EP0826067A1 - Simultane sequenzierung von nukleinsäuren - Google Patents
Simultane sequenzierung von nukleinsäurenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur sequenzspezifischen Markierung von Nukleinsäuren, umfassend die Erzeugung von markierten Nukleinsäurefragmenten durch eine enzymatische Markierungsreaktion, bei der ein markiertes Deoxyribonucleosidtriphosphat an ein Nukleinsäure-Primermolekül angefügt wird, und die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz über die Markierung, wobei die Markierungsreaktion in einem einzigen Reaktionsgefäß bei gleichzeitiger Anwesenheit von einem oder mehreren Nukleinsäure-Primermolekülen und mindestens zwei markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten, und unter Bedingungen erfolgt, bei denen an ein Nukleinsäure-Primermolekül nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten angefügt wird.
Description
Simultane Sequenzierung von Nukleinsäuren
BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur sequenzspezifischen Markierung und simultanen Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Erzeugung von markierten Nukleinsäurefragmenten durch eine enzymatische Markierungsreaktion. bei der ein markiertes Deoxyribonucleosidtriphosphat an einNukleinsäure-Primermolekül angefügt wird und die Bestimmung der Nukleinsequenz über die Markierung.
Bei der DNA-Sequenzierung durch die enzymatische Ketten¬ abbruchmethode nach Sanger werden, ausgehend von einer Nu- kleinsäure-Matritze, viele verschieden lange markierte Nukleinsäurefragmente durch eine enzymatische Extensions- und Terminationsreaktion hergestellt, bei der ein synthetischer Oligonukleotidprimer mit Hilfe von Polymerase und einer Mischung von Deoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTP) und Kettenabbruchmolekülen, insbesondere Dideoxyribonucleosid- triphosphaten (ddNTP) verlängert und terminiert wird.
Dabei wird üblicherweise jeweils in vier Ansätzen eine Mischung der Deoxyribonucleosidtriphosphate (dNTPs) und jeweils einem Dideoxyribonucleosidtriphosphat (ddNTP) eingesetzt. Auf diese Weise wird ein statistischer Einbau der Kettenabbruchmoleküle in die wachsenden Nukleinsäureketten erreicht, wobei nach dem Einbau eines Kettenabbruchmoleküls die DNA-Kette aufgrund des Fehlens einer freien 3'-0H-Gruppe nicht mehr weiter verlängert werden kann. Es entsteht daher eine Vielzahl von unterschied¬ lich langen DNA-Fragmenten, die statistisch gesehen an jeder möglichen Einbaustelle ein Kettenabbruchmolekul enthalten und dort enden. Diese vier Ansätze mit den jeweils aufgrund des Einbaus von Kettenabbruchmolekülen spezifisch an einer Base endenden Fragmenten werden nach ihrer Länge, z.B. durch
Polyacrylamid-Gelelektrophorese, üblicherweise in vier ver¬ schiedenen Spuren aufgetrennt und die Sequenz über die Markie¬ rung dieser Nukleinsäurefragmente ermittelt.
Heute wird die DNA-Sequenzierung mit automatisierten Systemen durchgeführt, bei denen üblicherweise eine nicht-radioaktive Markierung, insbesondere eine Fluoreszenz-Markierung verwendet wird (L.M. Smith et al, Nature 321 (1986), 674-679; W. Ansorge et al, J. Biochem. Biophys. Meth. 13 (1986), 315-323). Bei diesen automatisierten Systemen wird die Nukleotidsequenz direkt während der Auftrennung der markierten Fragmente gelesen und direkt in einen Computer eingegeben.
Bei den automatisierten Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren können nicht-radioaktive Markierungsgruppen entweder über markierte Primermoleküle, markierte Ketten¬ abbruchmoleküle oder als innere Markierung über markierte dNTP eingeführt werden. Bei all diesen bekannten Markierungsmethoden werden die Sequenzierungsreaktionen jeweils einzeln in einem Reaktionsgefäß durchgeführt, so daß mit einer Sequenzierungs- reaktion immer nur eine einzige Sequenz erhalten wird.
In der internationalen Patentanmeldung WO 93/03180 wird ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren beschrieben, bei dem Nukleinsäurefragmente nach Einbau von mindestens einem nicht-radioaktiv markierten dNTP als innere Markierung bestimmt werden, wobei die Einführung der inneren Markierung in die Nukleinsäurefragmente in Abwesenheit von Kettenabbruchmolekülen stattfindet.
Die simultane Bestimmung von zwei Nukleinsäuresequenzen mit zwei unterschiedlich markierten Primermolekülen in einem einzigen Reaktionsgefäß wurde von Wiemann et al (Anal. Biochem. 224 (1995) 117-121) beschrieben. Ein Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, daß farbstoffmarkierte Oligonukleotid¬ primer eingesetzt werden müssen, deren Herstellung sehr kostspielig ist oder/und aufwendig ist. Dieser Nachteil tritt
insbesondere bei der Sequenzierung längerer Genabschnitte unter Anwendung der "Walking primer"-Strategie zu Tage, bei der für jede Sequenzierungsreaktion unterschiedliche Primer verwendet werden müssen. Überdies wird durch die Verwendung markierter Primer manchmal die Hybridisierung des Primers mit der Nu- kleinsäurematrize behindert, was zu ungenauen Sequenzierungs¬ resultaten führen kann.
Um diesen Nachteil zu vermeiden, könnte man zwei Sequenzierungsreaktionen jeweils mit einem unmarkierten Primer und einem von zwei jeweils unterschiedlich markierten dNTP in zwei separaten Reaktionsgefäßen durchführen, die beiden Produkte vermischen, sie simultan auf ein Gel auftragen und die Sequenzen bestimmen. Der Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, daß Durchführung von zwei Sequenzierungsreaktionen in separaten Reaktionsgefäßen aufwendig und umständlich ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es somit, ein Verfahren zur sequenzspezifischen Markierung und Sequenzierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, bei dem die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise beseitigt sind. Insbesondere soll das erfindungsgemäße Verfahren die gleichzei¬ tige Durchführung von zwei oder mehr Sequenzierungsreaktionen in einem einzigen Reaktionsgefäß unter Verwendung von minde¬ stens zwei unterschiedlich markierten dNTP und mindestens zwei, vorzugsweise unmarkierten Primermolekülen ermöglichen.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur sequenzspezifischen Markierung von Nukleinsäuren, umfassend die Erzeugung von markierten Nukleinsäurefragmenten durch eine enzymatische Markierungsreaktion, bei der ein markiertes Deoxyribonucleosidtriphosphat aneinNukleinsäure-Primermolekül angefügt wird und die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz über die Markierung, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die Markierungsreaktion in einem einzigen Reaktionsgefäß bei gleichzeitiger Anwesenheit von einem oder mehreren Nu- kleinsäure-Pri ermolekülen und mindestens zwei markierten
Deoxyribonucleosidtriphosphaten, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten, und unter Bedingungen erfolgt, bei denen an ein Nukleinsäure- Primermolekül jeweils nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten angefügt wird.
