Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in
einer Probe, ein Reagenzkit zur Ausführung dieses Verfahrens und die Verwendung zweier
unterschiedlich markierter Sonden zum quantitativen Nachweis von Analyten in einer Probe.
Der Nachweis von Analyten in Proben hat insbesondere im Gesundheitswesen eine erhebliche
Bedeutung erlangt. Viele Analyten, z. B. in Körperflüssigkeiten, können als Indiz für das Vorliegen
einer Erkrankung oder Infektion verwendet werden. Viele der Analyten sind jedoch
selbst nicht direkt nachweisbar oder sind in sehr geringen Mengen neben großen Mengen ganz
ähnlicher Komponenten in der Probe enthalten, so daß ein direkter Nachweis in vielen Fällen
praktisch unmöglich ist. Aus diesem Grund wird immer öfter versucht, die zu bestimmenden
Analyten mit Hilfe nachweisbar markierter Sonden spezifisch nachweisbar zu machen. Diese
Sonden binden im Idealfall nur den Analyten und markieren ihn über diese Bindung. Mittlerweile
stehen eine Vielzahl von Markierungsgruppen zur Verfügung. Dazu gehören beispielsweise
Metalle, farbige Verbindungen, fluoreszierende Verbindungen, aber auch Enzyme, Elektrolumineszenzgruppen
und chemisch aktivierbare Gruppen.
In WO 92/14139 ist beispielsweise ein Gerät zur Durchführung eines Bindetests für einen zu
bestimmenden Analyten beschrieben, welches auf Elektrochemilumineszenz beruht. Hierbei
wird der Analyt über seine Bindung an eine mit Hilfe eines Metallkomplexes markierte Sonde
und Anregung durch Anlegen einer Spannung sowie Detektion des erzeugten Lichtsignales
bestimmt.
Ebenfalls als Markierungsgruppe wurden kalziumaktivierbare Photoproteine vorgeschlagen,
z. B. in EP 764 468. Der Mechanismus der Lichterzeugung beruht bei diesen Proteinen darauf
daß eine Lösung, welche den über einen mit Hilfe einer aequorinmarkierten Sonde markierten
Analyten enthält, eine kalziumsalzhaltige Lösung zugegeben wird. Hierdurch wird die Erzeugung
eines elektromagnetischen Signals aus dem Aequorin getriggert.
Nukleinsäuren sind aufgrund ihrer in der Basensequenz gespeicherten Information besonders
wertvolle Hilfsmittel in der Diagnostik. Spezielle Nukleinsäuresequenzen liegen jedoch gerade
deshalb in sehr großem Unterschuß gegenüber ganz ähnlichen Sequenzen vor. Es hat sich daher
als vorteilhaft erwiesen, die nachzuweisenden Nukleinsäuren vor ihrem Nachweis spezifisch
zu amplifizieren, d. h. eine Vielzahl von Kopien einer bestimmten Sequenz herzustellen. Ein
solches Verfahren stellt die Polymerasekettenreaktion (PCR) dar (US-A-4,683,202). Gerade
bei dieser Amplifikationsreaktion hat es sich jedoch erwiesen, daß ein quantitativer Nachweis
von Nukleinsäuren nicht oder nur unter sehr günstigen Bedingungen möglich ist, da die Amplifikationseffizienz
sehr stark von unterschiedlichsten Faktoren beeinflußt wird. Es wurde daher
vorgeschlagen, den analythaltigen Proben vor der Amplifikation einen Standardanalyten in bekannter
Menge zuzusetzen, der sich in einer detektierbaren Eigenschaft von dem zu bestimmenden
Analyten unterscheidet, sich jedoch in Bezug auf die Amplifikationseffizienz ähnlich
verhält wie der Analyt. Eine solche Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines
internen Standards ist beispielsweise beschrieben in US-A-5,213,961 oder US-A-5,219,727.
Ähnliche Verfahren sind beschrieben in WO 92/01812, WO 94/04706, EP-A-0 525 882, WO
95/02067 und WO 94/09156. In letztgenannter Patentanmeldung wird ein Verfahren beschrieben,
bei dem in der PCR immobilisierbare Primer eingesetzt werden und die Menge an Amplifikaten
über Sonden nachgewiesen wird.
In WO 93/10257 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem zunächst eine PCR durchgeführt und
die Reaktionsmischung anschließend mit zwei unterschiedlich markierten Sonden inkubiert
wird.
In WO 89/10552 ist ein Apparat zur simultanen Messung zweier Proben mittels verschiedener
ECL-anregbarer Label beschrieben. Es werden zwei Messzellen und zwei Detektoren verwendet,
die unterschiedliche Wellenlängen generieren und detektieren. Verfahren, bei denen
die Anregung räumlich und zeitlich getrennt funktioniert, um eine ausreichende Dynamik und
Sensitivität zu erzielen, haben jedoch den Nachteil, daß der Probendurchsatz gering und die
benötigten Probenvolumina groß sind.
In DE-C-3022426 ist ein Immunoassay beschrieben, bei dem ein Chemilumineszenzmarker
durch Anlegen einer Spannung und dadurch erzeugtes Oxidans zur Emission angeregt wird.
In EP-0 478-626 wird eine Detektionsgruppe beschrieben, die durch unterschiedliche Substanzen
so modifiziert wird, daß die daraus resultierenden Detektionsgruppen ein unterschiedliches
kinetisches Verhalten oder ein unterschiedliches Spektrum aufweisen. Die Anregung
erfolgt gleichzeitig durch denselben Trigger (oxidativ). Die Signale (spektral oder kinetisch)
überlappen sich jedoch in der Praxis sehr stark, so daß eine verringerte Dynamik und eine erniedrigte
Sensitivität resultiert.
In EP-0-199 804, US-5,238,808 und US-5,310,687 ist ebenfalls ein Mehrfach-Markierungskonzept
beschrieben, bei dem die unterschiedlichen Label optisch aufgrund ihrer unterschiedlichen
spektralen Charakteristika detektiert werden.
In WO 93/01308 ist ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten mittels Acridiniumester-markierter
Antikörper und Erzeugung eines Chemilumineszenzsignals durch Oxidation bei
basischem pH-Wert beschrieben.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung war es daher, den Stand der Technik teilweise oder vollständig
zu verbessern und insbesondere Verfahren bereitzustellen, bei denen der Nachteil der
bei gleichzeitiger Fluoreszenzanregung nicht oder schlecht zu trennenden Signale bei gleichzeitig
erhöhtem Durchsatz gegenüber getrennt nacheinander geführten Nachweisreaktionen vermieden
wird.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer
Probe durch Inkubation der Probe mit mindestens zwei Sonden, von denen mindestens eine für
den zu bestimmenden Analyten spezifisch ist und wobei die mindestens zwei Sonden unterschiedliche
Markierungsgruppen tragen, Erzeugung jeweils eines unterschiedlichen elektromagnetischen
Signals für jede unterschiedliche Markierungsgruppe und Auswertung der erzeugten
Signale als Zeichen für die Anwesenheit oder Menge des Analyten. Ebenfalls Gegenstand
der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Bestimmung eines Analyten und die Verwendung
zweier Sonden, die ein unterschiedliches elektromagnetisches Signal liefern können, zum
quantitativen Nachweis von Analyten in einer Probe.
In Figur 1 ist der schematische Aufbau eines Gerätes zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens gezeigt.
In Figur 2 ist der Signalverlauf für eine erfindungsgemäße Bestimmung bei unterschiedlichen
Analytkonzentrationen gezeigt.
In Figur 3 ist ein Vergleich zwischen zwei erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt, bei denen die
Detektionsreaktionen seitlich vertauscht wurden.
In Figur 4 ist die Struktur eines für die Anknüpfung eines Labels verwendeten Linkermoleküls
gezeigt.
In Figur 5 und 6 ist gezeigt, daß die Bestimmungen völlig unabhängig voneinander ablaufen.
In Figur 7 und 8 ist das Ergebnis eines Kompetitionsversuches zweier unterschiedlich markierter
Sonden um dasselbe Target gezeigt.
