoxy-Hb zwischen etwa 0,05 Gew.-% und etwa 0,2 Gew.-%.
Vorzugsweise wird der Lagerpuffer vor dem Mischen mit dem Deoxy-Hb filtriert, z.B. durch eine 10.000 Dalton Ultrafiltrationsmembran (Millipore Helicon Cat # CDUF050G1 oder A/G Technology Maxcell Cat # UFP-10-C-75).
In einer Ausführungsform fließt das gegen Oxydation stabilisierte Deoxy-Hb dann durch einen optionalen Filter. Geeignete Filter sind ein 0,2 μm Polypropylen Vorfilter und ein 0,5 μm Sterilmikrofilter (Pall Profile II, Cat # ABIY005Z7 oder Gelman Supor). Das Deoxy-Hb wird unter einer im Wesentlichen von Sauerstoff freien Atmosphäre gehalten. Dies lässt sich z.B. erreichen, wenn die Verfahrensapparatur vor und nach dem Befüllen mit gegen Oxidation stabilisiertem Deoxy-Hb mit einem inerten Gas wie Stickstoff ausgespült und abgeschirmt wird.
Vor der Überführung des gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb zur Polymerisation wird gegebenenfalls eine geeignete Menge an Wasser dem Polymerisationsreaktor zugesetzt. In einer Ausführungsform ist eine geeignete Menge an Wasser die Menge, welche zu einer Lösung mit einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 100 g/l Hb führen würde, wenn das gegen Oxidation stabilisierte Deoxy-Hb dem Polymerisationsreaktor zugesetzt wird. Das Wasser ist vorzugsweise arm an Sauerstoff.
Nachdem der pO₂ des Wassers im Polymerisationsschritt auf ein Niveau gesenkt wurde, das ausreicht, um den HbO₂-Gehalt etwa auf unter 20% zu drücken, typischer weniger als ca. 50 Torr, wird der Polymerisationsreaktor mit einem Inertgas wie Stickstoff ausgespült. Das gegen Oxidation stabilisierte Deoxy-Hb wird sodann in den Polymerisationsreaktor überführt, der gleichzeitig mit einem geeigneten Strom eines Inertgases durchspült wird.
Die Temperatur der gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb-Lösung im Polymerisationsreaktor wird auf eine Temperatur angehoben, bei der die Polymerisation des gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb optimal ist, wenn es mit einem Vernetzungsmittel in Kontakt kommt. Typischerweise liegt die Temperatur des gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb während der gesamten Polymerisation bei etwa 41°c bis etwa 45°C und vorzugsweise bei etwa 41°C bis etwa 43°C. Ein Beispiel für ein brauchbares Wärmeübertragungsmittel zum Heizen des Polymerisationsreaktors ist ein doppelwandiges Heizsystem, das erhitzt wird, indem heißes Ethylenglykol durch die Ummantelung geleitet wird.
Das gegen Oxidation stabilisierte Deoxy-Hb wird dann bei einer zur Polymerisation des gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb ausreichenden Temperatur einem geeigneten Vernetzungsmittel ausgesetzt um über ein Zeitspanne von etwa zwei Stunden bis etwa sechs Stunden eine Lösung aus polymerisiertem Hämoglobin ((Poly(Hb)) zu bilden.
Beispiele für geeignete Vernetzungsmittel sind polyfunktionelle Mittel, welche Hb quervernetzen wie z.B. Glutaraldehyd, Succindialdehyd, aktivierte Formen von Polyoxyethylen und Dextran, α-Hydroxyaldehyde wie Glykolaldehyd, N-Maleimido-6-aminocaproyl-(2'-nitro, 4'-sulfonsäure)phenylester, m-Maleimidobenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester, Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, Sulfosuccinimidyl-4-(N-maileimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat, m-aleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, m-Maleimido-benzoyl-N-hydroxysulfosuccinimidester, N-succinimidyl(4-iodoaactyl)aminobenzoat, Sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl}aminobenzoat, Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl}butyrat, Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrat, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbo-diimidhydrochlorid, N,N'-Phenylendimaleimid und u.a. zu der Bisimidat-Klasse, der Acyldiazid-Klasse oder der Aryldihalogenid-Klasse gehörende Verbindungen.
Eine geeignete Menge Vernetzungsmittel ist die Menge, mit welcher sich eine intramolekulare Vernetzung zur Stabilisierung des Hb und auch eine intermolekulare Vernetzung zur Bildung von Polymeren des Hb erzielen lassen, um dadurch die Rückhaltung in den Gefäßen zu erhöhen. Typischerweise ist eine geeignete Menge eines Vernetzungsmittels die Menge, bei welcher das molare Verhältnis von Vernetzungsmittel zu Hb über etwa 2:1 liegt. Vorzugsweise liegt das molare Verhältnis von Vernetzungsmittel zu Hb zwischen etwa 20:1 bis etwa 40:1.
Vorzugsweise erfolgt die Polymerisation in einem Puffer mit einem pH zwischen etwa 7,6 bis etwa 7,9 mit einer Chloridkonzentration kleiner oder gleich ca. 35 mMol.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine geeignete Menge des Vernetzungsmittels dem gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb zugesetzt, welche dann mit einem Mittel zum Mischen mit geringer Scherkraft vermischt werden. Ein geeignetes Mittel zum Mischen mit geringer Scherkraft ist ein statischer Mixer. Ein geeigneter statischer Mixer ist z.B. ein von Chemineer, Inc. erhaltener statischer "Kenics"-Mixer.
In einer Ausführungsform verursacht das Umwälzen des gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb und des Vernetzungsmittels durch den statischen Mixer turbulente Fließbedingungen mit im Allgemeinen einheitlichem Vermischen des Vernetzungsmittels mit dem gegen gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb, wodurch die Möglichkeit zur Ausbildung von Taschen aus Deoxy-Hb enthaltenden hohen Konzentrationen des Quervernetzungsmittels vermindert wird. Im Allgemeinen reduziert das gleichmäßige Vermischen des Vernetzungsmittels und des Deoxy-Hb die Bildung hochmolekularer Hb-Polymere, d.h. von Polymeren, die mehr als 500.000 Daltom wiegen und es erlaubt auch ein schnelleres Vermischen des Vernetzungsmittels und des Deoxy-Hb während der Polymerisation. Ferner erhält man wegen der Gegenwart einer Sulfhydryl-Verbindung, vorzugsweise NAC, eine signifikante intermolekulare Vernetzung des Hb während der Polymerisation des Hb. Während der genaue Mechanismus der Wechselwirkung der Sulfhydryl-Verbindung mit Glutaraldehyd und/oder Hb nicht bekannt ist, wird angenommen, dass die Sulfhydryl-Verbindung die chemische Verbindung von Hb/Vernetzungsmittel in einer Weise beeinflusst, dass sie zumindest teilweise die Bildung von hochmolekularen Hb-Polymeren hemmt und vorzugsweise stabilisiertes tetrameres Hb bildet.
Poly(Hb) ist so definiert, dass es eine signifikante intramolekulare Vernetzung aufweist, falls ein wesentlicher Anteil (z.B. mindestens etwa 50%) der Hb.Moleküle in dem Poly(Hb) chemisch gebunden sind und nur eine kleine Menge, wie z.B. weniger als etwa 15%, innerhalb der hochmolekularen polymerisierten Hämoglobinketten enthalten ist. Hochmolekulare Poly(Hb)-Moleküle sind z.B. Moleküle mit einem Molekulargewicht von über etwa 500.000 Dalton
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel verwendet. Typischer werden pro Kilogramm gegen Oxidation stabilisiertes Hb etwa 10 bis etwa 70 Gramm Glutaraldehyd eingesetzt. Mehr bevorzugt wird Glutaraldehyd über einen Zeitraum von 5 Stunden zugesetzt bis annähernd 29–31 Gramm Glutaraldehyd für jedes Kilogramm gegen Oxidation stabilisiertes Hb zugesetzt sind.
Nach der Polymerisation wir die Temperatur des Poly(Hb) im Polymerisationsreaktor typischerweise auf etwa 15°C bis etwa 25°C gesenkt.
Wenn das verwendete Vernetzungsmittel kein Aldehyd ist, ist das gebildete Poly(Hb) im Allgemeinen ein stabiles Poly(Hb). Wenn das verwendete Vernetzungsmittel ein Aldehyd ist, ist, ist das gebildete Poly(Hb) im Allgemeinen nicht stabil, bis es mit einem geeigneten Reduktionsmittel vermischt wird, um im Poly(Hb) zur Ausbildung stabilerer Bindungen weniger stabile Bindungen zu reduzieren. Beispiele für geeignete Reduktionsmittel sind Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid, Natriumdithionit, Trimethylamin, t-Butylamin, Morpholinboran und Pyridinboran. Vor der Zugabe des Reduktionsmittels wird die Poly(Hb)-Lösung gegebenenfalls mittels Ultrafiltration aufkonzentriert bis die Konzentration der Poly(Hb)-Lösung auf etwa 75 bis etwa 85 g/l erhöht ist. Eine Beispiel für einen geeigneten Ultrafilter ist ein 30.000 Dalton Filter (z.B. Millipore Relicon, Cat # CDUF050LT und Amicon, Cat # 540430).
Das pH der Poly(Hb)-Lösung wird sodann in den alkalischen pH-Bereich eingestellt, um das Reduktionsmittel zu schützen und eine Bildung von Wasserstoffgas zu verhindern, was während der folgenden Reduktion das Hb denaturieren kann.
In einer Ausführungsform wird das pH auf über 10 eingestellt. Das pH kann eingestellt werden, indem während oder nach der Polymerisation der Poly(Hb)-Lösung eine Pufferlösung zugesetzt wird. Typischerweise wird das Poly(Hb) gereinigt, um nicht polymerisiertes Hb zu entfernen. Dies kann mittels Diafiltration oder mit einer Hydroxyapatit-Chromatographie erfolgen (siehe z.B. die am 25. November 1997 veröffentlichte mit anhängige US-Schrift 5,691,453, deren Lehre hiermit als Referenz eingeführt wird).
Nach der pH-Einstellung wird mindestens ein Reduktionsmittel, vorzugsweise eine Natriumborhydrid-Lösung, dem Polymerisationsschritt zugesetzt, typischerweise durch die Deoxygeniserungsschleife. Typischerweise werden ca. 5 bis ca. 18 Mol Reduktionsmittel pro Mol Hb-Tetramer (pro 64.000 Dalton Hb) im Poly(Hb) zugegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird für jeweils 9 Liter Poly(Hb)-Lösung im Polymerisationssubsystem 98 ein Liter 0,25 M Natriumborhydrid-Lösung mit eine Geschwindigkeit von 0,1 bis 0,12 l/min zugegeben.
Das pH und die Elektrolyte des stabilen Poly(Hb) können sodann wieder auf physiologische Werte eingestellt werden, um ein stabiles Blutersatzmittel mit polymerisiertem Hb zu bilden, indem das stabile Poly(Hb) mit Hilfe einer Diafiltrationslösung mit geeignetem pH und physiologischen Elektrolyt-Werten einer Diafiltration unterzogen wird. Die Diafiltrationslösung ist vorzugsweise eine Pufferlösung.
Wenn das Poly(Hb) mit einem Reduktionsmittel reduziert wurde, weist die Diafiltrationslösung ein saures pH auf, vorzugsweise zwischen etwa 4 bis etwa 6.
Es kann auch eine nicht toxische Sulfhydryl-Verbindung der stabilen Poly(Hb)-Lösung als Reinigungsmittel zugesetzt werden, um die Stabilität des fertigen Blutersatzmittels mit polymerisiertem Hb zugesetzt werden. Die Sulfhydryl-Verbindung kann als teil der Diafiltrationslösung und/oder separat zugesetzt werden. Eine Menge der der Sulfhydryl-Verbindung wird zugesetzt, um eine Sulfhydryl-Konzentration zu erlangen, welche den Sauerstoff reinigt, um den Gehalt an Methämoglobin über die Lagerzeit unter ca. 15% zu halten. Vorzugsweise ist die Sulfhydryl-Verbindung NAC. Typischerweise ist die Menge an zugesetzter Sulfhydryl-Verbindung eine Menge, die ausreicht, um eine Sulfhydrylkonzentration zwischen ca. 0,05 Gew.-% und ca. 0,2 Gew.-% einzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Blutersatzmittel unter aseptischen Behandlungsbedingungen verpackt, während der Druck im Polymerisationsreaktor und der restlichen Transportvorrichtung mit einer inerten, im Wesentlichen sauestofffreien Atmosphäre aufrechterhalten wird.
Die Spezifikationen für ein nach dem Verfahren der Erfindung gebildetes geeignetes stabiles Blutersatzmittel mit polymerisiertem Hb sind in Tabelle I wiedergegeben. Tabelle I

^a – gemessen in Hb vor Polymerisation

Das stabile Blutersatzmittel wird sodann in einem Kurzzeit-Lagerbehälter oder in sterilen Lagerbehältern aufbewahrt, wobei jeder, wie oben genau beschrieben, eine Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt aufweist. Der Lagerbehälter sollte auch gegenüber dem Durchtritt von Wasserdampf ausreichend undurchlässig sein, um zu verhindern, dass sich über die Lagerzeit eine signifikante Konzentration des Blutersatzmittels verflüchtigt. Eine signifikante Konzentration des Blutersatzmittels ist die Konzentration, die dazu führt, dass bei einem oder mehreren Parametern des Blutersatzmittels der wert weit entfernt von der Spezifikation ist.
