EP1440147A2 - Procede d'enrichissement de cellules souches keratinocytaires - Google Patents

Procede d'enrichissement de cellules souches keratinocytaires

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EP1440147A2
EP1440147A2 EP02788031A EP02788031A EP1440147A2 EP 1440147 A2 EP1440147 A2 EP 1440147A2 EP 02788031 A EP02788031 A EP 02788031A EP 02788031 A EP02788031 A EP 02788031A EP 1440147 A2 EP1440147 A2 EP 1440147A2
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EP
European Patent Office
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cells
approximately
egf
adherent
stem cells
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02788031A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jacques Hatzfeld
Nicolas Fortunel
Antoinette Hatzfeld
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
LOreal SA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
LOreal SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, LOreal SA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1440147A2 publication Critical patent/EP1440147A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C12N5/063—Kereatinocyte stem cells; Keratinocyte progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells

Definitions

  • the invention also relates to keratinocyte stem cells having a high expansion potential.
  • a first compartment is made up of differentiated mature cells whose proliferation potential is very limited or zero (lymphocytes, macrophages, megakaryocytes, erythrocytes; keratinocytes of the suprabasal layers of the epidemic).
  • One of the aims of the invention is to provide a population of keratinocyte stem cells exhibiting a proliferation potential which is at least approximately 100 times greater than the proliferation potential of keratinocyte stem cells obtained by conventional methods.
  • preparation of keratinocytes is meant all of the keratinocytes obtained from a skin sample or from other possible sources of stem cells capable of generating skin (for example hair follicle). Adhesion takes place by deposition of the keratinocyte preparation on an adhesion substrate to which a component of extracellular matrices is adsorbed.
  • the expression “population of adherent cells with a potential for expansion greater than approximately 10” means that the population in question can be amplified by a factor greater than approximately 10 and therefore generate approximately 10 9 times more cells than it was used to initiate the cultures.
  • the expansion potential is estimated by the implementation of long-term cultures (greater than 100 days) making it possible to establish a cumulative expansion curve (by reference to the culture procedure described below in the examples).
  • the percentage of adherent cells represents approximately 5% to approximately 20%, in particular approximately 10%, of the cells contained in the preparation of keratinocytes.
  • the pre-enrichment step of the process of the invention makes it possible to obtain clonogenic cells having an expansion potential equal to or greater than approximately 5 ⁇ 10 10 .
  • mitogenic receptor is meant a receptor capable of inducing entry into mitosis and therefore of stimulating cell proliferation.
  • the mitogenic receptor is EGF-R.
  • the enrichment method according to the invention comprises:
  • the invention relates to the use of a keratinocyte stem cell composition as defined above, for skin reconstruction.
  • “Adherent” expressing the weakest EGF-R The population composed of adherent cells in 12 minutes on type I collagen was firstly separated into 2 fractions of equivalent size based on the level of expression of l 'EGF-R detectable on their surface. The fraction qualified as “EGF-R a ⁇ e ” contains 45% of the adherent keratinocytes expressing the weakest EGF-R and the fraction qualified as “ strong EGF-R” contains 45% of the adherent keratinocytes expressing the most strongly this receptor ( Figure 3). These experiments were carried out on several independent samples (n> 5).
  • IgG 2a -FITC isotypic control, Dako, Glostrup, Denmark); an anti-CD49b-PE antibody
  • mice ( ⁇ 2 integrin chain) produced in mice (labeling) (anti-human CD49b-PE mouse IgG 2a ; 12F1-H6 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) or of a non-specific control antibody of the same isotype (control isotypic) (mouse IgG 2a -PE isotypic control; G155-178 clone,
  • mice an anti-CD29-PE antibody (integrin ⁇ 1 chain) produced in mice (labeling) (anti-human CD29-FITC mouse IgGi; 4B4 clone, Coulter Corp., Miami, FL, USA) or a non-specific control antibody of the same isotype (isotypic control) (mouse IgGi-FITC isotypic control; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
  • labeling anti-human CD29-FITC mouse IgGi; 4B4 clone, Coulter Corp., Miami, FL, USA
  • a non-specific control antibody of the same isotype isotypic control
  • mouse IgGi-FITC isotypic control Becton Dickinson, San Jose, CA, USA
  • FIG. 9A shows the percentage (on the ordinate) of cells of the unfractionated population (white column), of the adherent population (12 min. On type I collagen, black column) and of the non-adherent population (12 min. on type I collagen, gray column) positive for immunological labeling of ⁇ 6 integrin.
  • FIG. 9B shows the percentage (on the ordinate) of cells of the unfractionated population (white column), of the adherent population (12 min. On type I collagen, black column) and of the non-adherent population (12 min. on type I collagen, gray column) positive for the immunological labeling of integrin c2.
  • the skin sample is cut into fragments of approximately 5mm x 5mm, then decontaminated by antibiotic treatment (Gentamycin (Life Technologies Ltd, Paisley, Scotland), 3 baths successive 10 minutes in DMEM culture medium (Life Technologies Ltd, Scotland)).
  • antibiotic treatment Genetamycin (Life Technologies Ltd, Paisley, Scotland)
  • 3 baths successive 10 minutes in DMEM culture medium (Life Technologies Ltd, Scotland)
  • the sample is then subjected to a proteolytic treatment (dispase (Boehringer, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 1 night at 4 ° C, then 30 minutes at 37 ° C).
  • the epidermis fragments separated from the dermal tissue are placed in a 0.05% trypsin-0.02% EDTA solution (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) (15 minutes at 37 ° C).
  • the preparation is agitated periodically to promote the dissociation of the cells.
  • the effect of trypsin is then neutralized by the addition of a culture medium containing 10%> of fetal calf serum (SVF) (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) (DMEM + 10% SNF).
  • SNF fetal calf serum
  • the cell suspension is placed in culture flasks "covered” with type I collagen (collagen solution I (Sigma Chemical Co Ltd, Irvine, UK) diluted by a factor of 2 in PBS, deposited for 45 minutes in the flasks, then drying after elimination of the surplus), at a density of 200,000 cells / cm 2 . After 12 minutes, the keratinocytes which have not adhered are removed by washing in PBS buffer. The adherent cells thus selected are detached from the support by gentle trypsinization (0.05% trypsin-0.02% EDTA (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) for 3 to 5 minutes at 37 ° C).
  • type I collagen collagen solution I (Sigma Chemical Co Ltd, Irvine, UK) diluted by a factor of 2 in PBS, deposited for 45 minutes in the flasks, then drying after elimination of the surplus
  • the keratinocytes are cultured in low density KGM medium (1600, 3200 and / or 4800 cells / cm 2 ) in order to obtain well-individualized clones which are easily observable under the microscope.
  • the culture medium is renewed 3 times a week until the experiments are stopped (6 to 12 days).
  • the clones are then fixed and colored, then counted and classified according to the number of cells which compose them.
  • the preparations are first fixed for 30 minutes at room temperature with formalin (formaldehyde in 35% solution) (Merck, Darmstadt, Germany) diluted to 10% in PBS buffer (BioWhittaker Inc., Walkersville, MA, USA), then washed twice with water. The cells are then incubated for 2 minutes with filtered hematoxylin (staining of the nuclei) (Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA). After rinsing with water, the preparations are air dried, then incubated for 5 minutes in eosin (Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA) at 1% in PBS buffer. They are again washed with water, then dried.
