WO1983003363A1 - Chromatographic method for isolating macromolecules - Google Patents

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WO1983003363A1
WO1983003363A1 PCT/DE1983/000056 DE8300056W WO8303363A1 WO 1983003363 A1 WO1983003363 A1 WO 1983003363A1 DE 8300056 W DE8300056 W DE 8300056W WO 8303363 A1 WO8303363 A1 WO 8303363A1
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Detlev Riesner
Metin Colpan
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Description

Chromatografisches Verfahren zur Isolierung von Makromolekülen
Die Erfindung betrifft ein chromatografisches Verfahren, bei dem Hohlräume enthaltende Trägermaterialien und Oberflächenmodifizierung der Trägermaterialien für spezielle Trennprobleme optimiert sind. Der Fortschritt der Biochemie, Molekularbiologie und Polymerforschung und deren Anwendung in Technik, Medizin, Pharmazie und Gentechnologie erfordert die schnelle und systematische Trennung und Isolierung von Makromolekülen. Von besonderem Interesse in den Biowiεsen- schaften sind dabei langkettige Oligonukleotide, hochmolekulare Nukleinsäuren und Proteine. So z. B. tritt in der Gentechnologie häufig das Problem auf, daß aus einem natürlich vorkommenden Gemisch von 100 und mehr verschiedenen hochmolekularen Nukleinsäuren eine einzige molekulare Spezies bis zur Homogenität gereinigt werden muß. Bekanntlich sind die eineeinen Nukleinsäuren durch Molekulargewicht, Größe und Form zu charakterisieren.
Für viele Trennprobleme haben sich chromatografische Verfahren als vorteilhaft erwiesen. Die meisten Vorteile in bezug auf Auflösung, geringen Zeitaufwand und Reproduzierbarkeit bietet dabei die Hochdruckflüssigkeitschromatografie (HPLC). Diese Methode wurde bisher in Form der Gelpermeationschromatografie (GPC) , der Ionenaustausch Chromatographie und der Reversed-Phase Chromatografie (RP-Chromatografie) angewendet. Dabei traten für die hier zu behandelnden Trennprobleme folgende Nachteile auf:
GPC ist nur in der Lage, sehr kleine von sehr großen Molekülen zu trennen.
Bisher bekannte Ionenaustauscher und Reversed-Phase
Trägermaterialien konnten mit hoher Auflösung nur für kleine Makromoleküle wie Oligonukleotide, Peptide und Proteinbruchstücke eingesetzt werden. Bei der Trennung von hochmelekularen Makromolekülen wie beispielsweise messenger -Ribonukleinsäuren, Viren, Viroiden, Deoxyribonukleinsäure-Fragmenten und großen Proteinen konnte die erforderte Auflösung nicht erreicht werden.
Das hydrophob-ionische-RPC-5 Chromatografiematerial wie beispielsweise von Larson, J.E. et al. (The Journal of Biological Chemistry (1979) 254, 5535-5541) beschrieben,wurde zwar erfolgreich bei der Trennung von Deoxyribonukleinsäure-Fragmenten eingesetzt, kann jedoch nicht auf die HPLC adaptiert werden, da das Trägermaterial nicht druckstabil ist. Man muß als Nachteile die niedrigen Flußraten, das heißt sehr lange Chromatografiezeiten und eine geringe chromatografische Stabilität des Chromatografiematerials in Kauf nehmen. Aufgrund der chemischen Eigenschaften des RPC-5 Materials war es nicht möglich, komplexe Ribonukleinsäuregemische und Proteingemische aufzutrennen.
Mit den bisher bekannten Chromatografieverfahren war es nicht möglich, komplexe makromolekulare Gemische mit hoher Auflösung und hoher Geschwindigkeit in die einzelnen Molekülspezies zu trennen und zu isolieren oder diese Gemische zu analysieren.
