EP0751827B1 - Verfahren zur bearbeitung von nukleinsäuren - Google Patents

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EP0751827B1
EP0751827B1 EP95913132A EP95913132A EP0751827B1 EP 0751827 B1 EP0751827 B1 EP 0751827B1 EP 95913132 A EP95913132 A EP 95913132A EP 95913132 A EP95913132 A EP 95913132A EP 0751827 B1 EP0751827 B1 EP 0751827B1
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EP
European Patent Office
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temperature
nucleic acids
processing
reaction mixture
amplification
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
EP95913132A
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English (en)
French (fr)
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EP0751827A1 (de
Inventor
Wolf Bertling
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Boehringer Mannheim GmbH
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Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
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Publication of EP0751827B1 publication Critical patent/EP0751827B1/de
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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples

Definitions

  • the invention relates to methods for processing nucleic acids by means of a temperature control element and devices and devices for performing of these procedures.
  • nucleic acids are known as e.g. B. very specific detection means for organisms well suited for the diagnosis of diseases. During these verification procedures are various processing steps, such as denaturation, hybridization, syntheses and Immobilization of nucleic acids and their enzymatic treatment are common. A The problem with such methods has long been the small amount of nucleic acids in the samples.
  • capillary PCR tries to remedy this. Is located the reaction mixture in glass capillaries with a small diameter. This can the time for performing an amplification sequence can be reduced to approximately 30 minutes.
  • a problem with capillary PCR is the vulnerability of the glass to be heated the capillary and the difficult to handle sample application.
  • the object of the present invention was, inter alia, the existing nucleic acid processing methods to improve and in particular to provide processes where the amplification can be completed in particular in time.
  • the invention therefore relates to a method for processing and in particular Worship of nucleic acids in a reaction mixture, characterized in that that the temperature of a surface adjacent to the reaction mixture and its immediate environment is regulated, however, the main space of the reaction mixture remains essentially isothermal.
  • the invention also relates to a device for processing and multiplication of nucleic acids with a temperature regulation element as well as a device, which contains this device.
  • nucleic acids are all types of modified nucleic acids or unmodified.
  • unmodified nucleic acids are natural occurring nucleic acids.
  • Modified nucleic acids can be exchanged by Groups of natural nucleic acids are created by other chemical residues. Examples are nucleic acid phosphonates, or phosphothioates and on the sugar residues or the bases modified by chemical groups, which can also be detectable Nucleic acids.
  • the processing of nucleic acids according to the present invention preferably contains at least one at elevated temperature, but at least from the ambient temperature deviating temperature, ongoing reaction step.
  • Such reaction steps are, for example, the thermal denaturation of partially or completely double-stranded nucleic acids. It is used to manufacture single strands or to Melt secondary structures, the nucleic acids to temperatures above the corresponding melting point heated.
  • Another step in the processing of nucleic acids is the hybridization of mutually complementary nucleic acids in single-stranded Areas to a nucleic acid duplex (hybrid). This takes place at Temperatures below the melting point of the hybrid take place. Hybridization To achieve this, the reaction mixture must often be cooled will.
  • Another one is used in particular in amplification or sequencing methods Processing step carried out, namely the extension of one to one so-called template nucleic acid (template) hybridized primers with the help of others Mono- or oligonucleotides.
  • the temperature is preferably set at the corresponding enzyme used has its optimum activity, or competitive reactions are reduced. This temperature can also be measured with the hybridization temperature be identical (2-stage PCR).
  • a special case of processing nucleic acids is the multiplication of nucleic acids.
  • practically all amplification methods e.g. B. target sequence dependent amplifications (especially non-isothermal Amplifications such as the polymerase chain reaction, ligase chain reaction or similar) be performed. Also takes place during this propagation process at least one of the temperature-sensitive processing steps mentioned above take place.
  • a central feature of the present invention is the fact that the change in Temperature not in the entire reaction mixture, but only in a very small one Part of the reaction mixture takes place. This has the consequence that the heating or Cooling down of this relatively small area can happen very quickly and thus the Processing of the nucleic acids is greatly accelerated.
  • the process is therefore the reaction mixture with a temperature adjustable Brought into contact. By changing the temperature of the surface the immediate surroundings of this surface are heated, adjusted or cooled, depending on the processing step and temperature of the reaction mixture. One can distinguish several cases here.
  • the surface can be cooled to to achieve hybridization of the nucleic acids in the adjacent environment.
  • the surface and thus the immediate surroundings can initially are heated to a temperature at which the extension of the primer takes place can.
  • the temperature can then be raised above the melting point of the nucleic acids be, thereby denaturing and strand separation of the double-stranded Nucleic acids can take place.
  • This can be a cooling down to a Connect the temperature at which the single strands can hybridize with new primers. This cycle can be run through several times.
  • the temperature at the Surface initially raised to separate double strands. Then the Temperature lowered to a temperature at which the single strands hybridize with primers. The optimum temperature for the extension is then set, if desired the cycle repeats.
  • the desired temperature can be maintained for a set period of time be, e.g. B. until the desired reactions on the surface expired are.
  • the temperature of the surface can also be controlled by known means and connected control measures (reheating, cooling) kept constant will.
  • the periods depend, as is customary in known methods, on the length of the to be processed nucleic acids and their homology as well as the special hybridization conditions from. However, the person skilled in the art can determine the optimum by simple experiments Determine time periods. Depending on the processing step, the periods are between Fractions of a second and a few seconds.
  • the main space of the reaction mixture remains in the essential isothermal, while that in the immediate vicinity of the surface Adapts reaction mixture to the temperatures set on the surface.
  • the heating element preferably has a relatively large surface area in comparison low heat capacity.
  • Metal foils for example, have proven suitable proven that can be heated in a suitable manner, e.g. B. by electrical Electricity. Materials for the metal foil are good heat-conducting materials, e.g. B. Gold, preferred.
  • the cooling element should have a comparatively high heat capacity.
  • a cooling medium solid, liquid or gaseous substances are possible. Liquid ones are preferred Cooling media, e.g. B. water. Good thermal conductivity is an advantage.
  • the arrangement of the heating element and the cooling element can correspond to the temperature of the reaction medium are changed, depending on whether the device is more used to heat or cool the surface and its immediate surroundings shall be. In general, however, the heating element is in close proximity be localized on the surface.
  • the surface of the heating element can also directly on the Adjacent reaction mixture. However, it is also possible to use a heating element separate the thin, thermally conductive layer from the reaction mixture.
  • the cooling element can in principle be positioned at any point with which cooling the surface and the immediate vicinity is possible. It has been preferred however, the cooling element was found to be on the side of the reaction mixture remote from the reaction mixture Position heating element. In the event that the heating element is low Has heat capacity is the fact that the heating element can also be cooled must not be a decisive disadvantage.
  • the heating element is used for heating until the surface and its immediate surroundings are heated to the desired temperature.
  • a strong temperature gradient will form near the surface, while the rest of the reaction mixture remains isothermal. This applies in particular if no remarkable liquid exchange is realized during the heating process, but also if a liquid exchange takes place.
  • the heating process can be completed within fractions of a second, in favorable cases even milliseconds. The same applies to cooling.
  • the reaction space, which is heated to the desired temperature can be very small, preferably it is less than 0.2 mm, particularly preferably less than 0.5 ⁇ m deep.
  • the area of the heating element directed onto the reaction mixture influences the depth of the temperature gradient and its rate of build-up. A preferred size of the surface can result from the desired applications of the method.
  • the surface area is ⁇ 2 cm 2 , particularly preferably between 0.2 cm 2 and 0.2 mm 2 .
  • the surface can be smooth or rough. In the event that the surface is simultaneously used as a carrier for agents for processing the nucleic acids, it is advantageous to enlarge this surface by means of surface structures.
  • the volume of the reaction mixture is practically not great for the invention Meaning. It can be a drop with a volume of 20 ⁇ l, however can also be an arbitrarily large volume. It is an advantage of the invention Process that the device containing the heating and cooling element, for example can also be introduced into a large vessel with reaction mixture, whereby the essential reactions only in a very small border area of the surface take place, while the remaining reaction space practically no influence on the reaction exercises. On the other hand, the samples and reagent quantities available are practical Limit the size of the reaction mixture.
  • the reaction volumes will increase therefore usually in a range between 1 ml and 30 ul, preferably between 100 ul and 50 ⁇ l, move, but can be done, for example, by applying the reaction mixture work on the temperature regulating surface even with much smaller volumes.
  • nucleic acids are attached to the temperature-adjustable surface or their immediate surroundings. This can be done in several ways happen, for example mechanically or by diffusion.
  • nucleic acids to be processed are bound to the surface
  • Oligonucleotides that are covalently bound to the surface and at least one Part of the nucleic acid to be processed are complementary. These oligonucleotides can, however, also via biospecific interactions, e.g. B. biotin streptavidin the surface be bound.
  • the binding of the nucleic acids to be processed is in accordance with the present invention preferably reversible.
  • the nucleic acids can be carried out according to one of the methods Process dependent time by heating the surface and its immediate surroundings to be released again. Between binding and releasing the nucleic acid any steps can be taken, e.g. B. carrying out chemical reactions, however, a separation of the bound nucleic acids from the original one Reaction mixture and transfer to a new reaction mixture.
  • nucleic acids In the event of a multiplication reaction of the nucleic acids, they can surface bound oligonucleotides as primers for elongation or extension under Use of the nucleic acid to be processed can be used as a template. Thereby an extended primer forms which is bound to the nucleic acid to be processed.
  • the Nucleic acid used as a template can be removed from the Extension product can be solved and in the next temperature cycle for one new, not yet extended immobilized primers act as a template. On this way it is possible to have a large amount of surface immobilized To extend primers and thus copies of parts of the nucleic acid to be processed to manufacture.
  • the extended (extended) surface primers in turn serve by means of complementary primers for an increase in those serving as a template Molecules.
  • the reagents required for the reactions to be carried out are in keep the entire reaction mixture in stock or add it as needed.
  • a propagation reaction based on the principle of the polymerase reaction (EP-B-0 201 184) are therefore the deoxyribonucleotides, a DNA polymerase and a to keep additional primers and suitable buffer reagents in the reaction mixture.
  • a propagation reaction based on the principle of the polymerase reaction EP-B-0 201 184
  • the deoxyribonucleotides e.g. RNA
  • a DNA polymerase e.g. RNA
  • RNA-dependent polymerases e.g. Ribonucleotides or RNA-dependent polymerases are provided. This step of the process can take special consideration of the working temperature of the processing enzyme to take.
  • nucleic acids to be processed can also be done using physical methods be bound to the surface, e.g. B. by means of a magnet. To do this, the However, nucleic acids are bound to a magnetizable particle.
  • the connection magnetic particles loaded with nucleic acid can thereby be made reversible that there is a magnet behind the surface or that it is induced. By Applying an alternating field can cause the magnetic parts to surface bound or removed from it.
  • thermostable polymerase is not essential for a multiplication reaction required and yet new enzyme does not have to be added to every amplification cycle Pipette reaction mixture.
  • nucleic acids can either be bound to the surface Condition or in the released state examined or with others Reagents are processed.