Unter einem Analyt im Sinne der Erfindung wird alles Material verstanden, welches Gegenstand
des Bestimmungsverfahrens sein soll. Es handelt sich bevorzugt um Inhaltsstoffe von
Proben, wie sie üblicherweise in der medizinischen Diagnostik anfallen, d. h. insbesondere Inhaltsstoffe
von Körperflüssigkeiten. Hierzu gehören insbesondere Antigene, Antikörper, Zellen
oder Nukleinsäuren. Bei den Nukleinsäuren kann es sich um Nukleinsäuren handeln, die für
eine Infektion, z. B. viralen oder baktierellen Ursprungs, spezifisch sind, z. B. virale oder
bakterielle Nukleinsäuren oder körpereigene Nukleinsäuren, bei denen untersucht werden soll,
ob sie sich gegenüber dem normalen Zustand verändert haben, z. B. durch Mutation, Deletion
oder Insertion in einer oder mehreren Stellen. Virale Nukleinsäuren sind beispielsweise Ribonukleinsäuren
von RNA-Viren, z. B. HCV, HIV oder HGV oder genomische DNA oder rRNA
von Bakterien, z. B. Chlamydien, Neisserien oder Salmonellen.
Unter einer Probe im Sinne der Erfindung werden insbesondere flüssige Proben verstanden, in
denen der zu bestimmende Analyt gelöst oder suspendiert ist. Bevorzugt ist die Probe eine
Körperflüssigkeit, z. B. Blut, Urin oder Sputum oder eine davon abgeleitete Flüssigkeit, z. B.
Serum, Plasma, Buffy-Coat oder eine Flüssigkeit, die unter Durchführung eines oder mehrerer
Reaktionsschritte davon abgeleitet wurde. Diese Reaktionsschritte finden bevorzugt unter Zugabe
von Reagenzien statt und können eine Anreicherung, Modifizierung oder Vermehrung
des in der ursprünglichen Probe vorhandenen Analyten oder die Abreicherung störender Bestandteile
der ursprünglichen Probe bewirkt haben. Ein besonders bevorzugtes Probenmaterial
sind Reaktionsmischungen, wie sie üblicherweise nach Durchführung einer Probenvorbereitung
mit anschließender PCR vorliegen. Unter einer Sonde im Sinne der Erfindung wird eine
Komponente eines Nachweissystemes für einen zu bestimmenden Analyten oder/und einen
Standardanalyten verstanden. Solche Komponenten sind beispielsweise solche, die den Analyten
oder den Standardanalyten über biologische Wechselwirkungen, z B. immunologische
Wechselwirkungen oder Wechselwirkungen durch Basenpaarungen, zwischen fiir eine Hybridisierung
ausreichend komplementären Sequenzen von Nukleobasen, erkennen. Bei der Sonde
handelt es sich daher bevorzugt um einen Antikörper, ein Antigen, ein Hapten oder eine
Nukleinsäure oder ein Nukleinsäureanaloges, welches sich z. B. dadurch von natürlichen
Nukleinsäuren unterscheidet, daß das Zuckerphosphatgrundgerüst durch ein Peptidgrundgerüst
ersetzt ist (z. B. gemäß WO 92/20702).
Das erfindungsgemäße Verfahren benutzt mindestens zwei Sonden, von denen mindestens eine
für den zu bestimmenden Analyten spezifisch ist. Als spezifisch wird die Sonde verstanden,
wenn sie unter den Testbedingungen weniger als 5 % Kreuzreaktivität mit anderen, z. B. nicht
zu bestimmenden, Probenbestandteilen oder in der Probe zu erwartenden Bestandteilen aufweist,
d. h. solche andere Bestandteile zu weniger als 5 % verglichen mit der Bindung des gewünschten
Bestandteiles, z. B. des Analyten, bindet.
Bevorzugt ist mindestens eine weitere Sonde nicht für den zu bestimmenden Analyten spezifisch.
Bevorzugt ist diese Sonde spezifisch für einen weiteren Inhaltsstoff der Probe, insbesondere
einen Bestandteil, der sich in seiner Struktur nur geringfügig, jedoch in definiertem
Maß von dem zu bestimmenden Analyten unterscheidet. Bevorzugt ist dieser weitere Bestandteil
der Probe ein Standardanalyt.
Unter einem Standardanalyten im Sinne der Erfindung ist ein Material zu verstehen, welches in
der Probe in einer definierten Menge, bevorzugt einer bekannten Menge, enthalten ist oder ihr
zugesetzt wurde. Der Standardanalyt unterscheidet sich auf definierte Weise von dem Analyten,
z. B. in seiner Bindefähigkeit zu der analytspezifischen Sonde, die er unter den gewählten
Testbedingungen bevorzugt im wesentlichen nicht bindet. Dieser Standardanalyt kann bereits
ursprünglich in der Probe enthalten sein, bevorzugt wird er der Probe jedoch vor Inkubation
der Probe mit den Sonden zugegeben. Für den Fall einer Bestimmung einer spezifischen
Nukleinsäure in einer Probe ist es bevorzugt, daß der Standardanalyt ebenfalls eine Nukleinsäure
ist, die sich von der Analytnukleinsäure entweder in ihrer Nukleotidsequenz oder ihrer
Länge unterscheidet. Besonders bevorzugt wird zur Herstellung einer Standardnukleinsäure
nach rekombinanten Technologien ein Teilstück einer Nukleinsäure mit der Analytsequenz
entfernt und hierfür ein Stück einer anderen, bevorzugt nicht im Analyten enthaltenen, Sequenz
eingefügt. Für diesen Fall ist es nicht erforderlich, daß sich die Analytnukleinsäure in ihrer
Länge in größerem Umfang von der Standardnukleinsäure unterscheidet. Bevorzugt wird sowohl
ein Teil der Analytnukleinsäure als auch ein Teil der Standardnukleinsäure einem Amplifikationsverfahren,
bevorzugt einem Verfahren zur Vermehrung dieser Sequenzen, z. B. mit
Hilfe der Polymerasekettenreaktion nach US-A-4,683,202, unterzogen. Hierfür werden bevorzugt
Primer eingesetzt, welche sowohl zur Amplifikation der Analytnukleinsäure als auch der
Standardnukleinsäure geeignet sind. Dieses Verfahren wird im allgemeinen als kompetitive
PCR bezeichnet und ist beispielsweise in US-A-5,213,961 beschrieben.
Für den oben genannten Fall einer Standardnukleinsäure wird die Nukleotidsequenz der ersten
Sonde (Analytsonde) so gewählt, daß sie mit dem Analyten oder dem Arnplifikationsprodukt
der Analytteilsequenz in einem Bereich hybridisieren kann, der in der Standardnukleinsäure
nicht vorhanden ist, während die zweite Sonde (Standardsonde) in ihrer Sequenz so gewählt
wird, daß sie mit dem Verlängerungsprodukt der Primer nur dann hybridisieren kann, wenn das
Verlängerungsprodukt durch Primerelongation unter Verwendung der Standardnukleinsäure
als Matrize gebildet wurde. Bevorzugt handelt es sich bei den Sonden um Oligonukleotide
oder Peptidnukleinsäuren (PNA, WO 92/20702). Wenn die erste Sonde analytspezifisch ist und
den Standardanalyten im wesentlichen nicht bindet, kann die zweite Sonde entweder so gewählt
werden, daß sie für den Standardanalyten spezifisch ist, oder daß sich sowohl den
Standardanalyten als auch den Analyten bindet. Der erste Fall ist stark bevorzugt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es jedoch prinzipiell auch möglich, zwei oder mehr
Sonden einzusetzen, die spezifisch fiir entsprechend viele unterschiedliche, zu bestimmende
Analyten sind. Auch hier ergeben sich einige der erfindungsgemäßen Vorteile.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist die Tatsache, daß mindestens zwei der Sonden
unterschiedliche Markierungsgruppen tragen,
wobei eine ein durch elektrische Anregung und die andere
ein durch chemische Anregung erzeugtes Lumineszenzsignal
liefern kann. Im einfachsten Falle werden zwei Sonden eingesetzt,
von denen jede eine unterschiedliche Markierungsgruppe trägt. Von diesen zwei Sonden
ist eine spezifisch für den zu bestimmenden Analyten. In weiteren Fällen kann eine oder
mehrere dieser Sonden mehrere identische Markierungsgruppen tragen, z. B. eine Sonde zwei
gleiche Markierungsgruppen. Dies kann zu einer Erhöhung der Sensitivität beitragen. Es ist
jedoch auch möglich, z. B. für die Bestimmung mehrerer Analyten mehr als zwei Sonden einzusetzen,
welche dann mehr als zwei unterschiedliche Markierungsgruppen tragen. Auch hier
kann jede Sonde ein oder mehrere gleiche Markierungsgruppen aufweisen. Vermieden werden
sollte der Fall, daß eine Sonde zwei unterschiedliche Markierungsgruppen im Sinne der Erfindung
trägt.