Das Nukleinsäure-Primermolekül ist eine Nukleinsäure, vorzugs¬ weise eine DNA, die ausreichend komplementär zu einer im Reaktionsansatz befindlichen Nukleinsäure ist, um mit dieser eine Hybridisierungsreaktion unter den jeweiligen Reaktions¬ bedingungen einzugehen. Die Länge des Primermoleküls ist vorzugsweise 10 - 100, besonders bevorzugt 12-50 und am meisten bevorzugt 12-30 Nukleotide.
Die Durchführung der enzymatischen Markierungsreaktion erfolgt beim erfindungsgemäßen Verfahren derart, daß an ein Nuklein¬ säure-Primermolekül jeweils nur eine einzige Art von markierten dNTPs und vorzugsweise jeweils nur eine einzige Art von markierten dNTPs und vorzugsweise jeweils nur ein einziges markiertes dNTP angefügt wird. Vorzugsweise wird das markierte dNTP direkt an das 3'-Ende des Primers (Position +1) angefügt. In diesem Fall ist die Base des markierten dNTP komplementär zu derjenigen Base, die auf der mit dem Primermolekül hybridi¬ sierenden Nukleinsäure direkt 5'-seitig des zum Primer kom¬ plementären Bereich angeordnet ist. Sofern ein spezifischer Einbau von nur einer einzigen Art der Markierung hinter jedem Primer gewährleistet ist, kann die Markierung auch in größerem Abstand zum 3'-Ende des Primers eingebaut werden (Positionen +2, +3, +4 etc.). Hierzu können zusätzlich zu den mindestens zwei unterschiedlich markierten dNTPs auch noch unmarkierte dNTPs in der Markierungsreaktion vorhanden sein.
Die Sequenz eines oder mehrerer Pri ermoleküle kann jedoch auch so gewählt werden, daß bei Verwendung einer Polymerase mit 3'- Exonukleaseaktivität die markierten dNTPs in einer Austauschreaktion als terminale Base des oder der Primer(s) eingefügt werden, wenn die 3'terminale Base des Primers gleich
der verwendeten Base des markierten dNTP ist.
Die Bedingungen bei der Durchführung der enzymatischen Markie¬ rungsreaktion werden so gewählt, daß statistisch nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten an den Primer angefügt werden kann. Um diese Reaktionsspezifität zu erreichen, werden vorzugsweise die Reaktionsbedingungen (wie etwa die Konzentrationen von Polymerase-Enzym oder/und dNTP, Temperatur, Konzentration von anderen Komponenten etc.) ent¬ sprechend gewählt. Außerdem kann die Spezifität der Reaktion durch Auswahl der Primermoleküle wie im folgenden erläutert, erhöht werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist beispielsweise die simultane Sequenzierung von DNA-Fragmenten mit zwei oder mehreren Primermolekülen, vorzugsweise unmarkierten Primermole- külen, und mehreren markierten dNTP in einem Reaktionsgefäß möglich. Es können mehrere Markierungsreaktionen gleichzeitig an verschiedenen Strängen der zu sequenzierenden Nukleinsäure oder an verschiedenen Stellen auf dem gleichen Nukleinsäure- sträng durchgeführt werden. Die Spezifität des erfindungs- gemäßen Verfahrens ist überraschenderweise derart hoch, daß statistisch eine einzige Art von Markierung, insbesondere nur ein einziges markiertes dNTP an ein bestimmtes Primermolekül angefügt wird, selbst wenn mehrere andere unterschiedlich markierte dNTP, Primermoleküle und Nukleinsäure-Matrize- Moleküle im gleichen Reaktionsgefäß anwesend sind.
Durch die Kombination von einer oder mehreren DNA-Matrizen und zwei oder mehreren Primermolekülen und markierten dNTPs in einer einzigen Sequenzierungsreaktion können die Kosten zur Durchführung der Sequenzierungsreaktionen um 50 - 75 % redu¬ ziert werden. Sowohl die Kosten für Chemikalien als auch für den Arbeitsaufwand werden verringert. Dies ist insbesondere bei Sequenzierungsprojekten im großen Maßstab bedeutend, wie etwa dem "Human Genome"-Sequenzierungsprojekt oder anderen Genom¬ projekten.
Es gibt einen weiten Bereich von Anwendungsformen für das erfindungsgemäße Verfahren, z.B. die Sequenzierung, Kartierung und selektive Markierung von DNA-Fragmenten in der medizini¬ schen Diagnostik, Molekularbiologie, Biochemie und Chemie. Die bedeutendste Anwendungsform ist die automatisierte DNA- Sequenzierung mit Fluoreszenz-Markierungsgruppen.
Spezifische Anwendungsformen sind das sogenannte Minisequenzie¬ ren, bei dem die Nukleinsäuresequenz nur innerhalb eines begrenzten Bereichs von bis zu drei Basen nach dem Primer auf Basis eines sequenzspezifischen Einbaus des markierten dNTP bestimmt wird. Eine weitere mögliche Anwendung ist der Nachweis von Punktmutationen in Genen, insbesondere in humanen Genen. Hierbei wird das Primermolekül derart ausgewählt, daß es unmittelbar vor einem "Hot Spot" der Mutation liegt. Es wird nur ein Primer zusammen mit zwei oder mehreren verschiedenen markierten dNTP verwendet und die Markierungsreaktion durch¬ geführt. Es wird nur ein einziges markiertes dNTP eingebaut, das komplementär zur entsprechenden Base auf der Nukleinsäure- Matrize ist. Anschließend kann das verlängerte Primermolekül analysiert und die Markierungsgruppe durch ihre Spektralcharak¬ teristik identifiziert werden. Auf diese Weise ist ein Rück¬ schluß auf die Sequenz des betreffenden Gens möglich.
