EP1181312A1 - Zytotoxische t-zellepitope des papillomavirus l1-proteins und ihre verwendung in diagnostik und therapie - Google Patents
Zytotoxische t-zellepitope des papillomavirus l1-proteins und ihre verwendung in diagnostik und therapieInfo
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- EP1181312A1 EP1181312A1 EP00940295A EP00940295A EP1181312A1 EP 1181312 A1 EP1181312 A1 EP 1181312A1 EP 00940295 A EP00940295 A EP 00940295A EP 00940295 A EP00940295 A EP 00940295A EP 1181312 A1 EP1181312 A1 EP 1181312A1
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Papillomavirus T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI, und/oder eine funktionell aktive Variante davon, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.
Description
Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus Ll-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Papillomavirus T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL,
ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI, und/oder eine funktioneil aktive Variante davon, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.
Die Papillomviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelsträngige DNA-Viren mit einer Genomgröße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder- förmigen Kapsid mit einem Durchmesser von ca. 55 nra. Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humanpathogene Papillomavirustypen (HPV) bekannt, von denen einige, z.B. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z.B. HPV-6, HPV-1 1 oder HPV-42 gutartige Tumore verursachen können.
Das Genom der Papillomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Der erste Bereich betrifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und Replikation des Virus enthält. Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthält verschiedene Protein-kodierende Abschnitte E1-E7, von denen z.B. das E6- und das E7-Protein für die Transformation von Epithelzellen verantwortlich sind und das El -Protein die DNA-Kopienzahl kontrolliert. Bei der E6- und E7-Region handelt es sich um sogenannte Onkogene, die auch in bösartig
entarteten Zellen exprimiert werden. Die dritte Region, auch L-(Late)Region genannt, enthält zwei Protein-kodierende Abschnitte Ll und L2, die für Strukturkomponenten des Viruskapsids kodieren. Das Ll -Protein ist zu über 90% im vi- ralen Kapsid vorhanden, wobei das Verhältnis von L1 :L2 im allgemeinen 30: 1 ist. Unter dem Begriff Ll -Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung das Hauptkapsid Protein der Papillomaviren (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445).
In über 50% der Fälle wird HPV-16 mit Gebärmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) in Verbindung gebracht. HPV-16 ist der Hauptrisikofaktor für die Ausbildung von cervicalen Neoplasien. Das Immunsystem spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Krankheit. So sind vermutlich zelluläre Immunantworten und insbesondere Antigen-spezifische T-Lymphozyten wichtig für den Abwehrmechanismus. Es wurde weiterhin gefunden, daß in hochgradig malignen cervicalen intra- epithelialen Neoplasien (CIN II/III) und cervicalen Tumoren das E7-Gen konsti- tutiv in allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird. Daher wird vor allem das E7-Protein als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekül für aktivierte T-Zellen betrachtet (siehe z.B. WO 93/20844). Die E7-induzierte zelluläre Immunantwort im Patienten ist aber anscheinend nicht stark genug, um den Krankheitsverlauf zu beeinflussen. Die Immunantwort kann eventuell durch geeignete Impfstoffe verstärkt werden.
Es konnte gezeigt werden, daß die Expression des Ll-Gens bzw. die Coexpressi- on des Ll - und L2-Gens zur Bildung von Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden oder Virus-ähnliche Partikel (VLPs für virus-like particle) führen kann (siehe z.B. WO 93/02184, WO 94/20137 oder WO 94/05792). Unter Capsomeren versteht man eine oligomere Konfiguration, die aus fünf Ll -Proteinen aufgebaut ist. Das Capsomer ist der Grundbaustein, aus denen virale Capside aufgebaut sind. Unter stabilen Capsomeren versteht man Capsomere, die nicht dazu in der Lage sind sich zu Capsiden zusammenzusetzen. Unter Capsiden versteht man die Hülle
des Papillomavirus, die beispielsweise aus 72 Capsomeren zusammengesetzt ist (Baker T et al (1991) Biophys J 60, 1445) Unter VLP versteht man ein Capsid, das morphologisch und in seiner Antigenitat einem intakten Virus gleicht Die VLPs konnten zur Auslosung einer humoralen Immunantwort, die durch Bildung \on neutralisierenden Antikörpern charakterisiert ist, in verschiedenen tieπschen Systemen verwendet werden Die Bildung von virus-neutrahsierenden Antikörpern gegen Ll - und oder L2-Proteιn ist jedoch von geπngerer klinischer Bedeutung, wenn die Virusinfektion bereits stattgefunden hat, da für die Ehminierung virus-mfizierter Zellen keine Antikörper, sondern eine virus-spezifische zytotoxi- sehe T-Zell-(CTL)-Antwort notwendig zu sein scheint Und obwohl VLPs in der Lage sind eine zytotoxische T-Zell-Antwort auszulosen, scheint eine ausschließlich gegen die Kapsidproteine L l und/oder L2 geπchtete Immunantwort nicht zur Bekämpfung eines durch Papillomaviren bedingten Tumors geeignet
Es wurden daher sogenannte chimare Papillomavirus-ahnliche Partikel (CVLPs für chimeπc virus-like particle) entwickelt, die aus einem Fusionsprotein des Kapsidproteins Ll und des potentiellen Tumorantigen E7 bestehen (WO 96/1 1272 und Muller, M et al (1997) Virology, 234, 93) Die CVLPs losten nur im geringen Maße eine gegen das E7-Proteιn geπchtete humorale Immunantwort aus (Muller, M et al (1997), supra) Einige der getesteten CVLPs induzieren jedoch tatsächlich die erwünschte E7-spezιfιsche zytotoxische T-Zellantwort in Mausen (siehe auch Peng S et al (1998) Virology 240,147-57) CVLPs sind deshalb sowohl für die Entwicklung eines Impfstoffes als auch für die Behandlung bereits bestehender Infektionen und daraus resultierender Tumore interessant, da die über MHC-Molekule der Klasse I-prasentierten E7-Peptιde von Tumorzellen Zielmo- lekule von zytotoxischen T-Zellen darstellen wurden
Einem Impfstoff bestehend aus CVLPs egt das Pπnzip der Pseudoinfektion der
Zellen durch die CVLPs zugrunde Dies bedeutet, daß die CVLPs wie Viren in die Zelle gelangen, dort zu Peptiden prozessiert werden, die Peptide dann auf MHC-
Klasse I und II-Molekule geladen werden und letztend ch CD8- bzw CD4- positiven T-Zellen präsentiert werden CD8-Zellen können als Folge dieser Stimulation zu zytotoxischen T-Zellen differenzieren und dann eine zellulare Immunantwort bewirken, CD4-Zellen hingegen entw ickeln sich zu T-Helferzellen und stimulieren B-Zellen zu einer humoralen oder CD8-posιtιve T-Zellen zu einer zytotoxischen Immunantwort und können selbst die Lyse von infizierten Zellen induzieren
Kleine Peptide können bereits auf der Zelloberflache an MHC-Klasse I-Molekule binden und dann ohne weitere Prozessierung CDS- oder CD4-posιtι\ e Zellen zu einer zellularen Immunantwort stimulieren Ein bestimmtes Peptid kann jedoch nur durch bestimmte MHC-Molekule gebunden werden Durch den großen Poly- morphismus der MHC-Molekule in naturlichen Populationen kann deshalb ein bestimmtes Peptid lediglich durch einen kleinen Teil einer Population gebunden und präsentiert w erden Unter Präsentation im Sinne der vorliegenden Erfindung wird verstanden, wenn ein Peptid oder Proteinfragment an ein MHC-Molekul bindet, wobei diese Bindung beispielsweise im endoplasmatischen Retikulum, im extrazellularen Raum, den Endosomen, Proendosomen, Lysosomen oder Protyso- somen, stattfinden kann, und wenn dann dieser MHC-Molekul-Peptid-Komplex auf der extrazellularen Seite der Zellmembran gebunden ist, so daß er durch Immunzellen spezifisch erkannt werden kann
Da CVLPs sowohl eine zellulare als auch humorale Immunantwort auslosen und nicht MHC-restπngiert sind, eignet sich diese Technologie generell zur Entwick- lung von Impfstoffen, indem die Fähigkeit zur Partikelbildung durch einen Ll- Anteil zur Verfügung gestellt wird und ein zusatzlicher Antigenanteil an diesen Ll -Anteil fusioniert wird
Bei der Entwicklung derartiger CVLPs ist es unbedingt notwendig, ein fünktio- nelles Testsystem zur Verfügung zu haben, mit dem man direkt die Immunogeni- tät von CVLPs untersuchen kann. Ein derartiges Testsystem sollte die Eigenschaft besitzen, daß CVLPs mit unterschiedlichen Antigenanteilen mit demselben Test- System untersucht werden können. Da für immunologische Therapieverfahren von Tumoren oder Viruserkrankungen die zelluläre Immunantwort von entscheidender Bedeutung ist, stellte sich die Aufgabe, die durch CVLPs hervorgerufene zelluläre Immunantwort meßbar zu machen.