Die Sonden werden der Probe in einer Menge und Konzentration zugesetzt, die fiir eine ausreichende
Bindung der Sonde an den Analyten, die Analyten oder den Standardanalyten geeignet
ist. Da in vielen Fällen die Menge an Analyt nicht bekannt ist, wird die Sonde üblicherweise
in einem stöchiometrischen Überschuß gegenüber der maximal denkbaren Menge an
Analyt zugegeben. Dies gilt insbesondere, wenn eine quantitative Auswertung des Verfahrens
beabsichtigt ist.
Hierzu ist es erfindungsgemäß nicht erforderlich, die Probe, nach Amplifikation, zu teilen und
jedem Teil eine der Sonden zuzugeben. Bevorzugt werden die Sonden zusammen mit der
Probe inkubiert, nicht getrennt. Daher sind relativ geringe Probenvolumina erforderlich.
Unter einer Markierungsgruppe im Sinne der Erfindung werden Gruppen verstanden, die direkt
oder indirekt an die Sonden gebunden sein können. Darüber hinaus können die Markierungsgruppen
ihrer Art nach in zwei Klassen eingeteilt werden, nämlich solche Gruppen, die selbst
kein fiir eine Bestimmung ausreichendes elektromagnetisches Signal liefern können und
Gruppen, die selbst ein elektromagnetisches Signal liefern können. Markierungsgruppen der
letzten Definition werden im Folgenden auch als Detektionsgruppen bezeichnet. Gruppen, die
selbst kein fiir eine Bestimmung ausreichendes elektromagnetisches Signal liefern können, sind
bevorzugt alle über biologische Wechselwirkungen, wie sie oben für die Wechselwirkung der
Sonde mit dem Analyt beschrieben sind, erkennbare Gruppen, z. B. Haptene, wie Digoxigenin
gemäß EP-B-O 324 474, oder Vitamine, z. B. Biotin. Digoxigenin kann beispielsweise durch
einen Antikörper gegen Digoxigenin und Biotin mit Hilfe von Avidin, Streptavidin oder Antibiotin/Antikörpem
erkannt werden.
Für den Fall der indirekten Markierung ist im erfindungsgemäßen Verfahren die Verwendung
eines Konjugates aus einer die genannte erkennbare Gruppe erkennenden Komponente
(Antikörper, Avidin etc.) und einer Gruppe, die ein elektromagnetisches Signal liefern kann
(Detektionsgruppe), bevorzugt. Dieses Konjugat kann der Inkubationsmischung der Probe mit
den Sonden bereits zu Anfang der Inkubation zugegeben werden, bevorzugt ist jedoch die Zugabe
des Konjugates nach erfolgter Inkubation der Sonden mit dem Analyten, ohne Abtrennung
oder nach Abtrennung nicht an den Analyten gebundener analytspezifischer Sonde
von der analytgebundenen Sonde.
Des weiteren hat es sich als höchst empfehlenswert erwiesen, nach Inkubation der Probe mit
den Sonden nicht an den Analyten gebundene analytspezifische Sonde von der analytgebundenen
Sonde sowie weitere an Probenbestandteile gebundene Sonden von den nicht gebundenen
Sonden abzutrennen. Dasselbe gilt fiir die Abtrennung nicht gebundenen Konjugats. Diese Abtrennung
kann vorteilhafterweise dadurch geschehen, daß die Bindeprodukte des Analyten
bzw. der weiteren Probenbestandteile bzw. des Standardanalyten mit den zugehörigen Sonden
an eine feste Phase (z. B. einen Festkörper in Form eines Beads) gebunden werden und die
verbleibende flüssige Phase von der festen Phase getrennt wird. Dies kann beispielsweise geschehen
durch Zurückhalten der festen Phase an einem Filter, während die Flüssigkeit durch
das Filtermaterial durchtreten kann. Eine weitere Möglichkeit ergibt sich durch Verwendung
magnetischer fester Phasen, und Anlegung eines Magnetfeldes, so daß sich die magnetischen
Phasen an einer bestimmten Stelle sammeln und die Flüssigkeit mit den nicht gebundenen Sonden
entfernt werden kann. Weiter bevorzugt wird die feste Phase mit Hilfe einer Waschflüssigkeit
von physikalisch anhaftenden, nicht jedoch an den Analyten bzw. die anderen Bestandteile
spezifisch gebundenen Sonden entfernt wird.
Die Bindung des Analyten an die feste Phase hängt wiederum von der Art des zu bestimmenden
Analyten ab. So können wiederum biologische Wechselwirkungen (bevorzugt jedoch einer
anderen Art oder/und Spezifität als bei der Bindung des Analyten bzw. Standardanalyten) für
die Bindung ausgenutzt werden. Sofern es sich bei dem Analyten um ein Antigen handelt, kann
die Bindung über eine feste Phase geschehen, die an ihrer Oberfläche durch Bindung eines
Antikörpers gegen dieses Antigen modifiziert ist. Für den Fall von Nukleinsäuren als Analyten
kann die Bindung über Sonden geschehen, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, die komplementär
zu einer Sequenz des Analyten, der weiteren Probenbestandteile bzw. der Standardnukleinsäure
ist. Bevorzugt wird die Sequenz dieser sogenannten Fangsonde, die kovalent oder
über biospezifische Wechselwirkungen, z. B. Biotin/Streptavidin, an die feste Phase gebunden
ist oder wird, so gewählt, daß sie sowohl komplementär zu einer Teilsequenz des Analyten als
auch der Standardnukleinsäure oder weiterer Analytnukleinsäuren ist. Dies ist insofern vorteilhaft,
als dann für das Abfangen beider Probenbestandteile nur eine einzige Art von Fangsonde
erforderlich ist. Ist der Analyt eine Zelle, so können diese Zellen durch Antikörper, die gegen
Oberflächenantigene auf diesen Zellen gerichtet sind (z. B. CD3 für T-Zellen), immobilisiert
werden. Die Selektion/Detektion kann mit Antikörpern gegen Untergruppen (z. B. der T-Helferzellen
mit CD4 mit einer ersten Markierungsgruppe, der T-Supressorzellen mit CD8 und
einer zweiten Markierungsgruppe) vorgenommen werden.
Eine weitere Möglichkeit der Bindung der Analytnukleinsäure bzw. der Standardnukleinsäure
oder weiterer Analytnukleinsäuren an eine feste Phase ist der Einbau einer immobilisierbaren
Gruppe in erzeugte Kopien während der Nukleinsäureamplifikation. Dies kann geschehen
durch Verwendung immobilisierbar markierter Primer oder immobilisierbar markierte Mononukleosidtriphosphate.
Als immobilisierbare Gruppe kann beispielsweise Biotin gewählt werden.
Die erhaltenen Amplifikate können dann an einer streptavidinbeschichteten Oberfläche
abgefangen werden.
Basierend auf der Anwesenheit der Markierungs- bzw. Detektionsgruppen wird nun ein elektromagnetisches
Signal fiir jede unterschiedliche Markierungs- bzw. Detektionsgruppe erzeugt.
Überraschenderweise hat es sich herausgestellt, daß die Kombination von auf unterschiedliche
Weise anregbaren Gruppen für die unterschiedlichen Sonden besonders vorteilhaft ist. Vorteilhaft
ist die erfindungsgemäße Kombination einer Sonde, die elektrisch zur Lumineszenz angeregt
werden kann (Elektrochemilumineszenz, ECL), mit einer Sonde, die chemisch zur Lumineszenz
angeregt werden kann (Biolumineszenz). Die selektive, d. h., gezielte Anregung der
Signalbildung bewirkt beispielsweise, daß Kreuzanregung, d. h., Mitanregung auch der gerade
nicht nachzuweisenden Markierungsgruppe stark reduziert oder sogar vermieden werden kann.