Bei einer Anwendung zur Sequenzbestimmung von Nukleinsäuren erfolgt die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise dadurch, daß man
a) mindestens ein Nukleinsäure-Primermolekül an die zu sequenzierende Nukleinsäure bindet,
b) eine Polymerase und mindestens zwei markierte Deoxyribonucleosidtriphosphate zugibt, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten,
c) das Reaktionsgemisch in einem einzigen Reaktionsgefäß
unter solchen Bedingungen inkubiert, daß an ein Primermo¬ lekül jeweils nur eine einzige Art von markierten Deoxy- ribonucleosidtriphosphaten angefügt wird, und
d) eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen über den sequenz- spezifischen Einbau der markierten Deoxyribonucleosidtri- phosphate bestimmt.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden in einem Reaktions¬ ansatz jeweils mindestens zwei markierte Deoxyribonucleosid- triphosphate verwendet, die jeweils unterschiedliche Markie¬ rungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten, d.h. es können maximal vier Deoxyribonucleosidtriphosphate (entspre¬ chend den Basen A, T, C und G) verwendet werden, von denen jede eine unterschiedliche Markierungsgruppe trägt. Die Markierungs¬ gruppen können radioaktive oder nicht-radioaktive Markierungen sein und sollten nebeneinander nachweisbar sein. Bevorzugt sind nicht-radioaktive Markierungsgruppen, insbesondere Fluoreszenz- Markierungsgruppen, z.B. Fluoreszenzfarbstoffe wie etwa Rhodamin, Derivate des Rhodamins wie etwa Methylrhodamin, Texasrot, Phycoerythrin, Fluorescein und Derivate davon, CY3, CY5. CY2, CY7, Coumarin, Infrarot 40, MR 200, Bodipy-Farbstoffe (Molecular Probes) , 1, N6-etheno-Modifizierungsgruppen für dNTPs (Molecular Probes) , IRD 40 etc. Andere geeignete nicht-radio¬ aktive Markierungsgruppen sind beispielsweise Metalle, magne¬ tische Markierungsgruppen, die durch Kernresonanz oder durch einen supraleitenden quanteninterferometrischen Detektor (SQID) nachweisbar sind oder Phosphoreszenzfarbstoffe. Zur Bestimmung der jeweiligen Markierungen können geeignete Anregungs- oder/und Detektionssysteme eingesetzt werden.
Beispiele für kommerziell erhältliche fluoreszenzmarkierte dNTP sind etwa Fluorescein-dUTP, Fluorescein-dATP (Boehringer Mannheim, Pharmacia) ; Texasrot-dCTP und dGTP (NEN-Dupont) , CY5- dATP und dCTP sowie CY3-dATP (Pharmacia) .
Zweckmäßigerweise verwendet man Fluoreszenzmarkierungsgruppen,
die sich gleichzeitig nebeneinander nachweisen lassen. So kann man beispielsweise zur Anregung der Fluoreszenzgruppen zwei oder mehrere unterschiedliche Lasersysteme verwenden, die mit entsprechenden Detektionssystemen gekoppelt sind. So können z.B. mit einem Argonlaser (Emissionswellenlänge = 488 nm) und entsprechenden Detektoren Fluorescein-Markierungsgruppen in den automatisiertenDNA-Sequenzierungssystemennachgewiesenwerden. Als zweiten Laser kann man beispielsweise einen Helium-Neon- Laser (Emissionswellenlänge = 594 nm) mit entsprechenden Detektoren zum Nachweis von Texasrot-markierten Nukleinsäuren verwenden. Durch Bandpassfilter können Interferenzen zwischen beiden Lasersystemen weitgehend unterdrückt werden. Die Daten werden durch zwei Detektorgeräte aufgezeichnet, eines für jeden Laser. Andererseits können auch Kombinationen von Fluoreszenz¬ farbstoffen verwendet werden, die durch ein einziges Lasersy¬ stem angeregt und durch jeweils unterschiedliche Detektions- systeme getrennt bestimmt werden können.
Die Konzentration der markierten dNTPs während der Markierungsreaktion ist vorzugsweise derart gering, daß bei einer gegebenen Polymerase-Konzentration im wesentlichen nur ein einziges markiertes dNTP an ein Primermolekül angefügt werden kann. Vorzugsweise werden daher die markierten dNTPs in einer Konzentration von 0,05 - 5 μmol/Liter, besonders bevor¬ zugt in einer Konzentration von 0,1 - 2,5 μmol/Liter verwendet. Bei einer derartigen dNTP-Konzentration kann die im Reaktions- gemisch vorliegende Polymerase statistisch nur ein einziges Molekül -dNTP an einen Primer anfügen. Die Polymerasekonzen- tration beträgt vorzugsweise 1-20 U, besonders bevorzugt 5-15 U pro Ansatz. Insbesondere bei gleichzeitiger Verwendung von mehreren Primermolekülen kann die Einhaltung der oben genannten Konzentrationsbereiche kritisch sein, da bei einer zu hohen dNTP- oder/und Enzymkonzentration das Anfügen mehrerer unter¬ schiedlich markierter dNTP an einen einzigen Primer möglich ist.
Weiterhin kann die Spezifität des Einbaus von markierten dNTPs
durch die Wahl des Markierungsmoleküls (z.B. Fluorescein, Texasrot etc.), durch die Wahl des dNTP (dUTP, dTTP, dATP, dCTP, dGTP etc.) oder/und durch die Art der Verknüpfung von dNTP und Markierungsmolekül (z.B. Länge des Spacerarms) beeinflußt werden.