  • the surface to which the oligonucleotides functioning as primers are formed are brought into contact with the sample liquid. After that the Brought the temperature of the surface and its immediate surroundings to a temperature which is above the melting point of the double-stranded contained in the sample Nucleic acid. After cooling the surface and the immediate area the nucleic acid to be detected will hybridize with the oligonucleotide.
  • the cycle is carried out with the aid of the nucleic acid to be detected made a variety of copies that were sent to the end of the propagation reaction Surface can remain bound.
  • the invention also relates to a device which can be used for use in the above-mentioned machining method.
  • the subject of the invention is a device for processing nucleic acids by means of a temperature regulating element, this element being suitable for regulating the temperature of the surface and the immediately adjacent surroundings, and wherein means for processing the nucleic acids can be bound to this.
  • These agents can be oligonucleotides and serve, for example, as primers.
  • This device preferably contains a cooling element and a heating element, the arrangement preferably being as in the processing method described above.
  • This device is preferably very small. For example, it can have a thickness of ⁇ 5 mm and an area of ⁇ 10 cm 2 .
  • the elements therein are simple components. Therefore, this device is excellently suitable for single use (disposable), which can reduce the inherent contamination risk for reusable. If the device is to be suitable for multiple use, it is also possible to separate the heating element from the space containing the reaction mixture by means of a very thin component and to make this component separable from the device. A new component can then be used for a further processing stage.
  • the invention also relates to a device for processing nucleic acids, which is a control element for a time-dependent temperature regulation and an inventive one Includes device.
  • the control element can be a control element so-called thermal cyclers according to EP-A-0 236 069 are used, is preferred however, control based on the principle of inkjet printers, since it has a higher Show control speed.
  • the control must be able to Heat the heating element at predetermined intervals until the surroundings of the Surface has a sufficient temperature.
  • it must be able to the cooling element at predetermined intervals for cooling on the surface
  • a coolant can be passed through the device Provided that the heat capacity of the heating element is low, but the heat output is relatively high, continuous cooling is also possible.
  • the surface to be tempered is in a different version on a preferably black base, preferably a plastic film, the from the surface to be tempered distal side by a laser beam, preferably an infrared laser.
  • a laser beam preferably an infrared laser.
  • Both the surface to be tempered, as well as the heat absorbing and heat conductive material a support surface, preferably infrared-transmissive glass.
  • the device according to the invention can have a wide variety of embodiments. For example it can be designed for immersion in a vessel. However, it can also be designed so that the liquid containing the nucleic acid to be processed on the Dripped surface or poured into a vessel formed by the surface This reaction space can also be closed after the liquid has been poured in so that contamination problems can be reduced.
  • One embodiment of the invention is a method for multiplying nucleic acids.
  • This method can also be used to isolate nucleic acids from a solution to convince another. Then a hybridization takes place in the first vessel (lower Temperature) and a denaturation (higher temperature) takes place in the second vessel.
  • Another embodiment of the present invention is a sequencing method of nucleic acids.
  • One way of applying the invention in context with sequence analysis is the so-called mini-sequence analysis. It can in each case the exact sequence determination of the nucleic acid nucleotide adjoining the primer be carried out by providing for sequencing in the solution only dideoxynucleotides and no deoxynucleotides for sequencing be added.
  • the four possible dideoxynucleotides ddATP, ddCTP, ddGTP and ddTTP are labeled with different fluorescent markers.
  • the incorporation of the next nucleotide leads to the termination of the sequence reaction and after purification of the extended primer located on the surface can analyze the sequence of the on the primer by analyzing the specific fluorescence Nucleotides can be determined.
  • a special case of the possibilities of using the present invention is a Procedure for sequencing nucleic acids previously in a PCR reaction have been amplified. After amplification, the increased product lies above the Primer covalently bound in double-stranded form on the reactive surface. By briefly going through an altitude temperature phase, this is denatured Single-stranded amplificate can be obtained by transferring it to a washing solution clean and is then again by transferring this time to a sequencing reaction can be used for subsequent sequencing.
  • This sequencing is particularly successful efficient, since there is now only single-stranded matrix material to which one Bind sequencing pair particularly efficiently. Due to the sequencing reaction then again a double-stranded molecule whose labeled (sequenced) Half is now available for analysis by gel chromatography. When using different labeled dideoxynucleotides (labeled with different fluorescent markers) all four reactions necessary for a sequence analysis can be Perform once, with the conventional method, this analysis must be done four times be repeated.
  • An exemplary cyclic gold surface can be obtained in that in a thin circuit board, two approx. 1 mm wide and 3 mm long slots at a distance of 3 mm parallel to each other.
  • these elongated holes are through Evaporating with gold conductively connected.
  • the gold layer on the proximal side is applied by a mask in the desired size, in this case 3 x 3 mm flush, over the two longitudinal surfaces is applied.
  • the inside of the longitudinal surface is galvanically flush to the surface coated with copper.
  • the two electrically conductive elongated holes are now coated with a gold layer a few ⁇ m thick. The coating process is described below:
  • the multi-gold sports plate was coated with "diluted" biotinthiol binding layers to form a hydrophobic SAM layer.
  • biotin thiol compound H-C12-DADOO-biotin; N, N '- (12-mercaptododecylyl-biotinylyl) -2,2'-diaminooethyl-glycol diether; 2.94 mg; 5x1 0-5 m
  • the diluent (12-mercaptoundecanol, 9.2 mg, 4.5x10 -4 m) were dissolved in 100 ml of ethanol pa
  • the freshly coated polycarbonate films were immersed in this solution. After 4 hours the plates were removed, washed twice with ethanol pa and immediately coated with streptavidin.
  • the gold spots and the SAM-coated foils were immersed in a streptavidin solution for one hour (concentration streptavidin: 0.5 mg / ml in 0.05 M potassium phosphate buffer pH 7.2).
  • concentration streptavidin 0.5 mg / ml in 0.05 M potassium phosphate buffer pH 7.2.
  • the surfaces treated in this way were then treated with a washing solution (50 mM potassium phosphate buffer pH 7.2, 2% sucrose, 0.9% NaCl, 0.3% bovine serum albumin fraction II) and then dried for 20 hours (25 ° C. and 40% atmospheric humidity).
  • the very thin thickness of the gold layer results in a very small conductive gold cross section (3 mm x 3 ⁇ m over a distance of 3 mm). This gold layer therefore represents a relatively high resistance compared to the conductor tracks.
  • the conductor tracks are now connected to a power supplier that is computer-based allows a control of the ohmic induced temperature of the surface of the oil.
  • the covering layer which isolates the measuring meander from platinum, one generally available on the market Platinum temperature sensor (PT 100) coated with a gold layer.
  • Platinum temperature sensor PT 100 coated with a gold layer.
  • PT 100 Platinum temperature sensor coated with a gold layer.
  • PT 100 Platinum temperature sensor coated with a gold layer.
  • An exemplary device for measuring the surface temperature of the gold foil (Option A).
  • a gold foil according to Example 1, variant a is covered with a mask that Evaporation of the gold foil with an approx. 1 mm wide gold thread that runs over this gold surface protrudes and can be connected to a measuring point.
  • a second thread e.g. B. made of nickel, bismuth or another alloy suitable for temperature measurement is also provided.
  • the metal thread lies on the same place on the gold surface as the gold thread at (200 nm thick), but separates in its course when leaving the tempering gold surface and leads as a separate metal thread (300 nm thick) a second measuring point.
  • This arrangement of the measuring probes made of gold and another, metal or alloy suitable for temperature measurement allows the measurement of Thermal voltage (2.2 mV / 100 ° Kalvin) in the area of the gold foil where the two Probe threads overlap.
  • the temperature at the cold junction is measured with a thermal precision PT 1000 element (accuracy> 1%) and standardized to 10 V (0 V corresponds to 0 °, 10 V corresponds to 100 °), only amplified and also standardized to 10 V.
  • the sum of both is in a sum amplifier Temperauren formed and for electronic control of the respective surface temperature used.
  • An exemplary device for measuring the surface temperature of the gold surface from example 1, variant b.
  • An exemplary implementation of a polymerase chain reaction uses a surface-fixed, biotin-labeled primer (5'-GAAGGGAGGAAGGAGGGAGCGGAC-3 ').
  • This primer is coupled to a surface streptavidin or gold streptavidin surface via its biotin group located at the 5 'end.
  • the molar amount of streptavidin or biotin / square millimeter is approximately 0.2 pmol / mm 2 .
  • the solution contains nanogram quantities or less of the following double or single-stranded template molecule and a counter primer in the concentration of between 0.5 ⁇ M to 2 ⁇ M.
  • the reaction takes place in commercially available PCR buffer (Boehringer Mannheim, package insert for enzyme 8th entry, ID number 1146165) at 1.5 mM Mg 2+ .
  • a commercially available Taq DNA polymerase (Boehringer Mannheim, ID number 1146165) was used as the polymerase in a concentration of 20 nM.
  • the counterprimer present in solution (5'-GGGTGGGGTGGTTGGGTGGTGGTG-3 ') was digoxigen-labeled at its 5' end (patent EP 0324474).
  • the PCR reaction took place at a constant solution temperature of 68 ° and one between 96 and 68 ° cyclically varying primer-coated surface instead.
  • the Cyclical duration of the higher temperature varied between in our example 0.1 seconds, 10 seconds and 1 minute that the lower temperature between 0.5 seconds, 20 seconds and 1 minute.
  • the solution was cooled to room temperature, only the complementary elongated biotin and elongated digoxigenin-labeled primers hybridizing with one another and forming double-stranded DNA fragments.
  • the surfaces were reacted with anti-Dig-POD, incubated for 30 minutes, washed again and treated with ABTS (staining protocol according to package insert item 3 for the Boehringer Mannheim reverse transcriptase assay, non-radioactive, ID number 1468120).
  • ABTS staining protocol according to package insert item 3 for the Boehringer Mannheim reverse transcriptase assay, non-radioactive, ID number 1468120.
  • the resulting colored product was quantified in an ELISA photometer at a wavelength of 405/490 nanometers.
  • the extinction values obtained demonstrate an amplification of a region of the template, measured as an extended counterprimer, which hybridizes to the primer coupled to the solid phase.
  • the values were 0.04 after correction of the blank value, and in controls without polymerase or without increasing the temperature, the values were 0.07 in the complete reaction mixture. Even heating the surface for several minutes (5 minutes) did not raise the ambient temperature in the constant temperature solution by more than 7 C, even if a significantly (100 times) larger surface (3 cm 2 ) was heated.
  • the element surface described in this example consists of a thin gold foil with a thickness of less than half a millimeter, that with a streptavidin layer is firmly connected. Affinity coupling allows this dextran layer again the biotin marked necessary for the further processing steps Attach oligonucleotides. These oligonucleotides are then above their 5'-phosphate end covalently coupled to the surface and thus have a reactive, accessible for enzymes 3 'end.
  • This gold foil which is structurally stabilized by a supporting plastic net can, and which has a reactive surface of about 5 x 5 mm, also serves as Heating element, since it is connected to an electrical power source, when the current flows leads to a spontaneous heating of this gold foil.
  • the cooling element Distal to the reaction approach, behind the gold foil, there is the cooling element.
  • the cooling element consists of a plastic channel with a 7 mm wide border on the gold foil Surface. The channel is 2 mm deep and extends the entire length of the here Sensor designated part of the device, in this case the heating and cooling elements as well as the reactive surface. This channel extends from one end of the Probe to the other end of the probe on which the reactive surface is attached, and back by including a web separating the two channels.