Dies bewirkt für das Gesamtverfahren einen großen dynamischen Meßbereich und relativ
niedrige Hintergrundsignale (hohe Sensitivität). Die Art der Erzeugung hängt von den jeweiligen
Erfordemissen im Hinblick auf die Signalerzeugung ab. Eine erste Gruppe von Markierungsgruppen
zeichnet sich dadurch aus, daß das Signal durch Inkontaktbringen der Markierungsgruppe
mit bestimmten (z. B. chemischen) Reagenzien erzeugt wird. Eine bevorzugte
Gruppen von Detektionsgruppen sind zur Biolumineszenz anregbare Gruppen, z. B. allosterisch
triggerbare Gruppen. Die Detektionsgruppen unterschiedlicher Sonden gehören bevorzugt
unterschiedlichen Substanzklassen an (z. B. ein niedermolekularer organischer Metallkomplex
und ein Protein). Zu Markierungsgruppen gehören beispielsweise die durch Ionen
aktivierbaren Photoproteine (Apo-Photoproteine, nativ oder bevorzugt recombinant hergestellt).
Zu diesen Photoproteinen gehören beispielsweise Aequorin, Obelin, Mitrocomin,
Thalassicolin und Clytin. Diese Proteine haben die Eigenschaft, daß sie ein Lichtsignal
abgeben, wenn sie aktiviert werden, so daß ihre Menge oder Anwesenheit durch Messung der
Lichtmessung bestimmt werden kann. Die Verwendung solcher Photoproteine in herkömmlichen
Tests und der Mechanismus, der zur Signalbildung führt, ist beispielsweise in Cormier,
M.L. et al., Photochem & Photobiol. 49/4, 509 - 512 (1989) oder Smith, D.F. et al., in
"Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status (P. Stanley & L. Kricka, eds.), John
Wiley and Sons, Chichester, U.K. 1991, 529 - 532 beschrieben. In diesem Fall findet die Aktivierung
durch Zugabe von Kalziumionen zu den markierten, gebundenen Sonden statt.
Adequate Chemilumineszenzdirektmarkierungen mit blitzartigem Signalprofil sind z. B. auch
Acridinium-Arylester, Acridinium-Acyl-Sulfonamide oder Isoluminolderivate, wie ABEI,
AEEI und AHEI.
Eine weitere, besonders geeignete Gruppe von Markierungsgruppen sind zur Elektrochemiluminszenz
anregbare Metallkomplexe. Solche Komplexe sind beispielsweise beschrieben in
EP-A-0 199 804, EP-A-0 265 519, WO 89/04302 und WO 92/14139. Bevorzugt handelt es
sich um Rutheniumkomplexe, welche als Liganden Bipyridyleinheiten aufweisen. Nukleinsäuresonden,
die mit speziellen Rutheniumhomplexen markiert sind, sind beispielsweise auch in EP-A-0
340 605 beschrieben. Besonders gut einsetzbare immunologische Sonden, welche mit
Rutheniumkomplexen markiert sind, sind beispielsweise in EP-A-0 178 450 beschrieben.
Neben Rutheniumkomplexen können auch andere entsprechend triggerbare Übergangsmetalle
(Osmium, Iridium, etc.) bzw. andere zur Elektrochemilumineszenz geeignete heterocylisch
aromatische Komplexliganden verwendet werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Detektionsgruppen zu einer Bildung eines detektierbaren,
auf die Gruppe zurückzuführenden Signals, angeregt. Bevorzugt ist dieses Signal ein
Lumineszenzsignal. Unter Lumineszenz wird üblicherweise ein Vorgang verstanden, bei dem
ein chemisch angeregter, metastabiler Molekülzustand unter Emission eines Photons
(elektromagnetische Strahlung) in einen niederenergetischen Zustand übergeht
Unter unabhängigen Erzeugungen eines Signals werden im Sinne vorliegenden Erfindung
Handlungen verstanden, durch die selektiv eine bestimmte Markierungsgruppe angeregt wird,
ohne daß Markierungsgruppen auf davon unterschiedlichen Sonden angeregt werden.
Unter einem elektromagnetischen Signal wird im Sinne der Erfindung bevorzugt ein Lichtsignal
verstanden. Besonders bevorzugt sind Lichtblitze.
Von unterschiedlichen elektromagnetischen Signalen wird im folgenden gesprochen, wenn sich
die Signale in ihrer Herkunft unterscheiden, z.B. herkommend von unterschiedlichen Substanzklassen
von Markierungsgruppen. Wenn im Folgenden von der Kombination von Elektrochemilumineszenz
und Biolumineszenz durch Photoproteine gesprochen wird, so ist dies nur
als bevorzugte Ausführungsform eines Systems zweier unterschiedlich anregbarer Lumineszenzmarkierungen
zu verstehen.
Die Erzeugung der unterschiedlichen elektromagnetischen Signale kann sowohl gleichzeitig als
auch nacheinander vorgenommen werden. Dies hängt insbesondere davon ab, ob die Signale so
stark unterschiedlich sind, daß sie auch gleichzeitig spezifisch detektiert werden können. Es hat
sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, die unterschiedlichen elektromagnetischen Signale
nacheinander zu erzeugen und zu detektieren. Daher ist es bevorzugt, Markierungsgruppen zu
wählen, die selektiv aktivierbar sind, z. B. eine erste Gruppe durch chemische oder/und allostenische
Triggerung und zweite durch elektrochemische Triggerung. Dies hat insbesondere
den Vorteil, daß die für die Signalerzeugung eventuell erforderlichen Reaktionsbedingungen
nicht in derselben Lösung eingestellt werden müssen. Für den Fall, daß es sich bei der ersten
Art von Markierungsgruppe um ein durch Ionen aktivierbares Photoprotein und bei der zweiten
Markierungsgruppe um einen zur Elektrochemilumineszenz anregbaren Metallkomplex
handelt, ist es möglich, die beiden Signale gleichzeitig oder nacheinander zu bestimmen. Eine
gleichzeitige Messung ist möglich bei Verwendung von Markierungsgruppen mit unterschiedlichen
Emissionswellenlängen. Das zur Lichtdetektion verwendete Modul muß dabei eine
spektroskopische Auftrennung der Signale, z. B. durch Wahl geeigneter Filter, Prismen oder
Gitter erlauben.
Bei Bestimmung der Signale nacheinander ist es möglich, zuerst die Bedingungen für die Erzeugung
des Photoproteinsignales einzustellen, aber bevorzugt, zunächst die Bedingungen für
die Erzeugung der Elektrochemilumineszenz einzustellen. Hierzu wird (für das Beispiel der
Markierung mit einem Rutheniumtrisbipyridylkomplex) eine Lösung von Kaliumphosphat, Tripropylamin
und Thesit™ mit den an die feste Phase gebundenen Analyten, Standardanalyten
und gegebenenfalls anderen zu bestimmenden Bestandteilen, an welche die Sonden gebunden
sind, in Kontakt gebracht. Dies kann entweder durch Zupipettieren der Lösung zu der festen
Phase geschehen, es ist jedoch auch möglich, die feste Phase in eine Lösung der Reagenzien
zuzugeben oder die Lösung an der festen Phase vorbeifließen zu lassen. Der letzte Fall ist bevorzugt,
da hierbei auch eine Reinigungswirkung erzeugt wird. In Anwesenheit der zwei oder
mehr Sonden wird nun die Elektrochemilumineszenz durch Anlegen einer Spannung erzeugt.
Der erzeugte Lichtblitz wird als Signal mit Hilfe eines geeigneten Instrumentes, z. B. unter
Anwendung eines Photomultipliers, in einen Meßwert umgewandelt. Für die Meßbedingungen
und Reagenzien wird auf die Publikation Uland, J.K. and Powell, M.J. in J. Electrochem. Soc.
137, pp. 3127-3127 (1990) verwiesen. Überraschenderweise stört die elektrische Signalerzeugung
die Aktivität der Photoproteine nicht.
Anschließend werden Reaktionsbedingungen eingestellt, wie sie für die Erzeugung eines
Signales basierend auf der Anwesenheit des Photoproteins erforderlich sind. Auch hier können
die entsprechenden Reagenzien zu der bereits vorliegenden Lösung oder einer entsprechenden
Waschlösung oder der festen Phase zugegeben werden. Bevorzugt ist jedoch die Verdrängung
der fiir die Erzeugung der Elektrochemilumineszenz erforderlichen Reagenzlösung durch die
Reagenzlösung für die Aktivierung des Photoproteins. Das Inkontaktbringen des Photoproteins
mit dem aktivierenden Ion bewirkt ebenfalls die Erzeugung eines Lichtsignals, dessen
Intensität instrumentell bestimmt und in einen Meßwert umgewandelt werden kann. Es war
möglich, das Signal, welches mit Hilfe von Aequorin erzeugt worden war, mit derselben apparativen
Anordnung wie der für die Detektion des Lichtblitzes, welcher mit Hilfe von
Rutheniumbipyridylkomplexen erzeugt worden war, zu messen, vorausgesetzt der Photomultiplier
hat eine genügende Empfindlichkeit bei beiden Emissionswellenlängen. Für die Bedingungen
zur Erzeugung eines Lichtsignales bei Verwendung von Aequorin als Label wird
hiermit Bezug genommen auf die Publikation Smith, D.F. et alt Bioluminescence and Chemiluminescence;
Current status (P. Stanley and L. Kricha, eds.), John Wiley, Chichester, U.K.,
pp. 529-532 (1991).