Zur enzymatischen Anfügung eines dNTP an das Primermolekül verwendet man im erfindungsgemäßen Verfahren eine Polymerase, vorzugsweise das Klenow-Fragment der E.coli-DNA-Polymerase I, unmodifizierte T7 DNA-Polymerase, modifizierte T7-DNA-Polyme¬ rase (Sequenase) , T -DNA-Polymerase, Taq-DNA-Polymerase, Bst- DNA-Polymerase oder Reverse Transkriptase. Von diesen Enzymen sind Polymerasen ohne 3' -Exonucleaseaktivität bevorzugt, z.B. modifizierte T7-Polymerase.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können jedoch auch Polymerasen mit 3' -Exonucleaseaktivität, z.B. unmodifi- zierte T7 Polymerase, bevorzugt sein, beispielsweise wenn das markierte Deoxyribonucleosidtriphosphat durch sequenziell erfolgende Exonuclease- und Polymeraseaktivitäten in einer Austauschreaktion als letzte Base des Primermoleküls (Position -1) eingefügt wird.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist seine Einfachheit, da keine markierten Primermoleküle benötigt werden. Dies ist insbesondere für Sequenzierungsprojekte in großem Maßstab, wie die Sequenzierung des menschlichen Genoms oder anderer Genomprojekte bedeutsam. Andererseits können, sofern gewünscht, natürlich auch markierte Primer verwendet werden, um ggf. zusätzlich Informationen über die Nukleinsäure- sequenz zu erhalten. Die Sequenzierungsreaktion kann außerdem mit einer Kombination von unmarkierten und markierten (Fluo¬ reszenzfarbstoffe oder andersartig, z.B. Digoxigenin, Biotin, Metalle etc.) Primern durchgeführt werden, wobei die Auswahl der Primer vorzugsweise derart erfolgen soll, daß die innere Markierung jeweils nur an unmarkierte Primer angefügt wird. Die markierten Primer tragen vorzugsweise andere Markierungsgruppen
als die markierten dNTPs.
Bei der simultanen Sequenzierung von Nucleinsäuren unter Verwendung von zwei oder mehr Primermolekülen ist die Auswahl der Primermoleküle bedeutsam. So müssen die Primer von ver¬ schiedenen Nukleotiden gefolgt werden, die bei einer Ver¬ längerung des Primers durch die Polymerase als nächste Base eingebaut werden. Auf diese Weise wird bei der Markierungs- reaktion nur jeweils eine Art von Markierungsgruppe an eine Art von Primermolekül angefügt. Durch die Wahl der Reaktions¬ bedingungen bei der Markierungsreaktion kann der Einbau anderer Markierungsgruppen ausgeschlossen werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem man mindestens zwei Primermole¬ küle verwendet, die an unterschiedliche Bereiche der zu sequenzierenden Nukleinsäure binden, wobei die Primermoleküle derart ausgewählt werden, daß die an ihr 3' -Ende als nächste anzufügende Base jeweils unterschiedlich ist, und wobei für jedes Primermolekül ein markiertes Deoxyribonucleosidtri¬ phosphat mit einer entsprechenden Base verwendet wird, so daß an jedes Primermolekül jeweils nur ein einziges unterschiedli¬ ches markiertes Deoxyribonukleosidtriphosphat angefügt wird. Zum besseren Verständnis wird in der vorliegenden Anmeldung die Base am 3' -Ende eines Primermoleküls jeweils als "Position -1" bezeichnet. Die durch die Polymerase an das 3'-Ende des Primermoleküls als nächste anzufügende Base wird mit "Position +1" und die als übernächste anzufügende Base mit "Position +2" bezeichnet.
Zur Erhöhung der Spezifität der Markierungsreaktion sollten vorzugsweise bei der Konstruktion der Primermoleküle noch weitere Kriterien beachtet werden. So verwendet man vorzugs¬ weise in einem Ansatz nur solche Primermoleküle, bei denen die an das 3' -Ende des Primers als nächste anzufügende Base (Position +1) nicht gleich mit der an das 3' -Ende eine anderen Primers als übernächste anzufügenden Base (Position +2) ist.
Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit verringert, daß ein Primermolekül mit zwei verschiedenen Markierungsgruppen markiert wird.
Weiterhin ist es bevorzugt, daß man Primermoleküle verwendet, bei denen die Base am 3'-Ende eines Primermoleküls (Position - 1) nicht gleich mit der an das 3'-Ende eines anderen Primermo- leküls als nächste anzufügenden Base (Position +1) ist. Auf diese Weise lassen sich mögliche Doppelmarkierungen aufgrund einer 3' -Exonucleaseaktivität des verwendeten Polymeraseenzyms vermeiden. Bei Verwendung einer Polymerase ohne 3' -Exonuclease¬ aktivität, z.B. modifizierte T7-Polymerase, muß dieses Auswahl¬ kriterium nicht unbedingt beachtet werden.
Bei Verwendung von zwei oder mehreren Primermolekülen können durch das erfindungsgemäße Verfahren zwei oder mehrere Nuk- leinsäuresequenzen gleichzeitig bestimmt werden.
Die Sequenzierungsreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens wird üblicherweise in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wird in einer Markierungsreaktion jeweils eine einzige Art von markierten dNTPs an das 3'-Ende des Primers angefügt. Besonders bevorzugt wird jeweils nur ein einziges markiertes dNTP an einen Primer angefügt. Der Primer wird vorzugsweise so ausge¬ wählt, daß das markierte dNTP direkt an sein 3' -Ende (Position +1) angefügt wird. Weiterhin ist es bevorzugt, daß bei der Markierungsreaktion nur markierte dNTP vorhanden sind, da auf diese Weise bei einer unerwünschten Bindung des Primers an sekundäre Bindungsstellen auf der Matrize die Wahrscheinlich¬ keit des Einbaus von markierten dNTPs verringert wird. Schlie߬ lich ist auch die Verwendung einer DNA Polymerase ohne 3'- Exonukleaseaktivität , z.B. Sequenase® bevorzugt, insbesondere wenn ein Primer mit einem Nukleotid endet, das als markiertes dNTP im Ansatz der Markierungsreaktion vorliegt.
Als nächster Schritt findet eine Extensionsreaktion bis zum Einbau eines Kettenabbruchmoleküls statt, durch den die
Polymerisation terminiert wird. Diese Extensionsreaktion wird vorzugsweise in separaten Ansätzen in Gegenwart der durch die Markierungsreaktion spezifischmarkierten Oligonucleotidprimer, der Polymerase, der zu sequenzierenden Nukleinsäure als Matrize, der vier unmarkierten Deoxyribonucleosidtriphosphate und jeweils einem Kettenabbruchmolekul durchgeführt. Dabei entsteht durch Verlängerung eines Primers ein Nukleinsäure- sträng, der eine für den jeweiligen Primer spezifische Markie¬ rungsgruppe trägt und durch den Einbau eines Kettenabbruchmole¬ küls terminiert ist.
Die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz durch das erfindungs¬ gemäße Verfahren erfolgt daher vorzugsweise dadurch, daß man
(dl) das Reaktionsgemisch nach Anfügung des markierten Deoxyribonucleosidtriphosphats in mehrere Ansätze auf¬ teilt, jedem Ansatz ein Extensionsreagenz zusetzt, das vier unmarkierte Deoxyribonucleosidtriphosphate und jeweils ein unterschiedliches Kettenabbruchmolekul enthält, und die Ansätze inkubiert,
(d2) die aus (dl) resultierenden Nukleinsäurefragmente nach ihrer Größe auftrennt und
(d3) die Nukleinsäuresequenz über die Markierung der einzelnen Fragmente bestimmt.
Bei der Extensionsreaktion liegen die vier unmarkierten dNTP in einem großen Überschuß gegenüber dem bei der Markierungs- reaktion verwendeten markierten dNTP vor, so daß kein weiterer Einbau von markierten dNTP während der Extensionsreaktion stattfindet. Vorzugsweise liegen die unmarkierten Deoxyribonucleosidtriphosphate in einem mindestens 100-fachen Überschuß, besonders bevorzugt in einem mindestens 1000-fachen Überschuß bezüglich der markierten Deoxyribonucleosidtri¬ phosphate vor. Die Konzentration der unmarkierten dNTP beträgt daher vorzugsweise 0,05-5 mmol/Liter und besonders bevorzugt
0,1-2,5 mmol/Liter im Extensionsansatz.
Als Kettenabbruchmoleküle werden zweckmäßigerweise Deoxyribonucleosidtriphosphate verwendet, die an der 3'- Position der Deoxyribose so modifiziert sind, daß sie keine freie OH-Gruppe aufweisen, aber dennoch von der Polymerase als Substrat akzeptiert werden. Beispiele für solche Kettenabbruch¬ moleküle sind etwa 3'-Fluor-, 3'-0-Alkyl- und 3' -H-modifizierte Deoxyribonucleoside. Vorzugsweise werden als Kettenabbruchmole¬ küle 3' -H-modifizierte Deoxyribonukleotide, d.h. Dideoxyribonu- cleosidtriphosphate (ddNTP) verwendet. Vorzugsweise arbeitet man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit unmarkierten Kettenabbruchmolekülen, es ist jedoch auch möglich, markierte Kettenabbruchmoleküle, wie sie dem Fachmann bekannt sind, zu verwenden.
Die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz über die Markierung erfolgt üblicherweise durch Auftrennung der markierten Nukleinsäurefragmente nach ihrer Länge. Diese Auftrennung kann nach allen in der Technik bekannten Methoden, z.B. durch verschiedene elektrophoretische ( z . B . Polyacrylamidgelelektrophorese) oder chromatographische (z.B HPLC) Verfahren erfolgen, wobei eine gelelektrophoretische Auftrennung bevorzugt ist. Ferner kann die Auftrennung der markierten Nukleinsäuren auf an sich beliebige Weise, d.h. manuell, halbautomatisch oder automatisch erfolgen, wobei jedoch die Verwendung eines automatisierten Sequenziergeräts im allgemeinen bevorzugt ist. In diesem Fall kann die Auftrennung der markierten Nukleinsäuren in ultradünnen Plattengelen von 20-500 μm, vorzugsweise 100 μm Dicke (siehe z.B. Stegemann et al, Methods in Mol. and Cell. Biol. 2 (1991), 182-184) oder Kapillaren durchgeführt werden. Die Sequenzbestimmung kann jedoch auch in nicht-automatisierten Vorrichtungen erfolgen, z.B. durch ein Blotting-Verfahren.
Steht für eine Sequenzbestimmung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nur eine sehr geringe Menge der zu sequenzierenden
Nukleinsäure zur Verfügung, so kann auch ein Amplifizierungsschritt durchgeführt werden. Eine Möglichkeit der Amplifizierung besteht darin, einen oder mehrere Zyklen einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von zwei Primern vor der eigentlichen Sequenzierung durchzuführen. Die PCR erfolgt üblicherweise ohne markierte dNTP. So kann die zu sequenzierende Nukleinsäure vor Durchführung der eigentlichen Sequenzierungsprozedur amplifiziert werden.
Andererseits kann der Amplifizierungsschritt auch mit Hilfe einer "Thermocycling"-Reaktion erfolgen. Die Thermocycling- Reaktion entspricht einer "normalen" Sequenzierungsreaktion, die allerdings - wie eine PCR - in mehreren Zyklen durchgeführt wird. Der Reaktionsansatz enthält die Nukleinsäure-Matrize, die Primermoleküle, die dNTP und die jeweils entsprechenden Kettenabbruchmoleküle sowie die vorzugsweise thermostabile Polymerase. Auf diese Weise wird pro Zyklus immer eine be¬ stimmte Menge der markierten Nukleinsäurefragmente syntheti¬ siert, wobei in mehreren Zyklen große Mengen an markierten Fragmenten erzeugt werden können.
Die zu sequenzierende Nukleinsäure kann sowohl in einzel- strängiger als auch in doppelsträngiger Form vorliegen. Es werden gute Ergebnisse erhalten, wenn sich die zu sequenzie¬ rende Nukleinsäure auf einem doppelsträngigen DNA-Sektor - z.B. einem Plasmid, Cosmid, Bakteriophagen (Lambda oder Pl) , einem viralen Vektor oder einem künstlichen Chromosom befindet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit zur selektiven Einführung einer einzigen Markierungsgruppe in eine Nukleinsäure, der neben anderen für die Markierung oder Sequenzierung erforderlichen Bestandteilen mindestens zwei markierte Deoxyribonucleosidtriphosphate enthält, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten. Die Reagenzien können z.B. in Form einer Lösung, einer Suspension oder eines Lyophilisats vorliegen. Dieser Reagenzienkit kann insbesondere zur Sequenzierung von Nu-
kleinsäuren verwendet werden und zusätzliche Reagenzien (z.B. Enzym, Primer, Pufferlösungen, unmarkierte dNTPs, Terminatoren) enthalten.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung in Verbindung mit den Figuren 1-4 weiter verdeutlichen.