Die Erfindung macht es sich zur Aufgabe, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, mit denen die o. a. Nachteile vermieden werden. Insbesondere soll es möglich sein, makromolekulare Gemische der verschiedensten Art, die Komponenten mit sehr unterschiedlichen Abmessungen, beispielsweise im Bereich von 30 Å bis 1000 A enthalten, in einem einzigen Durchlauf mit sehr hoher Auflösung und bei hoher Durchsatzgeschwindigkeit in ihre Komponenten aufzutrennen. Weiterhin sollten die verwendeten Materialien bei hohem Druck, weiten Temperaturbereichen und mit langer Lebensdauer einsetzbar sein. Wünschenswert ist eine hohe Beladbarkeit mit den zu trennenden makromolekularen Gemischen. Diese Aufgabe wurde gemäß der in Anspruch 1 und den folgenden Ansprüchen beschriebenen Erfindung gelöst. Entgegen der bisherigen Meinung in der Fachliteratur wurde somit ein chromatografisches Verfahren entwikkelt und die dazu notwendigen Trägermaterialien synthetisiert, mit denen es möglich ist, komplexe makromolekulare Gemische mit einem sehr weiten Molekülgrößenspektrum mit sehr hohem Auflösungsvermögen aufzutrennen. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner Ein- fachheit und der preiswerten und stabilen Materialien neben der wissenschaftlichen Anwendung vor allem für den industriellen Einsatz geeignet.
Entgegen den bisher bekannten Verfahren, die ausschließlich auf chemischen Eigenschaften der Trägermaterialien beruhten, geht die vorliegende Erfindung von der Erkenntnis aus, daß die Größe und/oder Form der Hohlräume der Trägermaterialien von ganz wesent licher Bedeutung für die Trennung ist, und in bestimmter Relation zur Größe der zu isolierenden Makromolekülspezies stehen muß. Es hat sich gezeigt, daß die Größe der Hohlräume das 1 - 20fache der zu isolierenden Komponente betragen muß. Sollten die Abmessungen der einzelnen zu trennenden Komponenten mehr als den Faktor 20 voneinander verschieden sein, ist es selbstverständlich möglich, die Trennung in mehreren Schritten durchzuführen.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist eine geeignete Modifizierung der Oberfläche vorgesehen. Es hat sich dabei als sehr vorteilhaft erwiesen, daß die für die Wechselwirkung mit den zu trennenden Substanzen verantwortlichen Gruppen über flexible Kettenmoleküle auf der Oberfläche verankert sind. Diese Wirkung wird beispielswiese durch Verwendung von α-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan und
N,N-Dimethylaminoethanol erreicht. Als wechselwirkende Gruppen kommen stark und schwach basische Anionenaustauscher, stark und schwach saure Kationenaustauscher, Gruppen mit hydrophoben Wechselwirkungen, Gruppen mit Polarisationswechselwirkungen und Gruppen, die mehrere der benannten Eigenschaften kombinieren, in Frage.
Da es sich gezeigt hat, daß bei vielen Anwendungen zweiwertige Metallionen zu erheblichen Störungen Anlaß geben können, wird gemäß der Erfindung weiterhin vorgeschlagen, daß alle mit den Lösungsmitteln in Berührung kommenden Teile aus Edelmetall, Kunststoff oder Glas bestehen, bzw. entsprechende Beschichtungen aufweisen. Die Erfindung ist anhand der Figuren näher erläutert.
Es zeigen:
Figur 1 eine ein sich bekannte Vorrichtung zur Durchführung eines chromatografischen Verfahrens.
Figur 2 Ausschnitte von Querschnitten durch Trägermaterialien mit verschiedenen Hohlraumgrößen.
Figuren
3,4,5 Grafische Darstellung verschiedener Elutions profile für verschiedene Hohlraumgrößen und Molekülgrößen.