  • formalin formalin in 35% solution
  • PBS buffer BioWhittaker Inc., Walkersville, MA, USA
  • EGF receptor EGF receptor
  • the cells are incubated in the presence of a secondary antibody produced in the rat and coupled with phyco-erythrin (PE), capable of recognizing mouse antibodies (Rat anti-Mouse IgG 2a + b -PE, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) (30 minutes at 4 ° C) .
  • PE phyco-erythrin
  • the cells are again washed twice, before being used for sorting by flow cytometry (FACS Vantage, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
  • the population of adherent keratinocytes was separated into fractions with different levels of expression of EGF-R and the cells contained therein were sorted in order to characterize them from a functional point of view.
  • the cells of each sub-population, sorted by flow cytometry, are subjected to a functional test making it possible to evaluate their capacity for long-term expansion (property associated with the most primitive cells called "strains").
  • the histology is characteristic of a properly formed and differentiated epidermis: I) a basal layer containing polygonal cells oriented perpendicular to the dermal substrate, II) 3 to 4 layers of spinous cells, III) 4 to 6 layers of granular cells, and IN) a compact stratum comeum composed of horny anuclei cells.

Abstract

L'invention concerne un procédé d'enrichissement d'une population de cellules souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de kératinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 5 mn à environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par trypsination, notamment à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes.

Description

PROCEDE D'ENRICHISSEMENT DE CELLULES SOUCHES
KERATINOCYTAIRES
L'invention a pour objet un procédé d'enrichissement de cellules souches kératinocytaires.
L'invention a également pour objet des cellules souches kératinocytaires présentant un potentiel d'expansion élevé.
Le tissu hématopoïétique et la peau présentent des similitudes au niveau de leur organisation. Il s'agit de systèmes biologiques dynamiques et hiérarchisés, dans lesquels de grandes quantités de cellules matures sont continuellement produites et renouvelées, durant toute la vie de l'individu. Les cellules qui les composent peuvent être schématiquement classées dans 3 compartiments selon leur stade d'évolution. Cependant, il n'existe pas de frontières nettement définies entre ces compartiments, chacun d'eux étant en réalité constitué d'un continuum de cellules au degré de maturation variable, et donc très hétérogène.
Un premier compartiment est composé de ..cellules matures différenciées dont le potentiel de prolifération est très limité ou nul (lymphocytes, macrophages, mégacaryocytes, érythrocytes ; keratinocytes des couches suprabasales de l'épidémie).
Un deuxième compartiment englobe une population de cellules qui possèdent un potentiel de prolifération variable mais limité qu'elles perdent progressivement en s'engageant vers la différenciation (progéniteurs et précurseurs hématopoïétiques ; keratinocytes en phase transitoire d'amplification).
Un troisième compartiment est constitué de cellules rares situées en amont dans la hiérarchie de ces systèmes. Il englobe les cellules souches (cellule souche hématopoïétique ; cellule souche kératinocytaire) notamment caractérisées par le fait que, bien que demeurant majoritairement dans un état de quiescence, ces cellules possèdent un potentiel d'expansion à long terme très important, mais aussi notamment caractérisées par leur capacité d'autorenouvellement.
Le phénotype des cellules souches kératinocytaires n'étant encore qu'imparfaitement caractérisé, ces cellules demeurent à ce jour difficiles à purifier, difficiles à sélectionner, et par conséquent on ne dispose à ce jour d'aucun procédé efficace d'enrichissement de cellules souches kératinocytaires. L'un des buts de l'invention est de proposer un procédé efficace, permettant d'obtenir une population de cellules souches kératinocytaires présentant un potentiel d'expansion à long terme élevé.
L'un des buts de l'invention est de fournir une population de cellules souches kératinocytaires présentant un potentiel de prolifération supérieur d'au moins environ 100 fois au potentiel de prolifération des cellules souches kératinocytaires obtenues par les procédés classiques.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'enrichissement d'une population de cellules souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de keratinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des keratinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 5 mn à environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions^ permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par tryspination, notamment à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes.
Par « population de cellules souches kératinocytaires » on désigne une population de keratinocytes possédant un potentiel d'expansion à long terme élevé, incluant des cellules clonogéniques, et capable de reconstruire un épiderme.
Par « préparation de keratinocytes », on désigne l'ensemble des keratinocytes obtenus à partir d'un prélèvement cutané ou d'autres sources possibles de cellules souches capables de générer de la peau (par exemple follicule pileux). L'adhésion se fait par dépôt de la préparation de keratinocytes sur un substrat d'adhésion auquel un composant de matrices extracellulaires est adsorbé.
Les cellules non adhérées au substrat d'adhésion sont éliminées par lavage. Par « composant de matrices extracellulaires », on désigne notamment des molécules telles que les collagènes, la laminine, la fibronectine, les protéoglycanes (1 à 7). L'adhésion des cellules peut être notamment vérifiée en réalisant des lavages dans des conditions classiques du substrat d'adhésion. Les cellules adhérentes sélectionnées ne sont pas décollées par ce moyen. Si la durée de l'adhésion est inférieure à 5 mn, le rendement de récupération est faible, par exemple inférieur à 1% par rapport à l'ensemble des cellules contenues dans la préparation de keratinocytes.
Si la durée de l'adhésion est supérieure à 30 mn, la séparation est peu discriminative, par exemple au moins 30% des cellules contenues dans la préparation de keratinocytes sont récupérées.
Le décollement a lieu dans des conditions permettant de maintenir une bonne viabilité des cellules, c'est à dire de conserver l'ensemble des cellules vivantes (>97% de cellules vivantes après décollement). La viabilité des cellules peut être notamment déterminée la méthode d'exclusion au bleu
Trypan (8).
Le procédé de l'invention permet avantageusement d'obtenir une population de cellules adhérentes présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 109.
L'expression « population de cellules adhérentes présentant un potentiel d'expansion supérieur à environ 10 » signifie que la population en question peut être amplifiée d'un facteur supérieur à environ 10 et donc générer environ 109 fois plus de cellules qu'il en a été utilisé pour initier les cultures.
Le potentiel d'expansion est estimé par la mise en œuvre de cultures à long terme (supérieures à 100 jours) permettant d'établir une courbe d'expansion cumulée (par référence à la procédure de culture décrite ci-après dans les exemples).
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, le pourcentage de cellules adhérentes représente environ 5 % à environ 20 %, notamment environ 10 %, des cellules contenues dans la préparation de keratinocytes.
Un autre mode de réalisation avantageux concerne un procédé d'enrichissement d'une population de cellules souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de keratinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des keratinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 5 mn à environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par tryspination, notamment à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes, environ 70% des cellules adhérentes exprimant la chaîne α6 des intégrines.
L'expression de la chaîne c6 des intégrines est notamment déterminée par marquage immunophénotypique et analyse par cytométrie en flux. Selon un mode de réalisation de l'invention les cellules adhérentes expriment fortement la chaîne α6 des intégrines.
L'expression « expriment fortement la chaîne α6 des intégrines » signifie que l'intensité moyenne de fluorescence est supérieure à 55 au jour 1, selon les données d'un F.A.C.S. VANTAGE Becton Dickinson. Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans le procédé selon l'invention, la population de cellules adhérentes comprend des cellules clonogéniques, notamment à raison d'au moins environ 1 %, notamment à raison d'au moins 2 % par rapport aux cellules adhérentes.
Par « cellules clonogéniques », on désigne des cellules possédant la capacité de donner naissance à un clone cellulaire.
On peut vérifier le caractère de clonogénicité des cellules par la mise en œuvre d'un test de culture à court terme (de 6 à 12 jours) (par référence à la procédure de culture décrite ci- après dans les exemples).
