EP1066403A1

EP1066403A1 - Verfahren zum nachweis von mikroorganismen in gasen

Info

Publication number: EP1066403A1
Application number: EP99917928A
Authority: EP
Inventors: Elmar Herbig; Dieter Nussbaumer; Khuong To Vinh
Original assignee: Sartorius AG
Current assignee: Sartorius AG
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2001-01-10
Also published as: US6562583B1; JP2002510501A; DE19814715A1; WO1999051765A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Mikroorganismen in Gasen, insbesondere Luft und Gelatinemembranfilter zur Durchführung des Verfahrens, die sich durch eine besondere Reinheit auszeichnen. Dazu wird das Gas zur Sammlung der Mikroorganismen durch ein von Partikeln mit einem Durchmesser grösser 0,45 νm, vorzugsweise 0,1 νm freies Gelatinemembranfilter geströmt, der Gelatinemembranfilter mit den gesammelten Mikroorganismen in einer wässrigen Lösung, die ein mit den Mikroorganismen Fluoreszenz hervorrufendes enzymatisches Markierungsmittel enthält, aufgelöst, die erhaltene Lösung mit den Mikroorganismen durch eine Analysenmembran einer Porengrösse im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 0,45 νm filtriert und die auf der Analysenmembran verbleibenden fluoreszierenden Mikroorganismen ausgezählt. Der Erfindungsgegenstand ist in der pharmazeutischen, biotechnologischen und Lebensmittelindustrie, im Umweltschutz, in der Abfallwirtschaft und in medizinischen Einrichtungen zur Bestimmung der Keimzahlbelastung der Medien einsetzbar.

Description

VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON MIKROORGANISMEN IN GASEN

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gasen, insbesondere Luft und Gelatinemembranfilter zur Durchführung des Verfahrens, die sich durch eine besondere Reinheit auszeichnen

Das Verfahren ist zum Nachweis von Mikroorganismen aus gasförmigen Medien, insbesondere aus Luft, in der pharmazeutischen, biotechnologischen und Lebensmittelindustrie, im Umweltschutz, in der Abfallwirtschaft und in medizinischen Einrichtungen zur Bestimmung der Keimzahlbelastung der Medien einsetzbar Die erfindungsgemaßen Gelatinemembranfilter dienen beispielsweise in Kombination mit einem Luftkeimsammelgerat zur Sammlung von Bakterien, Sporen, Viren, Hefen und Pilzen (Mikroorganismen), um deren Konzentration in Räumen mittels des erfindungsgemaßen Verfahrens bestimmen zu können Derartige Überwachungen sind Voraussetzung für die rechtzeitige Einleitung von Maßnahmen, um Personen und Produkte vor Schädigungen durch zu hohe Mikroorganismenkonzentrationen zum Beispiel in der Raumluft zu bewahren

In bestimmten Räumen mit besonderen Anforderungen an die Beschaffenheit der Luft, wie m klimatisierten Räumen, Reinraumen und Isolatoren, wird die Luft regelmäßig auf ihren Keimgehalt hin untersucht Da es sich in der Regel um gefilterte Luft handelt, die naturgemäß einen geringen Gehalt an Mikroorganismen aufweist, müssen gewöhnlich große Volumina untersucht werden, um ausreichend Keime für aussagefahige Ergebnisse zu sammeln Dazu wird eine Luftprobe beispielsweise mittels eines Luftkeimsammelgerätes, wie es von der Firma Sartorius AG unter der Bezeichnung „MD8 airscan" vertrieben wird, durch ein geeignetes Filter filtriert Als Filter werden für diesen Zweck sterile Membranfilter mit Porengrößen im Mikrofiltrationsbereich vorwiegend auf der Basis von Gelatine eingesetzt, wie sie beispielsweise in der DE-PS 11 73 640 beschrieben sind