Bei den Signalen handelt es sich bevorzugt und vorteilhafterweise um Blitzsignale. Dies bedeutet,
daß Anregung und Messung des Signals sehr schnell ablaufen können. Dadurch wird
die Gesamtmeßzeit für zwei Nachweisreaktionen nicht wesentlich länger (≥ 2,5 x) als die fiir
eine der beiden Einzelmessungen (z. B. Elektrochemilumineszenz: 4 Sekunden, Elektrochemilumineszenz
mit nachfolgender Biolumineszenz mit Aequorin: 5 Sekunden). Dies ermöglicht
einen maximalen Zugewinn bezüglich des Durchsatzes, besonders auf einem Analyzer, da das
Prinzip des dualen Markierungsnachweises nicht gemindert wird durch eine signifikante Aufweitung
des Meßzeitfensters. Es ergeben sich für die genannte Kombination keine Interferenzen
zwischen den beiden einer Probe zugeordneten Signalreaktionen durch vollständige zeitliche
Trennung innerhalb eines Meßschrittes, so daß eine saubere, voneinander unabhängige
Auswertung der beiden Signale direkt möglich wird, ohne Notwendigkeit für letztlich nur
Nährungswerte liefernde mathematische Korrektoralgorithmen. Die jeweilige Leistungsfähigkeit
der beiden Markierungsgruppen (z. B. im Hinblick auf Kriterien, wie analytische Sensitivität,
Serien- und Tag-Tag-Präzision, dynamischer Meßbereich und linearer Meßbereich) bleibt
auch in Kombination erhalten.
Die Messung der von unterschiedlichen Detektionsgruppen erzeugten Signale erfolgt bevorzugt
mit derselben Messanordnung, z. B. in derselben Messzelle. Bevorzugt wird die Messzelle
so gewählt, daß an ihr keine Änderungen bezüglich der detektierten Wellenlängen für beide
Detektionsgruppen erforderlich ist. Die Messzelle ist bevorzugt eine für das elektrochemische
Triggern einer Detektionsgruppe ausgelegte Messzelle. Die bevorzugt nachgeschaltete Detektion
beruhend auf einer anderen Substanzklasse als Detektionsgruppe benutzt nicht die
Elektroanordnung der ECL-Messzelle zur Anregung der Lumineszenz, sondern nur zur Detektion.
Die sequentielle Abfolge der Bestimmung der unterschiedlichen Detektionsgruppen macht es
moglich, daß die Gruppen keine unterschiedliche kinetische Charakteristik aufweisen müssen,
oder sich in ihrem spektralen Verhalten unterscheiden müssen. So ist beispielsweise der
Ruthenium-Komplex durch einen Fluorophor ersetzbar, der wie Aequorin in blaugrünem Bereich
emittiert.
Die Auswertung der Signale bzw. der Meßwerte für diese Signale hängt nun von der beabsichtigten
Aussage des Bestimmungsverfahrens ab. In jedem Fall jedoch ist das Vorhandensein
eines Meßwertes, der sich von einem Meßwert einer Vergleichsmessung unterscheidet, bei der
keine Sonde oder kein Analyt vorhanden war, ein Anzeichen für die Anwesenheit des Analyten.
Dasselbe gilt fiir den Meßwert für die übrigen Bestandteile oder einen Standardanalyten.
Dies kann benutzt werden, um eine qualitative Aussage über die Anwesenheit des Analyten
bzw. weitere Analyten zu erhalten. Das Ergebnis der Messung für den Standardanalyten kann
in einer qualitativen Messung für die Eichung des Systems und als Positivkontrolle verwendet
werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die Schritte:
- Bindung des Analyten und gegebenenfalls eines weiteren Analyten bzw. Standardanalyten
an eine feste Phase (z. B. ein Magnetpartikel),
- Bindung einer Sonde an den Analyten bzw. an den weiteren Analyten bzw. den Standardanalyten,
- Bestimmung der gebundenen ersten Sonde (in Anwesenheit, jedoch unabhängig von der
zweiten Sonde),
- Bestimmung der Bindung der zweiten Sonde (in Anwesenheit und unabhängig von der
ersten Sonde),
- Ermittlung der Anwesenheit bzw. Konzentration des mindestens einen Analyts aufgrund der
erhaltenen Signale der ersten Sonde. Hierbei können jedoch auch weitere Sonden, markiert
mit weiteren Markierungsgruppen und unter Verwendung weiterer unabhängiger Anregungen,
eingesetzt werden. Bevorzugt wird der Analyt, der weitere Analyt bzw. Standardanalyt
und die daran gebundenen Sonden nach Durchführung der Bestimmung vom Anregungsbzw.
Meßort entfernt, so daß dieser für die Durchführung einer weiteren Bestimmung, z. B.
der Bestimmung eines Analyten aus einer weiteren Probe, zur Verfügung steht.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch besonders geeignet fiir eine quantitative Bestimmung
eines Analyten. Unter einer quantitativen Bestimmung wird die Bestimmung der
Menge eines Analyten in der Probe und somit auch die Bestimmung der Menge an Analyt in
einer für die Herstellung der Probe verwendeten Primärprobe verstanden. Die quantitative
Bestimmung verwendet bevorzugt mindestens eine Sonde, die für den zu bestimmenden Analyten
spezifisch ist. Sollen mehrere Analyten bestimmt werden, sind weitere Sonden/Markierungsgruppen
erforderlich. Darüber hinaus wird eine Sonde eingesetzt, welche fiir
den Standardanalyten spezifisch ist. Da die Menge an Standardanalyt definiert und bekannt ist,
kann der Meßwert fiir den Standardanalyt zur Eichung des Meßwertes fiir den Analyt verwendet
werden.
Die Eichung des Systems kann z. B. folgendermaßen durchgeführt werden:
I. Erstellung einer Eichkurve:
Verschiedene Lösungen, z. B. 5, mit unterschiedlichen, aber bekannten Konzentrationen
an Analytnukleinsäure, werden mit jeweils der gleichen bekannten Menge an Standardnukleinsäuren
(z. B. 1000 Kopien) versetzt. Zu jeder dieser Lösungen werden Lösungen
mit den mindestens 2 Sonden (z. B. Rutheniummarkierung an der Analytsonde,
Aequorinmarkierung an der Standardsonde) gegeben. Nach Hybridisierung werden die
Meßsignale für die bekannten Konzentrationen an Analyt und Standard ermittelt. Daraus
wird eine Eichkurve erstellt, indem das Signalverhältnis der Messungen für Analyt zu
Standard in Abhängigkeit der eingesetzten bekannten Analytkonzentration aufgetragen
wird. II. Probenmessung und Auswertung
Der Probe mit der unbekannten Analytkonzentration wird vor der Messung die gleiche
Konzentration an Standardnukleinsäuren wie bei der Erstellung der Eichkurve (z. B.
1000 Kopien) zugegeben und die entsprechenden Meßsignale für den Analyt und den
Standard ermittelt. Das Signalverhältnis von Analyt zu Standard wird berechnet und die
Analytkonzentration aus der Eichkurve abgelesen.Die Verhältnisbildung aus 2 oder mehr gemeinsam (d. h. aus einem Reaktionsansatz)
erzeugten Signalen ist eine einfache Möglichkeit, eventuell auftretende Schwankungen in
der Signalgenerierung zu kompensieren. Vorallem werden eventuelle Schwankungen in
der Amplifikationsreaktion der unterschiedlichen Sonden für den Analyten bzw. Standard
korrigiert. Solche Schwankungen betreffen z. B. variable Effizienzfaktoren von Probe zu
Probe, oder für ein und dieselbe Probe von Cyclus zu Cyclus und rühren unter anderem
von Schwankungen in der Qualität der Probenvorbereitung her (z. B. Aufreinigungsgrad,
Abtrennung von Inhibitoren). per internem, co-amplifiziertem Standard und ratiometrischer
Auswertung werden solche Schwankungen für jeden Reaktionsansatz herausgerechnet.