Die Lösung dieser Aufgabe gelang durch die Identifikation von T-Zell-Epitopen, die in Verbindung mit MHC-Molekülen, in einer besonderen Ausfuhrungsform mit HLA A2.01 MHC-Molekülen in vivo und in vitro beispielsweise eine zytotoxische T-Zellantwort auslösen. Diese Peptide haben vorzugsweise die Sequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI. Diese Sequenzen sind Bestandteil des Ll- und des E7-Peptid des HPV16. Sie umfassen die Aminosäurebereiche Ll 86-94 (5104), Ll 123-131 (5106), Ll 285-293 (5107), Ll 275-283 (5108), Ll 238-246 (5109), Ll 426-434 (5112), Ll 28-39 (2016). Ll 31 1-320 (2017), Ll 408-417 (2018), Ll 38-47 (2019), Ll 396-404 (2020), Ll 349-357 (2022), Ll 298-306 (27/28), Ll 90-98 (9), E7 1-9 (43), E7 18-25 (45) und E7 44-53 (47/48). Die Namen der jeweiligen Epitope ist in Klammern angegeben.
Die E7-Peptide 43, 45 und 47/48 wurden als potentielle Epitope bereits in Käst et al, (1994) Journal of Immunology 152, 3904-3912 publiziert. Allerdings wird in dieser Publikation lediglich gezeigt, daß diese Peptide an HLA AI Moleküle binden können, jedoch nicht, daß tatsächlich ein zytotoxische T-Zellantwort ausgelöst werden kann. Des weiteren sind keine Daten aufgeführt, die dokumentieren, daß die Peptide als Bestandteil eines Proteins durch T-Zellen erkannt werden. Es
wurde nämlich vielfach gezeigt, daß Peptide, die per se an HLA-Moleküle binden, nicht notwendigerweise auch durch T-Zellen erkannt werden. Des weiteren ist bekannt, daß T-Zellen, die zwar ein Peptid erkennen, meßbar dadurch daß sie sich durch das Peptid zu einer T-Zellantwort induzieren lassen, nicht notwendigerwei- se auch Zellen erkennen, die mit ganzen Proteinen - enthaltend das entsprechende Peptid - beladen wurden. Dies ist dadurch zu erklären, daß oft Peptide Protease- schnittstellen enthalten, innerhalb derer die Peptide während der Prozessierung der ganzen Proteine in der Zelle geschnitten und somit zerstört werden und somit nicht mehr durch T-Zellen erkannt werden können. Diese Problematik wird bei- spielsweise in Feltkamp et al. (1993), Eur. J. Immunol. 23: 2242-2249 bestätigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI, und/oder eine funktionell aktive Variante davon.
Unter einer funktionell aktiven Vaπante von ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL,
SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI versteht man ein T-Zell-Epitop, das in einem T-Zell-Zytotoxizitäts-Testsystem (siehe beispielsweise Beispiele 2-5 der vorliegenden Erfindung) eine, an der Zytotoxizität von ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI gemessene Zytotoxizität besitzt, die minde- stens der Summe aus dem Mittelwert der Negativkontrollen und der dreifachen
Standardabweichung entspricht, vorzugsweise von mindestens ca. 30%, insbesondere mindestens ca. 50% und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 80%.
Eine bevorzugte Variante ist beispielsweise ein T-Zell-Epitop mit einer Sequenzhomologie zu ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI von minde- stens ca. 65%, vorzugsweise mindestens ca. 75% und insbesondere mindestens ca. 85% auf Aminosäureebene. Andere bevorzugte Varianten sind auch T-Zell- Epitope, die eine strukturelle Homologie zu ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL,
SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI haben. Solche Epitope können aufgefunden werden, indem man gegen die T-Zell-Epitope ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL,
SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI spezifische T-Zellen generiert (DeBruijn M.L. et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21, 2963-70; und DeBruijn M.L. (1992) Eur. J. Immunol. 22, 3013-20) und beispielsweise synthetisch hergestellte Peptide nach Wahl auf Erkennung durch die peptidspezi fischen T-Zellen getestet werden (siehe Beispiele). Insbesondere werden unter T-Zellepitopen zytotoxische T-Zellepitope verstanden. Es sind jedoch auch nicht zytotoxische T-Zellen bekannt, die ebenfalls MHC I-Moleküle erkennen können, so daß auch nicht-zytotoxische T- Zellepitope als Variante von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein T-Zell-Epitop, das Teil einer Verbindung ist, wobei die Verbindung kein natürlich vorkommendes Ll Protein eines Papillomavirus und keine ausschließlich N-terminale oder ausschließlich C-terminale Deletionsmutante eines natürlich vorkommenden Ll Proteins eines Papillomavirus ist.
In einer besonderen Ausführungsform kann ein T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV. und/oder eine funktionell aktive Variante in einem Ll -Protein eines anderen Papillomavirus oder in einem chimären Ll -Protein, beispielsweise einem HPV18L1E7- Fusionsprotein, enthalten sein. Eine solche erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Vorzugsweise kann das genannte T-Zell-Epitop als Teil einer Verbindung ein Polypeptid, das in bevorzugter Weise weitere Aminosäuresequenzen enthält, insbesondere ein Fusionsprotein sein. Insbesondere kann die Verbindung ein Polypeptid von mindestens ca. 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca. 35 Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca. 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 9-12 Aminosäuren Länge sein.
Um die Verbindung zu detektieren oder in ihrer Aktivität der Bindung an T-Zellen zu modifizieren, kann sie eine chemische, radioaktive Isotopen-, nicht radioaktive Isotopen-, und/oder Fluoreszensmarkierung des T-Zell-Epitops und/oder des genannten Fusionsproteins enthalten.
Beispiele von dem Fachmann bekannten chemischen Substanzen, die sich für eine erfindungsgemäße chemische Markierung eignen, sind: Biotin, FITC (Fluorescei- nisothiocyanat) oder Streptavidin.
Eine mögliche Ausführungsform ist, daß ein Peptid derart modifiziert wird, daß es mindestens ein Lysin enthält. An dieses Lysin wird in der dem Fachmann bekannter Weise Biotin oder FITC (Fluoresceinisothiocyanat) gekoppelt. Ein derartig modifiziertes Peptid wird an ein entsprechendes MHC-Molekül oder an eine Zelle mit entsprechenden MHC-Molekülen gebunden. Daraufhin kann das Peptid über markiertes Avidin oder Streptavidin bzw. direkt über die Fluoreszenz des FITC nachgewiesen werden.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen, die sich für eine erfindungsgemäße radioaktive Isotopenmarkierung eignen, sind: Η, 1 J, 131I, 32P, 33P oder
1 C.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen, die sich für eine erfindungs-
7 1 ". gemäße nicht radioaktive Isotopenmarkierung eignen, sind: "H oder C.
Beispiele von dem Fachmann bekannten fluoreszierenden Substanzen, die sich für eine erfindungsgemäße Fluoreszensmarkierung eignen, sind: Εu, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o- Phtaldehyd oder Fluorescamin.
Dem Fachmann sind weitere hier nicht aufgeführte Markierung bekannt, die auch im Sinne dieser Erfindung zur Markierung eingesetzt werden können.
Beispiele von dem Fachmann bekannten erfindungsgemäßen chemischen Modifikationen sind die Übertragung von Acetyl-, Phosphat-, und/oder Monosacharid- gruppen
Erfindungsgemäße Polypeptide mit einer Aminosäurelänge von ca. 50 können beispielsweise durch eine chemische Peptidsynthese hergestellt werden. Längere Polypetide werden vorzugsweise gentechnisch erzeugt. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Nukleinsäurekonstrukt zur Expression des genannten T-Zell-Epitops oder der Verbindungen, das folgende Komponenten enthält: (a) mindestens ein regulatorisches Element und (b) mindestens eine Nu- kleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Verbindung kodiert. Das genannte Nukleinsäurekonstrukt ist vorzugsweise aus DNA oder RNA. Geeignete regulatorische Elemente erlauben beispielsweise die konstitutive, regulierbare, gewebsspezifische, zellzyklusspezifische oder metabolischspezifi- sehe Expression in eukaryotischen Zellen oder die konstitutive, metabolischspezi- fische oder regulierbare Expression in prokaryotischen Zellen. Regulierbare Elemente gemäß der vorliegenden Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhancer, Silencer, und oder Repressorsequenzen.
Beispiele für geeignete regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Eu- karyoten ermöglichen sind Promotoren die von der RNA Polymerase III erkannt werden oder virale Promotoren, wie CMV-Enhancer, CMV-Promotor, SV40 Promotor und virale Promotor-und Aktivatorsequenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV HTLV oder HIV.
Beispiele für regulierbare Elemente, die regulierbare Expression in Eukaryoten ermöglichen sind der Tetrazyklinoperator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen M. et al (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
Beispiele für regulierbare Elemente, die gewebsspezi fische Expression in Euka- ryoten ermöglichen sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden.