Besonders geeignet sind Gelatinemembranfilter, auf denen die zurückgehaltenen Mikroorganismen feucht und vermehrungsfähig gehalten werden sollen Gelatinemembranen, auf denen die gesammelten Mikroorganismen aufgrund eines Zusatzes osmoprotektiver Substanzen eine besonders hohe Lebensfähigkeit aufweisen, sind in der DE-PS 197 50 215 beschrieben Nach der Probenahme können die Gelatinemembranfilter entweder auf einem Agarnahrboden bebrütet werden, wobei aus den einzelnen gesammelten Keimaggregaten Mikroorganismenkolonien heranwachsen (das Gelatinemembranfilter verflüssigt sich und verschwindet und die Mikroorganismenkolonien können direkt auf dem Agar gezählt werden), oder in einer sterilen Losung, wie einer Pepton-Wasser- oder einer physiologischen Kochsalzlosung gelost werden, so daß Teilmengen auf verschiedenen Nahrmedien bebrütet werden können Allerdings stehen nach diesen Methoden die Analysenergebnisse erst relativ spat zur Verfügung, weil das Koloniewachstum in der Regel bis zu 7 Tagen in Anspruch nimmt Nach einem mit ChemScan bezeichneten schnellen mikrobiologischen Analyseverfahren (Schnelltestsystem für den Nachweis von Mikroorganismen) stehen die Ergebnisse dagegen bereits nach 30 bis 90 Minuten zur Verfügung, weil bei diesem Verfahren der einzelne Mikroorganismus detektiert wird und die sonst übliche zeitaufwendige Mikroorganismen- Vervielfachung im Brutschrank entfallt Dazu wird eine wassrige, die lebenden Mikroorganismen enthaltende Probe durch eine 0,22 μm oder 0,45 μm Analysenmembran filtriert, um die in der Probe enthaltenden Mikroorganismen auf der Analysenmembran zurückzuhalten Die Analysenmembran wird für 30 Minuten bei 30°C auf eine Absorptionsunterlage aufgelegt, die mit einer Markierungsflussigkeit getrankt ist Die Markierungsflussigkeit besitzt die Fähigkeit mit dem Zellcytoplasma lebender Mikroorganismen über eine enzymgesteuerte Reaktion unter gelblicher Fluorescenz in Wechselwirkung zu treten Schließlich kann unter einem Mikroskop, vorzugsweise mit einem Laser- Scan- System, jeder einzelne Mirkoorganismus auf der Analysenmembran erkannt werden Man sollte erwarten, daß zur Anwendung dieses schnellen mikrobiologischen Analyseverfahrens für den Nachweis von Mikroorgansismen in Gasen die Gelatinemembranfilter, auf denen die Mikroorganismen aus der Luft gesammelt wurden, lediglich durch Auflosen der Gelatinemembranfilter in einer wassngen Losung, wie zum Beispiel einer Pepton- Wasser-Losung, in eine Probe zu überführen ist und diese Probe wie vorstehend beschrieben zu analysieren ist Es hat sich aber gezeigt, daß man keine auswertbaren gelblich fluorescierenden Signale auf der Analysenmembran erkennt und die Analysenmembran durchgehend rot gefärbt ist

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Mikroorganismen und für dieses Verfahren geeignete Gelatinemembranfilter zur Sammlung dieser Mikroorganismen aus Gasen vorzuschlagen

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Mikroorganismen in Gasen gelost, bei dem a) das Gas zur Sammlung der Mikroorgansimen durch ein von Partikeln mit einem Durchmesser großer 0,45 μm, vorzugsweise 0, 1 μm freies Gelatinemembranfilter geströmt wird, b) der Gelatinemembranfilter mit den gesammelten Mikroorganismen in einer wassngen Losung, die ein mit den Mikroorganismen Fluorescenz hervorrufendes enzymatisches Markierungsmittel enthalt, aufgelost wird, c) die erhaltene Losung mit den Mikroorganismen durch eine Analysenmembran einer Porengroße im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 0,45 μm filtriert wird und d) die auf der Analysenmembran verbleibenden fluorescierenden Mikroorganismen ausgezahlt werden

Es wurde gefunden, daß Gelatinemembranfilter zur Durchführung des Verfahrens geeignet sind, die frei von Partikeln mit Großen sind, die durch Mikrofiltrationsmembranen mit einem Porendurchmesser von höchstens 0,45 μm, vorzugsweise von höchstens 0,2 μm zurückgehalten werden Das heißt, das derartige Gelatinemembranfilter frei von Mikroorganismen, einschließlich von toten Mikroorganismen sind Um die Lebensfähigkeit der auf den Gelatinemembranfiltern gesammelten lebenden Mikroorganismen deutlich zu erhohen, enthalten die Gelatinemembranfilter in einer bevorzugten Ausführungsform osmoprotektive Substanzen, beispielsweise Tπmethylammonioacetat (Betain)

