EP0787182A2 - Embryonale herzmuskelzellen, ihre herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Embryonale herzmuskelzellen, ihre herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number
EP0787182A2
EP0787182A2 EP95940117A EP95940117A EP0787182A2 EP 0787182 A2 EP0787182 A2 EP 0787182A2 EP 95940117 A EP95940117 A EP 95940117A EP 95940117 A EP95940117 A EP 95940117A EP 0787182 A2 EP0787182 A2 EP 0787182A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
muscle cells
cells
genes
heart muscle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP95940117A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang-Michael Franz
Anna M. Wobus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leibniz-Institut fur Pflanzengenetik und Kulturpf
Original Assignee
Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung filed Critical Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Publication of EP0787182A2 publication Critical patent/EP0787182A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the invention relates to embryonic (cardiomyocytic and cardiomyoblastic) heart muscle cells, their production and their use, in particular for cell-mediated gene transplantation. Areas of application of the invention are medicine and genetic engineering.
  • the aim of the invention is, starting from pluripotent embryonic stem cells (ESC) or primordial germ cells (EGC, Stewart et al, Dev. Biol. 161/1994 /, 626-628) after their differentiation into spontaneously pulsating cardiac cells embryonic (cardiomyocytic or cardio -myoblastic) cardiac muscle cells, which have largely identical properties with cardiac muscle tissue. These cells should be suitable for therapeutic use, possibly after additional genetic engineering changes.
  • the object of the invention is to construct a vector system for modifying the stem cells and to develop a selection method for the transfected cells.
  • the invention is implemented with modified embryonic stem cells according to claims 1 to 4, the vector systems according to claims 5 and 6 and the selection method according to claim 7.
  • the scope of the invention also includes the use of the modified embryonic stem cells according to claims 8 to 10.
  • the vectors according to the invention consist of the following components: a) the regulatory, 2.1 kb long DNA sequence of the ventricle-specific myosin light chain-2 (MLC-2v) as a promoter, the selectable marker gene ⁇ -galactosidase and the Reporter gene neomycin as a fusion gene "ßgeo" and the SV40-PolyA-Tail (pAA) and possibly a position for the inclusion of immortalizing genes. b) the regulatory DNA sequence of the herpes simplex virus thymidine kinase promoter (HSV-Tk), the selectable marker gene hygromycin and the SV40 polyA tail (pAA).
  • Pluripotent embryonic stem cells are transfected with these vectors in vitro.
  • the successfully transfected cells are selected in the first step with the help of hygromycin.
  • Hygromycin-resistant cells are then differentiated into so-called embryoid bodies ("embryoid bodies").
  • the hygromycin-resistant embryoid bodies are then selected using the Geneticin (G418) cell poison.
  • the cells obtained are grown and examined for their composition (gene expression, proteins), their function and their contractile properties.
  • Embryonic stem cells (ESC) or primordial germ cells (EGC) of various origins, including those from mice, rats, pigs, cattle, dogs, rabbits, hamsters, including human cells, can be used as the starting material.
  • the vectors according to the invention and the sequence of the cell selection process are shown in Figure 1.
  • the invention further relates to cells which, in addition to the vectors a) and b) mentioned, also contain therapeutic genes such as, for. B. contain the angiogenesis factors VEGF or bFGF, which were introduced by viral or non-viral gene transfer.
  • the cell lines thus obtained can - with or without viral sequences - for cell-mediated gene transplantation, in particular which are used to build healthy tissue and to support contractile functions.
  • Another important use of the cell lines according to the invention is the in vitro testing of biologically active substances, in particular for the investigation of pharmacologically relevant substances or for the determination of toxic effects of exogenous active substances on cardiac cells in culture. This saves animal experiments, particularly in screening programs, and fulfills urgent public demands for animal replacement models.