Die Synthese eines gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten stabilen Blutersatzmittels aus polymerisiertem Hämoglobin wird ferner in dem US-Patent 5,296,465 beschrieben.
Die Vertebraten, welche das mit dem Verfahren der Erfindung gebildete Blutersatzmittel aufnehmen können sind Säuger, wie der Mensch, nicht humane Primaten, ein Hund, eine Katze, eine Ratte, ein Pferd oder ein Schaf. Vertebraten, welche dieses Blutersatzmittel aufnehmen können sind ferner Föten (pränatale Vertebraten), postnatale Vertebraten oder Vertebraten zum Zeitpunkt ihrer Geburt.
Ein Blutersatzmittel der vorliegenden Erfindung kann in das Kreislaufsystem verabreicht werden, indem das Blutersatzmittel direkt und/oder indirekt mit einer oder mehreren Injektionsmethoden in das Kreislaufsystem des Vertebraten injiziert wird. Beispiele für direkte Injektionsmethoden sind intravaskuläre Injektionen wie intravenöse und intraarterielle Injektionen intrakardiale Injektionen. Beispiele für indirekte Injektionsmethoden sind intraperitoneale Injektionen, subkutane Injektionen, so dass das Blutersatzmittel über das Lymphsystem in das Kreislaufsystem transportiert wird, Injektionen in das Knochenmark mit Hilfe eines Trokars oder Katheters. Das Blutersatzmittel wird vorzugsweise intravenös verabreicht.
Der zu behandelnde Vertebrat kann vor, Während und/oder nach der Infusion des Blutersatzmittels normovolämisch, hypervolämisch oder hypovolämisch sein. Das Blutersatzmittel kann in das Kreislaufsystem mit Verfahren wie dem Top-Loading und mittels Austauschverfahren eingeführt werden.
Ein Blutersatzmittel kann therapeutisch verabreicht werden, um in einem Vertebraten hypoxisches Gewebe zu behandeln, das verschiedene Ursachen haben kann, einschließlich einem verminderten RBC-Fluss in einem Teil oder dem gesamten Kreislaufsystem, einer Anämie oder einem Schock. Das Blutersatzmittel kann ferner prophylaktisch verabreicht werden, um in einem Vertebraten eine Sauerstoff-Depletion von Gewebe zu verhindern, die von einer möglichen oder erwarteten Verminderung des RBC-Flusses zu einem Gewebe oder im gesamten Kreislaufsystem des Vertebraten herrühren könnte. Eine weitere Diskussion über die Verabreichung von Hämoglobin zu einer therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung von Hypoxie, die insbesondere von einer teilweisen Arterienverstopfung oder von einer teilweisen Blockierung der Mikrozirkulation herrührt, sowie die dabei verwendeten Dosierungen wird in der am 23. März 1995 eingereichten mit anhängigen US-Patentanmeldung 08/409,337 vorgetragen, welche hiermit in ihrer Gesamtheit als Referenz eingeführt wird.
Typischerweise ist eine geeignete Dosis oder Kombination von Dosen eine Menge, welche, wenn sie im Blutplasma enthalten ist, in dem Blut des Vertebraten zu einer Gesamtkonzentration an Hämoglobin zwischen ca. 0,1 bis ca. 10 Gramm Hb/dl oder mehr führt, falls erforderlich, um Verluste großer Volumina an Blut auszugleichen.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen weiter und spezieller beschrieben.
BEISPIEL 1
SYNTHESE EINES STABILEN BLUTERSATZMITTELS AUS POLYMERISIERTEM Hb
Wie in dem US-Patent 5,296,465 beschrieben, wurden Proben von Rinder-Vollblut gesammelt, zur Bildung einer Blutlösung mit einem Antikoagulans aus Natriumcitrat vermischt und dann auf ihren Endotoxinghehalt hin analysiert.
Jede Probe der Blutlösungen wurde nach dem Sammeln bei einer Temperatur von ca. 2°C gehalten und dann filtriert, um mit einem Sieb von 600 Mesh große Aggregate und Teilchen zu entfernen.
Bevor sie vereinigt wurden, wurde der Penicillin-Gehalt jeder Blutlösung mit einem von Difco, Detroit, Michigan gekauften Kit unter Anwendung der Methode mit dem Titel "Rapid Detection of Penicillin in Milk" untersucht, um sicherzustellen, dass deie Penicillin-Gehalte in den Blutlösungen [0,008 Einheiten/ml waren.
Die Proben mit den Blutlösungen wurden sodann vereinigt und mit pyrogenfrei gemachter wässriger Natriumcitrat-Lösung vermischt, um eine 0,2 Gew.-% Lösung von Natriumcitrat in Rindervollblut zuzubereiten (im Folgenden als "0,2% Natriumcitrat-Blutlösung" bezeichnet).
Die 0,2% Natriumcitrat-Blutlösung wurde sodann nacheinander durch 800 μm und 50 μm Polypropylenfilter geleitet, um große Blutlösungstrümmer mit einem Durchmesser von annähernd 50 μm und darüber zu entfernen.
Die RBCs wurden dann gewaschen, um extrazelluläre Plasmaproteine wie BSA oder IgG von den RBCs abzutrennen. Um die in der Blutlösung enthaltenen RBCs zu waschen, wurde das Volumen der Blutlösung im Diafiltrationsbehälter anfangs durch Zusatz eines gleichen Volumens von gefilterter isotonischer Lösung zum Diafiltrationsbehälter verdünnt. Die isotonische Lösung wurde mit einer 10.000 Dalton Ultrafiltrationsmembran von Millipore (Cat # CDUF 050 G1) filtriert. Die isotonische Lösung setzte sich aus 6,0 g/l Natriumcitrat-Dihydrat und 8,0 g/l Wasser für Injektionszwecke (WFI) zusammen.
Die verdünnte Blutlösung wurde dann mittels Diafiltration durch eine 0,2 μm Hohlfaser (Microgon Krosflo II Mikrofiltrationskartusche) bis zu ihrem ursprünglichen Volumen aufkonzentriert. Gleichzeitig wurde gefilterte isotonische Lösung als Makeup kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit zugegeben, welche gleich der Geschwindigkeit des Filtratverlustes durch den 0,2 μm Diafilter war. Während der Diafiltration traten die Bestandteile der verdünnten Blutlösung, die einen deutlich kleineren Durchmesser wie die RBCs aufwiesen oder Flüssigkeiten wie Plasma sind, mit dem Filtrat durch die Wände des 0,2 μm Diafilters hindurch. Die RBCs, Blutplättchen und größeren Körperchen der verdünnten Blutlösung, wie z.B. die weißen Blutkörperchen, wurden zurückgehalten und zur Bildung einer dialysierten Blutlösung kontinuierlich isotonische Lösung zugegeben.
Während des Waschens der RBCs wurde die verdünnte Blutlösung bei einer Temperatur zwischen annähernd 10° cis 25°C bei einem Fluiddruck am Einlass des Diafilters zwischen etwa 25 psi und etwa 30 psi gehalten, um die Effizienz des Prozesses zu verbessern.
Das Waschen der RBCs war zu Ende, wenn das Volumen des aus dem Diafilter ausgewaschenen Filtrats gleich etwa 600% des Volumens der Blutlösung vor dem Verdünnen mit filtrierter isotonischer Lösung war.
Die diaylysierte Blutlösung wurde sodann kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von annähernd 4 l/min zu einer Sharples Super Centrifuge, Modell # AS-16 gepumpt, die mit einem #28 Ringdam ausgestattet war. Die Zentrifuge lief, während gleichzeitig dialysierte Blutlösung zugeführt wurde, um die RBCs von den weißen Blutkörperchen und Blutplättchen abzutrennen. Während des Betriebs drehte sich die Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit, die ausreicht, um die RBCs in eine schwere RBC-Phase aufzutrennen, spezifisch bei etwa 15.000 Upm, während auch ein wesentlicher Anteil der weißen Blutkörperchen (WBCs) und Blutplättchen in eine leichte WBC-Phase aufgetrennt wurde. Eine Fraktion von der RBC-Phase und eine Fraktion von der WBC-Phase wurden abgetrennt und während des Betriebs kontinuierlich aus der Zentrifuge entnommen.
Nach Abtrennung der RBCs wurden die RBCs lysiert, um eine Hb enthaltende Lösung zu bilden. Ein wesentlicher Anteil der RBCs wurde mechanisch lysiert, während die RBCs aus der Zentrifuge entnommen wurden. Nach dem Abquetschen der Wand der Entnahmeleitung für die RBC-Phase in einem Winkel zum Fluss der RBC-Phase aus der Zentrifuge rissen die Zellmenbranen der RCBs auf wodurch aus den RBCs Hämoglobin (Hb) in die RBC-Phase freigesetzt wurde.
Die lysierte RBC-Phase floss dann durch die Entnahmeleitung für die RBC-Phase in einen statischen Mixer (Kenics ½ Zoll in 6 Elementen, Chemineer, Inc.). Gleichzeitig mit der Überführung der RBC-Phase zum statischen Mixer wurde eine gleiche Menge WFI ebenfalls in den statischen Mixer injiziert, in welchem sich das WFI mit der RBC-Phase vermischte. Die Fließgeschwindigkeiten der RBC-Phase und des WFI in den statischen Mixer betrugen jeweils ca. 0,25 l/min.
Das Vermischen der RBC-Phase mit WFI im statischen Mixer führte zu einem Kolloid mit lysierten RBCs. Das Kolloid mit lysierten RBCs wurde dann aus dem statischen Mixer in eine Sharples Super Centrifuge (Modell # AS-16, Sharples Division of Alfa-Level Seperation, Inc.) überführt die geeignet war, das Hb von den nicht Hb enthaltenden Komponenten der RBCs abzutrennen. Die Zentrifuge drehte sich mit einer Geschwindigkeit, die ausreichte, das Kolloid mit lysierten RBCs in eine leichte Hb-Phase und eine schwere Phase aufzutrennen. Die leichte Phase setzte sich aus Hb zusammen und enthielt auch Nicht-Hämoglobin-Komponenten mit einer Dichte von annähernd gleich oder kleiner als die Dichte von Hb.
Die Hb-Phase wurde kontinuierlich aus der Zentrifuge entnommen, durch einen Mikrofilter Pellicon Kassette, Cat # HVLP 000 C5 von Millipore geschickt und zur Vorbereitung für die Reinigung von Hb in einen Aufbewahrungsbehälter überführt. Das Zellstroma wurde dann mit dem Retentat des Mikrofilters zum Aufbewahrungsbehälter rückgeführt. Während der Mikrofiltration wurde die Temperatur im Aufbewahrungsbehälter bei 10°C oder darunter gehalten. Zur Verbesserung der Effizienz war die Mikrofiltration fertig, wenn der Druck am Einlass des Mikrofilters von dem Anfangsdruck von ca. 10 psi auf etwa 25 psi gestiegen war. Das Hb-Mikrofiltrat wurde sodann vom Mikrofilter in den Mikrofiltratbehälter überführt.
Danach wurde das Mikrofiltrat durch einen 100.000 Ultrafilter Millipore Cat # CDUF 050 H1 gepumpt. Ein wesentlicher Anteil des in dem Hb-Mikrofiltrat enthaltenen Hb und Wassers ging durch den 100.00 Dalton Ultrafilter hindurch, um ein Hb-Ultrafiltrat zu bilden, während größere Zelltrümmer wie Proteine mit einem Molekulargewicht von über etwa 100.000 Dalton zurückgehalten wurden und zurück in den Behälter für das Mikrofiltrat geführt wurden. Gleichzeitig wurde WFI kontinuierlich als Makeup für da im Ultrafiltrat verloren gegangene Wasser zum Mikrofiltratbehälter gegeben. Im Allgemeinen umfassen Zelltrümmer alle ganzen und fragmentierten Zellbestandteile mit Ausnahme von Hb, kleineren Zellproteinen, Elektrolyten, Coenzymen und organischen Stoffwechselzwischenprodukten. Mit der Ultrafiltration wurde fortgefahren, bis die Konzentration des Hb im Mikrofiltratbehälter weniger als 8 Gramm/Liter (g/l) betrug. Während der Ultrafiltration des Hb wurde die Innentemperatur des Mikrofiltratbehälters bei etwa 10°C gehalten.
Das Hb-Ultrafiltrat wurde in einen Ultrafiltratbehälter überführt, in welchem dann das Hb-Ultrafiltrat durch ein 30,000 Dalton Mollipore Cat # CDUF 050 T1-Ultrafilter geschickt wurde, um kleinere Zellbestandteile wie Elektrolyte, Coenzyme, Stoffwechselzwischenproduktw und Protein mit einem Molekulargewicht unter 30.000 Dalton und Wasser aus dem Ultrafiltrat zu entfernen, wodurch eine ca. 100 g Hb/l enthaltende konzentrierte Hb-Lösung gewonnen wurde.