Sollte sich das Signalverhältnis zwischen den einzelnen Geräten und über die
Zeit pro Gerät ausreichend konstant verhalten, kann dieses Signalverhältnis beim Hersteller
des Gerätes bzw. der Reagenzien vorab ermittelt werden und zur Auswertung
mittels Korrekturfaktor bzw. Korrekturfunktion in der Auswertesoftware implementiert
werden. Dann ist kundenseitig nur noch die Erstellung einer Eichkurve aus verschiedenen
Konzentrationen an Analytnukleinsäure notwendig. III. Vor Erstellung der Eichkurve erfolgt zweckmäßigerweise eine experimentelle Prüfung
auf vergleichbare Amplifikationseffizienz von Proben-DNA und Standard-DNA (interner
Standard), erkennbar z. B. an parellel-linearen Verläufen bei Auftragung von log Signal
(Y) über log Ausgangskopienzahl N0 (X)
In Figur 1 ist der schematische Aufbau eines Gerätes zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens gezeigt. Ein entsprechendes Gerät, das einfach auf die Anforderungen
des beschriebenen Verfahrens adaptiert werden kann, ist von der Firma Boehringer
Mannheim GmbH (Elecsys 2010 oder 1010) erhältlich.
Bevorzugt laufen folgende Schritte ab:
1. Amplifikation mittels PCR einer Analytnukleinsaure in einer Probe in Anwesenheit
und Coamplifikation einer bekannten Menge an Standardnukleinsäure. 2. Denaturierung durch Zugabe von NaOH-Lösung. 3. Aufbewahrung dieser Probe im Probenrotor 5. 4. Überführung eines Aliquots in ein Gefäß des Inkubators. 5. Zugabe der analytspezifischen und der standardanalytspezifischen Sonde. 6. Inkubation mit streptavidinbeschichteten Magnetpartikeln in Inkubator 4. 7. Aufnahme eines Aliquots der Lösung aus dem Inkubator 4 über die Pipettiernadel
6 in die Meßzeile 13. 8. Aufnahme der Konditionierlösung aus Behälter 1 zum Transport des Aliquots
durch das Liquid Flow System. Die Magnetteilchen mit gebundenen Analyt,
Standardanalyt und Sonden werden durch den Magneten an der Arbeitselektrode
festgehalten. 9. Aufnahme von Konditionierlösung aus Behälter 1 zum Waschen der Beads auf der
Arbeitselektrode. 10. Anlegen einer Spannung zwischen Arbeits- und Gegenelektrode 10 und 11
(kontrolliert über Referenzelektrode 9) führt zur Aussendung eines Lichtblitzes.
Messung des Lichtblitzes mit dem Photomultiplier 7. 11. Aufsaugen der kalziumhaltigen Triggerlösung aus Gefäß 3 in die Meßzelle 13, dabei
Messung der entstehenden Lumineszenz. Die Teilchen sind hierbei durch den
Magneten 8 in der Meßzeile 13 festgehalten. 12. Entfernen des Magneten 8 und somit Abführung der gebundenen Magnetteilchen
mit durchgepumpter Reinigungslösung aus Gefäß 2. 13. Auswertung der Signalintensitäten. 14. Das Gerät steht zur erneuten Aufnahme einer zu vermessenden Probe (Schritt 1)
zur Verfügung.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung kann in vielerlei Hinsicht vorteilhaft genutzt werden.
Zunächst ist das Verfahren für die Durchführung quantitativer Bestimmungen von Analyten
geeignet. Die Menge an benötigter Probenflüssigkeit wird reduziert, gegebenenfalls
halbiert. Bei Verwendung der bevorzugten Detektionsmarkierungen ist nur ein einziges Gerät
zur Detektion und Auswertung erforderlich. Außerdem ist es möglich, auch immunologische
Tests mit auf Nukleinsäurebasis funktionierenden Tests zu kombinieren. Auf jeden Fall wird
der Durchsatz von Proben auf Testgeräten (Analyzer) ganz erheblich verbessert. Durch unabhängige
Anregung wird die zeitliche Trennung der Signale ermöglicht. Dies ermöglicht einen
großen dynamischen Bereich und die hohe Sensitivität.
In Figur 2 ist der Signalverlauf einer beispielhaften, hintereinander ablaufenden Bestimmung
zweier Detektionsgruppen (Rutheniumkomplex und Aequorin) gezeigt. Es wird erkenntlich,
daß die Signalintensitaten in der gleichen Größenordnung liegen, d. h. überraschenderweise
auch für Aequorinlabel in eigentlich zur Bestimmung der Elektrochemilumineszenz gedachten
Geräten eine ausreichende Signalausbeute erreicht werden kann. In Figur 2 bedeuten die
Kurvenverläufe 1 bis 7:
1 | 10 nM bio-Aeq /7 pM ruthenyliertes Oligonukleotid |
2 | 1 nM bio-Aeq / 7 pM ruthenyliertes Oligonukleotid |
3 | 100 pM bio-Aeq / 7 pM ruthenyliertes Oligonukleotid |
4 | 10 pM bio-Aeq /7 pM ruthenyliertes Oligonukleotid |
5 | 1 pM bio-Aeq / 7 pM ruthenyliertes Oligonukleotid |
6 | 0 M bio-Aeq / 7 pM ruthenyliertes Oligonukleotid |
7 | 0 M bio-Aequorin /0 M ruthenyliertes Oligonukleotid |
Aufgetragen ist die Signalstärke bei Vermessung gegen die Zeit in Sekunden.
Figur 3 zeigt, daß überraschenderweise praktisch kein Signalverlust durch vorgeschaltete ECL-Messung
zu beobachten ist. In Figur 3 ist der Verlauf der Signalintensitäten (bei gleichen Konzentrationsverhältnissen)
während einer Meßzeit in Sekunden gezeigt fiir einen ersten Fall, bei
dem zuerst das Aequorinlabel von MDP (Mono-biotin-Mono-DigoxigeninHepta-Peptid, erhältlich
aus dem Enzymun-Test® DNA Detection, Boehringer Mannheim GmbH, BRD, Best.-Nr.
1447777) und anschließend das ECL-Signal des Oligonukleotids 1 (SEQ.ID.NO. 1) gemessen
wird (Kurve 1) und einem zweiten Fall, in dem zuerst das ECL-Signal und anschließend
das Aequorinsignal gemessen wird (Kurve 2). Es ist erkennbar, daß sich die Intensität
des Aequorinsignals vor ECL-Messung nur unwesentlich von der Intensität des Signals
nach ECL-Messung unterscheidet. Dies bedeutet, daß die Biolumineszenzmarkierung
überraschenderweise durch den vorgeschalteten Elektrochemielumineszenzprozess nicht
wesentlich an Funktionalität verliert. Die Triggerspannung für die ECL-Messung ist jenseits
der Zersetzungsspannung von Wasser, d.h., die Wasseroxidation ist während des ECL-Prozesses
in vollem Gange, an der Anode (wo sich das Äquorin befindet), entstehen große
Mengen Sauerstoff. Die Umgebung des Proteins wird also erheblich gestört. Überraschenderweise
wird dadurch die durch das Protein hervorgerufene Signalhöhe nicht beeinflußt. Es muß
weiterhin gewährleistet werden, daß Reste der Reaktionslösungen für die vorangegangene
Bestimmung nicht mehr in störendem Umfang in der Messzelle verbleiben. Das gilt insbesondere
für Substanzen (z. B. Ionen), die, wenn die beiden Lösungen für die unterschiedlichen
Reaktionen aufeinandertreffen, schwerlösliche Niederschläge bilden (z. B. Calziumionen aus
der Aequorintriggerung und Phosphationen aus der ECL-Triggerung). Gerade die Verwendung
unterschiedlich und vollständig voneinander getrennt anregbarer Markierungen in nacheinander
ablaufenden Bestimmungsreaktionen insbesondere fiir Analysenautomaten, bei denen
eine Vielzahl von Bestimmungen nacheinander durchgeführt werden soll, und wobei die später
durchgeführten Bestimmungen noch genauso zuverlässig durchgeführt werden sollen, wie die
ersten, war für einen Fachmann nicht zu erwarten. Dies gilt insbesondere für Analysenautomaten
mit Durchflußküvetten, welche für unterschiedliche Bestimmungen eingesetzt werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Reagenzkit zur Bestimmung eines Analyten enthaltend
in einem oder getrennten Behältern zwei oder mehr Sonden, von denen mindestens eine für den
zu bestimmenden Analyten spezifisch ist, wobei von den mindestens zwei Sonden eine elektrisch zur
Lumineszenz und eine chemisch zur Lumineszenz angeregt werden kann.