Überraschenderweise wurde gefunden, daß es bereits ausreicht, eine von derartiken Partikeln befreite Gelatme als Ausgangsstoff für die Herstellung der Gelatinemembranfilter zu verwenden Vorteilhafterweise filtriert man dazu eine Losung handelsüblicher Gelatine durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer Porengroße von bis zu ungefähr 0,45 μm, vorzugsweise von bis zu ungefähr 0,2 μm und besonders vorzugsweise von bis zu 0, 1 μm Dabei hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die bereits formulierte Membranziehlosung unter Druck durch eine Mikrofiltrationsmembran der genannten Porengroße zu filtrieren Damit wird sichergestellt, daß in einem Arbeitsschritt aus jeder Komponente, aus der die Membranziehlosung hergestellt wurde, alle Partikel entfernt werden, die eine Große besitzen, daß sie von Mikrofiltrationsmembranen der genannten Porengroße zurückgehalten werden Die Druckfiltration ist deshalb zu bevorzugen, weil dabei im Vergleich zur Vakuumfiltration fluchtige Losungsmittel nicht abdampfen können und die quantitative Zusammensetzung der Membranziehlosung nicht verändert wird Als zur Filtration besonders geeignet hat sich eine hydrophile, vernetzte 0,2 μm Cellulosehydratmembran erwiesen, die unter dem Namen Hydrosart von der Sartonus AG, Gottingen auf dem Markt vertrieben wird (DE-PS 44 18 831) Eine nach dem ChemScan -Verfahren durchgeführte Analyse handelsüblicher Gelatine und Gelatinemembranfilter, die daraus direkt ohne den erfindungsgemaßen Filtrationsschπtt gefertigt und sterilisiert wurden, zeigte, daß ein Gramm derartiger Produkte zwischen ungefähr 10 000 und mehr als 1 000 000 toter Mikroorganismen enthalten kann Diese Menge an Mikroorganismen ist offensichtlich dafür verantwortlich, daß Gelatinemembranfilter selbst nach ihrer Steπ sierung m Schnelltestverfahren, bei denen Fluorescenz hervorrufende Markierungsmittel eingesetzt werden, wie in dem

ChemScan -Verfahren, nicht verwendet werden können Die bereits im Rohstoff vorhandenen, insbesondere toten Mikroorganismen verursachen offensichtlich eine Verfärbung der Analysenmembran und verhindern dadurch das Erkennen der Flurescenz von lebenden Mikroorganismen

In den erfindungsgemaß hergestellten Gelatinemembranfiltern konnte dagegen eine so weitgehende Reduktion der Mikroorganismen festgestellt werden, daß sie sich zur Sammlung von Mikroorganismen aus Gasen und zum Nachweis der gesammelten Mikroorganismen als geeignet erwiesen