Die in Figur 1 dargestellte Vorrichtung besteht aus einem druckfesten Zylinder (2) , der mit einem Zufüh rungsstutzen (1) und einem Auslaufstutzen (3) versehen ist. Im unteren Teil des Zylinders (2) ist ein sehr feinmaschiges, chemisch inertes Sieb (4) angeordnet. über dem Sieb (4) befindet sich der aus diskreten makroporösen Silicagelteilchen (5) bestehende chromatografische Träger. Die zu trennenden Substanzen werden in einer Lösung über den Zuführungsstutzen (1) eingefüllt und in den Hohlräumen des Trägers (5) adsorbiert. Bei dem anschließenden Elutionsschritt werden die zu trennenden Substanzen und Moleküle durch ein Lösungsmittel kontinuierlich variierender Zusammensetzung eluiert. Aufgrund der zeitlichen Änderung des Lösungsmittels treten im Ausfluß (3) die getrennten Komponenten zeitlich nacheinander aus.
Anhand von Figur 2 wird der Einfluß der Eohlraumgröße des Trägermaterials auf die Wechselwirkung mit dem Makromolekül erläutert. Ein Makromolekül (6) kann in einen zu kleinen Hohlraum (7) des Trägermaterials (5) nicht genügend eindringen, um eine optimale Wechselwirkung einzugehen. Der von seinen Abmessungen günstigere Hohlraum (8) erlaubt dagegen sehr intensive Wechselwirkungen. Um die Wechselwirkung zu erhöhen, sind die wechselwirkenden Gruppen über flexible Kettenmoleküle (9) auf der Hohlraumoberfläche verankert. Ist dagegen der Hohlraum (10) zu groß, so ist wieder mit einer Abnahme der Wechselwirkung zu rechnen. Die Kettenmoleküle haben in diesem Beispiel folgende chemische Struktur:
Figure imgf000008_0001
Die flexible Kette α-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan ist an der einen Seite am Träger-Silicagel (P) verankert und trägt am anderen Ende die Anionenaustauscher- gruppe N,N-Dimethylamino.
Die beschriebene chemische Modifikation wurde auf sphärische Silicagele mit 10 μm Korngröße und Hohlraumgroßen von 100 Å, 500 Å und 4000 Å angewendet. Dazu werden 50 g Silicagelteilchen in einem 1000 ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 24 h bei einer Temperatur von 240°C aktiviert. Nach dem Abkühlen wurde mit trockenem Stickstoff belüftet und mit 500 ml trokkenem α-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan versetzt. Die Umsetzung erfolgte 8 h bei 220 °C unter Stickstoffatmosphäre und unter ständigem Rühren. Nach der Umsetzung wurde das überschüsssige K-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan abgesaugt und das Produkt Epoxy-Silica mehrmals mit trockenem Dioxan gewaschen. Das Epoxy Silica wurde mit einem Vierhalskolben mit Innenthermometer, Rückflußkühler, Rührer und Stickstoffeinlei tungsrohr mit 500 ml trockenem N,N-Dimethylaminoethanol versetzt. Die Reaktion wurde durch 1 ml BF3/Ether katalysiert und 24 h unter Rückfluß gekocht. Nach der Reaktion wurde das Dimethylamino-Silicagel abgesaugt und mehrmals mit Dioxan, Methanol und Ether gewaschen und bei 50°C getrocknet. Die Ausbeute betrug 51,5 g.
In Figuren 3 bis 5 sind Trennbeispiele von kurzketti gen Nukleinsäuren (Figur 3) und langkettigsn Nukleinsäuren (Figuren 4, 5) dargestellt. Die Durchmesser der Hohlräume sind - wie in der Zeichnung angegeben -
100 Å, 500 Å und 4000 Å. Die Konzentration der elu ierten Komponenten wird durch die UV-Absorption bei 260 nm gemessen und gegen die Zeit aufgetragen.
Daraus lassen sich folgende Ergebnisse ablesen. Kurzkettige Nukleinsäuren mit einer Länge von 20 Å bis 30 Å werden optimal auf einer Hohlraumgröße von 100 Å getrennt (Figur 3) . Als ein Beispiel für eine Trennung langkettiger Nukleinsäuren wurde ein natürliches Gemisch von transfer RNA (80 Å Größe), ribosomaler 5SRNA (110 Å Größe), 9S messenger RNA (300 A Größe), und Viroid-RNA (450 Å Größe, eine pflanzenpathogene infektiöse RNA) gewählt. Es ist in Figur 4 deutlich zu sehen, daß die größte gewählte Porengröße die beste Trennung ergibt, wobei nicht ausgeschlossen ist, daß mit einer Hohlraumgroße, die zwischen 500 Å und 4000 Å liegt, eine noch bessere Trennung zu erzielen wäre. In Figur 5 ist das Beispiel aus Figur 4 durch langsamere Elution weiter optimiert worden. Es wird eine vollständige Trennung aller 4 Komponenten erreicht. Die in den angegebenen Beispielen verwendeten Dimethylamino-Silicagele hatten die Beladbarkeit von 4,8 mg Nukleinsäuregemisch/g (100 Å) , 17,2 mg Nukleinsäuregemisch/g (500 Å) und 5,6 mg Nukleinsäuregemisch/g (4000 Å) .
Das erfindungsgemäß beschriebene Verfahren ist das erste chromatografische Verfahren, das folgende Eigenschaften hat:
1. Allgemeine Anwendbarkeit zur Trennung von Makromolekülen.
2. Kurze Chromatografiezeiten und hohe Reproduzierbarkeit der Elutionsprofile durch die Verwendung von druckstabilen Trägern in HPLC Apparaturen.
3. Hohe Beladbarkeit.
4. Chromatograf iematerialien mit Langzeit Stabilität (kein "Ausbluten" der Chromatograf iesäulen)

Claims

Patentansprüche
1. Chromatografisches Verfahren zur Isolierung von Makromolekülen unter Verwendung von porenartige Hohlräume enthaltenden Trägern, dadurch gekennzeichnet, daß ein porenähnliche Hohlräume enthaltender Träger verwendet wird, bei dem die Durchmesser der Hohlräume das 1 - 20fache der Abmessungen derzu trennenden Makromoleküle und/oder makromolekularer Aggregate aufweisen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Hohlräume auf die größte Abmessung der jeweils zu isolierenden Makromolekülspezies abgestimmt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Hohlräume auf die maximalen Abmessungen der im Gemisch enthaltenden Makromolekülspezies abgestimmt ist.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlraumαuerschnitte möglichst konstant sind.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Querschnitte der Hohlräume um einen Faktor 3 größer oder kleiner als der Optimalguerschnitt sein können.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß der Querschnitt der Hohlräume kreisförmig ist, und die Oberfläche halbkugelförmig ist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß die Hohlräume röhrenförmig sind.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorher genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die die zu trennenden Makromoleküle enthaltende Lösung und die Elutionsmittel, beispielsweise durch Verwendung von Edelmetall, Glas und/oder Kunststoff für Säulen, Röhren, Ventile bzw. Pumpen, frei von zweiwertigen Metallionen gehalten werden.
9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Hohlräume in der Art modifiziert sind, daß nichtkovalente Wechselwirkungen mit den zu trennenden Makromole külen sichergestellt sind.
10. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorher genannten Ansprüche, gekennzeichnet durch eine stark oder schwach basische anionische Wechsel wirkung bewirkende Modifizierung der Oberflächen der Hohlräume.
11. Vorrichtung nach, einem oder mehreren der vorher genannten Ansprüche, gekennzeichnet durch eine stark oder schwach saure kationische Wechselwirkung bewirkende Modifizierung der Oberfläche der Hohlräume.
12. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorher genannten Ansprüche, gekennzeichnet durch eine hydrophobe Wechselwirkung bewirkende Modifizierung der Oberflächen der Hohlräume.
13. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorher genannten Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Polarisationswechselwirkung bewirkende Modifizierung der Oberflächen der Hohlräume.
14. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorher genannten Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Kombi nation der in den Ansprüchen 9 bis 13 genannten Wechselwirkungen.
15. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorher genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifizierung der Hohlraumflächen durch eine chemische Substanz erfolgt, die die für die Wechselwirkung verantwortlichen Gruppen an flexiblen Kettenmolekülen trägt.
16. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorher genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der die Hohlräume bildende Träger aus sphärischen oder gebrochenen Materialien mit einer Hohlraumgröße von 100 Å bis 10000 Å und einer spezifischen Oberfläche von 10 m2/g bis 800 m2/g, insbesondere zwischen
500 Å bis 4000 Å, mit einer spezifischen Oberfläche von 5m2 /g bis 200 m2/g und einer möglichst monodispersen Korngröße zwischen 3 μm bis 100 μm beträgt.
17. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorher genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die die Hohlräume aufweisenden Träger aus Siliziumdioxyd ob amorph oder kristallin, Alumosilikaten, Aluminiumoxyden oder aus mit diesen Materialien beschichteten Trägersubstanzen bestehen können.
18. Vorrichtung zur Herstellung nach den Ansprüchen 9 bis 17, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
a) Das Hohlräume enthaltende Trägermaterial wird mit einem Silanisierungsreagenz der allgemeinen Formel
R1R2R3Si R4
umgesetzt.
R1 entspricht einem Alkoxyrest mit 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere -OCH3 , -OC2H5, oder -OC3H7, oder einem Halogenatom, insbesondere -Cl, oder einer Dialkylaminogruppe mit identischen oder unterschiedlichen Alkylresten mit 1 bis 6 C-Atomen.
R2 und R3 entsprechen einem Kohlenwassεrstoff- rest mit 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere -CH3 , -C2H5, oder -C3H7, oder einem Alkoxyrest mit 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere -OCH3 , OC2H5 oder -OC3H7, oder einem Halogenatom oder einem durch mindestens eine Oxa- oder Aminogruppe unterbrochenen Alkylrest mit 4 bis 20 C-Atomen, wobei dieser Rest auch ein- oder mehrfach durch Halogen, Cyan, Nitro, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Hydroxy oder Aryl substituiert sein kann.
R4 entspricht einer Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 20 C-Atomen oder einem durch mindestens eine Oxa- oder Aminogruppe unterbrochenen Alkyl rest, wobei dieser Rest auch ein- oder mehrfach mit Halogen, Cyan, Nitro, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Alkoxy, Hydroxy, Aryl und/oder Epoxy substituiert sein kann, insbesondere
Figure imgf000015_0001
In einem zweiten Schritt wird der die Hohlräume enthaltende Träger mit einem Reagenz der allgemeinen Formel
X-R-Y II
zum endgültigen Chromatografiematerial umgesetzt. X besteht aus einer Amino-, Hydroxy-, Epoxy- Gruppe oder einem Halogenatom.
R besteht aus einer Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 20 C-Atomen oder einem durch mindestens eine Oxa- oder Aminogruppe unterbrochenen Alkyl- rest, wobei dieser Rest auch ein- oder mehrfach mit Halogen, Cyan, Nitro, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Alkoxy, Hydroxy, Aryl und/oder Epoxy substituiert sein kann.
Y entspricht einem Kohlenwasserstoffrest mit Anionen- oder Kationenaustauscher bildenden funktionellen Gruppen mit 1 bis 10 C-Atomen, der ein- oder mehrfach mit Amino-, Monoalkylamino-, Dialkylamino-, Quartäralkylamino-, Carboxylgruppen, Boronsäure, Alkyl- und Aryl-sulfonsäure substituiert sein kann.
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