  • the cell lines can also serve as vesicles for local gene transfer into the myocardium.
  • the desired therapeutic genes are transfected by a viral, preferably with an adenovirus or an adenovirus-associated virus shuttle vector, or a non-viral gene transfer method.
  • the genes are preferably packaged with the AAV vector pSub201.
  • the invention makes it possible for the first time to treat heart muscle diseases with the aid of cellular gene transfer (gene therapy). This means considerable medical progress, in particular diseases such as ischemic and congenital cardiomyopathies can be treated with greater prospects of success in the future.
  • the following elements are used to construct the vectors: 2.1 kb MLC-2v promoter (can be cloned with Kpnl and EcoRI), fusion gene ßgeo (can be cloned with BamHI), SV40-PolyA (can be cloned with Sacl) and Tk-hygromycin fusion gene in the bluescript KS- Vector. As shown in Figure 1, these elements become 2 vectors for cotransfection into pluripotent embryonic Stem cells created:
  • Any ES cell line which differentiates into cardiomyocytes can be used as a pluripotent stem cell line (Wobus et al, Differentiation 48/1991 /, 173-182), e.g. B. line D3 (Doetschmann et al, J. Embryol. Exp. Morphol. 3/1985 /, 27-45).
  • the D3 cells are cultivated on gelatinized plates with standardized culture medium on a feeder layer or in the presence of the recombinant "leukemia inhibiting factor" (LIF).
  • LIF corresponds to the "Differentiation Inhibiting Factor", which prevents the differentiation of the ES cells and promotes the cell division of the pluripotent ES cells.
  • the DNA constructs shown in Figure 1 are introduced into the ES cells by electroporation.
  • the vectors are linearized using restriction digestion and transfected in a concentration of 25 ⁇ g / ml using electroporation.
  • the pluripotent ES cell lines are then expanded in the LIF / ES cell medium. Only the thymidine kinase promoter is active in the undifferentiated ES cells, which leads to expression of the hygromycin resistance gene. By adding hygromycin B, the ES cells are selected for the incorporation of the foreign DNA (positive selection).
  • the differentiation system of the hanging drop is used to obtain "embryoid bodies".
  • a cell suspension containing about 400-600 ES cells in 20 l is pipetted onto the lids of petri dishes which are filled with a physiological buffer solution.
  • the cells collect in drops and form after two to three days of incubation "embryoid bodies”. After 7 days, the "embryoid bodies” are transferred to microtest tissue culture dishes, where they adhere to the gelatin-coated substrate.
  • various cell types, including cardiac muscle cells grow out ( Figure 2). Two to ten days after plating, about 80 to 90% of the adult "embryoid bodies” colonies contain spontaneously and synchronously contracting cardiac muscle cells (Wobus et al, 1991).
  • the MLC-2v promoter is active in these embryonic heart muscle cells. If the MLC-2v-ßgeo vector is successfully transfected and integrated into the genome of the ES cells, the fusion gene ß-galactosidase / neomycin is expressed.
  • the cardiomyocyte cells which are of clonal origin, can be identified by blue staining in the ⁇ -galactosidase assay.
  • the positive ES cell clones which contain both the Tk-hygromycin and the MLC-2v-ßgeo fusion gene, are expanded again and some are brought under the conditions described above to differentiate into "embryoid bodies".
  • the cell poison Geneticin G418 is added to the "embryoid bodies" in a concentration of 300 ⁇ g / ml.
  • the embryonic (cardiomyocytic or cardiomyoblastic) heart muscle cells are selected at an early stage.
  • the cells obtained are examined for tissue-specific gene expression, functional properties with the aid of electrophysiological techniques and for their contractile properties; the composition of the contractile proteins is characterized using appropriate monoclonal antibodies.
  • divisible beating cells can then be transferred to adult and neonatal cardiomyopathic mdx mice after thoracomy and direct injection into the myocardium. 5a

Abstract

Die Erfindung betrifft embryonale (kardiomyozytäre und kardiomyoblastäre) Herzmuskelzellen, ihre Herstellung und ihre Verwendung, insbesondere zur zellvermittelten Gentransplantation. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die Gentechnik. Die embryonalen Herzmuskelzellen gemäß der Erfindung enthalten zwei Genkonstrukte aus a) regulatorischer, 2,1 kb langer DNA-Sequenz des ventrikelspezifischen Myosin-Leicht-Kette-2 (MLC-2v) Promotors, dem selektionierbaren Markergen β-Galaktosidase in Fusion mit dem Reportergen Neomycin und aus b) regulatorischer DNA-Sequenz des Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase-Promotors und den selektionierbaren Markergen Hygromycin, sowie ggf. immortalisierende Gene und/oder ggf. durch homologe Rekombination inaktivierte Gene und/oder ggf. ein oder mehrere therapeutische Gene. Sie können vorteilhaft zur zellvermittelten Gentransplantation, insbesondere zum Aufbau gesunden Gewebes und zur Unterstüzung kontraktiler Funktionen, zur Untersuchung von Substanzen, insbesondere für pharmakologische Untersuchungen und für den Transfer therapeutischer Gene in das Myokard eingesetzt werden.

Description

Embryonale Herzmuskelzellen, ihre Herstellung und ihre Verwendung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft embryonale (kardiomyozytäre. und kardiomyoblastäre) Herzmuskelzellen, ihre Herstellung und ihre Verwendung, insbesondere zur zeilvermittelten Gentransplanta¬ tion. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die Gentechnik.
Es gibt bereits mehrere Arbeiten, die sich mit Herzmuskelzell¬ kulturen von Säugetieren beschäftigen. Die ersten Untersuchungen wurden mit Primärkulturen von embryonalem, neonatalem oder adultem Herzgewebe durchgeführt. Vorteilhafter ist die Verwendung von permanenten Zellinien von kardiomyozytärem Gewebe, weil man damit größere Mengen einer homogenen Zellpopulation auf einem definierten Entwicklungsstand zur Verfügung stellen kann. Deshalb hat es eine Reihe von Versuchen zur Immortalisierung von Herzmuskelzellen gegeben (u. a. A. Sen et al, J.Biol.Chem. 263/1988/, 19132-19136). Alle bisherigen Zellinien haben jedoch den Nachteil, daß sich bei einer Langzeitkultivierung funktioneile Defekte bemerkbar machen.
Die Erfindung hat das Ziel, ausgehend von pluripotenten embryonalen Stammzellen (ESC) oder primordialen Keimzellen (EGC, Stewart et al, Dev. Biol. 161/1994/, 626-628) nach deren Differenzierung in spontan pulsierende Herzzellen embryonale (kardiomyozytäre bzw. kardio-myoblastäre) Herzmuskelzellen zu gewinnen, welche weitgehend identische Eigenschaften mit Herzmuskelgewebe besitzen. Diese Zellen sollen für einen therapeutischen Einsatz, ggf. nach zusätzlicher gentechnischer Veränderung, geeignet sein. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Vektorsystem zur Modifizierung der Stammzellen zu konstruieren und ein Selektionsverfahren für die transfizierten Zellen zu entwickeln. Die Erfindung wird mit modifizierten embryonalen Stammzellen gemäß Anspruch 1 bis 4, den VektorSystemen gemäß Anspruch 5 und 6 und den Selektionsverfahren gemäß Anspruch 7 realisiert. Zum Schutzumfang der Erfindung gehört auch die Verwendung der modifizierten embryonalen Stammzellen gemäß Anspruch 8 bis 10.
Die erfindungsgemäßen Vektoren bestehen aus folgenden Bestand¬ teilen: a)der regulatorischen, 2,1 kb langen DNA-Sequenz des ventrikel¬ spezifischen Myosin-Leicht-Kette-2(MLC-2v) als Promotor, dem selektionierbaren Markergen ß-Galaktosidase und dem Reportergen Neomycin als Fusionsgen "ßgeo" und dem SV40-PolyA-Tail(pAA) und ggf. einer Position zur Aufnahme von immortalisierenden Genen. b)der regulatorischen DNA-Sequenz des Herpes-simplex-Virus- Thymidinkinase-Pro otors(HSV-Tk) , dem selektionierbaren Marker¬ gen Hygromycin und dem SV40-PolyA-Tail (pAA) .
