WO1992022586A1 - Oxidized composite comprising water-soluble carboxypolysaccharide and magnetic iron oxide - Google Patents

Oxidized composite comprising water-soluble carboxypolysaccharide and magnetic iron oxide Download PDF

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Hideo Nagae
Yoshio Ito
Akihiro Mizutani
Kimio Hirose
Masahiro Ohgai
Yasuji Yamashita
Nahoko Tozawa
Keito Yamada
Kyoji Kito
Shusaburo Hokukoku
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Description

明 細 書
水溶性カルボキシ多糖一磁性酸化鉄酸化複合体
技術分野
本発明は、 MR I造影剤、 温熱療法の発熱助剤、 X線造影剤等の生物 学分野及び医療分野で特に有用である新規な水溶性カルボキシ多糖ー磁 性酸化鉄酸化複合体に関する。
背景技術
コロイ ドサイズを持った磁性酸化鉄超微粒子は超常磁性を有し、 その 水性ゾルである磁性流体は、 近年特に MR I造影剤として注目されてい る。 しかしながら、 磁性酸化鉄超微粒子のみからなる水性ゾルは、 塩の 添加時における安定性、 加熱滅菌や経時安定性が極めて低く、 更に静脈 内投与における急性毒性も極めて強く、 このままでは医療用として使用 することができず、 これらの改善が図られてきた。
これらの安定性 ·安全性の向上のための 1つの手段として多糖類等と 磁性酸化鉄超微粒子との複合体を形成せしめることが提案されている。 例えば、 特公昭 5 9— 1 3 5 2 1号公報 ^国特許第 4 , 1 0 1 , 4 3 5 . 号明細書） には、 デキストランまたはデキストランを水酸化ナトリウム で加熱処理して得られるカルボキシデキストランと磁性酸化鉄超微粒子 との複合体が開示されており、 また、 米国特許第 4 , 4 5 2 , 7 7 3号明 細書には、 デキストラン一磁性酸化鉄微小球が開示されており、 さらに、 特公昭 6 4— 5 0 0 1 9 6号公報 （国際公開 WO 8 8 / 0 0 0 6 0号 明細書） には、 上記と類似の動物の器官および組織の in vivo MR I造 影用のデキストランー磁性酸化鉄微小球の組成物が開示されている （後 記比較例 1参照） 。 これら、 特にカルボキシデキストラン一磁性酸化鉄 超微粒子複合体は種々の安定性や急性毒性の向上が著しいが、 こうして 得られる複合体や微小球の水性ゾルを血管内に投与すると著しい血圧低 下をきたし、 時には死に至ることが確認された。
そこで本発明者らは鋭意検討の結果、 水溶性カルボキシ多糖一磁性酸 化鉄超微粒子複合体を酸素ガスなどの酸化剤で処理して得られる酸化複 合体は、 原料複合体が有している磁気的性質、 代謝性、 組織特異性等の 性質に実質的に影響を与えることなく、 血圧低下を殆どもしくは全く示 さないこと、 そして血圧低下と関連していると考えられる血小板凝集作 用をも顕著に低減しうることを見いだし、 本発明を完成するに至つた。 発明の開示
しかして、 本発明によれば、 水溶性カルボキシ多糖と磁性酸化鉄超微 粒子とからなる複合体であつて、 該複合体が酸化されていることを特徴 とする水溶性カルボキシ多糖—磁性酸化鉄酸化複合体が提供される。 本発明により提供される水溶性力ルボキシ多糖一磁性酸化鉄酸化複合 体は水性ゾルの形態で極めて毒性が弱く且つ安定性に優れており、 動物 の血管内に直接投与しても従来の複合体のように血圧低下作用を殆んど もしくは全く示さず、 しかも血小板凝集作用も小さく、 薬剤としての安 全性に優れており、 例えば、 核磁気共鳴イメージンク （以下、 MR Iと 略記する） 造影剤、 温熱療法用の発熱助剤、 薬物の局所投与用担体等と して医療の分野において好適に使用することができる。
以下、 本発明の水溶性カルボキシ多糖一磁性酸化鉄酸化複合体 （以下、 酸化複合体ということがある） についてさらに詳細に説明する。
