DE69937752T2

DE69937752T2 - Modifizierte peptide als therapeutische mittel

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Publication number: DE69937752T2
Application number: DE69937752T
Authority: DE
Inventors: Ulrich Newbury Park FEIGE; Chuan-Fa Longmont LIU; Janet Montecito CHEETHAM; Thomas Charles Newbury Park BOONE
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-25
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2019-10-26
Also published as: BR9914708A; US7189827B2; SK5252001A3; CN1746189A; US20040053845A1; AU2004200690C1; DE69937752T3; ZA200102753B; AU2004200687A1; SK287037B6; HK1090932A1; KR20010099706A; KR20070050977A; KR100753304B1; JP2007089586A; HK1042097A1; HUP0203506A2; IL142365A0; JP2003512011A; YU25901A

Description

Rekombinante Proteine sind eine aufstrebende Klasse therapeutischer Agenzien. Solche rekombinanten Therapeutika haben Fortschritte bei der Proteinformulierung und der chemischen Modifikation von Proteinen erzeugt. Solche Modifikationen können therapeutische Proteine schützen, primär durch das Verhindern ihrer Exposition gegenüber proteolytischen Enzymen. Proteinmodifikationen können auch die Stabilität des therapeutischen Proteins, seine Kreislaufzeit und biologische Aktivität verbessern. Francis (1992), Focus an Growth Factor 3: 4–10 (Mediscript, London), stellt einen Übersichtsartikel dar, der Proteinmodifikation und Fusionsproteine beschreibt und hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.

Eine nützliche Modifikation ist die Kombination mit der „Fc"-Domäne eines Antikörpers. Antikörper umfassen zwei funktionell unabhängige Teile, eine variable Domäne, die als „Fab" bekannt ist und Antigen bindet, und eine konstante Domäne, die als „Fc" bekannt ist und die Verbindung zu solchen Effektorfunktionen wie der Komplementaktivierung und dem Angriff durch phagozytische Zellen herstellt. Eine Fc hat im Serum eine lange Halbwertszeit, wohingegen eine Fab kurzlebig ist. Capon et al. (1989), Nature 337: 525–31. Wenn sie mit einem therapeutischen Protein zusammengebaut ist, kann eine Fc-Domäne eine längere Halbwertszeit bereitstellen oder solche Funktionen wie die Fc-Rezeptorbindung, Protein-A-Bindung, Komplementfixierung und vielleicht sogar die plazentale Übertragung umfassen. Id. Tabelle 1 fasst die Verwendung von Fc-Fusionen zusammen, die auf dem Gebiet bekannt sind. Tabelle 1 – Fc-Fusion mit therapeutischen Proteinen

Form von Fc	Fusionspartner	Therapeutische Implikationen	Literaturstelle
IgG1	N-Terminus von CD30-L	Hodgkin'sche Krankheit; anaplastisches Lymphom; T-Zell-Leukämie	US-Patent Nr. 5,480,981
Murines Fcγ2a	IL-10	anti-entzündlich; Transplantabstoßung	Zheng et al. (1995), J. Immunol. 154: 5590–600
IgG1	TNF-Rezeptor	septischer Schock	Fisher et al. (1996), N. Engl. J. Med. 334: 1697–1702; Van Zee, K. et al. (1996), J. Immunol. 156: 2221–30
IgG, IgA, IgM oder IgE (ausschließend die erste Domäne)	TNF-Rezeptor	Entzündung, Autoimmunstörungen	US-Patent 5,808,029 , erteilt am 15. September 1998
IgG1	CD4-Rezeptor	AIDS	Capon et al. (1989), Nature 337: 525–31
IgG1, IgG3	N-Terminus von IL-2	gegen Krebs, antiviral	Harvill et al. (1995), Immunotech. 1: 95–105
IgG1	C-Terminus von OPG	Osteoarthritis; Knochendichte	WO 97/23614 , veröffentlicht am 3. Juli 1997
IgG1	N-Terminus von Leptin	gegen Fettleibigkeit	PCT/US 97/23183 , eingereicht am 11. Dezember 1997
Menschlicher Ig Cγ1	CTLA-4	Autoimmunstörungen	Linsley (1991), J. Exp. Med. 174: 561–9

Ein sehr unterschiedlicher Ansatz zur Entwicklung therapeutischer Agenzien ist das Screenen einer Peptidbibliothek. Die Wechselwirkung eines Proteinliganden mit seinem Rezeptor findet häufig über eine vergleichsweise große Grenzfläche statt. Wie jedoch für das menschliche Wachstumshormon und seinen Rezeptor gezeigt werden konnte, tragen nur einige Schlüsselreste an der Grenzfläche zu dem Großteil der Bindungsenergie bei. Clackson et al. (1995), Science 267: 383–6. Der überwiegende Teil des Proteinliganden zeigt lediglich die Bindungsepitope in der richtigen Topologie oder dient Funktionen, die die Bindung nicht betreffen.
Somit können Moleküle, die lediglich „Peptid"-Länge (2 bis 40 Aminosäuren) aufweisen, an das Rezeptorprotein eines gegebenen großen Proteinliganden binden. Solche Peptide können die Bioaktivität des großen Proteinliganden („Peptidagonisten") nachahmen oder die Bioakti vität des großen Proteinliganden („Peptidantagonisten") durch kompetitive Bindung inhibieren.
Phage Display-Peptidbliotheken sind als leistungsfähiges Verfahren zum Identifizieren solcher Peptidagonisten und -antagonisten in Erscheinung getreten. Siehe z. B. Scott et al. (1990), Science 249:386; Devlin et al. (1990), Science 249:404; US-Pat. Nr. 5,223,409 , erteilt am 29. Juni 1993; US-Pat. Nr. 5,733,731 , erteilt am 31. März 1998; US-Pat. Nr. 5,498,530 , erteilt am 12. März 1996; US-Pat. Nr. 5,432,018 , erteilt am 11. Juli 1995; US-Pat. Nr. 5,338,665 , erteilt am 16. August 1994; US-Pat. Nr. 5,922,545 , erteilt am 13. Juli 1999; WO 96/40987 , veröffentlicht am 19. Dezember 1996; und WO 98/15833 , veröffentlicht am 16. April 1998 (von denen jede durch Bezugnahme aufgenommen ist). In solchen Bibliotheken werden zufällige Peptidsequenzen durch Fusion mit Mantelproteinen eines filamentösen Phagen gezeigt. Typischerweise werden die gezeigten Peptide mit einer mit einem Antikörper immobilisierten extrazellulären Domäne eines Rezeptors affinitätseluiert. Die zurückgehaltenen Phagen können durch aufeinanderfolgende Runden mit Affinitätaufreinigung und erneuter Ausbreitung angereichert werden. Die am besten bindenden Peptide können sequenziert werden, um Schlüsselreste innerhalb einer oder mehr als einer strukturell verwandten Familie von Peptiden zu identifizieren. Siehe z. B. Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696–9, bei denen zwei deutliche Familien identifiziert wurden. Die Peptidsequenzen können auch nahelegen, welche Reste sicher durch Alaninscanning oder durch Mutagenese auf der Ebene der DNA ersetzt werden können. Es können Mutagenesebibliotheken erzeugt und gescreent werden, um die Sequenz der besten Bindungspartner weiter zu optimieren. Lowman (1997), Ann Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401–24.
Es kann auch eine strukturelle Analyse von einer Protein-Protein-Wechselwirkung verwendet werden, um Peptide vorzuschlagen, die die Bindungsaktivität von großen Proteinliganden nachahmen. Bei solch einer Analyse kann die Kristallstruktur die Identität und relative Orientierung entscheidender Reste des großen Proteinliganden nahe legen, aus denen ein Peptid konzipiert werden kann. Siehe z. B. Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266–70. Diese analytischen Verfahren können auch verwendet werden, um die Wechselwirkung zwischen einem Rezeptorprotein und durch Phage Display selektierten Peptiden zu untersuchen, was eine weitere Modifikation der Peptide nahe legen kann, um die Bindungsaffinität zu erhöhen.
Andere Verfahren konkurrieren in der Peptidforschung mit dem Phage Display. Eine Peptidbibliothek kann an den C-Terminus des lac-Repressors fusioniert und in E. coli exprimiert werden. Ein anderes Verfahren auf der Grundlage von E. coli erlaubt das Zeigen auf der äußeren Membran der Zelle durch Fusion mit einem mit Peptidoglycan assoziierten Lipoprotein (PAL). Hiernach werden diese und verwandte Verfahren zusammen als „E. coli-Display" bezeichnet. Bei einem anderen Verfahren wird die Translation einer zufälligen RNA vor der Ribosomenfreisetzung angehalten, was zu einer Bibliothek von Polypeptiden führt, deren assoziierte RNA immer noch befestigt ist. Hiernach werden diese und verwandte Verfahren zusammen als „Ribosomen-Display" bezeichnet. Andere Verfahren verwenden die chemische Verbindung von Peptiden mit RNA; siehe z. B. Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297–303. Hiernach werden diese und verwandte Verfahren zusammen als „RNA-Peptid-Screening" bezeichnet. Es wurden Bibliotheken mit chemisch abgeleiteten Peptiden entwickelt, in denen Peptide auf stabilen, nichtbiologischen Materialien, wie beispielsweise Polyethylenstäbchen oder lösungsmitteldurchlässigen Harzen, immobilisiert sind. Eine andere Bibliothek mit chemisch abgeleiteten Peptiden verwendet Photolithographie, um Peptide zu scannen, die auf Objektträgern immobilisiert sind. Hiernach werden diese und verwandte Verfahren zusammen als „Screening chemischer Peptide" bezeichnet. Das Screening chemischer Peptide kann dahingehend vorteilhaft sein, dass es die Verwendung von D-Aminosäuren und anderen unnatürlichen Analoga sowie von Nicht-Peptid-Elementen erlaubt. Sowohl biologische als auch chemische Verfahren sind in Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355–62, besprochen.
Konzeptionell kann man peptidnachahmende Verbindungen für ein jegliches Protein unter Verwendung von Phage Display und den anderen oben erwähnten Verfahren entdecken. Diese Verfahren wurden zum Kartieren von Epitopen, zum Identifizieren entscheidender Aminosäuren bei Protein-Protein-Wechselwirkungen und als Leitstrukturen für die Entdeckung neuer therapeutischer Agenzien verwendet. Z. B. Cortese et al. (1996), Curr. Opin. Biotech. 7: 616–21. Jetzt werden Peptidbibliotheken am häufigsten bei immunologischen Studien wie beispielsweise beim Epitopkartieren verwendet. Kreeger (1996), The Scientist 10(13): 19–20.

Von besonderem Interesse hier ist die Verwendung von Peptidbibliotheken und anderen Techniken bei der Entdeckung von pharmakologisch aktiven Peptiden. Eine Reihe solcher Peptide, die auf dem Gebiet identifiziert wurden, ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Peptide sind in den aufgeführten Veröffentlichungen beschrieben, von denen jede hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die pharmakologische Aktivität der Peptide ist beschrieben, und in vielen Fällen folgt ihr ein Kurzbegriff dafür in runden Klammern. Einige dieser Peptide wurden modifiziert (z. B. um C-terminal quervernetzte Dimere zu bilden). Typischerweise wurden Peptidbibliotheken auf die Bindung an einen Rezeptor für ein pharmakologisch aktives Protein gescreent (z. B. EPO-Rezeptor). In wenigstens einem Fall (CTLA4) wurde die Peptidbibliothek auf die Bindung an einen monoklonalen Antikörper gescreent. Tabelle 2 – Pharmakologisch aktive Peptide

Form des Peptides	Bindungspartner/interessierendes Proteine^a	Pharmakologische Aktivität	Literaturstelle
Intrapeptid-Disulfidverbunden	EPO-Rezeptor	EPO-nachahmend	Wrighton et al. (1996), Science 273: 458–63; US-Pat. Nr. 5,773,569 , erteilt am 30. Juni 1998 an Wrighton et al.
C-terminal quervernetztes Dimer	EPO-Rezeptor	EPO-nachahmend	Livnah et al. (1996), Science 273: 464–71; Wrighton et al. (1997), Nature Biotechnology 15: 1261–5; Internationale Patentanmeldung WO 96/40772, veröffentlicht am 19. Dez. 1996
linear	EPO-Rezeptor	EPO-nachahmend	Naranda et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Scie. USA 96: 7569–74
linear	c-MpI	TPO-nachahmend	Cwirla et al. (1997) Science 276: 1696–9; US-Pat. Nr. 5,869,451 , erteilt am 9. Febr. 1999; US-Pat. Nr. 5,932,946 , erteilt am 3. Aug. 1999
C-terminal quervernetztes Dimer	c-MpI	TPO-nachahmend	Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696–9
Disulfidvernetztes Dimer		Stimulierung von Hämatopoese („G-CSF-nachahmend")	Paukovits et al. (1984), Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 365: 303–11; Laerum et al. (1988), Exp. Hemat. 16: 274–80
Alkandiylgruppenvernetztes Dimer		G-CSF-nachahmend	Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814–9; Cuthbertson et al. (1997), J. Med. Chem. 40: 2876–82; King et al. (1991), Exp. Hematol. 19:481; King et al. (1995), Blond 86 (Anhang 1): 309a
linear	IL-1-Rezeptor	entzündliche und Autoimmunkrankheiten („IL-1-Antagonist” oder „IL-1ra-nachahmend")	US-Pat. Nr. 5,608,035 ; US-Pat. Nr. 5,786,331 ; US-Pat. Nr. 5,880,096 ; Yanofsky et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 93; 7381–6; Akeson et al. (1996), J. Biol. Chem. 271: 30517–23; Wiekzorek et al. (1997), Pol. J. Pharmacol. 49:107–17; Yanofsky (1996), PNAs, 93: 7381–7386.
linear	Facteur thymique serique (FTS)	Stimulation von Lymphozyten ("FTS-nachahmend")	Inagaki-Ohara et al. (1996), Cellular Immunol. 171: 30–40; Yoshida (1984), Int. J. Immunopharmacol. 6: 141–6.
Intrapeptid-Disulfidverbunden	CTLA4 MAb	CTLA4-nachahmend	Fukumoto et al. (1998), Nature Biotech. 16: 267–70
exozyklisch	TNF-α-Rezeptor	TNF-α-Antagonist	Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266–70; WO 98/53842 , veröffentlicht am 3. Dezember 1998
linear	TNF-α-Rezeptor	TNF-α-Antagonist	Chirinos-Rojas ( ), J. Imm., 5621–5626.
Intrapeptid-Disulfidverbunden	C3b	Inhibition von Komplementaktivierung; Autoimmunkrankheiten ("C3b-Antagonist")	Sahu et al. (1996), J. Immunol. 157: 884–91; Morikis et al. (1998), Protein Sci. 7: 619–27
linear	Vinculin	Zelladhäsionsvorgänge – Zellwachstum, Differenzierung, Wundheilung, Tumormetastase („Vinculin-Bindung")	Adey et al. (1997), Biochem. J. 324: 523–8
linear	C4-Bindungsprotein (C4BP)	anti-thrombotisch	Linse et al. (1997), J. Biol. Chem. 272: 14658–65
linear	Urokinase-Rezeptor	Vorgänge assoziiert mit Urokinase-Wechselwirkung mit ihrem Rezeptor (z. B. Angiogenese, Tumorzell-Invasion und Metastase); („UKR-Antagonist”)	Goodson et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7129–33; Internationale Anmeldung WO 97/35969 , veröffentlicht am 2. Oktober 1997
linear	Mdm2, Hdm2	Inhibition der Inaktivierung von p53 vermittelt durch Mdm2 oder hdm2; Gegen Tumor („Mdm/hdm-Antagonist")	Picksley et al. (1994), Oncogene 9: 2523–9; Bottger et al. (1997) J. Mol. Biol. 269: 744–56; Bottger et al. (1996), Oncogene 13: 2141–7
linear	p21^WAF1	Gegen Tumor durch Nachahmen der Aktivität von p21^WAF1	Ball et al. (1997), Curr. Biol. 7: 71–80
linear	Farnesyl-Transferase	Gegen Krebs durch Verhinderung der Aktivierung von Ras-Onkogen	Gibbs et al. (1994), Cell 77: 175–178
linear	Ras-Effektordomäne	Gegen Krebs durch Inhibieren der biologischen Funktion des Ras-Onkogens	Moodie et al. (1994) Trends Genet 10: 44–48, Rodriguez et al. (1994), Nature 370: 527–532
linear	SH2/SH3-Domänen	Gegen Krebs durch Inhibieren von Tumorwachstum mit aktivierten Tyrosinkinasen	Pawson et al. (1993), Curr. Biol. 3: 434–432 Yu et al. (1994), Cell 76: 933–945
linear	p16^INK4	Gegen Krebs durch Nachahmung der Aktivität von p16; z. B. Inhibieren von Cyclin D-Cdk-Komplex („p16-nachahmend")	Fåhraeus et al. (1996), Curr. Biol. 6: 84–91
linear	Src, Lyn	Inhibition der Mastzellenaktivierung, IgE-verwandte Bedingungen, Typ I-Hyperempfindlichkeit ("Mastzellantagonist")	Stauffer et al. (1997), Biochem. 36: 9388–94
linear	Mastzellprotease	Behandlung von entzündlichen Störungen vermittelt durch Freisetzung von Tryptase-6 („Mastzellen-Proteaseinhibitoren")	Internationale Anmeldung WO 98/33812 , veröffentlicht am 6. August 1998
linear	SH3-Domänen	Behandlung von SH3-vermittelten Krankheitszuständen („SH3-Antagonist")	Rickles et al. (1994), EMBO J. 13: 5598–5604; Sparks et al. (1994), J. Biol. Chem. 269: 23853–6; Sparks et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1540–4
linear	HBV-Kernantigen (HBcAg)	Behandlung von viralen HBV-Infektionen ("gegen-HBV")	Dyson & Muray (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 2194–8
linear	Selektine	Neutrophilen-Adhäsion; Entzündungserkrankungen ("Selektin-Antagonist")	Martens et al. (1995), J. Biol. Chem. 270: 21129–36; Europäische Patentanmeldung EP 0 714 912 , veröffentlicht am 5. Juni 1996
linear, zyklisiert	Calmodulin	Calmodulin-Antagonist	Pierce et al. (1995), Molec. Diversity 1: 259–65; Dedman et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 23025–30; Adey & Kay (1996), Gene 169: 133–4
linear, zyklisiert	Integrine	Tumor-Zielsuchen; Behandlung wegen Zuständen im Zusammenhang mit Integrinvermittelten zellulären Ereignissen, einschließlich Blutplättchenaggregation, Thrombose, Wundheilung, Osteoporose, Gewebereparatur, Angiogenese (z. B. zur Behandlung von Krebs), und Tumorinvasion („Integrin-Bindung")	Internationale Anmeldungen WO 95/14714 , veröffentlicht am 1. Juni 1995; WO 97/08203 , veröffentlicht am 6. März 1997; WO 98/10795 , veröffentlicht am 19. März 1998; WO 99/24462 , veröffentlicht am 20. Mai 1999; Kraft et al. (1999), J. Biol. Chem. 274: 1979–1985
zyklisch, linear	Fibronectin und Bestandteile der extrazellulären Matrix von T-Zellen und Makrophagen	Behandlung von Entzündungs- und Autoimmunzuständen	WO 98/09985 , veröffentlicht am 12. März 1998
linear	Somatostatin und Cortistatin	Behandlung oder Verhinderung von hormonproduzierenden Tumoren, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Magengeschwür, Tumorwachstum, Inhibition von Hormonsekretion, Modulierung von Schlaf- oder neuraler Aktivität	Europäische Patentanmeldung 0 911 393 , veröffentlicht am 28. April 1999
linear	bakterielles Lipopolysaccharid	Antibiotikum; septischer Schock; durch CAP37 modulierbare Störungen	US-Pat. Nr. 5,877,151 , erteilt am 2. März 1999
linear oder zyklisch, ein- schließlich D-Aminosäuren	Pardaxin, Mellitin	antipathogen	WO 97/31019 , veröffentlicht am 28. August 1997
linear, zyklisch	VIP	Impotenz, neurodegenerative Erkrankungen	WO 97/40070 , veröffentlicht am 30. Oktober 1997
linear	CTLs	Krebs	EP 0 770 624 , veröffentlicht am 2. Mai 1997
linear	THF-gamma2		Burnstein (1988), Biochem., 27: 4066–71
linear	Amylin		Cooper (1987), Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 8628–32.
linear	Adrenomedullin		Kitamura (1993), BBRC, 192: 553–60.
zyklisch, linear	VEGF	anti-angiogen; Krebs, rheumatoide Arthritis, diabetische Retinopathie, Psoriasis ("VEGF-Antagonist")	Fairbrother (1998), Biochem., 37: 17754–17764.
zyklisch	MMP	Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen; Tumor-Wachstum ("MMP-Inhibitor")	Koivunen (1999), Nature Biotech., 17: 768–774.
	HGH-Fragment		US-Pat. Nr. 5,869,452
	Echistatin	Inhibition der Blutplättchenaggregation	Gan (1988), J. Biol. Chem., 263: 19827–32.
linear	SLE-Autoantikörper	SLE	WO 96/30057 , veröffentlicht am 3. Oktober 1996
	GD1alpha	Suppression von Tumormetastase	Ishikawa et al. (1988), FEBS Lett. 441(1): 20–4
	Antiphospholipid-beta-2-Glycoprotein-1 (β2GPI)-Antikörper	Endotheliale Zellaktivierung, Antiphospholipidsyndrom (APS), thromboembolisches Phänomen, Thrombozytopenie und rekurrenter fötaler Verlust	Blank et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 5164–8
linear	T-Zell-Rezeptor-beta-Kette	Diabetes	WO 96/11214 , veröffentlicht am 18. April 1996

^aDas in dieser Spalte aufgeführte Protein kann durch das assoziierte Peptid gebunden werden (z. B. EPO-Rezeptor, IL-1-Rezeptor) oder durch das assoziierte Peptid nachgeahmt werden. Die für jedes Protein aufgeführten Literaturstellen klären, ob das Molekül durch die Peptide gebunden oder nachgeahmt wird.
^bFTS ist ein Thymushormon, das durch das Molekül dieser Erfindung nachgeahmt wird, statt dass ein Rezeptor durch das Molekül dieser Erfindung gebunden wird.