Mit diesen Vektoren werden pluripotente embryonale Stammzellen in vitro transfiziert. Die erfolgreich transfizierten Zellen werden im ersten Schritt mit Hilfe von Hygromycin selektiert. Hygromycin-resistente Zellen werden dann zu sog. Embryoidkörpern ("embryoid-bodies") differenziert. Danach erfolgt eine Selektion der Hygromycin-resistenten Embryoidkörper mit dem Zellgift Geneticin (G418). Die erhaltenen Zellen werden weitergezüchtet und auf ihre Zusammensetzung (Genexpression, Proteine), ihre Funktion und ihre kontraktilen Eigenschaften untersucht. Als Ausgangsmaterial können embryonale Stammzellen (ESC) oder primordiale Keimzellen (EGC) unterschiedlichster Herkunft, u. a. von Maus, Ratte, Schwein, Rind, Hund, Kaninchen, Hamster, einschließlich menschlicher Zellen, eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren und der Ablauf des Zell- selektionsVerfahrens sind in Abbildung 1 dargestellt. Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Zellen, die neben den genannten Vektoren a) und b) auch noch therapeutische Gene wie z. B. die Angiogenesefaktoren VEGF oder bFGF enthalten, welche durch viralen oder nichtviralen Gentransfer eingebracht wurden. Die so erhaltenen Zellinien können - mit oder ohne virale Sequenzen - zur zeilvermittelten Gentransplantation, insbeson- dere zum Aufbau gesunden Gewebes und zur Unterstützung kontraktiler Funktionen, verwendet werden.
Eine weitere wichtige Verwendung der erfindungsgemäßen Zellinien besteht in der in-vitro-Testung von biologisch aktiven Substanzen, insbesondere zur Untersuchung pharmakologisch relevanter Substanzen oder zur Feststellung toxischer Wirkungen exogener Wirkstoffe an Herzzellen in Kultur. Damit werden insbesondere in Screeningprogrammen Tierversuche eingespart und damit dringende Forderungen der Öffentlichkeit nach Tierersatzmodellen erfüllt.
Die Zellinien können weiterhin als Vesikel für einen lokalen Gentransfer in das Myokard dienen. Dazu werden die gewünschten therapeutischen Gene durch ein virales, bevorzugt mit einem Adenovirus- oder einem Adenovirus-assoziierten-Virus-Shuttle- Vektor, oder ein nichtvirales Gentransferverfahren transfiziert. Bevorzugt erfolgt die Verpackung der Gene mit dem AAV-Vektor pSub201.
Durch die Erfindung wird erstmalig ermöglicht, Herzmuskel¬ erkrankungen mit Hilfe des zellulären Gentransfers zu behandeln (Gentherapie). Das bedeutet einen erheblichen medizinischen Fortschritt, insbesondere können auch Erkrankungen wie ischämische und kongenitale Kardiomyopathien künftig mit größeren Erfolgsaussichten therapiert werden.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
1. Klonierung der Vektoren zur Selektion embryonaler (kardiomyozytärer und kardiomyoblastärer) Herzmuskelzellen
Zum Aufbau der Vektoren geht man von folgenden Elementen aus: 2.1 kb MLC-2v Promotor (klonierbar mit Kpnl und EcoRI), Fusionsgen ßgeo (klonierbar mit BamHI), SV40-PolyA (klonierbar mit Sacl) und Tk-Hygromycin Fusionsgen im Blueskript KS-Vektor. Wie in Abbildung 1 dargestellt, werden aus diesen Elementen 2 Vektoren für die Kotransfektion in pluripotente embryonale Stammzellen erstellt:
(A) 2,1 MLC-2v-ßgeo
(B) Tk-Hygromycin.
2. Kotransfektion der Vektoren in pluripotente Stammzellen (ES- Zellen) und Selektion mit Hygromycin B
Als pluripotente Stammzellinie kann jede ES-Zellinie verwendet werden, die in Kardiomyozyten differenziert (Wobus et al, Differentiation 48/1991/, 173-182), z. B. die Linie D3 (Doetschmann et al, J. Embryol. Exp. Morphol. 3/1985/, 27-45). Die D3-Zellen werden auf gelatinierten Platten mit standardisiertem Kulturmedium auf feeder-layer oder in Anwesenheit des rekombinanten "Leukemia-Inhibiting-Factor"(LIF) kultiviert. Der LIF entspricht dem "Differentiation Inhibiting Factor", welcher die Differenzierung der ES-Zellen verhindert und die Zellteilung der pluripotenten ES-Zellen fördert. Die in Abbildung 1 dargestellten DNA-Konstrukte werden durch Elektro- poration in die ES-Zellen eingebracht. Hierfür werden die Vektoren mittels Restriktionsverdau linearisiert und in einer Konzentration von 25 μg/ml mittels Elektroporation transfiziert. Danach werden die pluripotenten ES-Zellinien im LIF/ES- Zellmedium expandiert. In den undifferenzierten ES-Zellen ist nur der Thymidinkinase-Promotor aktiv, was zu einer Expression des Hygromycin-Resistenzgens führt. Durch Zugabe von Hygromycin B werden die ES-Zellen auf den Einbau der Fremd-DNA hin selektioniert (Positiv-Selektion) .