本発明の酸化複合体は水溶性カルボキシ多糖 （以下、 C P Sと略称す る） と酸化鉄超微粒子との複合体を酸化することにより得ることができ る。 本発明の酸化複合体の直接の出発原料である上記複合体はそれ自体 既知のものであり、 例えば、 特公昭 5 9— 1 3 5 2 1号公報 （米国特許 第 4 , 1 0 1 , 4 3 5号明細書） に記載の方法で調製することができる。 本発明の酸化複合体の製造に用いることのできる複合体の一方の成分 である C P Sは多糖分子の還元末端にカルボキシル基 1個を有する水溶 性多糖であり、 その製法としては、 水溶性多糖をアルカリ、 特に、 水酸 化ナトリウムで加熱処理する方法や水溶性多糖の末端還元基のみを選択 的に酸化、 例えばヨウ素一水酸化ナトリウムまたは次亜塩素酸ナトリゥ ムなどの酸化剤により酸化する方法などが例示できる。 より具体的には 例えば、 多糖水溶液に水酸化ナトリウムを加え、 約 3 0〜約 1 0 0 °C、 好ましくは約 6 0〜約 1 0 0 °Cの温度で 0. 5〜6時間加熱処理するこ とにより得ることができる。 このようにして製造される C P Sは通常精 製することが望ましく、 その精製はそれ自体既知の方法、 例えば、 貧溶 媒による沈殿法、 透析法、 限外濾過法、 陽イオンおよび陰イオン交換樹 脂法、 電気透析法などを一つまたは組み合わせて行なうことができる。 こうして得られる C P Sはその 1分子に 1個のグルコメタサッカリン酸 残基を持つとされている [Carbohyd. Res. , 1 1 ( 1 9 6 9 ) 、 7 7 - 8 4参照] 。
また、 例えば多糖水溶液にヨウ素一水酸化ナトリウムまたは次亜塩素 酸ナトリウムなどの酸化剤を加え、 約 1 0〜約 6 0 °C、 好ましくは約 2 0〜約 4 0 °Cの温度で 0. 5〜1 6時間酸化処理することによつても C P Sを得ることができ、 次いで、 通常、 上記と同様な方法で精製するこ とができる。
本発明において用いることのできる C P Sは、 好ましくはアル力リ処 理によって得られる C P Sであり、 数平均分子量は一般に約 500〜約 30万、 好ましくは約 1000〜約 5万、 さらに好ましくは約 1500 〜約 2万の範囲内にあることができる。 更に上記のアル力リ処理もしく は酸化処理において、 多糖から C P Sへの変換率はアル力リ量ゃ酸化剤 が多いほど、 処理温度が高いほど、 および処理時間が長いほど高くなり、 一般にその変換率は、 多糖の還元糖を P%、 処理物の還元糖を c%とす ると、 100 (P— C) ZP%で表わすことができる。 本発明において は一般に、 変換率が約 30%以上、 好ましくは約 50%以上、 更に好ま しくは約 80%以上の CPSを用いることができる。
ここで用い得る多糖類としては、 水溶性のもの、 例えば、 グルコース ポリマーであるデキストラン、 デンプン、 グリコーゲン、 プルラン等； ガラクトースポリマーであるァガロース、 ガラクタン等；キシロースポ リマーであるキシラン等が挙げられ、 この中でもデキストラン、 デンプ ン及びプルランが好ましく、 デキストランが特に好ましい。
本発明の酸化複合体の製造に用いることのできる複合体 （以下、 原料 複合体ということがある） の調製法は、 予め調製した磁性酸化鉄超微粒 子のみから成る水性ゾルと CP Sとを反応させる第一の方法と、 CPS の存在下に 1ステップで合成する第二の方法に大別できる。
第一の方法では、 まず磁性酸化鉄超微粒子のみから成る水性ゾルを調 製する。 この水性ゾルの調製法には、 アルカリ共沈法やイオン交換樹脂 法等を例示することができる。
アルカリ共沈法では、 例えば、 第一鉄鉱酸塩と第二鉄鉱酸塩とをモル 比で約 1 ： 3ないし約 2： 1の範囲内の比率で含む約 0.1〜約 2Mの 水溶液と、 NaOH、 KOH、 NH4OH等の塩基とを p Hが約 7〜約 1 2になるように混合し、 必要に応じて加熱熟成し、 次いで生成する磁 性酸化鉄を分離、 水洗した後、 水に再分散し、 塩酸などの鉱酸を液の p Hが約 1〜約 3となるまで加えることにより、 磁性酸化鉄水性ゾルを得 ることができる。
5 一方、 イオン交換樹脂法では、 例えば、 第一鉄塩と第二鉄塩とを約 1
： 2のモル比で含む約 0. 1〜約 2 Mの水溶液を、 強塩基性交換樹脂ス ラリーに撹拌下 p Hを約 8〜約 9に保ちながら添加した後、 塩酸などの 鉱酸を p Hが約 1〜約 3になるまで加え、 次いで樹脂を濾別することに より磁性酸化鉄水性ゾルを得ることができる。 必要に応じてこれらの水
1 0 性ゾルは、 透析、 限外濾過、 遠心等により精製及び Zまたは濃縮するこ とができる。 こうして得られる磁性酸化鉄水性ゾルと C P S水溶液と は、 厳密に制限されるものではないが、 通常、 鉄と C P Sとの重量比が 約 1 ： 1ないし約 1 ： 6の割合で混合し加熱反応させる。 反応液中の磁 性酸化鉄の濃縮は、 これも特に制限されるものではないが、 通常、 鉄と i s して約 0 . 1〜約 1 0 WZV %、 好ましくは約 1〜約 5 WZV %の範囲 内が適当である。 反応は一般に室温ないし約 1 2 0 °Cの温度で約 1 0分 ないし約 1 0時間行うことができるが、 通常約 1時間程度還流加熱すれ ば十分である。