Durch das Screenen einer Peptidbibliothek identifizierte Peptide wurden als „Leitstrukturen" bei der Entwicklung von therapeutischen Agenzien und nicht als therapeutische Agenzien selbst betrachtet. Wie andere Proteine und Peptide würden sie in vivo entweder durch Nierenfiltration, zelluläre Klärungsmechanismen im reticuloendothelialen System oder durch proteolytischen Abbau schnell entfernt werden. Francis (1992), Focus an Growth Factors 3: 4–11.
Als Ergebnis verwendet die Technik die identifizierten Peptide gegenwärtig, um Wirkstoffziele zu validieren, oder als Gerüste für die Konzeption von organischen Verbindungen, die nicht so leicht oder schnell durch das Screenen einer chemischen Bibliothek identifiziert worden wären. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401–24; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370–8. Die Technik würde aus einem Verfahren Nutzen ziehen, durch das solche Peptide leichter therapeutische Agenzien ergeben könnten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, durch das die Halbwertszeit in vivo von einem oder mehr als einem biologisch aktiven Peptid durch die Fusion mit einem Vehikel erhöht wird. Bei dieser Erfindung werden pharmakologisch aktive Verbindungen durch ein Verfahren hergestellt, das das:

a) Selektieren wenigstens eines Peptides, das die Aktivität eines interessierenden Proteins moduliert; und das
b) Herstellen eines pharmakologischen Agens, das wenigstens ein Vehikel umfasst, welches kovalent mit wenigstens einer Aminosäuresequenz des selektierten Peptides verbunden ist,

Das bevorzugte Vehikel ist eine Fc-Domäne. Die in Schritt (a) gescreenten Peptide werden bevorzugterweise in einer Phage Display-Bibliothek exprimiert. Das Vehikel und das Peptid können über den N- oder C-Terminus des Peptides oder des Vehikels verbunden sein, wie unten weiter beschrieben ist. Derivate der obigen Verbindungen (unten beschrieben) sind von dieser Erfindung ebenfalls umfasst.
Die Verbindungen dieser Erfindung können durch synthetische Standardverfahren, rekombinante DNA-Techniken oder jegliche andere Verfahren zum Herstellen von Peptiden und Fusionsproteinen hergestellt werden. Verbindungen dieser Erfindung, die nicht-Peptidteile umfassen, können zusätzlich zu Standardreaktionen der Peptidchemie durch Standardreaktionen der organischen Chemie synthetisiert werden, wenn diese anwendbar sind.
Die primäre vorgesehene Verwendung ist die als therapeutische oder prophylaktische Agenzien. Das vehikelverbundene Peptid kann eine Aktivität aufweisen, die vergleichbar ist mit der – oder sogar noch größer ist als die – des natürlichen Liganden, der durch das Peptid nachgeahmt wird. Zusätzlich könnten bestimmte therapeutische Agenzien auf der Grundlage eines natürlichen Liganden Antikörper gegen einen eigenen endogenen Liganden des Patienten induzieren; das vehikelverbundene Peptid umgeht diese Falle durch das Aufweisen von wenig oder typischerweise gar keiner Sequenzidentität mit Hinblick auf den natürlichen Liganden.
Obwohl sie hauptsächlich als therapeutische Agenzien vorgesehen sind, können Verbindungen dieser Erfindung auch beim Screenen auf solche Agenzien nützlich sein. Z. B. könnte man ein Fc-Peptid (z. B. Fc-SH2-Domänenpeptid) in einem Test verwenden, der mit anti-Fc beschichtete Platten verwendet. Das Vehikel, insbesondere Fc, kann unlösliche Peptide löslich und somit für eine Anzahl von Tests nützlich machen.
Die Verbindungen dieser Erfindung können für therapeutische oder prophylaktische Zwecke durch das Formulieren von ihnen mit geeigneten pharmazeutischen Trägermaterialien und durch das Verabreichen einer wirksamen Menge an einen Patienten, wie beispielsweise einen Menschen (oder ein anderes Säugetier), der/das dies benötigt, verwendet werden. Andere verwandte Aspekte sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Es werden nach der Berücksichtigung der Figuren und der detaillierten Beschreibung der Erfindung zahlreiche zusätzliche Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung offenkundig werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine schematische Darstellung eines beispielhaften Verfahrens der Erfindung. Bei diesem bevorzugten Verfahren ist das Vehikel eine Fc-Domäne, die mit dem Peptid durch die Expression von einem DNA-Konstrukt kovalent verbunden ist, das sowohl für die Fc-Domäne als auch das Peptid codiert. Wie in 1 bemerkt ist, bilden die Fc-Domänen bei diesem Verfahren spontan ein Dimer.
2 zeigt beispielhafte Fc-Dimere, die von einem IgG1-Antikörper abgeleitet sein können. „Fc" steht in der Figur für eine jegliche der Fc-Varianten innerhalb der Bedeutung von „Fc-Domäne" hierin. „X¹" und „X²" stehen für Peptide oder Linker-Peptid-Kombinationen, wie hiernach definiert. Die spezifischen Dimere sind wie folgt:

A, D: Einzeln Disulfid-verbundene Dimere. IgG1-Antikörper weisen typischerweise zwei Disulfidbindungen an der Gelenkregion zwischen der konstanten und der variablen Domäne auf. Die Fc-Domäne in den 2A und 2D kann durch eine Verkürzung zwischen den beiden Stellen der Disulfidbindungen oder durch eine Substitution eines Cysteinylrestes durch einen umreaktiven Rest (z. B. Alanyl) ausgebildet werden. In 2A ist die Fc-Domäne am N-Terminus der Peptide verbunden; in 2D am C-Terminus.
B, E: Doppelt Disulfid-verbundene Dimere. Diese Fc-Domäne kann durch eine Verkürzung des elterlichen Antikörpers gebildet werden, um beide Cysteinylreste in den Fc- Domänenketten oder durch die Expression von einem Konstrukt beizubehalten, das eine für eine solche Fc-Domaine codierende Sequenz umfasst. In 2B ist die Fc-Domäne am N-Terminus der Peptide verbunden; in 2E am C-Terminus.
C, F: Nichtkovalente Dimere. Diese Fc-Domäne kann durch Beseitigung der Cysteinylreste entweder durch eine Verkürzung oder Substitution gebildet werden. Es besteht die Möglichkeit, dass man wünscht, die Cysteinylreste zu beseitigen, um Unreinheiten zu vermeiden, die durch die Reaktion des Cysteinylrestes mit Cysteinylresten von anderen in der Wirtszelle vorhandenen Proteinen gebildet werden. Die nichtkovalente Bindung der Fc-Domänen ist ausreichend, um das Dimer zusammenzuhalten.

Andere Dimere können unter Verwendung von Fc-Domänen gebildet werden, die von unterschiedlichen Arten von Antikörpern (z. B. IgG2, IgM) abgeleitet sind.
3 zeigt die Struktur von bevorzugten Verbindungen der Erfindung, die Tandemwiederholungen des pharmakologisch aktiven Peptides zeigen. 3A zeigt ein Einzelkettenmolekül und kann auch das DNA-Konstrukt für das Molekül darstellen. 3B zeigt ein Dimer, in dem der Linker-Peptid-Teil nur auf einer Kette des Dimers vorhanden ist. 3C zeigt ein Dimer, das den Peptidteil auf beiden Ketten aufweist. Das Dimer von 3C wird sich in bestimmen Wirtszellen nach der Expression eines DNA-Konstruktes, das für die in 3A gezeigte Einzelkette codiert, spontan bilden. Bei anderen Wirtszellen könnten die Zellen Bedingungen ausgesetzt werden, die die Bildung von Dimeren begünstigen, oder die Dimere können in vitro gebildet werden.
4 zeigt beispielhafte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 1 bzw. 2) von menschlichem IgG1-Fc, das für diese Erfindung verwendet werden kann.
5 zeigt ein synthetisches Schema (SEQ ID NOS: 1131–1134) für die Herstellung von PEGyliertem Peptid 19 (SEQ ID NO: 3).
6 zeigt ein synthetisches Schema (SEQ ID NOS: 1135–1136) für die Herstellung von PEGyliertem Peptid 20 (SEQ ID NO: 4).
7 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 5 bzw. 6) des in Beispiel 2 hiernach als „Fc-TMP" identifizierten Moleküls.
8 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 7 bzw. 8) des in Beispiel 2 hiernach als „Fc-TMP-TMP" identifizierten Moleküls.
9 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 9 bzw. 10) des in Beispiel 2 hiernach als „TMP-TMP-Fc" identifizierten Moleküls.
10 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 11 bzw. 12) des in Beispiel 2 hiernach als „TMP-Fc" identifizierten Moleküls.
11 zeigt die Anzahl von Blutplättchen, die in vivo in normalen weiblichen BDF1-Mäusen erzeugt wurden, die mit einer 100 μg/kg-Bolusinjektion von verschiedenen Verbindungen behandelt wurden, wobei die Begriffe wie folgt definiert sind.

PEG-MGDF:: PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20 kD, durch reduktive Aminierung an der N-terminalen Aminogruppe der Aminosäuren 1–163 von nativem menschlichem TPO befestigt, das in E. coli exprimiert wird (so dass es nicht glykosyliert ist).
TMP:: das TPO-nachahmende Peptid, das die Aminosäuresequenz IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 13) aufweist;
TMP-TMP:: das TPO-nachahmende Peptid, das die Aminosäuresequenz IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 14) aufweist;
PEG-TMP-TMP:: das Peptid von SEQ ID NO: 14, wobei die PEG-Gruppe ein PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5 kD ist, das wie in 6 gezeigt befestigt ist;
Fc-TMP-TMP:: die Verbindung von SEQ ID NO: 8 (8), dimerisiert mit einem identischen zweiten Monomer (d. h. die Cys-Reste 7 und 10 sind an die entsprechen den Cys-Reste im zweiten Monomer gebunden, um ein Dimer zu bilden, wie in 2 gezeigt ist); und
TMP-TMP-Fc: ist die Verbindung von SEQ ID NO: 10 (9), die auf die gleiche Weise wie TMP-TMP-Fc dimerisiert ist, abgesehen davon, dass die Fc-Domäne an dem C-terminalen Ende und nicht an dem N-terminalen Ende des TMP-TMP-Peptides befestigt ist.

12 zeigt die Anzahl der Blutplättchen, die in vivo in normalen BDF1-Mäusen erzeugt wurden, die mit verschiedenen, über implantierte osmotische Pumpen über eine Zeitspanne von 7 Tagen gelieferten Verbindungen behandelt wurden. Die Verbindungen sind wie für 7 definiert.
13 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 15 bzw. 16) des in Beispiel 3 hiernach als „Fc-EMP" identifizierten Moleküls.
14 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 17 bzw. 18) des in Beispiel 3 hiernach als „EMP-Fc" identifizierten Moleküls.
15 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 19 bzw. 20) des in Beispiel 3 hiernach als „EMP-EMP-Fc" identifizierten Moleküls.
16 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 21 bzw. 22) des in Beispiel 3 hiernach als „Fc-EMP-EMP" identifizierten Moleküls.
Die 17A und 17B zeigen die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 23), die in pCFM1656 zwischen den sonst nicht vorkommenden AatII (Position #4364 in pCFM1656)- und SacII(Position #4585 in pCFM1656)-Restriktionsschnittstellen eingefügt ist, um das Expressionsplasmid pAMG21 (ATCC-Zugangsnummer 98113) zu bilden.
18A zeigt das Hämoglobin, die roten Blutzellen und den Hämatokrit, die in vivo in normalen weiblichen BDF1-Mäusen erzeugt wurden, die mit einer 100 μg/kg-Bolusinjektion von verschiedenen Verbindungen behandelt wurden. 18B zeigt die gleichen Ergebnisse mit Mäusen, welche mit 100 μg/kg pro Tag behandelt wurden, die durch eine mikroosmoti sche 7-Tage-Pumpe abgegeben wurden, wobei die EMPs bei 100 μg/kg abgegeben wurden und rhEPO bei 30 U/Maus. (Bei beiden Experimenten wurden die Neutrophilen, Lymphozyten und Blutplättchen nicht beeinflusst.) In diesen Figuren sind die Begriffe wie folgt definiert.

Fc-EMP:: die Verbindung von SEQ ID NO: 16 (13), die mit einem identischen zweiten Monomer dimerisiert ist (d. h. die Cys-Reste 7 und 10 sind an die entsprechenden Cys-Reste in dem zweiten Monomer gebunden, um ein Dimer zu bilden, wie in 2 gezeigt ist);
EMP-Fc:: die Verbindung von SEQ ID NO: 18 (14), die auf die gleiche Weise wie Fc-EMP dimerisiert ist, abgesehen davon, dass die Fc-Domäne am C-terminalen Ende und nicht am N-terminalen Ende des EMP-Peptides befestigt ist.
„EMP-EMP-Fc": bedeutet eine Tandemwiederholung des gleichen Peptides (SEQ ID NO: 20), das über den C-Terminus der Peptide an der gleichen Fc-Domäne befestigt ist. „Fc-EMP-EMP" bedeutet die gleiche Tandemwiederholung des Peptides, aber mit der gleichen Fc-Domäne am N-Terminus der Tandemwiederholung befestigt. Alle Moleküle werden in E. coli exprimiert und sind daher nicht glykosyliert.

Die 19A und 19B zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 1055 und 1056) des Fc-TNF-α-Inhibitor-Fusionsmoleküls, das in Beispiel 4 hiernach beschrieben ist.
Die 20A und 20B zeigen die Nuldeotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 1057 und 1058) des TNF-α-Inhibitor-Fusionsmoleküls, das in Beispiel 4 hiernach beschrieben ist.
Die 21A und 21B zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 1059 und 1060) des Fc-IL-1-Antagonist-Fusionsmoleküls, das in Beispiel 5 hiernach beschrieben ist.
Die 22A und 22B zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 1061 und 1062) des IL-1-Antagonist-Fc-Fusionsmoleküls, das in Beispiel 5 hiernach beschrieben ist.
Die 23A, 23B und 23C zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 1063 und 1064) des Fc-VEGF-Antagonist-Fusionsmoleküls, das in Beispiel 6 hiernach beschrieben ist.
Die 24A und 24B zeigen die Nuldeotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 1065 und 1066) des VEGF-Antagonist-Fc-Fusionsmoleküls, das in Beispiel 6 hiernach beschrieben ist.
Die 25A und 25B zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 1067 und 1068) des Fc-MMP-Inhibitor-Fusionsmoleküls, das in Beispiel 7 hiernach beschrieben ist.
Die 26A und 26B zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 1069 und 1070) des MMP-Inhibitor-Fc-Fusionsmoleküls, das in Beispiel 7 hiernach beschrieben ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definition von Begriffen
Die in dieser Beschreibung durchgehend verwendeten Begriffe sind wie folgt definiert, wenn sie nicht in spezifischen Fällen in anderer Weise begrenzt sind.
Der Begriff „umfassend" bedeutet, dass eine Verbindung zusätzliche Aminosäuren an einem jeden der oder an beiden der N- oder C-Termini der gegebenen Sequenz umfassen kann. Natürlich sollten diese zusätzlichen Aminosäuren die Aktivität der Verbindung nicht erheblich stören.
Der Begriff „Vehikel" bedeutet ein Molekül, das den Abbau eines therapeutischen Proteins verhindert und/oder seine Halbwertszeit erhöht, seine Toxizität verringert, seine Immunogenität verringert oder seine biologische Aktivität erhöht. Beispielhafte Vehikel umfassen eine Fc-Domäne (die bevorzugt ist) genauso wie ein lineares Polymer (z. B. Polyethylenglycol (PEG), Polylysin, Dextran etc.); ein Polymer mit verzweigter Kette (siehe z. B. US-Patent Nr. 4,289,872 an Denkenwalter et al., erteilt am 15. September 1981; 5,229,490 an Tam, erteilt am 20. Juli 1993; WO 93/21259 an Frechet et al., veröffentlicht am 28. Oktober 1993); ein Lipid; eine Cholesterolgruppe (wie beispielsweise ein Steroid); ein Kohlenhydrat oder Oligosaccharid; oder ein jegliches natürliches oder synthetisches Protein, Polypeptid oder Peptid, das an einen Rettungsrezeptor bindet. Vehikel sind hiernach weiter beschrieben.
Der Begriff „natives Fc" bedeutet ein Molekül oder eine Sequenz, die die Sequenz eines nicht-Antigen-bindenden Fragmentes umfasst, das das Ergebnis des Verdaus eines ganzen Antikörpers ist, unabhängig davon, ob in monomerer oder multimerer Form. Die ursprüngliche Immunglobulinquelle des nativen Fcs ist bevorzugterweise von menschlichem Ursprung und kann ein jegliches der Immunglobuline sein, obwohl IgG1 und IgG2 bevorzugt sind. Native Fcs bestehen aus monomeren Polypeptiden, die durch kovalente (d. h. Disulfidbindungen) und nichtkovalente Verbindung zu dimeren oder multimeren Formen verbunden sein können. Die Anzahl der intermolekularen Disulfidbrücken zwischen monomeren Untereinheiten von nativen Fc-Molekülen reicht in Abhängigkeit von der Klasse (z. B. IgG, IgA, IgE) oder Unterklasse (z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2) von 1 bis 4. Ein Beispiel für eine native Fc ist ein Disulfid-verbundenes Dimer, das das Ergebnis eines Papainverdaus eines IgG ist (siehe Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071–9). Der Begriff „native Fc", wie hierin verwendet, ist für die monomeren, dimeren und multimeren Formen generisch.
Der Begriff „Fc-Variante" bedeutet ein Molekül oder eine Sequenz, die ausgehend von einem nativen Fc modifiziert ist, aber immer noch eine Bindungsstelle für den Rettungsrezeptor, FcRn, umfasst. Die internationalen Anmeldungen WO 97/34631 (veröffentlicht am 25. September 1997) und WO 96/32478 beschreiben beispielhafte Fc-Varianten, genauso wie die Wechselwirkung mit dem Rettungsrezeptor, und sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen. Somit umfasst der Begriff „Fc-Variante" ein Molekül oder eine Sequenz, die von einem nicht-menschlichen nativen Fc ausgehend humanisiert ist. Weiterhin umfasst eine native Fc Stellen, die entfernt werden können, weil sie strukturelle Merkmale oder eine biologische Aktivität bereitstellen, die für die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung nicht benötigt werden. Somit umfasst der Begriff „Fc-Variante" ein Molekül oder eine Sequenz, dem/der ein(e) oder mehr als ein(e) Fc-Stelle oder -Rest fehlt, die/der (1) eine Disulfidbindungsbildung, (2) eine Inkompatibilität mit einer ausgewählten Wirtszelle, (3) eine N-terminale Heterogenität nach der Expression in einer ausgewählten Wirtszelle, (4) eine Glycosylierung, (5) eine Wechselwirkung mit dem Komplement, (6) eine Bindung an einen Fc-Rezeptor, der nicht ein Rettungsrezeptor ist, oder (7) eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) beeinflusst oder umfasst. Fc-Varianten sind hiernach detaillierter beschrieben.
Der Begriff „Fc-Domäne" umfasst native Fc- und Fc-Varianten-Moleküle und -sequenzen, wie oben definiert. Wie bei Fc-Varianten und nativen Fcs umfasst der Begriff „Fc-Domäne" Moleküle in monomerer oder multimerer Form, unabhängig davon, ob sie durch den Verdau eines ganzen Antikörpers oder mit anderen Mitteln hergestellt sind.
Der Begriff „Multimer" bedeutet, wenn er auf Fc-Domänen oder Fc-Domänen umfassende Moleküle angewendet wird, Moleküle, die zwei oder mehr Polypeptidketten aufweisen, die kovalent, nichtkovalent oder sowohl durch kovalente als auch nichtkovalente Wechselwirkungen verbunden sind. IgG-Moleküle bilden typischerweise Dimere; IgM-Moleküle Pentamere; IgD-Moleküle Dimere; und IgA-Moleküle Monomere, Dimere, Trimere oder Tetramere. Multimere können sich durch das Ausnutzen der Sequenz und der sich daraus ergebenden Aktivität der nativen Ig-Quelle des Fcs oder durch das Derivatisieren (wie unten definiert) eines solchen Fcs gebildet werden.
Der Begriff „Dimer" bedeutet, wenn er auf Fc-Domänen oder Fc-Domänen umfassende Moleküle angewendet wird, Moleküle, die zwei Polypeptidketten aufweisen, die kovalent oder nichtkovalent verbunden sind. Somit sind beispielhafte Dimere innerhalb des Umfangs der Erfindung wie in 2 gezeigt.
Die Begriffe „Derivatisieren" und „Derivat" oder „derivatisiert" umfassen Verfahren bzw. sich daraus ergebende Verbindungen, bei denen (1) die Verbindung einen zyklischen Teil aufweist; z. B. eine Quervernetzung zwischen Cysteinylresten innerhalb der Verbindung; (2) die Verbindung quervernetzt ist oder eine Quervernetzungsstelle aufweist; z. B. weist die Verbindung einen Cysteinylrest auf und bildet somit in Kultur oder in vivo quervernetzte Dimere; (3) eine oder mehr als eine Peptidylverbindung durch eine nicht-Peptidylverbindung ersetzt ist; (4) der N-Terminus durch -NRR¹, NRC(O)R¹, -NRC(O)OR¹, -NRS(O)₂R¹, -NHC(O)NHR, eine Succinimidgruppe oder substituiertes oder nichtsubstituiertes Benzyloxycarbonyl-NH- ersetzt ist, wobei R und R¹ und die Ring-Substituenten wie hiernach definiert sind; (5) der C-Terminus durch -C(O)R² oder –NR³R⁴ ersetzt ist, wobei R², R³ und R⁴ wie hiernach definiert sind; und (6) Verbindungen, bei denen individuelle Aminosäureteile durch die Behandlung mit Agenzien modifiziert sind, die in der Lage sind, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren. Derivative sind hiernach weiter beschrieben.
Der Begriff „Peptid" bedeutet Moleküle von 2 bis 40 Aminosäuren, wobei Moleküle von 3 bis 20 Aminosäuren bevorzugt und diejenigen von 6 bis 15 Aminosäuren am bevorzugtesten sind. Beispielhafte Peptide können durch ein jegliches der oben zitierten Verfahren zufällig erzeugt wird, in einer Peptidbibliothek (z. B. einer Phage Display-Bibliothek) mitgeführt sein oder aus einem Verdau von Proteinen stammen.
Der Begriff „randomisiert", wie er verwendet wird, um Bezug auf Peptidsequenzen zu nehmen, bedeutet vollständig zufällige Sequenzen (z. B. durch Phage Display-Verfahren selektiert) und Sequenzen, bei denen ein oder mehr als ein Rest eines natürlich vorkommenden Moleküls durch einen Aminosäurerest ersetzt ist, der in dieser Position nicht in dem natürlich vorkommenden Molekül auftritt. Beispielhafte Verfahren zum Identifizieren von Peptidsequenzen umfassen Phage Display, E. coli-Display, Ribosomen-Display, RNA-Peptid-Screenen, chemisches Screenen und dergleichen.
Der Begriff „pharmakologisch aktiv" bedeutet, dass von einer derart beschriebenen Substanz festgestellt wird, dass sie eine Aktivität aufweist, die einen medizinischen Parameter (z. B. Blutdruck, Blutzellenzahl, Cholesterinkonzentration) oder Krankheitszustand (z. B. Krebs, Autoimmunstörungen) beeinflusst. Somit umfassen pharmakologisch aktive Peptide agonistische oder nachahmende und antagonistische Peptide, wie sie unten definiert sind.
Die Begriffe „-nachahmendes Peptid" und „-Agonist-Peptid" bedeuten ein Peptid, das eine biologische Aktivität aufweist, die mit einem Protein (z. B. EPO, TPO, G-CSF) vergleichbar ist, das mit einem interessierenden Protein wechselwirkt. Diese Begriffe umfassen weiterhin Peptide, die die Aktivität eines interessierenden Proteins indirekt nachahmen, wie beispielsweise durch das Verstärken der Wirkungen des natürlichen Liganden des interessierenden Proteins; siehe z. B. die in den Tabellen 2 und 7 aufgeführten G-CSF-nachahmenden Peptide. Somit umfasst der Begriff „EPO-nachahmendes Peptid" jegliche Peptide, die, wie in Wrighton et al. (1996), Science 273: 458–63, Naranda et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7569–74, oder wie in einer jeglichen anderen Literaturstelle, die in Tabelle 2 als einen EPO-nachahmenden Gegenstand aufweisend identifiziert ist, beschrieben, identifiziert oder abgeleitet sein können. Fachleute auf dem Gebiet erkennen an, dass man durch jede dieser Litera turstellen in die Lage versetzt wird, andere Peptide als die tatsächlich darin offenbarten durch das Befolgen der offenbarten Prozeduren mit unterschiedlichen Peptidbibliotheken zu selektieren.
Der Begriff „TPO-nachahmendes Peptid" umfasst Peptide, die, wie in Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696–9; US-Pat. Nrn. 6,869,451 und 5,932,946 und einer jeglichen anderen Literaturstelle, die in Tabelle 2 als TPO-nachahmenden Gegenstand aufweisend identifiziert ist, genauso wie in der US-Patentanmeldung „Thrombopoietic Compounds", die am gleichen Tag hiermit eingereicht wurde und hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist, beschrieben, identifiziert oder abgeleitet sein können. Fachleute auf dem Gebiet erkennen an, dass man durch eine jegliche dieser Literaturstellen in die Lage versetzt wird, andere Peptide als die tatsächlich darin offenbarten durch das Befolgen der offenbarten Prozeduren mit unterschiedlichen Peptidbibliotheken zu selektieren.
Der Begriff „G-CSF-nachahmendes Peptid" umfasst jegliche Peptide, die in Paukovits et al. (1984), Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 365: 303–11 oder einer jeglichen Literaturstelle, die in Tabelle 2 als einen G-CSF-nachahmenden Gegenstand aufweisend identifiziert ist, identifiziert oder beschrieben sein können. Fachleute auf dem Gebiet erkennen an, dass man durch eine jegliche dieser Literaturstellen in die Lage versetzt wird, andere Peptide als die tatsächlich darin offenbarten durch das Befolgen der offenbarten Prozeduren mit unterschiedlichen Peptidbibliotheken zu selektieren.
Der Begriff „CTLA4-nachahmendes Peptid" umfasst jegliche Peptide, die, wie in Fukomoto et al. (1998), Nature Biotech. 16: 267–70 beschrieben, identifiziert oder abgeleitet sein können. Fachleute auf dem Gebiet erkennen an, dass man durch eine jegliche dieser Literaturstellen in die Lage versetzt wird, andere Peptide als die tatsächlich darin offenbarten durch das Befolgen der offenbarten Prozeduren mit unterschiedlichen Peptidbibliotheken zu selektieren.
Der Begriff „-Antagonist-Peptid" oder „Inhibitor-Peptid" bedeutet ein Peptid, das die biologische Aktivität des interessierenden, assoziierten Proteins blockiert oder in irgendeiner Weise stört, oder eine biologische Aktivität aufweist, die mit der eines bekannten Antagonisten oder Inhibitors des interessierenden, assoziierten Proteins vergleichbar ist. Somit kann der Begriff „TNF-Antagonist-Peptid" Peptide umfassen, die, wie in Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266–70 oder in einer jeglichen der Literaturstellen, die in Tabelle 2 als TNF- Antagonist-Gegenstand aufweisend identifiziert ist, beschrieben, identifiziert und abgeleitet sein können. Fachleute auf dem Gebiet erkennen an, dass man durch eine jegliche dieser Literaturstellen in die Lage versetzt wird, andere Peptide als die tatsächlich darin offenbarten durch das Befolgen der offenbarten Prozeduren mit unterschiedlichen Peptidbibliotheken zu selektieren.
Die Begriffe „IL-1-Antagonist" und „IL-1ra-nachahmendes Peptid" umfassen Peptide, die die Aktivierung des IL-1-Rezeptors durch IL-1 inhibieren oder herunterregulieren. Die IL-1-Rezeptoraktivierung ist das Ergebnis der Bildung eines Komplexes von IL-1, dem IL-1-Rezeptor und dem IL-1-Rezeptor-Hilfsprotein. Der IL-1-Antagonist oder IL-1ra-nachahmende Peptide binden an IL-1, den IL-1-Rezeptor oder das IL-1-Rezeptor-Hilfsprotein und behindern die Komplexbildung von jeglichen zwei oder drei Bestandteilen des Komplexes. Beispielhafte IL-1-Antagonist- oder IL-1ra-nachahmende Peptide können, wie in den US-Patenten Nrn. 5,608,035 , 5,786,331 , 5,880,096 oder in einer jeglichen der Literaturstellen, die in Tabelle 2 als IL-1ra-nachahmenden oder IL-1-Antagonist-Gegenstand aufweisend identifiziert ist, beschrieben, identifiziert oder abgeleitet sein. Fachleute auf dem Gebiet erkennen an, dass man durch jede dieser Literaturstellen in die Lage versetzt wird, andere Peptide als die tatsächlich darin offenbarten durch das Befolgen der offenbarten Prozeduren mit unterschiedlichen Peptidbibliotheken zu selektieren.
Der Begriff „VEGF-Antagonist-Peptid" umfasst Peptide, die, wie in Fairbrother (1998), Biochem. 37: 17754–64 und in einer jeglichen der Literaturstellen, die in Tabelle 2 als VEGF-antagonistischen Gegenstand aufweisend identifiziert ist, beschrieben, identifiziert oder abgeleitet sein können. Fachleute auf dem Gebiet erkennen an, dass man durch jede dieser Literaturstellen in die Lage versetzt wird, andere Peptide als die tatsächlich darin offenbarten durch das Befolgen der offenbarten Prozeduren mit unterschiedlichen Peptidbibliotheken zu selektieren.
Der Begriff „MMP-Inhibitor-Peptid" umfasst Peptide, die, wie in Koivunen (1999), Nature Biotech, 17: 768–74 und in einer jeglichen der Literaturstellen, die in Tabelle 2 als MMP-inhibitorischen Gegenstand aufweisend identifiziert ist, beschrieben, identifiziert oder abgeleitet sein können. Fachleute auf dem Gebiet erkennen an, dass man durch jede der Literaturstellen in die Lage versetzt wird, andere Peptide als die tatsächlich darin offenbarten durch das Befolgen der offenbarten Prozeduren mit anderen Peptidbibliotheken zu selektieren.
Zusätzlich sind physiologisch akzeptable Salze der Verbindungen dieser Erfindung hierin ebenfalls umfasst. Mit „physiologisch akzeptable Salze" sind jegliche Salze gemeint, von denen bekannt ist oder von denen später entdeckt wird, dass sie pharmazeutisch akzeptabel sind. Einige spezifische Beispiele sind: Acetat; Trifluoracetat; Hydrogenhalogenide, wie beispielsweise Hydrochlorid und Hydrobromid; Sulfat; Citrat; Tartrat; Glycolat und Oxalat.
Struktur von Verbindungen
Im Allgemeinen. In den Stoffzusammensetzungen, die gemäß dieser Erfindung hergestellt werden, kann das Peptid an das Vehikel über den N-Terminus oder C-Terminus des Peptides befestigt sein. Somit können die Vehikel-Peptid-Moleküle dieser Erfindung durch die folgende Formel I beschrieben werden: (X1)_a-F¹-(X²)_b Iwobei:
F¹ ein Vehikel (bevorzugterweise eine Fc-Domäne) ist;
X¹ und X² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus -(L¹)_c-P¹, -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P², -(L¹)_cP¹-(L²)_d-P²-(L³)e-P³ und -(L¹)_eP¹-(L²)_d-P²-(L³)_eP³-(L⁴)_f-P⁴
P¹, P², P³ und P⁴ jeweils unabhängig Sequenzen pharmakologisch aktiver Peptide sind;
L¹, L², L³ und L⁴ jeweils unabhängige Linker sind; und
a, b, c, d, e und f jeweils unabhängig 0 oder 1 sind, mit der Maßgabe, dass wenigstens a oder b 1 ist.
Somit umfasst Verbindung I bevorzugte Verbindungen der Formeln X¹-F¹ IIund Multimere davon, wobei F¹ eine Fc-Domäne und am C-Terminus von X¹ befestigt ist; F¹-X² IIIund Multimere davon, wobei F¹ eine Fc-Domäne und am N-Terminus von X² befestigt ist; F¹-(L¹)_c-P¹ IVund Multimere davon, wobei F¹ eine Fc-Domäne und am N-Terminus von -(L¹)_c-P¹, befestigt ist; und F¹-(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P² Vund Multimere davon, wobei F¹ eine Fc-Domäne und am N-Terminus von -L¹-P¹-L²-P² befestigt ist;
Peptide. Eine jegliche Anzahl von Peptiden kann zusammen mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Von besonderem Interesse sind Peptide, die die Aktivität von EPO, TPO, Wachstumshormon, G-CSF, GM-CSF, IL-1ra, Leptin, CTLA4, TRAIL, TGF-α und TGF-β nachahmen. Peptidantagonisten sind ebenfalls von Interesse, insbesondere diejenigen, die hinsichtlich der Aktivität von TNF, Leptin, einem jeglichen der Interleukine (IL-1, 2, 3, ...) und Proteinen, die an der Komplementaktivierung beteiligt sind (z. B. C3b) antagonistisch sind. Targetierende Peptide sind ebenfalls von Interesse und umfassen Tumor-zielsuchende Peptide, Membran-Transport-Peptide und dergleichen. All diese Klassen von Peptiden können durch Verfahren entdeckt werden, die in den in dieser Beschreibung zitierten und in anderen Literaturstellen beschrieben sind.
Insbesondere Phage Display ist zum Erzeugen von Peptiden zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung nützlich. Es wurde festgestellt, dass eine Affinitätsselektion aus Bibliothe ken mit zufälligen Peptiden verwendet werden kann, um Peptidliganden zu einer jeglichen Stelle eines jeglichen Genproduktes zu identifizieren. Dedman et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 23025–30. Der Phage Display ist besonders gut zum Identifizieren von Peptiden geeignet, die an solche interessierenden Proteine wie Zelloberflächenrezeptoren oder jegliche Proteine binden, die lineare Epitope aufweisen. Wilson et al. (1998), Can. J. Microbiol. 44: 313–29; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370–8. Ein umfangreicher Überblick über solche Proteine ist in Herz et al. (1997), J. Receptor & Signal Transduction Res. 17(5): 671–776 zu finden, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Solche interessierenden Proteine sind für die Verwendung bei dieser Erfindung bevorzugt.