Figur 1 zeigt schematisch die erfindungsgemäße Sequenzierungsprozedur,
Figur 2 zeigt das Ergebnis einer Plasmidsequenzierung unter gleichzeitiger Verwendung von zwei unmarkierten Primern in Gegenwart von Fluorescein-15-dATP und Texasrot-5-dCTP,
Figur 3 zeigt das Ergebnis einer Untersuchung zum mehrfachen Einbau markierter dNTP und
Figur 4 zeigt das Ergebnis einer Untersuchung bezüglich des Einbaus einer Markierung in den Primer selbst.
Beispiel 1
Simultane DNA-Sequenzierung mit zwei Primern
cDNA-Moleküle, die aus einer humanen Keratinocyten-cDNA-Bank stammen, wurden nach Standardmethoden in einen Bluescript- Vektor (Stratagene, LaJolla, Californien, USA) cloniert. Die Plasmid-DNA' s wurden unter Verwendung von Quiagen (Hilden, Deutschland) oder Nucleobond AX Ionenaustauschersäulen (Mache- rey-Nagel, Düren, Deutschland) gereinigt.
Alle Primer wurden unter Verwendung der Computerprogramme Gene- Skipper (EMBL, Heidelberg, Deutschland) oder Oligo™, 4.1 (Medprobe, Oslo, Norwegen) entwickelt. Es wurden Primerpaare ausgewählt, die nicht zu Dimerbildung neigten und die keine weiteren Bindungsstellen auf der Matrize oder keine Neigung zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur hatten. Einer der Primer
wurde so ausgewählt, daß als nächste Base an das 3 '-Ende ein "A" angefügt wird. Der zweite Primer wurde so ausgewählt, daß als nächste Base ein "C" angefügt wird. Die Primer wurden auf dem multiplen Segment-DNA-Synthesizer von EMBL synthetisiert (Ansorge et al, Electrophoresis 13 (1992) 616 - 619) .
Zur Sequenzierung wurde folgendes Reaktionsprotokoll verwendet:
1. Denaturierung und Annealing
5-10 μg doppelsträngige DNA (5-8 kb) wurden mit 2 unmarkierten Primermolekülen (jeweils 2 pmol in einem Gesamtvolumen von 12 μl) vermischt und durch Zugabe von 1 μl 1 mol/Liter NaOH-Lösung und Erhitzen auf 65°C für 3 Minuten denaturiert. Nach einminütigem Abkühlen auf 37°C und kurzer Zentrifugation wurden 1 μl 1 mol/Liter HCl und 2 μl Annealingpuffer (1 mol/Liter Tris/HCl pH 8, 0,1 mol/Liter MgCl2) zugegeben.
2. Markierungsreaktion
Zu dem obigen Ansatz wurden jeweils 1 μl 10 μmol/Liter Fluorescein-15-dATP, 10 μmol/Liter Texasrot-5-dCTP und entweder native T7 DNA-Polymerase (8 U/μl) oder Sequenase (13 U/μl) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 min. lang bei 37°C inkubiert.
3. Extension und Termination
Zum Ansatz wurde 1 μl Extensionspuffer (304 mmol/Liter Natriumeitrat, 40 mmol/Liter MnCl2, 324 mmol/Liter Dithiothreitol) gegeben und vermischt. Dann wurde die Lösung in Aliquots aufgeteilt und 4 separaten Extensions/Terminationsmischungen zugesetzt, die aus 3 μl der jeweiligen Terminationslösungen (40 mmol/Liter Tris/HCl pH 7,4, 50 mmol/Liter NaCl, 5 μmol/Liter des jeweiligen ddNTP, jeweils 1 mmol/Liter dATP, dCTP, C7-dGTP
und dTTP) und 1 μl DMSO bestanden. Die Reaktion wurde 5 min. lang bei 37°C inkubiert und durch Zugabe von 4 μl Stoplösung (6 mg/ml Dextranblau und 20 mmol/Liter EDTA, pH 7,3 in entionisiertem Formamid) gestoppt. Dann wurden die Proben 4 min. lang bei 85°C denaturiert und auf ein Sequenzgel gegeben.
4. DNA-Sequenzierungsgerät
Der Aufbau des modifizierten DNA-Sequenziergeräts ist ausführlich bei Wiemann et al (Anal. Biochem. 224 (1995), 117-121 beschrieben. Zusätzlich zu dem üblichen Argon- Laser-Detektorsystem wurde in der Sequenzierungsvor¬ richtung ein Helium-Neon-Laser mit einem entsprechenden Detektor angebracht. Der Ar-Laser regt die Fluorescein- markierten Proben an, während der HeNe-Laser zur Anregung von Texasrot markierten DNA-Fragmenten verwendet wird. Beide Laserstrahlen werden mit Hilfe einer einzigen Lichtkopplungsplatte in das Gel geleitet, die zwischen zwei Spacern auf einer Seite des Gels angeordnet ist. Die räumliche Entfernung von 0,7 cm zwischen den Lasern und die Kombination von zwei unterschiedlichen Laser, Detektor- und Filtersystemen mit entsprechenden Fluorophoren stellt sicher, daß kein Überkreuznachweis der Sequenzsignale eintritt.
5. Gelelektrophorese
Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte auf denaturierenden 6,5 % Duracyl (Millipore, Bedford, Massachusetts, USA) Sequenziergelen. Die Auftrennung erfolgte über eine Distanz von 18,5 cm bei den Texasrot- markierten Fragmenten und 19,2 cm bei den Fluorescein- markierten Fragmenten unter Verwendung von Standard A.L.F. (Pharmacia, Uppsala, Schweden) Glasplatten. Die Sequenzen beider Reaktionen wurden on-line nachgewiesen und in einem Computer gespeichert.