次いで、 精製及び調整を行うが、 それはそれ自体既知の方法を一つま 20 たは組み合わせて用いることができる。 例えば、 限外濾過により生成す る複合体から未反応の C P S及び低分子化合物を分離する操作を繰り返 し、 所望の純度及び濃度を有する複合体水性ゾルを得ることができ、 ま た、 得られる反応液にメタノール、 エタノール、 アセトン等の複合体に 対する貧溶媒を添加し、 生成した複合体と優先的に沈殿析出させ、 析出 物を分離し、 ついで析出物を水に再溶解し、 流水透析し、 必要に応じて 減圧濃縮し、 所望の純度及び濃度を有する複合体水性ゾルを得ることが できる。 この際所望に応じて、 上記工程の途中及び Zまたは最後に、 p H調整、 遠心分離及び Zまたは濾過の工程を入れることもできる。 得られる複合体全体の粒子直径は一般に約 20〜約 400 nmの範囲 にあり、 また複合体中の磁性酸化鉄の粒子直径は一般に約 5〜3 Onm の範囲にある。 さらに、 得られる複合体の 1テスラにおける磁化は通常 鉄 l gあたり約 20〜約 150 emuの範囲内にある。
複合体調製の第二の方法は、 CPSの存在下に、 2価鉄鉱酸塩及び 3 価鉄鉱酸塩の混合鉄塩水溶液と塩基水溶液とを混合して反応させ、 1ェ 程で複合体を得る方法である。 この第二の方法は更に添加順序により、 (A)該 CPS水溶液に混合鉄塩水溶液を添加し、 ついで塩基水溶液を 添加し反応させる方法； （B)該 CPS水溶液に塩基水溶液を添加し、 次いで混合鉄塩水溶液を添加し反応させる方法； （C)塩基水溶液に該 CPS水溶液と混合鉄塩水溶液との混液を添加する方法； （D) 混合鉄 塩水溶液に該 CP S水溶液と塩基水溶液の混液を添加する方法などに分 類することができる。 これら （A)、 （B) 、 （C) 及び （D) 法は添 加順序が相違するのみで、 他の反応条件は本質的には変わらない。
上記混合鉄塩水溶液の調製は、 第 1鉄塩と第 2鉄塩とをモル比で約 1 ： 4ないし約 3 ： 1、 好ましくは約 1 ： 3ないし約 1： 1の割合で水性 媒体中に溶解することにより行なうことができる。 この鉄塩水溶液の濃 度は広い範囲にわたって変えることができるが、 通常約 0.1〜約 3M、 好ましくは約 0.5〜2Mの範囲内が適当である。
鉄塩としては、 例えば塩酸、 硫酸、 硝酸等の鉱酸との塩を挙げること ができ、 また、 塩基としては、 例えば NaOH、 KOH等のアルカリ金 属水酸化物；アンモニア、 トリェチルァミン、 トリメチルァミン等のァ ミン類などから選ばれる少なくとも 1種を使用することができる。 塩基 水溶液の濃度も広範囲にわたり変えることができ、 通常約 0.1〜約 1
0N、 好ましくは約 1〜約 5Nの範囲内が適当である。 用いる塩基の量 は添加終了後の反応液の P Hがほぼ中性ないし約 p H 12になる量、 即 ち鉄塩と塩基との比が約 1 ： 1ないし約 1 ： 1.5 (規定比） となるよ うな量とすることができる。
更に、 使用する CPSの量は、 用いる鉄塩中の鉄の重量を基準にして 約 1〜約 15倍、 好ましくは約 3〜約 10倍とすることができる。 また、 CPS水溶液の濃度も厳密に制限されるものではないが、 通常約 1〜約 40WZV%、 好ましくは約 5〜約 30WZV%の範囲内が適当である。 各水溶液の添加及び混合は撹拌下に室温から約 100°Cまでの加熱下に 行うことができ、 必要に応じて塩基または酸を添加して pHを調整した 後、 約 30〜約 120 °Cの温度で約 10分〜約 5時間、 通常約 1時間加 熱還流することにより反応させる。 こうして得られる反応液は前記第一 の方法におけると同様に精製し、 所望ならば、 pH調整、 濃縮、 さらに は濾過することができる。
得られる複合体全体の粒子直径は通常約 10〜約 300 nmの範囲内 にあることが望ましく、 また、 複合体中の磁性酸化鉄の粒子直径は通常 約 2〜2ひ nmの範囲内にあるのが好都合である。 さらに、 得られる複 合体の 1テスラにおける磁化は一般に鉄 1 g当り約 10〜約 150 em uの範囲内にあることができる。
上記いずれの方法によっても、 得られる原料複合体における CP Sと 磁性酸化鉄との比率は磁性酸化鉄粒子の直径や C P sの分子量等に依存 し、 広い範囲で変化させうるが、 原料複合体は、 一般に磁性酸化鉄中の 鉄 1重量部当り C P Sを約 0. 1〜約 5重量部、 好ましくは約 0. 2〜約 3重量部の範囲内で含有することができる。
なお、 第一及び第二の何れの方法による原料複合体の調製においても、 第 1鉄塩の 5 0モル％以下を他の 2価金属塩、 例えば、 マグネシウム、 カルシウム、 マンガン、 ニッケル、 コバルト、 銅、 亜鉛、 ストロンチウ ム、 バリゥム等の 1種または 2種以上の各塩で置き換えることもでき、 そのような置き換えによって製造される原料複合体も本発明に包含され るものである。
本発明の酸化複合体は、 上記の如くして製造された C P S—磁性酸化 鉄原料複合体を酸化することにより製造することができる。 この酸化に 際して使用される原料複合体は、 一般に、 その磁性酸化鉄の粒子直径が 約 2〜約 3 0 n m、 好ましくは約 4〜1 5 n mの範囲内にあり、 また複 合体の 1テスラにおける磁化は鉄 1 g当り約 1 0〜約 1 5 0 e m u . 好 ましくは約 3 0〜約 1 5 0 e m uの範囲内にあり、 さらに、 複合体の鉄 に対する C P Sの重量比が約 0. 1〜約 5、 好ましくは約 0. 2〜約 3の 範囲内にあることができ、 そして製法としては、 前記第二の方法によつ て得られる複合体が好ましい。
本発明において、 酸化は通常、 原料複合体の水性ゾルに適当な酸化剤 を作用させることにより行なうことができる。 用いうる酸化剤としては、 磁性酸化鉄を酸化して 2価鉄含量を減少させるが、 C P Sを実質的に酸 化もしくは分解しない、 いわゆる副反応を起こさない酸化剤が好ましく、 例えば、 過酸化水素、 オゾンなどの過酸化物や、 さらに好ましくは酸素 ガスまたは酸素ガスと不活性ガスとの混合気体のような酸化性ガスを例 示することができる。
過酸化物による酸化では、 過酸化物として過酸化水素、 オゾン等を例 示することができるが、 中でも過酸化水素が好ましい。 酸化反応の際、
5 原料複合体水性ゾルの濃度は、 特に制限されるものではないが、 一般に は鉄として約 0. 1〜約 4 M、 好ましくは約 0. 5〜約 2 Mの範囲内が適 当である。 この水性ゾルに過酸化物を 2価鉄に対するモル比で約 0. 2 〜約 4倍、 好ましくは約 0. 3〜約 2倍添加し、 好ましくは撹拌し、 約 0〜約 8 0 °C、 好ましくは約 1 5〜約 4 0 °Cで、 約 1 0分ないし約 2 4
1 0 時間、 好ましくは約 1〜約 5時間反応させるのがよい。 所望ならば、 亜 硫酸ナトリウムなどのような過酸化物の分解剤を添加した後、 前記原料 複合体の調製について述べたと同様の方法で精製及び Zまたは調整を行 い、 所望の純度、 濃度及び p Hを有する本発明の酸化複合体水性ゾルを 得ることができる。 この際、 特に限外濾過法で精製する場合に複合体の i s C P S含量が少なくなれば、 所望の濃度まで C P Sを添加することは、 安定性の向上のために好ましい。 得られる水性ゾルは、 それ自体既知の 方法、 好ましくは凍結乾燥法で乾燥することにより、 粉末状の酸化複合 体を得ることもできる。 得られる酸化複合体の全体の粒子直径、 複合体 中の磁性酸化鉄の粒子直径及び複合体の 1テスラにおける磁化は、 原料
20 複合体のそれと比較して実質的に変化がなく、 同程度となる。
一方、 酸化性ガスによる酸化では、 用い得る酸化性ガスとして、 酸素 ガス、 空気、 または窒素ガス、 アルゴンガス、 またはヘリウムガスなど の不活性ガスと酸素ガスとの混合気体を例示することができるが、 酸素 ガスまたは空気が特に好ましい。 所望ならば、 白金、 パラジュゥム、 ィ リジユウム及びそれらの化合物などの触媒を用いることもできる。 酸化 反応に際して、 原料複合体水性ゾルの濃度は、 特に制限されるものでは ないが、 上記と同様に約 0. 1〜約 4 M、 好ましくは約 0. 5〜約 2 Mの 範囲内が適当である。 酸化反応は、 撹拌下に酸化性ガス雰囲気で、 所望 により加圧下さらに Zもしくは超音波照射下に行なうことができる。 酸化反応は、 原料の性質と酸化性ガス濃度、 温度、 p H及び時間を主 要因として進行するが、 反応が進みすぎると複合体が凝集してくる、 酸 化反応の最適条件は実験的に簡単に決めることができる。 一般には、 室 温ないし約 1 2 0 °C、 好ましくは約 6 0〜約 1 0 0 °Cの温度において、 最終 p Hが約 3〜約 8、 好ましくは約 4〜約 6になるように調整し、 約 0. 5時間ないし約 3日間、 好ましくは約 2〜約 1 6時間反応させるこ とができる。 ついで必要ならば、 上記と同様の方法で精製及び Zまたは 調整を行い、 所望の純度、 濃度及び p Hを有する本発明の酸化複合体水 性ゾルを得ることができる。 この際、 特に限外濾過法で精製する場合に 複合体の C P S含量が少なくなれば、 所望の濃度まで C P Sを添加する ことは同様に好ましいことである。 得られる水性ゾルは前記と同様に、 好ましくは凍結乾燥法で乾燥することにより、 粉末状の酸化複合体とし て得ることができる。 酸化性ガス、 特に酸素ガスは、 過酸化物を用いた 場合に比較して副反応がより少ないと言う点で好ましい。 原料複合体と 比較した得られる酸化複合体の形状と物理的性質は、 過酸化物を用いた 場合と同様に実質的に変化がない。
かく して得られる本発明の酸化複合体は、 原料に用いた複合体に比較 して、 少ない 2価鉄含量と血圧に影響を及ぼさない性質、 即ち高い安全 性を有する他は、 原料複合体とほぼ同様な性質を有する。 以下に、 本発 明の酸化複合体の性質についてさらに詳しく説明する。 また、 特に断わ らない限り、 該酸化複合体及び原料複合体についての各種性質の測定方 法は同じである。
本発明の酸化複合体における C P Sに封する磁性酸化鉄の比率は、 主 として用いた原料複合体の比率に左右され、 更に酸化条件や精製条件に よっても変化するが、 一般に、 原料複合体の比率の半分ないし同程度に なる。 この比率が小さくなりすぎる場合には、 該酸化複合体の水性ゾル に原料に用いる CPSを、 例えば、 鉄 1重量部に対し CPSが約 0.5 〜約 4、 好ましくは約 0.8〜約 2重量部になるまで添加すれば、 酸化 複合体の安定性は向上する。
なお、 本明細書における複合体中の鉄含量 （この鉄は磁性酸化鉄に由 来する全鉄が含まれる） は、 例えば Analytical Chem.， 22 (195 0) 326に記載の方法に準拠し、 0—フユナント口リンによる比色定 量法によって決定した値である。 即ち、 複合体の水性ゾルまたは粉末に 濃塩酸を添加し、 含まれる鉄を完全に塩化物までに分解した後、 適当に 希釈し、 検波とする。 この検液 2m 1に 10%塩酸ヒドロキシルァミン . の lm 1を、 次いで 0.4 M齚酸バッファー （pH4) 中の 0.1%o— フエナントロリン試液の 7 m 1を加え、 波長 510n mでの吸光度を求 める。 一方、 鉄基準液と測定に用いた水についても、 同様に吸光度を求 め、 その比率から鉄含量を決定する。
また、 複合体中の C P S含量は、 Analytical Chem.、 25、 1656 (1953) に記載の方法に準拠し、 硫酸一アントロン法で測定したと きの値である。 すなわち、 上記鉄含量の測定に用いた塩酸分解液を適当 に希釈した液を硫酸一アントロン試薬に加えて発色させ、 吸光度を測定 する。 同時に複合体の製造に用いた C P Sを基準物質として、 同様に発 色させ、 吸光度を測定し、 両者の吸光度の比率から C P Sの含量を求め る。
本発明の酸化複合体の全鉄に対する 2価鉄含量は、 酸化条件や磁性酸 化鉄の粒子径などによって変化するが、 一般に約 0〜約 1 0 %、 好まし くは約 2〜約 7 %の範囲内であり、 一方、 原料複合体のそれは一般に約 1 0〜約 3 0 %である。 なお、 全鉄に対する 2価鉄含量は、 空気による 測定中の酸化を防ぐために窒素置換などの配慮をした上で、 1 0 %塩酸 ヒドロキシルアミンの代わりに 1 Mフッ化カリウムを用い、 上記鉄含量 の測定法と同様に操作して求める。
本発明の酸化複合体及び原料複合体を、 粉末 X線回折計 （ターゲッ ト ： C o , 波長： 1. 7 9 O A) を用い X線回折を行うと、 両者の回折パ ターンはいずれもブロードではあるが、 マグネタイト （F e 304) 標準 試料のそれによく一致する。 回折角度については、 原料複合体のそれは マグネタイ卜に一致もしくは近い値を取るが、 酸化複合体のそれはやや 高角側にずれる。 これらのことは、酸化により、 複合体中の磁性酸化鉄 の基本骨格は変わらないが、 格子定数 （結晶単位の長さ） が小さくなつ たことを示している。 なお、 本発明の酸化複合体は X線回折学的に磁性 酸化鉄をその要素とすることを意味し、 結晶水やその表面に水酸基を有 する磁性酸化鉄をも包含する。
また、 ここで得られる回折ピークは、 複合体に含まれる磁性粒子の直 径の減少に従ってブロード、 すなわち小さくなる。 従って、 複合体に含 まれる磁性酸化鉄の粒子直径が 0. l j[i m以下においては、 X線回折に より粒子直径を測定することができる。 すなわち、 X線回折での最強ピ ークについて下記シヱラー （Scherrer) 式に従って粒子直径を計募する ことができる。
D = kス Z ;S · c 0 s 0、
yS=V B2-b2
ここで
D ：粒子直径 （人）
k ：定数、 0.9
λ ： X線波長 （1.79 OA)
Θ ：ブラッグ角 （度）
B ：試料の半値幅 （ラジアン）
b ：標準試料の半値幅 （ラジアン）
なお、 用いる標準試料は粒子直径 1 t m以上のマグネタイ トである。 こうして求めた値は透過型電子顕微鏡から求めた値と比較的良く一致す る。
さらに、 本発明の酸化複合体全体の粒子直径は、 動的光散乱法 [例え ば、 Polymer J.、 13、 1037— 1043 (1981) 参照] により 測定された値であり、 本発明の酸化複合体は一般に約 10〜約 50 O n m、 好ましくは約 20〜約 200 nmの範囲内の直径を有することがで さる。
本発明の酸化複合体は単なる混合物ではなく、 磁性酸化鉄と CPSと の化合物である。 このことは、 例えば、 本発明の酸化複合体水性ゾルを ゲル力ラムで分画すると、 C P Sの溶出位置より高分子側に溶出ピーク が認められ、 かつそのピークの分析により糖及び鉄の両方が検出され、 そして該酸化複合体の製造工程中、 該複合体より小さい粒子を通過させ られるポア一サイズを有した限外濾過膜を用いて精製するとき、 残った 水性ゾルの糖と鉄の比率は次第に一定の値に収束してゆくことなどから 理解できる。