Eine besonders bevorzugte Gruppe von Peptiden sind diejenigen, die an Zytokinrezeptoren binden. Zytokine wurden kürzlich gemäß ihrem Rezeptorcode klassifiziert. Siehe Inglot (1997), Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 45: 353–7, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Unter diesen Rezeptoren sind CKRs (Familie I in Tabelle 3) besonders bevorzugt. Die Rezeptorklassifikation ist in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 – Nach Rezeptorcode klassifizierte Zytokinrezeptoren

Zytokine (Liganden)		Rezeptortyp
Familie	Subfamilie	Familie	Subfamilie
I. Hämatopoetische Zytokine	1. IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15	I. Zytokin R (CKR)	1. geteilter γCr
	2. IL-3, IL-5, GM-CSF		2. geteilter GP 140 βR
	3. IL-6, IL-11, IL-12, LIF, OSM, CNTF, Leptin (OB)		3. 3. geteilter RP 130
	4. G-CSF, EPO, TPO, PRL, GH		4. "Einzelketten"-R
	5. IL-17, HVS-IL-17		5. anderer R^c
II. IL-10-Liganden	IL-10, BCRF-1, HSV-IL-10	II. IL-10 R
III. Interferone	1. IFN-αI, α2, α4, m, t, IFN-β^d	III. Interferon R	1. IFNAR
IV. IL-1-Liganden	2. IFN-γ	III. Interferon R	2. IFNGR
IV. IL-1-Liganden	1. IL-1α, IL-1β, IL-1Ra	IV. IL-1R
V. TNF-Liganden	1. TNF-α, TNF-β (LT), FAS1, CD40 L, CD30L, CD27 L	V. NGF/TNF R^e
VI. Chemokine	1. A-Chemokine: IL-8, GRO α, β, γ, IF-10, PF-4, SDF-1	VI. Chemokin-R	1. CXCR
	2. β-Chemokine: MIP1α, MIP1β, MCP-1,2,3,4, RANTES, Eotaxin		2. CCR
	3. γ-Chemokine: Lymphotactin		3. CR
	3. γ-Chemokine: Lymphotactin		4. DARC^f
VII. Wachstumsfaktoren	1.1 SCF, M-CSF, PDGF-AA, AB, BB, FLT-3L, VEGF, SSV-PDGF	VII. RKF	1. TK-Subfamilie
	1.1 SCF, M-CSF, PDGF-AA, AB, BB, FLT-3L, VEGF, SSV-PDGF		1.1 IgTK III R
	1.2 FGFα, FGFβ		1.2 IgTK IV R
	1.3 EGF, TGF-α, VV-F19 (EGF-artig)		1.3 Cystein-reiches TK-I
	1.4 IGF-I, IGF-II, Insulin		1.4 Cystein-reiches TK II
	1.5 NGF, BDNF, NT-3, NT-4^g		1.5 Cystein-Knoten-TK V
	2. TGF-β1, β2, β3		2. STK-Subfamilie^h

^cIL-17R gehört zur CKR-Familie, wurde aber keiner der 4 angegebenen Subfamilien zugeordnet.
^dAndere IFN-Typ I-Subtypen bleiben unzugeordnet. Hämatopoetische Zytokine, IL-10-Liganden und Interferone besitzen keine funktionellen intrinsischen Proteinkinasen. Die Signalmoleküle für die Zytokine sind JAK's, STATs und verwandte Nicht-Rezeptor-Moleküle. IL-14, IL-16 und IL-18 wurden kloniert, bleiben aber gemäß dem Rezeptorcode unzugeordnet.
^eTNF-Rezeptoren verwenden mehrfache, unterschiedliche intrazelluläre Moleküle zur Signaltransduktion, die die „Death Domain" von FAS-R und den 55 kDa-TNF-αR umfassen, und an ihren zytotoxischen Wirkungen beteiligt sind. NGF/TNF-R kann sowohl an NGF als auch an verwandte Faktoren genau so wie an TNF-Liganden binden. Die Chemokinrezeptoren sind G-Protein-gekoppelte, Sieben-Transmembran(7TM, Serpentin)-Domänenrezeptoren.
^fDas Duffy-Blutgruppen-Antigen (DARC) ist ein Erythrozytenrezeptor, der an mehrere unterschiedliche Chemokine binden kann. Es gehört zur Immunglobulin-Superfamilie, aber die Charakteristika seiner Signaltransduktionsereignisse bleiben unklar.
^gDie neurotrophischen Zytokine können auch mit NGF/TNF-Rezeptoren assoziieren.
^hSTKS kann viele andere TGF-β-verwandte Faktoren umfassen, die unzugeordnet bleiben. Die Proteinkinasen sind ein intrinsischer Teil der intrazellulären Domäne der Rezeptorkinase-Familie (RKF). Die Enzyme sind über die Rezeptoren an der Signaltransmission beteiligt.

Für diese Erfindung beispielhafte Peptide erscheinen in den Tabellen 4 bis 20 unten. Diese Peptide können durch Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet offenbart sind. Es werden die Einzelbuchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren verwendet. Das X in diesen Sequenzen (und durchgehend in dieser Beschreibung, wenn es nicht in einem besonderen Fall anders spezifiziert ist) bedeutet, dass ein jeglicher der 20 natürlich vorkommenden Aminosäurereste vorhanden sein kann. Jegliche dieser Peptide können als Tandem (d. h. sequenziell) mit oder ohne Linker verbunden sein, und einige Tandem-verbundene Beispiele sind in der Tabelle bereitgestellt. Linker sind als „A" aufgeführt und können jegliche der hierin beschriebenen Linker sein. Tandem-Wiederholungen und Linker sind der Klarheit wegen durch Gedankenstriche getrennt gezeigt. Ein jegliches Peptid, das einen Cysteinylrest enthält, kann mit einem anderen Cys-haltigen Peptid quervernetzt sein, entweder eines oder beide von ihnen können mit einem Vehikel verbunden sein. Einige quervernetzte Beispiele sind in der Tabelle bereitgestellt. Ein jegliches Peptid, das mehr als einen Cys-Rest aufweist, kann auch eine Intrapeptid-Disulfidbindung ausbilden; siehe z. B. die EPO-nachahmenden Peptide in Tabelle 5. Einige Beispiele für Intrapeptid-Disulfid-verbundene Peptide sind in der Tabelle spezifiziert. Jegliche dieser Peptide können wie hierin beschrieben derivatisiert sein, und einige derivatisierte Beispiele sind in der Tabelle bereitgestellt. Die derivatisierten Peptide in den Tabellen sind beispielhaft und nicht limitierend, da die damit verbundenen underivatisierten Peptide bei dieser Erfindung ebenfalls verwendet werden können. Bei Derivaten, bei denen der C-Terminus mit einer Aminogruppe-Kappe versehen sein kann, ist die als Kappe dienende Aminogruppe als -NH₂ gezeigt. Bei Derivaten, bei denen Aminosäurereste durch andere Teile als Aminosäurereste substitutiert sind, sind die Substitutionen durch σ angezeigt, das jegliche der in Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814–9 und Cuthbertson et al. (1997), J. Med. Chem. 40: 2876–82, die durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschriebenen Teile bezeichnet. Der J-Substituent und die Z-Substituenten (Z₅, Z₆, ... Z₄₀) sind wie in den US-Patenten Nrn. 5,608,035 , 5,786,331 und 5,880,096 definiert, die durch Bezugnahme aufgenommen sind. Bei den EPO-nachahmenden Sequenzen (Tabelle 5) sind die Substituenten X₂ bis X₁₂ und die ganze Zahl „n" wie in WO 96/40772 definiert, die durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die Substituenten „Ψ", „Θ" und „+" sind wie in Sparks et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1540–4 definiert, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. X₄, X₅, X₆ und X₇ sind wie in der US-Patentameldung Nr. 5,773,569 definiert, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist, abgesehen von Folgendem: für Integrin-bindende Peptide sind X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇ und X₈ wie in den internationalen Anmeldungen WO 95/14714 , veröffentlicht am 1. Juni 1995, und WO 97/08203 , veröffentlicht am 6. März 1997, definiert, die ebenfalls durch Bezugnahme aufgenommen sind; und für VIP-nachahmende Peptide sind X₁, X₁', X₁''. X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ und Z und die ganzen Zahlen m und n wie in WO 97/40070 , veröffentlicht am 30. Oktober 1997, definiert, die ebenfalls durch Bezugnahme aufgenommen ist. Xaa und Yaa unten sind wie in WO 98/09985 , veröffentlicht am 12. März 1988, definiert, die durch Bezugnahme aufgenommen ist. AA₁, AA₂, AB₁, AB₂ und AC sind wie in der internationalen Anmeldung WO 98/53842 , veröffentlicht am 3. Dezember 1998, definiert, die durch Bezugnahme aufgenommen ist. Nur in Tabelle 17 sind X¹, X², X³ und X⁴ wie in der Europäischen Anmeldung EP 0 911 393 , veröffentlicht am 28. April 1999, definiert. Reste, die in fetter Schrift erscheinen, sind D-Aminosäuren. Alle Peptide sind durch Peptidbindungen verbunden, wenn dies nicht anders vermerkt ist. Die Abkürzungen sind am Ende dieser Beschreibung aufgeführt. In der „SEQ ID NO."-Spalte bedeutet „NR", dass für die gegebene Sequenz keine Sequenzaufführung benötigt wird. Tabelle 4 – Sequenzen von IL-1-Antagonist-Peptiden

Tabelle 5 – EPO-nachahmende Peptidsequenzen

Tabelle 6 – TPO-nachahmende Peptidsequenzen

Tabelle 7 – G-CSF-nachahmende Peptidsequenzen
Tabelle 8 – TNF-Antagonist-Peptidsequenzen
Tabelle 9 – Integrin-bindende Peptidsequenzen
Tabelle 10 – Selectin-Antagonist-Peptidsequenzen
Tabelle 11 – Antipathogene Peptidsequenzen

Tabelle 12 – VIP-nachahmende Peptidsequenzen

Tabelle 13 – Mdm/hdm-Antagonist-Peptidsequenzen
Tabelle 14 – Calmodulin-Antagonist-Peptidsequenzen
Tabelle 15 – Mastzellen-Antagonist/Mastzellen-Proteaseinhibitor-Peptidsequenzen
Tabelle 16 – SH3-Antagonist-Peptidsequenzen
Tabelle 17 – Somtatostatin- oder Cortistatin-nachahmende Peptidsequenzen
Tabelle 18 – UKR-Antagonist-Peptidsequenzen
Tabelle 19 – Makrophagen- und/oder T-Zell-inhibierende Peptidsequenzen

Tabelle 20 – Zusätzliche beispielhafte pharmakologisch aktive Peptide
Die vorliegende Erfindung ist auch besonders mit Peptiden nützlich, die eine Aktivität zur Behandlung von Folgendem aufweisen:

• Krebs, wobei das Peptid eine VEGF-nachahmende Verbindung oder ein VEGF-Rezeptor-Antagonist, ein HERZ-Agonist oder -Antagonist, ein CD20-Antagonist und dergleichen ist;
• Asthma, wobei das interessierende Protein ein CKR3-Antagonist, ein IL-5-Rezeptor-Antagonist und dergleichen ist;
• Thrombose, wobei das interessierende Protein ein GPIIb-Antagonist, ein GPIIIa-Antagonist und dergleichen ist;
• Autoimmunkrankheiten und andere Zustände, die eine Immunmodulation umfassen, wobei das interessierende Protein ein IL-2-Rezeptor-Antagonist, ein CD40-Agonist oder -Antagonist, ein CD40L-Agonist oder -Antagonist, eine Thymopoietin-nachahmende Verbindung und dergleichen ist.

Vehikel. Diese Erfindung erfordert die Anwesenheit von wenigstens einem Vehikel (F¹, F²), das an einem Peptid über den N-Terminus, C-Terminus oder eine Seitenkette von einer der Aminosäurereste befestigt ist. Es können auch mehrere Vehikel verwendet werden; z. B. Fcs an jedem Terminus oder ein Fc an einem Terminus und eine PEG-Gruppe am anderen Terminus oder an einer Seitenkette.
Das bevorzugte Vehikel ist eine Fc-Domäne. Die Fc-Domäne kann an den N- oder C-Terminus der Peptide oder sowohl an den N- als auch den C-Terminus fusioniert sein. Bei den TPO-nachahmenden Peptiden sind Moleküle, bei denen die Fc-Domäne an den N-Terminus des Peptidteils des Moleküls fusioniert ist, bioaktiver als andere derartige Fusionen, daher ist die Fusion an den N-Terminus bevorzugt.
Wie oben bemerkt, sind Fc-Varianten innerhalb des Umfangs dieser Erfindung geeignete Vehikel. Eine native Fc kann umfangreich modifiziert werden, um eine Fc-Variante gemäß dieser Erfindung zu bilden, mit der Maßgabe, dass die Bindung an den Rettungsrezeptor beibehalten wird; siehe z. B. WO 97/34631 und WO 96/32478 . Bei solchen Fc-Varianten kann man eine oder mehr als eine Stelle einer nativen Fc entfernen, die strukturelle Merkmale oder eine funktionale Aktivität bereitstellt, die von den Fusionsmolekülen dieser Erfindung nicht benötigt wird. Man kann diese Stellen z. B. durch das Substituieren oder Deletieren von Resten, durch das Einfügen von Resten an die Stelle oder durch das Verkürzen von Teilen entfernen, die diese Stelle enthalten. Die eingefügten oder substituierten Reste können auch veränderte Aminosäuren sein, wie beispielsweise peptidnachahmende Verbindungen oder D-Aminosäuren. Aus einer Anzahl von Gründen, von denen mehrere unten beschrieben sind, können Fc-Varianten wünschenswert sein. Beispielhafte Fc-Varianten umfassen Moleküle und Sequenzen, bei denen:

1. An der Ausbildung einer Disulfidbindung beteiligte Stellen entfernt sind. Solch eine Entfernung kann eine Reaktion mit anderen Cystein-haltigen Proteinen vermeiden, die in der Wirtszelle vorhanden sind, welche verwendet wird, um die Moleküle der Erfindung herzustellen. Zu diesem Zweck kann das Cystein-haltige Segment am N-Terminus verkürzt sein, oder Cystein-Reste können deletiert oder durch andere Ami nosäuren (z. B. Alanyl, Seryl) substituiert sein. Insbesondere kann man das N-terminale 20-Aminosäuren-Segment von SEQ ID NO: 2 verkürzen oder deletieren oder die Cystein-Reste an den Positionen 7 und 10 von SEQ ID NO: 2 substituieren. Selbst wenn Cystein-Reste entfernt sind, können die einzelkettigen Fc-Domänen immer noch eine dimere Fc-Domäne bilden, die nichtkovalent zusammengehalten wird.
2. Eine native Fc modifiziert ist, um sie mit einer ausgewählten Wirtszelle kompatibler zu machen. Zum Beispiel kann man die PA-Sequenz nahe dem N-Terminus einer typischen nativen Fc entfernen, die durch ein verdauendes Enzym in E. coli, wie beispielsweise Proliniminopeptidase, erkannt werden kann. Man kann auch einen N-terminalen Methioninrest hinzufügen, insbesondere, wenn das Molekül rekombinant in einer bakteriellen Zelle, wie beispielsweise E. coli, exprimiert wird. Die Fc-Domäne von SEQ ID NO: 2 (4) ist eine solche Fc-Variante.
3. Ein Teil des N-Terminus einer nativen Fc entfernt ist, um eine N-terminale Heterogenität zu verhindern, wenn sie in einer ausgewählten Wirtszelle exprimiert wird. Zu diesem Zweck kann man jegliche der ersten 20 Aminosäurereste am N-Terminus deletieren, besonders diejenigen an den Positionen 1, 2, 3, 4 und 5.
4. Eine oder mehr als eine Glykosylierungsstelle entfernt ist. Reste, die typischerweise glykosyliert sind (z. B. Asparagin), können eine zytolytische Antwort bewirken. Solche Reste können deletiert oder durch unglykosylierte Reste (z. B. Alanin) substituiert sein.
5. An der Wechselwirkung mit dem Komplement beteiligte Stellen, wie beispielsweise die C1q-Bindungsstelle, entfernt sind. Zum Beispiel kann man die EKK-Sequenz von menschlichem IgG1 entfernen oder substituieren. Es kann sein, dass die Komplementrekrutierung für die Moleküle dieser Erfindung nicht vorteilhaft ist, und sie kann daher mit einer solchen Fc-Variante vermieden werden.
6. Stellen entfernt sind, die die Bindung an Fc-Rezeptoren beeinflussen, welche keinen Rettungsrezeptor sind. Ein natives Fc kann Stellen für eine Wechselwirkung mit bestimmten weißen Blutzellen aufweisen, die für die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung nicht benötigt werden und daher entfernt sein können.
7. Die ADCC-Stelle entfernt ist. ADCC-Stellen sind auf dem Gebiet bekannt; siehe zum Beispiel Molec. Immunol. 29 (5): 633–9 (1992) hinsichtlich ADCC-Stellen in IgG1. Diese Stellen werden für die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung ebenfalls nicht benötigt und können daher entfernt sein.
8. Wenn das native Fc von einem nicht-menschlichen Antikörper abgeleitet ist, das native Fc humanisiert sein kann. Typischerweise wird man, um ein natives Fc zu humanisieren, ausgewählte Reste in dem nicht-menschlichen, nativen Fc gegen Reste substituieren, die normalerweise in einem menschlichen nativen Fc gefunden werden. Techniken zur Humanisierung von Antikörpern sind auf dem Gebiet wohl bekannt.

