DE69935786T2

DE69935786T2 - Geführte entwicklung und unterstützung von hydrogelzellzusammensetzungen

Info

Publication number: DE69935786T2
Application number: DE69935786T
Authority: DE
Inventors: Charles A. Vacanti; Martin Vacanti; Joseph P. Winchester Vacanti
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1999-04-22
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2019-04-23
Also published as: EP1076533A1; EP1076533B1; EP1076533A4; WO1999055252A1; DE69935786D1; JP2002512842A; WO1999055252A9; US7470425B2; US20040101518A1; AU3862499A; US6171610B1; ATE359039T1; JP4451985B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Erzeugung von Gewebe wie etwa Knorpel, Knochen, Nervensystem, Haut, Organe und Epithelschichten, um durch Krankheit oder Verletzung beschädigtes Gewebe zu reparieren oder zu ersetzen, um bestehendes Gewebe zu verstärken oder ursprünglich nicht vorhandenes Gewebe zu schaffen.
Hintergrund der Erfindung
In der medizinischen Gemeinschaft besteht starkes Interesse an Verfahren und Materialien für die Verwendung in der rekonstruktiven Chirurgie von Gewebe. Gewebezüchtung ist ein aufstrebender Ansatz, bei dem aus Gewebevorläuferzellen neues Gewebe wächst und in gewünschten Formen und Strukturen gezüchtet wird. Die Typen von Gewebe, die wachsen können und gezüchtet werden können, schließen zum Beispiel Knochen und Knorpel ein.
Eine der vorderrangigen Verwendungen von Ersatzknorpeln besteht darin, Defekte der Gelenkoberfläche von zahlreichen Gelenken zu korrigieren. Zum Beispiel kann ein beschädigter Knorpel des Meniskus in einem Knie eines Patienten durch einen künstlich gezüchteten Meniskus ersetzt werden. Siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5,041,138 (Vacanti et al.). In weiteren Beispielen von Gewebezüchtung können Hohlräume oder Lumen in Geweben mit Gewebevorläuferzellen, die zum Beispiel in Gelatine, Kollagen, Fibrin oder zahlreichen Hydrogelen suspendiert sind, gefüllt werden. Siehe zum Beispiel die Internationale Patentanmeldung WO 94/25080 mit dem Titel „Injizierbare Polysaccharid-Zell-Zusammensetzungen" (Griffith-Cima et al.).
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird ein Verfahren zur Erzeugung von neuem Gewebe in einem Patienten durch Einbringen einer flüssigen Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, die ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen enthält, in eine permeable, biokompatible Trägerstruktur beschrieben. Die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung füllt die permeable Trägerstruktur und nimmt bei Erstarren der Zusammensetzung die Form der Trägerstruktur an und neues Gewebe wird gebildet, da die Zellen wachsen und sich multiplizieren. Nach Sättigung mit der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung kann die Trägerstruktur einem Patienten implantiert werden. Alternativ kann die Trägerstruktur mit der flüssigen Hydrogel-Zell-Zusammensetzung gefüllt werden, nachdem sie in den Patienten implantiert wurde. Zum Beispiel kann die Trägerstruktur implantiert und anschließend mit der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung unter Verwendung einer Spritze oder eines Katheters eingespritzt werden. Die Trägerstruktur wird entsprechend des gewünschten, zu züchtenden Gewebes, z. B. ein Knochen, ein Meniskus für ein Knie, ein Ohr, ein Organ, eine Nase, ein Teil des Rückenmarks oder anderes Gewebe, z. B. Knorpelgewebe oder Gewebe des vegetativen Nervensystems, geformt.
Die Kombination aus Suspendieren der Gewebevorläuferzellen im Hydrogel und Einbringen der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in eine Trägerstruktur verbessert hochgradig die Qualität des Wachstums von neuem Gewebe und die Spannweite von Gewebeformen und -strukturen, die wachsen können. Die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung bildet eine einheitliche Zellverteilung mit einer gut definierten und genau kontrollierbaren Dichte. Darüber hinaus kann das Hydrogel sehr hohe Zelldichten, z. B. 50 Millionen Zellen/ml, tragen. Diese Faktoren verbessern die Qualität und Stärke des neuen Gewebes. Zusätzlich ermöglicht das Hydrogel die Diffusion von Nährstoffen und Abfallprodukten zu den Zellen hin oder von den Zellen weg, was Wachstum von Gewebe fördert.
Die Trägerstruktur liefert einen Träger für die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung und steuert die Entwicklung und Form des wachsenden Gewebes, das die Trägerstruktur füllt. Da anstatt der Trägerstruktur das Hydrogel die Gewebevorläuferzellen hält und suspendiert, kann die Trägerstruktur jede beliebige Form oder Struktur aus einer breiten Palette von Formen und Strukturen annehmen. Insbesondere sind geeignete Trägerstrukturen ausreichend permeabel, um die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung zu tragen und ermöglichen den Austausch von Nährstoffen und Abfallprodukten zwischen dem Hydrogel innerhalb der Trägerstruktur und Körperflüssigkeiten außerhalb der Trägerstruktur. Des Weiteren kann es sich bei den Trägerstrukturen um biologisch abbaubare oder biokompatible Trägerstrukturen handeln. Beispiele für Trägerstrukturen schließen Schwämme, Schäume, Korallen, feste anorganische, keramische oder metallische Strukturen ein, die innere Poren aufweisen, wie etwa aus Titan hergestellte Strukturen in Form von Waben, ein Skelett mit zarten Bälkchen, wie etwa ein Netz von dünnen, verflochtenen Polymerfasern, und ein Skelett mit dicken Bälkchen, wie etwa ein Netzwerk aus anorganischen, keramischen Stäben oder Stäben aus Plastik oder Metall, ein.
Gemäß einem Aspekt sieht die Erfindung im Allgemeinen ein ex vivo Verfahren zur Erzeugung von neuem Gewebe vor, das folgendes einschließt: Gewinnen einer flüssigen Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, das ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen einschließt; Einbringen der flüssigen Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in eine permeable, biokompatible Trägerstruktur mit einer vorbestimmten Form, die der Form des gewünschten Gewebes entspricht; und Ermöglichen, dass die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in der Trägerstruktur erstarren kann und dass die Gewebevorläuferzellen wachsen und neues Gewebe erzeugen können.
Durch Einspritzen der flüssigen Zusammensetzung in die Trägerstruktur kann die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in die Trägerstruktur eingebracht werden.
Die Trägerstruktur kann einem Lebewesen, z. B. einem Säuger wie etwa einem Menschen, implantiert werden. Nachdem die Trägerstruktur in das Lebewesen implantiert wurde, kann die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in die Trägerstruktur eingebracht werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung eine Gewebe bildende Struktur vor, die folgendes einschließt: Eine permeable, biokompatible Trägerstruktur mit einer vorbestimmten Form, die der Form des gewünschten Gewebes entspricht; und eine Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, welche die Trägerstruktur zumindest teilweise füllt, wobei die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen einschließt.
Bei den Zellen kann es sich zum Beispiel um Knochen bildende Zellen handeln und die Trägerstruktur kann poröses Hydroxylapatit einschließen. Bei der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung kann es sich ebenfalls um eine erstarrte Suspension von Hydrogel handeln, das dispergierte Gewebevorläuferzellen trägt.
Die Verfahren und Gewebe bildende Struktur können jedes beliebige der folgenden Merkmale einschließen.
Die Trägerstruktur kann jegliches/jeglichen keramische Material, Metal, Schwamm, Schaum, poröses Hydroxylapatit, ein Netz von Fasern (z. B. ein Netz von Polyglycolsäurefasern und Polymilchsäure) und zahlreiche Polymere einschließen. Die Trägerstruktur kann zum Beispiel aus Polyanhydrid, Polyorthoester, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Polyglactin oder Kombinationen derselben gebildet werden. Die Trägerstruktur kann ebenfalls komprimierbar oder starr oder elastisch sein.
Die Trägerstruktur kann in Form des gewünschten Gewebes ausgebildet sein, wie etwa in der Form eines an ein Gelenk angrenzenden Gelenkknorpels, eines Knochens, eines Teils eines Knochens, eines Knochendefekts oder eines Defekts einer Hirngewebezelle oder weiterer Gewebezellen des zentralen Nervensystems. Die Trägerstruktur kann ebenfalls in der Form eines Zylinders mit dem Durchmesser des Rückenmarks eines zu behandelnden Säugers ausgestaltet sein. Bei der Trägerstruktur kann es sich ebenfalls um eine biologisch abbaubare Trägerstruktur handeln.
Das Hydrogel kann eine der folgenden Substanzen einschließen: Polysaccharide, Proteine, Polyphosphazene, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere von Ethylendiamin, Polymilchsäuren, Polymethacrylsäuren, Copolymere von Acrylsäure und Methacrylsäure, Polyvinylacetat und sulfonierte Polymere.
Die Gewebevorläuferzellen können jede beliebige der folgenden Zellen einschließen: epidermale Zellen, Chondrozyten und weitere Knorpel bildende Zellen, Makrophagen, Dermalzellen, Muskelzellen, Haarfolikel, Fibroblasten, Organzellen, Osteoblasten und weitere Knochen bildende Zellen, Endothelzellen, Mucosazellen, Pleurazellen, Zellen des Ohrkanals, Zellen der tympanischen Membran, Peritonealzellen, Schwannsche Zellen, korneale Epithelzellen, Gingivazellen, Nervenzellen, Nervenstammzellen wie etwa sowohl Stammzellen des zentralen Nervensystem (ZNS), z. B. Stammzellen des Rückenmarks oder des Gehirns, als auch Stammzellen des vegetativen Nervensystem (VNS), z. B. postganglionäre Stammzellen aus Dünndarm, Blase, Leber, Lunge und Herz (zwecks Züchtung von Sympathikus und Parasympathikus und Ganglia), tracheale Epithelzellen, Hepatozyten, pankreatische Zellen und Herzzellen. Bei den Gewebevorläuferzellen kann es sich ebenfalls um neuroendokrine Stammzellen handeln.
Isolierte Nervenstammzellen des vegetativen Nervensystems eines adulten Säugers werden ebenfalls offenbart. Diese Stammzellen können aus jedem beliebigen innervierten Gewebe im Körper, einschließlich Gewebe des Herzen, der Blase, des Darms, der Lunge, der Leber und der Niere, isoliert werden. Isolierte, neuroendokrine Stammzellen eines Säugers, z. B. adulte Zellen, wie etwa jene, die aus der Pankreas (adult oder fötal) isoliert werden, oder adulte Zellen, die aus dem Nebennierenmark isoliert werden, werden ebenfalls offenbart.
Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung einer Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, die ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen umfasst, und eine permeable, biokompatible Trägerstruktur für die Herstellung einer Gewebe bildenden Struktur zwecks Verwendung bei der Erzeugung von neuem Gewebe vor.
Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines Hydrogel-Nervenstammzell-Zusammensetzung bei der Herstellung einer Gewebe bildenden Struktur zwecks Verwendung bei der Behandlung von defektem Nervengewebe vor, wobei diese Zusammensetzung zum Einbringen in eine Trägerstruktur der ungefähren Größe einer Kavität dient, die durch Lokalisieren der natürlichen Grenzen des defekten Gewebes und Entfernen des defekten Gewebes geschaffen wurden, um an den Oberflächen der Kavität gesundes Nervengewebe freizulegen, wobei die Nervenstammzellen so gewählt sind, dass sie sich in dem gesunden Nervengewebe differenzieren; und wobei die Trägerstruktur zur Implantation in die Kavität dient und dadurch das defekte Nervengewebe behandelt wird. Bei dem defekten Nervengewebe kann es sich um Gewebe des ZNS, z. B. im Gehirn oder Rückenmark, um Gewebe des VNS oder um neuroendokrines Gewebe handeln. Die Nervenstammzellen können aus dem gesunden Nervengewebe isoliert werden. Ein Spacer kann vorübergehend in die Kavität implantiert und anschließend durch die Trägerstruktur ersetzt werden.
Es wird ebenfalls ein Verfahren zum Isolieren und Kultivieren nicht differenzierter Nervenstammzellen von Säugern, z. B. adulte Zellen wie etwa neuroendokrine Zellen oder Zellen des vegetativen Nervensystems, beschrieben, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Gewinnen einer Probe von Gewebe des Nervensystems (und Halten des Gewebes bei ungefähr 40 F oder weniger); Dissoziieren des Gewebes in einer ersten Flüssigkeit; Trennen des Feststoffes von der ersten Flüssigkeit; Mischen des Feststoffes in eine zweite Flüssigkeit und Abbauen der Gewebstrümmer (z. B. mit einem Enzym wie etwa Trypsin), um eine Mischung zu bilden; Triturieren der Mischung, um Zellen zu trennen und differenzierte Zellen zu brechen; Trennen der Festkörper von der triturierten Mischung und Suspendieren der Festkörper in einem Kulturmedium, das epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und optional Fibroblasten-Wachstumsfaktor einschließt; Kultivieren des Kulturmediums und Passage der überlebenden Zellen zumindest alle vier Tage, wobei es sich bei den überlebenden Zellen um Nervenstammzellen handelt und diese in frischem Kulturmedium bei jeder Passage trituriert und resuspendiert werden; und Wiederholen der Schritte des Kultivierens und der Passage, um die Kultur von isolierten, nicht differenzierten Nervenstammzellen zu erhalten.
Bei einem „Hydrogel" handelt es sich um eine Substanz, die gebildet wird, wenn ein organisches Polymer (natürlich oder synthetisch) hart wird oder erstarrt, um eine dreidimensionale, offene Gitterstruktur zu erzeugen, die Wassermoleküle oder weitere Lösungen fängt, um ein Gel zu bilden. Das Erstarren kann z. B. durch Aggregation, Koagulation, hydrophobe Interaktionen oder Vernetzung ablaufen. Die in dieser Erfindung eingesetzten Hydrogele erstarren rasch, um die Zellen an der Anwendungsstelle zu halten, wodurch Probleme in Zusammenhang mit Phagozytose oder Zelltod beseitigt werden und neues Zellwachstum an der Anwendungsstelle gefördert wird. Die Hydrogele können ebenfalls für in dem Hydrogel suspendierte Zellen biokompatibel, z. B. nicht toxisch, sein.
Bei einer „Hydrogel-Zell-Zusammensetzung" handelt es sich um eine Suspension eines Hydrogels, das die gewünschten Gewebevorläuferzellen enthält. Diese Zellen können direkt aus einer Gewebequelle isoliert oder aus einer Zellkultur gewonnen werden. Bei einem „Gewebe" handelt es sich um eine Ansammlung oder Aggregation von bestimmten Zellen, die in ihrer natürlichen Matrix eingelagert sind, wobei die natürliche Matrix von bestimmten lebenden Zellen produziert wird.