3. Nachweis der Integration von MLC-2v-ßgeo in ES-Zellen und "embryoid-bodies"
Zur Gewinnung von "embryoid bodies" wird das Differenzierungs¬ system des hängenden Tropfens benutzt. Hierbei wird eine Zellsuspension, die etwa 400-600 ES-Zellen in 20 1 enthält, auf die Deckel von Petrischalen pipettiert, die mit einer physiologischen Pufferlösung gefüllt sind. Die Zellen sammeln sich im Tropfen und bilden nach zwei- bis dreitägiger Inkubation "embryoid bodies". Nach 7 Tagen werden die "embryoid bodies" auf Mikrotestgewebekulturschalen übertragen, wo sie auf dem Gelatine-beschichteten Substrat anhaften. Während der darauf¬ folgenden Kultivierung wachsen verschiedene Zeiltypen, u. a. Herzmuskelzellen, aus (Abbildung 2). Zwei bis zehn Tage nach Ausplattierung enthalten etwa 80 bis 90% der ausgewachsenen "embryoid bodies" Kolonien spontan und synchron kontrahierender Herzmuskelzellen (Wobus et al, 1991). In diesen embryonalen Herzmuskelzellen ist der MLC-2v Promotor aktiv. Bei erfolgreicher Transfektion und Integration des MLC-2v-ßgeo Vektors in das Genom der ES-Zellen kommt es zur Expression des Fusionsgens ß-Galaktosidase/Neomycin. Durch Blaufärbung im ß- Galaktosidase-Assay lassen sich die kardiomyozytären Zellen, welche klonalen Ursprungs sind, identifizieren.
4. Selektion embryonaler kardiomyozytärer und kardioblastärer Zellen
In einem zweiten Schritt werden die positiven ES-Zellklone, welche sowohl das Tk-Hygromycin als auch das MLC-2v-ßgeo Fusionsgen enthalten, erneut expandiert und ein Teil unter den oben beschriebenen Bedingungen zur Differenzierung in "embryoid bodies" gebracht. Zum Zeitpunkt der kardiomyogenen Differenzierung im Embryoidkörper wird das Zellgift Geneticin (G418) in einer Konzentrationen von 300 μg/ml zu den "embryoid bodies" gegeben. Damit werden die embryonalen (kardiomyozytären bzw. kardiomyoblastären) Herzmuskelzellen in einem frühen Stadium selektiert.
Die gewonnenen Zellen werden auf gewebespezifische Genexpression, funktioneile Eigenschaften mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken und auf ihre kontraktilen Eigenschaften untersucht, die Zusammensetzung der kontraktilen Proteine wird mit entsprechenden monoklonalen Antikörpern charakterisiert. Im Rahmen einer Gentherapie können teilungsfähige schlagende Zellen anschließend auf adulte und neonatale kardiomyopathische mdx-Mäuse nach Thorakomie und direkter Injektion in das Myokard übertragen werden. 5a
Text zu Abbildung 1:
(C) Kotransfektion von Tk-Hygromycin und 2.1 MLC-2v-ßgeo in ES(EG)-Zellen
- Selektion der transfizierten ES(EG)-Zellen
- Differenzierung der Hyg-resistenten ES(EG)-Zellen zu "embryoid-bodies"
- Selektion von Herzmuskelzellen aus "embryoid-bodies" mittels G418
- Charakterisierung der Hyg- und G418-resistenten Zellen auf kardiomyozytäre bzw. kardiomyoblastäre Eigenschaften
Text zu Abbildung 2:
Embryonale Stammzellen kultiviert auf "feeder layer"
Kultivierung von 400 oder 600 Zellen/20 μl Medium in hängenden Tropfen (Inkubation für 2 Tage) l Umsetzung der "embryoid bodies" und Kultivierung in Suspension
(Inkubation für 5 Tage) l Ausplattieren von "embryoid bodies" auf 24-well Gewebe- Kulturplatten (Inkubation bis zu 20 Tagen) l
1. PCR Analyse
2. Enzymatische Dissoziation der Cardiomyocyten
3. Immunfluoreszens
4. "Patch-clamp" - Versuche

Claims

Patentansprüche
1. Embryonale Herzmuskelzellen, enthaltend zwei Genkonstrukte aus zwei verschiedenen regulatorischen DNA-Sequenzen und zwei verschiedenen selektionierbaren Markergenen.
2. Embryonale Herzmuskelzellen gemäß Anspruch 1, enthaltend zwei Genkonstrukte aus a) regulatorischer, 2,1 kb langer DNA-Sequenz des ventrikel¬ spezifischen Myosin-Leicht-Kette-2(MLC-2v) Promotors, dem selek¬ tionierbaren Markergen ß-Galaktosidase und dem Reportergen Neomycin, b) regulatorischer DNA-Sequenz des Herpes-simplex-Virus-Thymi- dinkinase-Promotors und dem selektionierbaren Markergen Hygromycin.
3. Embryonale Herzmuskelzellen gemäß Anspruch 1 und 2, enthaltend zusätzlich immortalisierende Gene und/oder durch homologe Rekombination inaktivierte Gene und/oder ein oder mehrere therapeutische Gene.
4. Embryonale Herzmuskelzellen gemäß Anspruch 1 bis 3, enthaltend zusätzlich Sequenzen des Adenovirus (Ad) oder des Adenoassoziierten Virus (AAV) .
5. Embryonale Herzmuskelzellen gemäß Anspruch 1 bis 4, enthaltend zusätzlich einen Angiogenesefaktor, bevorzugt "vascular endothelial growth factor", VEGF, oder "basic fibroblast growth factor", bFGF, unter der Kontrolle eines in diesen Zellen aktiven Promotors als therapeutisches Gen.
6. Vektor, bestehend aus MLC-2 Promotor, selektionierbarem Markergen β-Galactosidase und dem Reportergen Neomycin als Fusionsgen "ßgeo", SV40-Poly A-Tail und ggf. einer Position zur Aufnahme von immortalisierenden Genen.
7. Vektor, bestehend aus regulatorischer DNA-Sequenz des Herpes- simplex-Virus-Thimidinkinase-Promotors und dem selektio¬ nierbaren Markergen Hygromycin.
8. Verfahren zur Herstellung von Zellen nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß embryonale Stammzellen (ESC) oder pri ordiale Keimzellen (EGC) mit den Vektoren nach Anspruch 6 und 7 kotransfiziert werden, die Selektion der embryonalen Stammzellen mit dem Zellgift Hygromycin erfolgt, nach Induktion der in vitro Kardiogenese anschließend die Selektion der embryonalen Herzzellen mit dem Zellgift Geneticin (G418) erfolgt, die erhaltenen Zellen ggf. mit den gewünschten therapeutischen Genen durch ein virales, bevorzugt mit einem Adenovirus- oder einem Adenovirus-assoziierten-Virus-Shuttle- Vektor, oder ein nichtvirales Gen-transferverfahren transfiziert werden.
9. Verwendung der embryonalen Herzmuskelzellen nach Anspruch 1 bis 4 zur zeilvermittelten Gentransplantation, insbesondere zum Aufbau gesunden Gewebes und zur Unterstützung kontraktiler Funktionen.
10. Verwendung der embryonalen Herzmuskelzellen nach Anspruch 1 bis 4 zur Untersuchung von Substanzen, insbesondere für pharmakotoxikologisehe Untersuchungen.
11. Verwendung der embryonalen Herzmuskelzellen nach Anspruch 1 bis 5 für den Transfer therapeutischer Gene in das Myokard.
EP95940117A 1994-11-22 1995-11-21 Embryonale herzmuskelzellen, ihre herstellung und ihre verwendung Withdrawn EP0787182A2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4441327 1994-11-22
DE4441327A DE4441327C1 (de) 1994-11-22 1994-11-22 Embryonale Herzmuskelzellen, ihre Herstellung und ihre Verwendung
PCT/DE1995/001699 WO1996016163A2 (de) 1994-11-22 1995-11-21 Embryonale herzmuskelzellen, ihre herstellung und ihre verwendung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP0787182A2 true EP0787182A2 (de) 1997-08-06

Family

ID=6533720

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP95940117A Withdrawn EP0787182A2 (de) 1994-11-22 1995-11-21 Embryonale herzmuskelzellen, ihre herstellung und ihre verwendung

Country Status (4)

Country Link
US (1) US5928943A (de)
EP (1) EP0787182A2 (de)
DE (1) DE4441327C1 (de)
WO (1) WO1996016163A2 (de)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602301A (en) 1993-11-16 1997-02-11 Indiana University Foundation Non-human mammal having a graft and methods of delivering protein to myocardial tissue
EP0862644A2 (de) * 1995-11-17 1998-09-09 Franz, Wolfgang-M., Dr. Gentherapeutisches nukleinsäurekonstrukt, seine herstellung und verwendung zur behandlung von herzerkrankungen
US6051008A (en) 1996-12-02 2000-04-18 Angiotrax, Inc. Apparatus having stabilization members for percutaneously performing surgery and methods of use
US6120520A (en) 1997-05-27 2000-09-19 Angiotrax, Inc. Apparatus and methods for stimulating revascularization and/or tissue growth
US6102926A (en) 1996-12-02 2000-08-15 Angiotrax, Inc. Apparatus for percutaneously performing myocardial revascularization having means for sensing tissue parameters and methods of use
JP2002507407A (ja) * 1998-03-23 2002-03-12 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 心臓由来幹細胞
US20030113301A1 (en) * 1999-07-23 2003-06-19 Albert Edge Muscle cells and their use in cardiac repair
US8252280B1 (en) 1999-08-05 2012-08-28 Regents Of The University Of Minnesota MAPC generation of muscle
US8075881B2 (en) 1999-08-05 2011-12-13 Regents Of The University Of Minnesota Use of multipotent adult stem cells in treatment of myocardial infarction and congestive heart failure
US7015037B1 (en) * 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
US10638734B2 (en) 2004-01-05 2020-05-05 Abt Holding Company Multipotent adult stem cells, sources thereof, methods of obtaining and maintaining same, methods of differentiation thereof, methods of use thereof and cells derived thereof
DE10014690A1 (de) * 2000-03-24 2001-10-18 Franz Wolfgang M Verfahren zur Isolierung in vito differenzierter Körperzellen
DE60134982D1 (de) 2000-07-13 2008-09-04 Abbott Cardiovascular Systems Einbringungssystem für myokardiales, zellulares material
US7862810B2 (en) * 2000-07-31 2011-01-04 New York Medical College Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium
AU2001284695A1 (en) * 2000-07-31 2002-02-13 New York Medical College Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium
US20110091428A1 (en) * 2000-07-31 2011-04-21 New York Medical College Compositions of adult organ stem cells and uses thereof
CA2431197C (en) * 2000-12-27 2012-03-13 Axiogenesis Ag System for the cell-specific and development-specific selection of differentiating embryonic stem cells, adult stem cells and embryonic germline cells
DE10136702B4 (de) 2000-12-27 2004-04-22 Axiogenesis Ag System zur zell- und entwicklungsspezifischen Selektion differenzierender embryonaler Stammzellen, adulter Stammzellen und embryonaler Keimbahnzellen
EP1367899A4 (de) * 2001-02-14 2004-07-28 Leo T Furcht Multipotente adulte stammzellen, ausgangsmaterial dafür, verfahren zu ihrer gewinnung und erhaltung, differenzierungsmethoden dafür, verfahren zu ihrer verwendung, sowie von ihnen stammende zellen
WO2003001202A1 (en) * 2001-06-25 2003-01-03 Cardion Ag Methods and cell populations for identifying and validating genomic targets, and for drug screening
US7732199B2 (en) 2001-07-12 2010-06-08 Geron Corporation Process for making transplantable cardiomyocytes from human embryonic stem cells
JP2004535199A (ja) * 2001-07-12 2004-11-25 ジェロン コーポレイション ヒト多能性幹細胞から産生される心筋細胞系譜の細胞
WO2003014361A1 (en) * 2001-08-02 2003-02-20 Altana Pharma Ag Novel recombinant gene expression method by stop codon suppression
DE10144326B4 (de) * 2001-09-10 2005-09-22 Siemens Ag Verfahren und System zur Überwachung eines Reifenluftdrucks
US6893431B2 (en) 2001-10-15 2005-05-17 Scimed Life Systems, Inc. Medical device for delivering patches
US8574195B2 (en) * 2002-06-10 2013-11-05 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Systems and methods for detecting tissue contact and needle penetration depth using static fluid pressure measurements
US7364567B2 (en) 2002-06-10 2008-04-29 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Systems and methods for detecting tissue contact and needle penetration depth
BR0312764A (pt) * 2002-07-26 2005-07-26 Wisconsin Alumni Res Found Cardiomiócitos funcionais originados de células-tronco embrionárias humanas
US20040191225A1 (en) * 2002-08-06 2004-09-30 Dinsmore Jonathan H. Injection system
JP2004246317A (ja) * 2002-12-20 2004-09-02 Hitachi Ltd 冷陰極型フラットパネルディスプレイ
US9321997B2 (en) * 2003-06-20 2016-04-26 Axiogenesis Ag Tissue modeling in embryonic stem (ES) cell system
WO2005003320A2 (en) * 2003-07-02 2005-01-13 Regents Of The University Of Minnesota Neuronal differentiation of stem cells
US8308708B2 (en) 2003-07-15 2012-11-13 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Deployment system for myocardial cellular material
US7840263B2 (en) * 2004-02-27 2010-11-23 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for device controlled gene expression
US20050214938A1 (en) * 2004-03-26 2005-09-29 Gold Joseph D Cardiac bodies: clusters of spontaneously contracting cells for regenerating cardiac function
US7452718B2 (en) * 2004-03-26 2008-11-18 Geron Corporation Direct differentiation method for making cardiomyocytes from human embryonic stem cells
EP1740945B1 (de) 2004-04-07 2018-09-19 Ncardia AG Nichtinvasive, in-vitro-funktionelle gewebetestsysteme
JP4814875B2 (ja) 2004-05-11 2011-11-16 アキシオジェネシス エージー ｉｎｖｉｔｒｏ分化細胞に基づく薬物発見のための検定
US7764995B2 (en) 2004-06-07 2010-07-27 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus to modulate cellular regeneration post myocardial infarct
US7828711B2 (en) * 2004-08-16 2010-11-09 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for modulating cellular growth and regeneration using ventricular assist device
US7981065B2 (en) 2004-12-20 2011-07-19 Cardiac Pacemakers, Inc. Lead electrode incorporating extracellular matrix
US8060219B2 (en) 2004-12-20 2011-11-15 Cardiac Pacemakers, Inc. Epicardial patch including isolated extracellular matrix with pacing electrodes
US9062289B2 (en) 2005-06-22 2015-06-23 Asterias Biotherapeutics, Inc. Differentiation of primate pluripotent stem cells to cardiomyocyte-lineage cells
WO2008063675A2 (en) * 2006-11-24 2008-05-29 Regents Of The University Of Minnesota Endodermal progenitor cells
JP2011510658A (ja) * 2008-01-30 2011-04-07 ジェロン・コーポレーション 幹細胞由来心筋細胞を培養するための合成表面

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5275942A (en) * 1991-12-16 1994-01-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill Mammalian cell-based DNA libraries

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9616163A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE4441327C1 (de) 1995-11-09
WO1996016163A2 (de) 1996-05-30
WO1996016163A3 (de) 1996-07-18
US5928943A (en) 1999-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE4441327C1 (de) Embryonale Herzmuskelzellen, ihre Herstellung und ihre Verwendung
DE69937347T2 (de) Regulierung der hämatopoietischen stammzelldifferenzierung durch verwendung von menschlichen mesenchymalen stammzellen
EP1948789B1 (de) Verfahren zur herstellung von permanenten humanen zelllinien
DE60020855T2 (de) Bedingte immortalisierung von zellen
DE60033663T2 (de) Verfahren zur herstellung einer nicht-differenzierten kultur von vogelzellen mittels primordialer keimzellen
Dribin et al. Conditioned medium enhances neuritic outgrowth from rat spinal cord explants
DE69831957T3 (de) Herzmuskelregenerierung unter verwendung mesenchymaler stammzellen
DE69937243T2 (de) Überexpression von gewünschten proteinen in eukaryotischen zellen mittels überexpression von cyclin d1
AU2002330465B2 (en) Screening method for a reprogramming agent, reprogramming agent screened by the method, method for using the reprogramming agent, method for differentiating an undifferentiated fusion cell, and production method of cells, tissues and organs.
WO2006044492A2 (en) Methods for generating rat embryo-derived cell lines and genetic modification of rat genome
EP0263908B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Proteinen mittels induzierbarer Expressionssysteme in in-vivo-vermehrten, genetisch modifizierten eukaryotischen Wirtszellen
WO1999001552A1 (de) Fluoreszierende proteine als zelltypspezifische reporter
JPH11507230A (ja) 細胞の不死化及び脱不死化
DE69736858T2 (de) Unsterbliche vogelzellen
DE69731310T2 (de) Verfahren zum unsterblich machen von zellen
DE60021404T2 (de) System zur herstellung von proteinen
DE60208066T2 (de) Promotoren zur kontrolle der zelldifferenzierung
Hashimoto et al. Cooperative transcription activation between Ad1, a CRE-like element, and other elements in the CYP11B gene promoter
WO1994016065A1 (en) Producing cells for transplantation to reduce host rejection and resulting cells
DE69836853T2 (de) Etablierte Mikrogliazellen
Thi et al. Proliferation and differentiation properties of permanent Schwann cell lines immortalized with a temperature-sensitive oncogene
Schilham et al. Sox-4 gene is required for cardiac outflow tract formation and pro-B lymphocyte expansion
DE19716098A1 (de) Fibroblasten mit einem Fremdgen enthaltende Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden
WO2002009507A1 (de) Somatischer klonierungs-gentransfer zur produktion von rekombinanten proteinen, zellen und organen
US20030109037A1 (en) Methods for application of genetically-modified endogenous or exogenous stem/progenitor or their progeny for treatment of disease

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 19970530

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH DK ES FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE

17Q First examination report despatched

Effective date: 20010409

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: CARDION AG

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: INSTITUT FUER PFLANZENGENETIK UND KULTURPFLANZENF

APBN Date of receipt of notice of appeal recorded

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNNOA2E

APBR Date of receipt of statement of grounds of appeal recorded

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNNOA3E

APAA Appeal reference recorded

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOS REFN

APAF Appeal reference modified

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSCREFNE

APBT Appeal procedure closed

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNNOA9E

17Q First examination report despatched

Effective date: 20010409

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: LEIBNIZ-INSTITUT FUER PFLANZENGENETIK UND KULTURPF

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20070712