本発明の酸化複合体の磁性 （例えば、 磁化及び保磁力） は、 室温で振 動試料式磁力計を用いて磁化—磁場曲線 （いわゆる M— H曲線） を描き、 これから求めることができる。 本発明の酸化複合体の 1テスラにおける 磁化は、 一般に鉄 1 g当り約 10〜約 150 emu、 好ましくは約 30 〜約 150 emuの範囲内である。 また、 本発明の酸化複合体の保磁力 は約 30ェルステツド以下であり、 実質的に超常磁性である。
水性ゾルの形態の本発明の酸化複合体の T 2 緩和能力は、 本発明の酸 化複合体を水で種々の濃度に希釈した水性ゾル及び希釈に用いた水につ いて、 60MHz (磁場が約 1.4テスラ） の CW— NMRを用い、 水 のプロトンの共鳴曲線を描き、 得られるピークの半値幅： Ai^z2 (単 位： Hz) を求め、 さらに 1ZT2 (単位： s e c—1) = 7τ ·厶リ1/2を 計算し、 1ΖΤ2 と測定試料の水性ゾル中の鉄濃度 （単位： mM) との 関係をグラフにプロッ トし、 最小自乗法で求めた直線の傾きから求める ことができる [単位： （s e c - mM) — 。 かようにして算出される 本発明の水性ゾルの形態の酸化複合体の T 2 緩和能力は、 一般に、 約 5 〜約 1000 (s e c - mM) — 好ましくは約 10〜約 500、 さら に好ましくは約 20〜約 300 (s e c · mM) —1の範囲内である。 原料複合体の水性ゾルを例えば兎に静脈内投与すると、 従来既知の様 々な磁性酸化鉄製剤と同様に、 数分後には兎の血圧は著しく低下し、 場 合によっては死に至ることさえある。 ところが、 全く予想外のことでは あるが、 本発明の酸化複合体では、 この様な血圧低下が全く起こらない か、 もしくは血圧低下の程度が非常に小さく、 著しい改善がみられる。 同様に、 本発明の酸化複合体は血小板凝集作用が著しく少ないことも 分かった。 即ち、 各複合体の水性ゾルを例えば兎に静脈内投与し、 5分 後の血液中の血小板数を投与直前の血小板数に対する比率 （すなわち血 小板の残存率、 ％) を求めると、 一般に、 原料複合体では約 1〜約 2 0 %であるのに対し、 本発明の酸化複合体では約 2 0〜約 1 0 0 %となり、 著しく改善される。
さらに、 本発明の酸化複合体は、 従来既知の未酸化複合体もしくは微 小球と比較して、 牛製アルブミンとの相互作用に大きな差を有する。 す なわち、 後記試験例 3に示すように、 従来既知の複合体もしくは本発明 の酸化複合体の各ゾルと牛製アルブミン水溶液とを混和するとき、 従来 既知の複合体はアルブミンと相互作用を起こし、 著しい凝集が起るが、 本発明の酸化複合体ではアルブミンとの相互作用はきわめて弱く、 相互 作用の結果生ずる凝集は実質的に認められないかもしくは極くわずかで ある。
—方、 マウスを用いた静脈内投与による各複合体の急性毒性 L D 50 の比較では、 本発明の酸化複合体のそれは、 鉄として約 1 5〜約 8 0 m m o 1 /K gであり、 原料複合体のそれと同等である。
また、 各複合体を鉄として 5 mm o 1 /K gの量ずつマウスに静脈内 投与し、 その 5分後に摘出した肺の病理組織学的検査成績による比較で も、 本発明の酸化複合体のそれは原料複合体のそれと同様である。 すな わち、 へマトキシリン ·ェォシン染色およびべルリン ·ブルー染色を施 したいずれの組織標本でも塞栓を認められず、 それ以外の異常も認めら れない。 さらに、 各複合体水性ゾルの少なくとも複合体の磁性酸化鉄部分は、 静脈内投与後速やかに細網内皮系の発達した臓器、 例えば肝臓、 脾臓、 骨髄等に集積し易く、 特に低投与量 （例えば鉄として 0. l mm o 1 Z K g以下） では投与した複合体の大半、 おそらく実質的に全てが肝臓の クッパー星細胞に集積することが分かっている。 この事実に基き、 CW — NMRを用いて肝臓の磁化の程度を測定することにより、 これら複合 体の代謝性を評価した。
すなわち、 複合体水性ゾルを鉄として 0. l mm o l ZK gの量をラッ トに静脈内投与し、 例えば投与後 1時間、 2時間、 4時間、 1曰、 3曰、 7曰及び 1 4曰経過した時点でラッ 卜の肝臓について、 T 2 緩和能力の 測定と同様にして 1 ΖΤ 2 (単位： s e c -1) を求め、 未投与ラット群 の肝臈の 1 ZT2 値による補正をした後、 投与後の時間との関係から各 複合体の代謝性を半減期 （Half life) として算出する。 本発明の好ま しい態様、 例えば実施例 1に示される酸化複合体の半減期は約 4曰であ り、 一方、 参考例 2に示される原料複合体のそれも約 4曰であり、 酸化 は代謝性に対して影響を与えないことが分る。
しかして、 本発明の酸化複合体は生物学分野及び医療分野、 例えば鉄 捕耠剤、 X線造影剤、 MR I造影剤、 温熱療法の際の発熱助剤、 血流の 測定、 さらには磁場を利用した局所への薬物の集中投与の際の担体など として安全に使用することができ、 この内でも、 血管内へ投与する使用 方法において特に有利に使用することができる。