Bei „Gewebevorläuferzellen" handelt es sich um Zellen, welche die Basis für neues Gewebe bilden. Bei Gewebezellen kann es sich um „Organzellen" handeln, was Hepatozyten, Langerhans'sche Inselzellen, Zellen von intestinalem Ursprung, aus der Niere gewonnene Zellen, Zellen von Haarfolikeln, Zellen des Glaskörpers in den Augen, Zellen aus dem Gehirn und weitere Zellen, die in erster Linie zwecks Synthese oder Sekretion oder Stoffwechsel von Materialien agieren, einschließt. Gewebevorläuferzellen schließen sogenannte „Stamm"zellen (oder „Progenitor"zellen) ein, bei denen es sich um nicht differenzierte Vorläuferzellen handelt, die eine Anzahl unterschiedlicher Typen spezifischer Zellen unter unterschiedlichen Umgebungsbedingungen bilden können. Stammzellen des Rückenmarks (oder Progenitorzellen) zum Beispiel sind nicht differenzierte Nervenzellen, die induziert werden können, um zahlreiche unterschiedliche Zelltypen in ausgereiftem Gewebe des Rückenmarks wie etwa motorische Neuronen, sensorische Neuronen, Interneuronen, Neuronen des präganglionären Sympathikus und Parasympathikus und Zellen des peripheren Nervensystems zu bilden.
Ein Verfahren zur Induktion von Reifung dieser Zellen besteht in der Änderung der physikalischen Eigenschaften des Trägergerüsts. Allein der Kontakt mit diesen Gerüsten kann die Zellen dazu veranlassen, zu differenzieren. Das Hinzufügen von Wachstumsfaktoren oder weiteren Hormonen zum Hydrogel kann ebenfalls das Differenzieren dieser Zellen steuern.
Bei einer „isolierten" Gewebevorläuferzelle, wie etwa einer isolierten, neuroendokrinen Stammzelle oder einer Stammzelle des VNS, handelt es sich um eine Zelle, die aus ihrer natürlichen Umgebung in einem Gewebe in einem Lebewesen entfernt wurde und zumindest vorübergehend in vitro kultiviert wurde. Der Begriff deckt sowohl einzelne, isolierte Zellen als auch Kulturen von „isolierten" Stammzellen ab, welche für die Stammzellen mit schwach oder nicht differenzierten Zellen signifikant angereichert wurden.
Sofern nicht anders definiert, besitzen alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Technik, in das diese Erfindung fällt, verstanden wird. Obwohl Verfahren und Materialien, die zu den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, in der praktischen Umsetzung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden untenstehend zweckmäßige Verfahren und Materialien beschrieben.
Die Erfindung weist mehrere Vorteile auf. Nach dem Gelieren wird die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung zum Beispiel von der Trägerstruktur getragen und bildet eine einheitliche Suspension, in der Nährstoffe mühelos zu den Zellen hin und Abfallprodukte von den Zellen weg diffundieren können. Als ein Ergebnis sorgt das Hydrogel für Zellviabilität und ermöglicht Gefäßbildung der Suspension, was schlussendlich im Wachstum von neuem Gewebe und seinem Anwachsen im Körper des Patienten resultiert. Die permeable Trägerstruktur, in die die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung eingebracht wird, liefert eine Form und Struktur für die erstarrende Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, während Nährstoffe und Abfallprodukte in dem Hydrogel auch weiterhin zu den Zellen hin und von den Zellen weg diffundieren können. Folglich steuert die Trägerstruktur die Entwicklung und Form des neuen Gewebes und zwar geschieht dies dank der Fähigkeit, externen Beanspruchungen aus der Umgebung und den umliegenden Geweben standzuhalten, d. h. die Trägerstruktur kann Gewichtsbelastung direkt standhalten, zum Beispiel, wenn die Struktur verwendet wird, um einen Knochen oder Knorpel zu ersetzen. Darüber hinaus können aufgrund des Charakteristikums der Gewichtsbelastung der Trägerstruktur in Knochen oder Knorpeln Beanspruchungen über die Hydrogel-Zell-Suspension übertragen werden, was die Entwicklung von Knochen oder Knorpeln in der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung fördert.
Bei Fehlen einer solchen Trägerstruktur ist ein Patient nicht in der Lage, jegliche Gewichtsbelastung oder jegliche Beanspruchung der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung auszuüben, da solche Kräfte dazu führen würden, dass die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung verzerrt und verdrängt wird. Bei jedem beliebigen Ersatz von Strukturgewebe, das Beanspruchung ausgesetzt ist, wie etwa Ligamente, Sehnen und Knochen überall im Körper, ist dies ähnlich. Es sei ebenfalls anzumerken, dass die Trägerstruktur nicht nur Druckkräfte, sondern auch Zugkräfte aufnimmt, wie etwa, wenn eine Sehne auseinandergezogen oder Haut gedehnt wird. In solchen Fällen imitiert die Trägerstruktur die Elastizität der Sehne oder der Haut und weist Enden auf, die typischerweise genäht sind oder auf angrenzendem Gewebe anhaften.
Auch zusammengesetzte Trägerstrukturen sind möglich. Es kann zum Beispiel eine Trägerstruktur erzeugt werden, die ein hohles Rohr aus Feststoff, z. B. Koralle, in das eine Zusammensetzung aus Hydrogel und Osteoblasten (oder weiteren Knochenvorläuferzellen eingebracht ist, und einen weicheren Träger im Zentrum, wie etwa ein Fasernetz, in das eine Hydrogel-Rückenmarkstammzell-Zusammensetzung eingebracht ist, aufweist.
Die Trägerstruktur hält ebenfalls die strukturelle Integrität und die gewünschte Form der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung aufrecht, ohne die physikalischen Charakteristika der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung derart zu ändern, dass sie Zellen schaden kann und die Diffusion von Nährstoffen und Abfallprodukten zu den Zellen hin und von den Zellen weg eingeschränkt werden kann.
Des Weiteren kann die Trägerstruktur so ausgebildet sein, dass sie komprimierbar und elastisch ist, sodass sie leicht, zum Beispiel mittels einer Kanüle, eines Endoskops oder eines Arthroskops, einem Patienten implantiert werden kann. Folglich kann die Trägerstruktur in die Form des gewünschten, zu wachsenden Gewebes, das dem Patienten in einem deformierten Zustand über eine Kanüle implantiert wird, zugeschnitten oder geformt werden, wobei es in der gewünschten Körperkavität expandieren kann und anschließend mit der flüssigen Hydrogel-Zell-Zusammensetzung eingespritzt wird. Das anschließende Wachstum von neuem Gewebe nimmt die Form der Trägerstruktur an.
Das Hydrogel kann ebenfalls derart ausgestaltet sein, dass es im Laufe der Zeit schrittweise expandiert, um Kavitäten zu füllen oder die Produktion einer größeren Masse an Gewebe im Laufe der Zeit fördert. Das Problem, dass dadurch, dass bei Wachstum des Gewebes die Ernährung der einzelnen Zellen ermöglicht wird, Volumen entsteht, wird durch langsame Expansion, zum Beispiel in Blase und Leber, gelöst. Als ein weiteres Beispiel können die Hydrogele im Rückgrad verwendet werden, um Teile des durch Krankheit beschädigten Rückenmarks zu behandeln, wobei die Wirbel intakt bleiben.
Zusätzlich können die Hydrogel-Zell-Zusammensetzungen, im Speziellen Zusammensetzungen von Nervenstammzellen oder Muskelzellen, auf elektrischen Strom leitende Trägerstrukturen eingebracht werden, was zur Förderung von Zellwachstum und zur Kontrolle der Richtung von Zellwachstum und Migration verwendet werden kann.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden, detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Schema einer permeablen Trägerstruktur, die mit einer Hydrogel-Zell-Zusammensetzung gefüllt ist.
2 ist eine Photographie einer permeablen, polymeren Trägerstruktur in Form eines Oberschenkelknochens einer Ratte.
3 ist eine Photographie einer nackten Maus, der die Trägerstruktur aus 2 subkutan implantiert wurde.
4 ist eine Photographie der Trägerstruktur aus 2, nachdem sie mit einer Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, die periosteale Zellen enthält, eingespritzt und anschließend aus der in 3 gezeigten Maus entfernt wurde.
5 ist eine Photographie, welche die Histologie der Trägerstruktur aus 4 zeigt.
Detaillierte Beschreibung
Die Erfindung sieht Verfahren und Zusammensetzungen für das Wachsen von neuem Gewebe wie etwa zum Beispiel Knorpel, Knochen, Haut, Epithelschichten, neue Organe und Gewebe des zentralen Nervensystems, einschließlich Hirngewebe, Rückenmarksgewebe, und periphere und vegetative Nerven, unter Verwendung einer Hydrogel-Zell-Zusammensetzung vor. Um die Entwicklung und Form des neuen Gewebes zu steuern, wird die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in eine permeable Trägerstruktur eingebracht, die entweder vor der nach dem Einbringen der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in die Trägerstruktur einem Patienten implantiert werden kann. Die nachfolgenden Unterabschnitte beschreiben gemeinsam mit illustrativen Beispielen geeignete Trägerstrukturen, Hydrogele, Zellen wie etwa Vorläuferzellen oder Stammzellen und Verfahren zum Einbringen.
Trägerstrukturen
Die Trägerstruktur sieht die Form und den Träger für das Erstarren der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung vor. Sie ist permeabel, weist typischerweise porenähnliche Kavitäten oder Zwischenräume auf, die mit der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung gefüllt sind. Zum Beispiel kann es sich bei der Trägerstruktur um ein poröses Polymer-Netz, einen natürlichen oder synthetischen Schwamm, ein Stück Koralle oder Hydroxylapatit mit gewünschter Porosität oder eine Matrix aus metallischen, anorganischen, keramischen Bälkchen oder Bälkchen aus Plastik handeln. Die Permeabilität der Trägerstruktur ermöglicht die Diffusion der Nährstoffe außerhalb der Struktur in die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung hinein, welche die Trägerstruktur füllt (d. h. wo die Zellen vorhanden sind), und die Diffusion von Abfallprodukten, die von den Zellen produziert werden, durch die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung aus der Struktur hinaus, wodurch das Wachstum der Zellen in der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung gefördert wird. Obwohl weitere Flüssigkeiten, z. B. Körperflüssigkeiten, die Trägerstruktur belegen können, ehe sie mit der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung gefüllt wird, verdrängt die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung diese Flüssigkeiten und verhärtet rasch in der Trägerstruktur.
Die Trägerstruktur ist in der Form des gewünschten, zu wachsenden Gewebes ausgebildet. Zum Beispiel kann die Trägerstruktur als ein Stück Knorpelgewebe, wie etwa ein Meniskus für ein Knie oder einen Ellbogen, ein Stück Knochen für die Reparatur eines Knochendefekts, ein Ohr, eine Nase, ein inneres Organ, ein Ligament, eine Sehne, eine Luftröhre (als eine Leitung), Unterkiefer, Rückenmark oder ein Teil des Gehirns oder der Haut, geformt sein. In Abhängigkeit von dem Material, aus dem die Trägerstruktur gemacht wird, kann dieselbe durch Schneiden, Formpressen oder Gießen oder jedes weitere, beliebige Verfahren, das die gewünschte Form für die Trägerstruktur produziert, geformt werden.
Bei der Trägerstruktur handelt es sich ebenfalls um biokompatible Trägerstruktur (z. B. nicht toxisch für die Zellen, die in dem Hydrogel suspendieren) und in einigen Fällen kann es sich bei der Trägerstruktur um biologisch abbaubare Trägerstruktur handeln. Die Trägerstruktur kann entweder bevor oder nachdem die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in die Trägerstruktur gefüllt wird, geformt werden. Zum Beispiel kann eine teilweise flexible Trägerstruktur mit der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung gefüllt und in eine gewünschte Form formgepresst werden, z. B. von Hand, während das Hydrogel verhärtet.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, dass die Trägerstruktur flexibel und/oder komprimierbar und elastisch ist. Insbesondere kann in diesen Fällen die Trägerstruktur bei der Implantation deformiert werden, wobei es hierbei möglich ist, die Implantation durch eine kleine Öffnung in dem Patienten oder durch eine Kanüle oder ein Instrument, die/das in eine kleine Öffnung im Patienten eingeführt wird, durchzuführen. Nach der Implantation expandiert die Trägerstruktur in ihre gewünschte Form und Ausrichtung.
Die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung kann entweder bevor oder nachdem die Trägerstruktur einem Patienten implantiert wird, in die Trägerstruktur eingespritzt werden. Wenn das Hydrogel erstarrt, nimmt es die Flexibilität und Elastizität der Trägerstruktur an. Solche Elastizität und Flexibilität ermöglichen es, dass eine mit Hydrogel-Zell-Zusammensetzung gesättigte Trägerstruktur Druck- und Zugkräfte aufnimmt. Zum Beispiel kann ein Gewebeersatz für eine Sehne, ein Ligament, einen Meniskus oder ein Stück Haut Zugkräfte, die mit dem Ziehen und Dehnen des Gewebeersatzes assoziiert sind, aufnehmen und ebenso kann er Druckkräfte, die mit Gewichtsbelastung durch Gewebeersatz assoziiert sind, aufnehmen. Zusätzlich können die Flexibilität und Elastizität der Trägerstruktur minimal invasives Einbringen des Gewebeersatzes aufnehmen, z. B. kann die Trägerstruktur komprimiert und mittels einer Kanüle in den Patienten gedrückt werden, woraufhin die Trägerstruktur im Patienten expandieren kann, nachdem sie positioniert wurde.
Die Trägerstruktur kann aus einem biokompatiblen oder biologisch abbaubaren, synthetischen Polymer wie etwa einem Polyanhydrid, einem Polyorthoester oder einer Polyglycolsäure gebildet werden. Das Polymer sollte so ausgewählt werden, dass die resultierende Trägerstruktur adäquate Form und adäquate Träger für die Hydrogel-Suspension, die Zellen enthält, liefert und ermöglicht, dass Nährstoffe zu den Zellen hin diffundieren können und Zellwachstum und -proliferation gefördert wird. Faktoren, einschließlich Nährstoffe, Wachstumsfaktoren, Inducer von Differenzierung oder Dedifferenzierung, Sekretionsprodukte, Immunomodulatoren, Inhibitoren von Entzündung, Regressionsfaktoren, biologisch aktive Verbindungen, die Zelldifferenzierung fördern oder Einwachsen des Lymphnetzes oder der Nervenfasern ermöglichen, und Medikamente können in die polymere Trägerstruktur inkorporiert sein.
Ein Beispiel für ein geeignetes Polymer ist Polyglactin, bei dem es sich um ein 90:10 Copolymer aus Glykolid und Lactid handelt und als geflochtenes, resorbierbares Nahtmaterial VICRYL^TM (Ethicon Co., Somerville, NJ) hergestellt wird.
Polymere Fasern können gemeinsam in einer filzähnlichen Polymermatte komprimiert werden, die dann zugeschnitten oder anderweitig in die gewünschte Trägerstruktur geformt wird. Alternativ können die polymeren Fasern gemeinsam in ein Formteil gedrückt werden, welches die komprimierten Fasern in die gewünschte Form für die Trägerstruktur gießt. In einigen Fällen kann zusätzliches Polymer zu den polymeren Fasern hinzugefügt werden, wenn sie formgepresst werden, um dem Fasernetz zusätzliche Strukturen zu verleihen.
Zum Beispiel kann Polyglycolsäure als ein Netz von Fasern ausgestaltet sein, das zu einer porösen Matte komprimiert wird, die dann zugeschnitten oder anderweitig in die gewünschte Form geformt wird und dann in eine Lösung von Polymilchsäure (z. B. eine 1 %ige Lösung) getaucht wird, um die Fasern zu binden und sie in die Lage zu versetzen, ihre Form beizubehalten, um die Trägerstruktur zu bilden. Die Polymilchsäure bindet die Vernetzungen der Polymilchsäurefasern und bedeckt diese individuellen Fasern, was die Form der formgepressten Fasern fixiert. Die Polymilchsäure wird ebenfalls in die Räume zwischen den Fasern gefüllt. Folglich kann die Porosität der Trägerstruktur durch Einführen einer geeigneten Menge an Polymilchsäure spezifiziert werden. Der für das Formpressen des Fasernnetzes in die gewünschte Form erforderliche Druck kann recht moderat sein. Es ist lediglich erforderlich, dass die Fasern in der gewünschten Form für eine Zeit, die für die Wirkung des Bindens und Bedeckens von Polymilchsäure ausreichend ist, gehalten werden. Die geeignete Länge und Dicke der Fasern hängen von der gewünschten Form und dem Zweck der Trägerstruktur ab. Zum Beispiel sollte die Stärke der Fasern, die proportional zu deren Dicke ist, ausreichend sein, um externen Kräften, die auf die Trägerstruktur einwirken, standzuhalten.
Alternativ oder zusätzlich kann die Trägerstruktur weitere Arten polymerer Fasern oder polymerer Strukturen, die durch im Stand der Technik bekannte Techniken produziert wurden, einschließen. Zum Beispiel können durch Verdampfen von Lösungsmittel aus einer Polymerlösung dünne Polymerfilme gewonnen werden. Diese können in eine gewünschte Form gegossen werden, falls die Polymerlösung aus einem Formteil mit dem Reliefmuster der gewünschten Form verdampft ist. Polymergele können ebenfalls in dicke, permeable Polymerstrukturen formgepresst werden, indem im Stand der Technik bekannte Techniken des Formpressens verwendet werden.
Die Trägerstrukturen können ebenfalls aus porösem Hydroxylapatit hergestellt werden, z. B. aus chemisch veränderter Meereskoralle (z. B. Interpore^®) oder aus Hydroxylapatitpaste, die modifiziert werden kann, um die Porosität zu erhöhen, und die anschließend in gewünschte Formen formgepresst werden kann. Nicht veränderte Meereskoralle kann verwendet werden, wird aber vom Körper resorbiert. Das Hydroxylapatit wird in der Form der gewünschten Trägerstruktur unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Instrumenten, wie etwa einem Dremel-Bohrer, bearbeitet. Die Verwendung von Hydroxylapatit oder Koralle als Trägerstruktur ist besonders für das Wachsen von Gewebe bei Knochendefekten geeignet. Um die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in der Koralle abzulagern, kann eine Nadel in eine Pore, tief in die Koralle, eingeführt werden und die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung wird als eine Flüssigkeit eingespritzt. Da Poren der Koralle untereinander verbunden sind, durchdringt die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung die Koralle und sättigt die Koralle, wobei eine gleichmäßige Verteilung von Zellen bereitgestellt wird.
Alternativ kann das Hydrogel mittels Ansaugen durch eine Trägerstruktur gezogen werden oder die Trägerstruktur kann vor der Vernetzung mit einem Mittel, das zwecks Vernetzung des Hydrogels in situ im Trägergerüst hinzugefügt wurde, in eine Hydrogel-Lösung getaucht werden. Als weitere Alternative können einige Hydrogele durch Photosensibilisierung vernetzt werden. Dies kann abgeschlossen werden, nachdem das Trägergerüst mit dem Hydrogel gesättigt wurde.
Die Trägerstruktur entspricht in Größe und Form dem zu wachsenden Gewebe, z. B. Größe und Form eines Knorpelersatzes, eines Knochendefekts, eines Ohrs, einer Nase oder einer in einem Teil von defektem Nervengewebe geschaffenen Kavität. Zum Beispiel kann eine Trägerstruktur für einen menschlichen Beinknochen, der in seinem Inneren porös ist, so lang und dick wie ein menschlicher Fußknochen sein. In einem solchen Fall füllt die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung sowohl die äußere Schicht der Trägerstruktur als auch den mittleren, porösen Bereich oder sie kann lediglich die äußere Schicht füllen und den mittleren porösen Bereich leer lassen, der als ein Kanal für das Einbringen von Nährstoffen zu der Innenwand des Gewebes, das an der äußeren Schicht entsteht, dient.
In einem weiteren Beispiel handelt es sich bei der für die Reparatur einer Verletzung des Rückenmarks verwendeten Trägerstruktur um einen Zylinder, dessen Dimensionen den Dimensionen von beschädigtem Rückenmark entsprechen. Die Trägerstruktur gibt nicht nur strukturelle Signale ab, sondern fördert auch Zelldifferenzierung, nachdem Zellen implantiert wurden und durch das Hydrogel migrieren, um die Trägerstruktur zu kontaktieren. Wachstumsfaktoren wie etwa epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF) können zu dem Hydrogel hinzugefügt werden, um Differenzierung und Multiplizierung zu fördern und Fibrose zu hemmen.
Einige weitere Arten von Trägerstrukturen sind ebenfalls möglich. Zum Beispiel kann die Trägerstruktur aus Schwämmen, Schäumen, Korallen, biokompatiblen anorganischen, keramischen oder metallischen Strukturen, die innere Poren aufweisen, wie etwa aus Titan hergestellte Strukturen in Form von Waben, einem Skelett mit zarten Bälkchen, wie etwa ein Netz von dünnen, miteinander verflochtenen Polymerfasern, und einem Skelett mit dicken Bälkchen, wie etwa ein Netzwerk aus anorganischen, keramischen Stäben oder Stäben aus Plastik oder Metall, gebildet werden. Diese Trägerstrukturen können unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden.
Hydrogele
Die in der praktischen Umsetzung dieser Erfindung verwendeten Hydrogele sollten biokompatibel und biologisch abbaubar sein, bevorzugt rasch in vivo erstarren, d. h. innerhalb von ungefähr 5 Minuten oder weniger, nachdem sie in die implantierte Trägerstruktur eingebracht wurden, und sie sollten in der Lage sein, lebende Zellen zu halten.
Die mit Nervenstammzellen verwendeten Hydrogele sind dergestalt, dass sie ausreichend viskos sind, um die Zellen in drei Dimensionen zu tragen. Falls die Suspension nicht ausreichend viskos ist, fallen die Zellen aufgrund der Gravitationskraft, sind nicht gleichmäßig verteilt und ändern ihren Phänotyp, sodass sie in einer weniger optimalen Art und Weise wirken. Der Idealfall besteht darin, die im Gel suspendierten Zellen in einer abgerundeten Konfiguration, die nicht differenziert ist, zu halten, bis die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung verwendet wird, um ein Netzwerk von Fasern, welches das Hydrogel trägt und die Stammzellen dazu anregt, in deren geeigneter Umgebung in den geeigneten Zelltypus zu differenzieren, zu durchdringen. Allerdings sollte das Hydrogel nicht zu viskos sein, um jegliche Zellmigration zu verhindern oder um Zellen daran zu hindern, bei der Differenzierung nach der Implantation mit dem Aussenden von Dendriten und Axonen zu beginnen.
Beispiele für unterschiedliche Hydrogele, die für die praktische Umsetzung dieser Erfindung geeignet sind, schließen folgende Hydrogele ein, sind aber nicht darauf beschränkt: (1) temperaturabhängige Hydrogele, die bei Körpertemperatur erstarren oder hart werden, z. B. PLURONICS^TM; (2) durch Ionen vernetzte Hydrogele, z. B. Natriumalginat; (3) Hydrogele, die hart werden, wenn sie entweder sichtbarem oder ultraviolettem Licht ausgesetzt werden, z. B. Copolymere von Polyethylenglycol und Polymilchsäure mit Acrylat-Endgruppen; und (4) Hydrogele, die nach einer pH-Änderung hart werden oder erstarren, z. B. TETRONICS^TM.
Beispiele für Materialien, die zur Bildung dieser unterschiedlichen Hydrogele verwendet werden können, schließen Polysaccharide wie etwa Alginat, Polyphosphazene und Polyacrylate, die ionisch vernetzt sind, oder Block-Copolymere wie etwa PLURONICS^TM (ebenfalls bekannt als POLOXAMERS^TM), bei denen es sich um durch Temperaturänderungen erstarrte Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere handelt, oder TETRONICS^TM (ebenfalls bekannt als POLOXAMINES^TM), wobei es sich hier um durch pH-Änderung erstarrte Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere von Ethylendiamin handelt, ein.
Ionische Hydrogele
Ionische Polysaccharide, wie etwa Alginate oder Chitosan, können verwendet werden, um lebende Zellen zu suspendieren. In einem Beispiel wird das Hydrogel durch Vernetzen des anionischen Salzes von Alginsäure, einem aus Algen isolierten Kohlenwasserstoffpolymer, mit Ionen, wie etwa Kalziumkationen, hergestellt. Die Stärke des Hydrogels steigt durch ansteigende Konzentration entweder an Kalziumionen oder an Alginat an. US Patent Nr. 4,352,883 beschreibt zum Beispiel das ionische Vernetzen von Alginat mit bivalenten Kationen in Wasser bei Raumtemperatur, um eine Hydrogelmatrix zu bilden.
Gewebevorläuferzellen werden mit einer Alginatlösung vermischt, die Lösung wird in eine bereits implantierte Trägerstruktur eingebracht und erstarrt dann in kurzer Zeit aufgrund des in vivo Vorhandenseins physiologischer Konzentrationen an Kalziumionen. Alternativ wird die Lösung vor der Implantation in die Trägerstruktur eingebracht und erstarrt in einer externen Lösung, die Kalziumionen enthält.
Im Allgemeinen sind diese Polymere zumindest teilweise in wässrigen Lösungen löslich, z. B. Wasser oder wässrige Alkohollösungen, die geladene Seitengruppen aufweisen, oder ein monovalentes, ionisches Salz derselben. Es gibt zahlreiche Beispiele für Polymere mit sauren Seitengruppen, die mit Kationen reagieren können, z. B. Polyphosphazene, Polyacrylsäuren und Polymethacrylsäuren. Beispiele für saure Gruppen schließen Carbonsäuregruppen, Sulfonsäuregruppen und halogenierte (bevorzugt fluorierte) Alkoholgruppen ein. Poly(vinylamine), Poly(vinylpyridin) und Poly(vinylimidazol) zählen zu den Beispielen für Polymere mit basischen Seitengruppen, die mit Anionen reagieren können.
Bei Polyphosphazenen handelt es sich um Polymere mit Backbones, die aus Stickstoff und Phosphoratomen bestehen, die durch Veränderung der Einzel- und Doppelbindungen getrennt wurden. Jedes Phosphoratom ist kovalent an zwei Seitenketten gebunden. Polyphosphazene, die verwendet werden können, weisen eine Mehrheit von Seitenketten auf, die sauer und in der Lage sind, mit bi- oder trivalenten Kationen Salzbrücken zu bilden. Carbonsäuregruppen und Sulfonsäuregruppen zählen zu den Beispielen für saure Seitenketten.
Biologisch erodierbare Polyphosphazene weisen zumindest zwei unterschiedliche Arten von Seitenketten auf, saure Seitengruppen, die in der Lage sind, mit multivalenten Kationen Salzbrücken zu bilden, und Seitengruppen, die unter in vivo Bedingungen hydrolysieren, z. B. Imidazolgruppen, Aminosäureester, Glycerol und Glucosyl. Biologisch erodierbare und biologisch abbaubare Polymere, d. h. Polymere, die sich innerhalb einer Periode, die in der gewünschten Anwendung akzeptierbar ist (normalerweise in vivo Therapie), auflösen oder abbauen, bauen sich in weniger als ungefähr fünf Jahren ab und bevorzugt in weniger als ungefähr einem Jahr, nachdem sie physiologischer Lösung mit einem pH von 6–8 und einer Temperatur von zwischen 25 °C und 38 °C ausgesetzt wurden. Die Hydrolyse der Seitenketten resultiert in Erosion des Polymers. Beispiele für hydrolysierende Seitenketten sind nicht substituierte und substituierte Imidazole und Aminosäureester, bei denen die Seitenkette über eine Aminbindung an das Phosphoratom gebunden ist.
Verfahren für die Synthese und Analyse zahlreicher Arten von Polyphosphazenen werden in den US Patenten Nr. 4,440,921, 4,495,174 und 4,880,622 beschrieben. Verfahren für die Synthese der weiteren, oben beschriebenen Polymere sind dem Fachmann bekannt. Siehe zum Beispiel Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J.I. Kroschwitz, Herausgeber (John Wiley and Sons, New York, NY, 1990). Viele Polymere wie etwa Polyacrylsäure, Alginate und PLURONICS^TM sind im Handel erhältlich.
Wasserlösliche Polymere mit geladenen Seitenketten werden durch Reagieren des Polymers mit einer wässrigen Lösung, die multivalente, entgegengesetzt geladene Ionen, entweder multivalente Kationen, wenn das Polymer saure Seitengruppen aufweist, oder multivalente Anionen, wenn das Polymer basische Seitengruppen aufweist, enthalten, geladen. Kationen für das Vernetzen der Polymere mit sauren Seitengruppen, um ein Hydrogel zu bilden, schließen bivalente und trivalente Kationen wie etwa Kupfer, Kalzium, Aluminium, Magnesium und Strontium ein. Wässrige Lösungen der Salze dieser Kationen werden zu den Polymeren hinzugefügt, um weiche, stark angeschwollene Hydrogele zu bilden, Anionen für das Vernetzen der Polymere, um ein Hydrogel zu bilden, schließen bivalente und trivalente Anionen wie etwa niedrigmolekulare Dicarboxylationen, Terephthalationen, Sulfationen und Carbonationen ein. Wie dies unter Bezugnahme auf Kationen beschrieben wurde, werden wässrige Lösungen der Salze dieser Kationen zu den Polymeren hinzugefügt, um weiche, stark angeschwollene Hydrogele zu bilden.
Mit dem Ziel, die Passage von Antikörpern in das Hydrogel zu verhindern und gleichzeitig den Eintritt von Nährstoffen zu ermöglichen, liegt eine zweckmäßige Polymergröße in dem Hydrogel im Bereich von zwischen 10 000 D und 18 500 D. Kleinere Polymere resultieren in Gelen von höherer Dichte mit kleineren Poren.
Temperaturabhängige Hydrogele
Temperaturabhängige oder temperatursensitive Hydrogele können bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Diese Hydrogele weisen Eigenschaften der sogenannten „Reversen Gelierung" auf, d. h. bei oder unterhalb der Raumtemperatur handelt es sich um Flüssigkeiten und bei Erwärmung auf höhere Temperaturen, z. B. Körpertemperatur, handelt es sich um ein Gel. Folglich können diese Hydrogele mühelos bei oder unterhalb von Raumtemperatur als eine Flüssigkeit angewandt werden und bilden automatisch ein halbfestes Gel, wenn sie auf Körpertemperatur erwärmt werden. Als ein Ergebnis sind diese Gele besonders zweckmäßig, wenn die Trägerstruktur zuerst in einen Patienten implantiert und dann mit der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung gefüllt wird. Beispiele für solche temperaturabhängigen Hydrogele sind PLURONICS^TM (BASF-Wyandotte), wie etwa Polyoxyethylen-Polyoxypropylen F-108, F-68 und F-127, Poly-(N-isopropylacrylamid) und Copolymere von N-isopropylacrylamid.
Diese Copolymere können durch standardmäßige Techniken bearbeitet werden, um Einfluss auf deren physikalische Eigenschaften wie etwa Porosität, Abbaugeschwindigkeit, Übergangstemperatur und Festigkeitsgrad zu nehmen. Zum Beispiel beeinflusst das Hinzufügen von Sacchariden mit niedrigem Molekulargewicht bei Vorhandensein und bei Fehlen von Salzen die untere kritische Lösungstemperatur (LCST) von typischen, temperatursensitiven Polymeren. Wenn diese Gele bei Konzentrationen, die in einem Bereich von zwischen 5 und 25 % (W/V) liegen, durch Dispersion bei 4 °C hergestellt werden, werden die Viskosität und die Temperatur des Übergangs Gel-Feststoff beeinflusst, wobei die Temperatur des Übergangs Gel-Feststoff zu der Konzentration umgekehrt proportional ist. Diese Gele weisen Diffusionscharakteristika auf, dank derer Zellen überleben und ernährt werden können.
US-Patent Nr. 4,188,373 beschreibt die Verwendung von PLURONIC^TM-Polyolen in wässrigen Zusammensetzungen, um wässrige Systeme für thermische Gelierung bereitzustellen. US-Patente Nr. 4,474,751, '752, '753 und 4,478,822 beschreiben Systeme zur Abgabe von Medikamenten, die mittels Wärme aushärtbare Polyoxyalkylengele verwenden; dank dieser Systeme können die Temperatur des Übergangs in Gel und/oder die Festigkeit des Gels durch Einstellen des pH und/oder der Ionenstärke sowie durch die Konzentration des Polymers verändert werden.
In einem Beispiel kann ein 23 %iges PLURONIC Gel hergestellt werden, bei dem es sich unterhalb von 15 °C und oberhalb von 50 °C um eine viskose Flüssigkeit und bei Temperaturen von zwischen 15 und 50 °C um ein Hydrogel handelt.
pH-abhängige Hydrogele
Bei weiteren Hydrogelen, die für die Verwendung in den Verfahren der Erfindung geeignet sind, handelt es sich um pH-abhängige Hydrogele. Bei diesen Hydrogelen handelt es sich bei, unterhalb von oder oberhalb von spezifischen pH-Werten um Flüssigkeiten und es handelt sich um Gele, wenn sie spezifischen pHs ausgesetzt werden, z. B. von 7,35 bis 7,45, dem normalen pH-Bereich von extrazellulären Flüssigkeiten im menschlichen Körper. Folglich können diese Hydrogele als Flüssigkeit mühelos in eine implantierte Trägerstruktur eingebracht werden und bilden automatisch ein halbfestes Gel bilden, wenn sie dem pH-Wert des Körpers ausgesetzt werden. TETRONICS^TM (BASF-Wyandotte) Polyoxyethylen-Polyoxypropylenpolymere von Ethylendiamin, Poly(diethylaminoethylmethacrylat-γ-ethylenglycol) und Poly-(2-hydroxymethylmethacrylat) zählen zu den Beispielen für solche pH-abhängigen Hydrogele. Diese Copolymere können durch standardmäßige Techniken bearbeitet werden, um deren physikalische Eigenschaften zu beeinflussen.
Hydrogele, die durch Licht erstarren
Bei weiteren Hydrogelen, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden können, handelt es sich um Hydrogele, die entweder durch sichtbares oder durch ultraviolettes Licht erstarren. Diese Hydrogele werden aus Makromeren hergestellt, einschließlich einem wasserlöslichen Bereich, einem biologisch abbaubaren Bereich und zumindest zwei polymerisierbaren Bereichen, wie dies im US Patent Nr. 5,410,016 beschrieben wird. Zum Beispiel kann das Hydrogel mit einem biologisch abbaubaren, polymerisierbaren Makromer einschließlich eines Kerns, einer Verlängerung an jedem Ende des Kerns und eines Abschluss an jeder Verlängerung beginnen. Bei dem Kern handelt es sich um ein hydrophiles Polymer, bei den Verlängerungen um biologisch abbaubare Polymere und bei den Endgruppen um Oligomere, die in der Lage sind, die Makromere zu vernetzen, nachdem sie sichtbarem oder ultraviolettem Licht ausgesetzt wurden, z. B. ultraviolettes Licht mit großer Wellenlänge.
Beispiele für solche durch Licht erstarrte Hydrogele schließen Polyethylenoxid-Block-Copolymere, Copolymere von Polyethylenglycol und Polymilchsäure mit Acrylatendgruppen und 10K Copolymer aus Polyethylenglycol und Glycolid mit einem Acrylat an beiden Enden ein. Wie bei PLURONIC^TM Hydrogelen können die Copolymere, die diese Hydrogele umfassen, durch standardmäßige Techniken bearbeitet werden, um deren physikalische Eigenschaften wie etwa Abbaugeschwindigkeit, Unterschiede bei Kristallinität und Festigkeitsgrad zu modifizieren.
Gewebevorläuferzellen
Gewebevorläuferzellen können direkt aus einem Säugerdonatoren gewonnen werden, z. B. aus den patienteneigenen Zellen, aus einer Zellkultur eines Donatoren oder aus etablierten Zellkulturlinien. Bei dem Säuger kann es sich um eine Maus, eine Ratte, einen Hasen, ein Meerschweinchen, einen Hamster, eine Kuh, ein Schwein, ein Pferd, eine Ziege, ein Schaf, einen Hund, eine Katze handeln oder der Säuger ist ein Mensch. Zellen derselben Spezies und bevorzugt mit demselben immunologischen Profil können durch Biopsie entweder aus dem Patienten oder einem nahen Verwandten gewonnen werden. Im Fall von Nervenstammzellen, die aus Nervengewebe isoliert wurden, können diese aus gesundem Gewebe, das an defektes Gewebe angrenzt, oder aus weiteren Stellen im gesunden Gewebe im Säuger isoliert werden.
Unter Verwendung von standardmäßigen Zellkultur-Techniken und -Bedingungen wachsen die Zellen dann in Kultur, bis sie konfluent werden und werden bei Bedarf verwendet. Bevorzugt werden die Zellen solange kultiviert, bis für eine bestimmte Anwendung eine ausreichende Anzahl von Zellen gewonnen wurde.
Wenn Zellen verwendet werden, die eine Immunreaktion auslösen können, wie etwa humane Muskelzellen eines immunologisch unterschiedlichen Donatoren, kann der Rezipient bei Bedarf immunosupprimiert werden, zum Beispiel unter Verwendung einer Aufstellung von Steroiden und weiterer immunosupprimierenden Medikamente wie etwa Ciclosporin. Allerdings verhindert die Verwendung von autologen Zellen eine derartige immunologische Reaktion.
Die Zellen können direkt aus einem Donatoren gewonnen, gewaschen und in einem ausgewählten Hydrogel suspendiert werden, ehe sie in eine Trägerstruktur eingebracht werden. Um Zellwachstum zu fördern, werden die Zellen genau vor dem Einführen in die Trägerstruktur zu dem Hydrogel hinzugefügt oder mit dem Hydrogel vermischt.
Durch Biopsie gewonnene Zellen werden geerntet, kultiviert und können dann nach Bedarf passieren, um kontaminierende, unerwünschte Zellen zu entfernen. Das Isolieren von Chondrozyten und Osteoblasten wird in den untenstehenden Beispielen beschrieben. Das Isolieren, Kultivieren und Passieren-Lassen von Stammzellen des zentralen Nervensystems, z. B. Hirnzellen, Rückenmarkszellen, Zellen des vegetativen Nervensystems und neuroendokrine Zellen (die in einem nicht differenzierten Zustand gehalten werden), werden ebenfalls unten beschrieben.
Zellviabilität kann unter Verwendung von standardmäßigen Techniken, einschließlich visueller Beobachtung durch ein Lichtmikroskop oder ein Scanning-Elektronenmikroskop, Histologie oder quantitative Untersuchung mit Radioisotopen, untersucht werden. Die biologische Funktion der in die Trägerstruktur eingebrachten Zellen kann unter Verwendung einer Kombination der oben angeführten Techniken und standardmäßiger funktioneller Assays bestimmt werden.
Beispiele für Zellen, die in die Trägerstruktur eingebracht werden können und anschließend neues Gewebe wachsen lassen, schließen epidermale Zellen; Chondrozyten und weitere Zellen, die Knorpel bilden („Knorpel bildende Zellen"); Makrophagen; Dermalzellen; Muskelzellen, Haarfolikel; Fibroblasten; Organzellen; Makrophagen; Osteoblasten, periosteale Zellen und weitere Zellen, die Knochen bilden („Knochen bildende Zellen"); Endothelzellen; Mucosazellen, z. B. Zellen aus Nase, Darm, Blase und orale Mucosazellen; Pleurazellen; Zellen des Ohrkanals; Zellen der tympanischen Membran; Peritonealzellen; Schwannsche Zellen; korneale Epithelzellen; Gingivazellen; tracheale Epithelzellen; und Nervenzellen, einschließlich Nervenstammzellen und Neuronen, z. B. aus dem Gehirn, dem Rückenmark und dem vegetativen Nervensystem, ein.
Nervenstammzellen für die Verwendung in den neuen Zusammensetzungen und Verfahren können aus einer Vielzahl von Nervensystemgeweben isoliert werden. Zum Beispiel können Zellen aus Rückenmarkgewebe, Hirngewebe und weiteren Geweben sowohl aus dem zentralen Nervensystem als auch aus dem peripheren und vegetativen Nervensystem, isoliert werden. Die Stammzellen von peripherem Nervengewebe können aus dem ZNS in der grauen Substanz des Rückenmarks stammen und wie hierin beschrieben für das Isolieren von Nervenstammzellen aus dem Rückenmark isoliert werden. Postganglionäre Stammzellen des vegetativen Nervensystems (außerhalb des Rückenmarks) können wie hierin beschrieben aus zahlreichen Geweben isoliert werden, z. B. aus jedem beliebigen innervierten Organ wie etwa Gewebe aus Herz, Niere, Dünndarm, Leber, Lunge und Blase. Präganglionäre Stammzellen des vegetativen Nervensystems sind in der grauen Substanz des Rückenmarks lokalisiert und daher in derselben Art und Weise isoliert wie Stammzellen des Rückenmarks und damit in Verbindung.
Neuroendokrine Stammzellen finden sich in Bereichen wie etwa dem Nebennierenmark und differenzieren in Zellen, die Catecholamine wie etwa Epinephrin und Norepinephrin erzeugen, und ebenfalls in der Pankreas, wobei sie in diesem Fall in Zellen wachsen, die Insulin (Beta-Zellen) oder Glucagon (Alpha-Zellen) sekretieren. Weitere Quellen für neuroendokrine Zellen sind die Nebenschilddrüse, die Hypophyse und der Hypothalamus. Diese Zellen können in derselben Art und Weise wie postganglionäre Stammzellen des vegetativen Nervensystem aus adulten Säugern, z. B. Menschen, isoliert werden und für die Herstellung von Gewebekonstrukten für die Behandlung von endokrinen Krankheiten wie etwa Diabetes verwendet werden.
Die isolierten Zellen müssen nicht differenziert sein, wobei die Zellen in Neuronen, Oligodendrite, Astrozyten und weitere Nervengewebe differenzieren können, wenn sie zahlreichen Wachstumsfaktoren ausgesetzt werden. Die Zellen können aus adultem Nervengewebe isoliert werden, obwohl ebenfalls fötales Nervengewebe verwendet werden kann.
Wenn es sich bei dem Nervengewebe, das repariert oder verstärkt werden soll, um Rückenmarkgewebe handelt, können die in der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung verwendeten Zellen aus dem Rückenmarkgewebe isoliert werden. Gleichermaßen können Hydrogel-Nervenstammzell-Zusammensetzungen für das Reparieren von Defekten im Hirngewebe Nervenzellen, die aus dem Hirngewebe isoliert wurden, einschließen. Falls aus Nervengeweben gewonnene Stammzellen allerdings ausreichend nicht differenziert sind, können diese Zellen verwendet werden, um jeden beliebigen Defekt im Nervensystem zu behandeln, da sie induziert werden können, um in bestimmte erforderliche Arten von Nervengewebe zu differenzieren.
Die isolierten Stammzellen werden durch wiederholtes Triturieren bei jeder Passage (z. B. wöchentlich) in Kultur, einschließlich Cytokine wie etwa epidermaler Wachstumsfaktor und basischer Fibroblasten Wachstumsfaktor, in einem nicht differenzierten Zustand gehalten. Sobald die isolierten Nervenstammzellen beginnen, sich in Kultur zu multiplizieren, beginnen sie ebenfalls zusammenzuwachsen, um Neurosphären zu bilden, die zahlreiche nicht differenzierte Zellen enthalten. Der Schlüssel für das Halten dieser Zellen in einem nicht differenzierten Zustand liegt in dem Triturieren der Zellen, ehe diese mit dem Aussenden von Axonen und Dendriten beginnen. Der Prozess des Triturierens sollte alle 5 bis 10 Tage ausgeführt werden; wöchentliche Intervalle erweisen sich als nicht zufriedenstellend. Diese wiederholten Triturationen und Passagen ermöglichen, dass isolierte, nicht differenzierte Nervenstammzellen unbegrenzt kultiviert werden können.
Herstellung von Hydrogel-Zell-Zusammensetzungen
Zuerst wird ein ausgewähltes Hydrogel unter Verwendung von standardmäßigen Techniken hergestellt. Zum Beispiel ist ein biologisch abbaubares, temperatursensitives Polymer bei einer Konzentration, die in einem Bereich von zwischen 5 und 25 % (W/V) liegt, für die vorliegende Erfindung zweckmäßig. Falls es sich bei dem Hydrogel um ein Alginat handelt, kann es in einer wässrigen Lösung gelöst werden, zum Beispiel eine 0,1 M Kaliumphosphatlösung, bei physiologischem pH, auf eine Konzentration von zwischen 0,5 und 2 Gew.-%, z. B. 1 %, um ein ionisches Hydrogel zu bilden.
Als nächstes werden isolierte Gewebevorläuferzellen in der Polymerlösung bei einer Konzentration, die jene des zu erzeugenden Gewebes imitiert, z. B. zwischen 10 und 100 Millionen Zellen/ml, zum Beispiel zwischen 20 und 50 Millionen Zellen/ml, suspendiert. Die optimale Konzentration an Zellen, die in die Trägerstruktur eingebracht werden sollen, wird von Fall zu Fall unterschiedlich bestimmt und kann abhängig vom Zelltypus und dem Bereich des Körpers des Patienten, in welchen die Trägerstruktur implantiert werden soll, stark variieren. Optimierungsexperimente erfordern das Modifizieren lediglich einiger weniger Parameter, d. h. der Zellkonzentration oder der Konzentration des Hydrogels, um optimale Viskosität und Zellanzahl zu erhalten, um das Wachstum von neuem Gewebe zu tragen.
Wie unten veranschaulicht, wurde zum Beispiel nach dem Einspritzen einer Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, die ungefähr 50 Millionen periosteale Zellen pro ml enthielt, Wachstum von neuem Knochengewebe in der Form eines Oberschenkelknochens einer Ratte, das in der gesamten Stärke einer polymeren Trägerstruktur mit 5 mm Durchmesser eindrang, beobachtet.
Einbringen in die und Implantation der Trägerstruktur
Die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung wird in eine beliebige der permeablen, hierin beschriebenen Trägerstrukturen eingebracht. 1 zeigt einen schematischen Querschnitt einer gefüllten Trägerstruktur, wobei es sich in diesem Fall um eine Trägerstruktur 10, die aus einem Netz an verflochtenen polymeren Fasern 12 gebildet wird, handelt. Die Räume zwischen den Fasern bilden untereinander verbundene Poren 14, die mit der flüssigen Hydrogel-Zell-Zusammensetzung gefüllt sind. Innerhalb einer kurzen Zeit nach dem Einbringen, z. B. weniger als drei oder fünf Minuten, erstarrt das Hydrogel 16, wodurch die Zellen 18 in dem Hydrogel innerhalb der Poren 14 der Trägerstruktur 10 suspendiert gehalten werden. Das erstarrte Hydrogel 16 garantiert Zellviabilität, wobei Diffusion von Nährstoffen und Abfallprodukten durch die untereinander verbundenen Poren der Trägerstruktur ermöglicht und schlussendlich das Wachstum von neuem Gewebe und sein Anwachsen an den Körper des Patienten erreicht wird.
Die Trägerstruktur 10 sieht eine Form und Struktur für die erstarrende Hydrogel-Zell-Zusammensetzung vor, während weiterhin permeable Diffusionswege durch das Hydrogel hindurch bereitgestellt werden. Das aufgrund der Zellen gewachsene Gewebe entspricht der Form der Trägerstruktur und die Trägerstruktur liefert strukturelle Integrität, die ausreichend ist, um externen Beanspruchungen aus der Umgebung und umliegenden Geweben während des Wachstums von neuem Gewebe standzuhalten. Bei gewissen Ausführungsformen, wie etwa wenn die Hydrogele Stammzellen des Nervensystems enthalten, spielt das Hydrogel eine Schlüsselrolle bei dem Halten der Zellen in einem nicht differenzierten Zustand vor der Implantation in den Körper, indem die Zellen suspendiert bleiben und nicht an der Trägerstruktur haften, wie etwa die polymeren Fasern in einer Netzstruktur. Nach der Implantation spielt die Trägerstruktur eine Rolle bei der Förderung der Differenzierung der Stammzellen, um unterschiedliche Nervenzellen zu werden, wie etwa motorische Neuronen, sensorische Neuronen und Striatum-Neuronen.
Die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung kann entweder bevor oder nachdem die Trägerstruktur einem Patienten implantiert wurde, in die geformte Trägerstruktur eingebracht werden. Das spezifische Verfahren zum Einbringen wird davon abhängen, ob die Trägerstruktur für die angegebene Viskosität der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung ausreichend „schwamm-ähnlich" ist, d. h. die Trägerstruktur hält die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung mühelos, ehe diese erstarrt. Schwamm-ähnliche Trägerstrukturen können in die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung getaucht und mit derselben gesättigt und anschließend aus der Zusammensetzung entfernt werden. Das Hydrogel kann dann in der Trägerstruktur erstarren. Dann wird die Trägerstruktur, die Hydrogel und Zellen enthält, dem Patienten implantiert. Die Trägerstruktur kann ebenfalls dem Patienten implantiert werden, ehe das Hydrogel vollständig erstarrt. Alternativ kann in eine schwamm-ähnliche Trägerstruktur die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung eingespritzt werden, entweder bevor oder nachdem die Trägerstruktur dem Patienten implantiert wurde. Dann kann die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung erstarren. Das Volumen der flüssigen Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, die in die Trägerstruktur eingespritzt wird, ist typischerweise kleiner als, aber doch vergleichbar mit dem Volumen der Trägerstruktur, d. h. dem Volumen des gewünschten, zu wachsenden Gewebes.
Trägerstrukturen, die die flüssige Zusammensetzung nicht mühelos halten, erfordern leicht unterschiedliche Verfahren. In diesen Fällen wird die Trägerstruktur zum Beispiel in die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung getaucht und mit derselben gesättigt, wodurch ein teilweises Erstarren ermöglicht wird. Sobald das Hydrogel, das Zellen enthält, bis zu dem Punkt erstarrt, bei dem die Trägerstruktur das Hydrogel halten kann, wird die Trägerstruktur aus dem teilweise erstarrten Hydrogel entfernt und gegebenenfalls wird teilweise erstarrtes Hydrogel, das an der Außenseite der Trägerstruktur anhaftet, entfernt, z. B. wird es von der Struktur abgekratzt. Alternativ kann die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in ein Formteil eingebracht werden, welche die Trägerstruktur enthält. Zum Beispiel kann die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung anderweitig in ein fluiddichtes Formteil eingespritzt werden, welches die Trägerstruktur enthält und mit der äußeren Form und Größe derselben übereinstimmt. Dann erstarrt das Hydrogel im Formteil, z. B. durch Erhitzen, Abkühlen, Aussetzen an Licht oder Einstellen des pH, woraufhin die Trägerstruktur, die Hydrogel und Zellen enthält, aus dem Formteil entfernt wird und einem Patienten implantiert werden kann.
Die Trägerstruktur kann dem Patienten z. B. subkutan oder subdermal implantiert werden und anschließend wird die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in die implantierte Trägerstruktur, zum Beispiel durch Einspritzen mittels einer Spritze oder durch ein endoskopisches Instrument, eingebracht. Das Volumen der in die Trägerstruktur eingespritzten Hydrogel-Zell-Zusammensetzung sollte sich in etwa der Größe der Trägerstruktur annähern (d. h. das durch das gewünschte, zu wachsende Gewebe verdrängte Volumen). Die implantierte Trägerstruktur stellt Raum und ein strukturelles Templat für die eingespritzte flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung bereit. Wie oben beschrieben, kann ein Teil der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung vor dem Erstarren aus der Trägerstruktur auslaufen. Allerdings zwängen die vorhandenen, um die implantierte Trägerstruktur umliegenden Gewebe (z. B. Muskel, Knochen, Knorpel) die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in der Trägerstruktur ausreichend ein, bis Gelierung eintritt. Gemäß weiteren Alternativen wie etwa einem Gewebeersatz für Haut kann die Trägerstruktur äußerlich am Patienten angebracht werden, z. B. durch Nähen oder Klebemittel.
In jedem beliebigen der obigen Fälle erstarrt das Hydrogel unter Verwendung eines Verfahrens, das dem bestimmten, verwendeten Hydrogel entspricht (z. B. leichtes Erhitzen einer Zusammensetzung einschließlich eines temperatursensitiven PLURONIC^TM Hydrogels).
Um die Trägerstruktur zu implantieren, kann die Implantationsstelle des Patienten, einem Säuger, durch chirurgische Resektion freigelegt werden und die Trägerstruktur kann direkt an dieser Stelle implantiert werden. Alternativ kann die Implantationsstelle z. B. mit Hilfe eines Endoskops, eines Laparoskops, eines Arthroskops oder eines Ösophagoskops betrachtet werden, von denen alle dergestalt modifiziert werden können, dass sie ein mechanisches Gelenk und ein System für das Einbringen der implantierten Trägerstruktur durch einen kleinen Schnitt einschließen. Während der Implantation wird die Stelle z. B. mittels einer Explosion von Luft oder durch Saugen von Körperflüssigkeiten einschließlich Blut gereinigt. Folglich kann die Trägerstruktur, die Hydrogel und Zellen enthält, über ein Laparoskop, ein Endoskop, ein Laryngoskop, ein Cystoskop, ein Proktoskop oder ein Thorakoskop zu jeder beliebigen inneren Oberfläche eines beliebigen Lumens oder einer beliebigen Kavität oder zu weiteren Oberflächen, wie etwa intraperitonealen, extraperitonealen und thorakalen Kavitäten, eingeführt und dann in den gewünschte Raum implantiert werden.
Während des gesamten Vorgangs des Implantierens kann die Menge an Traumata, die durch die Zellen während den Schritten des Einbringens und des Implantierens verursacht werden, bestimmt werden, indem eine biologische Funktion, die für die verwendeten Zellen spezifisch ist, gemessen wird. Zum Beispiel kann die Integrität des neuen Knorpels durch standardmäßige biomechanische Beanspruchungsanalysen, wie etwa Bestimmung der Kompressionsmoduli, untersucht werden, wenn Chondrozyten angewandt werden.
Es ist wichtig, anzumerken, dass die Trägerstruktur neben dem Bereitstellen einer Richtung und eines Weges für das Wachstum von neuem Gewebe ebenfalls Beanspruchungen von außen, die auf das sich entwickelnde Gewebe ausgeübt werden, verändern kann. Insbesondere kann die Trägerstruktur Beanspruchungen von außen entlang ausgewählter Richtungen übertragen oder abschwächen, was die Entwicklung von Gewebe optimieren kann. Zum Beispiel kann die Trägerstruktur Druckkräften standhalten und dadurch Druckkräfte auf sich in der Trägerstruktur entwickelndes Knochengewebe abschwächen. Zugleich entwickeln sich die neuen Knochenzellen unter normalen Beanspruchungen, z. B. jenen Beanspruchungen, die durch Gehen erzeugt werden, wobei Knochengewebe gebildet wird, das stärker ist als Knochengewebe, das bei Fehlen jeglicher Belastungskräfte gewachsen ist.
Die Trägerstruktur kann auch externe Zugkräfte, die durch Dehn- oder Drehbewegungen ausgeübt werden, an sich entwickelndes Sehnen- oder Ligamentgewebe übertragen. Solche Zugkräfte fördern das Wachstum von Sehnen- und Ligamentgewebe und erzeugen Gewebe, das stärker ist als Gewebe, das bei Fehlen solcher Kräfte gewachsen ist.
Das Positionieren der Trägerstruktur im Patienten und die Innenkonstruktion der Trägerstruktur bestimmen, wie die Trägerstruktur externe Kräfte an das sich entwickelnde Gewebe koppelt. Zum Beispiel können Polyglycolfasern, die für das Konstruieren einer Trägerstruktur verwendet werden, entlang einer bevorzugten Richtung ausgerichtet werden, sodass die mechanischen Eigenschaften der Trägerstruktur anisotrop sind. In solchen Beispielen können die anisotropen Eigenschaften der Trägerstruktur die Entwicklung von unterschiedlichen faszialen Ebenen, die Ausrichtung von Bündeln im Gewebe wie etwa von Muskelbündeln im Skelettgewebe und Herzmuskel, das Leitungsystem im Herzmuskel und die Entwicklung von polaren Geweben wie etwa Neuronen beeinflussen.
Anwendungen
Da die Hydrogel-Zell-Zusammensetzungen unterschiedliche Arten von Vorläuferzellen tragen können und die Trägerstruktur die Entwicklung und Form von neuem Gewebe steuern kann, können die neuen Verfahren immer dann verwendet werden, wenn das Erzeugen von neuem Gewebe wünschenswert ist. Bestimmte, unten beschriebene Anwendungen beziehen sich auf das Erzeugen von Knorpeln, Knochen und Nervengeweben.
Behandlung von Knorpeldefekten
Bei Knorpeln handelt es sich um eine spezialisierte Art von dichten Bindegeweben, die aus in einer Matrix eingelagerten Zellen bestehen. Es gibt mehrere Arten von Knorpeln. Hyaline Knorpel sind bläulich weisse, glasig transparente Knorpel, die eine homogene Matrix aufweisen, die Kollagenfasern enthält, die in Gelenkknorpeln, Rippenknorpeln, der Nasenscheidewand und im Kehlkopf und in der Luftröhre vorkommen. Bei Gelenkknorpeln handelt es sich um hyaline Knorpel, welche die Gelenkoberflächen von Knochen bedecken. Rippenknorpel verbinden die „echten" Rippen und das Brustbein. Faserartige Knorpel enthalten Kollagenfasern. Bei elastischen Knorpeln handelt es sich um ein Netz von elastischen Fasern, die Knorpelzellen halten, wobei dieselben in erster Linie im Kehlkopf, dem äußeren Ohr und dem Gehörgang vorkommen. Durch Ernten der geeigneten Chondrozytenvorläuferzellen kann jeder beliebige dieser Typen von Knorpelgewebe unter Verwendung der Verfahren der Erfindung wachsen.
Zum Beispiel kann für das Ersetzen eines Knorpelmeniskus im Knie neues Gewebe gezüchtet werden. Eine biokompatible Trägerstruktur, deren physikalische Charakteristika zum Beispiel denen eines Schwammes ähneln, wird in der Form des zu ersetzenden Meniskus zugeschnitten oder formgepresst. Die Trägerstruktur, bei der es sich ebenfalls um eine biologisch abbaubare Trägerstruktur handeln kann, wird dann mittels Arthroskop in das Kniegelenk eingebracht und gemäß der geeigneten Ausrichtung positioniert. Da die Trägerstruktur schwamm-ähnlich ist, kann sie beim Einbringen mittels Arthroskop komprimiert werden und nach der geeigneten Positionierung im Knie expandiert sie erneut. Anschließend wird eine flüssige Hydrogel-Chrondrozyt-Zusammensetzung in den Schwamm eingespritzt, wobei die Poren der Trägerstruktur gefüllt werden. Das Hydrogel erstarrt daraufhin und nimmt die Form des gewünschten Meniskusersatzes an und stellt eine Suspension für die Chondrozyten bereit, was Diffusion der Nährstoffe und Abfallprodukte zu den suspendierten Chondrozyten hin und von ihnen weg ermöglicht. Im Laufe der Zeit, z. B. nach einem Zeitraum von ungefähr sechs Wochen, bilden sich in der Suspension Gefäße und die Chondrozyten bilden neues Knorpelgewebe, das die Form des Meniskus annimmt und an vorhandenes Gewebe anwächst.
Behandlung von Knochendefekten
In einem weiteren Beispiel können periosteale Zellen (d. h. Knochen bildende Zellen) bei der Erfindung verwendet werden, um Knochendefekte zu füllen oder vollständige neue Knochen herzustellen. Zuerst wird die Größe der Trägerstruktur an die Dimensionen des Knochendefekts angepasst. Die Trägerstruktur kann aus Polymerfasern gebildet sein und in die gewünschte Größe und Form zugeschnitten oder formgepresst werden oder die Trägerstruktur kann alternativ aus einem Stück Hydroxylapatit oder Koralle gebildet sein und zu der gewünschten Größe und Form verarbeitet werden. Dann kann die Zusammensetzung aus Hydrogel und periostealen Zellen entweder bevor oder nachdem die Trägerstruktur im Knochendefekt positioniert wurde, in die Trägerstruktur eingebracht werden. Falls notwendig können Klebemittel verwendet werden, damit die Trägerstruktur an den Knochen im Knochendefekt anhaftet. Einmal mehr erstarrt das Hydrogel und suspendiert und erhält die Zellen, aus denen anschließend Knochengewebe wächst und die in den Knochendefekt gefüllt werden. In einigen Fällen ist es sogar vor dem vollständigen Wachsen des Knochengewebes möglich, die Trägerstruktur teilweise mit Gewicht zu belasten.
Behandlung von Defekten des Nervengewebes
In weiteren Beispielen kann die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung Zellen einschließen, die Gewebe des zentralen Nervensystems, einschließlich Hirngewebe, Rückenmarksgewebe, peripherer Nerven, vegetativer Nerven und neuroendokriner Zellen, erzeugen. Die Trägerstruktur kann einem Patienten implantiert werden, der nach einem Hirnschlag oder einer weiteren Verletzung einen Defekt des Rückenmarks oder des Hirns aufweist, und die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung kann in die Trägerstruktur eingespritzt werden oder die Trägerstruktur kann von der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung durchdrungen und dann implantiert werden. Dann steuert die Trägerstruktur das Wachstum und die Entwicklung von neu erzeugtem Nervengewebe. Der Defekt im Nervengewebe kann zum Beispiel auf einer Krankheit, einem physikalischen Trauma, einer Reperfusionsverletzung, Ischämie oder einer Infektion beruhen. Allerdings kann jeder beliebige Defekt in Nervengewebe unter Verwendung der neuen, Gewebe bildenden Struktur und der neuen Zusammensetzungen behandelt werden.
Die neue Hydrogel-Nervenstammzell-Zusammensetzung kann verwendet werden, um Defekte in Nervengewebe im ganzen Körper zu behandeln. Zum Beispiel können Hirngewebe nach einem Infarkt, beschädigte oder abgetrennte Nervengewebe im Rückenmark oder vegetative Nerven allesamt durch Ersetzen des beschädigten Gewebes mit der neuen Hydrogel-Nervenstammzell-Zusammensetzung, je nach Bedarf mit oder ohne Trägerstruktur, behandelt werden.
Anfänglich werden der Bereich und die Grenzen des defekten Nervengewebes definiert, zum Beispiel unter Verwendung von MRT, CAT-Scan, PET-Scan, evozierter elektrischer Potentiale oder Blutflussanalyse. Nach dem Definieren der äußeren Grenzen des defekten, d. h. beschädigten oder verletzten, Nervengewebes wird das beschädigte oder verletzte Gewebe chirurgisch mit einem sauberen Schnitt zwecks Erzeugen einer Kavität entfernt, wobei an den Schnitträndern normales gesundes Nervengewebe verbleibt (die Ränder oder Oberflächen der Kavität). Aus dem gesunden Gewebe, welches das beschädigte Gewebe umschließt, werden Zellen der grauen Substanz entfernt und kultiviert, damit isolierte, kultivierte, expandierte Nervenstammzellen erzeugt werden, die passieren, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Behandlung bereitzustellen.
Während die isolierten Nervenstammzellen z. B. für einen Zeitraum von 7 bis 14 Tagen kultiviert werden und expandieren, wird ein inerter, biokompatibler Spacer (z. B. aus Kalziumalginat), der dergestalt ist, dass er keine oder minimale Entzündungsreaktionen induziert, bevorzugt in den Raum, der beim Entfernen des beschädigten Nervengewebes erzeugt wird, eingeführt. Medikamente wie etwa Wachstumsfaktoren, entzündungshemmende Verbindungen wie etwa Steroide und/oder weitere pharmazeutische Mittel, die dergestalt sind, dass sie faserartiges Gewebe daran hindern, in den durch Entfernen des beschädigten Gewebes erzeugten Raum zu wachsen, können diesen biokompatiblen Spacer durchdringen.
Nach der Expansion der autologen Zellen auf eine ausreichende Anzahl von Zellen wird die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung wie hierin beschrieben hergestellt und zu einer Trägerstruktur hinzugefügt, z. B. einem faserartigen Netz, das in die Form des entfernten beschädigten Gewebes gebildet wird. Die Trägerstruktur, in welche die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung eingebracht ist, wird dann in den nach dem Entfernen des Spacers verbleibenden Raum implantiert. Selbstverständlich ist kein Spacer erforderlich, wenn die kultivierten Nervenstammzellen unmittelbar implantiert werden können. Alternativ kann die Trägerstruktur implantiert und dann z. B. mittels einer Spritze mit der Hydrogel-Nervenstammzell-Zusammensetzung gefüllt werden.
Obwohl bevorzugt wird, die Operation so rasch als möglich nach der Verletzung des Nervensystemgewebes vorzunehmen, können die neuen Zusammensetzungen verwendet werden, um Verletzungen, die einige Wochen oder Monate vor der Operation auftreten, zu behandeln, vorausgesetzt, bei der Operation bleibt ein sauberer Schnitt zurück, durch den auf beiden Seiten der implantierten Trägerstruktur gesundes Nervengewebe freigelegt wird. Autologe Zellen können ebenfalls von Stellen, die sich von der Operationsstelle unterscheiden, an der das beschädigte Nervengewebe entfernt wird, entfernt werden. Zum Beispiel können autologe Nervenzellen unter Verwendung von stereotaktischer Biopsie oder von Aspiraten, die Nadeln, die z. B. in das Rückenmark eingefügt werden, verwenden, entfernt werden. Dies ist möglich, da lediglich eine sehr geringe Anzahl von isolierten Nervenstammzellen, z. B. ungefähr fünf Zellen, für die neuen Kultivierungsmethoden erforderlich ist. Es kann zum Beispiel eine 22 Gauge Aspirationsnadel verwendet werden.
Jede beliebige Beschädigung oder jedes beliebige Trauma von Nervensystemgewebe kann repariert werden, einschließlich Infarkten, Gewebeschaden durch Krebs, Hirnschlag oder Wunden, wie etwa Einschusswunden oder weitere Quetsch- und Schnittverletzungen. Des Weiteren können zahlreiche Krankheiten des Nervensystems wie etwa Parkinsonsche Krankheit durch Implantieren von Hydrogel-Zell-Zusammensetzungen, die Nervenstammzellen einschließen, die gezüchtet wurden, um ein Gen, das ein dem erkrankten Patienten fehlendes Protein exprimiert, einzuschließen, behandelt werden.
Behandlung von Defekten des vegetativen Nervensystems
Das vegetative Nervensystem (VNS), das den Sympathikus und Parasympathikus einschließt, wird in prä- und postganglionäre Neuronen unterteilt. Die Zellkörper der präganglionären Neuronen sind im zentralen Nervensystem vorhanden und Nervenstammzellen, die diese präganglionären Neuronen bilden, werden unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken zum Isolieren von ZNS-Stammzellen isoliert. In Beispiel 8 wird eine Technik zum Isolieren von postganglionären Stammzellen des vegetativen Nervensystems beschrieben.
Die neue Zusammensetzung aus Hydrogel und Nervenstammzellen des VNS kann verwendet werden, um tatsächlich jedes beliebige Organsystem des Körpers zu innervieren, indem diese Zellen zuerst vom Wirt isoliert werden und sie danach in Kultur unter Verwendung von Cytokinen und Hormonen wie etwa EFG und bFGF mit einem standardmäßigen kompletten Kulturmedium (Dulbeccos Modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)/F12) in einem Inkubator expandieren. Bei geeigneter Expansion der Zellliniensuspension in einem biologisch inerten Hydrogel wie etwa PLURONIC F127, einem oberflächenwirksamen Stoff, kann eine Konzentration von 5 bis 50 × 10⁶/ml erzielt werden. Diese Hydrogelzusammensetzung wird dann direkt (lokal) in ein Organ des Wirts, das Funktionsstörung aufweist (z. B. eine atonische Blasenwand oder ein aganglionäres Darmsegment), eingespritzt. Im Laufe der Zeit verschwindet das Hydrogel und Nervenstammzellen des VNS bleiben zurück, die in vegetative Neuronen differenzieren, die mit vorhandenen Neuronen natürlich Synapsen bilden (sich verbinden), was in der Wiederherstellung der Funktion des Organs resultiert.
Klinische Anwendungen schließen jedes beliebige Organsystem oder jeden beliebigen Teil des Körpers ein, der durch das vegetative Nervensystem innerviert ist. Beispiele schließen folgendes ein: Atonische Blase bei Diabetikern und älteren Menschen, aganglionäre Darmstörungen wie etwa Hirschsprung-Krankheit, sexuelle Funktionsstörung, wobei Impotenz durch Innervationsstörungen verursacht wird, Probleme beim vegetativen Blutfluss der Haut oder jedem beliebigen Organ und tatsächliche Innervationsdefekte von Blutgefäßen. Zusätzlich können Funktionsstörungen von Drüsen aufgrund des Verlusts vegetativer Innervation behandelt werden.
Zusätzlich können Stammzellen des VNS in Verbindung mit weiteren gezüchteten Geweben, zum Beispiel in gezüchteten Organen, verwendet werden, um Zellorganisation und vegetative Innervation der neu erzeugten Gewebe, z. B. in der Leber, der Niere, dem Darm und der Blase, zu steuern. Diese gezüchteten Organe schließen eine Trägerstruktur und eine Hydrogel-Zell-Zusammensetzung ein, wobei die Gewebevorläuferzellen sowohl die Organzellen, z. B. Hepatozyten oder Herzmuskelvorläuferzellen, als auch vegetative postganglionäre Nervenstammzellen einschließen.
Zusätzliche Verwendungen von Nervenstammzellen
Nervenstammzellen, die aus dem ZNS, z. B. der Großhirnrinde, dem Striatum und dem Rückenmark, sowie aus dem VNS isoliert werden, können ebenfalls als „intelligente Zellen" verwendet werden, die beim Abstimmen der Organisation und der Entwicklung von weiteren gezüchteten Geweben, zum Beispiel in künstlichen Organen wie etwa den Nieren, der Leber, dem Darm und der Blase, durch Einschließen dieser Nervenstammzellen in eine Mischung von Vorläuferzellen, die für die Herstellung von gezüchteten Organen verwendet werden, beteiligt sind.
Vegetative Nervenstammzellen, die unter Verwendung von standardmäßigen Techniken wie zum Beispiel jene, die in den US Patenten Nr. 5,082,670 und 5,762,926 beschrieben werden, um Dopamin zu produzieren (oder mit natürlich vorkommenden Stammzellen, die Dopamin erzeugen), genetisch entwickelt wurden, dienen der Behandlung von neurodegenerativen Prozessen, wie etwa Morbus Parkinson, und werden dann zu einem Hydrogel hinzugefügt und/oder in eine Trägerstruktur eingespritzt. Solche Hydrogel-Nervenstammzell-Zusammensetzungen wirken nach der Implantation länger als eine eingespritzte Zellsuspension.
Gleichermaßen können genetische neurodegenerative Prozesse, wie etwa Leukodystrophien, mit Nervenstammzellen, die genetisch repariert wurden, behandelt werden.
Zusätzlich können neuroendokrine Stammzellen aus dem Nebennierenmark oder der Pankreas isoliert und dazu verwendet werden, endokrine Gewebekonstrukte für die Behandlung von solchen endokrinen Erkrankungen wie etwa Diabetes herzustellen.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die nachfolgenden, nicht einschränkenden Beispiele besser verständlich.
Beispiel 1
Herstellung einer Kalziumalginat-Chondrozyt-Zusammensetzung
Eine Kalziumalginat-Mischung wird durch Kombinieren von Kalziumsulfat, einem schwach löslichen Kalziumsalz, mit 1 %igem Natriumalginat, das in einer 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,4) gelöst ist, gewonnen. Die Mischung verbleibt bei 4 °C und bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Temperatur 15 °C übersteigt, in einem flüssigen Zustand. Unter Verwendung von standardmäßigen Techniken werden Chondrozyten aus Knorpelgewebe, z. B. der Gelenkoberfläche der Vordergliedmaßen von Kälbern, isoliert und zu der Mischung hinzugefügt, um eine endgültige Zelldichte von ungefähr 2 bis 5 × 10⁷/ml zu erzeugen (z. B. entsprechend ungefähr 10 % der Zelldichte eines humanen, juvenilen Gelenkknorpels). Eine solche Mischung kann in eine permeable Trägerstruktur eingebracht werden.
Beispiel 2
Herstellung einer temperatursensitiven Hydrogel-Chondrozyt-Zusammensetzung
Ein biokompatibles, biologisch abbaubares, entgegengesetzt temperatursensitives Copolymer-Gel wurde durch Herstellung einer 30 %igen Gewicht/Volumen-Lösung von einem Block-Copolymer aus PLURONIC^TM F127 und F68 gewonnen (erhältlich von BASF). Die Lösung verbleibt bei weniger als 15 °C in einem flüssigen Zustand und erstarrt innerhalb von 5 bis 10 Minuten, wenn die Temperatur auf über 15 °C erhöht wird. Unter Verwendung von standardmäßigen Techniken wurden Chondrozyten aus der Gelenkoberfläche von Vordergliedmaßen von Kälbern isoliert und zu der Hydrogelmischung hinzufügt, um eine endgültige Zelldichte von ungefähr 2 bis 6 × 10⁷/ml zu erzeugen. Eine solche Mischung kann in eine permeable Trägerstruktur eingebracht werden.
Beispiel 3
Gesteuertes Gewebewachstum eines distalen Oberschenkelknochens in einer Ratte unter Verwendung einer permeablen Trägerstruktur
In diesem Beispiel wurde eine synthetische, biokompatible, polymere Trägerstruktur verwendet, um die Entwicklung von neuem Knochengewebe, das aus einer Hydrogel-Zell-Zusammensetzung für das Ersetzen des distalen Oberschenkelknochens einer Ratte gebildet wird, zu steuern.
Eine Ratte wurde geopfert und ihr distaler Oberschenkelknochen entfernt. Der Knochen wurde in einem Messzylinder in Flüssigkeit getaucht, um das von dem Knochen verdrängte Volumen zu messen, das bei ungefähr 1 cm³ lag. Anschließend wurde unter Verwendung von standardmäßigen Techniken im Bereich der Acrylformteile ein externes Formteil des Oberschenkelknochens angefertigt. Unter Verwendung der externen Form wurde wie folgt eine poröse Trägerstruktur, die sich aus Polygycolsäure und Polymilchsäure zusammensetzt, erzeugt.
Polyglycolsäurefasern mit 14 Mikron im Durchmesser wurden in einem Netz umschlungen, in dem die Fasern durchschnittlich 150–250 Mikron voneinander beabstandet sind. Das Fasernnetz wurde dann für ungefähr 10 Sekunden in eine 1 %ige Lösung von Polymilchsäure getaucht und gesättigt. Die Lösung, deren Viskosität jener von Wasser ähnelt, beschichtete die Fasern und schweißte die Fasern dort zusammen, wo die Fasern sich überschnitten. Während das Fasernetz von der Polymilchsäurelösung noch nass war, wurde es in das Formteil gedrückt und konnte mehrere Minuten lang trocknen. Nach dem Verdampfen der Lösung und dem Trocknen der Polymilchsäure behielt das Fasernnetz die Form des Formteils bei. Der Vorgang fand bei Raumtemperatur statt und produzierte eine Trägerstruktur in der Form des distalen Oberschenkelknochens mit Löchern und Poren von ungefähr 200 Mikron im Durchmesser. Der Oberschenkelknochen selbst war ungefähr 15 mm lang und wies einen Durchmesser von zwischen 3 und 7 mm auf. 2 ist eine Photographie der Trägerstruktur des Oberschenkelknochens.
Dann wurde die Trägerstruktur subkutan auf den Rücken einer nackten Maus implantiert. 3 zeigt eine Photographie der nackten Maus, nachdem die Trägerstruktur implantiert wurde. Die Photographie zeigt deutlich die Definition der Trägerstruktur in Form des Oberschenkelknochens durch die Haut der Maus. Eine Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, die periosteale Zellen enthält, wurde dann in die Trägerstruktur eingespritzt.
Die periostealen Zellen wurden durch das Gewinnen von Streifen (ungefähr 5 mm mal 3 mm) aus chirurgisch von der Oberfläche eines Knochens entferntem Periosteum isoliert. Die Periost-Streifen wurden in einer Gewebekulturschale, die Nährstoff enthielt, platziert und periosteale Zellen wurden von den Periost-Streifen gelöst und multiplizierten sich während eines Zeitraums. Die Zellen wurden in vitro in einem Inkubator gehalten und konnten sich bis zu 4 Wochen lang multiplizieren. Bei dem in diesem Beispiel verwendeten Hydrogel handelte es sich um Kalziumalginat, dessen Herstellung in Beispiel 1 beschrieben ist. Die periostealen Zellen wurden zu dem Kalziumalginat hinzugefügt, um eine Hydrogel-Zell-Zusammensetzung mit einer Konzentration von ungefähr 50 Millionen Zellen pro cm³ zu produzieren. Eine geringe Konzentration an Kalzium wurde ebenfalls zu der Zusammensetzung hinzugefügt.
Ein Volumen der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, das dem erneut gemessenen Volumen des distalen Oberschenkelknochens (ungefähr 1 cm³) entspricht, wurde mittels einer 25 Gauge Nadel unter Verwendung einer Spritze von 3 cm³ in die Trägerstruktur, die unter die Haut der nackten Maus implantiert wurde, eingespritzt. Das Hydrogel erstarrte nach dem ionischen Vernetzen mit Kalziumionen, die zwar in allen Körpergeweben vorkommen, jedoch ebenfalls vor dem Einspritzen zu der Hydrogel-Zell-Zusammensetzung hinzugefügt worden waren. Nach dem Erstarren des Hydrogels ermöglichte die Trägerstruktur der Hydrogel-Suspension, die Zellen enthielt, ihre Form zu erhalten und Druckkräften standzuhalten, während sich neues Gewebe entwickelte.
Nach 8 Wochen wurde die Maus geopfert und zwecks Untersuchung wurde die Trägerstruktur in Form des Oberschenkelknochens entfernt. Wie in der Photographie aus 4 gezeigt, wuchs neues Gewebe an der Trägerstruktur an. Wie auf der Photographie aus 5 gezeigt, zeigte sich bei der histologischen Untersuchung der Trägerstruktur Wachstum von neuem Gewebe und Gefäßbildung, wie durch das Entstehen eines Havens-Systems in dem neuen Knochen angezeigt wurde. Insbesondere 5 zeigt einen Teil des neuen Gewebes, in dem Knochenzellen (hell angezeigt) ein Blutgefäß (dunkel angezeigt) in der Mitte der Photographie einschließen. Zusätzliche Knochenzellen füllten die Trägerstruktur. Die Photographie wurde mithilfe eines 20 X Mikroskopobjektivs gemacht und die Photographie entspricht einem Querschnittsfläche von 640 Mikron mal 950 Mikron.
Beispiel 3 veranschaulicht, dass Implantieren einer permeablen Trägerstruktur, die eine definierte Form aufweist, die Form und Entwicklung von neuem Gewebe, das aus einer Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, die in die Trägerstruktur eingespritzt wird, gebildet wird, steuert. Die Trägerstruktur hält mechanischen Kräften und Druckkräften Stand und ermöglicht, dass die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung neues Gewebe der gewünschten Form und des gewünschten Volumens entwickelt. Aus dem Mausmodell in diesem Beispiel geht eindeutig hervor, dass dieselben Techniken bei der Erzeugung von neuem Gewebe in menschlichen Patienten wirksam sind.
Beispiel 4
Isolieren von Stammzellen des Rückenmarks
Aus Fisher-Ratten wurden Stammzellen des Rückenmarks isoliert. Die Ratten wurden geköpft und die Körper fünfzehn Minuten lang auf Eis gelegt. Das Rückenmark wurde entfernt und bei 40 F in kalte, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in Petrischalen platziert. Das Rückenmark wurde leicht geöffnet, um die graue Substanz mithilfe eines Skalpells Nr. 15 freizulegen und die graue Substanz wurde vom Gewebe der verbleibenden weißen Substanz abgekratzt. Die weisse Substanz wurde mit Pinzetten entfernt, wobei Zellen der in der PBS suspendierten grauen Substanz zurückblieben. Die PBS wurde gerührt und in ein zur Hälfte mit kalter PBS gefülltes Zentrifugenglas geleert. Die Flüssigkeit wurde bei 1200 U/min × 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde abgesaugt.
Zehn Zentiliter 0,05 %iges Trypsin wurde zu dem Glas mit Zellen hinzugefügt und in einem Wasserbad 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Dieser Prozess des Enzymabbaus zerlegt Gewebstrümmer und tötet die Mehrzahl der Zellen (differenzierte Zellen) in der Lösung, ausgenommen die Stammzellen des Rückenmarks.
Nach fünf Minuten wurde das Trypsin mit DMEM (10 %iges fötales Kälberserumalbumin) inaktiviert. Die Mischung wurde gerührt und unter Verwendung einer Pasteur-Pipette mit normaler Öffnung wurden die Zellen in eine Mischung, die so fein wie möglich ist, aufgebrochen. Wiederum bestand das Ziel darin, alle Zellen, bei denen es sich nicht um Stammzellen handelte, zu zerstören. Die Zellen wurden ferner mit einer feinen Mikrokapillare mit einem Innendurchmesser von ungefähr 100 Mikron trituriert. Dieser Prozess tötet reife Nervenzellen durch Brechen von Appendicen und Fortsätzen. Nach der zweiten Trituration wurden die Zellen wiederum bei 1200 U/min × 5 Minuten geschleudert. Der Überstand wurde dekantiert und die verbleibenden Zellen wurden in komplettem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F12 (Gibco, Gaithersburg, MD) suspendiert. Das komplette Medium schließt Glucose, Transferrin, Insulin, Putrescin, Selen, Penicillin-Streptomycin und HEPES-Puffer in standardmäßigen Konzentrationen ein. Progesteron wurde in einer Konzentration von 20 ng/ml hinzugefügt.
Zu diesem Kulturmedium wurde epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und basischer Fibroblasten Wachstumsfaktor (bFGF) in einer Konzentration von 20 Nanogramm pro ml hinzugefügt. Dasselbe Wachstumsmedium kann für das Isolieren und Expandieren von Stammzellen von humanem Rückenmark verwendet werden. Für das Isolieren von Stammzellen des Hirngewebes von Tieren oder Menschen kann dasselbe Kulturmedium verwendet werden (DMEM), allerdings wird dasselbe lediglich mit EGF, nicht aber mit bFGF, supplementiert.
Die isolierten Stammzellen wurden bei 37 °C in 20 ml supplementiertem Wachstumsmedium in einem Kolben mit 5 % CO₂ kultiviert. Alle drei Tage wurden fünf ml frisches, komplettes DMEM/F12, das wie oben beschrieben supplementiert war, hinzugefügt. Während sich die Zellen multiplizieren (expandieren), können die Zellen passieren, indem sie aus dem Kolben heraus pipettiert, bei 1200 U/min × fünf Minuten geschleudert und in frischen, supplementierten Medien (20 ml) resuspendiert und mit einer Pipette mit normaler Öffnung (und optional mit einer Mikropipette) trituriert werden.
Bei jeder Passage werden die Zellen in einem Kolben in zwei gleiche Teile aufgeteilt und in zwei getrennten Kolben mit jeweils 20 ml resuspendiert. Die erste Passage (nach ungefähr 7 Tagen Kultivierung) erzielt annähernd 1 bis 6 Millionen Zellen, die zweite Passage eine Woche später erzielt annähernd 2 bis 12 Millionen Zellen. Nach drei bis vier Wochen hört die Population an Zellen zu wachsen auf und sie verbleibt bei einem konstanten Wert. Solange die Zellen auf wöchentlicher Basis passieren und trituriert werden, können die Zellen in einem nicht differenzierten Zustand unbegrenzt kultiviert werden.
Beispiel 5
Herstellung einer Hydrogel-Rückenmarkstammzell-Zusammensetzung
Ungefähr 20 bis 50 Millionen Zellen pro ml Rückenmarkstammzellen, die wie oben in Beispiel 4 beschrieben isoliert wurden, wurden in einer Lösung von komplettem DMEM/F12, das mit EGF, bFGF und einer 23 %igen Konzentration von PLURONIC^TM F127 supplementiert wurde, suspendiert. Bei diesem bestimmten PLURONIC handelt es sich um einen oberflächenwirksamen Stoff, der bewirkt, dass das Kulturmedium bei 15 bis 50 °C geliert und bei unter 15 °C und über 50 °C eine visköse Flüssigkeit wird.
Dann wurde die Hydrogel-Rückenmarkstammzell-Zusammensetzung dazu verwendet, ein ungewebtes Netz von Polyglycolsäure(PGA)-Fasern, die jeweils einen einzelnen Durchmesser von ungefähr 15 Mikron aufweisen, zu durchdringen. Dieses Netz hat das Aussehen einer kleinen Masse Baumwolle und wurde durch Eintauchen des Netzes in die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung durchdrungen. Alternativ kann das flüssige Hydrogel in das ungewebte Netz eingespritzt werden.
Das PGA Netz hält das PLURONIC-Gel durch kapillare Wirkung und stellt Steuerung des Wachstums der Nervenstammzellen, nachdem sie in ein Lebewesen implantiert wurden, bereit. Des Weiteren stimulieren die PGA Fasern die Differenzierung der nicht differenzierten Nervenstammzellen.
Nach dem Durchdringen enthielt ein kleiner Pfropfen von ungewebtem PGA Netz mit einem Durchmesser von ungefähr 3 Millimeter und einer Länge von ungefähr 4 bis 5 Millimeter ungefähr 50 Mikroliter Hydrogel-Zell-Zusammensetzung und folglich ungefähr 1 bis 5 Millionen Zellen.
Beispiel 6
Reparatur von Rückenmarkverletzungen bei Ratten
Dreißig Fisher-Ratten wurden anästhesiert und ihr Rückenmark wurde chirurgisch verletzt. Insbesondere wurde das Rückenmark in jedem Fall an zwei, ungefähr 3 bis 4 Millimeter voneinander beabstandeten Stellen vollständig getrennt und der dazwischenliegende Abschnitt des Rückenmarks wurde entfernt, wobei eine Lücke von 3 bis 4 Millimeter zurückblieb. Diese Lücke wurde eine Woche nach der Operation durch Magnet-Resonanz-Darstellung bestätigt. Die wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellte Hydrogel-Stammzell-Zusammensetzung wurde verwendet, um den Teil des Rückenmarks, der bei fünfzehn Versuchstieren entfernt wurde, zu ersetzen. Bei fünfzehn Kontrolltieren wurde dieselbe Operation durchgeführt, bei der ein Teil des Rückenmarks entfernt wurde, wobei eine 3 bis 4 mm große Lücke zurückblieb, jedoch wurde keine Hydrogel-Zell-Zusammensetzung eingeführt, um die Lücke zu ersetzen. Die Wunden auf dem Rückenmark wurden bei allen Tieren genäht. Die Wirbel der Wirbelsäure blieben stabil, da lediglich die Platte und die hinteren Fortsätze entfernt wurden.
Von den ursprünglich 30 Ratten starben 21 bei der Operation oder aufgrund von Komplikationen, wie etwa Spinalschock, Infektion oder Dehydrierung, wodurch neun Ratten überlebten. Bei diesen neun Ratten handelte es sich um fünf Versuchstiere und vier Kontrolltiere.
Alle lebenden Ratten erhielten standardmäßige postoperative Pflege und wurden über die Zeit hinweg beobachtet und normal gefüttert. Der allgemeine Zustand der Ratten und die Funktion der Hintergliedmaße wurden auf zwei Arten überprüft. Zuerst wurde das Schmerzempfinden durch Nadelstich überprüft (rechtes und linkes Hinterbein, rechter und linker Schenkel, Rücken und Abdomen), um die Kopfbewegung zu untersuchen, was eher das Vorhandensein von Schmerz anzeigt, als dies ein reiner Reflex, der sich zum Beispiel als Entziehen der Gliedmaße äußert, tut. Als nächstes wurde die motorische Funktion sowohl für den Reflex als auch für die spontane, zielgerichtete motorische Funktion untersucht. Nach sechs Wochen zeigten die fünf Kontrollratten kein Schmerzempfinden und keine zielgerichteten Bewegungen der Hintergliedmaßen an. Die Hintergliedmaßen waren ursprünglich atonisch, entwickelten dann jedoch nach ungefähr 7 bis 10 Tagen spastische Paralyse.
Im Gegensatz dazu zeigte sich bei den vier Versuchsratten ein klares Zurückkehren der Funktion in deren Hintergliedmaßen in unterschiedlichen Ausmaßen. Die Ratten zeigten bei allen Stellen das Vorhandensein von Schmerz (linkes und rechtes Hinterbein und linker und rechter hinterer Schenkel, Rücken und Abdomen) und zeigten klare spontane, zielgerichtete motorische Funktion an. Basierend auf visuellen Beobachtungen zeigte die beste der vier Versuchsratten nach vier Wochen ungefähr 90 Prozent der Funktion in dem rechten Hinterbein und ungefähr 80 Prozent Funktion in der linken Hintergliedmaß an. In der Tat legte diese Ratte das Gewicht ihres gesamten Körpers auf die beiden Hinterbeine, um Nahrung und Wasser zu erreichen. Nach vier Wochen zeigten die beiden Ratten, die sich in bescheidenem Ausmaße erholten, ungefähr 50 bis 60 Prozent Funktion in einem der Hintergliedmaßen und ungefähr 25 Prozent Funktion in der anderen Hintergliedmaße an. Die „Schlechteste" der vier Versuchsratten zeigte ungefähr 30 Prozent Funktion in dem rechten Hinterbein und ungefähr 10 bis 15 Prozent Funktion in dem linken Hinterbein an. Alle Versuchsratten zeigten auch weiterhin Besserung an.