Beispiele für regulierbare Elemente, die zellzyklusspezifische Expression in Euka- ryoten ermöglichen sind die Promotoren der folgenden Gene: cdc25C, Cyclin A, Cyclin E, cdc2, E2F, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6).
Beispiele für regulierbare Elemente, die metabolisch spezifische Expression in Eukaryoten ermöglichen sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glucose- mangel, durch Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden.
Um die Einführung der genannten Nukleinsäure und damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nukleinsäure als Plasmid, als Teil eines viralen, oder nicht viralen Vektors vorliegen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Vektor, insbesondere ein Expressions- vektor, der eine Nukleinsäure codierend für ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Baculoviren, Vakzi- niaviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Li- pide, oder Poly-Lysin konjugierte DNA.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mindestens ein T-Zell-Epitop enthält, vorzugsweise präsentiert. In einer besonderen Ausfuhrungsform wird die Zelle durch einen der genannten Vektoren transfiziert,
transformiert oder infiziert Diese Zelle exprimiert unter dem Fachmann bekannten Bedingungen, die zur Aktivierung der jeweils verwendeten regulierbaren Elemente fuhren, das erfindungsgemaße Polypeptid Das Polypeptid kann dann aus dieser Zelle isoliert und z B unter Verwendung einer der oben genannten Markie- rungen aufgereinigt werden Zur gentechnischen Herstellung und anschließenden Aufreinigung der expπmierten, erfindungsgemaßen Verbindungen eignen sich prokaryotische und eukaryotische Zellen, insbesondere Bakteπenzellen wie beispielsweise E co , Hefezellen wie beispielsweise S cerevisiae, Insekten Zellen wie beispielsweise Spodoptera frugiperda Zellen (Sf-9) oder Tπchoplusia ni Zel- len oder Saugerzellen wie beispielsweise COS-Zellen oder HeLa-Zellen
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform ist es, die Zelle, die das erfindungsgemaße Polypeptide exprimiert, selbst zu verwenden, wobei in einer besonders bevorzugten Aus führungs form die Zelle Teile das erfindungsgemaßen Polypeptids über MHC-1 Moleküle auf der Zelloberflache präsentiert Für die Herstellung einer erfindungsgemaßen Zelle sind Antigen-prasentierende Zellen wie beispielsweise B-Zellen, Makrophagen, dendπtische Zellen, Fibroblasten oder anderen HLA A2 01 positive Zellen, in einer bevorzugten Ausfuhrungsform JY-, T2, CaSki- Zellen oder EBV-transformierte B-Zelhnien, geeignet Die erfindungsgemaßen Zellen, die ein Polypeptid enthaltend ein T-Zell-Epitop, präsentieren, können als Zielzellen zur Restimulation von Immunzellen, insbesondere T-Zellen und/oder zur Messung der Aktivierung von T-Zellen eingesetzt werden Unter Zielzelle im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle zu verstehen, die über MHC- Molekule ein T-Zell-Epitope präsentiert und damit spezifisch eine T-Zell- Aktivierung hervorruft, insbesondere eine zytotoxische T-Zell-Reaktion gegen die Zelle
Ferner kann die ein T-Zell-Epitop enthaltene Verbindung, Teil eines Komplexes sein, der dadurch charakterisiert ist, daß die Verbindung kovalent oder über hy- drophobe Wechselwirkungen, Ionenbindung oder Wasserstoffbruckenbindungen
mit mindestens einer weiteren Spezies wie Peptide, Proteine, Peptoide, lineare oder verzweigte Oligo- oder Polysacharide und Nukleinsäuren verbunden ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Komplex enthaltend ein T- Zell-Epitop oder eine Verbindung und mindestens eine weitere Verbindung. Eine bevorzugte Ausführungsform ist, daß das Polypeptid in Verbindung mit MHC Klasse I-Molekülen, vorzugsweise als HLA A2.01 Tetramer vorliegt. Besonders bevorzugt sind humane MHC-Klasse I Moleküle. Durch die Technik von Altman J.D. et al. (1996, Science 274, 94-6) lassen sich beispielsweise HLA A2.01- Tetramere mit den entsprechenden gebundenen Peptiden herstellen, die in der Lage sind, an die T-Zellrezeptoren von peptidspezifischen zytotoxischen T-Zellen zu binden.
Eine weitere Ausführungsform ist die Immobilisierung der erfindungsgemäßen Verbindung oder des genannten Komplexes an Trägermaterialien. Als Trägermaterialien eignen sich beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien bzw. dünne Schichten des Trägers, insbesondere der genannten Materialien, oder (bio)molekulare Filamente wie Cellulose oder Gerüstproteine.
Zur Aufreinigung des erfindungsgemäßen Komplexes kann eine Komponente des Komplexes zusätzlich noch ein Protein-Tag enthalten. Erfindungsgemäße Protein- Tags erlauben beispielsweise die hochaffine Absorption an eine Matrix, stringen- tes Waschen mit geeigneten Puffern ohne den Komplex im nennenswerten Maße zu eluieren und anschließende gezielte Elution des absorbierten Komplexes. Beispiele von dem Fachmann bekannten Protein-Tags, sind ein (HIS)6-Tag, ein Myc- Tag, ein FLAG-Tag, ein Hämaglutenin-Tag, Glutathion-Transferase (GST)-Tag, Intein mit einem Affinitäts- Chitin-binding Tag oder Maltose binding protein
(MBP)-Tag Die erfindungsgemaßen Protein-Tags können sich N-, C-terminal, und/oder intern befinden
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum in v itro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen durch mindestens eine Verbindung, enthaltend ein T-Zell-Epitop Ein derartiges Verfahren besteht vorzugsweise aus drei Schritten a) In einem ersten Schπtt werden Zellen mit mindestens einer Verbindungen enthaltend ein T-Zell-Epitop stimuliert Diese Verbindung kann mindestens eine erfindungsgemaße Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einen erfindungsgemaßen Komplex enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein VLP, mindestens ein CVLP, und oder mindestens ein Virus bedeuten In einer bevorzugten Ausfuhrungsform w erden Immunzellen durch die Inkubation mit CVLPs stimuliert Diese Stimulation kann beispielsweise in Form einer Impfung erfolgen, oder durch Inkubation von Immunzellen mit CVLPs in vitro Derartig stimulierte Immunzellen w erden beispielsweise nach einer Impfung oder bei einem Tumorpatienten aus dem Blut, aus Tumoren oder aus Lymphknoten gewonnen, und/oder erden kultiviert b) In einem zweiten Schπtt werden Zellen mit mindestens einem erfindungsgemaßen T-Zell-Epitop, mindestens einer erfindungsgemaßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell- Epitop präsentiert und/oder mit mindestens einem erfindungsgemaßen
Komplex inkubiert c) In einem dπtten Schπtt erfolgt die Bestimmung der Aktivierung von T- Zellen Hierfür geeignete Verfahren sind beispielsweise der Nachweis der Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Expres-
sion von Oberflächenmolekülen auf T-Zellen, der Lyse von Zielzellen oder der Proliferation von Zellen. Hierfür geeignete Methoden sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Protocols in Im- munology (1999), edited by Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M. and Strober W., John Wiley & Sons), ELISPOT
(Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 51Cr- Freisetzungstest (Chapter 3.1 1 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der Nachweis der Proliferation (Chapter 3.12 in Cuπent Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwi- sehen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen, B-
Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen, Komplexen, und/oder Zellen, die erfindungsgemäße Markierungen enthalten, erlaubt die Detek- tion von T-Zellen, die das T-Zell-Epitop erkennen über den Nachweis der Bindung markierter Verbindungen, Komplexe, und oder Zellen an die T-
Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindung erfindungsgemäßer MHC-Polypeptid-Komplexe an die Oberfläche der T- Zellen nachgewiesen. Dies kann derart durchgeführt werden, daß die MHC-Komplexe selbst markiert, beispielsweise fluoreszenzmarkiert sind, oder daß man in einem weiteren Schritt einen MHC-spezifischen, markierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten Antikörper verwendet, um wiederum die MHC-Komplexe nachzuweisen. Die Fluoreszenzmarkierung der T-Zellen läßt sich dann beispielsweise in einem 'Fluorescens Activated Cell Sorter' (FACS) messen und auswerten. Eine andere Möglichkeit zum Nachweis der Bindung von den Komplexen an die T-Zellen ist erneut die
Messung der Aktivierung von T-Zellen (Cytokinassay, Elispot, 51Cr- Freisetzungstest, Proliferation, siehe oben). Allerdings benötigt man hierfür die gleichzeitige Stimulation von Korezeptoren (z. B. CD28), beispielsweise durch Korezeptor-spezifische Antikörper (Anti-CD28) und/oder andere unspezifische Aktivatoren (IL-2).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das einen zusätzlichen Schritt a') enthält, der nach Schritt a) eingeführt wird. a') In diesem zusätzlichen dem Schritt a) nachfolgenden Schritt a') werden die isolierten oder kultivierten Zellen mit mindestens einer Zielzelle beladen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP und oder mindestens einem Virus, mit mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, und/oder mindestens einer Zielzelle, die ein
T-Zell-Epitop präsentiert, für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere für mindestens ca. 1 Woche cokultiviert, bevor sich Schritt b) anschließt.
Unter Cokultivierung ist das Wachstum der Zellen:
(i) in Gegenwart von mindestens einer Zielzelle beladen mit einer er- findungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und/oder mindestens einem Virus, (ii) in Gegenwart mindestens eines erfindungsgemäßen Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop,
(iii) in Gegenwart mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, im selben Wachstumsmedium und selben Gewebekulturbehälter zu verste- hen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer T-Zell-Epitop präsentierenden Zielzelle. Hierbei ist es möglich, die
Zielzelle mit Kombinationen von unterschiedlichen T-Zell-Epitopen zu beladen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle mit mindestens einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop und/oder mindestens einem Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop inkubiert. In einer besonders bevorzugten Ausfüh- rungsform wird die Zielzelle in Wachstumsmedium, das erfindungsgemäße Polypeptide enthält, oder mit MHC Klasse I-Komplexen mit gebundenen erfindungsgemäßen Polypeptiden inkubiert. Die MHC Klasse I-Komplexe können beispielsweise als HLA A2.01 -Tetramere vorliegen. Ein Tetramer bindet dabei in der Regel vier Peptide. Diese können sowohl identisch sein oder aber unterschiedliche Spezies von Peptiden repräsentieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle mit einer Nukleinsäure und oder einem Vektor transfiziert, transformiert und/oder infiziert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle mit einem Vakziniavirusvektor infiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Antigen-präsentierenden Zellen beispielsweise mit B-Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen, embryonalen Zellen oder Fibroblasten oder anderen HLA A2.01 positiven Zellen, in einer bevorzugten Ausführungsform mit JY-, T2-, CaSki- Zellen oder EBV-transformierten B-Zellinien durchgeführt.
Die verwendeten CVLPs enthalten ein Papillomavirus Ll -Protein oder Varianten davon, insbesondere HPV16 Ll-Protein und, jedoch nicht notwendigerweise, ein zu Ll heterologes Protein oder Varianten davon. Die zwei Proteine können direkt oder indirekt gebunden vorliegen. Direkt gebunden meint im Sinne der Erfindung, daß eine kovalente Bindung zwischen den beiden Proteinen vorliegt, beispielsweise eine Peptidbindung oder eine Disulfidbindung. Indirekt gebunden bedeutet, daß die Proteine über nicht-kovalente Bindungen gebunden sind, beispielsweise hydrophobe Wechselwirkungen, Ionenbindungen oder Wasserstoffbrücken. In einer weiteren Ausfuhrungs form enthalten die CVLPs zusätzlich zu Ll-Protein oder Varianten davon ein Papillomavirus L2-Protein.
Eine bevorzugte Ausführung des Ll -Proteins der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise Ll -Proteine mit einer oder mehreren Deletionen, insbesondere einer C-terminalen Deletion Eine C-terminale Deletion hat den Vorteil, daß die Effizienz der Bildung virus-ahnlicher Partikel gesteigert werden kann, da das am C-Terminus lokalisierte nukleare Loka sationssignal deletiert wird Die C- terminale Deletion betragt daher vorzugsweise bis zu ca 35 Aminosäuren, insbesondere ca 25 bis ca 35 Aminosäuren, vor allem ca 32 bis ca 34 Aminosäuren Beispielsweise ist eine 32 Aminosäuren lange C-terminale Deletion des HPY16 Ll -Proteins ausreichend, um die Bildung von virus-ahnlichen Partikeln um das mindestens ca zehnfache steigern zu können Des w eiteren kann das Ll -Protein eine oder mehrere Mutationen tragen oder der Ll -Anteil aus Ll -Proteinen ' erschiedener Papillomaviren zusammengesetzt sein Gemeinsames Kennzeichen der erfindungsgemaßen Ll -Proteine ist, daß sie die Bildung von VLPs bzw CVLPs zulassen und daß sie mindestens ein erfindungsgemaßes T-Zell-Epitop enthalten
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist das Ll -Protein oder Vaπanten davon und das zu Ll heterologe Protein ein Fusionsprotein Beinhaltet sind auch he- terologe Proteine, die aus mehreren verschiedenen Proteinen oder Teilen da\ on zusammengesetzt sind Dies können beispielsweise auch Epitope, insbesondere zytotoxische T-Zellepitope von Proteinen sein Epitope im Sinne der Erfindung können dabei auch Teil eines synthetischen Polypeptids mit einer Lange von ca 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca 35 Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca 9 Aminosäuren sein
Bevorzugt sind zu Ll heterologe Proteine, die von einem viralen Protein abgeleitet sind, beispielsweise abgeleitet von HIV, HBV oder HCV, vorzugsweise von Papillomaviren, insbesondere von humanen Papillomaviren
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dies ein E-Protein eines Papillomavirus, vorzugsweise ein E6- und/oder E7-Protein. Insbesondere ist bevorzugt, wenn das E-Protein ein deletiertes E-Protein ist, vorzugsweise ein C-terminal deletier- tes, insbesondere ein C-terminal deletiertes E7-Protein, da diese Konstrukte in Verbindung mit deletiertem Ll-Protein bevorzugt virus-ähnliche Partikel ausbilden können. Insbesondere bevorzugt sind Deletionen bis zu 55 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 55 Aminosäuren, insbesondere ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren.
In einer weiteren Ausführung kann das zu Ll heterologe Protein von Antigenen nicht viraler Erreger abstammen. Ebenso können sie von Autoimmunantigenen wie z.B. Thyroglobulin, Myelin basic protein oder Zona Pellucida Glycoprotein 3 (ZP3), die mit bestimmten Autoimmunkrankheiten wie z.B. Thyroiditis, Multiple Sklerose, Oophoritis oder rheumatoider Arthritis assoziiert sind, abgeleitet sein. In einer bevorzugten Ausführung stammt das zu Ll heterologe Protein von Tumorantigenen ab, vorzugsweise Melanomaantigenen wie MART, Ovarialcarcino- mantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1 oder CA125, Coloncarcino- mantigenen wie CA125 oder Mammacarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-l , BCRA-2.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen, die durch Präparation aus Proben gewonnen werden. Dieses Verfahren erlaubt es zu bestimmen, ob in einer Probe, beispielsweise einer Blutprobe eines Patienten oder in Tumoren oder Lymphknoten eines Tumorpatienten, Papillomavirus Ll -Protein-spezifische zytotoxische T-Zellen vorhanden sind. Ein derartiges Nachweisverfahren enthält die folgenden Schritte: a") In einem ersten Schritt werden Zellen gewonnen, beispielsweise durch Blutabnahme von einem Patienten oder durch die Präparation zum Beispiel
von Tumoren oder Lymphknoten. Anschließend werden die Zellen in Wachstumsmedium aufgenommen und kultiviert. b) In einem zweiten Schritt werden Zellen mit mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert oder mit mindestens einem Komplex, der als eine Komponente eine Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitope umfaßt, inkubiert.
c) In einem dritten Schritt erfolgt die Bestimmung der Aktivierung von T- Zellen. Hierfür geeignete Verfahren sind beispielsweise der Nachweis der Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Expressi- on von Oberflächenmolekülen auf T-Zellen. der Lyse von Zielzellen oder der Proliferation von Zellen. Hierfür geeignete Methoden sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Protocols in Immunology ( 1999), edited by Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M. and Strober W., John Wiley & Sons), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 3 iCr-Freisetzungstest
(Chapter 3.1 1 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der Nachweis der Proliferation (Chapter 3.12 in Cuπent Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwischen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen, B-Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen, Komplexen, und/oder Zellen die erfindungsgemäße Markierungen enthalten erlaubt die Detektion von T-Zellen, die das T-Zell-Epitop erkennen über den Nachweis der Bindung markierter Verbindungen, Komplexe, und oder Zellen an die T-Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindung erfindungsgemäßer MHC-Polypeptid-
Komplexe an die Oberfläche der T-Zellen nachgewiesen. Dies kann derart durchgeführt werden, daß die MHC-Komplexe selbst markiert, beispielsweise fluoreszenzmarkiert sind, oder daß man in einem weiteren Schritt einen MHC-spezifischen, markierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten Antikörper verwendet, um wiederum die MHC-Komplexe nachzuweisen.
Die Fluoreszenzmarkierung der T-Zellen läßt sich dann beispielsweise in einem 'Fluorescens Activated Cell Sorter' (FACS) messen und auswerten. Eine andere Möglichkeit zum Nachweis der Bindung von den Komplexen an die T-Zellen ist erneut die Messung der Aktivierung von T-Zellen (Cyto- kinassay, Elispot, 51Cr-Freisetzungstest, Proliferation, siehe oben). Allerdings benötigt man hierfür die gleichzeitige Stimulation von Korezeptoren (z. B. CD28), beispielsweise durch Korezeptor-spezifische Antikörper (An- ti-CD28) und/oder andere unspezifische Aktivatoren (IL-2).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das einen zusätzlichen Schritt a') enthält, der nach Schritt a") eingeführt wird. a') In diesem zusätzlichen dem Schritt a") nachfolgenden Schritt a')werden die isolierten oder kultivierten Zellen mit mindestens einer Zielzelle beladen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-
Zell-Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP und/oder mindestens einem Virus, mit mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, und/oder mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere für mindestens ca. 1 Woche cokultiviert, bevor sich Schritt b) anschließt.
Unter Cokultivierung ist das Wachstum der Zellen:
(i) in Gegenwart von mindestens einer Zielzelle beladen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, min- destens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-
Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und/oder mindestens einem Virus,
(n) in Gegenwart mindestens eines erfindungsgemaßen Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop,
(in) in Gegenwart mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, im selben Wachstumsmedium und selben Gewebekulturbehalter zu verstehen
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testsystem (Kit) zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen enthaltend a) mindestens ein erfindungsgemaßes T -Zell-Epitop, mindestens eine erfindungsgemaße Verbindung, mindestens einen erfindungsgemaßen Vektor, mindestens eine erfindungsgemaße Zelle, und/oder mindestens einen erfindungsgemaßen Komplex, und b) Effektorzellen des Immunsystems, vorzugsweise T-Zellen, insbesondere zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen
Das Testsystem ird in einer besonderen Ausführungsform zur Bestimmung der, beispielsweise in einer Blutprobe eines Patienten oder in Tumoren oder Lymphknoten eines Tumorpatienten vorhandenen Ll -Protein-spezifischen zyto- toxischen T-Zellen verwendet In diesem Fall sind die in b) beschπebenen Zellen im Testsystem enthaltene Kontrollzellen, deren Aktivierung durch die erste Kitkomponente, die unter a) genannten Substanzen, als Standard dient Die in dieser Reaktion beobachteten Aktivierung wird mit die T-Zell-Aktivierung von aus Patienten isolierten Zellen durch die Kitkomponente a) verglichen
In einer weiteren besonderen Ausfuhrungs form wird das Testsystem beispielsweise zur Bestimmung der Ll -Protein-spezifischen Antigenitat einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, eines Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop, eines
Capsomers, eines stabilen Capsomers, eines VLPs, eines CVLPs, und/oder eines Virus verwendet. In diesem Fall sind die in a) beschriebenen Substanzen Kontrollsubstanzen deren aktivierende Wirkung auf die zweite Kitkomponente, die unter b) genannten Zellen, als Standard dient. Die in dieser Reaktion beobachteten Aktivierung wird mit der aktivierenden Wirkung einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, einem Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, einem Capsomer, einem stabilen Capsomer, einem VLP, ein CVLP, und/oder einem Virus auf die Kitkomponente b) verglichen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von mindestens einem T-Zell-Epitop, mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T- Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für eine ein T-Zell-Epitop enthaltende Verbindung, mindestens einer erfindungsgemäßen Zelle enthaltend ein T-Zell-Epitop zur, und/oder mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop zur Auslösung oder zum Nachweis einer Immunantwort.
Zur Stimulation von Immunzellen in vitro wie in vivo eignen sich insbesondere Zellen, die mindestens eines der erfindungsgemäßen Moleküle über ihre MHC- Klasse I-Moleküle präsentieren. Zur Antigen-Präsentation geeignete Zellen sind z. B. B-Zellen, dendritische Zellen, Macrophagen, Fibroblasten oder andere HLA A2.01 positive Zellen, die durch eine gemeinsame Kultivierung mit Immunzellen eine Stimulation von spezifischen T-Zellen eπeichen können.
In einer besonderen Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Verbindung beispielsweise ein HPV18 LlE7-Fusionsprotein, das zusätzlich ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop enthält, zur Detektion einer Immunantwort eingesetzt werden. Eine solche erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens einen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für eine ein T-Zell-Epitop enthaltende Verbindung, mindestens eine erfindungsgemäße Zelle enthaltend ein T-Zell-Epitop, und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Trägern sind Glas, Polystyren, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylase, natürliche oder modifizierte Zellulose, Polyacrylamide, Agarose, Aluminiumhydroxid oder Magnitid.
Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel oder Diagnostikum kann in Lösung vorlie- gen, an eine feste Matrix gebunden sein, und/oder mit einem Adjuvans versetzt sein.
Das Arzneimittel oder Diagnostikum kann auf verschiedene Weisen verabreicht werden. Beispiele von dem Fachmann bekannten Verabreichungsformen sind pa- renterale, lokale und/oder systemische Applikation durch z. B. orale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, und/oder topische Applikation. Die bevorzugte Applikationsform wird beispielsweise durch den natürlichen Infektionsweg der jeweiligen Papillomavirusinfektion beeinflußt. Die verabreichte Menge richtet sich nach Alter, Gewicht, allgemeinem Gesundheitszustand des Patienten und dem Typ der Papillomavirusinfektion. Das Arzneimittel oder Diagnostikum kann in Form von Kapseln, Lösung, Suspension, Elixier (für orale Applikation) oder sterile Lösungen bzw. Suspensionen (für parenterale oder intranasale Applikation) verabreicht werden. Als inerter und immunologisch akzeptabler Träger kann beispielsweise Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung verwendet werden.
Das Arzneimittel wird in therapeutisch effektiven Mengen verabreicht. Das bedeutet Mengen, die ausreichend sind, um eine schützende immunologische Antwort hervorzurufen.
In einer besonderen Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Verbindung beispielsweise ein HPV18 LlE7-Fusionsprotein, das zusätzlich ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop enthält, als Arzneimittel oder Diagnostikum eingesetzt werden. Eine solche erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Fig. 1 zeigt die graphische Auswertung der MTT-Färbung von WEHI-Zellysaten, gemessen als Absorption bei 595 nm, die mit Überständen von T-Zellen inkubiert worden waren, die wiederum durch unterschiedliche Antigen-präsentierende peri- phere Blutlymphozyten (PBL) stimuliert worden waren. Durch spezifische Antigen-präsentierende PBL stimulierte T-Zellen sekretieren TNF . Dieses induziert bei WEHI-Zellen Apoptose, so daß diese Zellen MTT nicht mehr zu einem bräunlichen Farbstoff prozessieren können. Niedrige Absorption bedeutet geringe Farbstoffproduktion und somit viele apoptotische Zellen, die somit viel TNFα ausgesetzt waren, so daß die zugehörigen T-Zellen stimuliert worden waren. Somit ist die Stimulation der T-Zellen umso besser, je niedriger die Absorption für ein bestimmtes Antigen bei 595 nm ist.
Fig. 2 zeigt die graphische Auswertung der Fluoreszenz von T2-Zellen - gemessen in einer FACS-Analyse - , deren auf der Zelloberfläche befindliche MHC-1 Moleküle durch einen FITC-markierten Antikörper markiert worden waren. Zel-
len, deren MHC-1 Moleküle spezifisch die auf der X-Achse aufgetragenen Peptide binden können, haben vermehrt MHC-1 Moleküle, da die spezifische Bindung die MHC-Komplexe stabilisiert, so daß sie sich auf der Zelloberfläche anreichern können.
Fig. 3 zeigt die Auswertung von drei FACScan-Experimenten nach Restimulation CVLP-spezifischer humaner T-Zellen mit peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMC), die unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist jeweils der Gehalt an CD3 aufgetragen, das für T-Zellen spezifisch ist, und von unten nach oben der Gehalt an humanem Interferon γ, das für aktivierte Zellen spezifisch ist.
Fig. 4 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen eines HLA AI positiven Spenders mit peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMC), die unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist der Name des jeweiligen Peptids aufgetragen, mit denen die PBMC beladen wurden. „None" steht für PBMC, die lediglich mit Puffer inkubiert wurden. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von Interferon γ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 5 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen eines nicht-HLA-typisierten Spenders mit peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMC), die unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist der Name des jeweiligen Peptids aufgetragen, mit denen die PBMC beladen wurden. „None" steht für PBMC, die lediglich mit Puffer inkubiert wurden. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von Interferon γ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 6 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen eines HLA AI positiven Spenders mit peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMC), die unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist der Name des jeweiligen Peptidpools aufgetragen, mit denen die PBMC beladen wurden. „None" steht für PBMC, die lediglich mit Puffer inkubiert wurden. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von Interferon γ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 7 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen eines HLA A24 positiven Spenders mit peripheren Blutmononukleären Zellen (BLCL), die unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist der Name des jeweiligen Peptidpools aufgetragen, mit denen die BLCL beladen wurden. „None" steht für BLCL, die lediglich mit Puffer inkubiert wurden. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von Interferon γ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 8 zeigt die Auswertung eines 51Cr-Freisetzungsexperiments nach Beladung von BLCL-Zellen eines HLA A24 positiven Spenders (=Zielzellen) mit dem Peptid 9. Die Zielzellen wurden durch mit den Peptiden 1-43 stimulierte T-Zellen (=Effektorzellen) lysiert. Auf der X-Achse ist das Verhältnis der eingesetzten Effektorzellen zu den eingesetzten Zielzellen aufgetragen, auf der Y-Achse die % der spezifisch lysierten Zielzellen, bestimmt durch die Freisetzung von 51Cr aus den Zielzellen. Die %-Werte wurden nach der in Beispiel 7 angegebenen Formel berechnet.
Beispiele
1. Beschreibung der Ausgangsmaterialien
• Die Herstellung von HPV16 L1ΛC*E7I -55 CVLPs erfolgte gemäß der deutschen Patentanmeldung DE 198 12 941, siehe auch Müller M. et al. (1997) Virology
234, 93-1 1 1.
• Die Herstellung von Ll VLP's erfolgte gemäß Müller M. et al. (1997) Virology 234, 93-11 1.
• T2 Zellen, die unter der ATCC Nummer: CRL-1992 zu beziehen sind, weisen einen Defekt im Antigenprozessierungs-assoziierten Transport auf, der zur
Unterbindung der Beladung von MHC-1 Molekülen im endoplasmatischen Retikulum führt. Die dennoch auf der Zelloberfläche vorhandenen unbelade- nen MHC-1 Moleküle können beispielsweise durch Inkubation der Zellen in Peptid-haltigen Medien beladen werden, so daß sich diese Zellen sehr gut zur Präsentation eines Antigens eignen.
• WEHI Zellen sind unter der ATCC Nummer CRL-2148 zu beziehen.
• PMBC bedeutet periphere Blutmononukleäre Zellen, deren Isolierung wird beispielsweise in Rudolf MP. et al. (1999), Biol. Chem. 380, 335-40 beschrieben. • BLCL bedeutet eine mit Hilfe des Epstein-Barr-Virus transformierte B-Zelline (erhalten von Dr. Andreas Kaufmann, Friedrich-Schiller-University, Jena, Deutschland).
• BB7.2 bedeute ein α-HLA A2.01-spezifischer monoklonaler Maus Antikörper (ATCC HB-82). • α-hum CD28 bedeutet ein monoklonaler Maus-Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD28 gerichtet ist.
• α-hum CD3/PE bedeutet ein monoklonaler Maus Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD3 (ε) gerichtet ist und den Fluoreszens- marker Phycoerithrin enthält (Medac, Hamburg, Deutschland).
• α-hum CD4/Cychrome bedeutet ein monoklonaler Maus-Antikörper, der ge- gen den extrazellulären Teil von humanen CD4 gerichtet ist und den Fluores- zensmarker Cychrome enthält (DAKO; Glostrup, Dänemark).
• α-hum Interferon γ/FITC bedeutet einen monoklonaler Ratten-Antikörper, der gegen humanes Interferon γ gerichtet ist und den Fluoreszensmarker FITC enthält (Medac, Hamburg, Deutschland). • α-hum CD8/PE bedeutet einen monoklonalen Maus-Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD8 gerichtet ist und den Fluores- zenzmarker Phycoerithrin enthält (Pharmingen, Heidelberg, Deutschland).
• InfluenzaMP bedeutet Aminosäuren 58-66 GILGFVFTL des Influenza Matrix Protein (siehe Dunbar P.R. et al. (1998) Curr. Biol. 26, 413-6). • HPV16E7-Peptid bedeutet Aminosäuren 11-20 YMLDLQPETT des humanen Papillomavirus E7-Proteins.
• Anhand des Algorithmus für potentielle HLA A2.01-bindende Peptide (Parker, KC et al. (1994) J. Immunol. 152: 163), durchgeführt in dem Peptid- Prediction Program von Parker unter http://www-bimas.dcrt.nih.gov/molbio/- hla bind index.html wurden die folgenden Peptide als Kandidaten für HPV16
Ll identifiziert und synthetisch hergestellt. Die angegebenen Aminosäurepositionen des jeweiligen Peptids sind relativ zum Met (+1) der unter Genbank Zugangsnummer k02718 hinterlegten Sequenz für Ll angegeben (siehe nachfolgende Tabelle 1).
Tabelle 1 : Potentielle HLA A2.01-bindende Peptide von HPN16 Ll
Peptid ame Sequenz rel. Ll -Position
5104 ILVPKVSGL (86-94)
5105 SMDYKQTQL (174-182)
5106 RLVWACVGV (123-131)
5107 HLFNRAGTV (285-293)
5108 YLRREQMFV (275-283)
5109 TLQANKSEV (238-246)
51 12 ILEDWNFGL (426-434)
5113 TLEDTYRFV (441-449)
2016 SLWLPSEATVYL (28-39)
2017 NLASSNYFPT (31 1-320)
2018 TLTADVMTYI (408-417)
2019 YLPPVPVSKV (38-47)
2020 YDLQFIFQL (396-404)
2021 FQLCKITLT (402-410)
2022 ICWGNQLFV (349-357)
2023 KVVSTDEYV (46-54)
2024 QLFVTVVDT (354-362)
2025 GLQYRVFRI (93-101)
• Des weiteren wurden um jeweils 9 Aminosäuren überlappende 20mer-Peptide synthetisiert, welche die Sequenz des Ll und des E7 Proteins von HPV16 um- fassen. Die Peptide wurden von 1 bis 52 durchnumeriert. Ihr Name und ihre
Sequenz sind in der folgenden Tabelle zuammengefaßt, in der "restr." restringiert bedeutet,
Tabelle 2: Synthetische überlappende 20mer Peptide von HPN16 Ll und E7
Peptid Sequenz relative Epitop-
Name Position Information Ll-Peptide
1 MSL LPSEATVY PPVPVSK (1-20)
2 YLPPVPVSKWSTDEYVART (12-31)
3 STDEYVARTNIYYHAGTSRL (23-42)
4 YYHAGTSRLLAVGHPYFPIK (34-53)
5 VGHPYFPIKKPNNNKILVPK (45-64)
6 NN KILVPKVSGLQYRVFRI (56-75)
7 GLQYRVFRIHLPDPNKFGFP (67-86)
8 PDPNKFGFPDTSFYNPDTQR (78-97)
9 SFYNPDTQRLVWACVGVEVG (89-108) zvtotox. Epitop, HLA A24 restr.
10 WACVGVEVGRGQPLGVGISG (100-119)
11 QPLGVGISGHPLLNKLDDTE (111-130)
12 LLNKLDDTENASAYAANAGV (122-141)
13 SAYAANAGVDNRECISMDYK (133-152)
14 RECISMDYKQTQLCLIGCKP (144-163)
15 Q CLIGCKPPIGEH GKGSP (155-174)
16 GEH GKGSPCTNVAVNPGDC (166-185)
17 NVAVNPGDCPPLELINTVIQ (177-196)
18 LELINTVIQDGDMVDTGFGA (188-207)
19 DMNDTGFGA DFTTLQANKS (199-218)
20 FTTLQANKSEVPLDICTSIC (210-229)
21 PLDICTSICKYPDYIKMNSE (221-240)
22 PDYIKMVSEPYGDSLFFYLR (232-251)
23 GDSLFFYLRREQMFVRHLFN (243-262) 24 QMFVRHLFNRAGAVGENVPD (254-273) 25 GAVGENVPDDLYIKGSGSTA (265-284) 26 YIKGSGSTANLASSNYFPTP (276-295) 27 ASSNYFPTPSGSMVTSDAQI (287-306) T-Helfer Epitop 28 S VTSDAQIFNKPYWLQRAQ (298-317) T-Helfer Epitop 29 KPYWLQRAQGHNNGIC GNQ (309-328) 30 NNGICWGNQLFVTWDTTRS (320-339) 31 VTWDTTRSTNMSLCAAIST (331-350) 32 MSLCAAISTSETTYKNTNFK (342-361) 33 TTYKNTNFKEYLRHGEEYDL (353-372) 34 LRHGEEYDLQFIFQLCKITL (364-383) 35 IFQLCKITLTADVMTYIHSM (375-394) 36 DVMTYIHSMNSTILEDWNFG (386-405) 37 TILEDWNFGLQPPPGGTLED (397-416) 38 PPPGGTLEDTYRFVTSQAIA (408-427) 39 RFVTSQAIACQKHTPPAPKE (419-438) 40 KHTPPAPKEDPLKKYTFWEV (430-449) 41 LKKYTFWEVNLKEKFSADLD (441-460) 42 KEKFSADLDQFPLGRKFLLQ (452-471 ) 43 PLGRKFLLQAGMHGDTPTLH (463-482) zytotox. Epitop HLA AI restr.
E7-Peptide
44 MHGDTPTLHEYMLDLQPETT (1-20)
45 MLDLQPETTDLYCYEQL DS (12-31) zytotox. Epitop HLA AI restr.
46 YCYEQLNDSSEEEDEIDGPA (23-42) 47 EEDEIDGPAGQAEPDRAHYN (34-53) zytotox. Epitop HLA AI restr.
48 AEPDRAHYNIVTFCCKCDST (45-64) zytotox. Epitop HLA AI restr.
49 TFCCKCDSTLRLCVQSTHVD (56-75) 50 LCVQSTHVDIRTLEDLLMGT (67-86) 51 TLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (78-97)
Influenza Kontrollpeptid
52 KEYLRHGEEGILGFVFTLCK
• Golgi Plug ist durch Pharmingen (Hamburg, Deutschland) erhältlich.
• Monensin ist durch Sigma (Deisenhofen, Deutschland) erhältlich. • IL-2 wurde von Becton Dickinson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
• MTT-Lösung in PBS bedeutet 2,5 mg/ml 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazoliumbromid in PBS (Sigma, Deisenhofen, Deutschland).
• PBS bedeutet „phosphate buffered saline" und besteht aus 16,6 mM Na2HPO 8,4 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl pH 7,4. • Zellen wurden jeweils bei 37°C und 5% CO2 in RPMI-Medium (Gibco BRL, Eggenstein; Deutschland) mit 10% fötalem Kälberserum, Kanamycin und Ampicillin kultiviert.
• Luma-Platten und der Canberra-Packerd B-Plate Counter wurden von Canber- ra-Packerd, Dreieich, Deutschland bezogen. • FACScan calibur bedeutet 'fluorescens activated cell sorter' die Apparatur wurde von Becton Dickenson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
• Cellquest Software wurde von Becton Dickinson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
2. Peptid-spezifische TNFα-Sekretion durch CVLP-stimulierte T-Zellen
a) Herstellung CVLP-spezifischer T-Zellen
Humane T-Zellen (4χ l05) eines HLA A2.01 positiven Spenders wurden für 8 Wochen mit HPV 16 LlΛC*E7ι_55 CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml CVLPs, 10 bestrahlten periphere Blutmononukleäre Zellen (PMBC) und 10 IU/ml IL-2 stimuliert und geerntet.
b) Stimulation mit Antigenen Die Zellen wurden über Nacht in 100 μl Medium bei 37°C mit unterschiedlichen Antigenen (PMBC + E7-Peptid; PMBC + HPV16 LlΔC*E7ι.55 (CVLP); PMBC + 5104, 5105, 5106, 5107, 5108, 5109, 51 12, 5113 je 10 μg/ml) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL-2 stimuliert. Während dieser Zeit produzieren stimulierte Zellen TNFα.
c) TNFα-Nachweis
Am nächsten Tag wurden 50 μl Überstand entnommen, eingefroren, wieder aufgetaut (um evtl. mitgenommene Zellen abzutöten) und zu 50 μl einer Zellsuspension gegeben, die 0,9x 106 WEHI-Zellen, 2 μg/ml Actinomycin D und 400 mM LiCl enthielt. Die Zellen wurden für 24 h bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit leitet TNFα (sofern im Überstand enthalten) Apoptose der WEHI-Zellen ein. Durch Zugabe von 50 μl einer 2,5 mg/ml MTT-Lösung in PBS wurden innerhalb von 3 Stunden nicht apoptotische Zellen braun angefärbt, apoptotische Zellen hingegen blieben gelb. Sämtli- ehe Zellen wurden durch Zugabe von 100 μl Lysis-Puffer (34% N,N dime- thylformamide, 20% sodium dodecyl sulfate) und eine Inkubation für mindestens 6 Stunden bei 37° lysiert, so daß die Farbstoffe freigesetzt wurden. Abschließend wurde die Absorption der Lösung bei 595 nm gemessen.
Fig. 1 zeigt die unterschiedlichen Antigene aufgetragen gegen die gemessene Absorption bei 595 nm. Niedrige Absorption bedeutet geringe Farbstoffproduktion und somit viele apoptotische Zellen, die somit viel TNFα ausgesetzt waren, so daß die zugehörigen T-Zellen stimuliert worden waren. Somit war die Stimulation der T-Zellen umso besser, je niedriger die Absoφtion bei 595 nm ist.
Ergebnis: Die Peptide 5104, 5106, 5107, 5108, 5109 und 51 12 waren in der Lage, CVLP-spezifische T-Zellen zu stimulieren.
3. Bindung von Peptiden an T2 -Zellen
a) Beladung der T2-Zellen 2,5x 106 T2-Zellen eines HLA A2.01 positiven Spenders wurden in Medium enthaltend 2% humanes Serum über Nacht in Anwesenheit von 0, 10 oder 100 μg/ml 5105, 5106, 5107, 5109, 5112, 5113, InfluenzaMP, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022, 2023, 2024, 2025 Peptid bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit können passende Peptide an die unphysiolo- gisch leeren MHC-1 Moleküle binden und diese somit stabilisieren, wohingegen MHC-1 Moleküle ohne passende Peptide relativ schnell wieder in die Zelle aufgenommen werden. Somit erhöhen spezifisch bindende Peptide die Anzahl der MHC-1 Moleküle auf der Zelloberfläche.
b) Nachweis der Peptidbindung an MHC- 1 Komplexe der T2-Zellen
Am nächsten Morgen wurden die Zellen geerntet, mit PBS enthaltend 0,5% bovines Serumalbumin (BSA) gewaschen und die MHC-1 Moleküle
nachgewiesen. Dies erfolgt durch die Inkubation für 30 min auf Eis mit dem Antiköφer BB7.2, Waschen und Färbung mit einem α-Maus FITC- Antiköφer für weitere 30 min auf Eis. Die Zellen wurden erneut gewaschen, in einem FACScan calibur gemessen und mit Cellquest Software analysiert.
Fig. 2 zeigt die verschiedenen Peptide aufgetragen gegen die gemessene Fluoreszenz.
Ergebnis: T2-Zellen nach Inkubation mit den Ll -Peptiden 5106, 5107, 5109, 51 12, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020 und 2022 zeigen wie nach Inkubation mit dem bekannten Influenza-Peptid MP deutlich mehr MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche, was auf eine Bindung der entsprechenden Peptide an die MHC- Moleküle hindeutet.
Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Humane T-Zellen (4χl05) eines HLA A2.01 positiven Spenders wurden für 8 Wochen mit HPV16 L1ΛC*E7I -55 CVLPS bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg ml CVLPs sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 10 μg/ml verschiedener Antigene in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 und 0,5 μg/ml α-human CD28 restimuliert: a) über Nacht mit CVLP-inkubierten PBMC b) über Nacht mit Ll 2022-Peptid inkubierten PBMC
c) über Nacht mit Ll 2025-Peptid (Kontroll-Peptid) inkubierten
PBMC
Nach einer Stunde wurde 1 μl Golgi Plug zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-hum CD3/PE, mit α-hum CD4/Cychrome und mit α-hum Interferon γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 3 zeigt, daß die CVLP-inkubierten PBMC wie auch die mit dem Ll -Peptid 2022-inkubierten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T- Zellen bewirkten, nicht aber die mit dem Kontroll-Peptid inkubierten PBMC.
5. Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Humane T-Zellen (4x10"^) eines HLA AI positiven Spenders wurden für 5 Wochen mit HPV 16L 1ΛC*E7I_55 CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml CVLPs sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 10 μg/ml der auf der X-Achse von Fig. 4 angegebenen Peptide in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin (300 μM) zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-hum CD8/PE, mit α-hum CD4/Cychrome und mit α-
hum Interferon γ/FITC gefärbt Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert
Ergebnis Fig 4 zeigt, daß die mit den Peptiden 43, 47 und 48-ιnkubιerten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit den ubπgen Peptiden inkubierten PBMC Das Peptid 43 enthalt das 9mer-Peptιd der Sequenz MHGDTPTLH, die beiden überlappenden Peptide 47 und 48 enthalten das lOmer-Peptid der Sequenz QAEPDRAHYN, die jeweils in Käst et al (su- pra) als HLA AI bindende Peptide beschπeben wurden, für die jedoch noch kein funktioneller Nachweis geführt werden konnte
6 Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Humane T-Zellen (4x10 ) eines nicht-HLA-typisierten Spenders wurden für 6 Wochen mit HPV16Llj,c*E7ι 5i CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml CVLPs sowie 10 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 10 μg/ml der auf der X-Achse von Fig 5 angegebenen Peptide in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin (300 μM) zugegeben Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-hum CD8/PE, mit α-hum CD4/Cychrome und mit α- hum Interferon γ/FITC gefärbt Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung
in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 5 zeigt, daß die mit den Peptiden 27 und 28-inkubierten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit den übrigen Peptiden inkubierten PBMC. Die beiden überlappenden Peptide 27 und 28 enthalten das Peptid der Sequenz SMVTSDAQI, so daß das tatsächlich erkannte Peptid im wesentlichen diese Sequenz umfassen muß.
Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Humane T-Zellen (4x10 ) eines HLA AI -positiven Spenders wurden für 6 Wo- chen mit HPV16L1ΛC*E7I _55 CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml CVLPs sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet.
Die 20mer-Peptide 1 bis 51 wurden gemäß der Matrix
in Peptidpools A bis H bzw. 1 bis 7 zusammengefaßt.
Anschließend wurden die T-Zellen eines HLA AI positiven Spenders in 100 μl Medium bei 37°C mit den Peptidpools in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Dabei wurden derartige Mengen der Peptidpools eingesetzt, daß für jedes einzelne Peptid 1 μg/ml zugegeben wurde. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Golgi Plug zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-hum CD8/PE, mit α-hum CD4/Cychrome und mit α-hum Interferon γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 6 zeigt, daß die mit den Peptidpools E und 6 inkubierten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit den übrigen Peptidpools inkubierten PBMC. Die Peptidpools E und 6 enthalten gemeinsam das Peptid 45, das somit aller Voraussicht nach für die Restimulation der CVLP-stimulierte T-Zellen verantwortlich ist. Das Peptid 45 enthält wiederum das Peptid ETTDLYCY, das Käst et al. (supra) als HLA AI bindendes Peptid beschrieben hat, für das jedoch noch kein funktioneller Nachweis geführt werden konnte.
Des weiteren wurden die T-Zellen eines HLA A24 positiven Spenders mit den Peptidpools wie oben restimuliert und analysiert.
Ergebnis: Fig. 7 zeigt, daß die mit den Peptidpools A und 2 inkubierten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit den übrigen Peptidpools inkubierten PBMC. Die Peptidpools A und 2 enthalten gemeinsam das Peptid 9, das somit aller Voraussicht nach für die Restimulation der CVLP-stimulierte T-Zellen verantw örtlich ist. Die Voraussage nach Parker et al. (supra) ergibt ein potentielles Peptid für HLA A24 mit der Sequenz FYNPDTQRL, das somit voraussichtlich für die Aktivität des Peptids 9 verantwortlich ist.
8. Lvse von mit Peptid 9 belandenen BLCL-Zellen
BLCL-Zellen eines HLA A24-positiven Spenders wurden mit 5 lCr für eine Stunde bei 37°C inkubiert, dreimal mit Medium gewaschen und in 2 Aliquots aufgeteilt. Zum einen Aliquot der Zellen wurden 10 μg/ml von Peptid 9 gegeben, das ande- re Aliquot diente als Negativkontrolle in Abwesenheit eines Peptids. Anschließend wurden jeweils 2000 der Zellen (=Zielzellen) zu ansteigenden Mengen von T-Zellen (=Effektorzellen) in einem Gesamtvolumen von 150 μl gegeben. Die T- Zellen waren zuvor über 5 Wochen mit einem Gemisch aus 43 Peptiden (Peptide 1-43, je 1 μg/ml) stimuliert worden. Parallel wurden Ansätze für spontane und maximale Lyse der Zellen angesetzt. Für die spontane Lyse dienten Zielzellen, die in Medium inkubiert wurden, für die maximale Lyse dienten Zielzellen, die mit 0,5%) Triton inkubiert wurden. Die Ansätze wurden für 5 h bei 37°C inkubiert. 50 μl Überstand der Ansätze wurden auf Luma-Platten gegeben und über Nacht bei
Raumtemperatur getrocknet. Am nächsten morgen wurde die Menge an radioaktivem 51Cr mit Hilfe eines Canbeπa-Packerd B-Plate Counter bestimmt (Counts) und in Relation zu den maximal lysierten Zellen des Triton- Ansatzes gesetzt. Dabei wurden die % spezifische Lyse nach der Formel: x = 100 • (counts - spontan counts) / (maximal counts - spontan counts) bestimmt.
Fig. 8 zeigt, daß die mit dem Peptid 9 beladenen BLCL-Zellen effektiv durch die T-Zellen lysiert werden konnten, die nicht beladenen BLCL-Zellen hingegen nicht. Das Peptid 9 ist somit ein HLA A24 restringiertes zytotoxische T- Zellepitop.
Claims
Patentansprüche
1. T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL,
RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI, und/oder eine funktionell aktive Variante davon.
2. T-Zell-Epitop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte
Variante eine Sequenzhomologie zu ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI von mindestens ca.
65%, vorzugsweise mindestens ca. 75% und insbesondere mindestens ca. 85% auf Aminosäureebene besitzt.
3. T-Zell-Epitop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Variante eine strukturelle Homologie zu ILVPKVSGL, RLVWACVGV,
HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI hat.
T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das T-Zell-Epitop ein zytotoxisches T-Zell-Epitop ist.
5. Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1 bis
4, wobei die Verbindung kein natürlich vorkommendes Ll Protein eines
Papillomavirus und keine ausschließlich N-terminale oder ausschließlich
C-terminale Deletionsmutante eines natürlich vorkommenden Ll Proteins eines Papillomavirus ist.
Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein Polypeptid, insbesondere ein Fusionsprotein ist.
7. Verbindung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Verbindung ein Polypeptid von mindestens ca. 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca. 35 Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca. 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 9-13 Aminosäuren Länge ist.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine chemische, radioaktive, nicht radioaktive Isotopen und/oder Fluoreszenzmarkierung des T-Zell-Epitops und/oder des genannten Fusionsproteins, und oder eine chemische Modifikation des T- Zell-Epitops und/oder Fusionsproteins enthält.
9. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein T-Zell-Epitop oder eine Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche
5-8 kodiert.
10. Vektor, insbesondere ein Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 enthält.
1 1. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8 enthält, vorzugsweise präsentiert.
12. Zelle nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 und/oder einem Vektor gemäß Anspruch 10 transfiziert, transformiert, und/oder infiziert ist.
13. Zelle nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit min- destens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und/oder mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8, inkubiert wurde.
14. Zelle nach Anspruch 1 1 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine B-Zelle, ein Makrophage, eine dendritische Zelle, ein Fibroblast, insbesondere eine JY-, T2-, CaSki-Zelle oder EBV-transformierte Zelle ist.
15. Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1 -4 oder eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und mindestens ei- ne weitere Verbindung.
16. Komplex nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex mindestens ein MHC-Klasse I-Molekül, vorzugsweise als HLA A2.01 Te- tramer enthält.
17. Komplex nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte MHC-Klasse I Molekül ein humanes MHC-Klasse I Molekül, insbesondere ein HLA A2.01 Molekül ist.
18. Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen durch mindestens eine Verbindung, enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1 -4, das folgende Schritte enthält: a) Stimulation von Zellen mit mindestens einer genannten Verbindung; b) Zugabe von mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1 -4 präsentiert oder eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 15-17, und c) Bestimmung der Aktivierung von T-Zellen.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Schritt a) folgenden zusätzlichen Schritt a') enthält:
a') Cokultivierung der Zellen für mindestens ca. 1 Woche, insbesondere mindestens ca. 8 Wochen mit:
(i) mindestens einer Zielzelle beladen mit einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einem Komplex gemäß ei- nem der Ansprüche 15-17, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und oder mindestens einem Virus,
(ii) mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17,
(iii) und/oder mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4 präsentiert, bevor sich Schritt b) anschließt.
20. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach einem der Ansprüche 1 1 , 13, 14, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzelle mit mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und/oder mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 enthaltend ein T- Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8, inkubiert wird.
21. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach einem der Ansprüche 1 1 , 12, 14, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 und/oder einem Vektor gemäß Anspruch 10 transfiziert, transformiert und/oder infiziert wird.
22. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzelle eine B-Zelle, ein Makrophage, eine dendritische Zelle, ein Fibroblast, insbesondere eine JY-, T2-, CaSki- Zelle oder EBV-transformierte Zelle ist.
23. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von Schritt a) folgender Schritt a") durchgeführt wird: a") Gewinnung und Präparation von Proben enthaltend T-Zellen und an- schließende Kultivierung.
24. Testsystem zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen enthaltend: a) mindestens ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4, mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 1-14, und/oder mindestens einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17, und
b) Effektorzellen des Immunsystems, vorzugsweise T-Zellen, insbesondere zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen.
25. Verwendung mindestes eines T-Zell-Epitops gemäß einem der Ansprüche 1-4, mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens eines Vektors gemäß Anspruch 10, mindestens einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 1-14, und/oder mindestens eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 15-17 zur Auslösung oder zum Nachweis einer Immunantwort.
26. Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 1-14, und/oder mindestens einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
27. Arzneimittel oder Diagnostikum nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens ein Vektor gemäß Anspruch 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 1-14, und/oder mindestens ein Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 in Lösung vorliegt, an eine feste Matrix gebunden ist, und/oder mit einem Adjuvans versetzt ist.
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