Die Spezifität der weiteren Sonden ist der obigen Schilderung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zu entnehmen. Darüber hinaus enthält das Reagenzkit bevorzugt einen Behälter mit einem
Standardanalyten, wobei die Konzentration des Standardanalyten bekannt oder/und definiert
ist. Außerdem kann das Reagenzkit weitere Reagenzien, die zur Bestimmung der Markierungsgruppen
erforderlich sind, enthalten. Weiterhin können auch Reagenzien zur Vorbehandlung
von Proben zur Herstellung einer analythaltigen, fiir die Bestimmung geeigneten Lösung,
enthalten sein. Diese sind bevorzugt in getrennten Behältern enthalten. Geeignete Reagenzien
sind beispielsweise Primer, Enzym- und Mononukleosidtriphosphate für die Durchführung
einer kompetitiven PCR. Weitere mögliche Bestandteile des Reagenzkits sind eine Suspension
von Magnetpartikeln, an welche der Analyt gebunden werden kann.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung zweier Sonden, gemäß Anspruch 14
zum quantitativen Nachweis von Analyten in einer
Probe.
Die folgenden Beispiele sollen den Gegenstand der Erfindung näher erläutern:
Beispiel 1
Aufeinanderfolgende Bestimmung von unterschiedlichen Detektionsgruppen an streptavidinbeschichteten
Magnetpartikeln bei gleichzeitiger Anwesenheit von Rutheniumkomplexen als
zweiter Detektionsgruppe
Für die Bestimmung unterschiedlicher Detektionsgruppen wurde eine 200 µl Pufferlösung
hergestellt, die biotinyliertes Aequorin (in den Konzentrationen 1 pM bis 10 nm) und das am
5'-Ende mit Bio-Link I (Firma Applied Biosystems Inc., Biotin Amidite, Best.-Nr. 401395)
biotinylierte und am 3'-Ende über AM III (Einbau während der Oligonukleotidsynthese an
CPG (Controlled Pore Glass) und Entfernen der Schutzgruppe Fmoc, FIG 4) mittels BPRu
(hergestellt gemäß Clin. Chem. 37/9, 1534 - 1539 (1991)) markierte Oligonukleotid I
(SEQ.ID.NO. 1) enthält. Diese Probelösungen wurden mit 36 µg Streptavidinbeads (Firma
Boehringer Mannheim GmbH, Elecsys® TSH Immunoassay, Best.-Nr. 1731459) in 50 µl des
oben genannten Puffers versetzt und 5 min. bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 120 µl
dieser Reaktionslösung in die Meßzelle des Elecsys 2010- oder Elecsys 1010-Analyzers der
Firma Boehringer Mannheim GmbH aufgenommen. Danach wurden 1100 µl einer Konditionierlösung
mit der Zusammensetzung 300 mM Kaliumphosphat, 180 mM Tripropylamin
(TPA) und 1,7 mM Thesit® durchgepumpt. Dann wurde ein Elektrochemilumineszenz(ECL)-Signal
generiert (Spannung: 1,25 V, Zeit: 0,8 sek.). Das ECL-Signal wurde aufgenommen und
ist auf dem linken Teil von Figur 2 zu sehen. Durch die konstante Konzentration des
Rutheniumlabels erhält man bei allen ECL-Messungen das ungefähr gleiche Signal.
Zur Messung des Aequorinsignals wird eine Triggerlösung der Zusammensetzung 10 mM
Tris/HCI, pH 7,4, 100 mM Calciumchlorid in die Meßzelle eingesaugt und dabei das entstehende
Signal gemessen. Das gemessene Signal ist auf dem rechten Ast der Kurven in Figur
2 gezeigt. Es ist erkennbar, daß das Signal der Aequorinmessungen von der Konzentration der
aequorinmarkierten Verbindungen abhängig ist.
Beispiel 2
Nachweis zweier verschiedenen Chlamydia - Targetsequenzen
Die reale Situation eines Dual Label Assays unter Benutzung eines internen Standards sieht so
aus, daß eine interne Standardnukleinsäure bekannter Konzentration in Anwesenheit einer
Analytnukleinsäure unbekannter Konzentration nachgewiesen werden muß. Dabei erstreckt
sich der potentielle Konzentrationsbereich der Analytnukleinsäure über mehrere Größenordnungen.
Für eine gleichbleibend gute Quantifizierungsmöglichkeit über den gesamten Konzentrationsbereich
ist es notwendig, daß das Standardsignal unabhängig von der Konzentration der Probe
konstant bleiben muß und das Analytsignal linear mit der Probenkonzentration variiert, unabhängig
von der Konzentration der ebenfalls vorhandenen Standardnukleinsäure.
Im vorliegenden Beispiel wird die Unabhängigkeit beider Signale mittels parallel geführter
Bindereaktionen zwischen zwei verschiedenen Fangsonden (Standard bzw. Analyt) und zwei
jeweils hybridisierungsfähigen Indikatorsonden (standard- bzw. analytspezifisch), von denen
eine mit Rubpy, die andere Aequorin-markiert ist. Die reale Test-Situation wird dadurch
modelliert, daß die Konzentration jeweils einer Fangsonde konstant gehalten wird (diese simuliert
dann den Standard), während die der anderen Fangsonde ( die dann den Analyten simuliert)
über vier Größenordnungen variiert wird.
Bei den Fangsonden handelt es sich um biotinylierte 40mere (20mer- (bzw. 19mer-) (nichtchlamydiaspezifische)
Spacersequenz + 20-mer- (bzw. 21-mer-) Hybridisierungssequenz).
Beide Hybridisierungssequenzen entstammen dem Chlamydia trachomatis Genom. Im einen
Fall hat die Hybridisierungszone die Sequenz 5'-CA GAG TTC TAT AGT GCT ATG-3'
(SEQ.ID.NO. 2). Die zugehörige Indikatorsonde 5'CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG-3'
(SEQ.ID.NO. 3) ist Aequorin-geiabelt (MH:SH Linkerchemie nach Funktionalisierung mit
basisch aktivierbarem [N-Trifluoroacetamido]-aminoalkyl-phosphoramidit).
In der anderen Fangsonde ist die Hybridisierungssequenz 5'-G TCT CTC ATC GAG ACA
AAG TG-3' (SEQ.ID.NO. 4). Die zugehörige Indikatorsonde 5'CA GAG TTC TAT AGT
GCT ATG-3' (SEQ.ID.NO. 5) ist über NHS-Chemie mit Ru(bipy)3 gekoppelt.
Von den beiden Chlamydia-Targets ( Fangsonde ) wird jeweils eines konstant bei 0.1nM gehalten,
während die Konzentration des anderen seriell auf 1*10-9, 1*10-10, 1*10-11, 1*10-12 M verdünnt
wird. Die Konzentration der beiden Indikatorsonden ist konstant (10nM). Die bei 37°C
gebildeten Hybride werden auf Streptavidin-beschichteten ECL-Beads (720 µg/ml aus
Elecsys® TSH) immobilisiert und anschließend mit dem Dual Label Zyklus wie in Beispiel 1
beschrieben vermessen.
FIG 5 und 6 zeigen daß während das Signal des jeweils gewählten Standards konstant bleibt,
sich für die jeweils als Analytnukleinsäure gewählte Fangsonde eine ausgezeichnete lineare
Korrelation zwischen Analytkonzentration und -signal über vier Größenordnungen hinweg
ergibt, unabhängig vom Signal des Standards.
