WO1990003440A1 - Method for detecting and counting microorganisms in filterable products - Google Patents

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Abstract

Method for the specific detection and counting of microorganisms present in filterable samples, consisting in effecting a first coloration of the micro-organisms by means of a first colorant acting on dead cells, and effecting the fusion of the DNA of non colored cells, and then effecting a second coloration of the cells by means of a second colorant acting on the RNA and on the unmatched DNA to color it differently as compared to the dead cells. It is thus possible to morphologically classify and count all micrroorganisms present in a sample of filterable product.

Description

Procédé de détection et de dénombrement des micro-organis dans des produits filtrables. Method for detecting and counting microorganisms in filterable products.
L' invention concerne essentiellement un procè de détection spécifique et de dénombrement des micro-org nismes dans des produits filtrables, notamment en vue leur identification.The invention essentially relates to a specific method of detection and counting of microorganisms in filterable products, in particular with a view to their identification.
Par produits filtrables, on entend des produit dont il est possible de filtrer un volume nécessaire à un analyse, au moyen d'une membrane de filtration. Ces pro duits peuvent être des liquides, ou bien des produits vis queux, pâteux ou solides qui ont été rendus filtrables pa un traitement mécanique, physique, chimique, et/ou enzyma tique.By filterable products is meant products from which it is possible to filter a volume necessary for an analysis, by means of a filtration membrane. These products can be liquids, or viscous, pasty or solid products which have been made filterable by mechanical, physical, chemical and / or enzymatic treatment.
L'analyse quantitative et qualitative des mi cro-organismes présents dans un produit, quel que soit l type de ce produit, permet de déterminer son état hygié nique et sanitaire.The quantitative and qualitative analysis of the micro-organisms present in a product, whatever the type of this product, makes it possible to determine its hygienic and sanitary state.
Les méthodes les plus couramment utilisées pou effectuer ce type de contrôle consistent à préparer u échantillon de produit filtrable, en le concentrant éven tuellement si les niveaux de contamination recherchés son très bas. La détection spécifique et le dénombrement de micro-organismes présents se font en incubant la totalit ou une fraction de l'échantillon sur un milieu de cultur facilitant théoriquement, la croissance et le développemen de tous les micro-organismes. Le dénombrement est réalis par comptage des colonies formées au bout d'un certai temps d'incubation à une température optimale permettant e théorie le développement des micro-organismes recherchés.The most commonly used methods to carry out this type of control consist in preparing a sample of filterable product, concentrating it if necessary if the contamination levels sought are very low. The specific detection and counting of microorganisms present is done by incubating all or a fraction of the sample on a culture medium theoretically facilitating the growth and development of all the microorganisms. The enumeration is carried out by counting the colonies formed after a certain incubation time at an optimal temperature allowing theory the development of the microorganisms sought.
Les inconvénients de ces techniques sont essen tiellement leur lenteur (de 2 à 8 jours selon les types d germes recherchés), leur manque de spécificité (le milie et les conditions de culture empêchent le développement d tous les germes vivants présents, et il y a nécessairemen sélection des cellules les plus vivaces et les plus adap tées a l'environnement proposé;, et leur manque de εenεibi lité (on n'obtient qu'un dénombrement en terme d'unités formant des colonies, et non un nombre de germes).The disadvantages of these techniques are essentially their slowness (2 to 8 days depending on the types of germs sought), their lack of specificity (the milia and the culture conditions prevent the development of all the live germs present, and there are necessarily selection of the most perennial cells and the most adapted to the proposed environment ;, and their lack of εenεibi lity (we only get a count in terms of units forming colonies, and not a number of germs).
On a déjà proposé des techniques de dénombre¬ ment basées sur des colorations différentes des cellules vivantes et des cellules mortes.Enumeration techniques have already been proposed based on different stains of living cells and dead cells.