Bevorzugte Fc-Varianten umfassen die folgenden: In SEQ ID NO: 2 (4) kann das Leucin an Position 15 durch Glutamat substituiert sein; das Glutamat an Position 99 durch Alanin; und die Lysine an den Positionen 101 und 103 durch Alanine. Zusätzlich kann ein oder mehr als ein Tyrosin-Rest durch einen Phenylalanin-Rest ersetzt sein.
Ein alternatives Vehikel wäre ein Protein, Polypeptid, Peptid, Antikörper, Antikörperfragment oder small molecule (z. B. eine peptidnachahmende Verbindung), das in der Lage ist, an einen Rettungsrezeptor zu binden. Zum Beispiel könnte man als Vehikel ein Polypeptid verwenden, wie es in US-Patent Nr. 5,739,277 , erteilt am 14. April 1998 an Presta et al., beschrieben ist. Peptide könnten auch durch Phage Display auf eine Bindung an den FcRn-Rettungsrezeptor selektiert werden. Solche an einen Rettungsrezeptor bindende Verbindungen sind auch innerhalb der Bedeutung von „Vehikel" umfasst und liegen innerhalb des Umfanges dieser Erfindung. Solche Vehikel sollten nach einer erhöhten Halbwertszeit (z. B. durch das Vermeiden von Sequenzen, die durch Proteasen erkannt werden) und nach einer verringerten Immunogenität (z. B. durch das Bevorzugen nichtimmunogener Sequenzen, wie bei der Antikörperhumanisierung entdeckt) ausgewählt sein.
Wie oben bemerkt, können auch Polymervehikel für F¹ und F² verwendet werden. Es sind zur Zeit verschiedene Mittel zum Befestigen von chemischen Teilen verfügbar, die als Vehikel nützlich sind, siehe z. B. Patentkooperationsvertrag („PCT") Internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/11953 mit dem Titel „N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods", die hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Diese PCT-Veröffentlichung offenbart unter anderem die selektive Befestigung von wasserlöslichen Polymeren am N-Terminus von Proteinen.
Ein bevorzugtes Polymervehikel ist Polyethylenglycol (PEG). Die PEG-Gruppe kann von jeglichem praktischen Molekulargewicht und linear oder verzweigt sein. Das durchschnittliche Molekulargewicht des PEGs wird bevorzugterweise im Bereich von 2 kiloDalton („kD") bis etwa 100 kDa liegen, bevorzugtererweise von etwa 5 kDa bis etwa 50 kDa, am bevorzugtesten von etwa 5 kDa bis etwa 10 kDa. Die PEG-Gruppen werden an den Verbindungen der Erfindung im Allgemeinen über eine Acylierung oder reduktive Alkylierung über eine reaktive Gruppe auf dem PEG-Teil (z. B. eine Aldehyd-, Amino-, Thiol- oder Estergruppe) an einer reaktiven Gruppe der erfindungsgemäßen Verbindung (z. B. einer Aldehyd-, Amino- oder Estergruppe) befestigt sein.
Eine nützliche Strategie für die PEGylierung synthetischer Peptide besteht aus dem Kombinieren eines Peptid- und eines PEG-Teils durch das Ausbilden einer Konjugatverbindung in Lösung, von denen jeder eine spezielle Funktionalität trägt, die gegenseitig mit der anderen reaktionsfähig ist. Die Peptide können durch herkömmliche Festphasensynthese leicht hergestellt werden (siehe z. B. die 5 und 6 und den hierin beigefügten Text). Die Peptide werden mit einer geeigneten funktionellen Gruppe an einer spezifischen Stelle „voraktiviert". Die Vorläufer werden vor dem Umsetzen mit dem PEG-Teil aufgereinigt und vollständig charakterisiert. Die Ligation des Peptides mit PEG findet normalerweise in wässriger Phase statt und kann leicht durch analytische Reverse-Phase-HPLC überwacht werden. Die PEGylierten Peptide können durch präparative HPLC leicht aufgereinigt und durch analytische HPLC, Aminosäureanalyse und Laser-Desorptions-Massenspektrometrie charakterisiert werden.
Polysaccharidpolymere sind ein anderer Typ wasserlöslicher Polymere, der für eine Proteinmodifikation verwendet werden kann. Dextrane sind Polysaccharidpolymere, die individuelle Glucose-Untereinheiten umfassen, die vorwiegend durch α1-6-Verbindungen verbunden sind. Das Dextran selbst ist in vielen Molekulargewichtsbereichen verfügbar und in Molekulargewichten von etwa 1 kD bis etwa 70 kD leicht verfügbar. Dextran ist ein geeignetes wasserlösliches Polymer zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung als Vehikel selbst oder in Kombination mit einem anderen Vehikel (z. B. Fc). Siehe zum Beispiel WO 96/11953 und WO 96/05309 . Von der Verwendung von an therapeutische oder diagnostische Immunglobuline konjugiertem Dextran wurde berichtet; siehe z. B. Europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 315 456 , die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Wenn Dextran gemäß der vorliegenden Erfindung als Vehikel verwendet wird, ist Dextran von etwa 1 kD bis etwa 20 kD bevorzugt.
Linker. Eine jegliche „Linker"-Gruppe ist optional. Wenn sie vorhanden ist, ist ihre chemische Struktur nicht entscheidend, weil sie primär als Abstandhalter dient. Der Linker besteht bevorzugterweise aus Aminosäuren, die miteinander durch Peptidbindungen verbunden sind. Somit besteht der Linker in bevorzugten Ausführungsformen aus 1 bis 20 Aminosäuren, die durch Peptidbindungen verbunden sind, wobei die Aminosäuren aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren ausgewählt sind. Einige dieser Aminosäuren können glykosyliert sein, wie von Fachleuten auf dem Gebiet gut verstanden wird. In einer bevorzugteren Ausführungsform sind die 1 bis 20 Aminosäuren aus Glycin, Alanin, Prolin, Asparagin, Glutamin und Lysin ausgewählt. Noch bevorzugtererweise besteht ein Linker aus einer Mehrzahl von Aminosäuren, die sterisch ungehindert sind, wie beispielsweise Glycin und Alanin. Somit sind bevorzugte Linker Polyglycine (insbesondere (Gly)₄, (Gly)₅), poly(Gly-Ala) und Polyalanine. Andere spezifische Beispiele für Linker sind:
(Gly)₃Lys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 333);
(Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO: 334);
(Gly)₃Cys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 335); und
GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 336).
Zur Erklärung der obigen Nomenklatur bedeutet z. B. (Gly)₃Lys(Gly)₄ Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Kombinationen von Gly und Ala sind ebenfalls bevorzugt. Die hier gezeigten Linker sind beispielhaft; Linker innerhalb des Umfanges dieser Erfindung können viel langer sein und andere Reste umfassen.
Nicht-Peptid-Linker sind ebenfalls möglich. Zum Beispiel könnten Alkyllinker, wie beispielsweise -NH-(CH₂)_s-C(O)- verwendet werden, wobei s = 2–20. Diese Alkyllinker können weiter durch jegliche nicht sterisch hindernde Gruppe substituiert sein, wie beispielsweise ein niederes Alkyl (z. B. C₁-C₆), niederes Acyl, Halogen (z. B. Cl, Br), CN, NH₂, Phenyl etc. Ein beispielhafter nicht-Peptid-Linker ist ein PEG-Linker,
wobei n derart ist, dass der Linker ein Molekulargewicht von 100 bis 5000 kD, bevorzugterweise von 100 bis 500 kD aufweist. Die Peptid-Linker können verändert werden, um auf die gleiche Weise wie oben beschrieben Derivate zu bilden.
Derivate. Die Erfinder sehen auch das Derivatisieren des Peptides und/oder des Vehikelteils der Verbindungen vor. Solche Derivate können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und dergleichen der Verbindungen verbessern. Die Teile können alternativ jegliche unerwünschte Nebenwirkung der Verbindungen und dergleichen beseitigen oder abschwächen. Beispielhafte Derivate umfassen Verbindungen, bei denen:

1. Die Verbindung oder irgendein Teil davon zyklisch ist. Zum Beispiel kann der Peptidteil modifiziert sein, so dass er zwei oder mehr als zwei Cys-Reste (z. B. im Linker) enthält, die durch die Ausbildung einer Disulfidbindung zyklisieren könnten. Zu Zitierungen von Literaturstellen zur Herstellung zyklischer Derivate, siehe Tabelle 2.
2. Die Verbindung quervernetzt oder in die Lage versetzt ist, zwischen Molekülen eine Quervernetzung auszubilden. Zum Beispiel kann der Peptidteil modifiziert sein, so dass er einen Cys-Rest enthält und dadurch in der Lage ist, eine intermolekulare Disulfidbindung mit einem gleichartigen Molekül auszubilden. Die Verbindung kann auch über ihren C-Terminus quervernetzt sein, wie bei dem unten gezeigten Molekül.
3.
4. Eine oder mehr als eine Peptidyl[-C(O)NR-]-Verbindung (Bindung) durch eine nicht-Peptidyl-Verbindung ersetzt ist. Beispielhafte nicht-Peptidyl-Verbindungen sind -CH₂-Carbamat [-CH₂-OC(O)NR-], Phosphonat, -CH₂-Sulfonamid [-CH₂-S(O)₂NR-], Harnstoff [-NHC(O)NH-], -CH₂-sekundäres Amin und alkyliertes Peptid [-C(O)NR⁶-, wobei R⁶ ein niederes Alkyl ist].
5. Der N-Terminus derivatisiert ist. Typischerweise kann der N-Terminus acyliert oder zu einem substituierten Amin modifiziert sein. Beispielhafte N-terminale Derivatgruppen umfassen -NRR¹ (andere als -NH₂), -NRC(O)R¹, -NRC(O)OR¹, -NRS(O)₂R¹, -NHC(O)NHR¹, Succinimid oder Benzyloxycarbonyl-NH-(CBZ-NH-), wobei R und R¹ jeweils unabhängig Wasserstoff oder ein niederes Alkyl sind, und wobei der Phenylring mit 1 bis 3 Substituenten substituiert sein kann, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Chlor und Brom besteht.
6. Der freie C-Terminus derivatisiert ist. Typischerweise ist der C-Terminus verestert oder amidiert. Zum Beispiel kann man auf dem Gebiet beschriebene Verfahren verwenden, um (NH-CH₂-CH₂-NH₂)₂ zu Verbindungen dieser Erfindung hinzufügen, die am C-Terminus eine jegliche der SEQ ID NOS: 504 bis 508 aufweisen. Gleichermaßen kann man auf dem Gebiet beschriebene Verfahren verwenden, um -NH₂ zu Verbindungen dieser Erfindung hinzuzufügen, die eine jegliche der SEQ ID NOS: 924 bis 955, 963 bis 972, 1005 bis 1013 oder 1018 bis 1023 am C-Terminus aufweisen. Beispielhafte C-terminale Derivatgruppen umfassen z. B. -C(O)R², wobei R² ein niederes Alkoxy ist, oder -NR³R⁴, wobei R³ und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder ein C₁-C₈-Alkyl (bevorzugterweise ein C₁-C₄-Alkyl) sind.
7. Eine Disulfidbindung durch einen anderen, bevorzugterweise stabileren, quervernetzenden Teil ersetzt ist (z. B. eine Alkandiylgruppe). Siehe z. B. Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814–9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357–9.
8. Ein oder mehr als ein individueller Aminosäurerest modifiziert ist. Von verschiedenen derivatisierenden Agenzien ist bekannt, dass sie spezifisch mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten reagieren, wie unten detailliert beschrieben ist.

Lysinylreste und N-terminale Reste können mit Anshydriden der Bernsteinsäure oder anderer Carboxylsäuren umgesetzt werden, die die Ladung der Lysinylreste umkehren. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von alpha-amino-haltigen Resten umfassen Imidoester, wie beispielsweise Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborohydrid; Trinitrobenzensulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und die Transaminasekatalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste können durch eine Reaktion mit einem jeglichen oder einer jeglichen Kombination von mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert werden, die Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexadion und Ninhydrin umfassen. Eine Derivatisierung von Arginylresten erfordert wegen des hohen pKas der funktionellen Guanidin-Gruppe, dass die Reaktion unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Weiterhin können diese Reagenzien mit den Lysingmppen genauso wie mit den epsilon-Aminogruppen von Arginin reagieren.
Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten wurde umfangreich untersucht, mit einem besonderen Interesse am Einführen spektraler Markierungen in Tyrosylreste durch die Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Am üblichsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosyl-Spezies bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden.
Carboxyl-Seitenkettengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) können durch die Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') wie beispielsweise 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl)-carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)-carbodiimid selektiv modifiziert werden. Weiterhin können Aspartyl- und Glutamylreste durch die Reaktion mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgewandelt werden.
Glutaminyl- und Asparaginyl-Reste können zu den entsprechenden Glutaminyl- und Aspartyl-Resten deamidiert werden. Alternativ können diese Reste unter mild sauren Bedingungen deamidiert werden. Beide Formen dieser Reste fallen unter den Umfang dieser Erfindung.
Cysteinylreste können durch Aminosäurereste oder andere Teile ersetzt werden, entweder, um die Ausbildung einer Disulfidbindung zu beseitigen, oder umgekehrt, um eine Quervernetzung zu stabilisieren. Siehe z. B. Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814–9.
Eine Derivatisierung mit bifunktionellen Agenzien ist zum Quervernetzen der Peptide oder ihrer funktionellen Derivate mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder mit anderen makromolekularen Vehikeln nützlich. Üblicherweise verwendete Quervernetzungs-Agenzien umfassen z. B. 1,1-bis(Diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, zum Beispiel Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, die Disuccinimidylester, wie beispielsweise 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleimide wie beispielsweise bis-N-Maleimido-1,8-octan umfassen. Derivatisierende Agenzien, wie beispielsweise Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in der Lage sind, in der Anwesenheit von Licht Quervernetzungen auszubilden. Alternativ werden zur Proteinimmobilisierung reaktive wasserunlösliche Matrizen, wie beispielsweise Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenhydrate und die reaktiven Substrate verwendet, die in den US-Patenten mit den Nrn. 3,969,287 ; 3,691,016 ; 4,195,128 ; 4,247,642 ; 4,229,537 ; und 4,330,440 beschrieben sind.
Kohlenhydrat(Oligosaccharid)-Gruppen können bequem an Stellen befestigt werden, von denen bekannt ist, dass sie in Proteinen Glykosylierungsstellen darstellen. Im Allgemeinen werden O-verbundene Oligosaccharide an Serin(Ser)- oder Threonin(Thr)-Resten befestigt, wohingegen N-verbundene Oligosaccharide an Asparagin(Asn)-Resten befestigt werden, wenn sie Teil der Sequenz Asn-X-Ser/Thr sind, wobei X eine jegliche Aminosäure außer Prolin sein kann. X ist bevorzugterweise eine der 19 natürlich vorkommenden Aminosäuren, die nicht Prolin sind. Die Strukturen von N-verbundenen und O-verbundenen Oligosacchariden und den Zuckerresten, die in jedem Typ gefunden werden, sind unterschiedlich. Eine Art von Zucker, die üblicherweise an beiden gefunden wird, ist N-Acetylneuraminsäure (als Sialinsäure bezeichnet). Sialinsäure ist üblicherweise der terminale Rest sowohl von N-verbundenen als auch O-verbundenen Oligosacchariden und kann der glykosylierten Verbindung aufgrund ihrer negativen Ladung saure Eigenschaften verleihen. Solch eine Stelle/solche Stellen kann/können in den Linker der Verbindungen dieser Erfindung eingebaut werden und wird/werden bevorzugterweise während der rekombinanten Produktion der Polypeptidverbindungen (z. B. in Säugetierzellen wie CHO, BHK, COS) durch eine Zelle glykosyliert. Solche Stellen können durch synthetische oder semi-synthetische Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, jedoch weiter glykosyliert werden.
Andere mögliche Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung der Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Oxidation des Schwefelatoms in Cys, die Methylierung der alpha-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), S. 79–86 (1983).
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch auf der Ebene der DNA verändert werden. Die DNA-Sequenz eines jeglichen Teils der Verbindung kann zu mit der ausgewählten Wirtszelle kompatibleren Codons verändert werden. Für E. coli, das die bevorzugte Wirtszelle ist, sind optimierte Codons auf dem Gebiet bekannt. Codons können substituiert werden, um Restriktionsschnittstellen zu beseitigen oder stille Restriktionsschnittstellen zu umfassen, die beim Verarbeiten der DNA in der ausgewählten Wirtszelle helfen können. Die Vehikel-Linker- und Peptid-DNA-Sequenzen können modifiziert werden, um jegliche der vorangehenden Sequenzveränderungen zu umfassen.
Verfahren zum Herstellen
Die Verbindungen dieser Erfindung können im Wesentlichen in transformierten Wirtszellen unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden. Dazu wird ein rekombinantes DNA-Molekül hergestellt, das für das Peptid codiert. Verfahren zur Herstellung solcher DNA-Moleküle sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Z. B. könnten für die Peptide codierende Sequenzen aus DNA unter Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymen ausgeschnitten werden. Alternativ könnte das DNA-Molekül unter Verwendung von chemischen Synthesetechniken, wie beispielsweise dem Phosphoramidat-Verfahren, synthetisiert werden. Es könnte auch eine Kombination dieser Techniken verwendet werden.
Die Erfindung umfasst auch einen Vektor, der in der Lage ist, die Peptide in einem geeigneten Wirt zu exprimieren. Der Vektor umfasst das DNA-Molekül, das für die Peptide codiert und funktionsfähig mit geeigneten Expressionssteuerungssequenzen verbunden ist. Verfahren zum Bewirken dieser funktionsfähigen Verbindung, entweder vor oder nachdem das DNA-Molekül in den Vektor eingefügt wird, sind wohl bekannt. Expressionssteuerungssequenzen umfassen Promotoren, Aktivatoren, Enhancer, Operatoren, Ribosomen-Bindestellen, Startsignale, Stoppsignale, Kappen-Signale, Polyadenylierungssignale und andere Signale, die an der Steuerung von Transkription oder Translation beteiligt sind.
Der sich ergebende Vektor, der auf sich das DNA-Molekül aufweist, wird verwendet, um einen geeigneten Wirt zu transformieren. Diese Transformation kann unter Verwendung von Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind.
Bei der Praktizierung dieser Erfindung kann eine jegliche große Anzahl verfügbarer und wohl bekannter Wirtszellen verwendet werden. Die Auswahl eines bestimmten Wirtes hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, die auf dem Gebiet anerkannt sind. Diese umfassen z. B. die Kompatibilität mit dem ausgewählten Expressionsvektor, die Toxizität der von dem DNA-Molekül codierten Peptide, die Transformationsrate, die Leichtigkeit der Gewinnung der Peptide, die Expressionscharakteristika, die biologische Sicherheit und die Kosten. Es muss mit dem Verständnis, dass nicht alle Wirte für die Expression einer bestimmten DNA-Sequenz gleichermaßen wirkungsvoll sind, eine Balance zwischen diesen Faktoren erreicht werden. Innerhalb dieser allgemeinen Richtlinien umfassen nützliche mikrobielle Wirte Bakterien (wie beispielsweise E. coli-Sp.), Hefe (wie Saccharomyces-Sp.) und andere Pilze, Insekten, Pflanzen, Säugetier-(einschließlich menschliche)Zellen in Kultur oder andere auf dem Gebiet bekannte Wirte.
Als nächstes wird der transformierte Wirt kultiviert und aufgereinigt. Wirtszellen können unter herkömmlichen Fermentationsbedingungen kultiviert werden, so dass die erwünschten Verbindungen exprimiert werden. Solche Fermentationsbedingungen sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Schließlich werden die Peptide aus der Kultur durch auf dem Gebiet wohl bekannte Verfahren aufgereinigt.
Die Verbindungen können auch durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können Festphasen-Synthesetechniken verwendet werden. Geeignete Techniken sind auf dem Gebiet wohl bekannt und umfassen diejenigen, die in Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, S. 335–61 (Katsoyannis und Panayotis Hrsg.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394–414; Stewart und Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; US-Pat. Nr. 3,941,763 ; Firm et al. (1976), The Proteins (3. Ausg.) 2: 105–253; und Erickson et al. (1976), The Proteins (3. Ausg.) 2: 257–527, beschrieben sind. Die Festphasensynthese ist die bevorzugte Technik zum Herstellen von individuellen Peptiden, weil sie das kostengünstigste Verfahren zum Herstellen kleiner Peptide darstellt.
Verbindungen, die derivatisierte Peptide oder nicht-Peptid-Gruppen enthalten, können durch wohl bekannte Techniken auf dem Gebiet der organischen Chemie synthetisiert werden.
Verwendungen der Verbindungen
Im Allgemeinen. Die Verbindungen dieser Erfindung weisen pharmakologische Aktivität auf, die sich aus ihrer Fähigkeit ergibt, an interessierende Proteine als Agonisten, nachahmende Verbindungen oder Antagonisten der nativen Liganden solcher interessierender Proteine zu binden. Die Nützlichkeit spezifischer Verbindungen ist in Tabelle 2 gezeigt. Die Aktivität dieser Verbindungen kann durch auf dem Gebiet bekannte Tests gemessen werden. Für die TPO-nachahmenden und EPO-nachahmenden Verbindungen sind in vivo-Tests in dem Beispielsteil hierin weiter beschrieben.
Zusätzlich zu therapeutischen Verwendungen sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung beim Diagnostizieren von Krankheiten nützlich, die durch eine Funktionsstörung ihres assoziierten interessierenden Proteins gekennzeichnet sind. In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Nachweisen eines interessierenden Proteins (z. B. eines Rezeptors) in einer biologischen Probe, das in der Lage ist, aktiviert zu werden, die folgenden Schritte: (a) Kontaktieren der Probe mit einer Verbindung dieser Erfindung; und (b) Nachweisen der Aktivierung des interessierenden Proteins durch die Verbindung. Die biologischen Proben umfassen Gewebeproben, intakte Zellen oder Extrakte davon. Die Verbindungen dieser Erfindung können als Teil eines diagnostischen Kits verwendet werden, um die Anwesenheit ihrer assoziierten interessierenden Proteine in einer biologischen Probe nachzuweisen. Solche Kits verwenden die Verbindungen der Erfindungen, an denen eine Markierung befestigt ist, um einen Nachweis zu erlauben. Die Verbindungen sind zum Identifizieren normaler oder abnormaler interessierender Proteine nützlich. Bei den EPO-nachahmenden Verbindungen kann z. B. die Anwesenheit von abnormalem interessierenden Protein in einer biologischen Probe solche Störungen die wie Diamond-Blackfan-Anämie anzeigen, von der man glaubt, dass der EPO-Rezeptor funktionsgestört ist.
Therapeutische Verwendungen EPO-nachahmender Verbindungen. Die EPO-nachahmenden Verbindungen der Erfindung sind zum Behandeln von Störungen nützlich, die durch niedrige Konzentrationen roter Blutzellen gekennzeichnet sind. Von der Erfindung sind Verfahren zum Modulieren der endogenen Aktivität eines EPO-Rezeptors in einem Säugetier umfasst, bevorzugterweise Verfahren zum Erhöhen der Aktivität eines EPO-Rezeptors. Im Allgemeinen kann ein jeglicher Zustand, der durch Erythropoietin behandelbar ist, wie beispielsweise Anämie, auch mit den EPO-nachahmenden Verbindungen der Erfindung behandelt werden. Diese Verbindungen werden in einer Menge und über einen Verabreichungsweg verabreicht, die/der hinsichtlich der Natur und Schwere des behandelt werdenden Zustandes geeignet ist und durch einen Fachmann auf dem Gebiet ermittelt werden kann. Die Verabreichung erfolgt bevorzugterweise durch Injektion, entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös.
Therapeutische Verwendungen TPO-nachahmender Verbindungen. Für die TPO-nachahmenden Verbindungen kann man solche Standardtests verwenden, wie diejenigen, die in WO 95/26746 mit dem Titel „Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation" beschrieben sind. Es erscheinen auch in den Beispielen hiernach auch in vivo-Tests.
Die zu behandelnden Zustände sind im Allgemeinen diejenigen, die eine vorhandene Megakaryozyten-Blutplättchen-Defizienz oder eine erwartete Megakaryozyten-/Blutplättchen-Defizienz umfassen (z. B. aufgrund einer geplanten Operation oder Blutplättchenspende). Solche Zustände werden gewöhnlich das Ergebnis einer Defizienz (zeitweilig oder permanent) von aktivem Mpl-Ligand in vivo sein. Der generische Begriff für eine Blutplättchen-Defizienz ist Thrombozytopenie, und daher sind die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen verfügbar, um eine Thrombozytopenie bei Patienten zu behandeln, die dies benötigen.
Eine Thrombozytopenie (Blutplättchen-Defizienzen) kann aufgrund von verschiedenen Gründen vorhanden sein, die eine Chemotherapie und eine andere Therapie mit einer Vielzahl von Wirkstoffen, eine Bestrahlungstherapie, Operation, einen zufälligen Blutverlust oder andere spezifische Krankheitszustände umfassen. Beispielhafte spezifische Krankheitszustände, die eine Thrombozytopenie umfassen und gemäß dieser Erfindung behandelt werden können, sind: aplastische Anämie, idiopathische Thrombozytopenie, metastatische Tumore, die zu einer Thrombozytopenie führen, systemischer Lupus erythematodes, Splenomegalie, Fanco ni's Syndrom, Vitamin B12-Mangel, Folsäuremangel, May-Hegglin-Anomalie, Wiskott-Aldrich-Syndrom und paroxysmale nocturnale Hämoglobinurie. Auch bestimmte Behandlungen von AIDS führen zu Thrombozytopenie (z. B. AZT). Auch bestimmte Wundheilungsstörungen könnten aus einer Zunahme der Blutplättchenzahlen einen Nutzen ziehen.
Hinsichtlich zu erwartender Blutplättchen-Defizienzen, z. B. aufgrund einer zukünftigen Operation, könnte eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mehrere Tage bis mehrere Stunden vor dem Bedarf an Blutplättchen verabreicht werden. Mit Hinblick auf akute Situationen, z. B. zufälligen und massiven Blutverlust, könnte eine Verbindung der Erfindung zusammen mit Blut oder aufgereinigten Blutplättchen verabreicht werden.
Die TPO-nachahmenden Verbindungen dieser Erfindung können auch beim Stimulieren bestimmter Zelltypen nützlich sein, die nicht Megakaryozyten sind, wenn bei solchen Zellen festgestellt wird, dass sie den Mpl-Rezeptor exprimieren. Zustände, die mit solchen den Mpl-Rezeptor exprimierenden Zellen assoziiert sind, welche auch auf die Stimulation durch den Mpl-Liganden reagieren können, liegen ebenfalls innerhalb des Umfangs dieser Erfindung.
Die TPO-nachahmenden Verbindungen dieser Erfindung können in einer jeglichen Situation verwendet werden, in der die Produktion von Blutplättchen oder Vorläuferzellen von Blutplättchen erwünscht ist, oder in der die Stimulation des c-Mpl-Rezeptors erwünscht ist. Somit können die Verbindungen dieser Erfindung z. B. verwendet werden, um einen jeglichen Zustand in einem Säugetier zu behandeln, bei dem ein Bedarf an Blutplättchen, Megakaryozyten und dergleichen besteht. Solche Zustände sind detailliert in den folgenden beispielhaften Quellen beschrieben: WO 95/26746 ; WO 95/21919 ; WO 95/18858 ; WO 95/21920 und sind hierin aufgenommen.
Die TPO-nachahmenden Verbindungen dieser Erfindung können auch beim Aufrechterhalten der Lebensfähigkeit oder der Haltbarkeit von Blutplättchen und/oder Megakaryozyten und verwandten Zellen sein. Dementsprechend könnte es nützlich sein, eine wirksame Menge von einer oder mehr als einer solchen Verbindung in eine Zusammensetzung zu umfassen, die solche Zellen enthält.
Die therapeutischen Verfahren, Zusammensetzungen und Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls alleine oder in Kombination mit anderen Zytokinen, löslichem Mpl-Rezeptor, hämatopoetischen Faktoren, Interleukinen, Wachstumsfaktoren oder Antikörpern bei der Behandlung von Krankheitszuständen verwendet werden, die durch andere Symptome genauso wie durch Blutplättchen-Defizienzen gekennzeichnet sind. Es wird erwartet, dass sich die erfindungsgemäße Verbindung beim Behandeln einiger Formen von Thrombozytopenie in Kombination mit allgemeinen Stimulatoren der Hämatopoese, wie beispielsweise IL-3 oder GM-CSF, als nützlich erweisen wird. Andere megakaryotische stimulierende Faktoren, d. h. meg-CSF, Stammzellfaktor (SCF), Leukämie-inhibierender Faktor (LIF), Oncostatin M (OSM) oder andere Moleküle mit einer Megakaryozyten-stimulierenden Aktivität können ebenfalls mit dem Mpl-Ligand verwendet werden. Zusätzliche beispielhafte Zytokine oder hämatopoetische Faktoren für eine solche Co-Verabreichung umfassen IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, Kolonie-stimulierenden Faktor-1 (CSF-1), SCF, GM-CSF, Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), EPO, Interferon-alpha (IFN-alpha), Konsensus-Interferon, IFN-beta oder IFN-gamma. Es kann weiterhin nützlich sein, entweder simultan oder sequenziell eine wirksame Menge eines löslichen Säugetier-Mpl-Rezeptors zu verabreichen, der die Wirkung zu haben scheint, dass er das Fragmentieren von Megakaryozyten zu Blutplättchen bewirkt, wenn die Megakaryozyten erst einmal die reife Form erreicht haben. Somit wird von der Verabreichung des erfindungsgemäßen Verbindung (um die Anzahl der reifen Megakaryozyten zu erhöhen), gefolgt von der Verabreichung des löslichen Mpl-Rezeptors (um den Liganden zu inaktivieren und den reifen Megakaryozyten zu erlauben, Blutplättchen zu produzieren), erwartet, dass sie ein besonders wirksames Mittel zum Stimulieren der Blutplättchenproduktion darstellt. Die oben zitierte Dosierung würde angepasst werden, um solche zusätzlichen Bestandteile in der therapeutischen Zusammensetzung auszugleichen. Der Fortschritt des behandelten Patienten kann durch herkömmliche Verfahren überwacht werden.
Bei Fällen, in denen die erfindungsgemäßen Verbindungen zu Zusammensetzungen von Blutplättchen und/oder Megakaryozyten und verwandten Zellen hinzugegeben werden, wird die zu umfassende Menge im Allgemeinen experimentell durch auf dem Gebiet bekannte Techniken und Tests festgestellt werden. Ein beispielhafter Mengenbereich beträgt 0,1 μg–1 mg erfindungsgemäße Verbindung pro 10⁶ Zellen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Im Allgemeinen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Verwenden pharmazeutischer Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen Verbindungen bereit. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können für die Verabreichung per Injektion oder für orale, pulmonale, nasale, transdermale oder andere Verabreichungsformen bestimmt sein. Im Allgemeinen umfasst die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirksame Mengen einer Verbindung der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsverbesserern, Emulgierungsmitteln, Adjuvanzien und/oder Trägern umfassen. Solche Zusammensetzungen umfassen Verdünnungsmittel von verschiedenem Pufferinhalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH und verschiedener Ionenstärke; Zusatzstoffe, wie beispielsweise Detergenzien und lösungsverbessernde Agenzien (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidationsmittel (z. B. Ascorbinsäure, Natriumdisulfid), Konservierungsstoffe (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Füllsubstanzen (z. B. Laktose, Mannitol); den Einbau des Materials in partikuläre Zubereitungen von Polymerverbindungen, wie beispielsweise Polymilchsäure, Polyglycolsäure etc. oder in Liposomen. Es kann auch Hyaluronsäure verwendet werden, und dies kann die Wirkung haben, die anhaltende Dauer im Kreislauf zu fördern. Solche Zusammensetzungen können den körperlichen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der Freisetzung in vivo und die Geschwindigkeit der Klärung in vivo der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Siehe Z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), Seiten 1435–1712, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form hergestellt werden oder können als trockenes Pulver, wie beispielsweise in lyophilisierter Form, vorliegen. Implantierbare Formulierungen zur anhaltenden Freisetzung sind ebenfalls vorgesehen, genauso wie transdermale Formulierungen.
Orale Dosierungsformen. Zur Verwendung hierin sind orale feste Dosierungsformen vorgesehen, die allgemein in Kapitel 89 von Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18. Ausg., Mack Publishing Co. Easton PA 18042, beschrieben sind, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Feste Dosierungsformen umfassen Tabletten, Kapseln, Pillen, Pastillen oder Hustenbonbons, Cachets oder Pellets. Auch eine liposomale oder Protein-Verkapselung kann verwendet werden, um die vorliegenden Verbindungen zu formulieren (wie z. B. Protein-Mikrosphären, von denen in US-Patent Nr. 4,925,673 berichtet wurde). Eine liposomale Verkapselung kann verwendet werden, und die Liposomen können mit verschiedenen Polymeren derivatisiert werden (z. B. US-Patent Nr. 5,013,556 ). Eine Beschreibung von möglichen festen Dosierungsformen für das Therapeutikum ist in Kapitel 10 von Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), herausgegeben von G. S. Banker und C. T. Rhodes, angegeben, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Im Allgemeinen wird die Formulierung die erfindungsgemäße Verbindung und inerte Inhaltsstoffe umfassen, die den Schutz gegen die Umgebung im Magen und die Freisetzung des biologisch aktiven Materials im Darm gestatten.
Es sind auch spezifisch orale Dosierungsformen der obigen erfindungsgemäßen Verbindungen vorgesehen. Wenn es nötig ist, können die Verbindungen derart chemisch modifiziert sein, dass eine orale Abgabe wirksam ist. Im Allgemeinen ist die vorgesehene chemische Modifikation die Befestigung von wenigstens einem Teil an das Verbindungsmolekül selbst, wobei der Teil (a) die Inhibition von Proteolyse; und (b) die Aufnahme in den Blutstrom aus dem Magen oder Darm erlaubt. Ebenfalls erwünscht ist die Zunahme der Gesamtstabilität der Verbindung und die Zunahme der Kreislaufzeit im Körper. Es können auch Teile für diesen Zweck verwendet werden, die bei dieser Erfindung als kovalent befestigte Vehikel nützlich sind. Beispiele für solche Teile umfassen: PEG, Copolymere von Ethylenglycol und Propylenglycol, Carboxymethylzellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin. Siehe zum Beispiel Abuchowski und Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg und Roberts, Hrsg., Wiley-Interscience, New York, NY, S. 367–83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4: 185–9. Andere Polymere, die verwendet werden könnten, sind Poly-1,3-Dioxolan und Poly-1,3,6-Tioxocan. Für die pharmazeutische Verwendung, wie oben angegeben, sind PEG-Teile bevorzugt.
Für Dosierungsformen zur oralen Abgabe ist es auch möglich, ein Salz einer modifizierten aliphatischen Aminosäure, wie beispielsweise Natrium N-(8-[2-Hydroxybenzoyl)]amino)caprylat (SNAC) als Träger zu verwenden, um die Absorption der therapeutischen Verbindungen dieser Erfindung zu erhöhen. Die klinische Wirksamkeit einer Heparinformulierung unter Verwendung von SNAC wurde in einer Phase II-Versuchsreihe demonstriert, die von Emisphere Technologies durchgeführt wurde. Siehe US-Patent Nr. 5,792,451 , „Oral drug delivery composition and methods".
Die Verbindungen dieser Erfindung können in der Formulierung als feine Multidispersionsteilchen in der Form von Granula oder Pellets einer Partikelgröße von etwa 1 mm umfasst sein. Die Formulierung des Materials für die Kapselverabreichung könnte ebenfalls in der Form eines Pulvers, der von leicht komprimierten Pfropfen oder gar von Tabletten vorliegen. Das Therapeutikum könnte durch Komprimierung hergestellt werden.
Farbstoff- und Geschmacksstoff-Agenzien können alle umfasst sein. Zum Beispiel kann das Protein (oder Derivat) formuliert sein (wie beispielsweise durch Liposom- oder Mikrosphären-Verkapselung) und dann weiter innerhalb eines essbaren Produktes enthalten sein, wie beispielsweise einem gekühlten Getränk, das Farbstoff- und Geschmacksstoff-Agenzien enthält.
Man kann die Verbindung der Erfindung mit einem inerten Material verdünnen oder ihr Volumen erhöhen. Diese Verdünnungsmittel könnten Kohlenhydrate, insbesondere Mannitol, α-Laktose, wasserfreie Laktose, Zellulose, Saccharose, modifizierte Dextrane und Stärke umfassen. Es können auch bestimmte anorganische Salze als Füllstoffe verwendet werden, die Kalziumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid umfassen. Einige kommerziell verfügbare Verdünnungsmittel sind Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress und Avicell.
Es können auch Desintegratoren von der Formulierung des Therapeutikums zu einer festen Dosierungsform umfasst sein. Als Desintegratoren verwendete Materialien umfassen, sind aber nicht begrenzt auf Stärke, die den kommerziellen Desintegrator auf der Grundlage von Stärke, Explotab, umfasst. Natriumstärkeglycolat, Amberlit, Natriumcarboxymethylcellulose, Ultramylopectin, Natriumalginat, Gelatine, Orangenschale, Säurecarboxymethylcellulose, natürlicher Schwamm und Bentonit können alle verwendet werden. Eine andere Form der Desintegratoren sind die unlöslichen kationischen Austauschharze. Pulverisierte Gummis können als Desintegratoren und als Bindemittel verwendet werden, und diese können pulverisierte Gummis, wie beispielsweise Agar, Karaya oder Tragant umfassen. Alginsäure und ihr Natriumsalz sind ebenfalls als Desintegratoren nützlich.
Bindemittel können verwendet werden, um das therapeutische Agens zusammenzuhalten, um eine harte Tablette zu bilden, und umfassen Materialien aus Naturprodukten, wie beispielsweise Acacia, Tragant, Stärke und Gelatine. Andere umfassen Methylcellulose (MC), Ethylcellulose (EC) und Carboxymethylcellulose (CMC). Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) könnten beide in alkoholischen Lösungen verwendet werden, um das Therapeutikum zu granulieren.
Es kann ein reibungsverminderndes Agens in der Formulierung des Therapeutikums umfasst sein, um das Kleben während des Formulierungsvorgangs zu verhindern. Schmiermittel können als Schicht zwischen dem Therapeutikum und der Stanzformwand verwendet werden, und diese können Stearinsäure umfassend ihre Magnesium- und Kalziumsalze, Polytetrafluoroethylen (PTFE), flüssiges Paraffin, Pflanzenöle und Wachse umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Lösliche Schmiermittel können auch verwendet werden, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat, Magnesiumlaurylsulfat, Polyethylenglycol verschiedener Molekulargewichte, Carbowax 4000 und 6000.
Es könnten Gleitmittel hinzugegeben werden, die die Fließeigenschaften des Wirkstoffs während der Formulierung verbessern und die Neuanordnung während der Komprimierung unterstützen könnten. Die Gleitmittel können Stärke, Talk, pyrogene Silicamasse und hydriertes Silicoaluminat umfassen.
Um die Auflösung der Verbindung dieser Erfindung in einer wässrigen Umgebung zu unterstützen, könnte ein oberflächenaktiver Stoff als Befeuchtungsagens hinzugegeben werden. Oberflächenaktive Stoffe können anionische Detergenzien, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsulfonat umfassen. Es könnten kationische Detergenzien verwendet werden, und diese könnten Benzalkoniumchlorid oder Benzethoniumchlorid umfassen. Die Liste potentieller nicht-ionischer Detergenzien, die in der Formulierung als oberflächenaktive Stoffe umfasst werden könnten, umfasst Lauromacrogol 400, Polyoxyl 40-Stearat, Polyoxyethylen hydriertes Castoröl 10, 50 und 60, Glycerolmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Saccharose Fettsäureester, Methylcellulose und Carboxymethylcellulose. Diese oberflächenaktiven Stoffe könnten in der Formulierung des Proteins oder Derivates entweder alleine oder in der Form einer Mischung in verschiedenen Verhältnissen vorhanden sein.
Zusatzstoffe können ebenfalls von der Formulierung umfasst sein, um die Aufnahme der Verbindung zu erhöhen. Zusatzstoffe, die diese Eigenschaft potentiell aufweisen, sind zum Beispiel die Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.
Es kann eine Formulierung mit gesteuerter Freisetzung wünschenswert sein. Die Verbindung dieser Erfindung könnte von einer inerten Matrix umfasst sein, die die Freisetzung entweder durch Diffusion oder durch Ausladungsmechanismen erlaubt, z. B. Gummis. Sich langsam zersetzende Matrizen können ebenfalls von der Formulierung umfasst sein, z. B. Alginate, Polysaccharide. Eine andere Form einer gesteuerten Freisetzung der Verbindungen dieser Erfindung ist über ein Verfahren auf der Grundlage des therapeutischen Oros-Systems (Alza Corp.), d. h. der Wirkstoff ist von einer semipermeablen Membran umgeben, die gestattet, dass Wasser eintritt und den Wirkstoff durch eine kleine einzelne Öffnung aufgrund von osmotischen Effekten herausdrückt. Auch einige enterische Beschichtungen haben die Wirkung einer verzögerten Freisetzung.
Es können andere Beschichtungen für die Formulierung verwendet werden. Diese umfassen eine Vielzahl von Zuckern, die in einer Beschichtungswanne angewendet werden könnten. Das therapeutische Agens könnte auch in einer mit einem Film beschichteten Tablette gegeben werden, und die in diesem Fall verwendeten Materialien sind in 2 Gruppen unterteilt. Die ersten sind die nicht-enterischen Materialien und umfassen Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Methylhydroxy-Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropyl-Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Providon und die Polyethylenglycole. Die zweite Gruppe besteht aus den enterischen Materialien, die üblicherweise Ester der Phthalsäure sind.
Es könnte eine Mischung von Materialien verwendet werden, um die optimale Filmbeschichtung bereitzustellen. Die Filmbeschichtung kann in einem Wannenbeschichter oder in einem Fließbett oder durch Komprimierungsbeschichtung ausgeführt werden.
Pulmonale Abgabeformen. Ebenfalls hierin vorgesehen ist die pulmonale Abgabe des vorliegenden Proteins (oder der Derivate davon). Das Protein (oder Derivat) wird an die Lungen eines Säugetieres während des Inhalieren abgegeben und durchtritt die Lungenepithelauskleidung in den Blutstrom. (Andere Berichte davon umfassen Adjei et al., Pharma Res. (1990) 7: 565–9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135–44 (Leuprolidacetat); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (Erg. bd. 5): S. 143–146 (Endothelin-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3: 206–12 (α1-Antitrypsin); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84 : 1145–6 (αl-Proteinase); Oswein et al. (März 1990), „Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (rekombinantes menschliches Wachstumshormon); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140: 3482–8 (Interferon-γ und Tumornekrosefaktor a) und Platz et al., US-Patent Nr. 5,284,656 (Granulozyten-Koloniestimulierender Faktor).
Zur Verwendung bei der Praktizierung dieser Erfindung vorgesehen ist ein weiter Bereich von mechanischen Vorrichtungen, die für die pulmonale Abgabe von therapeutischen Produkten konzipiert sind und Vernebler, Dosieraerosole und Pulverinhalatoren umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, mit all denen Fachleuten auf dem Gebiet vertraut sind. Einige spezifische Beispiele für kommerziell erhältliche Vorrichtungen, die für die Praktizierung dieser Erfindung geeignet sind, sind der Ultravent-Vernebler, hergestellt von Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; der Acorn II-Vernebler, hergestellt von Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; das Ventrolin-Dosieraerosol, hergestellt von Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; und der Spinhaler-Pulverinhalator, hergestellt von Fisons Corp., Redford, Massachusetts.
Alle solche Vorrichtungen erfordern die Verwendung von Formulierungen, die für das Abgeben der erfindungsgemäßen Verbindung geeignet sind. Typischerweise ist jede Formulierung für die verwendete Art von Vorrichtung spezifisch und kann zusätzlich zu Verdünnungsmitteln, Adjuvanzien und/oder Trägern, die für die Therapie nützlich sind, die Verwendung eines geeigneten Treibmaterials umfassen.
Die erfindungsgemäße Verbindung sollte, für die wirkungsvollste Abgabe an die distale Lunge, am vorteilhaftesten in einer partikulären Form mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von weniger als 10 μm (oder Mikronen), am bevorzugtesten 0,5 bis 5 μm, hergestellt werden.
Pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen Kohlenhydrate, wie beispielsweise Trehalose, Mannitol, Xylitol, Saccharose, Lactose und Sorbitol. Andere Inhaltsstoffe zur Verwendung in Formulierungen können DPPC, DOPE, DSPC und DOPC umfassen. Es können natürliche oder synthetische oberflächenaktive Stoffe verwendet werden. Es kann PEG verwendet werden (selbst abgesehen von seiner Verwendung beim Derivatisieren des Proteins oder Analogons). Es können Dextrane, wie beispielsweise Cyclodextran, verwendet werden. Es können Gallensalze und andere verwandte Verstärker verwendet werden. Es können Cellulose und Cellulosederivate verwendet werden. Es können Aminosäuren verwendet werden, wie beispielsweise bei der Verwendung in einer Pufferformulierung.
Es ist auch die Verwendung von Liposomen, Mikrokapseln oder Mikrosphären, Einschlusskomplexen oder anderen Arten von Trägern vorgesehen.
Zur Verwendung mit einem Vernebler geeignete Formulierungen, der entweder ein Jet- oder Ultraschall-Vernebler ist, werden typischerweise die erfindungsgemäße Verbindung umfassen, die in Wasser bei einer Konzentration von etwa 0,1 bis 25 mg biologisch aktivem Protein pro ml Lösung aufgelöst ist. Die Formulierung kann auch einen Puffer und einen einfachen Zucker umfassen (z. B. zur Proteinstabilisierung und zur Regulierung des osmotischen Drucks). Die Verneblerformulierung kann auch einen oberflächenaktiven Stoff enthalten, um die Oberflächen-induzierte Aggregation des Proteins zu verringern oder zu verhindern, die durch das Zerstäuben der Lösung bei der Bildung des Aerosols verursacht wird.
Formulierungen zur Verwendung mit einer Dosieraerosol-Vorrichtung werden im Allgemeinen ein fein zerteiltes Pulvers umfassen, das die erfindungsgemäße Verbindung mit der Hilfe eines oberflächenaktiven Stoffes suspendiert in einem Treibmittel enthält. Das Treibmittel kann ein jegliches herkömmliches Material sein, das für diesen Zweck verwendet wird, wie beispielsweise ein Fluorchlorkohlenwasserstoff, ein Hydrofluorchlorkohlenwasserstoff, ein Hydrofluorkohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoff, der Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlortetrafluorethan und 1,1,1,2-Tetrafluorethan oder Kombinationen davon umfasst. Geeignete oberflächenaktive Stoffe umfassen Sorbitantrioleat und Sojalecithin. Ölsäure kann als oberflächenaktiver Stoff ebenfalls nützlich sein.
Formulierungen zum Abgeben aus einer Pulverinhalatorvorrichtung werden einen fein zerteiltes trockenes Pulver umfassen, das die erfindungsgemäße Verbindung enthält, und können auch einen Füllstoff, wie beispielsweise Lactose, Sorbitol, Saccharose, Mannitol, Trehalose oder Xylitol in Mengen umfassen, die die Verteilung des Pulvers aus der Vorrichtung erleichtern, z. B. 50 bis 90 Gew.-% der Formulierung.
Nasale Abgabeformen. Die nasale Abgabe der erfindungsgemäßen Verbindung ist ebenfalls vorgesehen. Die nasale Abgabe erlaubt die Wanderung des Proteins zum Blutstrom direkt nach dem Verabreichen des therapeutischen Produktes an die Nase, ohne die Notwendigkeit der Ablagerung des Proteins in der Lunge. Formulierungen zur nasalen Abgabe umfassen diejenigen mit Dextran oder Cyclodextran. Die Abgabe über den Transport über andere Schleimhautmembranen ist ebenfalls vorgesehen.
Dosierungen. Das Dosierungsregime, das von einem Verfahren zum Behandeln der oben beschriebenen Zustände umfasst ist, wird durch den behandelnden Arzt bestimmt werden, der verschiedene Faktoren berücksichtigt, die die Wirkung der Wirkstoffe modifizieren, z. B. das Alter, den Zustand, das Körpergewicht, das Geschlecht und die Diät des Patienten, die Schwere einer jeglichen Infektion, die Zeit der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Im Allgemeinen sollte das tägliche Regime im Bereich von 0,1 bis 1000 Mikrogramm der erfindungsgemäßen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht liegen, bevorzugterweise im Bereich von 0,1–150 Mikrogramm pro Kilogramm.
Spezifische bevorzugte Ausführungsformen
Die Erfinder haben bevorzugte Peptidsequenzen für Moleküle bestimmt, die viele unterschiedliche Arten von Aktivität aufweisen. Die Erfinder haben weiterhin bevorzugte Strukturen dieser bevorzugten Peptide, kombiniert mit bevorzugten Linkem und Trägern, bestimmt. Bevorzugte Strukturen für diese bevorzugten Peptide sind in Tabelle 21 unten aufgeführt. Tabelle 21 – Bevorzugte Ausführungsformen

„F¹" ist eine Fc-Domäne, wie zuvor hierin definiert.