Beispiel 3
Kompetitiver Assay
In diesem Versuch erfolgt eine competitive Testführung mit dual label-Detektion als Modellassay
im Hinblick auf quantitative PCR (qPCR) via Co-amplifikation eines internen Standards,
wobei ein Label (eine Markierung) definitiv einem zu amplifizierenden Polynucleotid zugeordnet
ist. Hierbei repräsentieren die Indikatorsonden die per Konkurrenz um Primer-Anbindung
variable Menge an detektierbarem PCR-Produkt, ausgehend von Analyt-DNA bzw. interne
Standard-DNA (Hybridisierungsrate als Funktion der jeweiligen Ausgangskopienzahl).
a. Versuchsaufbau:
Eine biotinylierte 30-mer Fangsonde (10 dT-Spacersequenz + 20-mer Hybridisierungszone:
5'-CA GAG TTC TAT AGT GCT ATG-3' (SEQ.ID.NO. 6)) wird seriell verdünnt auf 1000,
100, 10 pmol/l (dazu 0 pmol/l = Pufferleerwert) und jeweils auf Streptavidin (SA)-beschichteten
ECL-Beads (720 µg/ml) immobilisiert. Eine dazu in ihrer Basensequenz komplementäre
20-mer Indikatorsonde (5'-CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG-3' (SEQ.ID.NO. 7)), anknüpfend
an eine Funktionalisierung mit basisch (NH3) aktivierbarem [N-Trifluoracetamido]-aminoalkyl-phosphoramidit
einmal über MH:SH-Linkerchemie mit Aequorin markiert, und
einmal über NHS-Chemie mit Ru2+(bipy)3, wird mit der Fangsonde zur Reaktion gebracht, wobei
es zu einer Konkurrenz zwischen Aequorin- und ECL-markierter Sonde um gemeinsame
Fangsondenbindestellen kommt. In einem Fall wird dabei die ECL-markierte Indikatorsonde
mit 0.4 nmol/l konstant gehalten, die Aequorin-markierte Sonde hingegen im Bereich 0.1 -
10 nmol/l variiert, im anderen Fall wird die Aequorin-Sondenkonzentration festgesetzt auf
1 nmol/l, während die ECL-Sondenkonzentration im Bereich 0.4 - 40 nmol/l variiert wird.
Um direkt vergleichen zu können, wurden die aus diesem Versuch erhaltenen Primärdaten
normiert: die ECL-Signale relativ zu 40 nmol/l (= großer Überschuß = 100%), die Aequorin-Signale
relativ zu 10 nmol/l (= 100%). Die relativen Änderungen, die sich bei Reaktion der
verschieden konzentrierten Fangsondenkonzentrationen mit einer bestimmten Mischung der
Indikatorsonden ergaben, wurden gemittelt und anschließend graphisch gegen die variierte
Indikatorsondenkonzentration aufgetragen.
b. Ergebnisse:
Das Ergebnisse der Messungen ist FIG 7 und 8 zu entnehmen. Bei absolut gleicher Hybridisierungssequenz
ist zu erwarten, daß der Schnittpunkt der Kurven genau da liegt, wo die Konzentration
der variierten Sonde genau der Konzentration der konstant gehaltenen Sonde entspricht
(sollte in der Nähe von 50% liegen).Wird die Aequorin-markierte Sonde auf 1 nmol/l festgesetzt
und die Ru2+(bipy)3-markierte Sonde variiert, so erhält man ein Schnittpunkt der Kurven
bei ca. 0.8 nmol/l, d.h. 0.8 nmol/l Ru2+(bipy)3-markierte Sonde sind äqui-effizient zu 1.0 nmol/l
Aequorin-markierter Sonde, was den zu erwartenden Molmasseneffekt (Aequorin: 22000 Da,
Ru2+(bipy)3 < 1000 Da) wiederspiegelt. Umgekehrt erhält man bei Variation der Aequorinmarkierten
Sonde einen Schnittpunkt bei ca. 2 nmol/l, d.h. 2 nmol/l sind äqui-effizient zu 0.4
nmol/l Ru2+(bipy)3-markierter Sonde. Diese aus Mittelwerten (s.o.) abgeleiteten Daten zeigen,
daß die Hybridisierungsraten mit den beiden Indikatorsonden trotz des erheblichen Molmassenunterschiedes
weitgehend ähnlich sind, und die Unterschiede gut der theoretischen
Voraussage folgen, womit die prinzipielle Tauglichkeit einer erfindungsgemäßen dual label-Detektion
für competitive qPCR auf Basis Co-Amplifikation eines internen Standards unterstrichen
wird. Dies wird weiter bestätigt durch die Restaktivität der einen Markierungssonde
bei maximalem Überschuß der anderen. Diese beträgt 4% bei konstant 1 nmol/l Aequorin-markierter
Sonde und 14% bei konstant 0.4 nmol/l Ru2+(bipy)3-markierter Sonde, was gut den
relativen Überschuß der jeweils anderen Sonde von 40:1 im ersten und 25:1 im letzten Fall
wiederspiegelt, in der zu erwartenden Orientierung verstärkt durch den Molmasseneffekt (d.h.
kinetischer Vorteil der Ru2+(bipy)3-markierten Sonde verstärkt den Effekt des Konzentrationsüberschusses
dieser Sonde über die Aequorin-markierte Sonde im ersten Fall, bzw. vermindert
den Effekt des Konzentrationsüberschusses der Aequorin-markierten Sonde im letzteren
Fall).
Beispiel 4
Quantitative Bestimmung einer Nukleinsäure
Probenvorbereitung und PCR-Amplikation
Eine Rohprobe wird erforderlichenfalls so vorbereitet, daß die Nukleinsäure in zugänglicher
Form vorliegen (z. B. Lyse von Zellen etc.). Die Nukleinsäuren können erforderlichenfalls gemäß
EP-B-0 201 184 amplifiziert werden (Polymerasekettenreaktion). Gemäß EP 0 420 260
wird Biotin mittels markierter Primer eingebaut.
Denaturierung
10 µl dieser Reaktionsmischung wurden mit 40 µl Denaturierungslösung (Zusammensetzung
0,05 M Natriumhydroxid, 0,15 M Natriumchlorid) denaturiert.
Hybridisierung
Anschließend werden 2 Sorten von Sonden zugegeben, von denen eine Rutheniummarkierung
(bevorzugt die analytspezifische Sonde) und die andere eine Aequorinmarkierung enthält
(bevorzugt die standardspezifische Sonde). Die Sonden sind in einer Hybridisierungslösung mit
der Zusammensetzung Phosphatpuffer, pH 6,5, Natriumchlorid und Rinderalbumin gelöst. Von
dieser Hybridisierungslösung werden 200 µl zu der vorher erzeugten Reaktionsmischung zugegeben.
Das Reaktionsgemisch bei 37 °C fiir 20 Minuten inkubiert.
Bindung an magnetische Beads
Zu der erhaltenen Reaktionslösung werden 50 µl Lösung von magnetischen Streptavidinbeads
(aus Elecsys® TSH-Immunoassay, Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 1731459)
(720 µg/ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten bei 37 °C inkubiert.
Messung
150 µl der erhaltenen Reaktionslösung werden in dem in Figur 1 beschriebenen Gerät in die
Meßzelle aufgenommen. Wie in Beispiel 1 beschrieben wird zunächst das Elektrochemilumineszenzsignal
und dann das Aequorinsignal gemessen.
Bezugszeichenliste
- (1)
- Konditionierlösung fiir die Meßzelle
- (2)
- Reinigungslösung Für die Meßzelle
- (3)
- Calciumchloridhaltige Triggerlösung
- (4)
- Inkubator
- (5)
- Primärprobenrotor
- (6)
- beweglicher Pipettor
- (7)
- Photomultiplier
- (8)
- beweglicher Magnet
- (9)
- Referenzelektrode
- (10)
- Arbeitselektrode
- (11)
- Gegenelektrode
- (12)
- Pumpe
- (13)
- Meßzelle
- (14)
- Umschaltventil fiir Kolbenpumpe
Sequenzprotokoll
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH (B) STRASSE: Sandhoferstr. 116 (C) ORT: Mannheim (E) LAND: DE (F) POSTLEITZAHL: 68305 (G) TELEFON: 0621 759 4348 (H) TELEFAX: 0621 759 4457 (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Bestimmung von Analyten unter Verwendung
zweier Markierungen (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7 (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature (B) LAGE:1 (D) SONSTIGE ANGABEN:/note= "A am 5'-Ende mit Bio-Link I mit Biotin markiert" (ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSEL: misc_feature (B) LAGE:21 (D) SONSTIGE ANGABEN:/note= "A am 3'-Ende mit AM III mit BPRu markiert" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7: