EP1027593A1 - Vorrichtung und verfahren zur durchführung von fluoreszenzimmuntests - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur durchführung von fluoreszenzimmuntests

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EP1027593A1
EP1027593A1 EP98959766A EP98959766A EP1027593A1 EP 1027593 A1 EP1027593 A1 EP 1027593A1 EP 98959766 A EP98959766 A EP 98959766A EP 98959766 A EP98959766 A EP 98959766A EP 1027593 A1 EP1027593 A1 EP 1027593A1
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EP
European Patent Office
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light
optical waveguide
optical
piston
cylinder
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98959766A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Katerkamp
Ulrich Kunz
Frank Grawe
Göran KEY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
Original Assignee
Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB filed Critical Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
Publication of EP1027593A1 publication Critical patent/EP1027593A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the invention relates to a device and a method for carrying out fluorescence immunoassays, light from at least one light source being directed onto a surface at one end of an optical waveguide and fluorescence from at least one with the light coupled into the optical waveguide by evanescent field excitation on the surface of the optical waveguide marker substance bound to a chemical or biochemical partner of a general receptor-ligand system is excited and the fluorescent light is partially coupled into the optical waveguide and is coupled out of the optical waveguide from the surface into which the exciting light has been coupled and via optics an optical detector is directed, with which the intensity of the fluorescent light is measured.
  • biochemical tests on general receptor-ligand systems such as e.g. Antibody antigen can be performed.
  • the tests are used to quantitatively determine chemical or biochemical substances in liquid samples.
  • Antibodies can thus be labeled with a specific marker (fluorophore), the marker in question being able to be optically excited at a specific excitation wavelength of the light and the fluorescent light obtained by the excitation, which in turn with a different wavelength occurs, detected with a suitable optical detector and the intensity of the fluorescent light is used to determine the respective proportion of the chemical or biochemical substance from the sample liquid.
  • a specific marker fluorophore
  • the evanescent field that forms at an interface is used for the fluorescence excitation.
  • the known physical relationships of the evanescent field and in particular the required total reflection of the excitation light must be taken into account.
  • WO 97/10 506 discloses an optical device for carrying out fluorescence immunoassays, in which an optical fiber is used, into which light from a light source is coupled and fluorescence of a sample is generated by evanescent field excitation.
  • the surface of the optical waveguide is accordingly coated with a chemical or biochemical component before the respective test, ie the introduction of the sample liquid into a container in which the optical fiber is accommodated, is carried out.
  • a very complex and complex optic is required, which consists of a plurality of individual optical components.
  • the light from the light source used is directed via a lens system onto a semitransparent mirror and part of the light is coupled as a reference signal to an optical detector and the other part of the light is coupled into the fiber via a further lens.
  • the end of the optical fiber opposite the coupling and decoupling surface is mirrored, so that most of the excitation and fluorescent light again is coupled out of the optical fiber. This leads to the fact that the ratio of excitation light to fluorescence light for the evaluation with the photodetector deteriorates and consequently the measuring accuracy is undesirably impaired.
  • a further disadvantage of this known device is that the light is to pass through the lens arranged in front of the coupling surface of the optical fiber, so that light enters the optical fiber at a defined main angle within a narrow angular range, which is advantageously required for evanescent field excitation. if at all very difficult to reach.
  • the fluorescence immunoassays are then carried out according to this known solution in such a way that the prepared, coated optical fiber accommodated in the container is brought into contact with the sample liquid by perforation in the lid of the container and the sample liquid enters and the connection to that on the surface of the optical fiber immobilized complementary partner of the receptor-ligand system can take place. After the connection, fluorescence is then excited by irradiation of the light from the light source used and its intensity is measured with the optical detector.
  • connection Since the respective mass transfer to the optical waveguide surface is important for the connection process and convection and diffusion must be taken into account, measurement errors occur in the solution known from WO 97/10 506, since the sample volume accommodated in the container is constant and the penetration the sample liquid via the perfo- rations happens very quickly and the connection is made in a still liquid. In this case, the connection is mainly influenced by diffusion, which, in addition to other disadvantages, also leads to the measurement time being extended.
  • the device according to the invention builds on the known state of the art already described and likewise uses at least one light source, with which light, for fluorescence excitation via the evanescent cente field, is coupled into an optical waveguide and the intensity of the fluorescent light of a marking substance, which is bound to a partner of a general receptor-ligand system, is determined with an optical detector.
  • the fluorescent light and part of the excitation light are coupled out from the same area into which the excitation light has been coupled.
  • the optical waveguide is received in a measuring chamber which is formed in a piston of a piston-cylinder unit.
  • the measuring chamber of the piston has an inflow into the interior of the cylinder which leads through the piston.
  • Such a piston-cylinder unit can be designed at least approximately like a conventional syringe, only the piston having to be modified accordingly with the measuring chamber.
  • a further improvement can be achieved by forming an additional sample collection chamber in the piston, which is connected to the measurement chamber. This creates a unit in which the incubation and the measurement can be carried out and after the respective test has been carried out the sample is safely recorded and the corresponding one
  • Piston-cylinder unit transported and can be disposed of without major problems and hazard formation.
  • the optical waveguide can have a surface which closes the bulb in this direction. It also forms a conclusion for the measuring and sample collection chamber. It also serves to fix the optical fiber on this side of the Piston.
  • the optical waveguide and the surface can advantageously be made in one piece from the same material, such as, for example, a polymer, such as polyethacrylate (PMMA).
  • a light absorber is advantageously arranged, which preferably consists of a black-colored plastic.
  • the light absorber can be dimensioned and shaped in such a way that it aligns and fixes the optical waveguide in the lower region of the measuring chamber.
  • Another favorable effect can be achieved with the light absorber, which improves the ratio of excitation light and fluorescent light to a value that is favorable for the measurement.
  • the light absorber With the help of the light absorber, almost all of the excitation light is absorbed, while the fluorescent light is only reduced by half, so that the ratio of the two light components is shifted in favor of the fluorescent light. This means that very sensitive light detectors can be used to measure the weak fluorescent light.
  • optical waveguide it is also possible to subdivide the optical waveguide into a number of optical waveguiding segments which run parallel to the light propagation in the optical waveguide.
  • the individual segments are spatially separated from each other by a thin layer.
  • the refractive index n 2 of this layer is smaller than that of the light-wave-guiding segments in order to achieve light guidance through total reflection.
  • a multi-analyte measurement is possible with such a segmented optical waveguide, since a fluorescence immunoassay is carried out with each segment carrying light waves can.
  • the closure e.g. can be a thin film or a corresponding stopper, which can be removed if necessary, which will be explained later, and the opening can be opened.
  • the respective sample liquid can advantageously be supplied via an inflow opening in the cylinder, as is also the case with conventional syringes.
  • the inflow opening should advantageously be closable with a valve, in order to avoid an undesired escape of sample liquid from the cylinder, after it has been filled.
  • Another favorable embodiment of the device according to the invention uses an absorbent material which is accommodated at least in the sample collecting chamber, wherein a part of the absorbent material can also protrude into the measuring chamber.
  • Filters and / or an immune column and / or a membrane which can be permeable or semi-permeable, can be present in front of or in the already mentioned inflow through the piston into the measuring chamber, in order to keep certain components contained in the sample liquid away from the measurement or otherwise targeted influence on the measurement with the use of an immune column and / or membrane and / or the filter. to be able to take.
  • the various fluorescence immunoassays can now be carried out in such a way that the surface of the optical waveguide contains various chemical or biochemical components, such as e.g. Antibody is coated, the coating being able to take place, for example, in a two-stage batch process.
  • Adsorptive immobilization of the respective components including prior cleaning of the fiber optic surface.
  • This can be carried out in a simple immersion process, with which it is easily and effectively possible to process a relatively large number of such optical fibers at the same time. Since the optical waveguides can also be produced by conventional injection molding processes and, consequently, a large number of optical waveguides are available connected to one another after the injection molding, this process can of course be carried out extremely effectively.
  • optical waveguides coated in this way are then inserted into the measuring chamber of a piston designed as already described, the opening in the surface at one end of the optical waveguide, which closes the piston, also being closed.
  • This surface can then be connected to the piston by gluing, an airtight seal being intended to be ensured.
  • the end face of the piston used for example with a biocomponent, before it is inserted into the cylinder.
  • the surface of the inside of the cylinder can be coated with a lyophilized biocomponent. It is also suitable to cover the surface of the inflow of the cylinder.
  • the device according to the invention can be made available for the respective need, and longer storage times are also readily possible under appropriate conditions.
  • the piston-cylinder unit prepared in this way can then be drawn up like a syringe and filled with sample liquid if necessary, a defined amount of sample liquid being able to be drawn into the cylinder.
  • the sample liquid remains exclusively in the cylinder and cannot get into the measuring chamber through the inflow in the piston and consequently not into the sample collection chamber, since the air contained therein cannot be displaced because the opening that allows air to escape is still closed.
  • the appropriately pretreated sample can be guided into the measuring chamber and past the optical waveguide if the air outlet opening on the end face is opened. In the case of a film used for this, this can be done by removing or piercing it. The air can escape from the measuring chamber and sample collection chamber and the chambers are filled by capillary forces, the sample liquid flowing continuously past the surface of the optical waveguide.
  • the flow of the sample liquid through the measuring chamber with a defined flow rate can also be achieved by a correspondingly targeted movement of the cylinder with the syringe plunger fixed. It is also not absolutely necessary for the air outlet opening on the end face to be opened, since the air in the measuring chamber and in particular in the sample collection chamber can be compressed and thus the sample can also flow past the surface of the optical waveguide. In this operating mode, an air outlet opening on the end surface is not necessary.
  • the syringe plunger When the pre-incubated sample liquid flows through the measuring chamber, the syringe plunger must be held in a defined manner so that the light from the light source for the excitation light hits the surface at the correct angle and can be coupled into the optical waveguide. If an optical fiber with a diameter of approx. 1 mm is used, relatively large compromises can be made in terms of position accuracy without the respective measurement results being adversely affected.
  • the valve at the inflow into the cylinder already mentioned prevents the sample liquid accommodated in the cylinder from undesirably escaping again and the entire amount being able to be used for the measurement; this is particularly important when the cylinder is moved to flow through the measuring chamber.
  • the fluorescent light excited by means of the light source already mentioned, which is coupled out from the end face of the optical waveguide, is released is detected with the optical detector already mentioned and its intensity is measured.
  • the optical structure to be used for this purpose will be specified further later.
  • Another improved possibility for guiding the sample liquid preincubated, as described, past the optical waveguide through the measuring chamber can also be done in such a way that in the sample collecting chamber a material which is highly absorbent for liquid, such as e.g. Vlies is included.
  • This material protrudes into the measuring chamber and the pre-incubated sample liquid can get into the measuring chamber from the cylinder after opening the closure, the opening in the surface, by capillary force and will continue to be caused by capillary forces in the liquid-absorbing material. chamber guided until the sample collection chamber is filled. This leads to a more stable liquid transport.
  • the fluorescence intensity is measured in the period in which the sample liquid flows along the optical waveguide through the measuring chamber. If a device designed in this way is used, the valve already mentioned at the inflow into the cylinder can be dispensed with, so that, for example, a conventional syringe body is used as the cylinder can be used, which is available inexpensively.
  • device with certainty. This is firstly a hydrodynamic layer at a certain distance from the wall and secondly a diffusive layer, the respective distances between the layers depending on the wall, the viscosity and the flow rate of the fluid.
  • the diffusive layer i.e. at a greater distance from the wall, the chemical and biochemical components are brought up to the surface by convection, and within the diffusive layer, ie in the direction of the wall, the movement then takes place via diffusion processes.
  • Mass transport by convection is much larger than that which can be achieved by diffusion. This for the relatively fast antigen-antibody reaction means that the reaction process is greatly slowed down by the relatively slow diffusion process and this can lead to a time of about 1 hour being required for an immunoassay, for example, in order to obtain a sufficiently accurate measurement result determine.
  • the thickness of the diffusive layer can be reduced, thus increasing the influence of the convective mass transfer to the wall to which the chemical or biochemical components are to be attached. This greatly improves the response behavior of the immunoassay and consequently reduces the measurement time required.
  • the thickness of the channel-like flow can also be reduced if the flow rate is not increased, in order to reduce the extent of the diffusive layer, as can be advantageously designed in the arrangement according to the invention comprising the measuring chamber and the optical waveguide.
  • the distance between the optical fiber surface and the inner surface of the measuring chamber is kept as small as possible. A distance of less than 2 mm is advantageous, preferably between 0.1 - 0.05 mm.
  • a device according to the invention designed in this way can be inexpensively manufactured as a mass product and prepared in advance coated with corresponding biocomponents. Another advantage is that contact of the respective sample liquid with a person is avoided and the person is kept securely closed even after the test has been carried out, which is particularly advantageous in medical use.
  • the lens and an optical filter which is transparent to the coupled fluorescent light in front of the optical detector in the beam path of the light coupled out, the excitation light being blocked by the optical filter.
  • the outcoupled light should be directed in parallel through the respective filter in the direction of the optical detector.
  • the optical part of the device according to the invention can be further improved by arranging an additional second lens in the beam path of the outcoupled light following the optical filter already mentioned, with which the fluorescent light guided through the filter is now focused on the detector.
  • the optical parameters and the distance between the lens and the detector must be selected or adjusted accordingly so that the image of the fluorescent light coupled out of the optical waveguide is imaged on the optical detector.
  • Filters for the respective fluorescent light should advantageously be arranged and manipulated in such a way that they can be moved alternately into the beam path of the outcoupled light, so that there is always only one of the two filters for the respective fluorescent light.
  • the corresponding filter When the corresponding filter is introduced into the beam path of the fluorescent light, it is advantageous to interrupt the beam path of the other excitation source in parallel, so that no light from this source enters the optical waveguide.
  • a further advantageous development of the invention is to arrange a diaphragm in front of the detector, the opening of which can be positioned at variable times in the beam path in front of the detector by translation and / or rotation of the diaphragm.
  • each individual segment of the optical waveguide can be measured with this arrangement.
  • a linear or areal arrangement of detectors e.g. to use a CCD camera to measure the individual segments of the optical fiber.
  • FIG. 1 shows an optical waveguide in several views for a device according to the invention
  • Figure 2 shows an inventive device in a
  • FIG. 3 shows an example of a piston for a device according to the invention
  • Figure 4 shows another example of a piston for a device according to the invention
  • Figure 5 shows an example of a device according to the invention with an additional valve in different operating positions
  • Figure 6 shows an example of the optical part of a device according to the invention.
  • FIG. 1 shows an optical waveguide 1 to be used in a device according to the invention in different views.
  • the optical waveguide 1 has on one of its two end faces a light absorber 5 made of a dark, preferably black plastic material, which absorbs a very large part of the incident light.
  • the light absorber 5 has approaches which allow guidance and fixing when the optical waveguide 1 is introduced into a measuring chamber 9, which will be described in more detail below. It is also possible to attach one or more such approaches to the optical waveguide 1.
  • FIG. 1 shows a possible way of dividing the optical waveguide 1 into a number of segments 27 that conduct light waves.
  • the single ones Segments 27 are separated from one another by a thin layer 28, the refractive index n 2 of which is smaller than that of the light wave-guiding segments n j .
  • the side view in FIG. 1 again illustrates the possible type of subdivision of the optical waveguide 1 shown.
  • a surface 2 is formed on the other end face of the optical waveguide 1, the diameter of which is substantially larger than that of the optical waveguide 1 and closes off one side, towards the surroundings, of a piston 6, which will also be described in more detail below.
  • a closure 4 can be, for example, a peelable or pierceable film.
  • the side view shown in FIG. 1 also makes clear the area of surface 2 to which the light is to be directed in order to excite the fluorescence.
  • the optical waveguide 1 thus completed can be introduced into a measuring chamber 9 of a piston 6 and glued to the piston on the surface 2, as can be seen in FIG. 2.
  • a chemical or biochemical component is already immobilized on the surface of the optical waveguide 1.
  • At least one sample collection chamber 10 is also formed, which is connected to the measuring chamber 9, the sample collection chamber 10 being ring-shaped. can be formed around the measuring chamber 9.
  • the sample collection chamber 10 should be dimensioned such that it can accommodate all or a large part of the sample liquid volume.
  • an inflow 8 which represents a connection between the measuring chamber 9 and the interior of the cylinder 7, in which the piston 6 with the optical waveguide 1 has been inserted.
  • the cylinder 7 has a further inflow 11 through which sample liquid can get into the interior of the cylinder 7.
  • Cylinders 7 arrive, as is the case with conventional syringes or other piston-cylinder arrangements. Since the opening 3 in the surface 2 is closed with the closure 4, no sample liquid can get into the measuring chamber 9 through the inflow 8. Only at the moment when the opening 3 is at least partially opened can the air contained in the sample collection chamber 10 and the measurement chamber 9 escape and be displaced by the sample liquid, which now flows through the inflow 8, the measurement chamber 9 into the sample collection chamber 10 can reach.
  • the cylinder 7 is preferably moved with the piston 6 fixed, so that the free volume inside the cylinder 7 is reduced and, at a defined speed of this movement, the corresponding flow rate of the sample liquid through the measuring chamber 9 can also be set in a defined manner.
  • the outflow of the sample liquid through the inflow 11 should be prevented with the help of a valve 15, which will be explained below.
  • the opening 3 in the surface can be dispensed with.
  • the sample liquid displaces the air in the measuring chamber 9 and compresses it in the closed sample collecting chamber 10, so that the sample liquid, depending on the direction of movement of the cylinder 7, flows through the measuring chamber 9.
  • a sample flow can take place solely by capillary forces into the measuring chamber 9 and from there into the sample collecting chamber 10 if the closure 4 has been removed or pierced.
  • FIG. 3 shows another example of a piston 6 for a device according to the invention.
  • the piston seal 13 can also be clearly seen in this illustration.
  • the sample collection chamber 10 is filled with a material 12 that is particularly absorbent for the sample liquid, it not being clearly evident in this illustration that a part of the absorbent material 12 can at least partially protrude into the measuring chamber 9.
  • the liquid transport of the sample liquid through the measuring chamber can be supported by the capillary action of the absorbent material, the sample liquid also flowing first through the measuring chamber 9 when the opening 3 in the surface 2 is at least partially cleared, and air can thereby escape is and the inflow 11 is open.
  • FIG. 4 shows that a filter or an immune column 14 can be arranged in the inflow 8 of the piston 6, through which the sample liquid must be passed before the actual entry into the measuring chamber 9. It is also possible for a filter or a membrane to cover the inflow 8 on the piston surface 23.
  • FIG. 5 shows the arrangement and function of a valve 15 which blocks or releases the inflow 11 into the interior of the cylinder 7.
  • a simple flap valve with a non-return effect is used, which is arranged in the interior of the cylinder 7 in the region of the inflow 11.
  • sample liquid can get into the interior of the cylinder 7 through the inflow 11 and the opened valve 15.
  • valve 15 closes and thus prevents sample liquid from being able to escape from the interior of the cylinder 7 via the inflow 11 in an undesirable manner.
  • two laser diodes 16 and 17 are used as light sources in order to either determine two different analytes in parallel or to additionally carry out a reference measurement.
  • the laser diode 16 directs light onto the coupling surface of the optical waveguide 1 at a fixed angle, so that the light for fluorescence excitation is coupled into the optical waveguide 1 and guided at a defined angle.
  • a laser diode 16 was used, which emits light with a wavelength with which fluorescence can be excited in the fluorophore Cy5.
  • the detector 22 can be a photodiode, a photo-avalanche diode or a photomultiplier.
  • a filter 19 is located in the beam path in front of the detector and is used for the fluorescent light of the fluorescent light. rophors is permeable and does not allow the proportions of excitation and stray light to pass through.
  • the lens 18 is provided with two slit-shaped cutouts through which the excitation light of the laser diodes 16 and 17 can be directed directly onto the coupling-in surface of the optical waveguide 1 without the light being refracted or deflected through the lens 18.
  • the laser diode 17 emits light with a wavelength with which the fluorophore Cy7 can be excited.
  • the detectable proportion of fluorescent light that can ultimately reach detector 22 is relatively small, it is favorable to alternate the already mentioned filter 19 and a second filter 20, which is permeable to fluorescent light from the fluorophore Cy7, into the beam path to move in front of the detector, consequently of course the respective measurement must also take place alternately and the measurement signals of the detector 22 must be synchronized with the movement of the two filters 19 and 20.
  • FIG. 6 also shows that an additional lens 21, for bundling the fluorescent light onto the detector 22 into the beam path of the light coupled out of the optical waveguide 1, is arranged after the filters 19 or 20.
  • the two laser diodes 16 and 17 are arranged diametrically opposite one another, but they can also be at another almost any angle to be arranged to each other.
  • the angle of incidence of the respective light beam of the laser diodes 16 and 17 must be maintained, which can be different in order to ensure an almost optimal coupling of the respective excitation light into the optical waveguide 1.
  • the beam path of the light source that is not required is also advantageously interrupted.
  • the laser diode 16 and the filter 19 are operated together, while the light from the laser diode 17 cannot enter the optical waveguide 1, since the beam path through the filter 20 has been interrupted.
  • the filters 19 and 20 should therefore both be chosen so that they are opaque to light from the laser diodes 16 and 17.
  • the diameter of the lens 18 can be reduced so that the light beams of the laser diodes 16 and 17 are not influenced by the lens 18 while maintaining all set angles.
  • optical filters 24 and 25 can be seen in FIG. 6, which are arranged directly behind the laser diodes 16 and 17 in their beam path and through which the respective excitation light is filtered in accordance with its design.
  • the laser diodes 16 and 17 used as a unit with appropriate optics that align the light beam direction in parallel.
  • the individual segments 27 can be measured in that there is a movable diaphragm 26 in the beam path in front of the detector 22.
  • the opening of the aperture 26 is positioned in the beam path by translation and / or rotation of the aperture 26 such that only fluorescent light from a segment 27 of the optical waveguide 1 reaches the detector 22.
  • the diaphragm 26 is movable, the fluorescence luminosity from the individual segments 27 can be measured with the detector 22 one after the other by translating and / or rotating the diaphragm 26.
  • a detector 22 which consists of a linear or areal arrangement of light-sensitive detectors. The fluorescent light from all segments 27 of the optical waveguide 1 can thus be measured virtually simultaneously.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests, wobei von mindestens einer Lichtquelle Licht auf eine Fläche an einem Ende eines Lichtwellenleiters gerichtet wird und mit dem im Lichtwellenleiter eingekoppelten Licht durch Evanescentfeldanregung an der Oberfläche des Lichtwellenleiters Fluoreszenz von mindestens einem an einen chemischen oder biochemischen Partner eines allgemeinen Rezeptor-Ligand-Systems gebundenen Markierungsstoffes angeregt wird. Die erfindungsgemäße Lösung soll dabei eine Möglichkeit schaffen, um mit geringem Aufwand und in kurzer Zeit Fluoreszenzimmuntests mit hoher Meßgenauigkeit durchführen zu können. Zur Lösung dieser Aufgabe wird das Fluoreszenzlicht aus dem Lichtwellenleiter ausgekoppelt und über eine Optik auf einen optischen Detektor gerichtet, mit dem die Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen wird. Dabei ist der Lichtwellenleiter in einer in einem Kolben einer Kolben-Zylindereinheit ausgebildeten Meßkammer aufgenommen und die Meßkammer über einen im Kolben ausgebildeten Zufluß mit dem Innenraum des Zylinders verbunden.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests, wobei von mindestens einer Lichtquelle Licht auf eine Fläche, an einem Ende eines Lichtwellenleiters gerichtet wird und mit dem im Lichtwellenleiter einge- koppelten Licht durch Evanescentfeldanregung an der Oberfläche des Lichtwellenleiters Fluoreszenz von mindestens einem an einem chemischen oder biochemischen Partner eines allgemeinen Rezeptor-Ligand- Systems gebundenen Markierungsstoffes angeregt wird und das Fluoreszenzlicht zum Teil in den Lichtwellenleiter eingekoppelt wird und aus dem Lichtwellenleiter aus der Fläche , in die das anregende Licht eingekoppelt wurde , ausgekoppelt wird und über eine Optik auf einen optischen Detektor gerichtet wird, mit dem die Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen wird.
Mit der Erfindung können die verschiedensten biochemischen Tests an allgemeinen Rezeptor-Ligand-Syste- men, wie z.B. Antikörper-Antigen durchgeführt werden. Mit den Tests werden quantitativ chemische oder biochemische Substanzen in flüssigen Proben bestimmt.
So können Antikörper mit einem bestimmten Markierungsstoff (Fluophore) markiert werden, wobei der jeweilige Markierungsstoff bei einer bestimmten Anregungswellenlänge des Lichtes optisch angeregt werden kann und das durch die Anregung erhaltene Fluoreszenzlicht, das wiederum mit einer anderen Wellenlänge auftritt, mit einem geeigneten optischen Detektor erfaßt und die Intensität des Fluoreszenzlichtes zur Bestimmung des jeweiligen Anteils der chemischen oder biochemischen Substanz aus der Probenflüssigkeit aus- genutzt wird. Für die Fluoreszenzanregung wird das sich an einer Grenzfläche ausbildende evanescente Feld benutzt. Hierbei müssen die bekannten physikalischen Zusammenhänge des evanescenten Feldes und dabei insbesondere die erforderliche Totalreflexion des Anregungslichtes berücksichtigt werden.
So ist aus WO 97/10 506 eine optische Vorrichtung zur Durchführung von Fluoreszenzimmunoassays bekannt, bei der eine Lichtleitfaser verwendet wird, in die Licht einer Lichtquelle eingekoppelt und Fluoreszenz einer Probe durch Evanescentfeldanregung erzeugt wird. Dabei wird die Oberfläche des Lichtwellenleiters vor Durchführung des jeweiligen Tests, also der Einleitung der Probenflüssigkeit in einen Behälter, in dem auch die Lichtleitfaser aufgenommen ist, entsprechend mit einer chemisch- oder biochemischen Komponente beschichtet.
Für die Einkopplung des Lichtes in die Lichtleitfaser ist eine sehr aufwendige und komplizierte Optik erforderlich, die aus einer Mehrzahl einzelner optischer Komponenten besteht. So wird das Licht der verwendeten Lichtquelle über ein Linsensystem auf einen halbdurchlässigen Spiegel gerichtet und ein Teil des Lichtes als Referenzsignal auf einen optischen Detektor und der andere Teil des Lichtes über eine weitere Linse in die Faser eingekoppelt. Dabei ist das der Ein- und Auskoppelflache entgegengesetzte Ende der Lichtleitfaser verspiegelt, so daß der größ- te Teil des Anregungs- und Fluoreszenzlichtes wieder aus der Lichtleitfaser ausgekoppelt wird. Dies führt dazu, daß das Verhältnis von Anregungs- zu Fluoreszenzlicht für die Auswertung mit dem Fotodetektor verschlechtert und demzufolge die Meßgenauigkeit in unerwünschter Weise beeinträchtigt wird.
Ein weiterer Nachteil dieser bekannten Vorrichtung besteht darin, daß das Licht über die vor der Einkoppelfläche der Lichtleitfaser angeordnete Linse erfol- gen soll, so daß ein Lichteintritt unter einem definierten Hauptwinkel innerhalb eines schmalen Winkelbereichs in die Lichtleitfaser, die für die Evanescentfeldanregung vorteilhaft erforderlich ist, wenn überhaupt nur sehr schwierig zu erreichen ist.
Die Fluoreszenzimmuntests werden dann nach dieser bekannten Lösung so durchgeführt, daß die in dem Behälter aufgenommene, vorbereitete, beschichtete Lichtleitfaser mit der Probenflüssigkeit in Kontakt gebracht wird, indem durch Perforationen im Deckel des Behälters die Probenflüssigkeit eintritt und die Anbindung an den auf der Oberfläche der Lichtleitfaser immobilisierten komplementären Partner des Rezep- tor-Ligand-Systerns erfolgen kann. Nach der Anbindung wird dann durch Einstrahlung des Lichtes der verwendeten Lichtquelle Fluoreszenz angeregt und deren Intensität mit dem optischen Detektor gemessen.
Da für den Anbindungsprozeß der jeweilige Stofftrans- port zur Lichtwellenleiteroberfläche eine Bedeutung hat und dabei Konvektion und Diffusion berücksichtigt werden müssen, treten bei der aus WO 97/10 506 bekannten Lösung Meßfehler auf, da das jeweils in den Behälter aufgenommene Probenvolumen konstant ist und das Eindringen der Probenflüssigkeit über die Perfo- rationen sehr schnell geschieht und die Anbindung damit in einer ruhenden Flüssigkeit erfolgt. In diesem Falle wird die Anbindung überwiegend durch Diffusion beeinflußt, was neben anderen Nachteilen auch zur Verlängerung der Meßzeit führt.
Bei dieser Art der nicht zeitlich aufgelösten Messung ist eine Hintergrundkorrektur des Meßsignals notwendig, was in WO 97/10506 nicht berücksichtigt wurde.
Ein weiterer wesentlicher Nachteil, der mit dieser bekannten Lösung verbunden ist, besteht darin, daß lediglich das Anregungslicht allein als Referenzsignal benutzt wird, um die Genauigkeit der Meßergeb- nisse zu erhöhen. Zur Verbesserung der Meßgenauigkeit und Aussagekraft der Testergebnisse sowie einer erhöhten Reproduzierbarkeit ist es jedoch erforderlich, für die Immuntests geeignetere Referenzmessungen durchzuführen.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Möglichkeit zu schaffen, um mit geringem Aufwand, in kurzer Zeit Fluoreszenzimmuntests mit hoher Meßgenauigkeit durchführen zu können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich bei Nutzung der in den untergeordneten Anεprü- chen enthaltenen Merkmale.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung baut auf den bereits beschriebenen bekannten Stand der Technik auf und verwendet ebenfalls mindestens eine Lichtquelle, mit der Licht, zur Fluoreszenzanregung über das evanes- cente Feld, in einen Lichtwellenleiter eingekoppelt wird und die Intensität des Fluoreszenzlichtes eines Markierungsstoffes, der an einem Partner eines allgemeines Rezeptor-Ligand-System gebunden ist, mit einem optischen Detektor bestimmt wird. Dabei wird das Fluoreszenzlicht und ein Teil des Anregungslichtes aus der gleichen Fläche ausgekoppelt, in die das Anregungslicht eingekoppelt worden ist. Der Lichtwellenleiter ist dabei in einer Meßkammer aufgenommen, die in einem Kolben einer Kolben-Zylindereinheit ausgebildet ist. Die Meßkammer des Kolbens verfügt dabei über einen Zufluß, in den Innenraum des Zylinders, der durch den Kolben führt. Eine solche Kolben-Zylindereinheit kann dabei zumindest annähernd, wie eine herkömmliche Spritze ausgebildet sein, wobei lediglich der Kolben entsprechend mit der Meßkammer modifiziert werden muß.
Eine weitere Verbesserung kann dadurch erreicht wer- den, in dem im Kolben eine zusätzliche Probensammel- kammer ausgebildet ist, die mit der Meßkammer in Verbindung steht. Dadurch entsteht eine Einheit, in der die Inkubation und die Messung durchgeführt werden kann und nach Durchführung des jeweiligen Tests die Probe sicher aufgenommen ist und die entsprechende
Kolben-Zylindereinheit transportiert und ohne größere Probleme und Gefahrenbildung entsorgt werden kann.
Der Lichtwellenleiter kann an der Seite, an der das Anregungslicht ein- und das Fluoreszenz- und ein Teil des Anregungslichtes wieder ausgekoppelt wird, eine Fläche aufweisen, die den Kolben in diese Richtung verschließt. Sie bildet also auch einen Abschluß für Meß- und Probensammelkammer. Außerdem dient sie zur Fixierung des Lichtwellenleiters an dieser Seite des Kolbens. Dabei kann der Lichtwellenleiter und die Fläche vorteilhaft einstückig aus dem gleichen Material, wie beispielsweise einem Polymer, wie Polyme- thyl ethacrylat (PMMA), bestehen.
Am anderen Ende des Lichtwellenleiters ist vorteilhaft ein Lichtabsorber angeordnet, der bevorzugt aus einem schwarz eingefärbten Kunststoff besteht. Dabei kann der Lichtabsorber so dimensioniert und ausge- formt sein, daß er den Lichtwellenleiter im unteren Bereich der Meßkammer ausrichtet und fixiert.
Mit dem Lichtabsorber kann ein weiterer günstiger Effekt erreicht werden, der das Verhältnis von Anre- gungs- und Fluoreszenzlicht zu einem für die Messung günstigen Wert verbessert. Mit Hilfe des Lichtabsorbers wird nahezu das ganze Anregungslicht absorbiert, während das Fluoreszenzlicht nur um die Hälfte verringert wird, so daß das Verhältnis der beiden Licht- anteile, zugunsten des Fluoreszenzlichtes verschoben ist. Damit können sehr empfindliche Lichtdetektoren verwendet werden, um das schwache Fluoreszenzlicht zu messen.
Es ist auch möglich, den Lichtwellenleiter in mehrere parallel zur Lichtausbreitung im Lichtwellenleiter verlaufende lichtwellenführende Segmente zu unterteilen. Die einzelnen Segmente sind dabei durch eine dünne Schicht räumlich voneinander getrennt. Der Bre- chungsindex n2 dieser Schicht ist kleiner als der der lichtwellenführenden Segmente, um Lichtführung durch Totalreflektion zu erreichen. Mit einem solchen seg- mentierten Lichtwellenleiter ist eine Multianalytmes- sung möglich, da mit jedem lichtwellenführenden Seg- ment ein Fluoreszenzimmunotest durchgeführt werden kann .
Für die Durchführung der Tests ist es außerdem gün- stig, in der Fläche, die den Kolben verschließt, eine verschließbare Öffnung vorzusehen, wobei der Verschluß z.B. eine dünne Folie oder ein entsprechender Stopfen sein kann, die bei Bedarf, worauf später noch zurückzukommen sein wird, entfernt und die Öffnung freigegeben werden kann.
Die jeweilige Probenflüssigkeit kann günstigerweise über eine Zuflußöffnung im Zylinder zugeführt werden, wie dies auch bei herkömmlichen Spritzen der Fall ist.
Dabei sollte die Zuflußöffnung günstigerweise mit einem Ventil , zur Vermeidung eines unerwünschten Probenflüssigkeitsaustrittes aus dem Zylinder, nach des- sen Befüllung, verschließbar sein.
Eine weitere günstige Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendet ein saugfähiges Material , das zumindest in der Probensammelkammer aufgenommen ist, wobei auch ein Teil des saugfähigen Materials in die Meßkammer hineinragen kann.
Vor bzw. in dem bereits erwähnten Zufluß durch den Kolben in die Meßkammer können Filter und/oder eine Immunsäule und/oder eine Membran, die permeabel oder semipermeabel sein kann, vorhanden sein, um bestimmte in der Probenflüsεigkeit enthaltene Komponenten von der Messung fernzuhalten oder anderweitig gezielt Einfluß auf die Messung mit der Verwendung einer Im- unsäule und/oder Membran und/oder des Filters vor- nehmen zu können.
Die verschiedenen Fluoreszenzimmuntests können nunmehr so durchgeführt werden, daß die Oberfläche des Lichtwellenleiters mit verschiedenen chemischen, bzw. biochemischen Komponenten, wie z.B. Antikörper, beschichtet wird, wobei die Beschichtung beispielsweise in einem zweistufigen Batchprozeß erfolgen kann. Dieser Batchprozeß beinhaltet neben der Beschichtung durch z.B. adsorptive Immobilisierung der jeweiligen Komponenten, auch eine vorherige Reinigung der Lichtwellenleiteroberfläche. Dies kann in einem einfachen Tauchverfahren durchgeführt werden, mit dem es einfach und effektiv möglich ist, eine relativ hohe An- zahl solcher Lichtwellenleiter gleichzeitig zu bearbeiten. Da die Lichtwellenleiter auch durch herkömmliche Spritzgießverfahren hergestellt werden können und demzufolge eine Vielzahl an Lichtwellenleitern nach dem Spritzgießen miteinander verbunden zur Ver- fügung stehen, ist dieser Vorgang selbstverständlich äußerst effektiv durchzuführen.
Die so beschichteten Lichtwellenleiter werden dann in die Meßkammer eines , wie bereits beschrieben ausge- bildeten Kolbens, eingesetzt, wobei die Öffnung in der Fläche am einen Ende des Lichtwellenleiters, die den Kolben abschließt, ebenfalls verschlossen ist. Die Verbindung dieser Fläche mit dem Kolben kann dann durch Verkleben erfolgen, wobei ein luftdichter Ab- schluß gesichert sein soll.
Es besteht auch die Möglichkeit, die Stirnfläche des verwendeten Kolbens vor der Einführung in den Zylinder, z.B. mit einer Biokomponente zu belegen. Alternativ kann auch die Oberfläche der Innenseite des Zylinders mit einer lyophilisierten Biokomponente belegt werden. Geeignet ist auch die Belegung der Oberfläche des Zuflußes des Zylinders.
In so vorbereiteter Form kann die erfindungsgemäße Vorrichtung für den jeweiligen Bedarf zur Verfügung gestellt werden, wobei auch längere Lagerzeiten unter entsprechenden Bedingungen ohne weiteres möglich sind.
Die so vorbereitete Kolben-Zylindereinheit kann dann bei Bedarf wie eine Spritze aufgezogen und mit Probenflüssigkeit gefüllt werden, wobei eine definierte Probenflüssigkeitsmenge in den Zylinder eingezogen werden kann. Die Probenflüssigkeit verbleibt ausschließlich im Zylinder und kann nicht durch den Zufluß im Kolben in die Meßkammer und demzufolge auch nicht in die Probensammelkammer gelangen, da die dort enthaltene Luft nicht verdrängt werden kann, weil die Öffnung, die einen Luftaustritt ermöglicht, noch verschlossen ist.
Bei Belegung des Zuflusses des Zylinders und/oder der Zylinderoberfläche und/oder der Kolbenstirnfläche mit Biokomponenten treten diese beim Befüllen in die Probenflüssigkeit ein. Dabei kommt es zu einer Wechselwirkung (Vorinkubation) der Biokomponente mit den chemischen oder biochemischen Komponenten der Proben- flüssigkeit. Nach dieser Vorinkubation kann die entsprechend vorbehandelte Probe in die Meßkammer und dort am Lichtwellenleiter vorbei geführt werden, wenn die Luftaustrittsöffnung an der Abschlußfläche geöffnet wird. Dies kann bei einer hierfür verwendeten Folie durch deren Entfernung bzw. Durchstechen erfol- gen. Die Luft aus der Meßkammer und Probensammelkammer kann entweichen und die Kammern werden durch Kapillarkräfte befüllt, wobei die Probenflüssigkeit kontinuierlich an der Lichtwellenleiteroberfläche vorbeifließt. Das Durchströmen der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer mit definierter Strömungsgeschwindigkeit kann auch durch entsprechend gezielte Bewegung des Zylinders, bei fixiertem Spritzenkolben erreicht werden. Hierbei ist es auch nicht zwingend notwendig, daß die Luftaustrittsöffnung an der Abschlußfläche geöffnet wird, da die Luft in der Meßkammer und besonders in der Probensammelkammer komprimiert werden kann und damit die Probe auch an der Lichtwellenleiteroberfläche vorbeiströmen kann. Bei dieser Betriebsart ist eine Luftaustrittsöffnung an der Abschlußfläche nicht notwendig.
Beim Durchströmen der vorinkubierten Probenflüssigkeit durch die Meßkammer muß der Spritzenkolben defi- niert gehalten werden, so daß das Licht der Lichtquelle für das Anregungslicht im richtigen Winkel auf die Fläche trifft und in den Lichtwellenleiter eingekoppelt werden kann. Wird ein Lichtwellenleiter mit einem Durchmesser von ca. 1 mm verwendet, können re- lativ große Abstriche an die Positionsgenauigkeit gemacht werden, ohne daß die jeweiligen Meßergebnisse negativ beeinflußt werden.
Das bereits erwähnte Ventil am Zufluß in den Zylinder verhindert, daß die im Zylinder aufgenommene Probenflüssigkeit unerwünscht wieder entweichen kann und die gesamte Menge für die Messung ausgenutzt werden kann, insbesondere ist dieses wichtig, wenn der Zylinder zum Durchströmen der Meßkammer bewegt wird. Während des Durchströmens der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer und Anbinden der markierten chemisch- oder biochemischen Komponente an den an der Lichtwellenleiteroberfläche immobilisierten Partner des Re- zeptor-Ligand-Systems , wird das mittels der bereits erwähnten Lichtquelle angeregte Fluoreszenzlicht, das aus der Stirnfläche des Lichtwellenleiter ausgekoppelt wird, mit dem bereits erwähnten optischen Detektor erfaßt und dessen Intensität gemessen. Der hier- für zu verwendende optische Aufbau soll später weiter spezifiziert werden.
Eine andere verbesserte Möglichkeit für das Vorbeiführen der, wie beschrieben, vorinkubierten Proben- flüssigkeit am Lichtwellenleiter durch die Meßkammer kann aber auch so erfolgen, daß in der Probensammelkammer ein für Flüssigkeit stark aussaugendes Material, wie z.B. Vließ aufgenommen ist. Dieses Material ragt bis in die Meßkammer hinein und die vorinkubier- te Probenflüssigkeit kann aus dem Zylinder nach Öffnung des Verschlusses , der in der Fläche vorhandenen Öffnung, durch Kapillarkraft in die Meßkammer gelangen und wird weiter durch Kapillarkräfte in dem flüssigkeitsaufsaugenden Material solange durch die Meß- kammer geführt, bis die Probensammelkammer gefüllt ist. Diese führt zu einem stabileren Flüssigkeitstransport.
Auch hier erfolgt die Messung der Fluoreszenzintensi- tat in dem Zeitraum, in dem die Probenflüssigkeit am Lichtwellenleiter entlang durch die Meßkammer strömt. Wird eine so ausgebildete Vorrichtung verwendet, kann auf das bereits erwähnte Ventil am Zufluß in den Zylinder verzichtet werden, so daß als Zylinder bei- spielsweise ein herkömmlicher Spritzengrundkörper verwendet werden kann, der kostengünstig erhältlich ist.
Bei Anbindung an eine biochemisch sensibilisierte Oberfläche müssen in einem strömenden System, zwei unterschiedliche Effekte, nämlich Konvektion und Diffusion, berücksichtigt werden.
Aus der Hydrodynamik ist es bekannt, daß ausgehend von laminaren Strömungen, die Strömungsgeschwindigkeit eines Fluides in einem Rohr oder einem kanalartigen Gebilde, wie dies die erfindungsgemäß ausgebildete Meßkammer ist, variabel mit dem Abstand von der Wandung ist. Dabei liegt die Strömungsgeschwindigkeit direkt an der Wandung bei 0 und steigt mit größer werdendem Abstand zur Wandung an.
Diese Tatsache berücksichtigend, lassen sich zwei Schichten in einer solchen laminaren oder quasilami- naren Strömung, wie sie bei der erfindungsgemäßen
Vorrichtung mit Sicherheit auftritt, definieren. Dies ist einmal eine hydrodynamische Schicht in einem bestimmten Abstand von der Wandung, und zweitens eine diffusive Schicht, wobei die jeweiligen Abstände der Schichten von der Wandung, von der Viskosität und der Strömungsgeschwindigkeit des Fluides abhängig sind.
Oberhalb der diffusiven Schicht, also mit einem größeren Abstand von der Wandung, werden die chemischen und biochemischen Komponenten durch Konvektion an die Oberfläche herangeführt und innerhalb der diffusiven Schicht, d.h. in Richtung zur Wandung, erfolgt die Bewegung dann über Diffusionsprozesse. Der Massentransport durch Konvektion ist wesentlich größer, als der, der durch Diffusion erreicht werden kann. Dies bedeutet für die relativ schnelle Antigen-Antikörper- reaktion, daß durch den relativ langsam ablaufenden Diffusionsprozeß der Reaktionsprozeß stark verlangsamt wird und dies kann dazu führen, daß für einen Immuntest beispielsweise eine Zeit von ca. 1 h benötigt wird, um ein ausreichend genaues Meßergebnis zu ermitteln.
Bei einem diffusiven Stofftransport tritt mit hoher Wahrscheinlichkeit noch eine Rückbindung von bereits gebundenen chemischen- oder biochemischen Komponenten auf , der genauso , wie die Tatsache , daß im Inneren der Strömung die Stoffkonzentration höher als im Bereich der diffusiven Schicht ist, das Meßergebnis verfälscht.
Durch Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit des Fluides kann die Dicke der diffusiven Schicht verringert werden und so der Einfluß des konvektiven Stofftrans- portes an die Wandung, an der die chemischen- oder biochemischen Komponenten angebunden werden sollen, vergrößert wird. Dadurch wird das Ansprechverhalten des Immuntests stark verbessert und demzufolge die erforderliche Meßzeit verringert.
Alternativ zur Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit kann aber auch bei nicht erhöhter Strömungsgeschwindigkeit die Dicke des kanalartigen Durchflusses verkleinert werden, um die Ausdehnung der diffusiven Schicht zu verringern, wie dies bei der erfindungsgemäßen Anordnung aus Meßkammer und Lichtwellenleiter vorteilhaft ausgelegt werden kann. Dabei wird der Abstand zwischen Lichtwellenleiteroberfläche und innerer Mantelfläche der Meßkammer möglichst klein ge- halten. Vorteilhaft ist ein Abstand kleiner 2 mm, bevorzugt zwischen 0,1 - 0,05 mm, einzuhalten.
Eine so ausgebildete erfindungsgemäße Vorrichtung, wie sie in den verschiedenen Ausführungen beschrieben worden ist, kann preiswert als Massenprodukt hergestellt und vorab mit entsprechenden Biokomponenten beschichtet vorbereitet werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß ein Kontakt der jeweiligen Probenflüssigkeit mit einer Person vermieden wird und diese auch nach Durchführung des Tests sicher verschlossen gehalten ist, was bei medizinischer Anwendung besonders vorteilhaft ist.
Für die Messung der Fluoreszenzintensität ist es gün- stig, im Strahlengang des aus dem Lichtwellenleiter ausgekoppelten Lichtes, eine Linse und ein für das ausgekoppelte Fluoreszenzlicht durchlässiges optisches Filter vor dem optischen Detektor anzuordnen, wobei das Anregungslicht vom optischen Filter gesperrt wird. Von der Linse ausgehend soll das ausgekoppelte Licht parallel durch das jeweilige Filter in Richtung auf den optischen Detektor gerichtet werden.
Um einen möglichst großen Anteil des ausgekoppelten
Lichtes auf den Detektor zu bekommen, muß eine solche Linse entsprechend groß dimensioniert sein.
Da es aber nachteilig ist, das Anregungslicht der Lichtquelle durch die Linse in den Lichtwellenleiter einzukoppeln, ist es günstig, in der Linse eine Aussparung vorzusehen, durch die der Anregungslicht- strahl der Lichtquelle ohne Beeinflussung der Linse in den Lichtwellenleiter eingekoppelt wird. Die so erreichbaren besseren Einkoppelverhältnisse in den Lichtwellenleiter rechtfertigen den geringen Verlust an ausgekoppeltem Licht, der infolge der in der Linse ausgebildeten Aussparung auftritt.
Der optische Teil der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann weiter verbessert werden, in dem eine zusätzliche zweite Linse im Nachgang zu dem bereits erwähnten optischen Filter im Strahlengang des ausgekoppelten Lichtes angeordnet wird, mit der nunmehr das durch das Filter geführte Fluoreszenzlicht auf den Detektor fokussiert wird. Dabei müssen die optischen Parameter und der Abstand der Linse zum Detektor entsprechend gewählt bzw. eingestellt werden, so daß das Abbild des aus dem Lichtwellenleiter ausgekoppelten Fluores- zenzlichtes auf dem optischen Detektor abgebildet wird.
Möglich ist aber auch, nur mit einer Linse und einem Filter vor dem Detektor das Licht auf den Detektor zu fokussieren. Diese Anordnung hat dann aber eine geringe Lichtstärke.
Eine besonders günstige Weiterbildung der Erfindung ergibt sich mit der Verwendung von zwei verschiedenen Lichtquellen mit unterschiedlicher Wellenlänge zur
Anregung verschiedener Markierungsstoffe , so daß entweder zwei verschiedene Analyte parallel gemessen werden können oder einer der Analyten als Referenz- analyt dient und so die Sicherheit des Testergebnis- ses stark erhöht werden kann, so daß die Forderung nach internen Qualitätskontrollen erfüllt werden kann.
Werden zwei verschiedene Lichtquellen verwendet, sind selbstverständlich auch zwei verschiedene optische Filter für das jeweilige Fluoreszenzlicht erforderlich. Diese sollten vorteilhaft so angeordnet und manipulierbar sein, daß sie alternierend in den Strahlengang des ausgekoppelten Lichtes bewegt werden können, so daß sich dort immer nur jeweils eines der beiden Filter für das jeweilige Fluoreszenzlicht befindet.
Da die beiden Lichtquellen nicht an einem gleichen Ort angeordnet sein können, ist für die zweite Lichtquelle, in der ersten Linse eine zusätzliche Aussparung entsprechend anzuordnen, so daß auch deren Licht direkt auf die Einkoppelfläche des Lichtwellenleiters trifft.
Vorteilhaft ist es beim Einbringen des entsprechenden Filters in den Strahlengang des Fluoreszenzlichtes parallel dazu den Strahlengang der jeweils anderen Anregungsquelle zu unterbrechen, so daß kein Licht dieser Quelle in den Lichtwellenleiter gelangt.
Eine weiterhin vorteilhafte Weiterbildung der Erfindung ist es, vor dem Detektor eine Blende anzuordnen, deren Öffnung zeitlich variabel durch Translation und/oder Rotation der Blende in den Strahlengang vor dem Detektor positioniert werden kann. Bei der Verwendung eines segmentierten Lichtwellenleiters kann mit dieser Anordnung jedes einzelne Segment des Lichtwellenleiters vermessen werden. Günstig ist auch anstelle eines Detektors eine lineare oder flächenhafte Anordnung von Detektoren z.B. eine CCD-Kamera zu verwenden, um die einzelnen Segmente des Lichtwellenleiters zu vermessen.
Nachfolgend soll die Erfindung an Ausführungsbeispie- len näher beschrieben werden.
Dabei zeigen:
Figur 1 einen Lichtwellenleiter in mehreren Ansichten für eine erfindungsgemäße Vorrichtung; Figur 2 eine erfindungsgemäße Vorrichtung in einer
Schnittdarstellung; Figur 3 ein Beispiel eines Kolbens für eine erfin- dungsgemäße Vorrichtung;
Figur 4 ein weiteres Beispiels eines Kolbens für eine erfindungsgemäße Vorrichtung; Figur 5 ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem zusätzlichen Ventil in verschiedenen Betriebsstellungen und
Figur 6 ein Beispiel für den optischen Teil einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
In der Figur 1 ist ein in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zu verwendender Lichtwellenleiter 1 in verschiedenen Ansichten dargestellt. Der Lichtwellenleiter 1 hat an einer seiner beiden Stirnseiten ein Lichtabsorber 5 aus einem dunklen, vorzugsweise schwarzen Kunststoffmaterial , der einen sehr großen Teil des einfallenden Lichtes absorbiert. Wie außerdem in Figur 1 erkennbar, hat der Lichtabsorber 5 Ansätze, die eine Führung und Fixierung bei Einführung des Lichtwellenleiters 1 in eine nachfolgend noch näher zu beschreibende Meßkammer 9 ermöglichen. Möglich ist auch einen oder mehrere solcher Ansätze am Lichtwellenleiter 1 anzubringen.
Weiterhin ist in Figur 1 eine mögliche Art der Aufteilung des Lichtwellenleiters 1 in mehrere lichtwel- lenführende Segmente 27 dargestellt. Die einzelnen Segmente 27 sind dabei durch eine dünne Schicht 28, deren Brechungsindex n2 kleiner ist, als der der lichtwellenführenden Segmente nj voneinander getrennt. Die Seitenansicht in Figur 1 verdeutlicht noch einmal die dargestellte mögliche Art der Unterteilung des Lichtwellenleiters 1.
An der anderen Stirnfläche des Lichtwellenleiters 1 ist eine Fläche 2 ausgebildet, deren Durchmesser we- sentlich größer als der des Lichtwellenleiters 1 ist und eine Seite, eines ebenfalls nachfolgend noch näher zu beschreibenden Kolbens 6, in Richtung zur Umgebung abschließt. In der Fläche 2 ist in einem zum Lichtwellenleiter 1 radial äußeren Bereich eine Öff- nung 3 vorhanden, die temporär mit einem Verschluß 4, verschlossen ist. Ein solcher Verschluß kann beispielsweise eine abzieh- oder durchstechbare Folie sein.
Die in Figur 1 dargestellte Seitenansicht macht außerdem den Bereich der Fläche 2 deutlich, auf den das Licht zur Anregung der Fluoreszenz zu richten ist.
Der so vervollständigte Lichtwellenleiter 1 kann in eine Meßkammer 9 eines Kolbens 6 eingeführt und mit dem Kolben an der Fläche 2 verklebt werden, wie dies in Figur 2 erkennbar ist.
Dabei ist auf der Oberfläche des Lichtwellenleiters 1 bereits eine chemische oder biochemische Komponente immobi1isiert.
Im Kolben 6 ist außerdem mindestens eine Probensammelkammer 10 ausgebildet, die mit der Meßkammer 9 verbunden ist, wobei die Probensammelkammer 10 ring- förmig um die Meßkammer 9 ausgebildet sein kann. Die Probensammelkammer 10 sollte so dimensioniert sein, daß sie das gesamte oder einen großen Teil des Probenflüssigkeitsvolumens aufnehmen kann. Im Kolben 6 ist ein Zufluß 8 , der eine Verbindung zwischen der Meßkammer 9 und dem Inneren des Zylinders 7 darstellt, in dem der Kolben 6 mit dem Lichtwellenleiter 1 eingeführt worden ist, vorhanden. Der Zylinder 7 verfügt über einen weiteren Zufluß 11, durch den Pro- benflüssigkeit in das Innere des Zylinders 7 gelangen kann.
Wird nunmehr der Kolben 6 bewegt, so daß sich der freie Innenraum im Zylinder vergrößert, kann Proben- flüssigkeit durch den Zufluß 11 in das Innere des
Zylinders 7 gelangen, wie dies auch bei herkömmlichen Spritzen oder anderen Kolben-Zylinderanordnungen der Fall ist. Da die Öffnung 3 in der Fläche 2 mit dem Verschluß 4 geschlossen ist, kann keine Probenflüs- sigkeit durch den Zufluß 8 in die Meßkammer 9 gelangen. Erst in dem Moment, in dem die Öffnung 3 zumindest teilweise freigegeben wird, kann die in der Probensammelkammer 10 und der Meßkammer 9 enthaltene Luft entweichen und durch die Probenflüssigkeit ver- drängt werden, die nun durch den Zufluß 8, die Meßkammer 9 in die Probensammelkammer 10 gelangen kann. Dabei wird bevorzugt der Zylinder 7, bei fixiertem Kolben 6 bewegt, so daß sich das freie Volumen im Inneren des Zylinders 7 verkleinert und bei definier- ter Geschwindigkeit dieser Bewegung auch die entsprechende Strömungsgeschwindigkeit der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer 9 definiert eingestellt werden kann. Dabei sollte das Ausströmen der Probenflüssigkeit durch den Zufluß 11 mit Hilfe eines, im weiteren noch zu erklärenden, Ventils 15 verhinert werden. Wenn die Probensammelkammer 10 ein entsprechend großes Volumen besitzt, kann auf die Öffnung 3 in der Fläche verzichtet werden. Beim Bewegen des Zylinders 7 wird durch die Probenflüssigkeit die Luft in der Meßkammer 9 verdrängt und in der geschlossenen Probensammelkammer 10 komprimiert, so daß ein Durchströmen der Meßkammer 9 mit der Probenflüssigkeit, je nach Bewegungsrichtung des Zylinders 7 erreicht wird. Aber auch ohne Bewegung des Zylinders 7 und ohne Ven- til 15 kann ein Probenfluß allein durch Kapillarkräfte in die Meßkammer 9 und von dort in die Probensammelkammer 10 erfolgen, wenn der Verschluß 4 entfernt oder durchstochen wurde.
In der Figur 3 ist ein weiteres Beispiel eines Kolbens 6 , für eine erfindungsgemäße Vorrichtung gezeigt. Dabei sind in dieser Darstellung auch die Kolbendichtung 13 deutlich erkennbar.
Bei diesem Beispiel ist die Probensammelkammer 10 mit einem für die Probenflüssigkeit besonders saugfähigen Material 12 ausgefüllt, wobei in dieser Darstellung nicht eindeutig erkennbar ist, daß ein Teil des saugenden Materials 12 zumindest teilweise in die Meß- kammer 9 hineinragen kann.
Mit einer solchen Ausführung kann der Flüssigkeitstransport der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer durch Kapillarkraftwirkung des saugenden Materials unterstützt werden, wobei auch hier die Probenflüssigkeit zuerst durch die Meßkammer 9 strömt, wenn die Öffnung 3 in der Fläche 2 zumindest teilweise freigegeben ist, und ein Luftaustritt dadurch möglich wird und der Zufluß 11 offen ist. In der Figur 4 ist dargestellt, daß im Zufluß 8 des Kolbens 6 ein Filter oder eine Immunsäule 14 angeordnet sein kann, durch die die Probenflüssigkeit vor dem eigentlichen Eintritt in die Meßkammer 9 geführt werden muß. Es ist auch möglich, daß ein Filter oder eine Membran den Zufluß 8 auf der Kolbenfläche 23 abdeckt.
In der Figur 5 ist die Anordnung und Funktion eines Ventiles 15, das den Zufluß 11 in das Innere des Zylinders 7 sperrt bzw. frei gibt, dargestellt. Bei diesem Beispiel wird ein einfaches Klappenventil, mit Rückschlagwirkung eingesetzt, das im Inneren des Zylinders 7 im Bereich des Zuflusses 11 angeordnet ist.
Wird nunmehr der Kolben 6 , wie dies mit dem rechten Pfeil deutlich gemacht ist, bewegt, kann Probenflüssigkeit durch den Zufluß 11 und das geöffnete Ventil 15 in das Innere des Zylinders 7 gelangen.
Wird die Bewegung des Kolbens 6 beendet, schließt das Ventil 15 und verhindert so, daß Probenflüssigkeit in unerwünschter Weise aus dem Inneren des Zylinders 7 über den Zufluß 11 austreten kann.
In dieser Stellung ist außerdem erkennbar, daß der Verschluß 4 an der Öffnung 3 durchstoßen ist und demzufolge die Probenflüssigkeit über den Zufluß 8 in die Meßkammer 9 gelangen kann, wenn dies, wie mit den beiden Pfeilen an der unteren Abbildung der Figur 5 angedeutet, der Zylinder 7 bewegt wird, so daß sich der freie Innenraum im Zylinder 7 verkleinert und die Probenflüssigkeit durch den Zufluß 8 gedrückt wird.
Ausgehend von der unteren Darstellung in Figur 5 durchströmt nunmehr die Probenflüssigkeit die Meßkammer 9 und gleichzeitig wird die jeweilige Fluoreszenzmessung durchgeführt, wobei der entsprechende optische Aufbau in der Figur 6 erkennbar ist.
Bei dem dort gezeigten Beispiel werden zwei Laserdioden 16 und 17 als Lichtquellen verwendet, um entweder parallel zwei verschiedene Analyten zu bestimmen oder zusätzlich eine Referenzmessung durchzuführen.
Dabei richtet die Laserdiode 16 Licht auf die Einkoppelfläche des Lichtwellenleiters 1, in einem festen Winkel , so daß das Licht zur Fluoreszenzanregung unter einen definierten Winkel in den Lichtwellenleiter 1 eingekoppelt und geführt wird.
Bei diesem Beispiel wurde eine Laserdiode 16 verwendet, die Licht mit einer Wellenlänge aussendet, mit der Fluoreszenz beim Fluorophor Cy5 angeregt werden kann.
Das aus dem Lichtwellenleiter 1 ausgekoppelte Licht, das zu einem kleinen Teil aus Fluoreszenzlicht und einem wesentlich größeren Teil aus rückgestreutem An- regungslicht besteht, gelangt divergent auf die Linse 18 und wird mit Hilfe der Linse 18 als paralleles oder annähernd paralleles Strahlenbündel durch den optischen Filter 19 in Richtung auf den optischen Detektor 22, zur Messung der jeweiligen Fluoreszenz- intensität gerichtet. Der Detektor 22 kann dabei eine Photodiode, eine Photoavalangediode oder ein Photomultipler sein.
Dabei befindet sich im Strahlengang vor dem Detektor ein Filter 19, das für das Fluoreszenzlicht des Fluo- rophors durchlässig ist und die Anteile an Anregungsund Streulicht nicht durchläßt.
Die Linse 18 ist, wie dies ebenfalls in der Figur 6 erkennbar ist, mit zwei schlitzförmigen Aussparungen versehen, durch die das Anregungslicht der Laserdioden 16 und 17 direkt auf die Einkoppelfläche des Lichtwellenleiters 1 gerichtet werden kann, ohne daß eine Brechung bzw. Ablenkung des Lichtes durch die Linse 18 erfolgt.
Die Laserdiode 17 sendet Licht mit einer Wellenlänge aus, mit der der Fluorophor Cy7 angeregt werden kann.
Da der erfaßbare Anteil an Fluoreszenzlicht, der letzlich auf den Detektor 22 gelangen kann, relativ klein ist, ist es günstig, den bereits erwähnten Filter 19 und einen zweiten Filter 20, der für Fluoreszenzlicht des Fluorophors Cy7 durchlässig ist, alter- nierend in den Strahlengang vor den Detektor zu bewegen, demzufolge muß selbstverständlich auch die jeweilige Messung alternierend erfolgen und eine Synchronisation der Meßsignale des Detektors 22 mit der Bewegung der beiden Filter 19 und 20 durchgeführt werden.
In der Figur 6 ist außerdem dargestellt, daß eine zusätzliche Linse 21, zur Bündelung des Fluoreszenzlichtes auf den Detektor 22 in den Strahlengang des aus dem Lichtwellenleiter 1 ausgekoppelten Lichtes, im Nachgang zu den Filtern 19 oder 20 angeordnet ist.
Bei diesem Beispiel sind die beiden Laserdioden 16 und 17 diametral gegenüber angeordnet, sie können jedoch auch in einem anderen nahezu beliebigen Winkel zueinander angeordnet werden.
Dabei muß jedoch der Auftreffwinkel des jeweiligen Lichtstrahles der Laserdioden 16 und 17 eingehalten werden, die unterschiedlich sein können, um eine nahezu optimale Einkopplung des jeweiligen Anregungslichtes in den Lichtwellenleiter 1 zu sichern.
Wie aus Figur 6 ersichtlich, wird beim Bewegen der Filter 19 und/oder 20 auch vorteilhaft der Strahlengang der jeweils nicht benötigten Lichtquelle unterbrochen. So wird z.B. die Laserdiode 16 und der Filter 19 zusammen betrieben, während das Licht der Laserdiode 17 nicht in den Lichtwellenleiter 1 gelangen kann, da der Strahlengang durch den Filter 20 unterbrochen wurde. Die Filter 19 und 20 sollten daher beide so gewählt werden, daß diese für Licht der Laserdioden 16 und 17 undurchlässig sind.
Alternativ zu den Schlitzen in der Linse 18, kann der Durchmesser der Linse 18 verkleinert werden, so daß die Lichtstrahlen der Laserdioden 16 und 17 nicht durch die Linse 18 beeinflußt werden unter Beibehaltung aller eingestellten Winkel.
Außerdem ist in Figur 6 noch die Anordnung zweier optischer Filter 24 und 25 erkennbar, die direkt hinter den Laserdioden 16 und 17 in deren Strahlengang angeordnet sind und durch die das jeweilige Anre- gungslicht entsprechend ihrer Auslegung gefiltert wird.
Um das Licht für die Anregung der Fluoreszenz unter einem festen und definierten Winkel auf die Einkop- pelflache des Lichtwellenleiters 1 zu richten, werden die Laserdioden 16 und 17 als eine Einheit mit einer entsprechenden Optik verwendet, die die Lichtstrahlrichtung entsprechend parallel ausrichtet.
Bei der Verwendung eines segmentierten Lichtwellenleiters 1 können die einzelnen Segmente 27 dadurch vermessen werden, daß sich im Strahlengang vor dem Detektor 22 eine bewegliche Blende 26 befindet. Die Öffnung der Blende 26 wird durch Translation und/oder Rotation der Blende 26 so im Strahlengang positioniert, daß nur Fluoreszenzlicht aus einem Segment 27 des Lichtwellenleiters 1 auf den Detektor 22 gelangt. Da die Blende 26 beweglich ist, können zeitlich nacheinander durch Translation und/oder Rotation der Blende 26 das Fluoreszenzliucht aus den einzelnen Segmenten 27 mit dem Detektor 22 vermessen werden. Vorteilhaft ist auch die Verwendung eines Detektors 22, der aus einer linearen oder flächenhaften Anorn- dung von lichtempfindlichen Detektoren besteht. Damit kann quasi gleichzeitig das Fluoreszenzlicht aus allen Segmenten 27 des Lichtwellenleiters 1 vermessen werden.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests, bei der Licht mindestens einer Lichtquelle (16,17) über eine Fläche, an einem Ende eines Lichtwellenleiters (1) eingekoppelt wird und mit dem im Lichtwellenleiter (1) eingekop- pelten Licht durch Evanescentfeldanregung an der
Oberfläche des Lichtwellenleiters (1) Fluoreszenz von mindestens einem an einen chemischen oder biochemischen Partner eines allgemeinen Rezeptor-Ligand-Systems gebundenen Markierungs- Stoffes angeregt und das Fluoreszenzlicht zum
Teil in den Lichtwellenleiter (1) eingekoppelt und aus dem Lichtwellenleiter (1) aus der Fläche in die das Licht eingekoppelt wurde , ausgekoppelt wird und über eine Optik auf einen opti- sehen Detektor (22) gerichtet ist, mit dem die
Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen wird, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß der Lichtwellenleiter (1) in einer in einem Kolben (6) einer Kolben-Zylindereinheit ausge- bildeten Meßkamraer (9) aufgenommen und die Meßkammer (9) über einen im Kolben (6) ausgebildeten Zufluß (8) mit dem Innenraum des Zylinders (7) verbunden ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtwellenleiter (1) parallel zur Lichtausbreitungsrichtung im Lichtwellenleiter (1) mittels mindestens einer Schicht (28), deren Brechungsindex n2 kleiner als der Brechungsindex n,^ des Lichtwellenleitermaterials ist, in mindestens zwei Lichtwellen führende Segmente (27) unterteilt ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen der inneren Mantelfläche der Meßkammer (9) und der Oberfläche des Lichtwellenleiters (1) kleiner als 2 mm ist.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß im Kolben (6) eine mit der Meßkammer (9) verbundene Probensammelkammer (10) ausgebildet ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, daß an der Fläche des Lichtwellenleiters (1), zur Licht Ein- und Auskopplung in dem Lichtleiter, eine den Kolben (6) verschließende Fläche (2) und am anderen Ende des Lichtwellenleiters (1) ein Lichtabsorber (5) angeordnet ist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet, daß am Lichtabsorber (5) und/oder am Lichtwellenleiter (1) mindestens ein
Führungsansatz ausgebildet ist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, daß in der Fläche (2) eine verschließbare Öffnung (3) vorhanden ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, daß am Zylinder (7) eine Zuflußöffnung (11) vorhanden ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zuflußöffnung (11) mit einem Ventil (15) verschließbar ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in der Probensammelkammer (10) ein Flüssigkeit aufsaugendes Material (12) aufgenommen ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß im oder vor dem Zufluß (8) zur Meßkammer (9) ein Filter und/oder eine Membran und/oder eine Immunsäule (14) angeordnet ist/sind.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang des aus dem Lichtwellenleiter (1) ausgekoppelten Lichtes eine Linse (18) und mindestens ein für das Fluoreszenzlicht durchlässiges optisches
Filter (19) vor dem optischen Detektor (22) angeordnet sind.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Linse (18) mindestens eine Aussparung aufweist, durch die das Licht der Lichtquelle (16) auf den Lichtwellenleiter (1) gerichtet ist.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite Lichtquelle (17) und ein zweites optisches Filter (20) mit dem ersten optischen Filter (19) alternierend in den Strahlengang des aus dem Licht- Wellenleiter (1) ausgekoppelten Lichtes bewegbar ist und die zweite Lichtquelle (17) Licht einer Wellenlänge zur Anregung von Fluoreszenz eines zweiten Markierungsstoffes sendet.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem/den optisch(en) Filter(n) (19, 20) und dem Detektor (22) eine zweite Linse (21) angeordnet ist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Filter (19) und/oder (20) für Licht beider Lichtquellen (16) und (17) undurchlässig sind.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang vor dem Detektor (22) eine bewegliche Blende (26) angeordnet ist, deren Öffnung im Strahlengang zeitlich veränderlich durch translatorische und- /oder rotatorische Bewegung positionierbar ist.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, der Detektor (22) eine lineare oder flächenhafte Anordnung mehrerer lichtempfindlicher Detektoren ist.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang zwischen den Lichtquellen (16, 17) und der Fläche (2) optische Filter (24, 25) angeordnet sind.
20. Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtwellenlei- ter (1) mit einer chemischen oder biochemischen Komponente beschichtet und in die Meßkammer (9) eingeführt wird;
Probenflüssigkeit durch die Meßkammer (9) ent- lang der Oberfläche des Lichtwellenleiters (1) geleitet wird, bei gleichzeitiger Fluoreszenzanregung mit in den Lichtwellenleiter (1) eingekoppeltem Licht einer Lichtquelle (16, 17) und das aus dem Lichtwellenleiter (1) ausgekoppelte Fluoreszenzlicht auf einen die Intensität des
Fluoreszenzlichtes messenden optischen Detektor (22) gerichtet wird, so daß beim Durchströmen der Probenflüεsigkeit das Anbinden des markierten Partners der biochemischen oder chemischen Komponente, auf der Oberfläche des
Lichtwellenleiters (1), zeitaufgelöst gemessen wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Kolbenstirnflache (23) und/oder die innere Oberfläche des Zylinders (7) und/oder die Oberfläche der Zuflußöffnung (11) vor der Durchführung des Fluoreszenzimmuntests mit einer chemischen oder bioche- mischen Komponente belegt wird.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß zum Durchströmen der Probenflüssigkeit durch die Meßkammer (9) die Öffnung (3) zumindest teilweise freigegeben wird.
23. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß bei verschlossener Zuflußöffnung am Zylinder (7), verschlossener Öffnung ( 3 ) oder einer Fläche ( 2 ) ohne eine Öffnung (3), fixiertem Kolben (6) und fixierter Fläche (2) mit Lichtwellenleiter (1), der Zylinder (7) translatorisch parallel zur Zylinderman- telflache hin und her bewegt wird, so daß die
Probenflüssigkeit entsprechend der Bewegungsrichtung des Zylinders (7) durch die Meßkammer ( 9) strömt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß mit zwei Lichtquellen (16, 17) Licht zur Anregung von Fluoreszenz zweier verschiedener Markierungsstoffe in den Lichtwellenleiter 81) eingekoppelt und das aus- gekoppelte Fluoreszenzlicht alternierend, durch entsprechende Bewegung von zwei Filtern (19, 20) im Strahlengang des ausgekoppelten Lichtes , gemessen wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter Analyt in der Probenflüssigkeit bestimmt oder eine Referenzmessung durchgeführt wird.
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