Selon ces techniques, un échantillon de produit est filtré sur une membrane de porosité déterminée, et les micro-organismes retenus sont colorés directement sur la membrane au moyen d'un colorant fluorescent, puis comptés par observation au moyen d'un microscope à épifiuoreεcence, les micro-organismes prenant des colorations différentes en fonction de leur degré de viabilité. En règle générale, les colorants fluorescents utilisés sont des "intercalants" c'est-à-dire des molécules chimiques planes (bromure d'éth dium, iodure de propidium, acridine orange par exemple) qui s'intercalent, sans liaisons covalentes, entre les tours de spire de l'ADN (acide désoxyribonucléique) , molécule bicaténaire.According to these techniques, a product sample is filtered through a membrane of determined porosity, and the microorganisms retained are colored directly on the membrane using a fluorescent dye, then counted by observation using an epiuorecence microscope, microorganisms taking different colors depending on their degree of viability. In general, the fluorescent dyes used are "intercalants", that is to say plane chemical molecules (eth dium bromide, propidium iodide, acridine orange for example) which are intercalated, without covalent bonds, between the turns of DNA (deoxyribonucleic acid), a double-stranded molecule.
Parmi toutes ces molécules fluorescentes, l'acridine orange est la plus utilisée en raison de son comportement particulier. En effet, si cette molécule agit bien comme intercalant vis-à-vis de l'ADN lui conférant ainsi une fluorescence verte, elle peut aussi s'associer de manière covalente avec les extrémités libres des bases pu- riques et pyrimidiques des acides nucléiques monocaténaires tels l'ARN (acide ribonucléique) , provoquant ainsi une fluorescence orange.Among all these fluorescent molecules, acridine orange is the most used because of its particular behavior. In fact, if this molecule acts well as an intercalator with respect to DNA, thus conferring on it a green fluorescence, it can also associate covalently with the free ends of the pure and pyrimidine bases of the single-stranded nucleic acids. such as RNA (ribonucleic acid), thus causing an orange fluorescence.
De plus, dans ce dernier cas, la fluorescence obtenue sera beaucoup plus intense car les acides nu¬ cléiques onocaténaires peuvent fixer, en moyenne, trois fois plus de molécules d'acridine que les bicaténaireε. La coloration finale d'une cellule est fonction du rapport ARN/ADN. Si la cellule est morte, l'ARN se dégrade très vite et l'on observe une fluorescence verte due uniquement a i'AL . S la cellule eεt en période active de εyntheεe, le taux d'ARN est important, et la coloration orange masq la coloration verte de l'ADN.In addition, in the latter case, the fluorescence obtained will be much more intense since the onocatenary nucleic acids can fix, on average, three times more acridine molecules than double streaks. The final staining of a cell is a function of the RNA / DNA ratio. If the cell is dead, the RNA degrades very quickly and we observe a green fluorescence due only to AL. S the cell is in active period of εyntheεe, the RNA level is high, and the orange coloration masks the green coloration of the DNA.
Cette méthode présente cependant un certai nombre d'inconvénients, notamment quant à l'interprétatio des résultats d'observation. En effet, l'état physiologiqu des cellules influe fortement sur l'intensité de la colora tion obtenue, qui va du jaune-verdâtre pour les cellules e "dormance" à l'orange vif pour les cellules très active métaboiiquement. De plus, la façon dont les cellules meu rent influe sur leur coloration. Une cellule morte d vieillesse sera colorée en vert, tandis qu'une cellule tué rapidement apparaîtra colorée en orange, comme une cellul vivante. Cet effet est particulièrement gênant dans le ca de contrôles de produits ayant subi une pasteurisation. Un autre inconvénient de cette méthode connu est que la membrane de filtration contient, au moment d l'observation, une quantité relativement importante de co lorant qui réémet une fluorescence verte au moment d l'observation et qui gène beaucoup la visualisation de cellules colorées.However, this method has a certain number of drawbacks, notably with regard to the interpretation of the observation results. Indeed, the physiological state of the cells strongly influences the intensity of the color obtained, which ranges from greenish-yellow for cells and "dormant" to bright orange for cells very metaboiically active. In addition, the way cells eat affects their coloring. A dead old cell will be colored green, while a rapidly killed cell will appear colored orange, like a living cell. This effect is particularly troublesome in the case of controls of products which have undergone pasteurization. Another drawback of this known method is that the filtration membrane contains, at the time of observation, a relatively large amount of color which re-emits green fluorescence at the time of observation and which greatly hinders the visualization of colored cells.