Die konzentrierte Hb-Lösung wurde vom Ultrafiltratbehälter auf die in den parallel angeordneten Chromatographiesäulen (2 Fuß lang mit einem Innendurchmesser von 8 Zoll) enthaltenen Medien geleitet, um das Hb mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie abzutrennen. Die Chromatographiesäulen enthielten ein zur Abtrennung von Hb von Nicht-Hämoglobin-Proteienen geeignetes Anionenaustauschermedium. Das Anionenaustauscher-medium. wurde von Silicagel gebildet. Das Silicagel wurde zur Bildung von aktiven Epoxidgruppen γ-Glycidoxypropylsilan ausgesetzt und dann C₃H₇(CH₃)₂NCl„ um ein Anionenaustauschermedium mit quartärem Ammonium zu bilden. Dieses Verfahren zur Behandlung von Silicagel wird im Journal of Chromatography, 120: 321–333 (1976) beschrieben.
Jede Säule wurde durch Ausspülen der Chromatographiesäulen mit einem ersten Puffer (Tris-acetet) vorbehandelt, was doe Hb-Bindung erleichterte. Das pH des Puffers lag bei etwa 9,0 ! 0,1. Dann wurden in jede Chromatographiesäule 4,52 Liter der konzentrierten Hb-Lösung injiziert. Nach der Injektion der konzentrierten Hb-Lösung wurden die Chromatographiesäulen dann gewaschen, indem zur Herstellung eines schrittweisen pH-Gradienten des Eluats aus den Säulen Pufferlösungen durch die Chromatographiesäulen geschickt wurden. Die Temperatur von jedem Puffer während seines Einsatzes betrug ca. 12,4°C. Die Puffer wurden vor ihrer Injektion auf die Chromatographiesäulen durch eine 10.000 Dalton Ultrafiltrationsmembran vorgefiltert Insbesondere transportierte eine erste Pufferlösung, 20 mM Trishydroxymethylaminomethanacetat (Tris-acetat) (pH ca. 8,4 bis ca. 9,4) die konzentrierte Hb-Lösung in gereinigtem Wasser (U-S.P.) in die Medien in den Chromatographiesäulen, um das Hb zu binden. Ein zweiter Puffer mit einem pH von ca. 8,3 stellte dann das pH in den Chromatographiesäulen ein, um aus den Chromatographiesäulen kontaminierende Nicht-Hämoglobin-Bestandteile zu eluieren, während das Hb zurückgehalten wird. Das Äquilibrieren mit der zweiten Pufferlösung wurde ca. 30 Minuten lang bei einer Fließgeschwindigkeit von annähernd 3,56 l/Min pro Säule oder ca. 6,1 Säulenvolumina (11,7 Porenvolumina) fortgeführt. Das Eluat aus dem zweiten Puffer wurde verworfen. Mit einer dritten Pufferlösung, 50 mM Tris-acetat (pH ca. 6,5 bis etwa 7,5), wurde dann das Hb aus den Chromatographiesäule als gereinigtes Hb-Produkt eluiert.
Das Hb-Eluat wurde sodann durch einen sterilen 0,22 μ Sartobran Cat # 5232507 G1PH-Filter zu einem Behälter geleitet, in welchem das Hb-Eluat gesammelt wurde. Die ersten 3–4% des Hb-Eluats und die letzten 3–4% des Hb-Eluats wurden verworfen.
Das Hb-Eluat wurde weiter verwendet, wenn das Eluat weniger als 0,05 EE/ml Endotoxin und weniger als 3,3 nMol/ml Phospholipide enthielt. Zu 60 Litern des ultrareinen Eluats, welches eine Konzentration von 100 g Hb/l aufwies, wurden 911,0 M NaCl und 20 mM Tris-Puffer (pH 8,9) gegeben, wodurch eine Hb-Lösung mit einer Ionenstärke von 160 mM gebildet wurde, um die Sauerstoffaffinität des Hb in der Hb-Lösung herabzusetzen. Die Hb-Lösung wurde sodann bei 10°C durch hindurchleiten durch den Ultrafilter, speziell ein 10.000 Dalton Millipore Helicon, Cat # CDUF050G1-Filter, aufkonzentriert, bis die Hb-Konzentration 110 g/l betrug.
Die Hb-Lösung wurde dann deoxygeniert, bis der pO₂ der Hb-Lösung auf den Wert gesunken war, wo der HbO₂-Gehalt ca 10% betrug, indem die Hb-Lösung mit 10 l/min durch eine 0,05 μm Phasen-Transfermembran aus einem Hoechst-Celanese Corporation Cat # G-240/40)-Polypropylen-Milrofilter geleitet wurde, um eine deoxygenierte Hb-Lösung (im Folgenden als "Deoxy-Hb" bezeichnet) zu bilden. Gleichzeitig wurde ein Fluss eines Stickstoffgases mit 50 L/min durch die Gegenseite der Phasen-Transfermembran geleitet. Während der Deoxygenierung wurde die Temperatur der Hb-Lösung zwischen ca. 19°C und ca. 31°C gehalten.
Ebenfalls während der Deoxygenierung und dann über den gesamten Prozess hinweg wurde das Hb in einer Atmosphäre mit niedrigem Sauerstoffgehalt gehalten, um die Sauerstoffabsorption durch das Hb möglichst gering zu halten und um den Gehalt an oxygeniertem Hb (Oxyhämoglobin oder HbO₂) von weniger als 10% im Deoxy-Hb beizubehalten.
601 des Deoxy-Hb wurden sodann durch einen Ultrafilter mit 1001 eines 0,2 Gew.-% N-Acetylcystein und 55 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,8) mit einem pO₂ von weniger als 50 Torr enthaltenden Lagerpuffers einer Diafiltration unterzogen, um ein gegen Oxidation stabilisiertes Deoxy-Hb zu bilden. der Lagerpuffer wurd vor dem Vermischen mit dem Deoxy-Hb mit einem 10.000 Dalton Millipore Helicon, Cat' CDUF050G1-Depyrogenierungsfilter depyrogeniert.
Der Lagerpuffer wurde kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit zugegeben, die dem Fluidverlust durch den Ultrafilter annähernd äquivalent war. Mit der Diafiltration wurde fortgefahren, bis der Volumenverlust durch die Diafiltration über den Ultrafilter ungefähr dreimal so groß war wie das anfängliche Volumen des Deoxy-Hb. An diesem Punkt kann das material gelagert werden.
Vor der Überführung des gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb in eine Polymerisationsapparatur wurde dem Polymerisationsreaktor sauerstoffarmes WFI zugesetzt, um zur Verhinderung einer mit Sauerstoff erfolgenden Oxidation des gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb die Polymerisationsapparatur von Sauerstoff zu befreien. Die Menge des der Polymerisationsapparatur zugesetzten WFI war die Menge, die man in einer Hb-Lösung mit einer Konzentration von ca. 40 Hb/l erhalten würde, wenn das gegen Oxidation stabilisierte Deoxy-Hb dem Polymerisationsreaktor zugegeben wurde. Das WFI wurd dann durch die Polymerisationsapparatur umgewälzt, um das WFI durch einen Fluss durch eine 0,05 μm Phasentransfermembran (Hoechst-Celanese Corporation Car# 5PCM-108, 80 Quadratfuß) aus einem Mikrofilter aus Polypropylen gegen einen Gegenstrom von mit Druck beaufschlagtem Stickstoff zu deoxygenieren. Die Fließgeschwindigkeit des WFI und des Stickstoffgases durch die Phasentransfermembran betrug ca. 18 bis 20 l/min bzw. 40 bis 60 l/min.
Nachdem der pO₂ des WFI in der Polymerisationsapparatur auf unter ca. 2 Torr gesenkt worden war, wurde der Polymerisationsreaktor mit Stickstoff unter einem Fluss von ca. 20 l/min Stickstoff ind den Kopfraum des Polymerisationsreaktors geschützt. Das gegen Oxidation stabilisierte Deoxy-Hb wurde dann in den Polymerisationsreaktor überführt.
Die Polymerisation erfolgte in einem 12 mM Phosphatpuffer mit einem pH von 7,8 der eine Chloridkonzentration von unter oder gleich ca. 35 mM aufwies, welche durch Vermischen der Hb-Lösung mit WFI erzeugt wurde.
Das gegen Oxidation stabilisierte Deoxy-Hb und N-Acetylcystein wurden dann langsam mit dem Vernetzungsmittel Glutaraldehyd vermischt, speziell mit 29,4 Gramm Glutaraldehyd für jedes Kilogramm Hb über einen Zeitraum von 5 Stunden, während auf 42°C erwärmt wurde und die Hb-Lösung durch einen statischen Kenics 1- ½ Zoll-Mixer mit 6 Elementen (Chemineer, Inc.) umgewälzt wurde, um eine Lösung mit polymerisiertem Hb (Poly(Hb)) zu erzeugen.
Das Umwälzen des gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb und des Glutaraldehyds durch den statischen Mixer sorgte für turbulente Fließbedingungen mit im Allgemeinen gleichmäßigem Vermischen des Glutaraldehyds mit dem gegen Oxidation stabilisierten Deoxy-Hb, wodurch das Potential zur Bildung von Taschen aus hohe Konzentrationen von Glutaraldehyd enthaltendem Deoxy-Hb vermindert wurde. Das im Allgemeinen gleichmäßige Vermischen des Glutaraldehyds und des Deoxy-Hb verminderte die Bildung von Pol(Hb) mit hohem Molekulargewicht (mit einem Molekulargewicht über 500.000 Dalton) und erlaubte auch ein schnelleres Vermischen des Glutaraldehyds und des Deoxy-Hb während der Polymerisation.
Darüber hinaus zeigte sich wegen der Gegenwart des N-Acetylcysteins nach der Polymerisation des Hb eine signifikante intramolekulare Vernetzung des Hb während der Polymermerisation des Hb.
Nach der Polymerisation wurde die Temperatur der Poly(Hb)-Lösung im Polymerisationsreaktor auf eine Temperatur zwischen ca. 15°C und ca. 25°C gesenkt.
Die Poly(Hb)-Lösung wurde dann durch Umwälzen der Poly(Hb)-Lösung durch den Ultrafilter aufkonzentriert, bis die Konzentration des Poly(Hb) auf etwa 85 g/l gestiegen war. Ein geeigneter Ultrafilter ist ein 30.000 Dalton Filter (z.B. Millipore Helicon, Cat # CDUF050LT).
Dann wurde die Poly(Hb)-Lösung mit 66,75 g Natriumborhydrid vermischt und dann erneut durch den statischen Mixer umgewälzt. Speziell wurden jeweils 9 Litern Poly(Hb)-Lösung ein Liter 0,25 M Natriumborhydrid-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 0,12 l/min zugesetzt.
Vor der Zugabe von Natriumborhydrid zu der Poly(Hb)-Lösung wurde das pH der Poly(Hb)-Lösung basisch gemacht, indem das pH auf ein pH von etwa 10 eingestellt wurde, um das Natriumborhydrid zu schützen und um die Entwicklung von Wasserstoffgas zu verhindern. Das pH der Poly(Hb)-Lösung wurde eingestellt, indem die Poly(Hb)-Lösung mit annähernd 215 l eines depyrogenierten deoxygenierten 12 mM Natriumboratpuffers, der ein pH von etwa 10,4 bis etwa 10,6 aufwies, einer Diafiltration unterzogen wurde. Die Poly(Hb)-Lösung wurde einer Diafiltration unterzogen, indem die Poly(Hb)-Lösung aus dem Polymerisationsreaktor durch den 30 kD Ultrafilter umgewälzt wurde. Der Natrtiumboratpuffer wurde der Poly(Hb)-Lösung mit einer Geschwindigkeit zugegeben, die zu der Geschwindigkeit des Fluidverlustes durch den Ultrafilter aus der Diafiltration annähernd äquivalent war. Mit der Diafiltration wurde fortgefahren, bis das Volumen des Fluidverlustes durch den Ultrafilter aus der Diafiltration etwa dreimal so groß war wie das Anfangsvolumen der Poly(Hb)-Lösung im Polymerisationsreaktor.
Nach der Einstellring des pH wurde die Natriumborhydridlösung dem Polymerisationsreaktor zugesetzt, um die Imin-Bindungen in der Poly(Hb)-Lösung zu Ketimin-Bindungen zu reduzieren und um stabiles Poly(Hb) in der Lösung zu bilden. Während der Zugabe von Natriumborhydrid wurde die Poly(Hb)-Lösung im Polymerisationsreaktor kontinuierlich durch den statischen Mixer und die 0,05 μm Phasentransfermembran aus einem Polypropylen-Mikrofilter umgewälzt, um gelösten Sauerstoff und Wasserstoff zu entfernen. Der Fluss durch einen statischen Mixer sorgte auch für turbulente Fließbesingungen des Natriumborhydrids, die das Natriumborhydrid mit der Poly(Hb)-Lösung schnell und effektiv vermischten. Die Fließgeschwindigkeiten der Poly(Hb)-Lösung und des Stickstoffgases durch die 0,05 μm Phasentransfermembran lagen zwischen etwa 2,0 bis 4,0 l/min bzw. zwischen etwa 12 bis 18 l/min. Nach beendeter Zugabe des Natriumborhydrids, hielt die Reduktion im Polymerisationsreaktor weiterhin an, während sich ein darin enthaltener Rührer sich mit annähernd 75 Umdrehungen pro Minute drehte.
Ungefähr eine Stunde nach der Zugabe des Natriumborhydrids wurde die Lösung mit stabilem Poly(Hb) aus dem Polymerisationsreaktor durch den 30.000 Dalton Ultrafilter umgewälzt, bis die Konzentration der Lösung mit stabilem Poly(Hb) 110 g/l betrug. Nach dem Aufkonzentrieren wurden das pH und die Elektrolyte der Lösung mit stabilem Poly(Hb) wieder auf physiologische Werte eingestellt, um ein Blutersatzmittel mit stabilem polymerisierten Hb zu erzeugen, indem die Lösung mit stabilem Poly(Hb) durch den 30.000 Dalton Ultrafilter mit einem 12 mM NAC, 115 mM NaCl, 4 mM KCl und 1,36 mM CaCl₂ in WFI (pH 5,0) enthaltenden filtrierten und deoxygenierten Puffer von niedrigem pH einer Diafiltration unterzogen wurde. Die Diafiltration wurde fortgeführt, bis das Volumen des über die Diafiltration durch den Ultrafilter verlorenen Fluids etwa sechsmal so groß war wie das Volumen des aufkonzentrierten Hb-Produkts vor der Diafiltration.
Nachdem das pH und die Elektrolyte wieder auf physiologische Werte gebracht waren, wurde das Blutersatzmittel aus stabilem polymerisierten Hb auf eine Konzentration von 5,0 g/dl verdünnt, indem der filtrierte deoxygenierte Puffer mit niedrigem pH dem Polymerisationsreaktor zugesetzt wurde. Das verdünnte Blutersatzmittel wurde dann durch Umwälzen aus dem Polymerisationsreaktor durch den statischen Mixer und einen 100.000 Dalton Reinigungfilter einer Diafiltration gegen einen 27 mM Natriumlactat, 120 mM NAC, 115 mM NaCl, 4 mM KCl und 1,36 mM CaCl2 in WFI (pH 7,8) enthaltenden filtrierten und deoxygenierten Puffer unterzogen. Mit der Diafiltration wurde fortgefahren, bis das Blutersatzmittel gemäß GPC bei einem Durchgang unter dissoziierenden Bedingungen weniger als 10% oder gleich etwa 10% einer modifizierten tetrameren und nicht modifizierten tetrameren Spezies enthielt.
Der Reinigungsfilter wurde unter Bedingungen von niedrigem Transmembrandruck mit eingeschränkter Permeatleitung benutzt. Nach der Entfernung beträchtlicher Mengen an modifiziertem und nicht modifiziertem tetrameren Hb hielt das Umwälzen des Blutersatzmittels durch den 30.000 Dalton Ultrafilter an, bis die Konzentration des Blutersatzmittels etwa 130 g/l betrug.
Das stabile Blutersatzmittel wurde dann in einem geeigneten Behälter mit einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt und mit geringer Eindringrate von Sauerstoff aufbewahrt.
BEISPIEL 2
ANALYSE DES POLYMERISIERTEN HÄMOGLOBINS
Die Konzentration des Endotoxins in dem Hämoglobin-Produkt wird nach dem von Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachusetts, J. Levin et al., J. Lab. Clin. Med., 75: 903–911 (1970) entwickelten Verfahren "Kinetic/Turbidimetric LAL 5000 Methodology" ermittelt. Zahlreiche Verfahren wurden verwendet, um nach jeglichen Spuren von Stroma zu suchen, z.B. z.B. ein Fällungassay, Immunoblotting und der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELIZA), um nach einem dem Fachmann bekannten spezifischen Protein der Zellmembran oder einem Glycolipid zu suchen
Eine Teilchenzählung erfolgte mit dem Verfahren "Particulate Matter in Injections: Large Volume Injections for Single Dose Infusions", U.S Pharmacopeia, 22: 1596, 1990.
Zur Ermittlung der Konzentration von Glutaraldehyd wurde eine repräsentative 400 μl Probe des Hämoglobi-Produkts mit Dinitrophenylhydrazin derivatisiert und dann bei 27°C mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min ein 100 μl Aliquot der derivatisierten Lösung zusammen muit einem Gradienten in eine YMC AQ-303 ODS-Säule injiziert. Der Gradient bestand aus zwei mobilen Phasen, 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser und 0,08% TFA in Acetonitril. Der Gradientenfluss bestand aus einem konstanten 60% 0,08% TFA in Acetonitril über einen Zeitraum von 6,0 Minuten, einem linearen Gradienten bis 85% 0,08% TFA in Acetonitril über einen Zeitraum von 12 Minuten, einem linearen Gradienten bis 100% 0,08% TFA in Acetonitril über einen Zeitraum von 4 Minuten, dem Halten bei 10% 0,08% TFA in Acetonitril über einen Zeitraum von 2 Minuten sowie dem Reäuqilibrieren bei 45% des 0,1% TFA in Wasser. Die Ultraviolettmessung erfolgte bei 360 nm.
Zur Bestimmung der NAC-Konzentration wurde ein Aliquot des Hb-Produkts 1:100 mit entgastem Natriumphosphat in Wasser verdünnt und 50 μl in eine YMC AQ-303 ODS-Säule mit einem Gradienten injiziert. Der Gradientenpuffer bestand aus einer Lösung von Natriumphosphat in Wasser und einer Mischung von 80% Acetonitril. in Wasser mit 0,05% TFA. Der Gradientenfluss bestand aus 100% Natriumphosphat in Wasser über einen Zeitraum von 15 Minuten, dann einem linearen Gradienten bis 100% einer Mischung aus 80% Acetonitril und 0,05% TFA über einen Zeitraum von 5 Minuten mit einem Halten über einen Zeitraum von 5 Minuten. Das System wurde dann zu 100% Natriumphosphat über einen Zeitraum von 20 Minuten reäquilibriert.
Die Analyse von Phospholipiden erfolgte nach einem Verfahren, das auf den in den folgenden Schriften enthaltenen Prozeduren basiert: Kolarovic et al., "A Comparison of Extraction Methods for the Isolation of Phospholipids from Biological Sources", Anal. Biochem., 156: 244–250, 1986 und Duck-Chong, C.G., "A Rapid Sensitive Method for Determining Phospholipid Phosphorus Involving Digestion with Magnesium Nitrate", Lipids, 14: 492–497, 1979.
Die Osmolarität wurde mittels Analyse auf einem Advanced Cryomatic Osmometer, Mosell #3C2, Advanced Instruments, Inc., Needham, Massachusetts ermittelt.
Die Konzentrationen des gesamten Hämoglobins, des Methämoglobins und des Oxyhämoglobins wurden auf einem Co-Oximeter Modell #482 von Instrumentation Laboratory, Lexington, Massachusetts bestimmt.
Die Na⁺-, K⁺-, Cl^–- und Ca⁺⁺-Konzentration sowei der pO₂ wurden mit einem Novastat Profile 4, Nova Biomedical Corporation, Waltham, Massachusetts ermittelt.
Die Sauerstoffbindungskonstante P₅₀ wurde mit einem Hemox-Analyzer, TCS Corporation, Southampton, Pennsylvania bestimmt.
Die Temperatur und das pH wurden nach dem Fachmann bekannten Standardverfahren gemessen.
Das Molekuklargewicht (MG) wurde ermittelt, indem an den Hämoglobin-Produkten unter Dissoziationsbedingungen eine Gelpermeationschromatographie (GPC) durchgeführt wurde. Eine repräsentative Probe des Hämoglobin-Produkts wurde auf die Molekulargewichtsverteilung hin analysiert. Das Hämoglobin-Produkt wurde innerhalb einer mobilen Phase von 50 mM Bis-Tris (pH 6,5), 750 mM MgCl₂ und 0,1 mM EDTA auf 4 mg/ml verdünnt. Dieser Puffer dient zur Dissoziation von Hb-Tetrameren in Dimere, welche nicht aus dem Poly(Hb) über intramolekulare oder intermolekulare Vernetzungen vernetzt wurden. Die verdünnte Probe wurde in eine TosHaas G3000SW-Säule injiziert. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,5 ml/min. und der Ultraviolett-Nachweis wurde bei 280 nm aufgezeichnet.
Die Ergebnisse der obigen Tests an nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten tierischen (OXYGLOBIN^TM)- und humanen (HEMOPURE^TM2)-Hb-Blutersatzmitteln sind in den Tabellen II bzw. III zusammengefasst. Tabelle II

^a – gemessen in Hb vor Polymerisation

^a – gemessen in Hb vor Polymerisation

BEISPIEL 3
BESTIMMUNG DER ONKOTISCHEN IN VIVO-EFFEKTE IN HUNDEN
Der Zweck dieser Untersuchung war die Bestimmung der onkotischen in vivo-Effekte, speziell das in den intravakulären Raum gezogene Wasservolumen pro Gramm verabreichten Hb, von tierischem (OXYGLOBIN^TM)-Hb-Blutersatzmittel in splenektomierten Neagle-Hunden durch Messung der Ausdehnung des Plasmavolumens nach einer Toploading-Dosis. Zusätzlich wurde eine vergleichbare Dosis von (RHEOMACRODEX^TM-Saline), das von Pharmacia hergestellt wird und 10% Dextran 40 und 0,9% Saline ist, ebenfalls bestimmt.
Für diese Untersuchungen wurden zwei Hunde nach einem routinemäßigen Gesundheitscheck und einer Akklimatisierungszeit von mindestens vier Wochen verwendet. Die Hunde wurden mindestens 3 Tage vor der Behandlung splenektomiert. Sie wurden mit einer Kombination von Atropin und Meperidin × HCl voranästhetisiert und über die Inhalation von Isofluoran anästhetisiert. Während des chirurgischen Eingriffs wurde Ringer Lactatlösung mit 10–20 ml/kg/hr infundiert.
Die Hunde erhielten das Hb-Blutersatzmittel (40 ml/kg) mit 20 ml/kg/hr übereinen Wegwerf-Schädelkatheter. Der Hämatokrit wurde vor der Dosierung gemessen und nach ¼, ½, 1, 2, 3, 4 Stunden oder länger nach der Dosierung gemessen, bis sich der Tiefsrpunkt des Hämatokrits einstellte.
Die Hunde wurden splenektomiert, um zu gewährleisten, dass das Plasmavolumen konstant blieb und dass sich mit der RBC-Masse eine genaue Messung der Veränderung im Plasmavolumen nach der Dosierung vornehmen ließ.
Die Berechnung der Veränderung im Plasmavolumen erfolgte unter Einsatz der folgenden Gleichung:
in welcher PV das Plasmavolumen, Hct₁ der Hämatokrit am Anfang und Hct₂ der Hämatokrit am Ende sind. Diese Berechnung basierte auf der Veränderung im Hämatokrit unter der Annahme, dass die Anzahl der RBCs im umgewälzten Blutvolumen und das mittlere Erythrocytenvolumen konstant blieben.
Wie in Tabelle IV gezeigt, trat der Tiefstpunkt des Hämatoktit bei beiden Hunden zwei Stunden nach der Dosierung auf. Das mittlere Erythrocytenvolumen (MCV) blieb während der gesamten Untersuchung stabil. Tabelle IV
Das Volumen des nach der Dosierung abgezogenen Fluids betrug für die Hunde 3503C bzw. 14 männlich 6 ml/g Hämoglobin und 9 ml/g Hämoglobin. Die Dosis der Lösung mit dem synthetischen Kolloid (Rheomacrodex^®-Saline) wurde auf der Grundlage einer Dosis berechnet, welche eine ähnliche onkotische Wirkung verursacht. Rheomacrodex zieht annähernd 22 ml Fluid aus dem Interstitium pro intravenös verabreichtem Gramm.
Die berechnete Vergleichsdosis von Rheomacrodex war 14 ml/kg bzw. 7 ml/kg für 30 ml/kg bzw. 15 ml/kg Hb-Blutersatzmittel.
Das intravaskulär von dem (Oxyglobin^TM)-Hb-Blutersatzmittel abgezogene Fluidvolumen waren 8 ml H₂O/Gramm Hb. Da das Volumen der Dosis 30 ml/kg betrug und die Konzentration des Hb in der Dosis 13 g/dl war, betrugen die Gesamtmenge an Hb pro Dosis 3,9 g/kg und das Gesamtvolumen des von dem Hb-Blutersatzmittel in den intravakulären Raum/Dosis abgezogenen Fluids 31,2 ml.
Die Lösung mit dem synthetischem Kolloid zieht etwa 22 ml Wasser/Gramm Dextran an sich. Die Gesamtmenge Dextran in der Kolloidlösung pro vergleichbarer Dosis Hb-Blutersatzmittel beträgt 1,4 g. Somit ist das Gesamtvolumen des in den intravaskulären Raumvergleichbarer Dosis Kolloidlösung abgezogenen Fluids 14 ml.
BEISPIEL 4
UNTERSUCHUNG ZUR DOSIS-WIRKUNG BEI HUNDEN
Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um bezüglich des arteriellen Sauerstoffgehalts relativ zu dem Hb der roten Blutkörperchen des Hundes und der Lieferung von Sauerstoff in splenektomierten Beagle-Hunden 60 Minuten und 24 Stunden nach einer akuten normovolämischen Blutverdünnung die Arzneimittelwirkung und Dosis-Wirkung von dem erfindungsgemäßen tierischen (OXYGLOBIN^TM)-Hb-Blutersatzmittel im Vergleich mit einer synthetischen Kolloidlösung von (RHEOMACRODEX^TM-Saline, Pharmacia) zu bestimmen, welche aus 10% Dextran 40 und 0,9% Daline besteht.
Die akute normovolämische Blutverdünnung ist ein Versuchsmodell, welches eine klinische Verfassung von Anämie in Folge eines Blutverlustes während eines chirurgischen Eingriffs nachahmt. Mit diesem Verfahren wurde eine schwere Anämie (Hkt = 9%, Hb = 3 g/dl) ausgelöst, um ein absolutes Bedürfnis nach einem Sauerstoff transportierenden Träger hervorzurufen. Die Versorgung mit Sauerstoff und der Sauerstoffgehalt nahmen mit der starken Blutung jäh ab.
Bei der Entwicklung des normovolämischen Blutverdünnungsmodells wurde gefunden, dass eine Behandlung zur Wiederherstellung der Sauerstoffversorgung entweder mit Hilfe einer Volumenexpansion allein, wie dies bei den Kontrollhunden geschah, oder mit einer Volumenexpansion zusammen mit einer Erhöhung des arteriellen Sauerstoffgehalts, wie dies bei den mit der Hb-Lösung behandelten Hunden erfolgte, innerhalb von etwa 10 Minuten nach Erreichen eines Hämatokrits von 9% zu geschehen hatte, um eine irreversible Abnahme des Blutdrucks sowie des Herzzeitvolumens, die dann zum Tod führten, zu vermeiden.
Zwei von 12 Kontrollhunden bei dieser Untersuchung starben während oder nach der Dosierung, obwohl sogar ihr Gefäßvolumen mit einer Dextran 40-Lösung innerhalb von 5 Minuten nach Erreichen des angestrebten Hämatokrits expandiert wurde. Der Tod dieser Hunde spiegelt die Stärke des Versuchsmodells wieder, das dann wieder das klinische Befinden bei einem schweren akuten Blutverlust wiedergibt.
Für diese Untersuchung wurden nach einem routinemäßjgen Gesundheitscheck und einer Akklimatisierungszeit von mindestens 4 Wochen 30 Hunde eingesetzt. Die Behandlung wurde gestaffelt, indem drei parallele Sektionen von Hunden (A, B und C) eingesetzt wurden, wobei jede Sektion einen Hund/Geschlecht/Gruppe enthielt. Die Hunde wurden 32 Tage vor dem ersten Behandlungstag nach dem Zufallsprinzip den 5 Gruppen zugeordnet (6 Hunde/Gruppe aus 3 männlichen und 3 weiblichen Tieren). Die Hunde wurden ihren jeweiligen Gruppen mit Hilfe einer auf dem Körpergewicht beruhenden Blockrandomisierung zugewiesen, indem ein Verfahren eingesetzt wurde, das unter den Gruppen eine gleiche Verteilung garantierte. Die männlichen und weiblichen Tiere wurden getrennt randomisiert. Jeder Hund mit nicht annehmbaren Vorbehandlungsdaten, wie z.B. anomalen klinischen Anzeichen oder klinischen Krankheitsdaten, wurde durch einen Ersatzhund ersetzt, der unter den gleichen Umgebungsbedingungen gehalten wurde.
Die Test-/Kontroll-Stoffe wurden mit einer einzigen intravenösen Infusion verabreicht. Die Infusionsrate wurde mit einer Infusionspumpe kontrolliert. Das aktuelle pro Stunde infundierte Volumen hing vom zuletzt gemessenen Körpergewicht des jeweiligen Hundes ab.
Die Höchste Dosis für die Hb-Lösung beruhte in Folge der Volumenexpansion in normovolämischen Hunden auf der sicheren Obergrenze für akute cardiovaskuläre Effekte. Die Dosis für den mittleren Bereich wurde ausgewählt, um die Form der Dosis-Wirkungs-Kurve zu definieren. Die niedrigste Dosis beruhte auf der Untergrenze für eine klinisch relevante Dosierung, wie sie durch das Volumen sowie hämodynamische Effekte im Hund definiert wird.
Jeder Hund wurde mindestens 7 Tage vor der Behandlung splenektomiert, um Auswirkungen auf das Versuchsmodell für eine erhöhte RBC-Masse im Kreislauf in Folge einer Kontraktion der Milz zu vermeiden. Am Tag der Behandlung mit der Hb-Lösung wurde jeder Hund durch Einatmen von Isofluran anästhetisiert und unter Verwendung der Raumluft mit einem Atemhubvolumen von 20–25 ml/kg mechanisch beatmet. Die Ventilationsrate wurde während der Prozedur so eingestellt, dass ein arterieller pCO₂ von annähernd 40 mmHg eingehalten wurde. Die zuletzt ausgeatmete Konzentration an Isofluran wurde gemessen und kontrolliert, um von Hund zu Hund für einen begründeten Vergleich des Anästhesieniveaus zu sorgen.
Die Hunde wurden mit Instrumenten versehen, um die Parameter der hämodynamischen Funktion und des Sauerstofftransports zu überwachen. Das Einsetzen eines Einschwemmkatheters in die Lungenschlagader wurde mit einer Analyse der Drücke und mit Druckaufzeichnungen bestätigt. Ein Doppellumenkatheter mit der Fähigkeit zur Bestimmung des Herzzeitvolumens mit Hilfe der Thermodilution wurde in die Oberschenkelschlagader eingeführt, um für eine Arterienleitung zur Überwachung des Blutdrucks sowie für eine Blutentnahme zu sorgen. Für den Volumenersetz und die Verabreichung der Test/Kontroll-Substanzen wurde ein Katheter in die Vena cephalica oder, falls erforderlich, eine andere Vene eingeführt.
Jeder Hund erhielt prophylaktisch einen Tag vor dem chirurgischen Eingriff, am Tag des chirurgischen Eingriffs und 3 tage lang nach der Entfernung der Milz einmal täglich eine Injektion von Antibiotika (Procain Penicillin G). V-Sporin, ein topisches Antibiotikum (Polymyxin B, Bacitracin, Neomycin) wurde, wie benötigt, einmal täglich am Ort der Operation aufgetragen.
Nach Anwendung der Instrumente wurden eine hämodynamische Stabilisierung zum Erreichen eines pCO2 von annähernd 40 mmHg sowie das sammeln von Baisniveau-Messungen durchgeführt. Sodann wurde ein Modell einer akuten normovolämischen Blutverdünnung erstellt, indem den Hunden Blut entnommen und gleichzeitig etwa das 1,6- bis 2,3-fache der entnommenen Volumina durch Ringer Lactatlösung ersetzt wurde, um einen isovolämischen Zustand aufrecht zu erhalten. Der isovolämische Zustand wurde erreicht, indem der Wedge-Druck ungefähr auf Basisniveau gehalten wurde. Die Blutentnahme/Volumenersatz dauerte ungefähr 45 bis 90 Minuten, bis die Hb-Konzentration etwa 30 g/l (3,0 g/dl) betrug. Die Ringer Lactatlösung wurde schnell infundiert, indem win Gravita Intravenous Set sowie eine Druckmanschette um den Infusionsbeutel verwendet wurden. Falls der arterielle systolische Blutdruck nach dem Auslösen de akuten Anämie und vor dem Beginn der Dosierung für mehr als 5 Minuten Dauer [50 mmHg lag, wurde der Hund zurückgewiesen und durch einen Ersatzhund ersetzt, der unter den gleichen Umgebungsbedingen gehalten wurde.
Die Dosen der Kolloid-Kontroll-Lösung und der Hb-Lösung wurden wie in Tabelle V angegeben verabreicht. Die hämodynamischen Messungen wurden vor der Blutentnahme, vor Verabreichung der Dosis, unmittelbar nach der Verabreichung der Dosis sowie 60 Minuten und 24 Stunden nach der Verabreichung der Dosis vorgenommen. Nach der 60 Minuten-Messung erwachte der Hund aus der Narkose und wurde für hämodynamische Messungen, die 24 Stunden nach der Verabreichung der Dosis durchgeführt wurden, erneut an Instrumente gelegt Tabelle V
Alle hämodynamischen Parameter wurden statistisch analysiert, entweder mit einer Varianzanalyse (ANOVA) oder eine Covarianzanalyse (ANCOVA) mit entweder dem Wert vor der Blutentnahme oder dem Wert nach der Verabreichung der Dosis als Covariat. Es wurden spezifische lineare Kontraste konstruiert, um die Volumeneffekte der verabreichten Lösung zu testen, der Effekt des Hb-Blutersatzmittels (Arzneimitteleffekt) und die Do sis-Wirkung des Hb-Blutersatzmittels. Diese Tests wurden nur für Parameter durchgeführt, für welche die Differenz zwischen den experimentellen Gruppen beim 0,05 Niveau statistisch signifikant war. Vergleiche von spezifischen Variablen zu verschiedenen Zeitpunkten wurden mit paarweisen Student-Tests in jeder Gruppe durchgeführt.
Der arterielle Sauerstoffgehalt war in dieser Untersuchung ein Kriterium für die Wirksamkeit. Der arterielle Sauerstoffgehalt ist ein Maß für die Sauerstoff-Transportkapazität von zellulärem Hb und Plasma-Hb sowie für den im Plasma gelösten Sauerstoff. In Abwesenheit von Plasma-Hb berechnet sich der arterielle Sauerstoffgehalt aus der von gesättigtem zellulären Hb transportierten Sauerstoffmenge und dem Partialdruck des eingeatmeten Sauerstoffs. Weil in dieser Untersuchung davon ausgegangen wurde, dass das Plasma-Hb einen signifikanten Beitrag zum Sauerstoffgehalt leistet, wurde der Sauerstoffgehalt direkt unter Verwendung eines LexO2Con-K-Instruments (Chestnut Hill, MA) gemessen. Während des Experiments wurde keine mit Sauerstoff angereicherte Luft verabreicht, weil es nicht nötig war und um die störenden Effekte einer erhöhten eingeatmeten Sauerstoffkonzentration auf die Messung des arteriellen Sauerstoffgehalts zu vermeiden.
Die mittleren arteriellen und venösen Sauerstoffgehalte nahmen nach der Auslösung einer Anämie in allen Gruppen um das vier- bzw. achtfache ab. Der arterielle Sauerstoffgehalt stieg 60 Minuten nach Verabreichung der Dosis im Vergleich mit den Werten vor Verabreichung der Dosis in allen mit Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen signifikant an und blieb 24 Stunden nach Verabreichung der Dosis bei den Gruppen mit mittlerer und hoher Dosis deutlich erhöht. Der arterielle oder venöse Sauerstoffgehalt veränderte sich nach Verabreichung der Dosis in jeder der Kontrollgruppen nicht.
Wie in 2 gezeigt, war der arterielle Sauerstoffgehalt in den mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen im Vergleich mit den Kontrollgruppen 60 Minuten und 24 Stunden nach der Verabreichung der Dosis deutlich erhöht. 60 Minuten und 24 Stunden nach der Verabreichung der Dosis war eine lineare Dosis-Wirkungs-Beziehung zu erkennen. 60 Minuten nach der Verabreichung der Dosis wurde für den arteriellen Sauerstoffgehalt ein deutlicher Volumeneffekt nachgewiesen.
Auch der venöse Sauerstoffgehalt wurde in den mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen im Vergleich mit den Kontrollgruppen 60 Minuten und 24 Stunden nach der Ver abreichung der Dosis deutlich erhöht. der Anstieg zeigte 60 Minuten nach Verabreichung der Dosierung eine lineare Dosis-Wirkungs-Beziehung, jedoch nicht 24 Stunden danach.
Die beobachtete Dosis-Wirkungs-Beziehung, die bei mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen im Unterschied des arteriellen und venösen (A-V) Sauerstoffgehalts 60 Minuten nach Verabreichung der Dosis beobachtet wurde, wurde den auf dem Fehlen eines Arzneimitteleffekts beruhenden deutlichen Volumeneffekten sowie ähnlichen Beobachtungen von Volumeneffekten in Kontrollgruppen 60 Minuten nach Verabreichung der Dosis zugeschrieben. Die mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen zeigten nach 24 Stunden im Vergleich mit den kolloiden Kontrollgruppen bei einer signifikanten linearen Dosis-Wirkungsbeziehung eine deutliche Vergrößerung des Unterschieds zwischen arteriellem und venösem (A-V) Sauerstoffgehalt. Der A-V-Unterschied ist vor dem Hintergrund des Herzzeitvolumens zu interpretieren. 24 Stunden nach Verabreichung der Dosierung war der A-V-Unterschied in den Kontrollgruppen deutlich geringer als bei den mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen. Eine mögliche Erklärung für diesen Unterschied ist die, dass die Hunde der Kontrollgruppen auf ein größeres Herzzeitvolumen zurückgreifen mussten, um den Bedürfnissen des Sauerstoffverbrauchs bei peripheren Geweben nachzukommen. Die mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen behielten einen genügend großen A-V-Unterschied 24 Stunden nach Verabreichung der Dosis bei, um die Bedürfnisse der peripheren Gewebe ohne Grund für ein größeres Herzzeitvolumen zu befriedigen.
Zusätzlich zu dem arteriellen Sauerstoffgehalt wurden in dieser Untersuchung auch der arterielle Gesamtsauerstoffgehalt untersucht, der relativ zum Beitrag von RBC-Hb des Hundes (CaO₂/g RBC Hb) normalisiert war. Dieser Vergleich wurde unternommen um die Unterschiede im arteriellen Sauerstoffgehalt unter den Gruppen mit Verabreichung einer Dosis aufzuzeigen, das das RBS-Hb in allen Gruppen konstant war. Die mögliche Korrelation zwischen den Konzentrationen von Plasma-Hb oder Gesamthämoglobin und dem aerteriellen Sauerstoffgehalt würde ein brauchbares klinisches Maß für die Wirksamkeit abgeben. Wie in 3 gezeigt, zeigten alle mit Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen 60 Minuten und 24 Stunden nach Verabreichung der Dosis (mit Ausnahme der Gruppe mit niedriger Dosis nach 24 Stunden) einen deutlichen Anstieg des CaO₂/g RBC-Hämoglobins gegenüber den Werten vor der Verabreichung der Dosis. Der arterielle Sauerstoffgehalt in Bezug auf den von RBC-Hb beigetragenen unterschied sich nicht signifi kant in den Kolloidkontrollen zwischen dem Wert vor der Verabreichung der Dosis und den Werten 60 Minuten oder 24 Stunden nach Verabreichung der Dosis.
Der arterielle Gesamtsauerstoffgehalt in Bezug auf den vom Hb der RBCs beigesteuerten war in den mit Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen im Vergleich mit den kolloiden Kontrollen 60 Minuten nach der Verabreichung der Dosis mit einem signifikanten linearen Dosis-Wirkungs-Beziehung signifikant erhöht. Ein signifikanter Dosis-Effekt trat auch 24 Stunden nach der Verabreichung der Dosis mit einer signifikanten linearen Dosis-Wirkungs-Beziehung auf, aber der Arzneimitteleffekt war nicht ganz signifikant (P < 0,06).
Die Sauerstoffabgabe war ein anders Kriterium für die Wirksamkeit. Die Sauerstoffabgabe wird auf Grundlage des arteriellen Sauerstoffgehalts und des Herzzeitvolumens berechnet. Die Sauerstoffabgabe wird daher von allen physiologischen Faktoren beeinflusst, welche einen Einfluss auf das Herzzeitvolumen ausüben. Die für diese Untersuchung gewählte Kontrolle war das synthetische Kolloid (RHEOMACRODEX-Saline, Pharmacia), welches aus 10% Dextran 40 und 0,9% Saline besteht, wenn es das intravaskuläre Volumen expandiert und von dem nicht bekannt ist, dass es Sauerstoff transportiert. Die Kontrolle lieferte einen Vergleich der äquivalenten Volumenexpansion mit den kolloidalen Eigenschaften des Hämoglobins im Hb-Blutersatzmittel.
Weil erwartet wurde, dass jede Dosis des Hb-Blutersatzmittels einen unterschiedlichen Volumeneffekt zeigt, wurden zwei Dosen der Dextranlösung als Kontrollen für den Volumeneffekt eingesetzt, so dass die Daten nur den Arzneimitteleffekt der unterschiedlichen Dosen widerspiegeln würden. Dieser Vergleich wurde für die niedrigen und mittleren Dosen durchgeführt. Die Dosen der Kolloidkontrollen wurden auf Grundlage der Dosen von Dextran 40 ausgewählt, welche einen äquivalenten Vergleich der onkotischen in vivo-Effekte der Testsubstanzen mit niedriger und mittlerer Dosierung lieferten, wie dies aus den Ergebnissen von Beispiel 2 ermittelt wurde.
Der Volumeneffekt wurde statistisch definiert, indem die mittlere Differenz zwischen dem Kolloid mit mittlerer Dosierung (14 ml/kg) dem Kolloid mit niedriger Dosierung (7 ml/kg) verwendet wurden. Die Arzneimittelwirkung wurde durch Vergleich von jeder mit Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppe mit ihrer entsprechenden Kolloidkontrolle ermittelt.
Eine lineare Dosis-Wirkungs-Beziehung trat auf, wenn zwischen den mit einer niedrigen Dosis des Hb-Blutersatzmittels behandelten Gruppen und den mit einer mittleren Dosis des Hb-Blutersatzmittels behandelten Gruppen ein statistisch signifikanter Unterschied zu erkennen war.
Die Sauerstoffabgabe wurde nach der Gleichung DO₂ = CO × CaO₂ y 10/kg berechnet, in welcher CO das Herzzeitvolumen und CaO₂ den arteriellen Sauerstoffgehalt bedeuten. Wie erwartet trat bei allen Behandlungsgruppen nach der Auslösung einer Anämie ein zwei- bis dreifacher mittlerer Anstieg bei der DO₂ auf. Der Sauerstoffgehalt nahm genügend ab, so dass das Halten des Sauerstoffverbrauchs auf Basisniveau von einem Anstieg des Herzzeitvolumens und einer erhöhten Extraktion von Sauerstoff herrühren musste, was zu einem niederen venösen Sauerstoffgehalt führte. Wie in 4 gezeigt, nahm die Sauerstoffabgabe 60 Minuten nach der Dosierung im Vergleich mit den Werten vor der Dosierung in der mit niedriger Dosis des Hb-Blutersatzmittels behandelten Gruppe um ca. 30% zu und war in den mit mittlerer Dosis des Hb-Blutersatzmittels behandelten Gruppen größer als 100%. Der Unterschied war für alle drei Dosierungsgruppen signifikant (p < 0,05). Die Kontrollgruppen zeigten über dies Zeit hinweg keine signifikanten Unterschiede. 60 Minuten nach der Dosierung war in allen Gruppen die DO₂ signifikant unterschiedlich mit signifikanten Arzneimittel- und Dosis-Effekten mit linearer Dosis-Wirkungs-Beziehung. 24 Stunden nach der Dosierung war unter den Gruppen kein Unterschied mehr in der Sauerstoffabgabe bemerkt worden. Die Verbesserung bei der Sauerstoffabgabe 60 Minuten nach der Dosierung für alle mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen im Vergleich mit ihren entsprechenden kolloiden Kontrollen war primär auf einen mit der Dosis in Zusammenhang stehenden Anstieg des arteriellen Sauerstoffgehalts zusätzlich zu einer mäßigen Zunahme des Herzzeitvolumens zurückzuführen.
Der Sauerstoffverbrauch wurde nach der Gleichung VO₂ = CO × CaO₂ × 10 kg berechnet. Eine zwei- dreifache mittlere Abnahme der DO₂ fand nach dem Auslösen der Anämie in allen Gruppen statt. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede unter den mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Kontrollgruppen oder in einer Gruppe bemerkt, wenn die Werte vor der Dosierung mit den Werten nach der Dosierung verglichen wurden.
Das Sauerstoff-Extraktionsverhältnis (VO₂/DO₂) für alle Gruppen zeigte einen ungefähr dreifachen Anstieg nach Auslösung der Anämie. Die Sauerstoff-Extraktionsverhältnisse nahmen in allen mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen 60 Minuten nach der Dosierung im Vergleich mut den Kontrollgruppen signifikant ab. Zwischen den mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen und den Kontrollgruppen wurden 24 Stunden nach der Dosierung keine signifikanten Unterschied bemerkt.
Das mittlere Herzzeitvolimen stieg in allen Gruppen nach Auslösung der Anämie um 10% bis 39% an. Das Herzzeitvolumen war 24 Stunden nach der Dosierung im Vergleich mut den Werten vor der Blutentnahme in den kolloiden Kontrollgruppen signifikant größer, jedoch nicht bei den mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen. Ein signifikanter Volumeneffekt, der zu den signifikanten Unterschieden beim Herzzeitvolumen zwischen den Kolloidgruppem mit niedriger und mittlerer Dosis beitrug, war 60 Minuten nach der Dosierung evident. Der Zuwachs des Herzzeitvolumens stand auch in Folge der Expansion des intravaskulären Volumens nach der Dosierung oder einem erhöhten sympathetischen Tonus in Folge des Belastung mit der schweren Anämie mit einem erhöhten Schlagvolumen in Verbindung. Eine signifikante Dosis-Wirkung zwischen den mit dem Hb-Blutersatzmittel mit niederiger und hoher Dosis behandelten Gruppen waren 60 Minuten nach der Dosierung zu beobachten, aber nicht 24 Stunden nach der Dosierung. Kein Unterschied im Herzzeitvolumen zwischen den mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen und den kolloiden Kontrollgruppen war 60 Minuten oder 24 Stunden nach der Dosierung zu erkennen.
Der Wedge-Druck (PAWP) der Lungenschlagader änderte sich während der Auslösung der Anämie nicht. Der PAWP nahm in der Kolloid-Gruppe mit niedriger Dosis 60 Minuten nach der Verabreichung der Dosis im Vergleich mit den Werten vor Verabreichung der Dosis signifikant ab blieb in der Kolloid-Gruppe mit mittlerer Dosis unverändert. Der PAWD in den mit dem Hb-Blutersatzmittel in mittlerer und hoher Dosierung behandelten Gruppen war 60 Minuten nach der Dosierung im Vergleich mit den Werten vor Verabreichung der Dosis in linearer Dosis-Wirkungs-Beziehung signifikant angestiegen. Der erhöhte PAWD widerspiegelte 60 Minuten nach der Dosierung eine Dosis-abhängige Zunahme des intravaskulären Volumens. 60 Minuten oder 24 Stunden nach der Dosierung wurde zwischen den mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen und den Kontrollgruppen kein signifikanter Arzneimitteleffekt entdeckt. 60 Minuten nach der Dosierung wurde in der Kolloid-Kontrollgruppe ein signifikanter Volumeneffekt nachgewiesen.
In allen Gruppen wurden nach der Auslösung der Anämie der systolische, diastolische und mittlere arterielle Blutdruck signifikant ab und stiegen dann unmittelbar nach der Dosierung signifikant an. Die Abnahme des systolischen arteriellen Blutdrucks nach Auslösung der Anämie stand wahrscheinlich mit einer Abnahme des peripheren vaskulären Widerstands in Folge der verringerten Viskosität des Blutes als Folge der Anämie in Zusammenhang. 60 Minuten nach der Dosierung unterschieden sich der systolische, diastolische und mittlere arterielle Blutdruck beider Kontrollgruppen nicht signifikant von den Werten vor der Dosierung. Der systolische, diastolische und mittlere Druck der Kolloidkontrolle mit niedriger Dosis unterschieden sich 24 Stunden nach der Dosierung im Vergleich mit den Werten vor der Dosierung nicht signifikant. Im Gegensatz dazu war die Zunahme der systolischen, diastolischen und mittleren Drücke in allen mit Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen 60 Minuten und 24 Stunden nach der Dosierung im Vergleich mit den Werten vor der Dosierung statistisch signifikant. Die systolischen, diastolischen und mittleren Blutdrücke der mit Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen waren 60 Minuten aber nicht 24 Stunden nach der Dosierung signifikant höher als bei den entsprechenden kolloiden Kontrollgruppen.
60 Minuten nach der Dosierung wurden im Vergleich mit den Werten vor der Dosierung signifikante Zunahmen der systolischen, diastolischen und mittleren Drücke der Lungenschlagader in den mit Hb-Blutersatzmittel mit mittlerer und hoher Dosis behandelten Gruppen beobachtet. Die Zuwächse blieben 24 Stund nach der Dosierung in der mit Hb-Blutersatzmittel mit mittlerer Dosis behandelten Gruppe für den diastolischen Lungenschlagaderdruck bestehen. Zusätzlich zeigte 24 Stunden nach der Dosierung die Kolloidgruppe mit niedriger Dosis im Vergleich mit den Werten für den mittleren Druck der Lungenschlagader vor der Dosierung einen statistisch signifikanten Anstieg. Dieser Anstieg wurde als klinisch signifikant angesehen. Die Anstiege im systemischen arteriellen systolischen und diastolischen Blutdruck 60 Minuten nach der Dosierung von Hb-Blutersatzmittel im Vergleich mit den Werten vor der Dosierung waren ein direkter Arzneimitteleffekt des Hb-Blutersatzmittels. Der diastolische Druck blieb in den Kolloid-Kontrollgruppen unverändert, was wahrscheinlich das Ergebnis eines verminderten peripheren vaskulären Widerstandes war.
Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen und den Kontrollgruppen für den systolischen Druck der Lungenschlag ader entweder 60 Minuten oder 24 Stunden nach der Dosierung gefunden. Im Gegensatz dazu unterschieden sich der diastolische und der mittlere Druck der Lungenschlagader signifikant in Bezug auf das Volumen, das Arzneimittel und die Dosis-Wirkungen 60 Minuten, aber nicht 24 Stunden, nach der Verabreichung der Dosis.
Der Gesamthämoglobingehalt nahm bei der Blutentnahme ungefähr um das vierfache oder mehr ab. Mit Hb-Blutersatzmittel behandelte Gruppen zeigten 60 Minuten und 24 Stunden nach der Dosierung einen dosisabhängigen Anstieg des Gesamthämoglobingehalts im Vergleich mit den entsprechenden Kolloid-Kontrollgruppen.
Die Plasma-Hämoglobin-Konzentrationen stiegen 60 Minuten und 24 Stunden nach der Dosierung in den mit Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen im Vergleich mit den entsprechenden Kolloid-Kontrollgruppen dosisabhängig an. Die Zuwächse der Plasma-Hämoglobin- und Gesamthämoglobin-Konzentrationen nach der Dosierung in allen mit Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen im Vergleich mit den entsprechenden Kolloid-Kontrollgruppen waren dem Hämoglobingehalt des Hb-Blutersatzmittels zuzuschreiben. Der dosisabhängige signifikante Anstieg hielt 24 Stunden an stand in Korrelation mit dem anhaltenden Zuwachs des arteriellen Sauerstoffgehalts.
Zusammengefasst war die Wirkung auf die Behandlung mit dem Hb-Blutersatzmittel linear, d.h. 60 Minuten nach der Verabreichung der Dosis war die Verbesserung der Sauerstoffabgabe und der hämodynamischen Eigenschaften umso größer, je größer die Dosis für das Hb-Blutersatzmittel war. Der aufrecht erhaltene arterielle Sauerstoffgehalt und normale klinische Symptome beim Atmen von Raumluft stützen eine heilsame biologische Wirkung des Hb-Blutersatzmittels, welche in den mit Dosen von 30 ml/kg und 45 ml/kg Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen 24 Stunden andauern. Die Clearance des Hb-Blutersatzmittels ist auch verantwortlich für die bei der Sauerstoffabgabe und den hämodynamischen Effekten 24 Stunden nach der Dosierung beobachteten Veränderungen. Schließlich stützen die Ergebnisse aus dieser Untersuchung die Wahl einer Dosis, die von 30 ml/kg bis 45 ml/kg reicht. Beide dieser Dosierungsgruppen zeigten bei den Parametern für die Wirksamkeit statistisch signifikante Unterschiede von entsprechenden Kontrollgruppen und die Dosis-Wirkungs-Beziehung war linear.
Die logische klinische Grundlage für diesen Dosisbereich beruht auf der Tatsache, dass ein stark anämischer Hund (z.B. mit einem Hämatokrit von < 15% mit deutlichen klinischen Symptomen) von einer höhern Dosis einen Nutzen ziehen könnte, wie sich dies durch die lineare Dosis-Wirkungs-Beziehung eines besseren arteriellen Sauerstoffgehalts und einer besseren Sauerstoffabgabe zeigt. Eine konservativere Dosis jedoch wäre für einen Hund angezeigt, der anfällig für eine intravaskuläre Volumen-Überbelastung ist. Der dosisabhängige vorübergehende Anstieg im Wedge-Druck der Lungenschlagader und den 60 Minuten nach der Verabreichung der Dosis bei mit dem Hb-Blutersatzmittel behandelten Gruppen beobachteten Drücken der Lungenschlagader würde eine Verwendung von höheren Dosen bei dieser Population von Hunden beschränken. Daher würde in einer breiten Hundepopulation, in welcher der Grad der Anämie und der Status des intravaskulären Volumens feststehen, ein Dosierungsbereich von 30–45 ml/kg effektiv sein.
BEISPIEL 5
UNTERSUCHUNG DER DOSIS-WIRKUNGS-BEZIEHUNG BEIM MENSCHEN
Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um die Sicherheit und Toleranz steigender Raten einer intravenösen Verabreichung des Hb-Blutersatzmittels (iom Folgenden als HBOL bezeichnet) auf hämodynamische, neuroendokrine und hämatologische Parameter beim Menschen zu bewerten. Die Testpersonen waren normale, gesunde, männliche Erwachsene (70–90 kg) mit einem Alter zwischen 18 und 45 Jahren. Während der Untersuchung wurden die Testpersonen auf eine kontrollierte isokalorische Diät von 55% Kohlenhydraten, 30% Fett (Verhältnis von mehrfach ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren 2:1), 15% Protein und 250 mÄqu Natrium pro Tag gesetzt. Die Flüssigkeitsaufnahme betrug 3000 ml/Tag, wobei koffeinhaltige Getränke vermieden wurden. Eine gleichzeitige Einnahme von Medikamenten wurde ebenfalls vermieden. Ferner wurden bei dieser Untersuchung von den Testpersonen auch kein Alkohol oder Tabak konsumiert.
Die 12 untersuchten Personen wurden in drei Testgruppen eingeteilt. In jeder Testgruppe erhielten drei Personen HBOL und eine Person diente als Kontrolle, welche Ringer Lactat-Lösung erhielt. Jede Testgruppe erhielt unterschiedliche Raten einer HBOL-Infusion. Die Untersuchung wurde als Rate Escalation-Blindversuch über einen Zeitraum von 30 Tagen durchgeführt.
Während der stationären Phase am Tag 1 der Untersuchung wurde jedem Patienten ei kleiner arterieller Messkatheter in die Radialis der nicht dominanten Hand eingeführt. Der Einführungsort wurde mit einer antiseptischen Lösung (Alkohol und/oder Iod) gereinigt und dann eine kleine menge 1%–2% anästhetischer Lidocain-Lösung subkutan über dem Ort der Radialis injiziert. Der Arterienkatheter wurde eingesetzt, um den Blutdruck zu überwachen und um die Bestimmung der Blutgase zu erleichtern. Ein bis zwei Stunden danach hatten wurde allen Personen in eine Vene an einem Arm ein großlumiger intravenöser Katheter (eine Nadel von 16 Gauge in der Ellenbeuge) eingepflanzt. Jede Person wurde dann einer Venenpunktion von 750 ml (1,5 Einheiten) Vollblut in weniger als 15 Minuten unterzogen, gefolgt on einer isovolämischer Blutverdünnung durch Infusion von 2250 ml Ringer Lactatlösung über einen Zeitraum von 2 Stunden.
Unter Einsatz einer Steriltechnik wurden sodann 45 Gramm (346 ml) HBOL intravenös infundiert, indem das HBOL nacheinender durch einen standardisierten 80 μm Blutfilter und einen 5 μm Filter filtriert wurde und dann wurde das HBOL durch den großlumigen intravenösen Katheter in die Armvene von jeder Person aus den Testgruppen 1, 2 und 3 mit Geschwindigkeiten von 0,5 g/min, 0,75 g/min bzw. 1,0 g/min infundiert.
Gleichzeitig erfuhr jede Person über den Radialis-Katheter eine Überwachung der Invasion mittels Reihentests der Lungenfunktion, einer Beurteilung der Herzfunktion, mehrfachen hämatologischen, chemischen und Harn-Labortests, die während der ersten 28 Stunden nach Beginn der HBOL-Infusion routinemäßig und häufig durchgeführt wurden.
Danach wurden in der ambulanten Phase (Tage 2–29) in den ersten vier Tagen nach der Infusion täglich und dann einen Monat lang jede Woche Laboruntersuchungen, Vitalzeichen, ECGs und medizinische Ereignisse durchgeführt bzw. aufgenommen Bemerkenswert war, dass während des Tages 1 die hämodynamischen Werte im Allgemeinen für den systolischen, diastolischen und mittleren arteriellen Druck bei den mit HBOL behandelten Gruppen höher lagen als bei den Kontrollen. Obwohl es eine beachtliche Variationsbreite im Blut gab, stehen die Daten für den Druck im Einklang mit der Aktivität des Patienten (z.B. bei Mahlzeiten oder bei Benutzung des Badezimmers) und dem Tagesrhythmus. Die mit HBOL behandelten Personen wiesen im Allgemeinen für den systolischen Blutdruck (ca. 5–15 mmHg), den diastolischen Blutdruck (ca. 5–10 mmHg) und den mittleren arteriellen Druck (ca. 10 mmHg) nur während des Tages 1 höhere Werte auf als die Kontrollen. Die Werte neigten dazu, während der Stunden 8–12 ihren Peak zu erreichen und kehrten während des Schlafs und nach Entfernung des arteriellen Katheters wieder auf Basisniveau zurück. Der Puls lag im Allgemeinen am Tag 1 in allen mit HOBL behandelten Gruppen im Vergleich mit den Kontrollen etwa 10 Schläge niedriger. der Tiefstpunkt des Pulsabfalls wurde innerhalb der ersten 15 Minuten der Infusion beobachtet. Nach 24 Stunden waren die Werte in allen Testgruppen ähnlich.
Der Herzindex fiel während der ersten Stunde der Infusion um ca. 1–2 l/min/m², blieb während der Stund 4 bis zu 1 l/min/m² unter dem Wert für die Kontrollen und kehrte dann in Stund 4 zum Basisniveau zurück. Der Herzindex stieg auch währen der aktiven Zeiten (wie oben) des Patienten an.
Der periphere Gesamtwiderstand verlief parallel mit den Veränderungen des Blutdrucks, die Werte kehrten jedoch binnen zwei Stunden auf Basisniveau zurück. Der vorübergehende Anstieg des systemischen Blutdrucks zusammen mit dem Anstieg des peripheren Gesamtwiderstands und dem Abfall des Herzindex kam nicht unerwartet. Es ist wichtig, zu betonen, dass es keinen Unterschied in der Geschwindigkeit der Verabreichung und der Größe dieser hämodynamischen Wirkungen und dass kein Eingreifen angezeigt war.
Die Lungenfunktionstests (einschließlich der Mehrfachbestimmungen der Spirometrie und der Lungenvolumina) sowie die Messungen des arteriellen Blutgases waren nicht bemerkenswert. Was bemerkenswert war, war die die gesteigerte Diffusionskapazität, welche in den mit HOBL behandelten Gruppen beobachtet wurde. Der 10–15% Anstieg der Diffusionskapazität war im Vergleich mit dem 10% Abfall bei den Kontrollen bis zu 24 Stunden statistisch signifikant. Diese Befunde waren wegen des Ausmaßes der Phlebotomie und der Blutverdünnung, denen alle Gruppen unterzogen wurden, besonders wichtig, Anders als erwartet waren in den hämatologischen Untersuchungen mit dem vorübergehenden Rückgang von Hämoglobin, Hämatokrit und Zahl der roten Blutkörperchen und der Serumproteine die Labortests für Hämatologie und Serumchemie nicht bemerkenswert. Eine Ausnahme bildeten das Serum-Eisen und das Ferritin, welche bei den Stunden 6 bzw. 48 nach Verabreichung des HOBL Peak-Werte zeigten.
Die chemischen Messungen beim Serum waren nicht bemerkenswert, mit Ausnahme von einer Person (# 10), bei welcher ein vorübergehender Anstieg bei den Serum-Transaminasen und der Lipase zu verzeichnen war. Es ist wichtig, festzuhalten, dass bei dieser Person keinerlei klinisch signifikante medizinische Vorkommnisse (z.B. Schluckstörungen oder Bauchschmerzen) zu verzeichnen waren, welche mit dem Zeitpunkt des Auftretens der erhöhten Werte für diese Enzyme zusammenfielen. Die genaue Ätiologie dieser anomalen Laborwerte ist unklar, aber vorhergehende Untersuchungen legen nahe, dass eine vorübergehende subklinische Verkrampfung des Oddi-Sphinkter oder von anderen Abschnitten des Leber/Galle- und Pankreasgangsystems eine Rolle spielen könnten. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass diese Veränderungen vorübergehend (und nicht von Bauchbeschwerden begleitet) und ohne ersichtliche Folgeerscheinungen waren. Im dem nach der Dosierung aufgenommenen Ultraschallbild der Gallenblase von Person #10 waren keine signifikanten Veränderungen zu erkennen.
Die Urinanalyse war über die ganzen Untersuchungen hinweg nicht bemerkenswert. Während der Untersuchungen gab es bei den Personen keinerlei nachweisbare Hämoglobinspuren im Harn. Zusätzlich war während der Zeit der Blutverdünnung die Kreatinin-Clearance wie erwartet geringfügig erhöht, während das Adenosindeaminase-Bindungsprotein im Harn, die Elektrolyte (Natrium, Kalium, Chlorid), Eisen, Mikroalbumin, NAG (N-Acetyl-β-glucosaminidase) und der Harnstickstoff aus Harnstoff nicht bemerkenswert waren.
In Abhängigkeit von der Verabreichungsgeschwindigkeit wurden keine ersichtlichen Veränderungen bei der Mehrzahl der pharmakokinetischen Parameter beobachtet. Vor und nach dem Beginn der HBOL-Infusion wurden für eine Größenausschluss-(Gelfiltrations)-Chromatographie (SEC)-Analyse des Gesamthämoglobins und der offensichtlichen Molekulargewichtsfraktionen des Hämoglobins regelmäßig aufeinander folgende Blutproben und zusätzliche Urinproben gesammelt. Es wurden nur sporadische Konzentrationen von Plasma-Dimmer-Fraktionen beobachtet, welche jede pharmakokinetische Analyse ausschließen. Die einzigen statistisch signifikanten Unterschiede (p < 0,05) wurden bei der Tetramer-Volumen-Verteilung (nimmt mit zunehmender Geschwindigkeit ab), der erreichten maximalen Tetramer-Konzentration (nimmt mit zunehmender Geschwindigkeit zu) und der Zeit des Auftretens der maximalen Tetramer-Konzentration (nimmt mit zunehmender Geschwindigkeit ab) beobachtet.
Die beobachteten medizinischen Vorkommnisse standen mit den erwarteten Befunden zur Phlebotomie (z.B. eine vasovagale Episode), zu den mehrfachen Lungenfunktionstests (Aerophagie, Aufstoßen oder abdominales "Gas"), zu der Einführung in die Arterienbahn (z.B. Schmerz oder nervöses Zittern) oder zu abdominalen Beschwerden (z.B. assoziiert mit der Einnahme des Eisen-Supplements) in Einklang. Obwohl es so aussah, als gäbe es einen Hintergrund für unspezifische vorübergehende Darm-"Gase", kamen keine Fälle von offenkundigen Bauchschmerzen oder Dysphagie. Zusätzlich gab es keine Korrelation dieser Symptome mit irgendwelche Veränderungen bei den Serum-Transaminasen oder der Lipase.