Die erfindungsgemaßen Gelatinemembranfilter sind insbesondere für schnelle mikrobiologische Analyseverfahren zur direkten Bestimmung einzelner Mikroorganismen, insbesondere lebender Mikroorganismen geeignet, die mit Markierungsmitteln Fluorescenz-Signale zeigen Dazu wird das Gelatinemembranfilter, auf dem die Mikroorganismen aus Gasen gesammelt wurden, zur Auflosung in eine wassπge Losung gebracht, durch eine Analysenmembran mit Porengroßen im Bereich von etwa 0,2 bis höchstens 0,45 μm filtriert, um die auf dem Gelatinemembranfilter gesammelten Mikroorganismen auf der Analysenmembran zurückzuhalten Hierbei ist die Verwendung von Mikrosieb-Membranentypen, wie sie beispielsweise in der WO 95/13860 AI beschrieben werden, insbesondere Kernspurmembranen mit Porengroßen von etwa 0,2 μm bevorzugt Die Verwendung derartiger Analysenmembranen ist deshalb von Vorteil, weil sie sich durch eine enge Porengroßenverteilung und aufgrund des geraden Porenverlaufs quer zur Membranflache durch eine hohe Filtrationsgeschwindigkeit auszeichnen und weil Mikroorganismen vollständig auf der Oberflache dieser Membranen zurückbleiben und nicht wie bei herkömmlichen Mikrofiltrationsmembranen in die Porenstruktur eindringen können Die Analysenmembran wird für 30 Minuten bei 30° C auf eine Absorptionsunterlage aufgelegt, die für Mikroorganismen mit einer Fluorescenz hervorrufernden Markierungsflussigkeit getrankt ist In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Markierungsflussigkeit direkt der zur Auflosung des Gelatinemembranfilters dienenden wassngen Losung zugesetzt und nach einer auszutestenden Markierungszeit werden die markierten Mikroorganismen auf der Analysenmembran gesammelt Schließlich werden unter einem Mikroskop oder vorzugsweise mit einem Laser-Scan-System, die einzelnen auf der Analysenmembran fluorescierenden Mirkoorganismus quantitativ erfaßt Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemaßen Gelatinemembranfilter wird im Einzelnen wie folgt durchgeführt Es wird zunächst eine wassrige homogene Membranziehlosung mindestens bestehend aus Gelatine mit einem Anteil von 4,5 bis 5,6 % an der gesamten Membranziehlosung, aus Ethanol mit einem Anteil von 38 bis 46 % an der gesamten Membranziehlosung und wahlweise aus einem Bindemittel mit einem Gehalt von 0,02 bis 0,1 % an der gesamten Membranziehlosung hergestellt Als Bindemittel kann beispielsweise Polyvinylalkohol eingesetzt werden Die Membranziehlosung wird unter Druck durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer Porengröße von maximal 0,45 μ, vorzugsweise bis 0,2 μm filtriert Dann wird ein dunner Film aus der Membranziehlosung auf einer Unterlage ausgebreitet, und der dünne Film wird zur Ausbildung einer gelierten Phase Luft ausgesetzt Die gelierte Phase wird sodann zur Nachbehandlung in ein Fällbad eingebracht, welches aus Methylacetat besteht In einer bevorzugten Ausfuhrungsform enthalt die Membranziehlosung zusatzlich wenigstens eine osmoprotektive Substanz mit einem Anteil von 0,005 bis 0,75 % bezogen auf den Gehalt an Gelatine Als osmoprotektive Substanz kann beispielsweise Trimethylammonioacetat verwendet werden

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als erstes Verfestigungsbad Methylacetat mit einem Alkohol, insbesondere Methanol, mit einem Anteil von 10 bis 20 % am gesamten ersten Verfestigungsbad verwendet. Die Membran verbleibt in diesem ersten Verfestigungsbad über eine Zeitdauer von ein bis drei Stunden bei Raumtemperatur bevor sie in ein zweites Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat überfuhrt wird Trocknung und Sterilisierung, vorzugsweise mit Gammastrahlen, schließen sich an Die Erfindung wird anhand des nachstehenden Ausführungsbeispiels erläutert

Beispiel Zur Herstellung eines Gelatinemembranfilters werden 200 g handelsübliches Gelatinepulver und 2 g Polyvinylalkohol als Bindemittel (Mowiol Typ 18-88, Hoechst AG) unter einstundigem Ruhren bei 60° C in 2000 g Wasser gelost und anschließend mit 1645 g Ethanol und 0,02 g Tπmethylammonioacetat als osmoprotektiver Substanz gelost in 10 g Wasser versetzt Diese Membranziehlosung wird im Dead-End-Modus bei einer Druckdifferenz von 3 bar und einer Temperatur von etwa 40° C durch eine vernetzte Cellulosehydrat-Membran mit einer Porengroße von 0,2 μm filtriert Die filtrierte und auf 21° C temperierte Membranziehlosung wird zu einem Film der Starke 350 μm auf eine Unterlage ausgebreitet und Luft mit einer relativen Feuchte von etwa 45 % bei Raumtemperatur ungefähr 5 Minuten ausgesetzt Der gelierte Film wird zusammen mit der Unterlage in ein erstes Verfestigungsbad, daß aus Methylacetat mit einem Anteil von 14 % Methanol besteht, für die Dauer von 3 Stunden und danach in ein zweites Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat für die Dauer von 3 Stunden eingebracht Der Gelatinemembranfilter wird von der Unterlage abgezogen, getrocknet und mit Gammastrahlen sterilisiert

Der so erhaltene Gelatinemembranfilter weist einen Luftdurchfluß von 140 1/mιn cm² bar auf Ein nach diesem Beispiel hergestellter Gelatinemembranfilter, der 150 mg Gelatine enthalt, wurde in 50 ml Peptone-Wasser gelost und mit 100 μl Delvolase Enzym und Fluoreszenzfarbstoff versetzt Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten bei 37° C wurde die Losung über eine 0,4 μm Analysenmembran aus Cellulosenitrat filtriert und die Analysenmembran unter dem Mikroskop ausgewertet Es konnten keine Mikroorganismen gefunden werden

In einem Vergleichsversuch, der analog dem vorstehenden Beispiel durchgeführt wurde, allerdings mit dem Unterschied, daß auf die Filtration der Membranziehlosung verzichtet wurde, zeigte nach Behandlung mit dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Enzym eine durchgehend rot gefärbte Analysenmembran, was auf die Anwesenheit einer Vielzahl toter Mikroorganismen hindeutet

Die erfindungsgemaßen Gelatinemembranfilter zur Luftkeimsammlung stellen zusammen mit einem Schnelltestsystem zum Nachweis von Mikroorganismen, wie dem ChemScan -System eine extrem genaue Nachweismethode für sehr niedrige Keimzahlen dar, wodurch sie sich besonders für Quahtatskontrollfragen in der pharmazeutischen Industrie und Biotechnologie eignen Durch Erhalt der mikrobiologischen Analysenresultate in wenigen Minuten wird eine Just-in-time Produktion unterstutzt Es treten praktisch keine Wartezeiten bei der Freigabe von Produktionraumen auf, da mikrobiologische Verunreinigungen in sehr kurzer Zeit nachweisbar sind und nicht mehr wie bei herkömmlichen Methoden bis zu einer Woche Inkubationszeiten benotigt werden, um zum mikrobiologischen Befund zu gelangen Dadurch wird die Produktionssicherheit entscheidend erhöht

Claims

9Patentansprüche

1 Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gasen, bei dem a) das Gas zur Sammlung der Mikroorgansimen durch ein von Partikeln mit einem Durchmesser großer 0,45 μm, vorzugsweise 0, 1 μm freies Gelatinemembranfilter geströmt wird, b) der Gelatinemembranfilter mit den gesammelten Mikroorganismen in einer wassrigen Losung, die ein mit den Mikroorganismen Fluorescenz hervorrufendes enzymatisches Markierungsmittel enthalt, aufgelost wird, c) die erhaltene Losung mit den Mikroorganismen durch eine Analysenmembran einer Porengröße im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 0,45 μm filtriert wird und d) die auf der Analysenmembran verbleibenden fluorescierenden Mikroorganismen ausgezahlt werden

2 Gelatinemembranfilter zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 erhaltlich durch a) Filtrieren einer wassrigen homogenen Membranziehlosung, die mindestens aus Gelatine mit einem Anteil von 4,5 bis 5,6 % an der gesamten Membranziehlosung, aus Ethanol mit einem Anteil von 38 bis 46 % an der gesamten Membranziehlosung und wahlweise aus einem Bindemittel mit einem

Gehalt von 0,02 bis 0, 1 % an der gesamten Membranziehlosung besteht, durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer Porengroße von bis zu 0,45 μm, vorzugsweise von bis zu 0, 1 μm, b) Ausbreiten eines dünnen Films aus der Membranziehlosung auf einer Unterlage, c) Aussetzen des dünnen Films feuchter Luft zur Ausbildung einer gelierten Phase, d) Einbringen der gelierten Phase in ein Fallbad aus Methylacetat zur Verfestigung des Gelatinemembranfilters und e) Trocknen des Gelatinemembranfilters 10

3. Gelatinemembranfilter nach Anspruch 2 erhältlich durch Filtrieren der wassrigen homogenen Membranziehlosung, der zusätzlich osmoprotektiven Substanzen mit einem Anteil von 0,005 bis 0,75 % bezogen auf den Gehalt an Gelatine zugesetzt wurden.

4. Gelatinemembranfilter nach Anspruch 3, bei dem der Membranziehlosung als osmoprotektive Substanz Trimethylammonioacetat (Betain) zugesetzt wurde.

5. Gelatinemembranfilter nach Anspruch 2 erhältlich durch Einbringen der gelierten Phase in ein Fällbad, das aus einem ersten Verfestigungsbad aus Methylacetat mit einem Anteil von 10 bis 20% eines Alkohols, vorzugsweise Methanol und aus einem zweiten Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem als Analysenmembran ein Mikrosieb, vorzugsweise eine Kernspurmembran mit einer Porengröße im Bereich von etwa 0,45 bis etwa 0,2 μm verwendet wird.