Il faut encore noter que les différents auteur ayant travaillé sur cette méthode ne sont pas du tout d'ac cord sur l'interprétation à donner aux résultats d'observa tion. Certains pensent que 1'acridine orange perme de colorer en orange les cellules métaboliquement active et en vert les cellules métaboliquement inactiveε, d'autre arrivent à une interprétation totalement contraire, e d'autres pensent que la coloration n'est pas un indice d viabilité mais est simplement fonction des conditions opé ratoires (concentration du colorant, temps de contact, tam pons utilisés, etc...).It should also be noted that the various authors who have worked on this method are not at all in agreement on the interpretation to be given to the observation results. Some people think that acridine orange allows the metabolically active cells to be colored orange and the metabolically inactive cells to be green, others come to a completely opposite interpretation, others think that coloring is not an indication of viability. but is simply a function of the operating conditions (concentration of the dye, contact time, pads used, etc.).
La présente invention a notamment pour objet u procédé de détection spécifique et de dénombrement de mi cro-orgamεmeε présents dans des produits filtrableε, pa coloration différente des cellules vivantes et des cellule mortes, qui ne présente aucun des inconvénients de la tech¬ nique antérieure citée.The subject of the present invention is in particular a method for specific detection and enumeration of mi cro-orgamεmeε present in filterable products, by different staining of living cells and of cells dead, which does not have any of the drawbacks of the cited prior technique.
L'invention a également pour objet un procédé de ce type qui permet un classement morphologique et un dé¬ nombrement très fins et très précis des micro-organismes présents dans un produit filtrable.The invention also relates to a process of this type which allows very fine and very precise morphological classification and counting of the microorganisms present in a filterable product.
L'invention a encore pour objet un procédé de ce type, qui permet un classement morphologique et un dé¬ nombrement très rapides des micro-organismes présentε dans un produit filtrable.The invention also relates to a process of this type, which allows very rapid morphological classification and counting of the microorganisms present in a filterable product.
Elle propose, à cet effet, un procédé consiε- tant à filtrer le produit sur une membrane propre à retenir des micro-organismes, et à colorer leε micro-organismes re¬ tenus pour les dénombrer par comptage et les différencier, caractérisé en ce qu'il consiste :To this end, it proposes a process consisting in filtering the product on a membrane capable of retaining microorganisms, and in coloring the retained microorganisms in order to count them by counting and differentiating them, characterized in that 'it consists :
- a) à effectuer une première coloration des micro-organismes au moyen d'un premier colorant agissant uniquement sur les cellules mortes,a) carrying out a first coloration of the microorganisms by means of a first dye acting only on dead cells,
- b) à effectuer la fusion de l'ADN des cel¬ lules non colorées dans l'étape précédente,b) performing the fusion of the DNA of the non-colored cells in the previous step,
- c) puis à effectuer une seconde coloration des cellules au moyen d'un second colorant agissant sur l'ARN et sur l'ADN désapparié des cellules traitées dans 1'étape b) .c) then carrying out a second staining of the cells by means of a second dye acting on the RNA and on the mismatched DNA of the cells treated in step b).
1 - v.-r_e.rnstion permet αcnc, de façon simple, a ob¬ tenir des colorations différentes des cellules mortes et des cellules vivantes, tout en garantissant que toutes les cellules mortes seront colorées d'une certaine façon, et que toutes les cellules vivantes seront colorées d'une autre façon. 1 - v. R_e.rnstion-allows αcnc, simply, has ob¬ hold different colors of dead cells and living cells, while ensuring that all the dead cells will be colored in some way, and that all living cells will be stained in another way.
Pour cela, il suffit d'utiliser un premier co¬ lorant qui se fixe uniquement sur les cellules mortes comme un intercalant entre les spires de la double hélice de l'ADN et qui a pour effet de colorer et de stabiliser la structure de l'ADN et de la rendre insensible au phénomène de fusion, qui consiste à séparer, par action de la cha-For this, it suffices to use a first colorant which is fixed only on the dead cells as an interlayer between the turns of the DNA double helix and which has the effect of coloring and stabilizing the structure of the DNA and make it insensitive to the phenomenon of fusion, which consists in separating, by the action of cha-
FEUILLE DE REMPLACEMENT leur, les deux brins de la molécule d'ADN en formant ains de l'ADN monocaténaire.REPLACEMENT SHEET their, the two strands of the DNA molecule thus forming single-stranded DNA.
Ainsi, l'étape de fusion agit seulement s l'ADN des cellules qui n'a pas été stabilise, ce qui pér il met, au cours de l'étape suivante, de fixer le second colo rant sur l'ADN désapparié et l'ARN éventuellement présent de façon covalente en empêchant tout réappariement ulté rieur de l'ADN.Thus, the fusion step acts only if the DNA of the cells which has not been stabilized, which makes it necessary, during the following step, to fix the second dye on the mismatched DNA and the 'RNA possibly present covalently by preventing any subsequent re-pairing of DNA.
L'ADN monocaténaire est alors traité comm i l'ARN et donne la même coloration.The single-stranded DNA is then treated as RNA and gives the same color.
Selon une autre caractéristique de l'invention la fusion de l'ADN est réalisée par un traitement thermiqu à une température déterminée, par exemple par contact ave l'eau à une température comprise entre 65=C et 100'C enAccording to another characteristic of the invention, the DNA is fused by heat treatment at a determined temperature, for example by contact with water at a temperature between 65 = C and 100'C in
15 viron.About 15.
Selon encore une autre caractéristique de l'in vention, le colorant utilisé dans l'étape a) pour la colo ration des cellules mortes est le sulfate de berbérine.According to yet another characteristic of the invention, the dye used in step a) for the coloring of dead cells is berberine sulfate.
Le sulfate de berbérine est un alcaloïde ex 0 trait de diverses plantes, qui se fixe sur l'ADN en s' in tercalant entre les spires de la double hélice et provoqu une fluorescence verte lorsqu'on l'excite par une lumièr bleue.Berberine sulphate is an alkaloid ex 0 trait of various plants, which binds on the DNA by interfering between the turns of the double helix and causes a green fluorescence when it is excited by a blue light.
Selon une autre caractéristique de l'invention 5 le second colorant utilisé dans l'étape c), est l'acridin orange.According to another characteristic of the invention, the second dye used in step c) is acridin orange.
L'acridine orange se fixe de façon covalent sur l'ARN et sur l'ADN monocaténaire pour donner une colo ration orange en réponse à une excitation par de la lumièr ..:. bleue.The acridine orange binds covalently to the RNA and to the single-stranded DNA to give an orange color in response to an excitation by light. blue.
Selon une autre caractéristique de l'invention le procédé consiste également à exposer la membrane à un rayonnement ultra-violet de longueur d'onde déterminée pendant une durée déterminée, pour annuler 1 'émissivité lu mineuse αeε molécules de colorant retenueε par la membran de filtration, dans la plage de longueurs d'onde d'observa¬ tions.According to another characteristic of the invention, the method also consists in exposing the membrane to ultraviolet radiation of determined wavelength for a determined period, to cancel the emissivity or minerality of dye molecules retained by the membrane. filtration, in the wavelength range of observa¬ tions.
L'acridine orange qui est retenue dans l'épais¬ seur de la membrane de filtration peut être éteinte très i rapidement, par exposition à un rayonnement ultra-violet pendant quelques secondes, sans que le même phénomène se produise pour l'acridine fixée sur l'ADN et l'ARN, qui est davantage protégée et stabilisée que l'acridine libre rete¬ nue par la membrane. i On peut ainsi éliminer, en observation, un fond vert très brillant, et donc observer uniquement des cel¬ lules oranges et des cellules vertes, sur fond noir.The acridine orange which is retained in the thickness of the filtration membrane can be extinguished very quickly by exposure to ultraviolet radiation for a few seconds, without the same phenomenon occurring for the acridine fixed on DNA and RNA, which is more protected and stabilized than the acridine free retained by the membrane. i One can thus eliminate, by observation, a very bright green background, and therefore observe only orange cells and green cells, on a black background.
L'observation est réalisée au moyen d'un micro¬ scope à épifluorescence.The observation is carried out using an epifluorescence micro¬ scope.
15 Le procédé selon l'invention prévoit également de balayer la surface de la membrane de filtration au moyen d'un faisceau lumineux, d'enregistrer des images des lignes ou des zones de balayage au moyen d'une caméra vidéo, et d'utiliser des moyens d'analyse d'image pour identifier etThe method according to the invention also provides for scanning the surface of the filtration membrane by means of a light beam, recording images of the scanning lines or zones by means of a video camera, and using image analysis means to identify and
20 dénombrer les micro-organismes retenus par la membrane.20 enumerate the microorganisms retained by the membrane.
Un tel procédé est très facilement automa¬ tisable, et permet dans un temps très court (quelques mi¬ nutes) de classer morphologiquement et de dénombrer les mi¬ cro-organismes présents dans un échantillon de produit.Such a process is very easily automa¬ tisable, and allows in a very short time (a few minutes) to classify morphologically and enumerate the micro-organisms present in a product sample.
25 Le procédé selon 1'invention est applicable à toutes sortes de produits, notamment à des échantillons de produits alimentaires ou agro-alimentaires, de produits cosmétiques, de produits pharmaceutiques, de produits in¬ dustriels, de produits naturels tels que l'air, le sol,The method according to the invention is applicable to all kinds of products, in particular to samples of food or agri-food products, cosmetic products, pharmaceutical products, industrial products, natural products such as air, floor,
5.- l'eau ; ou de produits ou liquides biologiques tels que le sang, l'urine, etc..5.- water; or biological products or liquids such as blood, urine, etc.
Pour mieux faire comprendre l'invention, on va maintenant décrire de façon détaillée, à titre d'exemple, une mise en oeuvre particulière du procédé selon l'inven¬ tion. Un échantillon de produit est filtré par d pression sur une membrane dont la porosité et le diamèt sont choisis en fonction de la taille de l'échantillon analyser et des germes que l'on veut identifier et déno brer. On peut notamment utiliser une membrane ayant un dia mètre de l'ordre de 45 mm ou moins, et une porosité infé rieure ou égale à 0,5 μm environ. Les cellules retenues su la membrane sont ensuite mises en contact pendant une mi nute avec 5 ml de sulfate de berbérine à 1 g/1 préparé e solution de Ringer à un pH 7.To better understand the invention, we will now describe in detail, by way of example, a particular implementation of the method according to the invention. A product sample is filtered by pressure on a membrane, the porosity and diameter of which are chosen according to the size of the sample to be analyzed and the germs that we want to identify and count. One can in particular use a membrane having a diameter of the order of 45 mm or less, and a porosity less than or equal to approximately 0.5 μm. The cells retained on the membrane are then brought into contact for a minute with 5 ml of berberine sulphate at 1 g / 1 prepared by Ringer's solution at pH 7.
Le sulfate de berbérine est ensuite évacué pa aspiration.Berberine sulfate is then evacuated by suction.
Les cellules retenues par la membrane sont en suite mises en contact pendant une minute avec 25 ml d'ea distillée stérile à une température de l'ordre de 85"C pour réaliser la fusion de l'ADN des cellules non colorée par le sulfate de berbérine, après quoi l'eau est évacué par aspiration.The cells retained by the membrane are then brought into contact for one minute with 25 ml of sterile distilled water at a temperature of the order of 85 "C to effect the fusion of the DNA of the cells not stained with sulphate. berberine, after which the water is evacuated by suction.
Simultanément, ou immédiatement après la fu sion, les cellules retenues sur la membrane de filtratio sont mises en contact pendant une minute avec 5 ml d'un solution à 0,1 g/1 d1acridine orange, préparée dans un tam pon citrate/phosphate à un pH de 7.Simultaneously, or immediately after the fusion, the cells retained on the filtration membrane are brought into contact for one minute with 5 ml of a solution of 0.1 g / 1 d 1 acridine orange, prepared in a tam pon citrate / phosphate at a pH of 7.
La solution d'acridine orange est ensuite éva cuée par aspiration, puis la membrane est rincée avec 10 m d'eau distillée stérile et est déposée sur une lame d verre et recouverte d'huile à immersion pour microscope e d'une lamelle couvre-objet.The orange acridine solution is then evacuated by suction, then the membrane is rinsed with 10 m of sterile distilled water and is placed on a glass slide and covered with immersion oil for microscope and a coverslip. object.
Cette préparation est alors exposée pendant 3 secondes à un rayonnement ultra-violet ayant une longueu d'onde d'environ 255 nm.This preparation is then exposed for 3 seconds to ultraviolet radiation having a wavelength of approximately 255 nm.
L'observation est faite ensuite au moyen d'u microscope à épifluoreεcence, avec une longueur d'ond d'excitation lumineuse de 4ûû-45û nm et un filtre d'arrêt 480 nm, pour une identification et un dénombrement des mi cro-organismes dans les longueurs d'onde visibles supé rieures à 480 nm.The observation is then made using an epifluorescence microscope, with a light excitation wavelength of 4 de-45û nm and a stop filter 480 nm, for identification and counting of the mi cro-organisms in visible wavelengths greater than 480 nm.
Toute la surface de la membrane de filtratio doit être examinée si l'on veut pouvoir atteindre la sen sibilité maximale de détection, qui est d'une cellule pa échantillon. Le grossissement utilisé du microscope est d 500, ce qui correspond à un minimum acceptable pour distin guer la morphologie cellulaire.The entire surface of the filtration membrane must be examined in order to be able to reach the maximum detection sensitivity, which is one cell per sample. The magnification used of the microscope is d 500, which corresponds to an acceptable minimum for distinguishing cell morphology.
Les avantages du procédé selon l'invention son les suivants :The advantages of the process according to the invention are the following:
- les cellules mortes sont colorées en ver fluorescent, et les cellules vivantes en orange vif, c qui évite tous les problèmes d'interprétation des résultat liés à l'utilisation de 1"acridine orange dans la techniqu- the dead cells are stained in fluorescent worm, and the living cells in bright orange, c which avoids all the problems of interpretation of the results linked to the use of 1 "orange acridine in the technique.
•> _- antérieure, • > _- previous,
- la morphologie cellulaire est conservée e permet de distinguer les levures des bacilles et des cocci,- the cell morphology is preserved and makes it possible to distinguish yeasts from bacilli and cocci,
- le sulfate de berbérine qui diffuse libremen dans les cellules mortes et les colore, ne pénètre pas dan les cellules vivantes,- berberine sulphate which diffuses freely in dead cells and colors them, does not penetrate dan living cells,
- les cellules colorées en vert par le sulfat de berbérine ne sont pas sensibles au chauffage utilis pour la fusion de l'ADN,- cells colored green by berberine sulphate are not sensitive to the heating used for DNA fusion,
- la durée totale d'une analyse (filtration, coloration, examen, comptage) réalisée par un opérateur es d'environ 30 minutes,- the total duration of an analysis (filtration, coloring, examination, counting) carried out by an operator is approximately 30 minutes,
- la sensibilité maximale et le seuil de détec tion sont de 1 cellule,- the maximum sensitivity and the detection threshold are 1 cell,
- les dénombrements réalisés par ce procédé d coloration sont beaucoup plus précis que ceux réalisés pa les techniqueε de culture,- the counts made by this coloring process are much more precise than those made by the cultivation techniques,
- le procédé selon l'invention est extrêmemen simple et ne demande ni personnel qualifié en microbiolo gie, ni laboratoire spécialement équipé,- the process according to the invention is extremely simple and requires neither qualified personnel in microbiology, nor specially equipped laboratory,
- l'utilisation de membraneε de diamètre plu faible et le couplage du microεcope d'obεervation a de moyens de balayage par un faisceau lumineux de longueu d'onde appropriée, à une caméra vidéo et à un systèm d'analyse d'image permettent de réaliser des identifica tions et des dénombrements de micro-organismeε en quelque minutes par échantillon traité. - the use of membranes of smaller diameter and the coupling of the observation microscope has means of scanning by a light beam of appropriate wavelength, a video camera and an image analysis system make it possible to carry out identifications and enumerations of microorganisms in a few minutes per sample treated.

Claims

REVENDICATIONS
1 ) Procédé de détection spécifique et de dé¬ nombrement de micro-organismes dans un produit filtrable, consistant à filtrer le produit sur une membrane propre à retenir les micro-organismes, et à colorer les micro-orga¬ nismes retenus pour les dénombrer par comptage et les dif¬ férencier, caractérisé en ce qu'il consiste :1) A method of specific detection and counting of microorganisms in a filterable product, consisting in filtering the product on a membrane capable of retaining the microorganisms, and in coloring the microorganisms retained to count them by counting and differentiating them, characterized in that it consists:
- a; à effectuer une première coloration des micro-organismeε au moyen d'un premier colorant agissant uniquement sur les cellules mortes,- at; to carry out a first coloration of the microorganisms using a first dye acting only on dead cells,
- b) à effectuer la fusion de l'ADN des cel¬ lules non colorées dans l'étape précédente,b) performing the fusion of the DNA of the non-colored cells in the previous step,
- c) puis à effectuer une seconde coloration des cellules au moyen d'un second colorant agissant sur l'ARN et sur l'ADN désapparié des cellules traitées dans l'étape b).- c) then to carry out a second staining of the cells by means of a second dye acting on the RNA and on the mismatched DNA of the cells treated in step b).
2* ) Procédé selon la revendication 1, caracté¬ risé en ce qu'il consiste à fixer le premier colorant cité comme un intercalant sur l'ADN des cellules mortes pour le colorer et le stabiliser, puis à réaliser la fusion de l'ADN non stabilisé des autres cellules pour le désappa¬ rier, et à fixer le second colorant cité de façon covalente sur l'ARN ainsi que sur l'ADN désapparié, pour empêcher son réappariement ultérieur et le colorer comme de l'ARN.2 * ) Process according to claim 1, caracté¬ ized in that it consists in fixing the first dye cited as an intercalating agent on the DNA of dead cells to color it and stabilize it, then in carrying out the fusion of the DNA not stabilized from the other cells to unpair it, and to fix the second dye cited covalently on the RNA as well as on the mismatched DNA, to prevent its subsequent re-pairing and to color it like RNA.
3") Procédé selon la revendication 1 ou 2, ca¬ ractérisé en ce que la fusion de l'ADN est réalisée par traitement thermique à une température déterminée.3 ") A method according to claim 1 or 2, ca¬ characterized in that the DNA fusion is carried out by heat treatment at a determined temperature.
4') Procédé selon la revendication 3, caracté¬ risé en ce que le traitement thermique est réalisé par contact avec de l'eau à une température comprise entre 65"C et 100 C environ.4 ') Method according to claim 3, caracté¬ ized in that the heat treatment is carried out by contact with water at a temperature between 65 "C and 100 C approximately.
5 ) Procédé selon l'une des revendicationε 1 à 4, caractéπεé en ce que le colorant utilisé dans l'étape a) est le sulfate de berbérine. 6;) Procédé selon l'une des revendications 15) Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the dye used in step a) is berberine sulfate. 6 ; ) Method according to one of claims 1
5, caractérisé en ce que le colorant utilisé dans l'étap c) est 1'acridine orange.5, characterized in that the dye used in step c) is acridine orange.
7" ) Procédé selon l'une des revendications 1 !. 6, caractérisé en ce que la seconde coloration des cellule est réalisée pendant ou immédiatement après l'étape de fu sion de l'ADN des cellules non colorées.7 " ) Method according to one of claims 1!. 6, characterized in that the second staining of the cells is carried out during or immediately after the step of fusing the DNA of the non-stained cells.
8") Procédé selon l'une des revendicationε 18 " ) Method according to one of claims 1
7, caractérisé en ce qu'il conεiεte enεuite à exposer l iϋ membrane à un rayonnement ultra-violet de longueur d'ond déterminée, pendant une durée déterminée, pour annule l'émissivité lumineuse des molécules de colorant retenue par la membrane de filtration, dans la plage de longueurs d'onde d'observation. 15 9ς ) Procédé selon l'une des revendications 1 à7, characterized in that it then follows to expose the membrane to ultraviolet radiation of determined wavelength, for a determined period, to cancel the light emissivity of the dye molecules retained by the filtration membrane, in the observation wavelength range. 15 9 ς ) Method according to one of claims 1 to
8, caractérisé en ce qu'il consiste à observer les cellules colorées au moyen d'un microscope à épifluorescence pour les classer morphologiquement et les dénombrer.8, characterized in that it consists in observing the colored cells by means of an epifluorescence microscope in order to classify them morphologically and to count them.
10') Procédé selon l'une des revendications 1 à 20 9, caractérisé en ce qu'il consiste à balayer la surface de la membrane au moyen d'un faisceau lumineux, à enregistrer des images des lignes ou zones de balayage au moyen d'une caméra vidéo, et à utiliser des moyens d'analyse d'image pour identifier et dénombrer les micro-organismes retenus 25 par la membrane.10 ') Method according to one of claims 1 to 20 9, characterized in that it consists in scanning the surface of the membrane by means of a light beam, in recording images of the scanning lines or zones by means of 'a video camera, and to use image analysis means to identify and count the microorganisms retained by the membrane.
11') Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est appliqué à des échantillons de produits alimentaires ou agro-alimentaires, de produits cosmétiques, de produits pharmaceutiques, de 3.* produits industriels, de produits naturels tels que l'air, le sol, l'eau ; ou de produits ou liquides biologiques tels que le εang, l'urine, etc.. 11 ') Method according to one of the preceding claims, characterized in that it is applied to samples of food or agri-food products, cosmetic products, pharmaceutical products, 3. * industrial products, natural products such that air, soil, water; or biological products or liquids such as blood, urine, etc.
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