Arbeitsbeispiele
Die oben beschriebenen Verbindungen können wie unten beschrieben hergestellt werden. Diese Beispiele umfassen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und sind veranschaulichend und nicht begrenzend.
Beispiel 1
TPO-nachahmende Verbindungen
Das folgende Beispiel verwendet Peptide, die durch die in Tabelle A hiernach erscheinenden Nummern identifiziert sind.
Herstellung von Peptid 19. Peptid 17b (12 mg) und MeO-PEG-SH 5000 (30 mg, 2 Äquiv.) wurde in 1 ml wässrigem Puffer (pH 8) aufgelöst. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur etwa 30 Minuten lang inkubiert, und die Reaktion wurde durch analytische HPLC überprüft, was einen zu 80% abgeschlossenen Ablauf der Reaktion zeigte. Das pegylierte Material wurde durch präparative HPLC isoliert.
Herstellung von Peptid 20. Peptid 18 (14 mg) und MeO-PEG-Maleimid (25 mg) wurden in etwa 1,5 ml wässrigem Puffer (pH 8) aufgelöst. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur etwa 30 Minuten lang inkubiert, und nach dieser Zeit war die Umwandlung zu etwa 70% abgeschlossen, wie durch analytische HPLC durch Auftragen eines Aliquots einer Probe auf die HPLC-Säule verfolgt wurde. Das pegylierte Material wurde durch präparative HPLC aufgereinigt.
Bioaktivitätstest. Der in vitro-TPO-Biotest ist ein mitogener Test, der einen IL-3-abhängigen Klon von murinen 32D-Zellen verwendet, die mit dem menschlichen Mpl-Rezeptor transfiziert wurden. Dieser Test ist detaillierter in WO 95/26746 beschrieben. Die Zellen werden in MEM-Medium enthaltend 10% fötalen Klon II und 1 ng/ml mIL-3 gehalten. Vor der Probenzugabe werden die Zellen durch zweifaches Abwaschen mit Wachstumsmedium ohne mIL-3 vorbereitet. Eine erweiterte TPO-Standardkurve mit zwölf Punkten wird vorbereitet, die von 33 bis 39 pg/ml reicht. Vier Verdünnungen, von denen geschätzt wird, dass sie im linearen Teil der Standardkurve (100 bis 125 pg/ml) liegen, werden für jede Probe zubereitet und in dreifacher Ausführung untersucht. Ein Volumen von 100 μl jeder Probenverdünnung oder von Standard wird zu geeigneten Reaktionsnäpfen einer Mikrotiterplatte mit 96 Reaktionsnäpfen hinzugegeben, die 10000 Zellen/Reaktionsnapf enthält. Nach vierundvierzig Stunden bei 37°C und 10% CO₂ wird MTS (eine Tetrazoliumverbindung, die durch Zellen zu einem Formazan biologisch reduziert wird) zu jedem Reaktionsnapf hinzugegeben. Etwa sechs Stunden später wird die Extinktion mit einem Plattenleser bei 490 nm abgelesen. Eine Dosis-Antwort-Kurve (Log TPO-Konzentration gegen O.D.-Hintergrund) wird erzeugt, und eine lineare Regressionsanalyse wird von Punkten durchgeführt, die im linearen Teil der Standardkurve liegen. Konzentrationen von unbekannten Testproben werden unter Verwendung der sich ergebenden linearen Gleichung und einer Korrektur für den Verdünnungsfaktor bestimmt.
TMP-Tandemwiederholungen mit Polyglycin-Linkern. Unsere Konzeption von sequenziell verbundenen TMP-Wiederholungen basierte auf der Annahme, dass eine dimere Form von TMP für seine wirksame Wechselwirkung mit c-Mpl (dem TPO-Rezeptor) benötigt wurde, und dass die beiden TMP-Moleküle abhängig davon, wie sie im Zusammenhang mit dem Rezeptor gegeneinander gewunden waren, in der C- zu N-Terminus-Konfiguration auf eine Weise zusammen aneinandergehängt werden könnten, die die globale dimere Konformation nicht stören würde. Es ist klar, dass der Erfolg der Konzeption von Tandem-verbundenen Wiederholungen von der richtigen Auswahl der Länge und Zusammensetzung des Linkers abhängt, der den C- und N-Terminus der beiden sequenziell ausgerichteten TMP-Monomere verbindet. Da keine Strukturinformation zu an c-Mpl gebundenem TMP verfügbar war, wurde eine Reihe von wiederholten Peptiden mit aus 0 bis 10 und 14 Glycin-Resten zusammengesetzten Linker (Tabelle A) synthetisiert. Glycin wurde aufgrund seiner Einfachheit und Flexibilität auf der Grundlage des Grundprinzips ausgewählt, dass eine flexible Polyglycin-Peptidkette die freie Faltung der zwei aneinandergehängten TMP-Wiederholungen zur benötigten Konfirmation erlauben könnte, wohingegen andere Aminosäuresequenzen unerwünschte Sekundärstrukturen annehmen könnten, deren Starrheit die korrekte Packung des wiederholten Peptides im Rezeptorzusammenhang stören könnte.
Die sich ergebenden Peptide sind durch herkömmliche Festphasen-Peptidsyntheseverfahren leicht zugänglich (Merrifield (1963), J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149), entweder mit Fmoc- oder t-Boc-Chemie. Anders als bei der Synthese des C-terminal verbundenen parallelen Di mers, die die Verwendung eines orthogonal geschützten Lysinrestes als den anfänglichen Verzweigungspunkt erforderte, um die beiden Peptidketten in einer pseudosymmetrischen Weise aufzubauen (Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696–9), war die Synthese dieser Tandem-Wiederholungen ein unkompliziertes, schrittweises Zusammensetzen der kontinuierlichen Peptidketten von C- zum N-Terminus. Weil die Dimerisierung von TMP eine dramatischere Wirkung auf die proliferative Aktivität als auf die Bindungsaffinität aufwies, wie für das C-terminale Dimer gezeigt wurde (Cwirla et al. (1997)), wurden die synthetischen Peptide direkt auf biologische Aktivität in einem TPO-abhängigen Zell-Proliferationstest unter Verwendung eines IL-3-abhängigen Klons von murinen 32D-Zellen untersucht, die mit dem Volllängen-c-Mpl transfiziert waren (Palacios et al., Cell 41:727 (1985)). Wie die Testergebnisse zeigten, zeigten alle Polyglycin-verbundenen Tandem-Wiederholungen im Vergleich zum Monomer > 1000-fache Erhöhungen der Wirksamkeit und waren in diesem Zell-Proliferationstest sogar wirksamer als das C-terminale Dimer. Die absolute Aktivität des C-terminalen Dimers in unserem Test war niedriger als die des nativen TPO-Proteins, was sich von den zuvor veröffentlichten Erkenntnissen unterscheidet, nach denen festgestellt wurde, dass das C-terminale Dimer so aktiv wie der natürliche Ligand war (Cwirla et al. (1997)). Der Grund dafür könnten Unterschiede bei den Bedingungen sein, die in den beiden Tests verwendet wurden. Nichtsdestotrotz zeigte die Differenz der Aktivität zwischen Tandem-(C-Terminus des ersten Monomers verbunden mit dem N-Terminus des zweiten Monomers) und C-terminalen (C-Terminus des ersten Monomers verbunden mit dem C-Terminus des zweiten Monomers; auch als parallel bezeichnet) Dimeren im gleichen Test klar die Überlegenheit der Tandem-Wiederholungs-Strategie gegenüber der parallelen Peptiddimerisierung. Es ist interessant, anzumerken, dass ein großer Längenbereich durch den Linker toleriert wird. Der optimale Linker zwischen Tandempeptiden mit ausgewählten TMP-Monomeren ist anscheinend aus 8 Glycinen zusammengesetzt.
Andere Tandemwiederholungen. Nach dieser ersten Serie von TMP-Tandemwiederholungen wurden mehrere andere Moleküle, entweder mit unterschiedlichen Linker oder Modifikationen innerhalb des Monomers selbst, konzipiert. Das erste dieser Moleküle, Peptid 13, weist einen Linker auf, der aus GPNG zusammengesetzt ist, einer Sequenz, von der bekannt ist, dass sie eine hohe Neigung aufweist, eine Sekundärstruktur vom β-Turn-Typ auszubilden. Obwohl es immer noch ungefähr 100-fach wirksamer als das Monomer ist, wurde von diesem Peptid festgestellt, dass es > 10 mal weniger aktiv als das äquivalente GGGG-verlinkte Analogen war. Somit schien die Einführung eines vergleichsweise starren β-Turns an der Linkerre gion eine leichte Verdrehung der optimalen Agonistenkonformation in dieser kurzen Linkerform verursacht zu haben.
Das Trp9 in der TMP-Sequenz ist ein hochgradig konservierter Rest unter den aus Bibliotheken mit zufälligen Peptiden isolierten aktiven Peptiden. Es gibt auch ein hochgradig konserviertes Trp in den Konsensussequenzen von EPO-nachahmenden Peptiden, und von diesem Trp-Rest wurde festgestellt, dass es an der Ausbildung eines hydrophoben Kerns zwischen den beiden EMPs beteiligt war und zu hydrophoben Wechselwirkungen mit dem EPO-Rezeptor beitrug. Livnah et al. (1996), Science 273: 464–71). In analoger Weise könnte der Trp9-Rest in TMP eine ähnliche Funktion bei der Dimerisierung des Peptidliganden aufweisen, und als Versuch, die Wirkungen von nichtkovalenten hydrophoben Kräften zu modulieren und abzuschätzen, die von den beiden Indolringen ausgeübt werden, wurden mehrere Analoga hergestellt, die sich aus Mutationen am Trp ergeben. So wurde der Trp-Rest in Peptid 14 in jedem der beiden TMP-Monomere durch ein Cys ersetzt, und es wurde durch Oxidation eine intramolekulare Disulfidbindung zwischen den beiden Cysteinen ausgebildet, von der man sich vorstellte, dass sie die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den beiden Trp-Resten bei der Peptiddimerisierung nachahmen würde. Peptid 15 ist die reduzierte Form von Peptid 14. In Peptid 16 wurden die beiden Trp-Reste durch Ala ersetzt. Wie die Testdaten zeigen, waren alle drei Analoga inaktiv. Diese Daten zeigten weiterhin, dass Trp für die Aktivität des TPO-nachahmenden Peptides entscheidend ist, nicht lediglich für die Bildung des Dimers.
Die nächsten beiden Peptide (Peptid 17a und 18) enthalten in ihrem 8-Aminosäuren-Linker beide einen Lys- oder Cys-Rest. Diese beiden Verbindungen sind Vorläufer der beiden PEGylierten Peptide (Peptid 19 und 20), bei denen die Seitenkette des Lys oder Cys durch einen PEG-Teil modifiziert ist. Es wurde ein PEG-Teil in der Mitte eines vergleichsweise langen Linkers eingeführt, so dass der große PEG-Bestandteil (5 kDa) ausreichend weit von den entscheidenden Bindungsstellen im Peptidmolekül entfernt ist. PEG ist ein bekanntes biokompatibles Polymer, das zunehmend als kovalenter Modifikator verwendet wird, um die pharmakokinetischen Profile von Therapeutika auf der Grundlage von einem Peptid und Protein zu verbessern.
Es wurde ein modulares Verfahren auf der Grundlage einer Lösung für die praktische PEGylierung von synthetischen oder rekombinanten Peptiden ersonnen. Dieses Verfahren basiert auf der nun wohl etablierten chemoselektiven Ligationsstrategie, die die spezifische Reaktion zwischen einem Paar wechselseitig reaktiver Funktionalitäten verwendet. So wurde beim pegylierten Peptid 19 die Lysin-Seitenkette mit einer Bromacetylgruppe voraktiviert, um Peptid 17b zu ergeben, und es damit für die Reaktion mit einem Thiol-derivatisierten PEG anzupassen. Dazu wurde eine orthogonale Schutzgruppe, Dde, für den Schutz des Lysin-ε-Amins verwendet. Wenn die gesamte Peptidkette erst einmal zusammengesetzt war, wurde das N-terminale Amin mit t-Boc erneut geschützt. Dde wurde anschließend entfernt, um die Bromacetylierung zu gestatten. Diese Strategie ergab ein Rohpeptid von hoher Qualität, das unter Verwendung von herkömmlicher Reverse Phase-HPLC leicht aufgereinigt wurde. Die Ligation des Peptides mit dem Thiol-modifizierten PEG lief in wässrigem Puffer bei pH 8 ab, und die Reaktion war innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen. Eine MALDI-MS-Analyse des aufgereinigten, pegylierten Materials zeigte ein charakteristisches, glockenförmiges Spektrum mit einem Inkrement von 44 Da zwischen den benachbarten Peaks. Bei PEG-Peptid 20 wurde ein Cysteinrest in die Linkerregion eingesetzt, und seine Seitenketten-Thiolgruppe würde als Befestigungsstelle für ein Maleimid-haltiges PEG dienen. Es wurden ähnliche Bedingungen für die Pegylierung dieses Peptides verwendet. Wie die Testdaten zeigen, wiesen die beiden pegylierten Peptide im Vergleich zu ihren unpegylierten Gegenstücken eine noch höhere in vitro-Bioaktivität auf.
Peptid 21 weist in seinem 8-Aminosäuren-Linker ein potentielles Glykosylierungsmotiv, NGS, auf. Weil unsere beispielhaften Tandem-Wiederholungen aus natürlichen Aminosäuren hergestellt sind, die durch Peptidbindungen verbunden sind, sollte die Expression eines solchen Moleküls in einem geeigneten eukaryontischen Zellsystem ein Glykopeptid erzeugen, wobei der Kohlenhydrat-Teil zum Seitenketten-Carboxyamid von Asn hinzugefügt ist. Die Glykosylierung ist ein üblicher post-translationaler Modifikationsvorgang, der viele positive Einflüsse auf die biologische Aktivität eines gegebenen Proteins durch das Erhöhen seiner Löslichkeit in Wasser und seiner in vivo-Stabilität ausüben kann. Wie die Testdaten zeigen, erhielt der Einbau dieses Glykosylierungsmotives in den Linker eine hohe Bioaktivität. Der synthetische Vorläufer des potentiellen Glykopeptides hatte praktisch eine Aktivität, die mit der des -(G)₈-verbundenen Analogons vergleichbar war. Von diesem Peptid wird erwartet, dass es aufgrund der ähnlichen chemophysikalischen Eigenschaften, die von einem PEG- und einem Kohlenhydrat-Teil gezeigt werden, eine Aktivität in der gleichen Größenordnung wie die pegylierten Peptide aufweist, wenn es erst einmal glykosyliert ist.
Das letzte Peptid ist ein Dimer einer Tandem-Wiederholung. Es wurde durch das Oxidieren von Peptid 18 hergestellt, was eine intermolekulare Disulfidbindung zwischen den beiden am Linker angeordneten Cysteinresten ausbildete. Dieses Peptid wurde konzipiert, um auf die Möglichkeit einzugehen, dass TMP als Tetramer aktiv war. Die Testdaten zeigten, dass dieses Peptid auf einer angepassten molaren Basis nicht aktiver als eine durchschnittliche Tandemwiederholung war, was indirekt die Vorstellung stützt, dass die aktive Form von TMP tatsächlich ein Dimer ist, ansonsten würde die Dimerisierung einer Tandemwiederholung einen weiteren Einfluss auf die Bioaktivität ausüben.
Um die in vitro-Daten in Tieren zu bestätigen, wurde eine pegylierte TMP-Tandemwiederholung (Verbindung 20 in Tabelle A) subkutan über osmotische Pumpen an normale Mäuse abgegeben. Bei den Blutplättchenzahlen wurden über die Dauer der Behandlung zeit- und dosisabhängige Erhöhungen festgestellt. Am Tag 8 wurden Peak-Blutplättchenkonzentrationen über dem 4-fachen der Basislinie festgestellt. Eine Dosis von 10 μg/kg/Tag der pegylierten TMP-Wiederholung rief eine ähnliche Antwort wie (nichtpegylierter) rHuMGDF hervor, der bei 100 μg/kg/Tag über den gleichen Weg abgegeben wurde. Tabelle A – TPO-nachahmende Peptide
Diskussion. Es ist gut anerkannt, dass MGDF auf eine ähnliche Weise wie hGH wirkt, d. h. ein Molekül des Proteinliganden bindet für dessen Aktivierung an zwei Moleküle des Rezeptors. Wells et al. (1996), Ann. Rev. Biochem. 65: 609–34. Nun wird diese Wechselwirkung durch die Wirkung eines viel kleineren Peptides, TMP, nachgeahmt. Jedoch legen die vorliegenden Studien nahe, dass diese Nachahmung die konzertierte Wirkung von zwei TMP-Molekülen erfordert, da die kovalente Dimerisierung von TMP entweder auf eine C-C-parallele oder sequenzielle C-N-Art die biologische in vitro-Wirksamkeit des ursprünglichen Monomeres um einen Faktor von mehr als 10³ erhöhte. Die vergleichsweise geringe Biowirksamkeit des Monomers beruht wahrscheinlich auf der ineffizienten Bildung des nichtkovalenten Dimers. Eine vorausgebildete kovalente Wiederholung hat die Fähigkeit, die Entropie-Barriere bei der Bildung eines nichtkovalenten Dimers zu beseitigen, die ausschließlich durch schwache, nichtkovalente Wechselwirkungen zwischen zwei Molekülen des kleinen, 14-Reste-Peptides angetrieben wird.
Es ist interessant, dass dieser Tandem-Wiederholungs-Ansatz eine ähnliche Wirkung auf das Erhöhen der Bioaktivität aufwies wie die veröffentlichte C-C-Dimerisierung. Diese beiden Strategien führten zwei sehr unterschiedliche molekulare Konfigurationen herbei. Das C-C-Dimer ist ein quasi-symmetrisches Molekül, wohingegen die Tandemwiederholungen in ihren linearen Strukturen keine derartige Symmetrie aufweisen. Trotz dieses Unterschiedes zwischen ihren primären Strukturen schienen diese beiden Arten von Molekülen in der Lage zu sein, sich wirksam zu einer ähnlichen biologisch aktiven Konformation zu falten und die Dimerisierung und Aktivierung von c-Mpl zu bewirken. Diese experimentellen Beobachtungen stellen eine Reihe von Einsichten bereit, wie die beiden TMP-Moleküle miteinander bei der Bindung an c-Mpl Wechselwirken können. Zunächst müssen sich die beiden C-Termini der beiden gebundenen TMP-Moleküle in vergleichsweise großer Nähe zueinander befinden, wie durch die Daten mit dem C-terminalen Dimer nahegelegt wird. Zweitens müssen die jeweiligen N- und C-Termini der beiden TMP-Moleküle im Rezeptorkomplex ebenfalls sehr nahe zueinander ausgerichtet sein, so dass sie direkt mit einer einzelnen Peptidbindung aneinander gehängt sein können, um die durch die Tandem-Wiederholungs-Strategie herbeigeführte auf die nahezu maximale Aktivität erhöhende Wirkung zu verwirklichen. Das Einfügen von einem oder mehr als einem (bis zu 14) Glycinresten an der Kontaktstelle erhöhte (oder verringerte) die Aktivität nicht in erheblicher Weise weiter. Der Grund dafür kann in der Tatsache liegen, dass eine flexible Polyglycin-Peptidkette in der Lage ist, sich ohne das Verursachen jeglicher erheblicher Veränderungen der Gesamtkonformation leicht aus der Kontaktstelle herauszuwinden. Diese Flexibilität scheint die Orientierungsfreiheit für die TMP-Peptidketten bereitzustellen, dass sie sich beim Wechselwirken mit dem Rezeptor in die erforderliche Konformation falten und ihn als Stelle einer Modifikation validieren. Dies stützende indirekte Belege ergaben sich aus der Untersuchung von Peptid 13, bei dem eine viel starrere b-Turnausbildende Sequenz als Linker anscheinend eine Abweichung der Rückgratausrichtung um den Linker herum erzwang, die zu einer leichten Verdrehung der optimalen Konformation und auf diese Weise zu einer moderaten (10-fachen) Verringerung der Aktivität im Vergleich zu der analogen Verbindung mit einem 4-Gly-Linker geführt haben könnte. Drittens spielt Trp9 in TMP eine ähnliche Rolle wie Trp13 in EMP, das nicht nur an der Peptid-Peptid-Wechselwirkung bei der Ausbildung von Dimeren beteiligt ist, sondern auch durch das Beitragen hydrophober Kräfte bei der Peptid-Rezeptor-Wechselwirkung wichtig ist. Mit dem W zu C-Mutantenanalogon, Peptid 14, erhaltene Ergebnisse legen nahe, dass eine kovalente Disulfidverbindung nicht ausreichend ist, um sich den hydrophoben Wechselwirkungen anzunähern, die durch das Trp-Paar bereitgestellt werden, und dass sie als kurze Verbindung die beiden TMP-Monomere zu nahe zueinander bringen und dadurch die Gesamtkonformation der optimalen dimeren Struktur stören könnte.
Eine Analyse der möglichen Sekundärstruktur des TMP-Peptides kann ein weiteres Verständnis der Wechselwirkung zwischen TMP und c-Mpl bereitstellen. Dies kann durch das Bezugnehmen auf die veröffentlichte Struktur des EPO-nachahmenden Peptides erleichtert werden. Livnah et al. (1996), Science 273: 464–75. Das rezeptorgebundene EMP weist eine b-Hairpin-Struktur auf, mit einem durch das hochgradigen Konsens darstellende Gly-Pro-Leu-Thr im Zentrum ihrer Sequenz ausgebildeten b-Turn. Statt GPLT weist TMP eine hochgradig selektierte GPTL-Sequenz auf, von der wahrscheinlich ist, dass sie einen ähnlichen Turn ausbildet. Dieses Turn-artige Motiv ist in TMP jedoch nahe dem N-terminalen Teil angeordnet. Eine Voraussage der Sekundärstruktur unter Verwendung des Chau-Fasman-Verfahrens legt nahe, dass die C-terminale Hälfte des Peptides eine Neigung aufweist, eine helikale Konformation anzunehmen. Zusammen mit dem hochgradig konservierten Trp an Position 9 kann diese C-terminale Helix zur Stabilisierung der dimeren Struktur beitragen. Es ist interessant, zu bemerken, dass die meisten unserer Tandemwiederholungen wirksamer sind als das C-terminale parallele Dimer. Tandemwiederholungen geben dem Molekül anscheinend eine besser passende Konformation als es die C-C-parallele Dimerisierung tut. Das anscheinend asymmetrische Merkmal einer Tandemwiederholung könnte sie näher an den natürlichen Liganden ge bracht haben, der als asymmetrisches Molekül zwei unterschiedliche Stellen verwendet, um an zwei identische Rezeptormoleküle zu binden.
Es wurde die Einführung eines PEG-Teils ins Auge gefasst, um die in vivo-Aktivität des modifizierten Peptides durch das Bereitstellen eines Schutzes gegen einen proteolytischen Abbau und durch eine Verlangsamung seiner Klärung durch die Nierenfiltration bereitzustellen. Es war unerwartet, dass die Pegylierung die in vitro-Bioaktivität eines Tandem-wiederholten TMP-Peptides in dem zellbasierten Proliferationstest weiter erhöhen konnte.
Beispiel 2
Fc-TMP-Fusionen
TMPs (und wie in Beispiel 3 beschriebene EMPs) wurden in entweder monomerer oder dimerer Form entweder als N-terminale oder C-terminale Fusionen an die Fc-Region von menschlichem IgG1 exprimiert. In allen Fällen verwendete das Expressionskonstrukt den luxPR-Promotor im Expressionsplasmidvektor pAMG21.
Fc-TMP. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für die Fc-Region von menschlichem IgG1 codiert, die im Leserahmen an ein Monomer des TPO-nachahmenden Peptides fusioniert ist. Der pFc-A3-Vektor und ein synthetisches TMP-Gen waren die Matrizen für die PCR-Reaktionen. Das synthetische Gen wurde aus den drei überlappenden Oligonukleotiden (SEQ ID NO: 364, 365 bzw. 366) konstruiert, die unten gezeigt sind:
Diese Oligonukleotide wurden anneliert, um den Duplex auszubilden, der für eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 367 bzw. 368) codiert, die unten gezeigt ist:
Dieser Duplex wurde in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von 1842-98 und 1842-97 als Sense- und Antisense-Primer amplifiziert.
Der Fc-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit pFc-A3 unter Verwendung der unten gezeigten Primer (SEQ ID NOS: 369 und 370) erzeugt:
Die Oligonukleotide 1830-51 und 1842-98 enthalten einen Überlappungsbereich von 24 Nukleotiden, der gestattet, dass die beiden Gene im korrekten Leserahmen durch das Kombinieren der obigen PCR-Produkte in einer dritten Reaktion unter Verwendung der außenliegenden Primer 1216-52 und 1842-97 aneinanderfusioniert werden.
Das endgültige PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie für EMP-Fc hierin beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #3728 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzen (SEQ ID NO: 5 und 6) des Fusionsproteins sind in 7 gezeigt.
Fc-TMP-TMP. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für die Fc-Region von menschlichem IgG1 codiert, die im Leserahmen an ein Dimer des TPO-nachahmenden Peptides fusioniert ist. Der pFc-A3-Vektor und ein synthetisches TMP-TMP-Gen waren die Matrizen für die PCR-Reaktionen. Das synthetische Gen wurde aus den unten gezeigten 4 überlappenden Oligonukleotiden (entsprechend SEQ ID NO: 371 bis 374) konstruiert:
Die 4 Oligonukleotide wurden anneliert, um den Duplex auszubilden, der für eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 375 bzw. 376) codiert, die unten gezeigt ist:
Dieser Duplex wurde in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von 1830-52 und 1830-55 als Sense- und Antisense-Primer amplifiziert.
Der Fc-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit pFc-A3 unter Verwendung der Primer 1216-52 und 1830-51 erzeugt, wie oben für Fc-TMP beschrieben ist. Das Volllängen-Fusionsgen wurde aus einer dritten PCR-Reaktion unter Verwendung der außenliegenden Primer 1216-52 und 1830-55 erhalten.
Das endgültige PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt zu herzustellen, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #3727 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 7 und 8) des Fusionsproteins sind in 8 gezeigt.
TMP-TMP-Fc. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für eine Tandemwiederholung des TPO-nachahmenden Peptides codiert, das im Leserahmen an die Fc-Region von menschlichem IgG1 fusioniert ist. Das EMP-Fc-Plasmid aus Stamm #3688 (siehe Beispiel 3) und ein synthetisches, für das TMP-Dimer codierendes Gen waren die Matrizen für die PCR-Reaktionen. Das synthetische Gen für die Tandemwiederholung wurde aus den unten gezeigten 7 überlappenden Oligonuldeotiden (entsprechend SEQ ID NO: 377 bis 383) konstruiert:
Diese Oligonukleotide wurden anneliert, um den gezeigten Duplex auszubilden, der für eine unten gezeigte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 384 und 385) codiert:
Dieser Duplex wurde in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von 1885-52 und 1885-58 als Sense- und Antisense-Primer amplifiziert.
Der Fc-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit DNA aus dem EMP-Fc-Fusionsstamm #3688 (siehe Beispiel 3) unter Verwendung der Primer 1885-54 und 1200-54 erzeugt. Das Volllängen-Fusionsgen wurde in einer dritten PCR-Reaktion unter Verwendung der außenliegenden Primer 1885-52 und 1200-54 erzeugt.
Das endgültige PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie hierin für Fc-EMP beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon ausgewählt und als Amgen-Stamm #3798 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 9 und 10) des Fusionsproteins sind in 9 gezeigt.
TMP-Fc. Es wurde bei der Ligation in TMP-TMP-Fc zufällig eine DNA-Sequenz erhalten, die für ein Monomer des TPO-nachahmenden Peptides codiert, das im Leserahmen an die Fc-Region von menschlichem IgG1 fusioniert ist, vermutlich aufgrund der Fähigkeit von Primer 1885-54, an 1885-53 wie auch an 1885-58 zu annelieren. Es wurde ein einzelner Klon, der die korrekte Nuldeotidsequenz für das TMP-Fc-Konstrukt aufwies, ausgewählt und als Amgen-Stamm #3788 bezeichnet.
Die Nuldeotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 11 und 12) des Fusionsproteins sind in 10 gezeigt.
Expression in E. coli. Kulturen von jedem der pAMG21-Fc-Fusionskonstrukte in E. coli GM221 wurden bei 37°C in Luria Broth-Medium, einschließlich 50 mg/ml Kanamycin, wachsen gelassen. Die Induktion der Expression des Genproduktes aus dem luxPR-Promotor wurde nach der Zugabe des synthetischen Autoinduktors N-(3-Oxohexanoyl)-DL-Homoserinlacton zu dem Kulturmedium in einer Endkonzentration von 20 ng/ml erreicht. Die Kulturen wurden weitere 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach 3 Stunden wurden die bakteriellen Kulturen durch Mikroskopie auf die Anwesenheit von Einschlusskörpern untersucht und anschließend durch Zentrifugation gewonnen. In induzierten Kulturen wurden refraktile Einschlusskörper beobachtet, was anzeigt, dass die Fc-Fusionen am wahrscheinlichsten in der unlöslichen Fraktion in E. coli produziert wurden. Die Zellpellets wurden direkt durch erneute Suspension in Laemmli-Probenpuffer lysiert, der 10% b-Mercaptoethanol enthielt, und wurden durch SDS-PAGE analysiert. In jedem Fall wurde auf einem SDS-PAGE-Gel eine intensive Coomassie-gefärbte Bande des passenden Molekulargewichts beobachtet.
pAMG21. Das Expressionsplasmid pAMG21 kann vom Amgen-Expressionsvektor pCFM1656 (ATCC #69576) abgeleitet werden, der wiederum von dem Amgen-Expressionsvektorsystem abgeleitet werden kann, das in US-Patent Nr. 4,710,473 beschrieben ist. Das Plasmid pCFM1656 kann von dem beschriebenen Plasmid pCFM836 ( Patent Nr. 4,710,473 ) abgeleitet werden, durch:

(a) Zerstören der beiden endogenen NdeI-Restriktionsstellen durch Endenauffüllung mit T4-Polymerase-Enzym, gefolgt von der Ligation mit glatten Enden;
(b) Ersetzen der DNA-Sequenz zwischen den sonst nicht vorkommenden AatII- und ClaI-Restriktionsschnittstellen, die den synthetischen P_L-Promotor enthalten, durch ein ähnliches Fragment, das aus pCFM636 ( Patent Nr. 4,710,473 ) erhalten wurde, der den PL-Promotor (siehe SEQ ID NO: 386 unten) enthält; und
(c) Ersetzen der kleinen DNA-Sequenz zwischen den sonst nicht vorkommenden ClaI- und KpnI-Restriktionsschnittstellen durch das Oligonuldeotid, das die Sequenz von SEQ ID NO: 388 aufweist.

Das Expressionsplasmid pAMG21 kann anschließend von pCFM1656 durch das Herstellen einer Reihe von ortsgerichteten Basenänderungen durch PCR-Mutagenese mit überlappenden Oligos und durch DNA-Sequenz-Substitutionen abgeleitet werden. Ausgehend von der BglII-Stelle (Plasmid bp # 180) unmittelbar 5' zum Plasmid-Replikationspromotor
und fortschreitend in Richtung der Plasmid-Replikationsgene, sind die Basenpaaränderungen wie in Tabelle B unten gezeigt. Tabelle B – Basenpaaränderungen, die zu pAMG21 führen
Die DNA-Sequenz zwischen den sonst nicht vorkommenden AatII- (Position #4364 in pCFM1656) und SacII- (Position #4585 in pCFM1656) Restriktionsschnittstellen wird durch die DNA-Sequenz (SEQ IDNO: 23) ersetzt, die in den 17A und 17B gezeigt ist. Während der Ligation der klebrigen Enden dieser Substitution-DNA-Sequenz werden die außenliegenden AatII- und SacII-Schnittstellen zerstört. In der substituierten DNA sind sonst nicht vorkommende AatII- und SacII-Schnittstellen vorhanden.
GM221 (Amgen #2596). Der Amgen-Wirtsstamm #2596 ist ein K-12-E. coli-Stamm, der von Amgen-Stamm #393 abgeleitet ist. Er wurde modifiziert, um sowohl den temperaturempfindlichen Lambda-Repressor cI857s7 in der frühen ebg-Region als auch den lacI^Q-Repressor in der späten ebg-Region (68 Minuten) zu enthalten. Die Anwesenheit dieser beiden Repressorgene erlaubt die Verwendung dieses Wirtes mit einer Vielzahl von Expressionssystemen, beide dieser Repressoren sind für die Expression aus luxP_R jedoch irrelevant. Der untransformierte Wirt weist keine Resistenzen gegen Antibiotika auf.
Die Ribosomen-Bindestelle des cI857s7-Gens wurde derart modifiziert, dass sie eine verstärkte RBS enthält. Sie wurde in das ebg-Operon zwischen Nukleotidposition 1170 und 1411, wie in Genbank-Zugangsnummer M64441Gb_Ba nummeriert, unter Deletion der intervenierenden ebg-Sequenz eingefügt. Die Sequenz der Einfügung ist unten gezeigt, wobei kleingeschriebene Buchstaben die ebg-Sequenzen darstellen, die die unten gezeigte Einfügung (SEQ IDNO: 388) flankieren:
Das Konstrukt wurde an das Chromosom unter Verwendung eines rekombinanten Phagen abgegeben, der als MMebg-cI7857s7 enhanced RBS #4 in F'tet/393 bezeichnet wurde. Nach der Rekombination und Auflösung verbleibt nur die oben beschriebene chromosomale Einfügung in der Zelle. Sie wurde zu F'tet/GM101 umbenannt. F'tet/GM101 wurde dann durch die Abgabe eines lacI^Q-Konstruktes in das ebg-Operon zwischen Nukleotidposition 2493 und 2937, wie in Genbank-Zugangsnummer M64441Gb_Ba nummeriert, unter Deletion der intervenierenden ebg-Sequenz modifiziert. Die Sequenz der Einfügung ist unten gezeigt, wobei die kleingeschriebenen Buchstaben die ebg-Sequenzen darstellen, die die unten gezeigte Einfügung (SEQ ID NO: 389) flankieren:
Das Konstrukt wurde an das Chromosom unter Verwendung eines rekombinanten Phagen abgegeben, der als AGebg-LacIQ#5 in F'tet/GM101 bezeichnet wurde. Nach der Rekombination und Auflösung verbleibt nur die oben beschriebene chromosomale Einfügung in der Zelle. Sie wurde zu F'tet/GM221 umbenannt. Das F'tet-Episom wurde aus dem Stamm unter Verwendung von Acridin Orange bei einer Konzentration von 25 μg/ml in LB entfernt. Der Stamm mit der Entfernung wurde als Tetracyclin-empfindlich identifiziert und als GM221 gelagert.
Expression. Kulturen von pAMG21-Fc-TMP-TMP in E. coli GM221 in Luria Broth-Medium, einschließlich 50 μg/ml Kanamycin wurden, vor der Induktion bei 37°C inkubiert. Die Induktion der Expression des Fc-TMP-TMP-Genproduktes aus dem luxPR-Promotor wurde nach der Zugabe des synthetischen Autoinduktors N-(3-Oxohexanoyl)-DL-Homoserinlacton zu den Kulturmedien in einer Endkonzentration von 20 ng/ml erreicht, und die Kulturen wurden weitere 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach 3 Stunden wurden die bakteriellen Kulturen durch Mikroskopie auf die Anwesenheit von Einschlusskörpern untersucht und dann durch Zentrifugation gewonnen. In induzierten Kulturen wurden refraktile Einschlusskörper beobachtet, was anzeigt, dass das Fc-TMP-TMP am wahrscheinlichsten in der unlöslichen Fraktion in E. coli produziert wurde. Die Zellpellets wurden direkt durch erneute Suspension in Laemmli-Probenpuffer einschließlich 10% •-Mercaptoethanol lysiert und durch SDS-PAGE analysiert. Auf einem SDS-PAGE-Gel wurde eine intensive Coomassie-gefärbte Bande von etwa 30 kDa beobachtet. Das erwartete Genprodukt würde eine Länge von 269 Aminosäuren und ein erwartetes Molekulargewicht von etwa 29,5 kDa aufweisen. Die Fermentation wurde auch unter den Bedingungen des Standard-Labormaßstabs im Maßstab von 10 L durchgeführt, was hinsichtlich des Fc-TMP-TMP zu ähnlichen Expressionsmengen führte wie denjenigen, die im Labormaßstab erhalten wurden.
Aufreinigung von Fc-TMP-TMP. Die Zellen werden in Wasser (1/10) durch Hochdruck-Homogenisierung (2 Durchgänge bei 14000 PSI) aufgebrochen, und die Einschlusskörper werden durch Zentrifugation (4200 UPM in J-6B 1 Stunde lang) geerntet. Die Einschlusskörper werden in 6 M Guanidin, 50 mM Tris, 8 mM DTT, pH 8,7 1 Stunde lang bei einem Verhältnis von 1/10 solubilisiert. Die solubilisierte Mischung wird 20-fach in 2 M Harnstoff, 50 mM Tris, 160 mM Arginin, 3 mM Cystein, pH 8,5 verdünnt. Die Mischung wird über Nacht in der Kälte gerührt und dann durch Ultrafiltration etwa 10-fach konzentriert. Sie wⁱrd anschließend 3-fach mit 10 mM Tris, 1,5 M Harnstoff, pH 9, verdünnt. Der pH dieser Mischung wird anschließend mit Essigsäure auf pH 5 eingestellt. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wird auf eine SP-Sepharose-Fast-Flow-Säule geladen, die in 20 mM NaAc, 100 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml Proteinladung, Raumtemperatur) äquilibriert ist. Das Protein wird unter Verwendung eines 20-Säulenvolumen-Gradienten im gleichen Puffer eluiert, der von 100 mM NaCl bis 500 mM NaCl reicht. Die vereinigten Fraktionen von der Säule werden 3-fach verdünnt und auf eine SP-Sepharose-HP-Säule in 20 mM NaAc, 150 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml Proteinladung, Raumtemperatur) geladen. Das Protein wird unter Verwendung eines 20 Säulenvolumen-Gradienten im gleichen Puffer eluiert, der von 150 mM NaCl bis 400 mM NaCl reicht. Der Peak wird vereinigt und filtriert.
Charakterisierung der Fc-TMP-Aktivität. Das Folgende ist eine Zusammenfassung der in vivo-Daten aus Mäusen mit verschiedenen Verbindungen dieser Erfindung.

Mäuse: Normale weibliche BDF1, im Alter von etwa 10–12 Wochen.

Blutabnahmeplan: Zehn Mäuse pro Gruppe, behandelt am Tag 0, zwei Gruppen begannen 4 Tage versetzt bei einer Gesamtheit von 20 Mäusen pro Gruppe. Zu jedem Zeitpunkt wurde fünf Mäusen Blut abgenommen, Mäusen wurde minimal dreimal pro Woche Blut abgenommen. Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt, und ein Gesamtvolumen von 140–160 μl Blut wurde durch Punktur des orbitalen Sinus erhalten. Das Blut wurde auf einem Technicon H1E-Blutanalysator gezählt, auf dem Software für murines Blut lief. Die gemessenen Parameter waren weiße Blutzellen, rote Blutzellen, Hämatokrit, Hämoglobin, Blutplättchen, Neutrophile.
Behandlungen: Die Mäuse erhielten entweder bei einer Bolus-Behandlung eine subkutane Injektion, oder ihnen wurden mikroosmotische 7-Tage-Pumpen für eine kontinuierliche Abgabe implantiert. Subkutane Injektionen wurden in einem Volumen von 0,2 ml abgegeben. Osmotische Pumpen wurden in einem subkutanen Einschnitt eingesetzt, der zwischen den Schulterblättern von betäubten Mäusen in die Haut gemacht wurde. Die Verbindungen wurden in PBS mit 0,1% BSA verdünnt. Alle Experimente umfassten eine Kontrollgruppe, die als „Träger" markiert und nur mit diesem Verdünnungsmittel behandelt wurde. Die Konzentration der Testartikel in den Pumpen wurde derart angepasst, dass die kalibrierte Fließgeschwindigkeit aus den Pumpen die in den Kurven angegebenen Behandlungsmengen ergab.
Verbindungen: Eine Dosis-Titration der Verbindung wurde an die Mäuse in mikroosmotischen 7-Tage-Pumpen abgegeben. Die Mäuse wurden mit verschiedenen Verbindungen mit einer Einzeldosis von 100 μg/kg in osmotischen 7-Tage-Pumpen behandelt. Einige der gleichen Verbindungen wurden an Mäuse anschließend als einzelne Bolusinjektion gegeben.
Ergebnisse des Aktivitätstests: Die Ergebnisse der Aktivitätsexperimente sind in den 11 und 12 gezeigt. Bei Dosis-Antwort-Tests unter Verwendung der mikroosmotischen 7-Tage-Pumpen wurde die maximale Wirkung mit der Verbindung von SEQ ID NO: 18 bei 100 μg/kg/Tag festgestellt; die 10 μg/kg/Tag-Dosis zeigte etwa 50% der maximalen Aktivität, und 1 μg/kg/Tag war die niedrigste Dosis, bei der in diesem Testsystem eine Aktivität festgestellt werden konnte. Die Verbindung war bei der 10 μg/kg/Tag-Dosis etwa gleich aktiv wie 100 μg/kg/Tag unpegyliertes rHu-MGDF im gleichen Experiment.
Beispiel 3
Fc-EMP-Fusionen
Fc-EMP. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für die Fc-Region von menschlichem IgG1 codiert, die im Leserahmen an ein Monomer des EPO-nachahmenden Peptides fusioniert ist. Ein Vektor, der die Fc-Sequenz enthält (pFc-A3, beschrieben in der Internationalen Anmeldung WO 97/23614 , veröffentlicht am 3. Juli 1997), und ein synthetisches, für das EPO-Monomer codierendes Gen waren die Matrizen für die PCR-Reaktionen. Das synthetische Gen für das Monomer wurde aus den 4 überlappenden Oligonukleotiden (entsprechend SEQ ID NO: 390 bis 393) konstruiert, die unten gezeigt sind:
Die 4 Oligonukleotide wurden anneliert, um den Duplex auszubilden, der für eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 394 bzw. 395) codiert, die unten gezeigt ist:
Dieser Duplex wurde in einer PCR unter Verwendung von
als Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID NO: 396 bzw. 397) amplifiziert.
Der Fc-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit pFc-A3 unter Verwendung der Primer
erzeugt, die SEQ ID NO: 369 bzw. 399 sind. Die Oligonukleotide 1798-17 und 1798-18 enthalten einen Überlappungsbereich von 61 Nukleotiden, der erlaubt, dass die beiden Gene im korrekten Leserahmen durch das Kombinieren der obigen PCR-Produkte in einer dritten Reaktion unter Verwendung der außenliegenden Primer 1216-52 und 1798-19 aneinanderfusioniert werden.
Das endgültige PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI verdaut und dann in den ebenfalls mit XbaI und BamHI verdauten Vektor pAMG21 (unten beschrieben) ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente Wirtszellen des E. coli-Stammes 2596 (GM221, hierin beschrieben) transformiert. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #3718 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des sich ergebenden Fusionsproteins (SEQ ID NO: 15 und 16) sind in 13 gezeigt.
EMP-Fc. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für ein Monomer des EPO-nachahmenden Peptides codiert, das im Leserahmen an die Fc-Region von menschlichem IgG fusioniert ist. Der pFC-A3a-Vektor und ein synthetisches, für ein EPO-Monomer codierendes Gen waren die Matrizen für die PCR-Reaktion. Das synthetische Gen für das Monomer wurde aus den 4 überlappenden Oligonukleotiden 1798-4 und 1798-5 (oben) und 1798-6 und 1798-7 (SEQ ID NO: 400 bzw. 401) konstruiert, die unten gezeigt sind:
Die 4 Oligonukleotide wurden anneliert, um den Duplex auszubilden, der für eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 402 bzw. 403) codiert, die unten gezeigt ist:
Dieser Duplex wurde in eine PCR-Reaktion unter Verwendung von
als Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID NO: 404 bzw. 405) amplifiziert.
Der Fc-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit pFc-A3 unter Verwendung der Primer
und
erzeugt, die SEQ ID NO: 406 bzw. 407 sind. Die Oligonuldeotide 1798-22 und 1798-23 enthalten eine Überlappungsbereich von 43 Nuldeotiden, der erlaubt, dass die beiden Gene im korrekten Leserahmen durch das Kombinieren der obigen PCR-Produkte in einer dritten Reaktion unter Verwendung der außenliegenden Primer 1787-21 und 1200-54 aneinanderfusioniert werden.
Das endgültige PCR-Produkt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI verdaut, und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie oben beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #3688 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 17 und 18) des sich ergebenden Fusionsproteins sind in 14 gezeigt.
EMP-EMP-Fc. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für ein Dimer des EPO-nachahmenden Peptides codiert, das im Leserahmen an die Fc-Region von menschlichem IgG1 fusioniert ist. Das EMP-Fc-Plasmid aus Stamm #3688 oben und ein synthetisches, für das EPO-Dimer codierendes Gen waren die Matrizen für die PCR-Reaktion. Das synthetische Gen für das Dimer wurde aus den 8 überlappenden Oligonukleotiden (entsprechend SEQ ID NO: 408 bis 415) konstruiert, die unten gezeigt sind:
Die 8 Oligonukleotide wurden anneliert, um den Duplex auszubilden, der eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 416 bzw. 417) codiert, die unten gezeigt ist:
Dieser Duplex wurde in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von 1869-23 und 1871-79 (oben gezeigt) als Sense- und Antisense-Primer amplifiziert.
Der Fc-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit DNA des Stammes 3688 unter Verwendung der Primer 1798-23 und 1200-54 (oben gezeigt) erzeugt.
Die Oligonukleotide 1871-79 und 1798-23 enthalten einen Überlappungsbereich von 31 Nukleotiden, der erlaubt, dass die beiden Gene im korrekten Leserahmen durch das Kombi nieren der obigen PCR-Produkte in einer dritten Reaktion unter Verwendung der außenliegenden Primer 1869-23 und 1200-54 aneinanderfusioniert werden.
Das endgültige PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie für Fc-EMP beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #3813 bezeichnet.
Die Nuldeotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 19 bzw. 20) des sich ergebenden Fusionsproteins sind in 15 gezeigt. Es gibt an der Position 145 eine stille Mutation (A zu G, in Fettdruck gezeigt), so dass das endgültige Konstrukt eine andere Nukleotidsequenz aufweist als das Oligonukleotid 1871-72, von dem es abgeleitet ist.
Fc-EMP-EMP. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für die Fc-Region von menschlichem IgG1 codiert, die im Leserahmen an ein Dimer des EPO-nachahmenden Peptides fusioniert ist. Die Plasmide aus den Stämmen 3688 und 3813 oben waren die Matrizen für die PCR-Reaktionen.
Der Fc-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit DNA des Stammes 3688 unter Verwendung der Primer 1216-52 und 1798-17 (oben gezeigt) erzeugt. Der EMP-Dimer-Teil des Moleküls war das Produkt einer zweiten PCR-Reaktion mit DNA des Stammes 3813 unter Verwendung der Primer 1798-18 (ebenfalls oben gezeigt) und SEQ ID NO: 418, die unten gezeigt ist:
Die Oligonukleotide 1798-17 und 1798-18 enthalten einen Überlappungsbereich von 61 Nukleotiden, der erlaubt, dass die beiden Gene im korrekten Leserahmen durch das Kombinieren der obigen PCR-Produkte in einer dritten Reaktion unter Verwendung der außenliegenden Primer 1216-52 und 1798-20 aneinanderfusioniert werden.
Das endgültige PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kom petente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie oben für Fc-EMP beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt zu produzieren, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #3822 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 21 bzw. 22) des Fusionsproteins sind in 16 gezeigt.
Charakterisierung der Fc-EMP-Aktivität. Die Charakterisierung wurde wie folgt in vivo ausgeführt.

Mäuse: Normale weibliche BDF1, im Alter von etwa 10–12 Wochen.