MR I造影剤として好ましく使用し得る本発明の酸化複合体は、 投与 方法や目的とする組織によって広く変え得るが、 一般に、 C P Sの数平 均分子量が約 5 0 0〜約 3 0万、 好ましくは約 1 0 0 0〜約 5万、 より 好ましくは約 1500〜約 2万の範囲内にあり、 磁性酸化鉄の粒子直径 が約 2〜約 30 nm、 好ましくは約 5〜約 15 nmの範囲内にあり、 そ して T2 緩和能力が一般に約 5〜約 1000 (s e c * mM) — 好ま しくは約 10〜約 500 (s e c · mM) 1、 より好ましくは約 20〜 約 300 (s e c - mM) 1 の範囲内にあるものが好適である。
本発明の酸化複合体を MR I造影剤として使用する場合には、 酸化複 合体を水性ゾルの形態で使用することが望ましい。 この際の酸化複合体 の濃度は広範囲にわたって変えることができるが、 通常鉄換算で約 lm mo 1 1ないし約 4mo 1ノし 好ましくは約0.01〜約21110 1 Z1の範囲内を例示することができる。 また、 水性ゾルの調製に際して は、 例えば塩化ナトリウムなどの無機塩；ブドウ糖などの単糖類；マン ニッ ト、 ソルビッ ト等の糖アルコール類；酢酸塩、 乳酸塩、 クェン酸塩、 酒石酸塩などの有機酸塩；あるいはリン酸緩衝剤、 トリス緩衝剤などの 生理学的に許容される種々の助剤を添加することもでき、 さらには種々 のリンゲル液に該酸化複合体水性ゾルを添加することもできる。
本発明の酸化複合体を MR I造影剤として使用する場合のその使用量 は、 診断部位によって異なるが、 通常鉄換算で約 1 mo lZKg〜約 1 Ommo 1 /Kg体重、 好ましくは約 2 /mo 1 ZKg〜約 lmmo lZKg体重の範囲内である。 投与方法としては、 例えば、 静脈内、 動 脈内、 膀胱内、 筋肉内、 皮下などへの注射、 注入などが挙げられるが、 場合によっては経口投与または腸内直接投与も可能である。 例えば好ま しい形態の本発明の酸化複合体を静脈内投与すると、 比較的速く、 例え ば数時間以内にその多くが細網内皮系、 特に肝臓に集まり、 その結果肝 臓の MR I撮影が好適におこなわれる。 この際、 肝臓にたとえば癌など の細網内皮系機能の低下した病変部があれば、 他の正常部位と比較して 病変部には本発明の酸化複合体が全くまたは少ししか集まらないので、 病変部の MR I撮影による特定を容易に行うことができる。 なお、 本発 明の酸化複合体は T2 画像のみならず 画像に対しても造影剤として の効果を有している。
図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1で製造された酸化複合体の粉末 X線回折計 （ターゲッ ト ： Co、 波長： 1.790人） を用いて得られた X線回折図であり、 図 2は、 参考例 2で製造された原料複合体の粉末 X線回折計 （タ一ゲッ ト ： Co、 波長： 1.79 OA) を用いて得られた X線回折図である。 実施例
以下、 本発明を参考例、 実施例等によってさらに具体的に説明する。 参考例 1
分子量 4, 000のデキストランを水酸化ナトリウムを用いて加熱処 理して得られるカルボキシデキストラン （変換率 95%) 105 gを水 350mlに溶解し、 これに 1M—塩化第二鉄水溶液 140m 1 (塩化- 第二鉄 ·六水塩 37.8 g相当） に塩化第一鉄 ·四水塩 13.6 gを窒素 気流下で溶解した水溶液を加え、 さらに加温しながら、 撹拌下に 3規定 水酸化ナトリウム水溶液を 242m 1添加する。 次いで 6規定塩酸を加 え pHを 7.0に調整した後、 1時間 30分加熱還流する。 冷後、 2, 1 00 xGで 30分間遠心分離し、 上清体積の 93%のエタノールを添加 して複合体を沈殿させ、 2, 10 OxG-で 10分間遠心分離し、 得られ た沈殿物を水に溶解し、 16時間流水透析する。 透析液の pHを水酸化 ナトリウムで 7.2に調整し、 減圧濃縮し、 次いでメンブレンフィルタ 一 （ポア一サイズ： で濾過を行ない目的とする複合体水性 ゾル （参考例 1) 190m l (鉄濃度： 56mgZm l ) を得る。 磁性 酸化鉄の粒子径： 8.8 n m、 全体の粒子径： 70 n m、 CP S 鉄重 量比： 1.08、 1テスラにおける磁化： 91 emuZl g鉄、 T2 緩 和能力： 230 (mM · s e c) 1、 全鉄中の二価鉄割合： 21%。
参考例 2