  • a suitable cooling liquid e.g. B. water circulated.
  • the entire unit is cast in hard plastic and recyclable, d. H. both the gold foil and the plastic are recyclable.
  • the control of both the heating of the reactive surface and the circulation speed and pre-cooling temperature of the coolant is controlled by an electronic third part, which is attached outside the sensor, made.
  • This third The unit also includes the storage container and the connection connections for the coolant.
  • this third unit there is also a micropump that is used for the Circulation of the coolant is responsible.
  • the surface of the sensor is ready for use. Via an input unit on the Surface of the control unit is attached, which has a digital display both the individual temperature ranges and the duration of their influence on them Selectable surface.
  • Acting here as an example of an application of the device according to the invention it is an amplification reaction of polymerase chain reaction a predetermined nucleic acid sequence.
  • Primers with a length of 16 bases each, spaced 4 nucleotides apart encode.
  • the sequence of one primer is identical, that of others complementary to the analyzing sequence.
  • the one identified here as identical The primer is reactive via the biotin label present at the 5 'end Surface coupled.
  • the other, complementary primer and all other reagents, that are usually used in a so-called PCR reaction are added to the reaction mixture.
  • the reaction is started.
  • the temperature changes in the reactive surface are programmed to carry out 50 heating and Cooling cycles can be carried out in about 1 minute.
  • the surface is cleaned of all non-covalently bound reaction partners. The surface cleaned in this way, which now only extended and primer molecules Contains primer molecules for analysis, together with the probe, in one device introduced that according to the principle of plasmon resonance, a direct determination of the Quantity of the extended product allows.

Description

Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsäuren mittels eines Temperaturregulationselements sowie Vorrichtungen und Geräte zur Durchführung dieser Verfahren.
In der Analytik, insbesondere in der medizinischen Diagnostik, beginnen sich immer mehr Verfahren zu etablieren welche auf Nachweisen und Synthesen von Nukleinsäuren beruhen. Nukleinsäuren sind als z. B. sehr spezifisches Erkennungsmittel für Organismen zur Diagnose von Krankheiten gut geeignet. Während dieser Nachweisverfahren sind verschiedenste Bearbeitungsschritte, wie Denaturierung, Hybridisierung, Synthesen und Immobilisierung von Nukleinsäuren, sowie deren enzymatische Behandlung üblich. Ein Problem bei solchen Verfahren war lange Zeit die geringe Menge an Nukleinsäuren in den Proben.
Eine Lösung für dieses Problem, mit der eine Vielzahl von Analysten für einen Nachweis zugänglich gemacht wird, brachte die Amplifikation von Nukleinsäuren. Ein solches Verfahren ist in der EP-A-0 200 362 beschrieben nämlich die Polymerase Chain Reaction (PCR). Dabei wird durch mehrfache Verlängerung von Primern in einer Reaktionslösung eine Vielzahl von Kopien der ursprünglichen Nukleinsäure hergestellt. Diese können beispielsweise durch Hybridisierung mit einer markierten Nukleinsäuresonde gemäß EP-A-0 201 184 nachgewiesen werden. Die dabei verwendeten Reaktionslösungen werden zur Trennung von Doppelsträngen und für die Extensionsreaktion jeweils in Intervallen auf bestimmte Temperaturen erhitzt bzw. wieder abgekühlt. Dadurch, daß es sich um relativ große Volumina handelt, bedingen die Zeiten für die Temperaturregulierung eine relativ lange Zeit für die Durchführung des gesamten Amplifikationsverfahrens.
Eine Abhilfe versucht hier die sogenannte Kapillar-PCR zu schaffen. Dabei befindet sich die Reaktionsmischung in Glaskapillaren mit einem geringen Durchmesser. Dadurch kann die Zeit für die Durchführung einer Amplifikationssequenz auf ca. 30 min gesenkt werden. Ein Problem bei der Kapillar-PCR ist die Anfälligkeit des mitzuerhitzenden Glases der Kapillare und die schwer handhabbare Probenapplikation.
In jüngerer Zeit werden auch immer mehr Amplifikationsverfahren beschrieben, bei denen die Amplifikationsreaktionen in einem geschlossenen System, d. h. ohne Zufuhr von Reagenzien während der Zyklen, durchgeführt werden kann. So ist in WO 92/07089 ein System beschrieben bei dem die Amplifikationsmischung solange wie erforderlich in einem Kreislaufsystem geführt wird, indem die Reaktionsmischung immer wieder erhitzt und abgekühlt wird. Durch Wahl des Durchmessers kann die Verweilzeit der Mischung in den einzelnen Zonen des Systems beeinflußt werden. In EP-A-0511712 ist ein Amplifikationsverfahren beschrieben, bei dem die Amplifikationsmischung cyclisch auf ganz bestimmte Temperaturen gebracht wird, um relativ kurze Zykluszeiten zu erreichen. Auch hier ist die Probenhandhabung erschwert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es unter anderem, die bestehenden Nukleinsäurebearbeitungsverfahren zu verbessern und insbesondere Verfahren bereitzustellen, bei denen die Amplifikation in besonders der Zeit abgeschlossen werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bearbeitung und insbesondere Verehrung von Nukleinsäuren in einer Reaktionsmischung, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur einer an die Rektionsmischung angrenzenden Oberfläche und deren unmittelbaren Umgebung reguliert wird, jedoch der Hauptraum der Reaktionsmischung im wesentlichen isotherm verbleibt.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind eine Vorrichtung zum Bearbeiten und Vermehrung von Nukleinsäuren mit einem Temperaturregulationselement sowie ein Gerät, welches diese Vorrichtung enthält.
Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind alle Arten von Nukleinsäuren, modifizierte oder unmodifizierte. Unmodifizierte Nukleinsäuren sind beispielsweise die natürlich vorkommenden Nukleinsäuren. Modifizierte Nukleinsäuren können durch Austausch von Gruppen der natürlichen Nukleinsäuren durch andere chemische Reste entstehen. Beispiele sind Nukleinsäure-Phosphonate, oder -Phosphothioate und an den Zuckerresten oder den Basen durch chemische Gruppen, die auch nachweisbar sein können, modifizierte Nukleinsäuren.
Die Bearbeitung von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung enthält bevorzugt mindestens einen bei erhöhter Temperatur, zumindest aber von der Umgebungstemperatur abweichenden Temperatur, ablaufenden Reaktionsschritt. Solche Reaktionsschritte sind beispielsweise die thermische Denaturierung von teilweise oder vollständig doppelsträgigen Nukleinsäuren. Dabei werden, um Einzelstränge herzustellen oder um Sekundärstrukturen aufzuschmelzen, die Nukleinsäuren auf Temperaturen oberhalb des entsprechenden Schmelzpunktes erhitzt. Ein weiterer Bearbeitungsschritt von Nukleinsäuren ist die Hybridisierung von zueinander komplementären Nukleinsäuren in einzelsträngigen Bereichen zu einem Nukleinsäuredoppelstrang (Hybrid). Dieser findet bei Temperaturen unterhalb des Schmelzpunktes des Hybrides statt. Um eine Hybridisierung zu erreichen, muß daher oft eine Abkühlung der Reaktionsmischung vorgenommen werden. Insbesondere in Amplifikations- oder Sequenzierungsverfahren wird ein weiterer Bearbeitungsschritt durchgeführt, nämlich die Verlängerung (Extension) eines an eine sogenannte Matrizen-Nukleinsäure (template) hybridisierten Primers mit Hilfe weiterer Mono- oder Oligonukleotide. Hierbei wird bevorzugt die Temperatur eingestellt, bei der das entsprechende verwendete Enzym sein Aktivitätsoptimum aufweist, bzw. Konkurrenzreaktionen vermindert sind. Diese Temperatur kann auch mit der Hybridisationstemperutur identisch sein (2-Stufen-PCR).
Ein Spezialfall der Bearbeitung von Nukleinsäuren ist die Vermehrung von Nukleinsäuren. Dabei können gemäß der vorliegenden Erfindung praktisch alle Amplificationsverfahren, z. B. zielsequenzabhängige Amplifikationen (insbesondere nicht-isotherme Amplifikationen wie die Polymerase Chain Reaction, Ligase Chain Reaction oder ähnliche) durchgeführt werden. Auch während dieser Vermehrungsverfähren findet mindestens einer der oben genannten temperatursensitiven Bearbeitungsschritte statt.
Zentrales Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß die Änderung der Tempertur nicht in der gesamten Reaktionsmischung, sondern nur in einem sehr kleinen Teil der Reaktionsmischung stattfindet. Dies hat zur Folge, daß das Aufheizen bzw. das Abkühlen dieses relativ kleinen Bereiches sehr schnell vor sich gehen kann und damit die Bearbeitung der Nukleinsäuren stark beschleunigt wird. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher die Reaktionsmischung mit einer temperaturregulierbaren Oberfläche in Kontakt gebracht. Durch Änderung der Temperatur der Oberfläche wird die unmittelbare Umgebung dieser Oberfläche erhitzt, angeglichen oder abgekühlt, je nach Bearbeitungsschritt und Temperatur der Reaktionsmischung. Man kann hier mehrere Fälle unterscheiden.
Für den Fall, daß die Temperatur der Reaktionsmischung höher liegt als die Schmelztemperatur der zu bearbeitenden Nukleinsäuren, kann die Oberfläche gekühlt werden, um in der angrenzenden Umgebung eine Hybridisierung der Nukleinsäuren zu erreichen.
Für den Fall, daß die Temperatur der Reaktionsmischung niedriger ist als die Schmelztemperatur und die Temperatur, die für eine Verlängerung eines Primers an der Nukleinsäure erforderlich ist, kann die Oberfläche und damit die unmittelbare Umgebung zunächst auf eine Temperatur erhitzt werden, bei der die Extension des Primers stattfinden kann. Anschließend kann die Temperatur über den Schmelzpunkt der Nukleinsäuren erhöht werden, wodurch eine Denaturierung und Strangtrennung der gebildeten doppelsträngigen Nukleinsäuren stattfinden kann. Daran kann sich eine Abkühlung auf eine Temperatur, bei der die Einzelstränge mit neuen Primern hybridisieren können, anschließen. Dieser Zyklus kann mehrfach durchlaufen werden.
Für den Fall, daß die Temperatur der Reaktionsmischung zwischen der für die Extension optimalen Temperatur und der Schmelztemperatur liegt, wird die Temperatur an der Oberfläche zunächst erhöht, um Doppelstränge zu trennen. Anschließend wird die Temperatur auf eine Temperatur gesenkt, bei der die Einzelstränge mit Primern hybridisieren. Daraufhin wird die für die Extension optimale Temperatur eingestellt und gewünschtenfalls der Zyklus wiederholt.
Die gewünschte Temperatur kann über einen festgelegten Zeitraum aufrechterhalten werden, z. B. solange, bis die gewünschten Reaktionen an der Oberfläche abgelaufen sind. Dazu kann die Temperatur der Oberfläche auch durch bekannte Kontrollmaßnahmen und angeschlossene Regelmaßnahmen (Nachheizen, -Kühlen) konstant gehalten werden. Die Zeiträume hängen, wie bei bekannten Verfahren üblich, von der Länge der zu bearbeitenden Nukleinsäuren und deren Homologie sowie den speziellen Hybridisierungsbedingungen ab. Der Fachmann kann jedoch durch einfache Versuche die optimalen Zeiträume ermitteln. Die Zeiträume liegen, je nach Bearbeitungsschritt, zwischen Sekundenbruchteilen und wenigen Sekunden.
Bei den oben geschilderten Fällen verbleibt der Hauptraum der Reaktionsmischung im wessetlichen isotherm, während sich die in unmittelbarer Umgebung der Oberfläche befindliche Reaktionsmischung den an der Oberfläche eingestellten Temperaturen anpaßt.
Zur Regulierung der Temperatur und zum Einstellen spezifischer Temperaturen an der Oberfläche und deren unmittelbarer Umgebung empfiehlt es sich, als Oberfläche die Oberfläche einer Vorrichtung zu wählen, die aus einem Heizelement und einem Kühlelement besteht. Das Heizelement hat bevorzugt eine relativ große Oberfläche bei vergleichsweise geringer Wärmekapazität. Als geeignet haben sich beispielsweise Metallfolien erwiesen, die auf geeignete Weise erhitzt werden können, z. B. durch elektrischen Strom. Als Materialien für die Metallfolie sind gut wärmeleitende Materialien, z. B. Gold, bevorzugt.
Das Kühlelement sollte eine vergleichsweise hohe Wärmekapazität haben. Als Kühlmedium kommen feste, flüssige oder gasförmige Stoffe in Frage. Bevorzugt sind flüssige Kühlmedien, z. B. Wasser. Eine gute Wärmeleitfähigkeit ist von Vorteil.
Die Anordnung des Heizelements und des Kühlelements kann entsprechend der Temperatur des Reaktionsmediums verändert werden, je nach dem, ob die Vorrichtung mehr zum Erhitzen oder zum Kühlen der Oberfläche und deren unmittelbarer Umgebung benutzt werden soll. Im allgemeinen wird jedoch das Heizelement in unmittelbarer Nähe der Oberfläche lokalisiert sein. Die Oberfläche des Heizelementes kann auch direkt an die Reaktionsmischung angrenzen. Es ist jedoch auch möglich, das Heizelement durch eine dünne, wärmeleitfähige Schicht von der Reaktionsmischung zu trennen.
Das Kühlelement kann prinzipiell an jeder Stelle positioniert sein, mit der eine Abkühlung der Oberfläche und der unmittelbaren Umgebung möglich ist. Als bevorzugt hat es sich jedoch erwiesen, das Kühlelement auf der der Reaktionsmischung abgelegenen Seite des Heizelements zu positionieren. Für den Fall, daß das Heizelement eine geringe Wärmekapazität hat, ist die Tatsache, daß das Heizelement ebenfalls abgekühlt werden muß, nicht von entscheidendem Nachteil.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird mit Hilfe des Heizelements so lange geheizt, bis die Oberfläche und ihre unmittelbare Umgebung auf die gewünschte Temperatur erhitzt ist. Dabei wird sich ein starker Temperaturgradient in der Nähe der Oberfläche ausbilden, während der restliche Teil des Reaktionsgemisches isotherm bleibt. Dies gilt insbesondere, wenn kein bemerkenswerter Flüssigkeitsaustausch während des Aufheizvorganges realisiert wird, aber auch, wenn ein Flüssigkeitsaustausch stattfindet. Der Aufheizvorgang kann innerhalb von Sekundenbruchteilen, in günstigen Fällen sogar Millisekunden, abgeschlossen sein. Dasselbe gilt für die Kühlung. Der Reaktionsraum, welcher auf die gewünschte Temperatur erhitzt wird, kann sehr klein sein, bevorzugt ist er weniger als 0,2 mm, besonders bevorzugt weniger als 0,5 µm tief. Die auf die Reaktionsmischung hingerichtete Fläche des Heizelements beeinflußt die Tiefe des Temperaturgradienten und seine Aufbaugeschwindigkeit. Aus den gewünschten Anwendungen des Verfahrens kann sich eine bevorzugte Größe der Oberfläche ergeben. In der Regel ist die Oberfläche < 2 cm2, besonders bevorzugt zwischen 0,2 cm2 und 0,2 mm2. Die Oberfläche kann glatt oder auch rauh sein. Für den Fall, daß die Oberfläche gleichzeitig als Träger von Mitteln für die Bearbeitung der Nukleinsäuren genutzt wird, ist es vorteilhaft, diese Oberfläche durch Oberflächenstrukturen zu vergrößern.
Das Volumen der Reaktionsmischung ist für die Erfindung praktisch nicht von großer Bedeutung. Es kann sich hierbei um einen Tropfen mit einem Volumen von 20 µl, jedoch auch um ein beliebig großes Volumen handeln, Es ist ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die das Heize- und das Kühlelement enthaltende Vorrichtung beispielsweise auch in ein großes Gefäß mit Reaktionsmischung eingebracht werden kann, wobei die wesentlichen Reaktionen nur in einem sehr kleinen Grenzbereich der Oberfläche stattfinden, während der übrige Reaktionsraum praktisch keinen Einfluß auf die Reaktion ausübt. Andererseits stellen die erhältlichen Proben und Reagenzmengen ein praktisches Limit für die Größe der Reaktionsmischung dar. Die Reaktionsvolumina werden sich daher meist in einem Bereich zwischen 1 ml und 30 µl, bevorzugt zwischen 100 µl und 50 µl, bewegen, jedoch läßt sich zum Beispiel durch Aufbringen des Reaktionsansatzes auf die temperaturregulierende Oberfläche auch mit sehr viel kleineren Volumina arbeiten.
Zur Bearbeitung der Nukleinsäuren werden diese an die temperaturregulierbare Oberfläche oder deren unmittelbare Umgebung gebracht. Dies kann auf verschiedene Weise geschehen, beispielsweise mechanisch oder durch Diffusion. Bevorzugt werden die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden. Diese Bindung wiederum kann unterschiedlicher Art sein. Bevorzugt ist eine chemische Bindung, entweder über Adsorption oder biospezifische Wechselwirkungen. Im Falle einer Bindung durch Adsorption kann die Oberfläche mit einem nukleinsäurebindenden Reagenz belegt sein. Biospezifische Wechselwirkungen können Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und den zu bearbeitenden Nukleinsäuren sein (Hybridisierung, komplementärer Teil dieser Nukleinsäuren), jedoch ach Wechselwirkungen zwischen Antigenen oder Haptenen mit dagegen gerichteten Antikörpern und Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen. Eine bevorzugte Art der Bindung der zu bearbeitenden Nukleinsäuren an die Oberfläche geschieht über Oligonukleotide, die kovalent an die Oberfläche gebunden sind und zumindest zu einem Teil der zu bearbeitenden Nukleinsäure komplementär sind. Diese Oligonukleotide können jedoch auch über biospezifische Wechselwirkungen, z. B. Biotin-Streptavidin, an die Oberfläche gebunden sein.
Die Bindung der zu bearbeitenden Nukleinsäuren ist gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt reversibel. Die Nukleinsäuren können nach einer von dem durchzuführenden Vorgang abhängigen Zeit durch Erhitzen der Oberfläche und ihrer unmittelbaren Umgebung wieder freigesetzt werden. Zwischen dem Binden und Freisetzen der Nukleinsäure können beliebige Schritte vorgenommen werden, z. B. Durchführung chemischer Reaktionen, jedoch ach eine Trennung der gebundenen Nukleinsäuren von der ursprünglichen Reaktionsmischung und Überführung in eine neue Reaktionsmischung.
Für den Fall einer Vermehrungsreaktion der Nukleinsäuren können die an die Oberfläche gebundenen Oligonukleotide als Primer für die Elongation oder Extension unter Verwendung der zu bearbeitenden Nukleinsäure als Matrize verwendet werden. Dadurch bildet sich ein an die zu bearbeitende Nukleinsäure gebundener verlängerter Primer. Die als Matrize benutzte Nukleinsäure kann durch Temperaturerhöhung von dem Verlängerungsprodukt gelöst werden und kann im nächsten Temperaturzyklus für einen neuen, bisher noch nicht verlängerten immobilisierten Primer als Matrize wirken. Auf diese Weise ist es möglich, eine große Menge an an der Oberfläche immobilisierten Primern zu verlängern und somit Kopien von Teilen der zu bearbeitenden Nukleinsäure herzustellen. Die extendierten (verlängerten) oberflächenbehafteten Primer dienen wiederum mittels komplementärer Primer zu einer Vermehrung der als Matrize dienenden Moleküle. Die für die durchzuführenden Reaktionen erforderlichen Reagenzien sind in der gesamten Reaktionsmischung vorrätig zu halten oder diese sind nach Bedarf zuzugeben. Für eine Vermehrungsreaktion nach dem Prinzip der Polymerasereaktion (EP-B-0 201 184) sind daher die Deoxyribonukleotide, eine DNA-Polymerase und ein weiterer Primer und geeignete Puffer-Reagenzien in der Reaktionsmischung zu halten. Zur Darstellung anderer Nukleinsäuretypen (z. B. RNA), sind andere Reagenzien, z. B. Ribonukleotide oder RNA abhängige Polymerasen vorgesehen. Dieser Schritt des Verfährens kann besondere Rücksicht auf die Arbeitstemperatur des bearbeitenden Enzyms nehmen.
Die zu bearbeitenden Nukleinsäuren können jedoch auch über physikalische Methoden an die Oberfläche gebunden werden, z. B. mittels eines Magneten. Hierzu müssen die Nukleinsäuren jedoch an ein magnetisierbares Teilchen gebunden werden. Die Bindung von mit Nukleinsäure beladenen magnetischen Teilchen kann dadurch reversibel gestaltet werden, daß sich ein Magnet hinter der Oberfläche befindet oder induziert wird. Durch Anlegen eines Wechselfeldes können die magnetischen Teilen an die Oberfläche gebunden bzw. von ihr entfernt werden.
Spezielle Ausführungsformen, die teilweise vorteilhafte Wirkung aufweisen, sind ebenfalls denkbar. So kann die Effizienz gesteigert werden, indem die Diffusion der Nukleinsäuren in der Reaktionsmischung durch Konvektion verstärkt wird. Es kann auch vorteilhaft sein, gegenüber den üblicherweise verwendeten Reaktionsmischungen höhere Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer einzusetzen. Außerdem kann die zu bearbeitende Nukleinsäure zu Beginn der Reaktion durch Vorhybridisierung an der Oberfläche konzentriert werden.
Im Falle einer Amplifikation oder Vermehrung der Nukleinsäuren kann es sein, daß die Anzahl der zu durchlaufenden Zyklen, z. B. bei einer PCR, erhöht werden muß, damit genügend Amplifikationsprodukt erzeugt wird. Wegen der sehr kurzen Zykluszeit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist dies jedoch nicht von Nachteil.
Für den Fall, daß die Reaktionsmischung auf einer relativ niedrigen Temperatur gehalten wird, bedeutet dies, daß an die Hitzestabilität der Reagenzien weniger Ansprüche gestellt werden müssen als bei mehrmaliger Erhitzung der gesamten Reaktionsmischung. Eine thermostabile Polymerase ist daher für eine Vermehrungsreaktion nicht unbedingt erforderlich und dennoch muß nicht in jedem Amplifikationszyklus neues Enzym zu der Reaktionsmischung zupipettiert werden.