Blutabnahmeplan: Zehn Mäuse pro Gruppe, behandelt am Tag 0, zwei Gruppen begannen 4 Tage versetzt bei einer Gesamtheit von 20 Mäusen pro Gruppe. Zu jedem Zeitpunkt wurde fünf Mäusen Blut abgenommen, Mäusen wurde maximal dreimal pro Woche Blut abgenommen. Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt, und ein Gesamtvolumen von 140–160 ml Blut wurde durch Punktur des orbitalen Sinus erhalten. Das Blut wurde auf einem Technicon H1E-Blutanalysator gezählt, auf dem Software für murines Blut lief. Die gemessenen Parameter waren WBC, RBC, HCT, HGB, PLT, NEUT, LYMPH.
Behandlungen: Die Mäuse erhielten entweder bei einer Bolusinjektion eine subkutane Injektion, oder ihnen wurden mikroosmotische 7-Tage-Pumpen für eine kontinuierliche Abgabe implantiert. Subkutane Injektionen wurden in einem Volumen von 0,2 ml abgegeben. Osmotische Pumpen wurden in einen subkutanen Einschnitt eingesetzt, der zwischen den Schulterblättern von betäubten Mäusen in die Haut gemacht wurde. Die Verbindungen wurden in PBS mit 0,1% BSA verdünnt. Alle Experimente umfassten eine Kontrollgruppe, die als „Träger" markiert und nur mit diesem Verdünnungsmittel behandelt wurde. Die Konzentration der Testartikel in den Pumpen wurde derart angepasst, dass die kalibrierte Fließgeschwindigkeit aus den Pumpen die in den Kurven angegebenen Behandlungsmengen ergab.
Experimente: Verschiedene Fc-konjugierte EPO-nachahmende Peptide (EMPs) wurden an Mäuse in der Form einer einzelnen Bolusinjektion bei einer Dosis von 100 μg/kg abgegeben. Die Fc-EMPs wurden an Mäuse in mikroosmotischen 7-Tage-Pumpen abgegeben. Die Pum pen wurden am Ende der 7 Tage nicht ersetzt. Den Mäusen wurde bis zum Tag 51, an dem HGB und HCT zu den Basislinienkonzentrationen zurückkehrten, Blut abgenommen.
Beispiel 4
TNF-α-Inhibitoren
Fc-TNF-α-Inhibitoren. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für die Fc-Region von menschlichem IgG1 codiert, die im Leserahmen an ein Monomer des TNF-α-inhibitorischen Peptides fusioniert ist. Der Fc- und 5-Glycin-Linkerteil des Moleküls wurde in einer PCR mit DNA aus dem Fc-EMP-Fusionsstamm #3718 (siehe Beispiel 3) unter Verwendung des Sense-Primers 1216-52 und des Antisense-Primers 2295-89 (SEQ ID NO: 369 bzw. 1112) erzeugt. Die für das TNF-α-inhibitorische Peptid codierenden Nukleotide wurden durch den unten gezeigten PCR-Primer 2295-89 bereitgestellt:
Das Oligonukleotid 2295-89 überlappt mit dem Glycin-Linker- und Fc-Teil der Matrize über 22 Nuldeotide, wobei die PCR dazu führt, dass die zwei Gene im korrekten Leserahmen aneinanderfusioniert sind.
Das PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie für EMP-Fc hierin beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt zu produzieren, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #4544 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 1055 und 1056) des Fusionsproteins sind in den 19A und 19B gezeigt.
TNF-α-Inhibitor-Fc. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für ein TNF-α-inhibitorisches Peptid codiert, das im Leserahmen an die Fc-Region von menschlichem IgG1 fusioniert ist. Ein Plasmid, das ein unverwandtes Peptid enthält, welches über einen fünf Glycin-Linker an Fc fusioniert ist, war die Matrize für die PCR-Reaktion. Die für das TNF-α-inhibitorische Peptid codierenden Nukleotide wurden durch den Sense-PCR-Primer 2295-88 bereitgestellt, wobei Primer 1200-54 als der Antisense-Primer (SEQ ID NO: 1117 bzw. 407) diente. Die Primersequenzen sind unten gezeigt:
Das Oligonukleotid 2295-88 überlappt mit dem Glycin-Linker und dem Fc-Teil der Matrize über 24 Nukleotide, wobei die PCR dazu führt, dass zwei Gene im korrekten Leserahmen aneinanderfusioniert sind.
Das PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie hierin für EMP-Fc beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #4543 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 1057 und 1058) des Fusionsproteins sind in den 20A und 20B gezeigt.
Expression in E. coli. Kulturen von jedem der pAMG21-Fc-Fusionskonstrukte in E. coli GM221 wurden bei 37°C in Luria Broth-Medium, einschließlich 50 mg/ml Kanamycin, wachsen gelassen. Die Induktion der Expression des Genproduktes aus dem luxPR-Promotor wurde nach der Zugabe des synthetischen Autoinduktors N-(3-Oxohexanoyl)-DL-Homoserinlacton zu den Kulturmedien in einer Endkonzentration von 20 ng/ml erreicht. Die Kulturen wurden weitere 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach 3 Stunden wurden die bakteriellen Kulturen durch Mikroskopie auf die Anwesenheit von Einschlusskörpern untersucht und anschließend durch Zentrifugation gewonnen. In induzierten Kulturen wurden refraktile Einschlusskörper beobachtet, was anzeigt, dass die Fc-Fusionen am wahrscheinlichsten in der unlöslichen Fraktion in E. coli produziert wurden. Die Zellpellets wurden direkt durch erneute Suspension in Laemmli-Probenpuffer, einschließlich 10% β-Mercaptoethanol, lysiert und durch SDS-PAGE analysiert. In jedem Fall wurde auf einem SDS-PAGE-Gel eine intensive Coomassie-gefärbte Bande des passenden Molekulargewichts beobachtet.
Aufreinigung von Fc-Peptid-Fusionsproteinen. Die Zellen werden in Wasser (1/10) durch Hochdruck-Homogenisierung (2 Durchgänge bei 14000 PSI) aufgebrochen, und die Einschlusskörper werden durch Zentrifugation (4200 UPM in J-6B 1 Stunde lang) geerntet. Die Einschlusskörper werden in 6 M Guanidin, 50 mM Tris, 8 mM DTT, pH 8,7 bei einem Verhältnis von 1/10 1 Stunde lang solubilisiert. Die solubilisierte Mischung wird 20-fach in 2 M Harnstoff, 50 mM Tris, 160 mM Arginin, 3 mM Cystein, pH 8,5, verdünnt. Die Mischung wird über Nacht in der Kälte gerührt und dann durch Ultrafiltration etwa 10-fach konzentriert. Sie wird anschließend 3-fach mit 10 mM Tris, 1,5 M Harnstoff, pH 9, verdünnt. Der pH dieser Mischung wird dann mit Essigsäure auf pH 5 eingestellt. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wird auf eine SP-Sepharose-Fast-Flow-Säule geladen, die in 20 mM NaAc, 100 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml Proteinladung, Raumtemperatur) äquilibriert ist. Das Protein wird von der Säule unter Verwendung eines 20-Säulenvolumen-Gradienten im gleichen Puffer eluiert, der von 100 mM NaCl bis 500 mM NaCl reicht. Die vereinigten Fraktionen von der Säule werden 3-fach verdünnt und auf eine SP-Sepharose-HP-Säule in 20 mM NaAc, 150 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml Proteinladung, Raumtemperatur) geladen. Das Protein wird unter Verwendung eines 20-Säulenvolumen-Gradienten im gleichen Puffer eluiert, der von 150 mM NaCl bis 400 mM NaCl reicht. Der Peak wird vereinigt und filtriert.
Charakterisierung der Aktivität von Fc-TNF-α-Inhibitor und TNF-α-Inhibitor-Fc. Die Bindung dieser Peptid-Fusionsproteine an TNF-α kann durch BIAcore durch Verfahren charakterisiert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, der mit den Lehren der vorliegenden Beschreibung ausgerüstet ist.
Beispiel 5
IL-1-Antagonisten
Fc-IL-1-Antagonist. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für die Fc-Region von menschlichem IgG1 codiert, die im Leserahmen an ein Monomer eines IL-1-Antagonist-Peptids fusioniert ist. Der Fc- und 5-Glycin-Linker-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit DNA aus dem Fc-EMP-Fusions-Stamm #3718 (siehe Beispiel 3) unter Verwendung des Sense-Primers 1216-52 und des Antisense-Primers 2269-70 (SEQ ID NO: 369 bzw. 1118) erzeugt. Die für das IL-1-Antagonist-Peptid codierenden Nukleotide wurden durch den unten gezeigten PCR-Primer 2269-70 bereitgestellt:
Das Oligonukleotid 2269-70 überlappt mit dem Glycin-Linker- und Fc-Teil der Matrize über 22 Nukleotide, wobei die PCR dazu führt, dass zwei Gene im korrekten Leserahmen aneinanderfusioniert sind.
Das PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie hierin für EMP-Fc beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #4506 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 1059 und 1060) des Fusionsproteins sind in den 21A und 21B gezeigt.
IL-1-Antagonist-Fc. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für ein IL-1-Antagonist-Peptid codiert, das im Leserahmen an die Fc-Region eines menschlichen IgG1 fusioniert ist. Ein Plasmid, das ein unverwandtes Peptid enthält, das über einen fünf Glycin-Linker an Fc fusioniert ist, war die Matrize für die PCR-Reaktion. Die für das IL-1-Antagonist-Peptid codierenden Nukleotide wurden durch den Sense-PCR-Primer 2269-69 bereitgestellt, wobei der Primer 1200-54 als Antisense-Primer (SEQ ID NO: 1119 bzw. 407) diente. Die Primersequenzen sind unten gezeigt:
Das Oligonukleotid 2269-69 überlappt mit dem Glycin-Linker- und Fc-Teil der Matrize über 24 Nukleotide, wobei die PCR dazu führt, dass zwei Gene im korrekten Leserahmen aneinander fusioniert sind.
Das PCR-Genprodukt (das Volllangen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie hierin für EMP-Fc beschrieben ist. Die Klone wurden auf ihre Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #4505 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 1061 und 1062) des Fusionsproteins sind in den 22A und 22B gezeigt. Die Expression und Aufreinigung wurden wie in den vorherigen Beispielen ausgeführt.

Charakterisierung der Aktivität des Fc-IL-1-Antagonist-Peptides und der Aktivität von IL-1-Antagonist-Peptid-Fc. Die IL-1-Rezeptorbindungs-Kompetition zwischen IL-1β, IL-1RA und Fc-konjugierten IL-1-Peptidsequenzen wurde unter Verwendung des IGEN-Systems ausgeführt. Die Reaktionen enthielten 0,4 nM Biotin-IL-1R + 15 nM IL-1-TAG + 3 uM konkurrierende Substanz + 20 ug/ml Streptavidin-Konjugat-Kügelchen, wobei die konkurrierenden Substanzen IL-1RA, Fc-IL-1-Antagonist, IL-1-Antagonist-Fc waren). Die Kompetition wurde über einen Bereich von Konzentrationen der konkurrierenden Substanzen von 3 uM bis 1,5 pM getestet. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle C gezeigt: Tabelle C – Ergebnisse des IL-1-Rezeptorbindungs-Kompetitionstests

	IL-1pep-Fc	Fc-IL-1pep	IL-1ra
KI	281,5	59,58	1,405
EC50	530,0	112,20	2,645
95% Vertrauensbereiche
EC50	280,2 bis 1002	54,75 bis 229,8	1,149 bis 6,086
KI	148,9 bis 532,5	29,08 bis 122,1	0,6106 bis 3,233
Güte der Anpassung
R²	0,9790	0,9687	0,9602

Beispiel 6
VEGF-Antagonisten
Fc-VEGF-Antagonist. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für die Fc-Region von menschlichem IgG1 codiert, die im Leserahmen an ein Monomer des VEGF-nachahmenden Peptides fusioniert ist. Das pFc-A3-Plasmid und ein synthetisches Gen eines VEGF-nachahmenden Peptides waren die Matrizen für die PCR-Reaktion. Das synthetische Gen wurde durch das Annelieren der folgenden zwei Oligonuldeotidprimer (SEQ ID NO: 1110 bzw. 1111) zusammengesetzt:
Die beiden Oligonukleotide annelieren, um den folgenden Duplex auszubilden, der für eine unten gezeigte Aminosäuresequenz codiert (SEQ ID NO: 1113 und 1114):
Dieser Duplex wurde in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von 2293-05 und 2293-06 als Sense- und Antisense-Primer amplifiziert (SEQ ID NO: 1111 und 1112).
Der Fc-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit dem pFc-A3-Plasmid unter Verwendung der Primer 2293-03 und 2293-04 als Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID NOs: 1120 bzw. 1121) erzeugt. Das Volllängen-Fusionsgen wurde aus einer dritten PCR-Reaktion unter Verwendung der außenliegenden Primer 2293-03 und 2293-06 (SEQ ID NO 1112) erhalten. Diese Primer sind unten gezeigt:
Das PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie es hierin für EMP-Fc beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #4523 bezeichnet.
Die Nuldeotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 1063 und 1064) des Fusionsproteins sind in den 23A und 23B gezeigt.
VEGF-Antagonist-Fc. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für ein VEGF-nachahmendes Peptid codiert, das im Leserahmen an die Fc-Region von menschlichem IgG1 fusioniert ist. Das pFc-A3-Plasmid und das oben beschriebene synthetische Gen des VEGF-nachahmenden Peptides waren die Matrizen für die PCR-Reaktion. Der synthetische Duplex wurde in einer PCR-Reaktion unter Verwen dung von 2293-07 und 2293-08 als Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID NO: 1124 bzw. 1125) amplifiziert.
Der Fc-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit dem pFc-A3-Plasmid unter Verwendung der Primer 2293-09 und 2293-10 als Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID NO: 1126 bzw. 1127) erzeugt. Das Volllangen-Fusionsgen wurde aus einer dritten PCR-Reaktion unter Verwendung der außenliegenden Primer 2293-07 und 2293-10 erhalten. Diese Primer sind unten gezeigt:
Das PCR-Genprodukt (das Volllängen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie hierin für EMP-Fc beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #4524 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 1065 und 1066) des Fusionsproteins sind in den 24A und 24B gezeigt. Die Expression und Aufreinigung wurden wie in den vorherigen Beispielen ausgeführt.
Beispiel 7
MMP-Inhibitoren
Fc-MMP-Inhibitor. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für die Fc-Region von menschlichem IgG1 codiert, das im Leserahmen an ein Monomer eines MMP-inhibitorischen Peptides fusioniert ist. Der Fc- und 5- Glycin-Linkerteil des Moleküls wurden in einer PCR-Reaktion mit DNA von dem Fc-TNF-α-Inhibitor-Fusionsstamm #4544 (siehe Beispiel 4) unter Verwendung des Sense-Primers 1216-52 und des Antisense-Primers 2308-67 (SEQ ID NO: 369 bzw. 1115) erzeugt. Die für das MMP-Inhibitor-Peptid codierenden Nuldeotide wurden durch den unten gezeigten PCR-Primer 2308-67 bereitgestellt:
Das Oligonukleotid 2308-67 überlappt mit dem Glycin-Linker- und dem Fc-Teil der Matrize über 22 Nukleotide, wobei die PCR dazu führt, dass die beiden Gene im korrekten Leserahmen aneinander fusioniert sind.
Das PCR-Genprodukt (das Volllangen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie hierin für EMP-Fc beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nuldeotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #4597 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 1067 und 1068) des Fusionsproteins sind in den 25A und 25B gezeigt. Die Expression und Aufreinigung wurden wie in den vorherigen Beispielen ausgeführt.
MMP-Inhibitor-Fc. Es wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie eine DNA-Sequenz konstruiert, die für ein MMP-inhibitorisches Peptid codiert, das im Leserahmen an die Fc-Region von menschlichem IgG1 fusioniert ist. Der Fc- und 5-Glycin-Linkerteil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit DNA aus dem Fc-TNF-α-Inhibitor-Fusionsstamm #4543 (siehe Beispiel 4) erzeugt. Die für das MMP-inhibitorische Peptid codierenden Nukleotide wurden durch den Sense-PCR-Primer 2308-66 bereitgestellt, wobei der Primer 1200-54 als der Antisense-Primer (SEQ ID NO: 1116 bzw. 407) diente. Die Primersequenzen sind unten gezeigt:
Das Oligonukleotid 2269-69 überlappt mit dem Glycin-Linker- und Fc-Teil der Matrize über 24 Nukleotide, wobei die PCR dazu führt, dass die beiden Gene im korrekten Leserahmen zusammen aneinander fusioniert sind.
Das PCR-Genprodukt (das Volllangen-Fusionsgen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 ligiert und in kompetente Zellen des E. coli-Stammes 2596 transformiert, wie hierin für EMP-Fe beschrieben ist. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen, und darauf, ob sie die Genfusion besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Es wurde ein einzelner derartiger Klon selektiert und als Amgen-Stamm #4598 bezeichnet.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 1069 und 1070) des Fusionsproteins sind in den 26A und 26B gezeigt.
Die Erfindung ist nun vollständig beschrieben, es wird für einen Fachmann auf dem Gebiet offenkundig sein, dass daran viele Veränderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne den Geist und Umfang der Erfindung, wie hierin dargestellt, zu verlassen.
Abkürzungen
Die in dieser Beschreibung durchgehend verwendeten Abkürzungen sind wie unten definiert, wenn sie nicht in spezifischen Fällen anders definiert sind.

Ac: Acetyl (verwendet, um acetylierte Reste zu bezeichnen)
AcBpa: acetyliertes p-Benzoyl-L-phenylalanin
ADCC: Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität
Aib: Aminoisobutansäure
bA: beta-Alanin
Bpa: p-Benzoyl-L-phenylalanin
BrAc: Bromacetyl (BrCH₂C(O))
BSA: Rinder-Serumalbumin
Bzl: Benzyl
Cap: Capronsäure
CTL: Cytotoxische T-Lymphozyten
CTLA4: Cytotoxische T-Lymphozyten-Antigen 4
DARC: Duffy-Blutgruppen-Antigenrezeptor
DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
Dde: 1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxo-cyclohexyliden)ethyl
EMP: Erythropoietin-nachahmendes Peptid
ESI-MS: Elektronenspray-Ionisierungs-Massenspektrometrie
EPO: Erythropoietin
Fmoc: Fluorenylmethoxycarbonyl
G-CSF: Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor
GH: Wachstumshormon
HCT: Hämatokrit
HGB: Hämoglobin
hGH: Menschliches Wachstumshormon
HOBt: 1-Hydroxybenzotriazol
HPLC: Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie
IL: Interleukin
IL-R: Interleukin-Rezeptor
IL-1R: Interleukin-1-Rezeptor
IL-1ra: Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist
Lau: Laurinsäure
LPS: Lipopolysaccharid
LYMPH: Lymphozyten
MALDI-MS: Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisierungs-Massenspektrometrie
Me: Methyl
MeO: Methoxy
MHC: Haupt-Histokompatibilitätskomplex
MMP: Matrix-Metalloproteinase
MMPI: Matrix-Metalloproteinase-Inhibitor
1-Nap: 1-Naphthylalanin
NEUT: Neutrophile
NGF: Nervenwachstumsfaktor
Nle: Norleucin
NMP: N-Methyl-2-pyrrolidon
PAGE: Polyacrylamidgelelektrophorese
PBS: Phosphat-gepufferte Saline
Pbf: 2,2,4,6,7-Pendamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
PCR: Polymerase-Kettenreaktion
Pec: Pipecolinsäure
PEG: Poly(ethylenglycol)
pGlu: Pyroglutaminsäure
Pic: Picolinsäure
PLT: Blutplättchen
pY: Phosphotyrosin
RBC: rote Blutzellen
RBS: Ribosomen-Bindestelle
RT: Raumtemperatur (25°C)
Sar: Sarcosin
SDS: Natriumdodecylsulfat
STK: Serin-Threonin-Kinasen
t-Boc: tert-Butoxycarbonyl
tBu: tert-Butyl
TGF: Gewebewachstumsfaktor
THF: humoraler Thymus-Faktor
TK: Tyrosinkinase
TMP: Thrombopoietin-nachahmendes Peptid
TNF: Gewebe-Nekrosefaktor
TPO: Thrombopoietin
TRAIL: TNF-verwandter Apoptose-induzierender Ligand
Trt: Trityl
UK: Urokinase
UKR: Urokinase-Rezeptor
VEGF: vaskulärer endothelialer Zellwachstumsfaktor
VIP: vasoaktives intestinales Peptid
WBC: weiße Blutzellen

Claims

Stoffzusammensetzung der Formel (X1)a F1-(X2)b und Multimere davon, wobei: F¹ eine Fc-Domäne ist; X¹ und X² jeweils unabhängig aus -(L¹)_c-P¹, -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P², -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_e-P³ und -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_e-P³-(L⁴)_f-P⁴ ausgewählt sind; P¹, P², P³ und P⁴ jeweils unabhängig randomisierte Sequenzen pharmakologisch aktiver Peptide sind; L¹, L², L³ und L⁴ jeweils unabhängige Linker sind; und a, b, c, d, e und f jeweils unabhängig 0 oder 1 sind, vorausgesetzt, dass wenigstens a oder b 1 ist, und wobei „Peptid" Moleküle mit 2 bis 40 Aminosäuren bezeichnet, und wobei weder X¹ noch X² ein natives Protein ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1 mit der Formel X¹-F¹ oder F¹-X².
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1 mit der Formel F¹-(L¹)_c-P¹.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1 mit der Formel F¹-(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P².
Stoffzusammensetzung nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 4, wobei F¹ eine IgG-Fc-Domäne ist.
Stoffzusammensetzung nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 4, wobei F¹ eine IgG1-Fc-Domäne ist.
Stoffzusammensetzung nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 4, wobei F¹ die Sequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Stoffzusammensetzung nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 7, wobei P¹, P², P³ und P⁴ jeweils unabhängig randomisierte IL-1-Antagonist-Peptidsequenzen sind.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die IL-1-Antagonist-Peptidsequenz aus den SEQ ID NOs: 212, 907, 908, 909, 910, 917 und 979 ausgewählt ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die IL-1-Antagonist-Peptidsequenz aus den SEQ ID NOs: 213 bis 271, 671 bis 906, 911 bis 916 und 918 bis 1023 ausgewählt ist.
Stoffzusammensetzung nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 7, wobei P¹, P², P³ und P⁴ jeweils unabhängig randomisierte EPO-nachahmende Peptidsequenzen sind.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die EPO-nachahmende Peptidsequenz aus Tabelle 5 ausgewählt ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 11, die eine aus den SEQ ID NOs: 83, 84, 85, 124, 419, 420, 421 und 461 ausgewählte Sequenz umfasst.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 11, die eine aus den SEQ ID NOs: 339 und 340 ausgewählte Sequenz umfasst.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 11, die eine aus den SEQ ID NOs: 20 und 22 ausgewählte Sequenz umfasst.
Stoffzusammensetzung nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 7, wobei P¹, P², P³ und P⁴ jeweils unabhängig randomisierte TPO-nachahmende Peptidsequenzen sind.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die TPO-nachahmende Peptidsequenz aus Tabelle 6 ausgewählt ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 16, die eine aus den SEQ ID NOs: 6 und 12 ausgewählte Sequenz aufweist.
Stoffzusammensetzung nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 7, wobei P¹, P², P³ und P⁴ jeweils unabhängig randomisierte TNF-Antagonist-Peptidsequenzen sind.
Stoffzusammensetzung nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 7, wobei P¹, P², P³ und P⁴ jeweils unabhängig randomisierte GCSF-nachahmende Peptidsequenzen sind.
DNA, die für eine Stoffzusammensetzung nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 20 kodiert.
Expressionsvektor, der die DNA nach Anspruch 21 umfasst.
Wirtszelle, die den Expressionsvektor nach Anspruch 22 umfasst.
Zelle nach Anspruch 23, wobei die Zelle eine E. coli-Zelle ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Stoffzusammensetzung nach einem jeden der Ansprüche 1 bis 20 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, Lösungsverbesserer, Emulgierungsmittel, Adjuvans und/oder Träger umfasst.
Stoffzusammensetzung gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 20 zur Verwendung als therapeutisches oder prophylaktisches Agens.
Verfahren zum Herstellen einer pharmakologisch aktiven Verbindung, das a) Auswählen wenigstens eines randomisierten Peptides, das die Aktivität eines interessierenden Proteins moduliert; und b) Herstellen eines pharmakologischen Agens, das wenigstens eine Fc-Domäne umfasst, die kovalent mit wenigstens einer Aminosäuresequenz des ausgewählten Peptides oder der ausgewählten Peptide verbunden ist, umfasst, wobei „Peptid" Moleküle mit 2 bis 40 Aminosäuren bezeichnet.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Peptid in einem Verfahren ausgewählt wird, das Screenen einer Phage-Display-Bibliothek, einer E. coli-Display-Bibliothek, einer ribosomalen Bibliothek oder einer chemischen Peptidbibliothek umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Peptid ein randomisiertes EPO-nachahmendes Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Peptid ein randomisiertes TPO-nachahmendes Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Peptid ein randomisiertes IL-1-Antagonist-Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Peptid ein randomisiertes GCSF-nachahmendes Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Peptid ein randomisiertes TNF-Antagonist-Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Peptid aus den Tabellen 4 bis 20 ausgewählt ist.
Verfahren nach einem jeden der Ansprüche 27 bis 34, wobei die hergestellte Verbindung die Formel (X¹)_a-F¹-(X²)_b und Multimere davon aufweist, wobei: F¹ eine Fc-Domäne ist; X¹ und X² jeweils unabhängig aus -(L¹)_c-P¹, -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P², -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_e-P³ und -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_eP³-(L⁴)_fP⁴ ausgewählt sind; P¹, P², P³ und P⁴ jeweils unabhängig randomisierte Sequenzen pharmakologisch aktiver Peptide sind; L¹, L², L³ und L⁴ jeweils unabhängige Linker sind; und a, b, c, d, e und f jeweils unabhängig 0 oder 1 sind, vorausgesetzt, dass wenigstens a oder b 1 ist, und wobei weder X¹ noch X² ein natives Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die hergestellte Verbindung die Formeln X¹-F¹ oder F¹-X² aufweist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die hergestellte Verbindung die Formeln F¹-(L¹)_c-P¹ oder F¹-(L¹)_c-P¹-(L)² _d-P² aufweist.
Verfahren nach einem jeden der Ansprüche 27 bis 37, wobei F¹ eine IgG-Fc-Domäne ist.
Verfahren nach einem jeden der Ansprüche 27 bis 37, wobei F¹ eine IgG1-Fc-Domäne ist.
Verfahren nach einem jeden der Ansprüche 27 bis 37, wobei F¹ die Sequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.