L'étape de pré-enrichissement du procédé de l'invention permet d'obtenir des cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 1010.
L'expression « cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 1010 » signifie que les cellules clonogéniques contenues dans la population de cellules adhérentes possèdent en moyenne la capacité de générer une filliation d'au moins environ 5 x 1010 keratinocytes. ,; Seules les cellules clonogéniques participent effectivement à l'expansion. Comme indiqué ci-dessus, étant donné qu'environ 1% à 2% des cellules de la population adhérente sont clonogéniques, il en résulte que le potentiel d'expansion de ces cellules clonogéniques est environ 50 à 100 fois supérieur à celui estimé à l'échelle de la population cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé d'enrichissement selon l'invention, comprend, après l'étape de pré-enrichissement, une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression d'un récepteur mitogénique sur les cellules adhérentes et récupération de la fraction de cellules adhérentes qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du récepteur mitogénique, ladite expression étant mesurée par cytométrie de flux, cette fraction étant désignée par fraction « récepteur mitogénique faιble ».
L'étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression d'un récepteur mitogénique permet de séparer les cellules adhérentes en 2 fractions : une fraction désignée par fraction « récepteur mitogénique fort » qui exprime le plus fortement le récepteur mitogénique et l'autre désignée par fraction « récepteur mitogéniquefaιble » qui contient 20 % à 50 % des cellules adhérentes exprimant le plus faiblement le récepteur mitogénique.
Les résultats obtenus ont démontré de manière reproductible que les keratinocytes les plus primitifs qui possèdent le potentiel d'expansion le plus important sont significativement enrichis dans la fraction récepteur mitogéniquefaιble.
Par « récepteur mitogénique », on désigne un récepteur capable d'induire l'entrée en mitose et donc de stimuler la prolifération cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, le récepteur mitogénique est choisi dans le groupe comprenant les récepteurs de facteurs de croissance capables d'induire la prolifération de cellules souches kératinocytaires et notamment le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF-R), et le récepteur du facteur de croissance kératinocytaire (KGF-R).
Par « récepteur de facteurs de croissances capables d'induire la prolifération des cellules souches kératinocytaires », on désigne tout récepteur dont le ligand est un facteur de croissance capable de stimuler l'entrée en mitose et la prolifération des cellules souches kératinocytaires.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, le pourcentage de cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du récepteur mitogénique est d'environ 2 % à environ 5 %, par rapport aux cellules contenues dans la préparation de keratinocytes.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, le récepteur mitogénique est EGF-R.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon l'invention comprend :
- une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion sur collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 % et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes,
- une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression du récepteur EGF-R sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF-
-p faible
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon l'invention comprend : - une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion sur collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 % et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes, environ 10% desdites cellules adhérentes exprimant la chaîne α6 des intégrines,
- une étape d'enrichissement par détection duiiiveau d'expression du récepteur EGF-R sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF- Rfaible.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon l'invention comprend :
- une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion d'une préparation de keratinocytes sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des keratinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 % et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes, environ 70% desdites cellules adhérentes exprimant la chaîne α6 des intégrines,
- une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression du récepteur EGF-R sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF-
-Q faible
Dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, la fraction EGF-Rfaιble présente un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 1010. L'expression « fraction EGF-Rfaιb,e présente un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 1010 » signifie que la population de cellules adhérentes peut être amplifiée d'un facteur supérieur à environ 1010 et donc générer environ 1010 fois plus de cellules qu'il en a été utilisé pour initier les cultures.
Le potentiel d'expansion est estimé par la mise en œuvre de cultures à long terme permettant d'établir une courbe d'expansion cumulée (par référence à la procédure de culture décrite ci-après dans les exemples).
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, la fraction EGF-R aι le comprend des cellules clonogéniques, notamment au moins environ 1 % et notamment au moins environ 2 % par rapport aux cellules contenues dans la fraction EGF-R faible.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 10n.
L'expression « cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 1011 » signifie que les cellules clonogéniques contenues dans la population de cellules adhérentes EGF-Rfaι le possèdent en moyenne la capacité de générer une filliation d'au moins environ 5 x 1011 keratinocytes.
Environ 1% à 2% des cellules de la fraction EGF-R faιble sont clonogéniques, et il en résulte que le potentiel d'expansion de ces cellules est environ 50 à 100 fois supérieur à celui estimé à l'échelle de la fraction cellulaire. L'invention concerne également un procédé de culture de cellules souches kératinocytaires comprenant la mise en culture de la fraction « récepteur mitogénique faιb,e » obtenue selon le procédé défini ci-dessus, avec une densité d'ensemencement d'environ 2 500 à environ 7 000 cellules/cm2, pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi d'un décollement dans des conditions permettant le détachement des cellules dans des conditions n'altérant pas leur viabilité, et d'un repiquage, les étapes de décollement et de repiquage successives ayant lieu lorsque la densité cellulaire atteint au plus environ 120 000 cellules / cm2. La densité d'ensemencement doit être telle que l'expansion cellulaire obtenue entre 2 repiquages successifs soit la plus importante possible, c'est à dire que le nombre de cellules puisse par exemple être multiplié par environ au moins 15 lorsque les keratinocytes sont en phase de croissance exponentielle (expansion cellulaire supérieure à environ 15). Si la densité d'ensemencement est inférieure à 2 500 cellules / cm2 ou si elle est supérieure à 7 000 cellules / cm , l'expansion cellulaire obtenue entre 2 repiquages successifs (lorsque les cellules sont en phase de croissance exponentielle) est inférieure à 15 et donc non optimale.
On décolle les cellules lorsque le nombre de cellules obtenu est d'environ 120 000 cellules / cm2 afin d'éviter que les cultures atteignent un état de confluence, un tel état entraînant un engagement des cellules vers la différentiation et conduisant à un arrêt de la prolifération.
A la suite du décollement, on effectue un repiquage des cultures qui sont réensemencées à une densité comprise entre environ 2 500 et 7 000 cellules / cm2. Les étapes de décollement et de repiquage successifs sont effectués lorsque la densité cellulaire atteint au plus environ 120 000 cellules / cm2.
Le procédé de culture s'arrête lorsque le potentiel d'expansion de la population cellulaire testée est épuisé : la culture entre dans un état de sénescence et cesse spontanément de proliférer. Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé de culture de cellules souches kératinocytaires selon l'invention, l'étape de décollement a lieu dans des conditions permettant d'une part le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,05 % + EDTA 0,02 % et d'autre part le détachement de cellules les plus difficiles à détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,25 % + EDTA 0,02 %.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé de culture de cellules souches kératinocytaires comprend la mise en culture de la fraction EGF-R faιble définie ci-dessus, avec une densité d'ensemencement d'environ 2500 à environ 7000 cellules/cm2 pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi du décollement dans des conditions permettant le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, à l'aide de trypsine 0,05 % + EDTA 0,02 % et le détachement des cellules les plus difficiles à détacher à l'aide de trypsine 0,25 % + EDTA 0,02 %, et suivi du repiquage des cellules souches obtenues.
L'invention concerne une composition de cellules souches telles qu'obtenues par mise en œuvre de l'étape de pré-enrichissement telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également une composition de cellules souches telles qu'obtenues par mise en œuvre du procédé selon l'invention
L'invention concerne également une composition de cellules kératinocytaires souches comprenant des cellules souches kératinocytaires, (CSK), possédant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à 1010.
L'invention concerne également une composition de CSK telle que définie ci-dessus, dans laquelle les CSK sont viables.
L'invention concerne également une composition de cellules souches telle que définie ci-dessus, contenant des CSK à la surface desquelles le niveau d'expression d'un récepteur mitogénique est faible, le qualificatif « faible » étant défini de manière relative par rapport au profil d'expression du récepteur mitogénique observé dans la dite composition de CSK.
L'invention concerne une composition de cellules souches telle que définie ci-dessus, dans laquelle le niveau d'expression du récepteur de l'EGF (EGF-R) est faible.
L'invention concerne l'utilisation d'une composition de cellules kératinocytaires souches telle que définie ci-dessus, pour la reconstruction de peau.
Un mode de réalisation détaillé de l'invention est décrit ci-après.
1/ Pré-sélection d'une population cellulaire de cellules « adhérentes », qui représente 10% des keratinocytes totaux et englobe l'essentiel des CSKs.
1 - Sélection des cellules de la population de cellules « adhérentes » : La méthode de sélection repose sur la capacité d'adhésion des keratinocytes. Le substrat d'adhésion choisi est un support de plastique sur lequel du collagène de type I est adsorbé. On dépose les préparations de keratinocytes issus de prélèvements cutanés sur le substrat d'adhésion, puis on procède à une incubation à 37°C pendant un temps court. Les cellules n'ayant pas adhéré au support sont prélevées, puis les cellules adhérentes sont décollées par trypsination douce et récupérées séparément. Il a été déterminé qu'une durée d'incubation de 12 minutes est adaptée à la sélection d'une population enrichie en cellules capables d'initier une expansion cellulaire in vitro. Les cellules ayant adhéré sont désignées par « adhérentes ».
2 - Caractéristiques phénotypiques des cellules de la population de cellules « adhérentes » : Des analyses de l'expression de molécules de surface impliquée dans l'adhésion cellulaire ont été réalisées par cytométrie en flux sur la population non fractionnée, ainsi que sur la population de cellules adhérentes et sur la population de cellules non- adhérentes (Figure 9). On a observé que la population de cellules adhérentes est significativement enrichie en cellules exprimant la chaîne α6 des intégrines (CD49f) (environ 70% des cellules présentent l'intégrine α6 à leur surface), critère associé aux keratinocytes les plus primitifs, alors que la population de cellules non adhérentes en est moins riche (environ 30% des cellules présentent l'intégrine β à leur surface). Une expression des chaînes α2 et βl des intégrines est détectée de manière moins spécifique à la surface des cellules issues des populations totales (non-fractionnées), adhérentes, et non adhérentes.
3 - Caractéristiques fonctionnelles des cellules de la population de cellules « adhérentes » : Une statistique effectuée sur plusieurs prélèvements indépendants (n>5 expériences) montre que la population de cellules adhérentes ne représente que 10,4% des keratinocytes totaux, mais présente un enrichissement important en cellules clonogéniques (Figure 1A). En effet, la réalisation de tests clonogéniques à court terme (6 jours) sur ces deux populations de cellules indique que 2,3% des keratinocytes issus de la population de cellules non-adhérentes en 12 minutes possèdent la capacité de générer des clones sur un support de plastique alors que seulement 0,2% des cellules de la population des cellules non- adhérentes sont clonogéniques (Figure 1B .
Le contenu de chacune des populations de cellules sélectionnées par la méthode d'adhésion rapide sur collagène de type I en keratinocytes possédant un fort potentiel d'expansion, propriété plus représentative de la fonction physiologique des CSKs, a été évalué. Les résultats obtenus à partir de plusieurs prélèvements indépendants (n>5 expériences) montrent que les cellules les plus primitives, qui expriment le plus fort potentiel de prolifération à long terme, sont enrichies dans la population de cellules adhérentes (Figure 2). En effet, les cellules contenues dans cette population permettent d'obtenir une expansion cumulée supérieure à celle de la population totale. En revanche, la population des cellules non adhérentes apparaît majoritairement constituée de keratinocytes plus tardifs, et n'exprime qu'un potentiel de prolifération plus réduit. 11/ Tri d'une fraction de cellules dites « adhérentes EGF-Rfalble » qui représente 20% à 45% des cellules de la population de cellules « adhérentes », donc 2% à 4,5% des keratinocytes totaux, et englobe l'essentiel des CSKs.
1 - Fraction de cellules composée de 45% des cellules de la population de cellules
« adhérentes » exprimant le plus faiblement l'EGF-R : La population composée des cellules adhérentes en 12 minutes sur collagène de type I a tout d'abord été séparée en 2 fractions de taille équivalente sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R détectable à leur surface. La fraction qualifiée de « EGF-R aι e » contient 45% des keratinocytes adhérents exprimant le plus faiblement l'EGF-R et la fraction qualifiée de « EGF-Rfort » contient 45% des keratinocytes adhérents exprimant le plus fortement ce récepteur (Figure 3). Ces expériences ont été réalisées sur plusieurs prélèvements indépendants (n>5). Les résultats obtenus démontrent de manière reproductible que les keratinocytes les plus primitifs qui possèdent le potentiel d'expansion le plus important sont significativement enrichis dans la fraction EGF-Rfelble (Figure 4). Ceci corrèle avec l'observation microscopique des cellules à différents temps de culture, qui révèle une production de keratinocytes de petite taille indifférenciés à plus long terme dans les cultures initiées à partir de la fraction EGF-Rfaιble (Figure 5), critère associé aux keratinocytes primitifs (9).
2 - Fraction composée de 20% des cellules de la population de cellules « adhérentes » exprimant le plus faiblement l'EGF-R : La population de cellules adhérentes a finalement été séparée en 4 fractions de taille équivalente sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R détectable à la surface des cellules.
Quatre fractions de représentativité égale et comprenant chacune 20% des cellules de cette population ont été définies comme fractions « EGF-R" + », « ÈGF-R"1-1" », « EGF-R*"1"1" », et « EGF-R"^ » (Figure_6) : les fractions dites « EGF-R" + » et « EGF-R"" » sont incluses dans la fraction EGF-Rfa, le et contiennent chacune 20% des cellules de la population adhérente ; les fractions dites « EGF-R+++ » et « EGF-R++++ » sont incluses dans la fraction EGF-Rfort et contiennent chacune 20% des cellules de la population adhérente. On a observé une proportionnalité inverse entre le niveau d'expression de l'EGF-R à la surface des cellules ainsi sélectionnées, et leur potentiel de prolifération à long terme (Figure 7). En effet, l'expansion cumulée la plus importante est obtenue à partir de la fraction EGF-R" + alors que la valeur obtenue à partir de la fraction EGF-R1 s'avère la moins élevée. Les fractions EGF-R*"1" et EGF-R""-1" se comportent de manière intermédiaire (n>3 expériences indépendantes réalisées).
Ces résultats expérimentaux valident la possibilité d'utiliser un récepteur de facteur de croissance mitogénique (récepteur à tyrosine kinase de l'EGF) comme marqueur phénotypique pour sélectionner une fraction de keratinocytes significativement enrichie en CSKs.
111/ Evaluation optimale du potentiel d'expansion à long ternie des populations de keratinocytes sélectionnées.
1 - Trypsination ménagée des cellules lors des repiquages successifs : L'objectif est de limiter le stress occasionné aux cellules lors des décollements et repiquages successifs des cultures à long terme, problème qui pourrait conduire à une sous estimation de leur potentiel. On effectue tout d'abord un traitement protéolytique ménagé (trypsine 0,05%-EDTA 0,02%) qui permet le décollement d'une partie des cellules tout en évitant de les soumettre à un traitement protéolytique trop drastique qui pourrait altérer leur viabilité. Les cellules les plus difficiles à détacher pour lesquelles la protéolyse douce s'est avérée inefficace sont ensuite soumises à un traitement protéolytique plus fort (trypsine 0,25%-EDTA 0,02%), ce qui permet finalement de récupérer l'ensemble de la population. Une étude comparative de l'impact de différentes méthodes de décollement sur la viabilité des cellules a été réalisée.
2 - Densité d'ensemencement des flacons de culture adaptée pour une expansion optimale des keratinocytes : Afin d'évaluer quelles densités d'ensemencement sont compatibles avec une bonne mise en évidence du potentiel d'expansion des cellules testées, lors de l'initiation des cultures à long terme ainsi qu'à chaque repiquage successif, on a réalisé des expériences sur une durée de 7 jours. Celles-ci ont permis de déterminer que des densités d'ensemencement comprises entre 2500 et 7000 cellules / cm2 sont les plus adaptées puisqu'elles permettent d'obtenir une expansion cellulaire d'un facteur 15 à 20, alors que des densités d'ensemencement inférieures et supérieures donnent de moins bons résultats. Figures 1A et 1B : Représentativité et clonogénicité des populations cellulaires de cellules « adhérentes » et de cellules « non adhérentes ».
Les figures 1A et 1B montrent l'enrichissement en cellules clonogéniques obtenu après sélection par la méthode d'adhésion sur collagène de type I.
Les keratinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été séparés en une population cellulaire dite « adhérente » et une population dite « non adhérente » par une étape d'adhésion de 12 minutes sur du collagène de type I. La représentativité de chaque fraction par rapport à la population cellulaire totale a été évaluée, ainsi que leur contenu en keratinocytes clonogéniques.
Sur la figure 1 A, on a représenté le pourcentage de cellules constituant la population de cellules adhérentes par rapport aux cellules totales (colonne hachurée) et le pourcentage de cellules constituant la population de cellules non adhérentes par rapport aux cellules totales (colonne pleine). Sur la figure 1B, on a représenté le pourcentage de cellules clonogéniques respectivement dans la population de cellules adhérentes (colonne hachurée) et dans la population de cellules adhérentes (colonne pleine).
Les résultats obtenus montrent que la population cellulaire dite « adhérente » est significativement enrichie en cellules clonogéniques, puisqu'elle ne représente que 10% des keratinocytes totaux mais contient un pourcentage de cellules clonogéniques 10 fois plus élevé que celui de la population dite « non adhérente ».
Figure 2 : Comparaison du potentiel d'expansion des keratinocytes contenus dans la population non fractionnée, des populations de cellules « adhérentes » et « non adhérentes ».
Les keratinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été séparés en une population cellulaire dite « adhérente » et une population dite « non adhérente » par une étape d'adhésion de 12 minutes sur du collagène de type I. Les cellules contenues dans les 2 populations, ainsi que celles de la population totale non fractionnée, ont été soumises à un test de culture à long terme (nombre total cumulé de cellules produites), afin de comparer leur potentiel d'expansion.
On a représenté en abscisses le temps (exprimé en nombre de jours) et en ordonnées l'expansion cumulée (nombre de cellules produites au jour X / nombre de cellules au jour 1). La courbe avec des carrés noirs correspond aux résultats obtenus à partir des cellules de la population totale, celles avec des triangles à partir des cellules de la population adhérente (12 minutes sur collagène I) et celles avec des ronds à partir des cellules de la population non- adhérente (12 minutes sur collagène I). Les résultats obtenus montrent que la population cellulaire dite « adhérente » contient l'essentiel des cellules primitives à fort potentiel d'expansion, alors que la population cellulaire dite « non adhérente » est majoritairement composée de keratinocytes plus tardifs qui n'expriment qu'un potentiel d'expansion réduit.
Figures 3A et 3B : Séparation de la population de keratinocytes de cellules
« adhérentes » en 2 fractions sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R.
Des keratinocytes de la fraction dite « adhérente », pré-enrichie en cellules primitives par une étape d'adhésion sur collagène de type I, ont été marqués par un anticorps fluorescent dirigé contre l'EGF-R (anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de l'EGF-R). Le signal a été analysé de manière semi-quantitative par cytométrie en flux
La figure 3 A présente un profil de marquage représentatif de l'EGF-R obtenu à partir de keratinocytes de la fraction adhérente (surface la plus sombre), ainsi que le profil contrôle correspondant (surface la plus claire). L'axe des abscisses représente l'intensité de fluorescente mesurée par cytométrie en flux et exprimée en échelle logarithmique. L'axe des ordonnées représente la distribution des cellules analysées en fonction de l'intensité du signal fluorescent mesuré.
La figure 3B permet de visualiser la distribution Gaussienne du niveau d'expression de l'EGF-R à la surface des keratinocytes de la fraction adhérente (axes des abscisses et ordonnées identiques à ceux de la figure 3A). Les résultats obtenus montrent une distribution du signal suffisamment étalée pour permettre le tri de cellules exprimant soit faiblement l'EGF-R, soit fortement ce récepteur. Le profil présenté illustre une séparation de la population adhérente en 2 fractions : l'une, dite « EGF-Rfaιble », contient 45% des cellules adhérentes exprimant le plus faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rfort », contient 45% des cellules adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à leur surface. Figure 4 : Comparaison du potentiel d'expansion à long terme des keratinocytes contenus dans les fractions de phénotype " EGF-Rfaible " et " EGF-Rfort ".
Les keratinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-enrichis en cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis séparés en 2 fractions : l'une, dite « EGF-Rfa,ble », contient 45% des cellules adhérentes exprimant le plus faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rfor », contient 45% des cellules adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à leur surface. Le potentiel d'expansion à long terme (nombre total cumulé de cellules produites) de ces 2 fractions a été comparé. L'axe des abscisses correspond au temps de culture exprimé en jours et l'axe des ordonnées à l'expansion cumulée déjà définie.
La courbe avec des carrés noirs correspond aux résultats obtenus à partir des cellules de la fraction EGF-Rfaιble et celle avec des losanges à partir des cellules de la fraction EGF-Rfort.
Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-Rf ιble » contient l'essentiel des cellules primitives à fort potentiel d'expansion, alors que les cellules de la fraction cellulaire dite « EGF-R ort » possèdent un potentiel d'expansion moins important.
Figures 5A, 5B, 5C et 5D : Cultures issues des fractions " EGF-Rfaible " et " EGF-Rfort ".
La figure 5 A correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rfa,ble (Jour 34 de culture) La figure 5B correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rfort (Jour 34 de culture) La figure 5C correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rfaιb,e (Jour 70 de culture) La figure 5D correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rfort (Jour 70 de culture)
Les keratinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-enrichis en cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis séparés en deux fractions : l'une, dite « EGF-R aιble », contient 45% des cellules adhérentes exprimant le plus faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rfort », contient 45% des cellules adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à leur surface. La production de cellules de petite taille, critère associé aux CSKs, a été suivie au cours du temps par observation microscopique dans les cultures issues de chacune de ces 2 fractions. Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-Rfa,ble » assure une production plus prolongée de cellules primitives de petite taille que la fraction cellulaire dite « EGF-Rfort ».
Figure 6 : Séparation de la population de keratinocytes « adhérente » en 4 fractions sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R.
Des keratinocytes de la population dite « adhérente », pré-enrichie en cellules primitives par une étape d'adhésion sur collagène de type I, ont été marqués par un anticorps fluorescent dirigé contre l'EGF-R (anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de l'EGF-R). Le signal a été analysé de manière semi-quantitative par cytométrie en flux.
L'axe des abscisses représente l'intensité de fluorescente mesurée par cytométrie en flux et exprimée en échelle logarithmique. L'axe des ordonnées représente la distribution des cellules analysées en fonction de l'intensité du signal fluorescent mesuré.
Le profil de cytométrie en flux présenté illustre une séparation de la population adhérente en 4 fractions : les fractions dites « EGF-R" + » et « EGF-R++ » sont incluses dans la fraction EGF-Rfaιble et contiennent chacune 20%> des cellules de la population adhérente ; les fractions dites « EGF-R+++ » et « EGF-R**** » sont incluses dans la fraction EGF-Rfort et contiennent chacune 20%> des cellules de la population de cellules adhérentes.
Figure 7 : Comparaison du potentiel d'expansion à long terme des keratinocytes contenus dans les fractions de phénotype " EGF-R" + ", " EGF-R** ", " EGF-R*** ", et " EGF-R**** ".
Les keratinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-enrichis en cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis séparés en 4 fractions : 2 fractions extrêmes contenant respectivement 20% des cellules exprimant le plus faiblement et fortement l'EGF-R, « EGF-R/+ » et « EGF-R**** », ainsi que 2 fractions présentant des marquages intermédiaires « EGF-R** » et « EGF-R*** ». Le potentiel d'expansion à long terme de ces 4 fractions a été comparé (nombre total cumulé de cellules produites). La courbe avec des triangles noirs correspond aux résultats obtenus à partir des cellules de la fraction EGF-R" +, celle avec des losanges à partir des cellules de la fraction EGF-R**, celle avec des ronds à partir des cellules de la fraction EGF-R***, celle des carrés à partir des cellules de la fraction EGF-R****.
Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-R" + » est la plus enrichie en cellules primitives possédant un fort potentiel d'expansion à long terme.
Figures 8A, 8B, 8C et 8D : Capacité des cellules primitives Adh***EGF-Rfaible à générer in vitro un épiderme pluristratifié.
Le substrat de culture utilisé est un derme humain dévitalisé et exempt d'épiderme, préparé suivant la méthode décrite par Régnier et al, (1981) (10). Les keratinocytes issus des différentes sous-populations, Adh***EGF-Rfort (4 ou 7 passages successifs de cultures) ou Adh***EGF-Rfaι le (4 ou 7 passages successifs de cultures), ont été déposés sur ce substrat dermique et cultivés pendant 6 jours dans du milieu DMEM/Ham F 12 (invitrogen), contenant 10%> de sérum de veau fœtal (Invitrogen) ; lO ng/ml d'EGF (BD Biosciences, USA) ; 0,4 μg/ml d'hydrocortisone (Sigma Chemical Co) ; 10"6 M de isoprotérénol (Sigma Chemical Co.) ; 5 μg/ml de transferrine (Sigma Chemical Co.) ; 2xl0"9 M de triiodothyronine (Sigma Chemical Co.) ; LδxlO"4 M d'adénine (Sigma Chemical Co.), et 5 μg/ml d'insuline (Sigma Chemical Co.). Les cultures ont ensuite été placées à l'interface air-liquide et poursuivies en absence d'isoprotérénol, de transferrine, de triiothyronine et d'adénine. L'analyse histologique des épidémies reconstruits a été effectuée 7 jours plus tard. (NR. Adh*** signifie qu'il s'agit de keratinocytes issus de la population adhérente suite au pré-enrichissement).
La figure 8A montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré à partir de keratinocytes Adh***EGF-Rfaιble au passage 4. L'épiderme obtenu est correctement formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 μm, est graduée tous les 10 μm.
La figure 8B montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré à partir de keratinocytes Adh***EGF-R ort au passage 4. L'épiderme obtenu est correctement formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 μm, est graduée tous les 10 μm. La figure 8C montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré à partir de keratinocytes Adh***EGF-R aι le au passage 7. L'épiderme obtenu est correctement formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 μm, est graduée tous les 10 μm.
La figure 8D une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré à partir de keratinocytes Adh***EGF-Rfort au passage 7. L'épiderme obtenu est dégénératif. L'échelle représentée, de taille maximale 100 μm, est graduée tous les 10 μm.
Les résultats montrent que le potentiel organogénique de la sous-population Adh***EGF-Rfa,ble est plus durable que celui des keratinocytes de la sous-population Adh***EGF-Rfort.
Figures 9A, 9B et 9C : phénotypage par cytométrie en flux de la population non fractionnée de keratinocytes et des fractions adhérentes et non-adhérentes obtenue après le pré-enrichissement.
Les marquages immuno-phénotypiques sont réalisés sur des échantillons de 50 000 cellules en suspension dans du PBS/BSA à 0,2%. Afin de limiter la fixation non spécifique d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma globulines " issues de la même espèce que les anticorps utilisés pour les marquages (Rat γ globulin ou
Mouse γ globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech, Marseille,
France) pendant 10 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à 4°C en présence d'un anticorps anti-CD49f-FITC (intégrine chaîne α6) produit chez le rat
(marquage) (anti-human CD49f-FITC rat IgG2a ; GoH3 clone, Pharmingen, San Diego, CA,
USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (rat
IgG2a-FITC isotypic control, Dako, Glostrup, Denmark) ; d'un anticorps anti-CD49b-PE
(intégrine chaîne α2) produit chez la souris (marquage) (anti-human CD49b-PE mouse IgG2a ; 12F1-H6 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgG2a-PE isotypic control; G155-178 clone,
Pharmingen, San Diego, CA, USA) ; d'un anticorps anti-CD29-PE (intégrine chaîne βl) produit chez le la souris (marquage) (anti-human CD29-FITC mouse IgGi ; 4B4 clone, Coulter Corp., Miami, FL, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgGi-FITC isotypic control; Becton Dickinson, San José, CA, USA). Les cellules sont ensuite lavées en PBS/BSA avant d'être analysées par cytométrie en flux. Pour chaque échantillon, les statistiques sont effectuées sur au moins 10 000 événements comptabilisés.
La Figure 9 représente le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (avant passage sur collagène, colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique des intégrines α6, α2 et βl. Ces résultats sont les moyennes et les écarts types obtenus pour 3 expériences indépendantes.
La Figure 9A montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique de l'intçgrine α6.
La Figure 9B montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique de l'intégrine c2.
La Figure 9C montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique de l'intégrine βl.
Les résultats montrent qu'environ 70% des cellules de la population de cellules adhérentes expriment l'intégrine α6 alors qu'environ 40%> des cellules de la population non- fractionnée expriment cette intégrine et que seulement environ 30% des cellules de la population non-adhérente l'expriment. EXEMPLES
1/ Isolement des keratinocytes à partir d'un prélèvement cutané (prépuce).
Après élimination du tissu sous-cutané à l'aide d'un scalpel, le prélèvement cutané est découpé en fragments d'environ 5mm x 5mm, puis décontaminé par un traitement antibiotique (Gentamycine (Life Technologies Ltd, Paisley, Scotland), 3 bains successifs de 10 minutes dans du milieu de culture DMEM (Life Technologies Ltd, Scotland)). Pour permettre la séparation du derme de l'épiderme, le prélèvement est ensuite soumis à un traitement protéolytique (dispase (Boehringer, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 1 nuit à 4°C, puis 30 minutes à 37°C). Les fragments d'épiderme séparés du tissu dermique sont placés dans une solution de trypsine 0,05%-EDTA 0,02% (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) (15 minutes à 37°C). La préparation est agitée périodiquement pour favoriser la dissociation des cellules. L'effet de la trypsine est ensuite neutralisé par l'ajout d'un milieu de culture contenant 10%> de sérum de veau fœtal (SVF) (Sigma- Aldrich, St Quentin Fallavier, France) (DMEM+10%SNF). La suspension cellulaire est homogénéisée, puis lavée dans du milieu de culture pour keratinocytes (Keratinocyte growth médium, KGM) (KGM Bullet Kit, BioWhittaker, Clonetics Corp., San Diego, CA, USA). Les cellules en suspension sont comptées au microscope à l'aide d'une cellule de Malassez. La viabilité des échantillons est estimée par la méthode d'exclusion au bleu Trypan (Life Technology, Cergy Pontoise Cedex, France).
11/ Enrichissement d'une préparation de keratinocytes en cellules primitives de la couche basale de l'épiderme. La couche basale de l'épiderme contient les keratinocytes les plus primitifs dits " souches ". Ces cellules peuvent être séparées des keratinocytes plus matures sur la base de leur propriété d'adhésion rapide. Cette étape permet un pré-enrichissement de la préparation en cellules primitives.
La suspension cellulaire est placée dans des flacons de culture « recouverts » avec du collagène de type I (solution de collagène I (Sigma Chemical Co Ltd, Irvine, UK) diluée d'un facteur 2 dans du PBS, déposée pendant 45 minutes dans les flacons, puis séchage après élimination du surplus), à une densité de 200 000 cellules/cm2. Après 12 minutes, les keratinocytes n'ayant pas adhéré sont éliminés par lavage en tampon PBS. Les cellules adhérentes ainsi sélectionnées sont détachées du support par une trypsination douce (trypsine 0,05%-EDTA 0,02% (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant 3 à 5 minutes à 37°C). Après neutralisation de la trypsine (DMEM+10%SVF), les cellules sont récupérées, lavées, puis remises en suspension dans du milieu KGM. La fraction des cellules adhérentes sélectionnée par cette méthode représente environ 10%> des keratinocytes totaux de l'épiderme.
111/ Tests clonogéniques à court terme.
Les keratinocytes sont cultivés dans du milieu KGM à faible densité (1600, 3200 et/ou 4800 cellules/cm2) afin d'obtenir des clones bien individualisés et aisément observables au microscope. Le milieu de culture est renouvelé 3 fois par semaine jusqu'à l'arrêt des expériences (6 à 12 jours). Les clones sont alors fixés et colorés, puis comptés et classés suivant le nombre de cellules qui les composent.
Pour la coloration, les préparations sont tout d'abord fixées pendant 30 minutes à température ambiante avec de la formaline (aldéhyde formique en solution 35%) (Merck, Darmstadt, Germany) diluée à 10% dans du tampon PBS (BioWhittaker Inc., Walkersville, MA, USA), puis lavées 2 fois à l'eau. Les cellules sont ensuite incubées pendant 2 minutes avec de l'hématoxyline filtrée (coloration des noyaux) (Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA). Après rinçage à l'eau, les préparations sont séchées à l'air, puis incubées pendant 5 minutes dans de l'éosine (Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA) à 1% dans du tampon PBS. Elles sont à nouveau lavées à l'eau, puis séchées.
TV/ Phénotypage par cytométrie en flux de la population non-fractionnée de keratinocytes, des fractions adhérentes et non-adhérentes obtenues après le préenrichissement.
Les marquages immuno-phénotypiques sont réalisés sur des échantillons de 50 000 cellules en suspension dans du PBS/BSA à 0,2%. Afin de limiter la fixation non spécifique d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma globulines " issues de la même espèce que les anticorps utilisés pour les marquages (Rat γ globulin ou Mouse γ globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France) pendant 10 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à 4°C en présence d'un anticorps anti-CD49f-FITC (intégrine chaîne α6) produit chez le rat (marquage) (anti-human CD49f-FITC rat IgG2a ; GoH3 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (rat IgG2a-FITC isotypic control, Dako, Glostrup, Denmark); d'un anticorps anti-CD49b-PE (intégrine chaîne α2) produit chez la souris (marquage) (anti-human CD49b-PE mouse IgG2a ; 12F1-H6 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgG2a-PE isotypic control; G155-178 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ; d'un anticorps anti-CD29-PE (intégrine chaîne βl) produit chez le la souris (marquage) (anti-human CD29-FITC mouse IgGi ; 4B4 clone, Coulter Corp., Miami, FL, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgGi-FITC isotypic control; Becton Dickinson, San José, CA, USA). Les cellules sont ensuite lavées en PBS/BSA avant d'être analysées par cytométrie en flux. Pour chaque échantillon, les statistiques sont effectuées sur au moins 10 000 événements comptabilisés.
Les résultats présentés dans la Figure 9 indiquent que la population de cellules adhérentes sur le collagène de type I exprime fréquemment l'intégrine α6 (environ 10% des cellules positives) par rapport à la population non-fractionnée (environ 40% des cellules positives) et à la population non-adhérente (environ 30% des cellules positives). La population de cellules adhérentes présente donc un enrichissement significatif en intégrines de type α6 par rapport à la population non fractionnée. Par comparaison, les intégrines α2 et βl ne sont pas des marqueurs adaptés pour l'évaluation de l'enrichissement obtenu car la majorité des cellules des trois populations (non-fractionnée, adhérente, non-adhérente) exprime ces intégrines.
V/ Marquage du récepteur de l'EGF (EGF-R) pour analyse et tri par cytométrie en flux.
Les cellules en suspension sont centrifugées et reprises dans du tampon PBS contenant 0,2% de sérum albumine bovine (BSA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) (PBS/BSA 0,2%o). Afin de limiter la fixation non spécifique d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma globulines de rat " (Rat γ globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France) pendant 10 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à 4°C en présence d'un anticorps anti-EGF-R (domaine extracellulaire) non conjugué produit chez la souris (marquage) (anti- human EGF-R mouse IgG b; EGFRl clone, Dako, Glostrup, Denmark) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype que l'anticorps anti-EGF-R (contrôle isotypique) (mouse IgG2b isotypic control, Immunotech, Marseille, France). Après 2 lavages successifs en PBS/BSA 0,2%), les cellules sont incubées en présence d'un anticorps secondaire produit chez le rat et couplé à la phyco-érythrine (PE), capable de reconnaître les anticorps de souris (Rat anti-Mouse IgG2a+b-PE, Becton Dickinson, San José, CA, USA) (30 minutes à 4°C). Les cellules sont à nouveau lavées 2 fois, avant d'être utilisées pour le tri par cytométrie en flux (FACS Vantage, Becton Dickinson, San José, CA, USA). On a séparé la population de keratinocytes adhérents en fractions présentant différents niveaux d'expression de l'EGF-R et trié les cellules qu'elles contiennent afin de les caractériser d'un point de vue fonctionnel.
VI7 Evaluation du potentiel d'expansion à long terme des fractions de keratinocytes triées par cytométrie en flux.
Les cellules de chaque sous-population, triées par cytométrie en flux, sont soumises à un test fonctionnel permettant d'évaluer leur capacité d'expansion à long terme (propriété associée aux cellules les plus primitives dites "souches").
Après estimation de la viabilité par la méthode d'exclusion au bleu Trypan, 60 000 cellules de chaque sous-population sont ensemencées dans des flacons de culture non "recouverts", d'une surface de 25 cm2. Le milieu de culture (KGM) est changé 3 fois par semaine. Les cellules sont décollées de leur support, comptées et réensemencées à raison de 60 000 cellules viables par flacon de 25 cm2 lorsque les cultures atteignent 70-80% de confluence, afin d'éviter que les cellules ne s'engagent vers la différenciation suite à des phénomènes d'inhibition de contact. Le décollement des cellules est réalisé en 2 étapes successives. Il s'agit tout d'abord d'une trypsination douce (trypsine 0,05%-EDTA 0,02% (Biological industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant 3 à 5 minutes à 37°C) qui permet de détacher environ 80%> des cellules. Les cellules les plus difficiles à détacher pour lesquelles la protéolyse douce s'est avérée inefficace sont ensuite soumises à une trypsination plus forte (trypsine 0,25%-EDTA 0,02%» (Biological industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant 5 minutes à 37°C) qui permet de récupérer l'ensemble de la population cellulaire.
A chaque passage, l'expansion cumulée obtenue est calculée pour chaque culture (nombre de cellules produites au jour X / nombre de cellules ensemencées au jour 1). Les expériences sont poursuivies jusqu'à épuisement du potentiel de prolifération des cellules. Les résultats sont présentés sous la forme d'une courbe d'expansion cumulée qui permet de visualiser le potentiel de prolifération total de chacune des sous-populations cellulaires testées. VU/ Capacité des cellules souches épidermiques sélectionnées à générer in vitro un épiderme reconstruit.
Une autre caractéristique des keratinocytes Adh***EGF-Rfaιble qui a été évaluée est leur potentiel organogénique, c'est à dire leur capacité à générer in vitro un épiderme pluristratifié (N.B. Adh*** signifie qu'il s'agit de keratinocytes issus de la population adhérente suite au pré-enrichissement). Des keratinocytes des sous-populations Adh***EGF-Rfort et Adh***EGF-Rfaιble ont été cultivés durant 7 passages successifs. A chaque passage, une partie des cellules amplifiées a été prélevée pour être ensemencée sur un substrat dermique. Aux passages précoces (passage 4), les keratinocytes issus des cultures initiées avec des cellules Adh***EGF-Rfort et avec des cellules Adh***EGF-Rfaιble ont montré une bonne capacité à produire un épiderme de bonne qualité (Figure 8A, Figure 8B). Dans les deux cas, l'histologie est caractéristique d'un épiderme correctement formé et différencié: I) une couche basale contenant des cellules polygonales orientées perpendiculairement au substrat dermique, II) 3 a 4 couches de cellules spineuses, III) 4 a 6 couches de cellules granuleuses, et IN) un stratum comeum compact composé de cellules cornées anucleées. A un nombre de passages plus élevé (passage 7), il a été observé que seulement les keratinocytes issus de la sous- population Adh***EGF-Rfaιb e demeurent capables de générer un épiderme (Figure 8C), les cultures issues de la sous-population Adh**+EGF-Rfort ne produisant plus qu'un épiderme dégénératif (Figure 8D). Ces résultats démontrent le potentiel organogénique de la sous- population Adh***EGF-Rf ιble plus durable que celui des keratinocytes de la sous-population Adh***EGF-Rf0,t.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'enrichissement d'une population de cellules souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de keratinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des keratinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 5 mn à environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par trypsination, notamment à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes.
2. Procédé d'enrichissement selon la revendication 1, dans lequel la population des cellules adhérentes présente un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 109.
3. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel le pourcentage de cellules adhérentes représente environ 5 %o à environ 20 %, notamment environ 10 %>, des cellules contenues dans la préparation de keratinocytes.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel environ 70 % des cellules adhérentes exprime la chaîne α6 des intégrines.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la population de cellules adhérentes comprend des cellules clonogéniques, notamment à raison d'au moins environ 1 %, notamment à raison d'au moins environ 2 %> par rapport aux cellules adhérentes.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel les cellules clonogéniques présentent un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 1010.
7. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant, après l'étape de pré-enrichissement, une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression d'un récepteur mitogénique sur les cellules adhérentes et récupération de la fraction de cellules adhérentes qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du récepteur mitogénique, ladite expression étant mesurée par cytométrie de flux, cette fraction étant désignée par fraction « récepteur mitogénique fa,ble ».
8. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le récepteur mitogénique est choisi dans le groupe comprenant les récepteurs de facteurs de croissance capables d'induire la prolifération de cellules souches kératinocytaires et notamment le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF-R), et le récepteur du facteur de croissance kératinocytaire (KGF-R).
9. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel le pourcentage de cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du récepteur mitogénique est d'environ 2 %> à environ 5 %>, par rapport aux cellules contenues dans la préparation de keratinocytes.
10. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel le récepteur mitogénique est EGF-R.
11. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant :
- une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion sur collagène d'une préparation de keratinocytes, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 % et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes,
- une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression du récepteur EGF-R sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 %ι des cellules adhérentes présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF-
TJ faible
12. Procédé d'enrichissement selon la revendication 11, dans lequel la fraction EGF- R aι présente un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 1010.
13. Procédé d'enrichissement selon la revendication 12, dans lequel la fraction EGF- Rfaιble comprend des cellules clonogéniques, notamment au moins environ 1 % et notamment au moins environ 2 % par rapport aux cellules contenues dans la fraction EGF-Rfaιble.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel les cellules clonogéniques présentent un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 1011.
15. Procédé de culture de cellules souches kératinocytaires comprenant la mise en culture de la fraction « récepteur mitogénique fa,ble » obtenue selon les revendications 7 à 14, avec une densité d'ensemencement d'environ 2 500 à environ 7 000 cellules/cm2, pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi d'un décollement dans des conditions permettant le détachement des cellules dans des conditions n'altérant pas leur viabilité, et d'un repiquage, les étapes de décollement et de repiquage successives ayant lieu lorsque la densité cellulaire atteint au plus environ 120 000 cellules / cm2.
16. Procédé de culture de cellules souches kératinocytaires selon la revendication 15, dans lequel l'étape de décollement a lieu dans des conditions permettant d'une part le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,05 % + EDTA 0,02 % et d'autre part le détachement de cellules les plus difficiles à détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,25 % + EDTA 0,02 %.
17. Procédé de culture de cellules souches kératinocytaires comprenant la mise en culture de la fraction EGF-Rfaιble obtenue selon la revendication 11, avec une densité d'ensemencement d'environ 2500 à environ 7000 cellules/cm2 pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi du décollement dans des conditions permettant le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, à l'aide de trypsine 0,05 % + EDTA 0,02 % et le détachement des cellules les plus difficiles à détacher à l'aide de trypsine 0,25 %> + EDTA 0,02 %, et suivi du repiquage des cellules souches obtenues.
18. Composition de cellules souches telles qu'obtenues par mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 6 ou par mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 7 à 17.
19. Composition de cellules kératinocytaires souches comprenant des cellules souches kératinocytaires, (CSK), possédant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à 1010.
20. Composition de CSK selon l'une des revendications 18 ou 19, dans laquelle les CSK sont viables.
21. Composition de cellules souches selon l'une des revendications 18 à 20, contenant des CSK à la surface desquelles le niveau d'expression d'un récepteur mitogénique est faible.
22. Composition de cellules souches selon la revendication 21, dans laquelle le niveau d'expression du récepteur de l'EGF (EGF-R) est faible.
23. Utilisation d'une composition de cellules kératinocytaires souches selon l'une des revendications 18 à 22, pour la reconstruction de peau.
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