An die erfindungsgemäße Bearbeitung der Nukleinsäuren können sich beliebige weitere Schritte anschließen. So können die Nukleinsäuren entweder im an die Oberfläche gebundenen Zustand oder im wieder freigesetzten Zustand untersucht oder mit weiteren Reagenzien bearbeitet werden.
Mit Hilfe des geschilderten erfindungsgemäßen Vermehrungsverfahrens läßt sich somit auf einfache Weise ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe bilden Hierzu wird die Oberfläche, an welche die als Primer fungierenden Oligonukleotide gebunden sind, mit der Probeflüssigkeit in Kontakt gebracht. Danach wird die Temperatur der Oberfläche und ihrer unmittelbaren Umgebung auf eine Temperatur gebracht, welche über dem Schmelzpunkt der in der Probe enthaltenen doppelsträngigen Nukleinsäure liegt. Nach Abkühlung der Oberfläche und der unmittelbaren Umgebung wird die nachzuweisende Nukleinsäure mit dem Oligonukleotid hybridisieren. Durch Zyklusführung wird, wie oben beschrieben, mit Hilfe der nachzuweisenden Nukleinsäure eine Vielzahl von Kopien hergestellt, die am Ende der Vermehrungsreaktion an die Oberfläche gebunden bleiben können. Durch Hybridisierung mit markierten Nukleinsäuresonden und deren Detektion mit Hilfe der Markierung kann die Menge an Nukleinsäuren an der Oberfläche bestimmt werden. Bei Verfahren, die einen direkten Nachweis von Nukleinsäurehybriden ohne Markierung oder von verlängerten Einzelsträngen (Primern) erlauben (z. B. nach dem Prinzip der Oberflächen-Plasmonenresonanz), ist auch ein direkter Nachweis möglich. Verwendet man für die Vermehrungsreaktion markierte Primer oder Mononukleotide, entfällt die Hybridisierung mit einer nachweisbar markierten Nukleinsäuresonde. Es ist ach ein Ansatz denkbar, bei dem im Ansatz eine höhere Temperatur gehalten wird und die Oberfläche, die für weitere Schritte nötigen tieferen Temperaturen annimmt.
Da die erfindungsgemäße Anwendung des Verfahrens zur Vermehrung der Nukleinsäuren praktisch an einer Oberfläche abläuft, führen wir für diese Vermehrungsreaktion die Bezeichnung 2D-Amplifikation ein.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung, die zum Einsatz im oben genannten Bearbeitungsverfahren verwendet werden kann. Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung eine Vorrichtung zum Bearbeiten von Nukleinsäuren mittels eines Temperaturregulationselements, wobei dieses Element zur Temperaturregulation der Oberfläche und der unmittelbar angrenzenden Umgebung geeignet ist und wobei an diesem Mittel zur Bearbeitung der Nukleinsäuren gebunden werden können. Diese Mittel können Oligonukleotide sein, und beispielsweise als Primer dienen. Diese Vorrichtung enthält bevorzugt ein Kühlelement sowie ein Heizelement, wobei die Anordnung bevorzugt wie im oben beschriebenen Bearbeitungsverfahren vorliegt. Diese Vorrichtung ist bevorzugt sehr klein. Sie kann beispielsweise eine Dicke von < 5 mm und eine Fläche von < 10 cm2 haben. Die darin befindlichen Elemente, wie das Kühlelement oder das Heizelement, sind einfache Bauteile. Daher ist diese Vorrichtung ausgezeichnet geeignet zur einmaligen Verwendung (Disposable), was die für wiederverwendbare inherente Kontaminationsgefahr reduzieren kann. Soll die Vorrichtung für eine Mehrfachbenutzung geeignet sein, ist es ach möglich, das Heizelement durch ein sehr dünnes Bauteil vom Raum, welcher die Reaktionsmischung enthält, zu trennen und dieses Bauteil von der Vorrichtung abtrennbar zu machen. Für eine weitere Bearbeitungsstufe kann dann ein neues Bauteil eingesetzt werden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Gerät zur Bearbeitung von Nukleinsäuren, welches ein Steuerelement für eine zeitabhängige Temperaturregulierung sowie eine erfindungsgemäße Vorrichtung enthält. Als Steuerelement kann das Steuerelement eines sogenannten Thermocyclers gemäß EP-A-0 236 069 verwendet werden, bevorzugt wird jedoch eine Steuerung nach dem Prinzip von Tintenstrahldruckern , da sie eine höhere Steuerungsgeschwindigkeit ausweisen. Das Steuerelement muß in der Lage sein, das Heizelement in vorbestimmten Intervallen so lange zu erhitzen, bis die Umgebung der Oberfläche eine ausreichende Temperatur aufweist. Ebenso muß es in der Lage sein, über das Kühlelement in vorbestimmten Intervallen für eine Kühlung an der Oberfläche zu sorgen Dazu kann beispielsweise eine Kühlflüssigkeit durch die Vorrichtung geleitet werden Sofern die Wärmekapazität des Heizelementes gering, die Wärmeleistung jedoch relativ hoch ist, ist ach eine kontinuierliche Kühlung möglich. Als Oberfläche kann man verschiedene Formen in einer ohmisch temperierbaren Version dieses Geräts verwenden, die abhängig von der Spannung und der Dauer des Stromflusses thermisch erhitzt werden. In einer abweichenden Version befindet sich die zu temperierende Oberfläche auf einer vorzugsweise schwarzen Unterlage, bevorzugterweise einer Plastikfolie, die von der zu temperierenden Oberfläche distalen Seite her durch einen Laserstrahl, bevorzugterweise einem Infrarotlaser, erwärmt wird. Sowohl die zu temperierende Oberfläche, als auch das wärmeabsorbierende und wärmeleitende Material können dabei auf einer Trägerfläche, bevorzugterweise infrarotdurchlässiges Glas, angebracht sein.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann verschiedenste Ausführungsformen haben. Beispielsweise kann sie für ein Eintauchen in ein Gefäß ausgelegt sein. Sie kann jedoch auch so gestaltet sein, daß die die zu bearbeitende Nukleinsäure enthaltende Flüssigkeit auf die Oberfläche aufgetropft oder in ein durch die Oberfläche gebildetes Gefäß eingefüllt werden kann Dieser Reaktionsraum kann auch nach Einfüllen der Flüssigkeit verschlossen werden, so daß Kontaminationsprobleme verringert werden können.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zu Vermehrung von Nukleinsäuren. Dabei handelt es sich, wie in Beispiel 3, z. B. um eine als Polymerasekettenreaktion bezeichnete Amplifikationsreaktion mit anschließender Detektion.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur Anreicherung von Nukleinsäuren z. B. durch Hybridisation. Bei kovalent an die Oberfläche adsorbierten Primern mit einer ausreichenden Spezifität läßt sich durch Vorwahl der Hybridisierungstemperatur, bei bekannter Zusammensetzung (ionischer Zusammensetzung, Konzentration von Reagenzien) der zu analysierenden Reaktionslösung eine Hybridisationstemperatur dergestalt vorgeben, daß eine spezifische Bindung der zu analysierenden Nukleinsäure an die zur Hybridisierung eingesetzten kovalent an die Oberfläche gebundenen Primer stattfindet. Dieses Verfahren kann dazu eingesetzt werden
  • a) eine genaue Auswertung der tatsächlichen Hybridisationstemperatur vorzunehmen,
  • b) eine genaue Konzentration der zu analysierenden Nukleinsäuren im Reaktionsgemisch vorzunehmen,
  • c) auf das Vorhändeseein kreuzhybridisierender Sequenzen zu testen.
    • Diese kurze Auflistung ist nicht abschließend.
    Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um Nukleinsäuren von einer Lösung in eine andere zu überführen. Dann findet im ersten Gefäß eine Hybridisierung (niedere Temperatur) und im zweiten Gefäß eine Denaturierung (höhere Temperatur) statt.
    Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren. Eine Möglichkeit der Anwendung der Erfindung im Zusammenhang mit Sequenzanalysen ist die sogenannte Minisequenzanalyse. Dabei kann jeweils die genaue Sequenzbestimmung des an den Primer anschließenden Nukleinsäurenukleotids vorgenommen werden, indem in der Lösung die zur Sequenzierung bereitgestellt wird, ausschließlich Dideoxynukleotide und keine Deoxynukleotide zur Sequenzierung zugesetzt werden. Die vier möglichen Dideoxynukleotide ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP sind mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markiert. In jedem Fall führt also der Einbau des jeweils nächsten Nukleotids zum Abbruch der Sequenzreaktion und nach Aufreinigung des extendierten an der Oberfläche befindlichen Primers kann durch Analyse der spezifischen Fluoreszenz die Sequenz des auf dem Primer befindlichen Nukleotids bestimmt werden.
    Ein Spezialfall der Möglichkeiten der Anwendung der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, die zuvor in einer PCR-Reaktion amplifiziert worden sind. Nach der Amplifikation liegt das vermehrte Produkt über den Primer kovalent gebunden in doppelsträngiger Form an der reaktiven Oberfläche vor. Durch kurzes Durchlaufen einer Höhentemperaturphase wird durch Denaturierung dieses Amplifikat einzelsträngig vorliegen, läßt sich durch Überführen in eine Waschlösung reinigen und ist danach wiederum durch Überführen diesmal in eine Sequenzierreaktion einsetzbar für eine darauffolgende Sequenzierung. Diese Sequenzierung verläuft besonders effizient, da nun nur einzelsträngiges Matrizenmaterial vorhanden ist, an das ein Sequenzierpaar besonders effizient binden wird. Durch die Sequenzierreaktion liegt anschließend wieder ein doppelsträngiges Molekül vor, dessen markierte (sequenzierte) Hälfte nun zur Analyse durch Gelchromatographie zur Verfügung steht. Bei Einsatz verschiedener markierter (mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierten Dideoxynukleotiden) lassen sich alle vier für eine Sequenznalyse notwendigen Reaktionen auf einmal durchführen, bei der konventionellen Methode muß diese Analyse viermal wiederholt werden.
    Die vorliegende Erfindung wird anhand der beiliegenden Figuren näher erläutert:
  • Figur 1 zeigt das Aufbauschema einer erfindungsgemäßen Vorrichtung (1), welche in ein mit Reaktionsgemisch (2) gefülltes Reaktionsgefäß (3) eintaucht. Die Vorrichtung enthält ein Kühlelement (4) und ein mittels Strom heizbares Heizelement (5). An die Oberfläche des Heizelement sind Oligonukleotide (6) kovalent gebunden. Sowohl das Kühlwie das Heizelement sind über Anschlüsse (7; 8) an Steuereinheiten regulierbar.
  • In Figur 2 ist ein beispielhafter Temperaturverlauf für eine Vermehrungsreaktion nach der Art der PCR gezeigt. In einer ersten Phase (A) werden die Nukleinsäuren bei einer Temperatur von etwas unterhalb 100 °C denaturiert. In einer Phase (B) findet bei etwa 50 °C die Hybridisierung der zu vermehrenden Nukleinsäuren mit den immobilisierten Oligonukleotiden an der Festphase statt. In einer dritten Phase (C) findet bei ca. 70 °C die Extension der Primer unter Verwendung der Nukleinsäure als Templat statt.
  • In Figur 3 sind die unmittelbarer Nähe der Oberfläche ablaufenden Reaktionen (Phasen A bis C) gezeigt. Für Phase (A) sind drei Isothermen in ihrem schematischen Verlauf, für Phase (B) und (C) jeweils nur eine Isotherme angezeigt. In Phase (A) werden Nukleinsäuren denaturiert und diffundieren über eine gewisse Zeit einzelsträngig, in Phase (B) hybridssieren Vorlagen und Primer und in Phase (C) werden Primer entlang der Matrizen extendiert.
  • Figur 4 zeigt einen möglichen Prototypen einer für die erfindungsgemäße Anwendung geeigneten Oberflächentemperierung. Die Heizeinheit, die die auswechselbaren beheizten Goldoberflächen sowie die physischen Voraussetzungen zur Kühlung bzw. Erwärmung (Kühlmittelanschluß, Stromanschluß) enthält, ist über Steckverbindungen (7; 8) an die eigentlichen Meßeinheiten (1) mit den ebenfalls daran angebrachten Halterungen für Reaktionsgefäße (11) angebracht, in denen die für die Durchführung der Reaktion notwendigen Matrizenmoleküle, Pufferbestandteile und Primer in Lösung sind sowie die Polymerase vorliegen.Die Meßfühler (9), hier in Form einesTeststreifens, enthalten in FIG 4 beispielhaft Goldoberflächen (5), die nicht mit denselben Primern (6) beschichtet sein müssen.
  • Figur 5 zeigt Vergrößerungen der Meßeinheiten mit auswechselbaren Teststreifen aus FIG 4, wobei die Meßeinheit (1, bestehend aus 9 und 10) aus Elektronikanschluß und Kühlaggregat (oberer, grauer Teil der Abbildung) und dem Teststreifen (= Meßhülle) besteht. Ein Querschnitt durch diese Meßeinheit ist im unteren Teil der Abbildung dargestellt, auf dem man den zur Kühlung verwendeten Kühlkreislauf (4) mit Rührmechanismus (12) und Kühlflüssigkeit (13) sowie die Reaktionsoberflächen (5, 6) mit Elektronikanschluß erkennen kann. Im rechten Teil der unteren Abbildung ist eine weitere Vergrößerung des Kathodenanschlusses der Goldmembran (5) mit Unterstützungs- und Trennfilter (14) sowie Haftschicht für die Oligonukleotide (6) erkennbar.
  • Figur 6 besteht aus einer Schemazeichnung des sich in unmittelbarer Umgebung der Haftschicht mit Oligonukleotiden ausbildenden Temperagradienten und dem zu erwartenden Temperaturprofil, hier am Beispiel einer 3stufigen PCR, bei der die Temperaturen 96 ° für 0,1 Sekunden, 54 °für 0,5 Sekunden und 72 ° für ebenfalls 0,5 Sekunden dargestellt sind.
    • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:
    Beispiel 1: Herstellung einer zyklisch temperierbaren Oberfläche (Variante a).
    Eine beispielhafte zyklisch temperierbare Goldoberfläche läßt sich dadurch erhalten, daß in eine dünne Leiterplatte zwei ca. 1 mm breite und 3 mm lange Langlöcher im Abstand von 3 mm parallel zueinander ausgefräst werden. Auf der einen Seite, die der Lösung zugewandt ist und daher proximale Seite genannt wird, werden diese Langlöcher durch Bedampfen mit Gold leitend miteinander verbunden. Auf der distalen Seite wird eines dieser Langlöcher über die Leiterplattenbahnen mit der Anode, das andere ebenfalls über die Leiterplattenbahnen mit der Kathode verbunden.
    Die Goldschicht auf der proximalen Seite wird dadurch aufgebracht, daß eine Maske in der gewünschten Größe, in diesem Fall 3 x 3 mm bündig, über die beiden Längsflächen aufgebracht wird. Die Innenseiten der Längsfläche sind galvanisch bündig bis zur Oberfläche mit Kupfer beschichtet. In dem folgenden Bedampfungsverfahren, das wie branchenüblich durchgeführt wird, werden nun die beiden elektrisch leitenden Längslöcher mit einer wenige µm dicken Goldschicht beschichtet. Das Beschichtungsverfahren ist im Folgenden beschrieben:
    Die Herstellung der Goldoberfläche erfolgte durch Aufdampfen auf "Lexan" Polycarbonatfolien (Hersteller: General Electric, Dicke 0.75 mm) mit den Abmessungen 8x8 cm über eine Metallmaske (d = 0.5 mm, Aluminium) in einer Leybold Hochvakuum-Beschichtungsanlage (Univex 450). Die Oberflächen liegen in regelmäßigen Abständen, die ein Zerlegen der bedampften Platte in mehrere Einheiten zulassen. Die Schichtdicke des Geldes beträgt 300 nm. In einem weiteren Schritt erfolgte die Beschichtung der Multi-Goldsportplatte mit "verdünnten" Biotinthiol-Bindeschichten unter Bildung einer hydrophoben SAM-Schicht. Die Biotinthiolverbindung (HS-C12-DADOO-Biotin; N,N'-(12-mercaptododecylyl-biotinylyl)-2,2'-diaminooethyl-glycoldiether; 2.94 mg; 5x10-5 m) und der Verdünner (12-Mercaptoundecanol, 9.2 mg, 4.5x10-4 m) wurden in 100 ml Ethanol p.a. gelöst. In diese Lösung wurden die frisch beschichteten Polycarbonatfolien getaucht. Nach 4 h wurden die Platten entnommen, 2mal mit Ethanol p.a. gewaschen und sofort mit Streptavidin beschichtet. Dazu wurden die Goldspots und die SAM-beschichteten Folien 1 h in eine Streptavidinlösung getaucht (Konzentration Streptavidin: 0.5 mg/ml in 0.05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7.2). Die so behandelten Oberflächen wurden danach mit einer Waschlösung (50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.2, 2 % Saccharose, 0.9 % NaCl, 0.3 % Rinderserumalbumin Fraktion II) behandelt und anschließend 20 h getrocknet (25° C und 40 % Luftfeuchtigkeit).
    Durch die sehr geringe Dicke der Goldschicht resultiert ein sehr geringer leitender Goldquerschnitt (3 mm x 3 µm über eine Strecke von 3 mm). Diese Goldschicht stellt daher einen relativ hoben Widerstand im Vergleich zu den Leiterbahnen dar.
    Die Leiterbahnen werden nun an einen Stromversorger angeschlossen, der computergestützt eine Kontrolle der ohmisch induzierten Temperatur der Göldoberfläche zuläßt.
    Herstellung einer zyklisch temperierbaren Oberfläche (Variante b)
    In einer Variante zur Herstellung einer zyklisch temperierbaren Oberfläche wird die Abdeckschicht, die den Meßmäander aus Platin isoliert, eines allgemein im Handel befindlichen Platintemperatursensors (PT 100) mit einer Goldschicht bedampft. Schließt man diesen Meßsensor nun an eine reglergesteuerte Spannungsquelle an, so läßt sich dieser Sensor auch als Thermoquelle für die aufgedampfte Goldschicht verwenden. Dazu ist es nötig, Strom und Spannung am Platinsensor über einen Analogdividierer an einen Regler weiterzuleiten. Regelgröße des Reglers ist der Widerstand des beheizten Platinelements, was eine exakte Temperatursteuerung zuläßt, wenn eine Normierung der Goldoberflächentemperatur mit der Temperatur des Platinmäanders stattgefunden hat.
    Beispiel 2: Eine beispielhafte Vorrichtung zur Messung der Oberflächentemperatur der Goldfolie (Variante a).
    Eine Goldfolie gemäß Beispiel 1, Variante a, wird mit einer Maske abgedeckt, die das Bedampfen der Goldfolie mit einem ca. 1 mm breiten Goldfaden, der über diese Goldoberfläche hinausragt und an einen Meßpunkt anschließbar ist, zuläßt. Eine weitere Marke, die das Bedampfen mit einem zweiten Faden, z. B. aus Nickel, Wismut oder einer anderen zur Temperaturmessung geeigneten Legierung, zuläßt, wird ebenfalls bereitgestellt. Der Metallfaden liegt auf derselben Stelle der Goldoberfläche wie der Goldfaden beim (200 nm dick), trennt sich jedoch in seinem Verlauf beim Verlassen der zu temperierenden Goldoberfläche und führt als getrennter Metellfaden (300 nm dick) zu einem zweiten Meßpunkt. Diese Anordnung der Meßsonden aus Gold und einem weiteren, zur Temperaturmessung geeigneten Metall oder Legierung erlaubt die Messung der Thermospannung (2,2 mV/100 ° Kalvin) in dem Bereich der Goldfolie, wo die beiden Meßsondenfäden überlappen. Die Temperatur an der Vergleichsstelle (Cold Junction) wird mit einem Thermopräzisions PT 1000-Element gemessen (Genauigkeit > 1 %) und auf 10 V normiert (0 V entspricht 0 °, 10 V entspricht 100 °), ausschließlich verstärkt und ebenfalls auf 10 V normiert. In einem Summenverstärker wird die Summe beider Temperauren gebildet und zur elektronischen Steuerung der jeweiligen Oberflächentemperatur verwendet.
    Beispiel 2b Eine beispielhafte Vorrichtung zur Messung der Oberflächentemperatur der Goldfläche aus Beispiel 1, Variante b.
    Zur exakten Ermittlung der Oberflächentemperatur der Goldschicht besteht die Möglichkeit, die Oberflächen zweier wie in Beispiel 1, Variante b, beschriebener goldbedampfter PT 100-Meßsersoren in der Art aneinander zur pressen, daß jeweils die Hälfte der goldbedampften Flächen des Heizsensors und des Meßsensors einander abdecken und sich die jeweils verbleibende Fläche im umgebenden Medium befindet. Wird nun nur der eine Sensor zur Messung, der andere zur Erwärmung verwendet, so läß sich damit exakt die Temperatur der Goldoberflächen berechnen. Die Temperatur an der Oberfläche der Sensoren entspricht exakt dem Mittelwert der Temperatur des beheizten und des nicht-beheizten Sensors, die beide über Widerstandsmessungen genau definierbar sind. Auf diese Weise können mittels eines zur Messung verwendeten Temperatursensors eine ganze Reihe von temperierbaren Oberflächen geeicht und für die Durchführung von PCR-Reaktionen vorbereitet werden. Der Temperaturgradient zweier so angeordneter Oberflächen beträgt zwischen der beheizten und nicht-beheizten Oberfläche ca. 3 °C.
    Beispiel 3: Durchführung einer zweistufigen PCR mit einem oberflächenfixierten Primer.
    Eine beispielhafte Durchführung einer Polymerasekettenreaktion verwendet einen oberflächenfixierten, biotinmarkierten Primer (5'-GAAGGGAGGAAGGAGGGAGCGGAC-3'). Dieser Primer ist über seine am 5'-Ende befindliche Biotingruppe an eine oberflächliche Streptavidin- bzw. Goldstreptavidinoberfläche gekoppelt. Die molare Menge von Streptavidin bzw. Biotin/Quadratmillimeter beträgt etwa 0.2 pmol/mm2. In Lösung befinden sich Nanogramm-Mengen oder weniger des folgenden doppel- oder einzelsträngigen Matrizenmoleküls
    Figure 00160001
    und ein Gegenprimer in der Konzentration von zwischen 0,5 µM bis 2 µM. Die Reaktion findet in handelsüblichem PCR-Puffer (Boehringer Mannheim, Beipackzettel zum Enzym 8. Ansgabe, Identnummer 1146165) bei 1,5 mM Mg2+ statt. Als Polymerase wurde eine händelsübliche Taq-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim, Identnummer 1146165) in der Konzentration von 20 nM eingesetzt. Der in Lösung vorhandene Gegenprimer (5'-GGGTGGGGTGGTTGGGTGGTGGTG-3') war an seinem 5'-Ende Digoxigenen-markiert (Patent EP 0324474).
    Die PCR-Reaktion fand bei einer konstanten Lösungstemperatur von 68 ° und einer zwischen 96 und 68 ° zyklisch variierenden primerbeschichteten Oberfläche statt. Die zyklische Dauer der höheren Temperatur variierte in unserem Beispiel zwischen 0,1 Sekunden, 10 Sekunden und 1 Minute, die der niedrigeren Temperatur zwischen 0,5 Sekunden, 20 Sekunden und 1 Minute.
    Nach Abschluß der zyklischen Temperierung wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt, wobei ausschließlich die komplementären elongierten biotin- und elongierten digoxigenin-markierten Primer miteinander hybridisieren und doppelsträngige DNA-Fragmente bildeten. Nach Waschen mit PCR-Pufferlösung wurden die Oberflächen anti-Dig-POD umgesetzt, 30 Minuten inkubiert, erneut gewaschen und mit ABTS versetzt (Färbeprotokoll gemäß Beipackzettel Punkt 3 zum Boehringer Mannheim Reverse-Transkriptase-Assay, non-radioaktiv, Identnummer 1468120). Das entstandene farbrige Produkt wurde in einem ELISA-Photometer bei einer Wellenlänge von 405/490 Nanometern quantitativ bestimmt. Die erhaltenen Extinktionswerte belegen eine Amplifikation eines Bereichs des Templates, gemessen als extendierter Gegenprimer, der an den an die Festphase gekoppelten Primer hybridisiert. In typischern Experimenten erhielten wir Extinktionswerte um 0.4 bei Messung im Elisareader und nach Korrektur um den digoxigeninfreien Leerwert. In Kontrollexperimenten ohne Template lagen nach Leerwertkorrektur die Werte bei 0.04 und in Kontrollen ohne Polymerase bzw. ohne Temperaturerhöhung jedoch im kompletten Reaktionsansatz lagen die Werte bei 0.07. Selbst mehrminütiges (5 Minuten) Erhitzen der Oberfläche erhöhte die Umgebungstemperatur in der konstant temperierten Lösung nicht mehr als 7 C, selbst wenn eine wesentlich (100fach) größere Oberfläche (3 cm2) erhitzt wurde.
    Beispiel 4: Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
    Eine beispielhafte Vorrichtung gemäß dieser Erfindung besteht aus drei Strukturuntereinheiten. Bei diesen drei Struktureinheiten handelt es sich um
  • 1. die in das flüssige Reaktionsmillieu eindringende heizbare und temperaturregulierbare Oberfläche,
  • 2. um die zur Heizung und Kühlung notwendigen Bauteile, die an
  • 3. die elektronische Steuerung angeschlossen sind.
    • Die in diesem Beispiel beschriebene Elementoberfläche, besteht aus einer dünnen Goldfolie mit einer Dicke von weniger als einem halben Millimeter, die mit einer Streptavidinschicht fest verbunden ist. Durch Affinitätskopplung läßt sich an diese Dextranschicht wiederum die für die weiteren Bearbeitungsschritte notwendigen biotinmarkierten Oligonukleotide anbringen. Diese Oligonukleotide sind dann über ihr 5'-Phosphatende kovalent an die Oberfläche gekoppelt und besitzen somit ein reaktives, für Enzyme zugängliches 3'-Ende.
    Diese Goldfolie, die durch ein unterstützendes Plastiknetz stukturell stabilisiert werden kann, und die eine reaktive Oberfläche von etwa 5 x 5 mm besitzt, dient auch zugleich als Heizelement, da sie an eine elektrische Stromquelle angeschlossen ist, die bei Stromfluß zu einer spontanen Erhitzung dieser Goldfolie führt. Distal zum Reaktionsansatz, hinter der Goldfolie, befindet sich das Kühlelement. In diesem Fall besteht das Kühlelement aus einem in Plastik ausgesparten Kanal mit einer an die Goldfolie grenzenden 7 mm breiten Fläche. Der Kanal ist 2 mm tief und erstreckt sich über die ganze Länge des hier als Meßfühler bezeichneten Teil des Gerätes, der in diesem Fall die Heiz- und Kühlelemente sowie die reaktive Oberfläche umfaßt. Dieser Kanal erstreckt sich von einem Ende des Meßfühlers bis zum anderen Ende des Meßfühlers, an dem die reaktive Oberfläche angebracht ist, und zurück indem er einen die beiden Kanäle trennenden Steg umfaßt. In diesem als Kühlschleife zu bezeichnendem Bauteil, wird eine geeignete Kühlflüssigkeit, z. B. Wasser, umgewälzt. Die gesamte Einheit ist in Hartplastik eingegossen und recyclebar, d. h. sowohl die Goldfolie als auch das Plastik sind wiederverwertbar.
    Die Steuerung sowohl der Erhitzung der reaktiven Oberfläche, als auch der Umwälzgeschwindigkeit und Vorkühltemperatur der Kühlflüssigkeit wird über einen elektronischen dritten Bateil, der außerhalb des Meßfühlers angebracht ist, vorgenommen. Diese dritte Einheit umfaßt auch das Vorratsbehältnis sowie die Verbindungsanschlüsse für die Kühlflüssigkeit. In dieser dritten Einheit befindet sich weiterhin eine Mikropumpe, die für die Umwälzung der Kühlflüssigkeit zuständig ist. Durch Anflanschen der Kühlflüssigkeitsschläuche an die Meßeinheit sowie durch das Anschließen der Stromzufuhr an die reaktive Oberfläche wird der Meßfühler einsatzbereit. Über eine Eingabeeinheit, die an der Oberfläche der Steuereinheit angebracht ist, die über einen digitalen Display verfügt, sind sowohl die einzelnen Temperaturbereiche, als auch die Dauer ihrer Einwirkung auf diese Oberfläche vorwählbar.
    Beispiel 5: Durchführung einer Vermehrungsreaktion mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
    Bei dem hier als Beispiel einer erfindungsgemäßen Anwendung der Vorrichtung handelt es sich um eine als Polymerasekettenreaktion bezeichnete Amplifikationsreaktion von einer vorgegebenen Nukleinsäuresequenz. Für diese Nukleinsäuresequenz sind zwei Primer mit einer Länge von jeweils 16 Basen, die im Abstand von 4 Nukleotiden zueinander codieren, ausgewählt worden. Der eine Primer ist in seiner Sequenz identisch, der andere komplementär zur analysierenden Sequenz. Der hier als identisch bezeichnete Primer ist dabei über seine am 5' -Ende vorliegenden Biotinmarkierung an die reaktive Oberfläche gekoppelt. Der andere, komplementäre Primer sowie alle weiteren Reagenzien, die üblicherweise in einer sogenannten PCR-Reaktion zum Einsatz kommen, sind dem Reaktionsansatz zugegeben. Durch Eingabe der entsprechenden Reaktionstemperaturen die in unmittelbarer Nähe der reaktiven Oberfläche herrschen sollen, und durch Eintauchen der reaktiven Oberfläche bzw. des Meßfühlers (siehe Beispiel 4) in den Reaktionsansatz, wird die Reaktion gestartet. Die Temperaturänderungen in der reaktiven Oberfläche sind so programmiert, daß die Durchführung von 50 Erwärmungs- und Abkühlungszyklen in ca. 1 Min. durchgeführt werden kann. Durch anschließendes Eintauchen des Meßfühlers in eine Lösung mit destilliertem Wasser und kurzfristiges Erhitzen, wird die Oberfläche von allen nicht kovalent gebundenen Reaktionspartner gereinigt. Die so gereinigte Oberfläche, die nun nur noch Primermoleküle und extendierte Primermoleküle enthält, wird zur Analyse, zusammen mit dem Meßfühler, in ein Gerät eingeführt, das nach dem Prinzip der Plasmonenresonanz, eine direkte Bestimmung der Menge des extendierten Produkts zuläßt.
    Bezugszeichenliste
    1.
    erfindungsgemäße Vorrichtung, Meßeinheit
    2.
    Reaktionsgemisch
    3.
    Reaktionsgefäß
    4.
    Kühlelement
    5.
    Heizelement/Oberfläche
    6.
    Oligonukleotide
    7.
    Anschlüsse für Kühlelement
    8.
    Anschlüsse für Heizelement
    9.
    auswechselbarer Meßfühler
    10.
    Elektronikänschluß und Kühlaggregat
    11.
    Halterung für Reaktionsgefäß
    12.
    Rührer
    13.
    Kühlflüssigkeit
    14.
    Unterstützungs- und Trennfilter (Abtrennung des Kühlmittels)

    Claims (41)

    1. Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsäuren in einer Reaktionsmischung, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der an die Reaktionsmischung angrenzenden Oberfläche und deren unmittelbare Umgebung reguliert wird, jedoch der Hauptraum der Reaktionsmischung im wesentlichen isotherm verbleibt.
    2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem mindestens ein Arbeitsschritt eine Temperatur, die von dem Reaktionsansatz abweicht, aufweist.
    3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein temperaturverändernder Arbeitsschritt der thermischen Denaturierung dient.
    4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein temperaturverändernder Schritt der Hybridisation von Nukleinsäuren dient.
    5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein temperaturverändernder Schritt der Extension eines Matrizenmoleküls dient.
    6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Arbeitsschritte der zielsequenz-abhängigen Amplifikation eines Matrizermolekuls dienen.
    7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für eine Detektion der Bearbeitungs- und Vermehrungsergebnisse geeignete Reaktanden an eine Oberflache gebunden vorliegen.
    8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zur Bearbeitung von Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden sind.
    9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß diese Mittel Oligonukleotide sind.
    10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß sich Mittel zur Bearbeitung der Nukleinsäuren in der Reaktionsmischung befinden.
    11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Detektion spezifischer Sequenzen nach Hybridisierung mit markierten Nukleinsäuren oder markierbaren Nukleinsäuren durchgeführt wird.
    12. Verfahren gemaß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermehrung (Amplifikation) eine nicht temperatur resistente DNA-Polymerase eingesetzt wird.
    13. Verfahren gemaß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermehrung (Amplifikation) eine temperatur resistente DNA-Polymerase eingesetzt wird.
    14. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermehrung (Amplifikation) eine RNA-abhängige RNA-Polymerase verwendet wird.
    15. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermehrung (Amplifikation) eine RNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet wird.
    16. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermehrung (Bearbeitung) eine DNA-Ligase verwendet wird.
    17. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1, 6, 8, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zur Bearbeitung der Nukleinsäuren an die Oberfläche gebracht werden.
    18. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1, 8, 9, 10, 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der bei der Bearbeitung beteiligten, bei erhöhter Temperatur ablaufenden Reaktionen an einer Oberflache abläuft.
    19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß für die Meßlösung eine weitestgehende Volumenunabhängigkeit besteht, d. h. sowohl in sehr kleinen als auch sehr großen Volumina dieses Verfahren zur Bearbeitung und Vermehrung von Nukleinsäuren durchgeführt werden kann.
    20. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Diffusion der Nukleinsäuren in der Reaktionsmischung durch Konvektion oder Bewegung gesteigert wird.
    21. Vorrichtung zur Bearbeitung von Nukleinsäuren mit Hilfe eines Temperaturregulationselements, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung eine temperaturregulierbare Oberfläche enthält, an welche Mittel zur Bearbeitung der Nukleinsäuren gebunden sind.
    22. Vorrichtung gemäß Anspruch 21 zur Verwendung für Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20.
    23. Vorrichtung zur Bearbeitung von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 21 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß die in das Reaktionsmilieu ragende Oberfläche gekühlt und/oder geheizt werden kann.
    24. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 21 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß die temperaturregulierende Oberfläche durch chemische oder physikalische Behandlung zur Aufnahme von Reaktanden zur Bearbeitung der Nukleinsäuren vorbereitet wurde.
    25. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner eine Steuereinheit zur Regulierung der Temperatur der Oberfläche aufweist.
    26. Vorrichtung gemäß der Ansprüche 21, 22 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß eine zeitlich koordinierte Regulation der Temperaturänderungen vorgenommen wird.
    27. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 21, 22 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Heizelement mit einer geringen und ein Kühlelement einer hohen Wärmekapazität aufweist.
    28. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 21 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche zu einer direkten Auswertung der Bearbeitungs- und Vermehrungsergebnisse verwendet wird.
    29. Vorrichtung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die temperaturregulierte Oberfläche aus einer Folie aus wärmeleitfähigem Material besteht, bevorzugterweise Metall, besonders bevorzugterweise Gold.
    30. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 21, 22 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Kühlung der temperaturregulierten Oberfläche auf der dem Reaktionsansatz distalen Seite vorgenommen wird.
    31. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 21, 22 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Heizelement identisch ist mit der reaktiven Oberfläche, wobei diese Oberfläche speziell behandelt ist.
    32. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 21, 22, 24, 30 und 31, dadurch gekennzeichnet, daß Nukleinsäuren an der Oberfläche des Heizelements fixiert sind.
    33. Vorrichtung gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierung über Mittlungsstrukturen zum Heizelement erfolgt.
    34. Vorrichtung gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß diese Fixierung über Mittlungsstrukturen sowohl über chemische als auch biospezifische Bindung erfolgt.
    35. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 21 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß Nukleinsäuren nur vorübergehend in unmittelbarer Nähe der Oberfläche assoziieren bzw. dort verweilen.
    36. Vorrichtung gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß diese Assoziation von Nukleinsäuren an die reaktive Oberfläche durch die Bindung dieser Nukleinsäuren an Magnetobeads bzw. die Adsorption dieser Nukleinsäuren an Magnetobeads gewährleistet wird.
    37. Vorrichtung gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß ein induzierbares Magnetfeld zur Attrahierung der Magnetobeads dient.
    38. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung, die Heiz- und Kühlelemente enthält, nur einmal verwendbar ist, um Kontaminationen vorzubeugen.
    39. Vorrichtung gemäß Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte Vorrichtung mehrfach verwendbar ist, und nur die Oberfläche bzw. deren Halterung für einzelne Arbeitsgänge ausgetauscht werden muß.
    40. Vorrichtung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die temperaturregulierte Oberfläche ohmisch beheizt wird.
    41. Vorrichtung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die temperaturregulierte Oberfläche durch Strahlen, bevorzugterweise Infrarotstrahlen und wiederum bevorzugterweise lasererzeugte Infrarotstrahlen, erwärmt wird.
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    WO (1) WO1995025592A1 (de)

    Families Citing this family (16)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    JP3985872B2 (ja) * 1995-07-31 2007-10-03 プレシジョン・システム・サイエンス株式会社 容器
    DE19610146C1 (de) 1996-03-15 1997-06-12 Wolf Prof Dr Bertling Vorrichtung zur Untersuchung von biologischen und medizinischen Proben
    US5912129A (en) * 1998-03-05 1999-06-15 Vinayagamoorthy; Thuraiayah Multi-zone polymerase/ligase chain reaction
    US6171850B1 (en) 1999-03-08 2001-01-09 Caliper Technologies Corp. Integrated devices and systems for performing temperature controlled reactions and analyses
    US6403317B1 (en) * 1999-03-26 2002-06-11 Affymetrix, Inc. Electronic detection of hybridization on nucleic acid arrays
    US6544477B1 (en) 2000-08-01 2003-04-08 Regents Of The University Of Minnesota Apparatus for generating a temperature gradient
    DE10315074A1 (de) * 2003-04-02 2004-10-14 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren
    US20060258021A1 (en) * 2003-08-12 2006-11-16 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Biocompatible linkers for surface plasmon resonance biosensors
    US7833709B2 (en) 2004-05-28 2010-11-16 Wafergen, Inc. Thermo-controllable chips for multiplex analyses
    US7939312B2 (en) * 2006-08-30 2011-05-10 Dxna Llc Rapid thermocycler with movable cooling assembly
    CA2677833C (en) 2007-01-22 2016-05-03 Wafergen, Inc. Apparatus for high throughput chemical reactions
    EP3822361A1 (de) 2015-02-20 2021-05-19 Takara Bio USA, Inc. Verfahren zur schnellen präzisen abgabe, visualisierung und analyse von einzelzellen
    CA3020629A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Takara Bio Usa, Inc. Multi-z imaging and dispensing with multi-well devices
    DE102018103215B3 (de) * 2018-02-13 2019-08-14 Gna Biosolutions Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Extraktion einer Nukleinsäure aus einer Probenflüssigkeit
    DE102019114011B3 (de) * 2019-05-07 2020-07-30 Gna Biosolutions Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Extrahieren und/oder Vervielfältigen einer Target-Nukleinsäure
    DE102020118516A1 (de) 2020-06-26 2021-12-30 Gna Biosolutions Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Extraktion und Amplifikation einer Target-Nukleinsäure

    Family Cites Families (35)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    US5261545A (en) * 1978-06-29 1993-11-16 Yoshino Kogyosho Co., Ltd. Polyester container
    US4256945A (en) * 1979-08-31 1981-03-17 Iris Associates Alternating current electrically resistive heating element having intrinsic temperature control
    JPS60241884A (ja) * 1984-05-15 1985-11-30 Tokyo Daigaku 自動サイクリング反応装置およびこれを用いる自動分析装置
    US4965188A (en) * 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
    US5038852A (en) * 1986-02-25 1991-08-13 Cetus Corporation Apparatus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
    US5089406A (en) * 1987-01-07 1992-02-18 Allied-Signal Inc. Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences
    EP0357611B1 (de) * 1987-02-26 1995-04-26 The University Of Sydney Verfahren zum nachweis des karzinogenen menschlichen papillomavirus
    US4902624A (en) * 1987-11-23 1990-02-20 Eastman Kodak Company Temperature cycling cuvette
    FI79342C (fi) * 1987-12-23 1989-12-11 Orion Yhtymae Oy Apparat, del av en apparat och foerfarande foer maongfaldigande av nukleinsyror.
    EP0433363A4 (en) * 1988-09-08 1992-05-06 The Salk Institute For Biological Studies Replicative rna-based amplification detection systems
    US4865986A (en) * 1988-10-06 1989-09-12 Coy Corporation Temperature control apparatus
    US4950608A (en) * 1989-04-25 1990-08-21 Scinics Co., Ltd. Temperature regulating container
    CA2016981C (en) * 1989-06-12 1994-09-27 Mark Joseph Devaney, Jr. Temperature control device and reaction vessel
    WO1991004340A1 (en) * 1989-09-20 1991-04-04 Cambridge Biotech Corporation In vitro, isothermal nucleic acid amplification
    US5346672A (en) * 1989-11-17 1994-09-13 Gene Tec Corporation Devices for containing biological specimens for thermal processing
    WO1991007504A1 (en) * 1989-11-21 1991-05-30 Kindconi Pty. Ltd. Improved dna polymerisation device
    US5427930A (en) * 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction
    EP0745689A3 (de) * 1990-05-11 1996-12-11 Microprobe Corporation Teststab für einen Nukleinsäure-Hybridisierungstest
    US5187084A (en) * 1990-06-22 1993-02-16 The Dow Chemical Company Automatic air temperature cycler and method of use in polymerose chain reaction
    DE4029004C1 (de) * 1990-09-13 1992-04-02 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften Ev, 3400 Goettingen, De
    RU2017821C1 (ru) * 1990-10-10 1994-08-15 Анатолий Михайлович Онищенко Способ амплификации днк и устройство для его осуществления
    DE4034036C2 (de) * 1990-10-26 1994-03-03 Diagen Inst Molekularbio Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellsuspensionen
    KR100236506B1 (ko) * 1990-11-29 2000-01-15 퍼킨-엘머시터스인스트루먼츠 폴리머라제 연쇄 반응 수행 장치
    US5270183A (en) * 1991-02-08 1993-12-14 Beckman Research Institute Of The City Of Hope Device and method for the automated cycling of solutions between two or more temperatures
    CA2065719A1 (en) * 1991-04-30 1992-10-31 John B. Findlay Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
    WO1992020778A1 (en) * 1991-05-24 1992-11-26 Kindconi Pty Limited Biochemical reaction control
    CA2074214C (en) * 1991-07-23 2000-02-22 Will Bloch Improvements in the in situ pcr
    DE4213029A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleins aeuresequenzen
    CA2126748A1 (en) * 1991-12-24 1993-06-25 Stephen Minter Manipulating nucleic acid sequences
    JPH05236997A (ja) * 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
    US5587128A (en) * 1992-05-01 1996-12-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification devices
    US5498392A (en) * 1992-05-01 1996-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification device and method
    GB9212164D0 (en) * 1992-06-09 1992-07-22 Medical Res Council Preparation of nucleic acids
    EP0603411B1 (de) * 1992-07-01 1998-08-19 KATOH, Keiichi Keramischer apparat zur erwaermung und kuehlung
    DE4301693A1 (de) * 1993-01-22 1994-07-28 Cytech Biomedical Inc Verfahren zur Amplifikation und Verfahren zum Nachweis von Polynucleotidsequenzen an fester Phase

    Also Published As

    Publication number Publication date
    EP0751827A1 (de) 1997-01-08
    WO1995025592A1 (de) 1995-09-28
    JP3591653B2 (ja) 2004-11-24
    JPH09510353A (ja) 1997-10-21
    ES2123239T3 (es) 1999-01-01
    US5985555A (en) 1999-11-16
    ATE169844T1 (de) 1998-09-15
    DE4409436A1 (de) 1995-09-21
    DE59503269D1 (de) 1998-09-24

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