Figur 1 zeigt schematisch das Prinzip der simultanen Sequenzierung von Nukleinsäuren. Nach Denaturierung binden zwei Primer an die jeweils komplementären Bereiche der zu sequenzierenden Nukleinsäure-Matrize. Die Matrizen können vom gleichen Strang einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder von verschiedenen Strängen der gleichen doppel¬ strängigen DNA oder von verschiedenen DNA's stammen. Bei der Sequenzierungsreaktion werden zwei unterschiedlich markierte dNTP verwendet. Beim Markierungsschritt der Sequenzierungsreaktion sind nur die beiden markierten Nukleotide Fluorescein-15-dATP und Texasrot-5-dCTP anwesend.
Eine selektive Markierung spezifischer Produkte mit nur einem Farbstoff wird durch Einbau des jeweiligen Nukleo- tids als erste Base direkt stromabwärts des Primermoleküls erreicht. Diese Reaktion ist vergleichbar mit der Minise- -quenzierung (Syvänen et al, Genomics 8 (1990) , 684-692) von Punktmutationen, wo die direkt an den Primer angefügte Base der unterscheidende Faktor ist, ob ein markiertes dNTP eingebaut oder nicht eingebaut wird. Die Auswahl der Primer erfolgt derart, daß die an den Primer direkt anzufügenden Basen unterschiedlich sind, z.B. ein "A" . und ein "C" . Bei diesem Markierungsschritt wird in jeden Primer immer nur das korrekte Nukleotid eingebaut. Nach Einbau des ersten markierten dNTP könnte die Polymerase eine Pause einlegen, da die markierten dNTP nur in einer geringen Konzentration vorliegen. Auch könnte die Polyme¬ rase von der Matrize abfallen und für die Extendierung weiterer Primermoleküle bis zum Einbau der markierten dNTPs zur Verfügung stehen (z.B. bei der Cycle Sequenzie¬ rung) .
Bei der Extensions- und der Terminationsreaktion werden aufgrund eines hohen Überschusses an unmarkierten dNTP keine markierten dNTP mehr eingebaut.
Fig. 2 zeigt Sequenzdaten, die bei einer simultanen Sequenzierung an beiden Strängen einer Plasmid-DNA erhalten wurden. Es wurden zwei unmarkierte Walking-Primer verwendet. Fig. 2a zeigt die mit Fluorescein-15-dATP erzeugte Sequenz und Figur 2b die mit Texasrot-5-dCTP erzeugte Sequenz.
Fig. 3 zeigt das Ergebnis eines Tests auf Mehrfacheinbau von markierten dNTP. Es wurden Sequenzierungsprimer ausgewählt, bei denen an den Positionen +1 und +2 zunächst ein "C" und dann ein "A" bzw. zunächst ein "A" und dann ein "C" eingebaut werden. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit nativer T7-DNA-Polymerase durchgeführt. Fig. 3a zeigt die Texasrot-Signale von einem Primer mit einem "C" an Pos. +1 und einem "A" an Pos. +2. Fig. 3b zeigt die Fluorescein-Signale des gleichen Primers. Fig. 3c zeigt Texasrot-Signale von einem Primer mit "A" an Pos. +1 und "C" an Pos. +2. Fig. 3d zeigt Fluorescein-Signale mit dem Primer aus Fig. 3c.
Aus Fig. 3 ist zu erkennen, daß kein Einbau von Fluores- cein-15-dATP an Pos. +2 erfolgte (Fig. 3b) . Fig. 3c zeigt hingegen, daß ein geringer Einbau von Texasrot 5 dCTP an Position +2 stattfand. Da die Markierung in Pos. +2 deutlich schwächer als die Markierung in Pos. +1 ist, sind aber auch die mit dem zweiten Primer erhaltenen Sequenzda¬ ten eindeutig.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf den Einbau einer Markierung innerhalb des Primers. Es werden Sequen- zierprimer ausgewählt, die ein "A" als 3' -terminale Base (Position -1) enthielten und die ein "C" als nächste Base (Position +1) eingebaut werden soll, sowie Primer mit umgekehrter Basenfolge. Die Sequenzierungsreaktionen wurden entweder mit nativer T7-DNA-Polymerase (n-T7) oder Sequenase (Seq) durchgeführt. Fig. 4a zeigt Texasrotsi¬ gnale aus einer Sequenzierung mit Sequenase und einem
Primer mit "A" als 3' -terminaler Base und einem "C" an Position +1. Fig. 4b zeigt Fluoresceinsignale aus einer Seqenzierung mit Sequenase und mit dem Primer von Fig. 4a. Fig. 4c zeigt Texasrot-Signale von einer Sequenzierung mit nativer T7-Polymerase und dem Primer von Fig. 4a. Fig. 4d zeigt Fluorescein-Signale aus einer Sequenzierung mit nativer T7-DNA-Polymerase und dem Primer von Fig. 4a. Fig. 4e zeigt Fluoresceinsignale von einer Sequenzierung mit Sequenase und einem Primer, mit "C" als 3' -terminaler Base und einem "A" an Pos. +1. Fig. 4f zeigt Texasrot-Signale aus einer Sequenzierung mit Sequenase und dem Primer von Fig. 4e.
Bei Durchführung der Reaktion mit Sequenase (Version 2.0) und dem Primer mit 3' -terminalem "A" , wurde nur Texasrot- dCTP an Position +1 eingebaut (Fig. 4a) während Fluores- cein dATP an Position -1 nicht in den Primer eingebaut wurde (Fig. 4b) . Mit nativer T7 DNA-Polymerase war hingegen ein geringer Einbau von Fluorescein-dATP inner¬ halb des Primers (Position -1) zu erkennen (Fig. 4d) .
Mit einem "C" als letzter Base des Primers und einem "A" als nachfolgender Base wurde gefunden, daß auch bei Verwendung von Sequenase ein Einbau von Texasrot-dCTP an Position -1 stattfand (Fig. 4f) . Aufgrund der geringen Signalstärke tritt jedoch keine signifikante Störung der Sequenzierungsreaktion ein.
Claims
Verfahren zur sequenzspezifischen Markierung von Nu¬ kleinsäuren, umfassend die Erzeugung von markierten Nukleinsäurefragmenten durch eine enzymatische Markie¬ rungsreaktion, bei der ein markiertes Deoxyribonucleosid¬ triphosphat an ein Nukleinsäure-Primermolekül angefügt wird, und die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz über die Markierung, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungsreaktion in einem einzigen Reaktions¬ gefäß bei gleichzeitiger Anwesenheit von einem oder mehreren Nucleinsäure-Primermolekülen und mindestens zwei markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten, und unter Bedingungen erfolgt, bei denen an ein Nukleinsäure-Primermolekül nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten angefügt wird.
Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) mindestens ein Nukleinsäure-Primermolekül an eine zu sequenzierende Nukleinsäure bindet,
b) eine Polymerase und mindestens zwei markierte De¬ oxyribonucleosidtriphosphate zugibt, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschied¬ liche Basen enthalten,
c) das Reaktionsgemisch in einem einzigen Reaktionsgefäß unter solchen Bedingungen inkubiert, daß an ein Primermolekül jeweils nur eine einzige Art von markierten Deoxyribonucleosidtriphosphaten angefügt wird, und d) eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen über den sequenzspezifischen Einbau der markierten Deoxyribo¬ nucleosidtriphosphate bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß an ein Nukleinsäure-Primermolekül jeweils nur ein einziges markiertes Deoxyribonucleosidtriphosphat angefügt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Deoxyribonucleosidtriphosphat direkt an das 3'-Ende des Primermoleküls (Position +1) angefügt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichent, daß man zur Anfügung des markierten Deoxyribonucleosid- triphospats an das Primermolekül eine DNA-Polymerase ohne 3' -Exonukleaseaktivität verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine modifizierte T7 DNA-Polymerase verwendet.
7. Verfahren nach einer der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Anfügung des markierten Deoxyribonucleosidtriphosphats an das Primermolekül eine DNA-Polymerase mit 3' -Exonucleaseaktivität verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Deoxyribonucleosidtriphosphat durch die sequenziell erfolgenden Exonuclease- und Polymeraseaktivitäten der DNA-Polymerase in einer Austauschreaktion als letzte Base des Primermolekuls (Position -1) eingefügt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Nukleinsäure-Primermoleküle verwendet, die keine Markierungsgruppe tragen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß man markierte Nukleinsäure-Primermoleküle verwendet, die eine andere Markierung als die markierten Deoxyribonu¬ cleosidtriphosphate tragen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungsgruppe der Primermoleküle ausgewählt wird aus Fluoreszenzfarbstoffen, Metallen, Biotin und Digoxigenin.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß man die markierten Deoxyribonucleosidtriphosphate in einer Konzentration von 0,05-5 μmol/Liter verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die markierten Deoxyribonuclosidtriphosphate in einer Konzentration von 0,1-2,5 μmol/Liter verwendet.
14. Verfahren zur simultanen Sequenzierung von Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei Primermoleküle verwendet, die an unterschiedliche Bereiche der zu sequenzierenden Nu¬ kleinsäure binden, wobei die Primermoleküle derart ausgewählt werden, daß die an ihr 3'-Ende als nächste anzufügende Base (Position +1) jeweils unterschiedlich ist und daß für jedes Primermolekül ein markiertes Deoxy¬ ribonucleosidtriphosphat mit einer entsprechenden Base verwendet wird, so daß an jedes Primermolekül jeweils nur ein unterschiedliches markiertes De¬ oxyribonucleosidtriphosphat angefügt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Primermoleküle verwendet, bei denen die an das 3'- Ende eines Primermolekuls als nächste anzufügenden Base (Position +1) nicht gleich mit der an das 3' -Ende eines anderen Primermolekuls als übernächste anzufügenden Base (Position +2) ist.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Primermoleküle verwendet, bei denen die Base am 3' -Ende eines Primermolekuls (Position -1) nicht gleich mit der an das 3'-Ende eines anderen Primermolekuls als nächste anzufügenden Base (Position +1) ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung der Nukleinsäuresequenz
(dl) das Reaktionsgemisch nach Anfügung des markierten Deoxyribonucleosidtriphosphats aufteilt, jedemAnsatz ein Extensionsreagenz zusetzt, das vier unmarkierte Deoxyribonucleosidtriphosphate und jeweils ein unter¬ schiedliches Kettenabbruchmolekul enthält, und die Ansätze inkubiert,
(d2) die aus (dl) resultierenden Nukleinsäurefragmente nach ihrer Größe auftrennt und
(d3) die Nukleinsäuresequenz über die Markierung der ein- zelnen Fragmente bestimmt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß man zwei oder mehrere Nukleinsäuresequenzen gleichzei¬ tig bestimmt.
19. Verfahren nach einer der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sequenzbestimmung in einer automatisierten Sequenziervorrichtung durchführt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei Deoxyribonucleosidtriphosphate verwendet, die jeweils unterschiedliche Fluoreszenzmarkie¬ rungsgruppen tragen.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzmarkierungsgruppen ausgewählt werden aus Fluorescein oder Derivaten davon, Texasrot, Rhodamin oder Derivaten davon, Phycoerythrin, CY3 , CY5, CY2, CY7, Coumarin, Infrarot 40, MR 200, Bodipy-Farbstoffen, IRD 40 und 1,N6-etheno-Modifizierungsgruppen.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß man Fluoreszenzmarkierungsgruppen verwendet, die sich gleichzeitig nebeneinander nachweisen lassen.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis zwei oder mehrere unterschiedliche Lasersysteme verwendet.
24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis ein einziges Lasersystem verwendet.
25. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Deoxyribonucleosidtriphosphate in einer Konzen¬ tration von 0,05-5 mmol/Liter eingesetzt werden.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Deoxyribonucleosidtriphosphate in einer Konzen¬ tration von 0,1-2,5 mmol/Liter eingesetzt werden.
27. Reagenzienkit zur Durchführung eines Verfahren nach einem der Ansprüche 1-26, dadurch gekennzeichnet, daß er neben anderen für die Markierung oder Sequenzierung erforderlichen Bestandteilen mindestens zwei markierte Deoxyribonucleosidtriphosphate enthält, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen und unterschiedliche Basen enthalten.
28. Verwendung eines Reagenzienkits nach Anspruch 27 zur Se¬ quenzierung von Nukleinsäuren.
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