Beispiel 7
Kultivieren von isolierten Nervenstammzellen in Hydrogel
Bei dieser Studie wurden Nervenstammzellen in PLURONIC^® F127 suspendiert, um das in vitro Überleben, die optimale Zelldichte für Kultur und die phänotypische Expression als Antwort auf zahlreiche Faktoren einschließlich epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF) und 10 %iges fötales Rinderserum (FBS), zu veranschaulichen.
Striatum-Stammzellen wurden vom Striatum von Tag 15 Balb-C Mäuseembryonen (wie in Beispiel 5 beschrieben) geerntet und bei 37 °C in komplettem DMEM/F12 (1:1) mit Progesteron (als ein trophisches Mittel) und EGF inkubiert. In den oben angeführten Medien, die 23 % PLURONIC F127 enthielten, wurden die Zellen bei 5, 10 und 20 Millionen Zellen/ml suspendiert und 21 Tage lang bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert. Zellen, die auf dieselbe Art und Weise von denselben Quellen geerntet wurden, wurden bei einer Konzentration von 5 Millionen Zellen/ml bei Fehlen (Kontrolle) oder unter Vorhandensein von EGF bei 20 ng/ml, NGF bei 100 ng/ml oder 10 % FBS suspendiert und in derselben Art und Weise inkubiert. An Tag 7 und Tag 14 wurden Zellen aus der Kultur entfernt, mittels Cytospin auf Objektträgern abgelagert und mit Antikörpern jeweils auf GFAP (saures gliales Faserprotein), NF (Neurofilament) und 04 als Marker für Gliazellen, Neuronen und Oligodendrozyten hin untersucht.
Beim Zellwachstum wurde zwischen den unterschiedlichen Zellkonzentrationen kein Unterschied beobachtet. Zusätzlich wurde durch Differenzierung in eine breite Palette an CNS-Zellen Pluripotenzialität gezeigt, wie dies durch positives Antikörper-Färben für GFAP, NF und 04 angezeigt wurde. Wie in der Tabelle unten gezeigt, wird die phänotypische Regulation durch die Zunahme an NF+ Zellen in den NGF- und FBS-Gruppen an Tag 14 veranschaulicht. Dies stimmt mit der Regulation der Lineagenbildung von Nervenstammzellen, die in Suspensionskultur beobachtet wurde, überein.
Tabelle
Basierend auf diesen Versuchen ist klar, dass Nervenstammzellen überleben und sich vermehren, wenn sie in PLURONIC F127 bei einer Konzentration von 5 Millionen Zellen/ml kultiviert werden. Die phänotypische Expression dieser Stammzellen wurde durch Wachstumsfaktoren in einer ähnlichen Art und Weise wie Stammzellen, die lediglich in Medien kultiviert wurden, kontrolliert.
In einem weiteren Versuch wurden adulte Rückenmarkstammzellen von Ratten in PLURONIC^® 127 mit einem PGA Netz wie in Beispiel 5 beschrieben suspendiert. Nicht für die Implantation in Beispiel 6 verwendete Zellen wurden bei 37 °C mit Normalluft und 5 % CO₂ inkubiert. Die Stammzellen bildeten Neurosphären und banden an das PGA Netz und überlebten eine Woche, ehe sie verworfen wurden.
Beispiel 8
Isolieren von postganglionären Stammzellen des vegetativen Nervensystems aus dem Herzen, der Lunge, der Leber, der Niere, der Blase und dem Darm der adulten Ratte
Eine adulte Ratte wurde durch Köpfen geopfert und der gesamte Körper wurde auf Eis gekühlt. Das Herz, die Lunge, die Leber, die Niere, die Blase und der Darm wurden unter sterilen Bedingungen seziert und ein 5 mm-Gewebefragment jedes dieser Organe wurde in einer separate Petrischale kalter PBS platziert. Jedes Gewebefragment wurde aggressiv mit einer Skalpellklinge # 15 in kalte PBS abgeschabt. Die abgeschabten Gewebefragmente wurden verworfen und die verbleibende PBS wurde zu 10 ml kalter PBS hinzugefügt und bei 1200 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert.
Die PBS wurde abgesaugt und 10 ml 0,05 %iges Trypsin wurden zu dem Sediment hinzugefügt und in einem 37 °C warmen Wasserbad 5 Minuten lang inkubiert. Das Trypsin wurde durch Hinzufügen von 10 ml DMEM + 10 % FSA inaktiviert. Die Proben wurden mit einer Pasteur-Pipette trituriert, bis das Gewebe in einer feinen Suspension vorhanden war, anschließend wurden sie erneut mit einer Pasteur-Mikropipette mit reduzierter Öffnung trituriert, bis das Gewebe dissoziiert wurde. Die Proben wurden bei 1200 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Sediment wurde in DMEM/F12, das mit 20 ng/ml EGF und bFGF supplementiert wurde, resuspendiert und bei 37 °C mit 5 CO₂ in einem Inkubator platziert. Alle Proben, von jedem Organ, enthielten einige kleine, runde Nervenstammzellen. Bei Zellen, die am Boden der Kolben anlagen, wurde selten Differenzierung in Neuronen beobachtet.
Derselbe Vorgang kann verwendet werden, um Nervenstammzellen des VNS aus jedem beliebigen Organ des Körpers mittels vegetativer Innervation zu extrahieren und isolieren.
Beispiel 9
Isolieren von neuroendokrinen Stammzellen aus der Nebenniere und der Pankreas der adulten Ratte
Eine adulte Ratte wurde durch Köpfen geopfert und der gesamte Körper wurde auf Eis gekühlt. Die Nebenniere und die Pankreas wurden unter sterilen Bedingungen seziert, um ein 5 mm-Gewebefragment zu erhalten. Das Gewebefragment der Nebenniere wurde aggressiv mit einer Skalpellklinge # 15 in kalte PBS abgeschabt. Das Gewebefragment der Pankreas wurde mit einem Skalpell # 15 in kaltes DMEM-F12 Medium und 10 % FSA geschabt, was zur Folge hat, dass die endogenen Enzyme der Pankreas inaktiviert wurden. Das DMEM-F12 Medium mit Pankreas-Gewebe-Abschabungen wurde zu 5 ml kalter PBS hinzugefügt.
Die abgeschabten Gewebefragmente wurden verworfen und die verbleibende PBS (und DMEM-F12/FSA) (die Stammzellen enthaltend) wurde zu 10 ml kalter PBS hinzugefügt und bei 1200 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Die PBS (und DMEM-F12/FSA) wurde abgesaugt und 10 ml 0,05° %iges Trypsin wurden zu dem Sediment hinzugefügt und in einem 37 °C warmen Wasserbad 5 Minuten lang inkubiert. Das Trypsin wurde durch Hinzufügen von 10 ml frisches DMEM-F12 + 10 % FSA inaktiviert. Die Proben wurden mit einer Pasteur-Pipette trituriert, bis das Gewebe in einer feinen Suspension vorhanden war, anschließend wurden sie erneut mit einer Pasteur-Mikropipette mit reduzierter Öffnung trituriert, bis das Gewebe dissoziiert wurde. Die Proben wurden bei 1200 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Sediment wurde in komplettem DMEM/F12, das mit 20 ng/ml EGF und bFGF supplementiert wurde, resuspendiert und bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einem Inkubator platziert. Alle Proben, von jeder Drüse, enthielten einige kleine, runde neuroendokrine Nervenstammzellen.
Derselbe Vorgang kann verwendet werden, um neuroendokrine Stammzellen aus weiteren Drüsen des Körpers, z. B. Hypothalamus, Hypophyse, Nebenschilddrüse und Schilddrüse, und entlang des Verdauungstraktes und der Aorta, zu extrahieren und zu isolieren.

Claims

Gewebe bildende Struktur, umfassend: eine permeable, biokompatible Trägerstruktur mit einer vorbestimmten Form, die der Form des gewünschten Gewebes entspricht; und eine Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, die wenigstens teilweise die Trägerstruktur füllt, wobei die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen umfasst, wobei die Zellen keine humanen Embryonalzellen umfassen.
Gewebe bildende Struktur nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Therapie.
Gewebe bildende Struktur nach Anspruch 1, wobei die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung eine erstarrte Suspension eines Hydrogels ist, das dispergierte Gewebevorläuferzellen trägt.
Verwendung einer Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, umfassend ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen und eine permeable, biokompatible Trägerstruktur zur Herstellung einer Gewebe bildenden Struktur zur Verwendung in der Erzeugung neuen Gewebes.
Verwendung eines Hydrogels zur Herstellung einer flüssigen Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, umfassend ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen zur Freisetzung in eine permeable, biokompatible Trägerstruktur zur Verwendung in der Erzeugung neuen Gewebes, wobei man die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in der Trägerstruktur erstarren und die Gewebevorläuferzellen wachsen und neues Gewebe erzeugen lässt.
Verwendung von Gewebevorläuferzellen zur Herstellung einer flüssigen Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, umfassend ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen zur Freisetzung in eine permeable, biokompatible Trägerstruktur zur Verwendung in der Erzeugung neuen Gewebes, wobei man die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in der Trägerstruktur erstarren und die Gewebevorläufer wachsen und neues Gewebe erzeugen lässt.
Verwendung eines Hydrogels und von Gewebevorläuferzellen zur Herstellung einer flüssigen Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, umfassend ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen zur Freisetzung in eine permeable, biokompatible Trägerstruktur zur Verwendung in der Erzeugung neuen Gewebes, wobei man die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in der Trägerstruktur erstarren und die Gewebevorläuferzellen wachsen und neues Gewebe erzeugen lässt.
Produkt, enthaltend (i) eine Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, umfassend ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen und (ii) eine permeable, biokompatible Trägerstruktur zur Verwendung in der Herstellung einer Gewebe bildenden Struktur zur Verwendung in der Erzeugung neuen Gewebes, wobei die Trägerstruktur für die Implantation in ein Lebewesen, vor oder nach Einbringen der Zusammensetzung in diese Struktur, bestimmt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Trägerstruktur für die Implantation in ein Lebewesen, vor oder nach Einbringen der Zusammensetzung in diese Struktur, bestimmt ist.
Ex-vivo-Verfahren zur Erzeugung neuen Gewebes, bei dem man eine flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung, umfassend ein Hydrogel und Gewebevorläuferzellen gewinnt; die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in eine permeablen, biokompatiblen Trägerstruktur mit einer vorbestimmten Form, die der Form des gewünschten Gewebes entspricht, einbringt; und die flüssige Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in der Trägerstruktur erstarren und die Gewebevorläuferzellen wachsen und neues Gewebe erzeugen lässt.
Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 10, wobei man die Hydrogel-Zell-Zusammensetzung in die Trägerstruktur einspritzt.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Trägerstruktur in Form des gewünschten Gewebes ausgebildet ist.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Trägerstruktur in Form eines Gelenkknorpels, angrenzend an ein Gelenk, einen Knochen, einen Teil eines Knochens oder einen Knochendefekt, ausgebildet ist.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Trägerstruktur in Form eines Zylinders mit dem Durchmesser des Rückenmarks eines zu behandelnden Säugers ausgebildet ist.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Trägerstruktur ein keramisches Material umfasst.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Träger biologisch abbaubar ist.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Trägerstruktur einen Schwamm oder Schaum umfasst.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Trägerstruktur komprimierbar ist.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Trägerstruktur ein Netz von Fasern umfasst.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Trägerstruktur ein Netz von polymeren Fasern umfasst.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Trägerstruktur ein Netz von Polyglycolsäurefasern und Polymilchsäure umfasst.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Trägerstruktur aus Polyanhydrid, Polyorthoester, Polyglycolsäure, Polymilchsäure oder Polyglactin gebildet ist.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Trägerstruktur porösen Hydroxylapatit umfasst.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Trägerstruktur Metall umfasst.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Trägerstruktur starr ist.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei das Hydrogel unter Polysacchariden, Proteinen, Polyphosphazenen, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymeren, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymeren von Ethylendiamin, Polyacrylsäuren, Polymethacrylsäuren, Copolymeren von Acrylsäure und Methacrylsäure, Polyvinylacetat und sulfonierten Polymeren ausgewählt ist.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Gewebevorläuferzellen unter Epidermiszellen, Chondrozyten und anderen Zellen, die Knorpel, Makrophagen, Dermalzellen, Muskelzellen, Haarfolikel, Fibroblasten, Organzellen, Osteoblasten bilden, und anderen Zellen, die Knochen, Endothelzellen, Mucosazellen, Pleurazellen, Zellen des Ohrkanals, Zellen der tympanischen Membran, Peritonealzellen, Schwannsche Zellen, korneale Epithelzellen, Gingivazellen, Nervenzellen, Nervenstammzellen und tracheale Epithelzellen bilden, ausgewählt sind.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei die Gewebevorläuferzellen unter Stammzellen des zentralen Nervensystems, Stammzellen des vegetativen Nervensystems und Stammzellen des peripheren Nervensystems ausgewählt sind.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei die Gewebevorläuferzellen unter Hirnstammzellen und Rückenmarkstammzellen ausgewählt sind.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Gewebevorläuferzellen neuroendokrine Stammzellen sind.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Gewebevorläuferzellen unter aus Blase, Dünndarm, Lunge, Herz, Niere und Leber isolierten Stammzellen des vegetativen Nervensystems ausgewählt sind.
Gewebe bildende Struktur, Verwendung, Produkt oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei die Zellen Knochen bildende Zellen sind und die Trägerstruktur porösen Hydroxylapatit umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Gewebevorläuferzellen Nervenstammzellen sind und die Gewebe bildende Struktur zur Verwendung in der Behandlung defekten Nervengewebes dient, wobei die Zusammensetzung zum Einbringen in eine Trägerstruktur der ungefähren Größe und Form einer Kavität dient, die durch Lokalisieren der natürlichen Grenzen des defekten Gewebes und Entfernen des defekten Gewebes geschaffen wurde, um an den Oberflächen der Kavität gesundes Nervengewebe freizulegen, wobei die Nervenstammzellen so gewählt sind, dass sie sich in dem gesunden Nervengewebe differenzieren: und wobei die Trägerstruktur zur Implantation in die Kavität dient und dadurch das defekte Nervengewebe behandelt wird.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei das defekte Nervengewebe Gewebe des zentralen Nervensystems ist.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei das defekte Nervengewebe im Hirn oder Rückenmark ist.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei das defekte Nervengewebe Gewebe des vegetativen Nervensystems oder endokrines Gewebe ist.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Nervenstammzellen aus gesundem Nervengewebe isoliert werden.