Zusammengefasst wurde HBOL gut vertragen. Obwohl es kleine vorübergehende Anstiege beim Blutdruck und dem peripheren Gesamtwiderstand mit gleichzeitigem Abfall des Herzindex während der ersten zwei Stunden der Infusion gab, waren die hämodynamischen Befunde nicht bemerkenswert. Die Erhöhung der Diffusionskapazität war während der ersten 24 Stunden bei den mit HOBL behandelten Gruppen größer als bei den Kontrollen.
BEISPIEL 6
WIRKUNG VON HOBL AUF DEN MENSCHEN BEIM FAHRRADTEST
Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um die Übungskapazität von Personen zu bestimmen, denen eine autologe Transfusion von HBOL verabreicht wurde. Spezifische Endpunkte waren die Lungenfunktion (z.B. die Diffusionskapazität und die Milchsäure-Spiegel und der pO₂), die hömodynamischen Werte (z.B. die Herzfrequenz, der Herzindex und der Blutdruck) sowie die Belastungstoleranz (z.B. die Ausdauer, die Arbeitsbelastung und die anaerobe Schwelle). Die Personen waren sechs normale, gesunde Menschen männlichen Geschlechts mit einem Alter von 18–45 Jahren. Eine Person wurde in der Untersuchung ausgetauscht, da sie das Venenpunktionsvolumen in weniger als 15 Minuten nicht erreichen konnte. Die Untersuchung wurde als randomisierter Zweifach-Crossover-Blindversuch durchgeführt.
Alle Personen hatten eine Venenpunktion von 750 ml, gefolgt von einer Ringer Lactat [3:1]-Infusion und entweder einer autologen Transfusion (ATX) oder 45 g HBOL. Das ATX oder HBOL wurde über 90 Minuten mit 0,5 g/min verabreicht. Am Tage vor der Phlebotomie und etwa 45 Minuten nach der Infusion von ATX oder HBOL wurden Fahrrad-Belastungstests durchgeführt. Der gleiche Ablauf wurde eine Woche später wiederholt und die Personen einer Cross-over-Behandlung unterzogen.
Am Tag der Dosierung (Tage 1 und 8) wurde allen Personen eine Arterienleitung in eine Radialis eingesetzt, sie wurden an Geräte für eine Kardia-Telemetrie und Impedanz-Kardiographie angeschlossen und dann erfolgte eine Venenpunktion (PBX) von 750 ml Vollblut (< 15 Minuten). Darauf erfolgte eine Infusion von 2250 ml Ringer Lactatlösung (RL) über einen Zeitraum von zwei Stunden (der isovolämischen Blutverdünnungs-Phase). Die Personen erhielten dann entweder HBOL (45 g [ca. 346–360 ml] mit einer Geschwindigkeit von 0,5 g/min über einen Zeitraum von 90 Minuten) oder ATX (110–120 g Hämoglobin [ca. 750 ml] mit derselben Geschwindigkeit und über dieselbe Zeit wie beim HBOL). Der BEST erfolgte ca. 45 Minuten nach dem Ende von jeder Infusion. Aufeinander folgende Messungen der arteriellen Blutgase, der Hämatologie, der Chemie sowie die Urintests erfolgten intensiv während des 24-stündigen Zeitraums an den Zagen 1 und 8. Eine Reihennachbehandlung erfolgte ambulant zwischen den Dosierungen und über einen Zeitraum von 1 Monat, nachdem alle Dosierungen beendet waren.
Die Personen waren in der Lage, während der HBOL- und ATX-Zeiten bis zu ähnlichen Belastungsniveaus zu üben. Die Sauerstoffaufnahme (VO₂) und die Produktion von Kohlendioxid (VCO₂) an der anaeroben Schwelle waren nahezu identisch. Die aktuelle Arbeitsbelastung in METS, die Watt, der Puls (als % des maximalen Pulses), die Zeit bis zur anaeroben Schwelle, das Atemhubvolumen (VT) und das Minutenvolumen (VE) waren ebenfalls ähnlich. Die Werte für die arteriellen Blutgase waren während des HBOL- und ATX-Zeitraums ähnlich. Die kleinen Verringerungen beim pH und Bicarbonat bei einem Anstieg des Milchsäurewertes steht mit den erwarteten Befunden an der aeroben Schwelle in Einklang. Die Ergebnisse dieser Fahrradtests zeigten, dass die Belastungskapazität (definiert als Zeit und Arbeitsbelastung bis zum Erreichen der anaeroben Schwelle) am Basisniveau und nach den Infusionen von jeder autologen Transfusion oder von HBOL ähnlich war. Speziell war die Hämodynamik beim systolischen, diastolischen und mittleren arteriellen Druck während des HOBL-Zeitraums mit geringfügig höheren werten (-5 mmHg) bemerkenswert. Gleichartig wie der Anstieg des Blutdrucks war der Anstieg peripheren Gesamtdrucks, im Allgemeinen innerhalb der ersten vier Stunden. der Herzindex fiel während des HBOL-Zeitraums (-0,5 l/min/m²). Der Puls war während des HBOL-Zeitraums etwa 5–10 Schläge niedriger als während des ATX-Zeitraums. Diese Befunde sind in den HBOL-Untersuchen beobachtet worden und waren von geringem klinischen Interesse.
Die Lungenfunktionstests waren nicht bemerkenswert, mit Ausnahme der Diffusionskapazität nach den AEX- und HBOL-Infusionen mit einem 14% Anstieg über das Basisniveau. Die Personen waren in der Lage, eine ähnliche Arbeitsbelastung während der HBOL- und ATX-Zeiten zu erreichen. Die Messungen der arteriellen Blutgase währen einer Peak-Belastung (anaerobe Schwelle) waren in beiden Zeiträumen ähnlich, aber der arterielle pO₂ tendierte während des HBOL-Zeitraums zu einem höheren Wert. Die Milchsäurespiegel im Plasma waren während des HBOL-Zeitraums niedriger als im ATX-Zeitraum. Die übrigen Stoffwechselmessungen zeigten, dass der Sauerstoffverbrauch, die Produktion von Kohlendioxid sowie der Energieverbrauch des Stoffwechsels während des HBOL-Zeitraums größer waren als während des ATX-Zeitraums. Der oben erwähnte Vergleich ist grob geschätzt etwa ein Gramm HOBL zu 3 Gramm ATX. Die Diffusionskapazität in Verbindung mit den Beobachtungen zu VO₂ und VCO₂ zeigt, dass pro Gramm HBOL mehr Sauerstoff an das Gewebe geliefert wird als pro Gram ATX. Es wird gewöhnlich angenommen, dass die Diffusionskapazität direkt mit dem Hämoglobinspiegel variiert, es liegt jedoch nahe, dass 1 Gramm Plasma-Hämoglobin die Diffusionskapazität um genau soviel erhöhen kann wie 3 Gramm RBC-Hämoglobin.
Die Laborversuche waren bemerkenswert für kleine aber vorübergehende Anstiege von ALT, AST, 5'-Nucleotidase, Lipase und Kreatinkinase während des HBOL-Zeitraums. Beim Urin gab es keine anomalen Befunde.
Die hämatologischen Untersuchungen standen mit denen in Beispiel 5 in Einklang.
Die beobachteten medizinischen Vorkommnisse standen mit den erwarteten Befunden zur Phlebotomie (z.B. eine vasovagale Episode), zu den Mehrfachen Lungefunktionstests (z.B. Aufstoßen oder Bauch-"Gase") zur Einsetzung einer Arterienleitung (z.B. Schmerz oder nervöses Zittern über dem Ort der Einführung) oder zu zahlreichen alltäglichen Beschwerden, welche bei normalen Personen im Verlauf eines Monats wahrgenommen werden könnten (z.B. Kopfschmerzen, eine Infektion der oberen Atmungswege oder ein Schnupfen im Einklang. Die eine Person (Person #105), welche eine abdominale "Gas"-Entwicklung und einen Druck im mittleren Epigastrium verspürte, aber ohne Dysphagie, lässt noch andere Magen-Darm-Beschwerden vermuten, welche in vorigen HBOL-Studien beobachtet worden sind. L-Arginin wurde als therapeutische Maßnahme auf der Grundlage des Konzepts eingesetzt, dass Hämoglobin die endogene Stickoxid-Funktion stören kann (Stickoxid ist bei der Entspannung der glatten Muskulatur im Magen-Darm-Trakt unerlässlich, besonders in der Speiseröhre und im Darm). L-Arginin ist das Substrat, für welche die Stickoxidsynthase Stickoxid produziert. Falls das Hämoglobin zu einer Verminderung des Stickoxidgehalts führ (vielleicht durch eine Anbindung von Häm an das Stickoxid), könnte die Verabreichung von L.Arginin theoretisch von Nutzen sein. Die Person erhielt offenbar durch das L-Arginin über einen Zeitraum von zwei Stunden eine vorübergehende Erleichterung von seinen Symptomen. Dies ist kein unerwarteter Befund, da die Halbwertszeit von L-Arginin im Plasma etwa eine Stund beträgt. Unglücklicherweise traten einige Nebenwirkungen (Übelkeit, Erbrechen) auf und die Infusion wurde angehalten. Wir entschlossen uns, ihm zwei Dosen eines Anticholinergikums, eines Antispamodikums, Hyoscyamin, zu verabreichen. Dies fuhr offensichtlich weiterhin damit fort, die Symptome des abdominalen "Gases" und des Drucks zu vermindern. Die Person hatte keine weiteren Beschwerden oder Folgeerscheinungen.
HBOL war zusammenfassend mit einer besseren Versorgung mit und Nutzung von Sauerstoff während der Arbeits- und Ruhephasen verbunden. HBOL lieferte ein ähnliches Spektrum von hämodxnamischen Daten, Sicherheit bei den Laborergebnissen, pharmakokinetischen Daten und medizinischen Ereignissen zu dem, was zuvor beobachtet worden ist. Ein Eingreifen mit L-Arginin kann zu einem Umschlag der Symptome im Magen-Darm-Trakt führen, sein Einsatz wurde aber durch Übelkeit und Erbrechen eingeschränkt. Der Einsatz einer Therapie mit einem Anticholinergikum könnte bei der Behandlung der im Magen-Darm-Trakt auftretenden Symptome wertvoll sein.
ÄQUIVALENTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Der Fachmann erkennt oder ist in der Lage, nur durch routinemäßiges Herumexperimentieren viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung aufzufinden. Diese oder alle anderen derartigen äquivalenten Ausführungsformen sollen von den folgenden Ansprüchen mit umfasst werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Hämoglobin-Produkts, bei dem man: (a) eine Hämoglobin-Lösung auf eine Anionenaustauscher-Chromatographiesäule lädt; und (b) wenigstens eine Tris(hydroxymethyl)aminomethanacetat-Pufferlösung in die Säule injiziert, wobei diese Pufferlösung einen pH aufweist, der niedriger als derjenige der Säule ist, wodurch ein gereinigtes Hämoglobin-Produkt von der Säule eluiert wird.
Verfahren von Anspruch 1, wobei wenigstens zwei Tris(hydroxymethyl)aminomethanacetat-Pufferlösungen sequenziell in die Säule injiziert werden, wobei jede dieser Pufferlösungen einen verschiedenartigen pH aufweist, wodurch die Säule einem abgestuften pH-Gradienten unterworfen wird.
Verfahren von Anspruch 1, wobei die Säule vor der Elution des Hämoglobin-Produkts mit wenigstens einer Tris(hydroxymethyl)aminomethanacetat-Pufferlösung äquilibriert wird.
Verfahren von Anspruch 3, wobei die Säule bei einem pH in einem Bereich von (a) zwischen 8,2 bis 8,6; oder (b) zwischen 8,2 und 8,4 äquilibriert wird; oder (c) einen pH von 8,3 aufweist.
Verfahren von Anspruch 4, wobei wenigstens elf Säulenhohlraumvolumina der Pufferlösung während dieser Äquilibrierung der Säule in die Säule injiziert werden.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Säule zunächst bei einem pH in einem Bereich zwischen (a) größer als 8,7; oder (b) in einem Bereich zwischen 8,7 und 10,0: oder (c) in einem Bereich zwischen 8,7 und 9,3; oder (d) in einem Bereich zwischen 8,9 und 9,1 äquilibriert wird.
Verfahren von Anspruch 6, wobei die Säule zunächst mit Tris(hydroxymethyl)aminomethanacetat äquilibriert wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Hämoglobin-Produkt mit einem Puffer bei einem pH (a) von weniger als 8,2; oder (b) in einem Bereich zwischen 6,5 und 7,5 eluiert wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Anionenaustauschermedium aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Amin- oder Ammonium enthaltenden Silicagel, Aluminiumoxidgel, Titandioxidgel (titania gel) vernetztem Dextran, Agarose, einem Polyacrylamid, einem Polyhydroxyethylmethacrylat oder Styroldivinylbenzol besteht.
Verfahren von Anspruch 9, wobei das Anionenaustauschermedium ein Amin oder Ammonium enthaltendes Silicagel ist.