参考例 1で用いたカルボキシデキストラン1, 050 を水3, 500 m lに溶解し、 これに 1M—塩化第二鉄水溶液 1， 400m 1 (塩化第 二鉄 ·六水塩 378 g相当） に塩化第一鉄 ·四水塩 136 gを窒素気流 下で溶解した水溶液を加え、 さらに加温しながら、 撹拌下に 3規定水酸 化ナトリウム水溶液を 2, 420m l添加する。 次いで 6規定塩酸を加 え pHを 7. 1に調整した後、 2時間加熱還流する。 冷後 2, 100 XG で 30分間遠心分離し、 上清をメンブレンフィルター （ポア一サイズ： 0.2 urn) で濾過し、 水を加えて 10 1 とし、 限外濾過 （分画分子量 ： 10万ダルトン） で 1.5 1まで濃縮した後、 濃縮液に水を加えなが ら排出液量が 12 1になるまで限外濾過 （分画分子量： 10万ダルトン） を行ない、 濾過内液にカルボキシデキストランと鉄の重量比が 1 ： 1に なるように所定量のカルボキシデキストランを添加した後、 pHを水酸 化ナトリウムで 7.0に調整し、 2， 100 xGで 1時間 30分間遠心分 離し、 上清をメンブレンフィルター （ポア一サイズ： 0.2 πι で濾 過を行なって目的とする複合体水性ゾル （参考例 2) 1.9 1 (鉄濃度 ： 57mg/m 1 ) を得る。 磁性酸化鉄の粒子径： 8.6 nm、 全体の 粒子径： 64nm、 CP Sノ鉄重量比： 1.03、 1テスラにおける磁 ィ匕： 89 emu/1 g鉄、 T2 緩和能力： 220 (mM - s e c) "1, 全鉄中の二価鉄割合： 23%。
参考例 3
アンバーライ ト I RA— 410 (ロー アンドハース社製イオン交換 樹脂） 1000mlに水 580mlを加えて得られるスラリーに、 撹拌 下に 30 以下で5»11を8.0〜8.7に維持しながら 1M塩化第二鉄水 溶液 200mlおよび 1 M塩化第一鉄水溶液 100mlの混合液を添加 し、 続いて濃塩酸を加えて pHを 1.5にし、 同一 pHで 1時間撹拌す る。 次いでイオン交換樹脂と濾別したゾルを 10時間流水透析すると、 磁性酸化鉄水性ゾル （pH3.5、 鉄濃度 12.8mgZml ) が得られ る。 このゾル 980m lに参考例 1で用いたカルボキシデキストラン 1 00 gを加えて 40分間加熱還流し、 冷後、 エタノール 840mlを加 え、 2, 100 xG、 10分間遠心分離する。 沈殿を水に溶解し 16時 間流水透析し、 透析液に所定量のカルボキシデキストランを添加し、 こ れを水酸化ナトリウム水溶液で pHを 7.2に調整し、 減圧濃縮し、 次 いでメンブレンフィルター （ポア一サイズ： 0.45 m) で濾過を行 ない目的とする複合体水性ゾル （参考例 3) 21 Oml (鉄濃度： 54 mgXm 1 ) を得る。 磁性酸化鉄の粒子径： 6.5 nm、 全体の粒子径 ： 80 nm、 CP SZ鉄重量比： 0.86、 1テスラにおける磁化： 8 5 emu/1 g鉄、 T2 緩和能力： 195 (mM - s e c) 全鉄中 の二価鉄割合 9.0%。
参考例 4
分子量 20， 000のデキストランを水酸化ナトリウムを用いて加熱 処理して得られるカルボキシデキストラン （変換率 90%) 167 gを 水 700m lに溶解し、 これに 1M—塩化第二鉄水溶液 280ml (塩 化第二鉄 ·六水塩 75.6 g相当） に塩化第一鉄 ·四水塩 27.2 gを窒 素気流下で溶解した水溶液を加え、 さらに加温しながら、 撹拌下に 3規 定水酸化ナトリウム水溶液を 484ml添加する。 次いで 6規定塩酸を 加え pHを 7.0に調整した後、 1時間 30分加熱還流する。 冷後、 2, 100 X Gで 30分間遠心分離し、 上清の 55%のエタノールを添加し て複合体を沈澱させ、 2, 100 xGで 10分間遠心分離する。 得られ た沈澱物を水に溶解し、 その溶液体積の 57%のエタノールを添加して 複合体を再沈澱させ、 2, 10 OxGで 10分間遠心分離し、 得られた 沈澱物を水に溶解し、 16時間流水透析する。 透析液の pHを水酸化ナ トリウムで 7.2に調整し、 減圧濃縮し、 次いでメンブレンフィルター (ポア一サイズ： 0.2^m) で濾過を行ない目的とする複合体水性ゾ ノレ （参考例 4) 390ml (鉄濃度： 56mgZm 1 ) を得る。 磁性酸 化鉄の粒子径： 7.8 n m、 全体の粒子径： 63 n m、 CPS 鉄重量 比： 1.12、 1テスラにおける磁化： 85 emuノ 1 g鉄、 T2 緩和 能力： 195 (mM · s e c) 、 全鉄中の二価鉄割合： 16%。
参考例 5
分子量 10, 000のデキストリン （デンプン） を水酸化ナトリウム を用いて加熱^理して得られるカルボキシデキストリン （変換率 73%) 147gを水 700mlに溶解し、 これに' 1 M—塩化第二鉄水溶液 28 0ml (塩化第二鉄，六水塩 75.6 g相当） に塩化第一鉄 · 4水塩 2 7.2 gを窒素気流下で溶解した水溶液を加え、 さらに加温しながら、 撹拌下に 3規定水酸化ナトリウム水溶液 484mlを添加する。 次いで 6規定塩酸を加えて pHを 7.0に調整した後、 1時間加熱還流する。 冷後、 2, 100 xGで 30分間遠心分離し、 上清液にエタノールを 0. 74倍量添加して複合体を沈澱させ、 得られた沈澱物を水に再溶解し、 16時間流水透析する。 透析液の p Hを水酸化ナトリウムで 7.2に調 整し、 減圧濃縮し、 次いでメンブレンフィルター （ポア一サイズ： 0.
45 n ) で濾過し、 原料複合体水性ゾル （参考例 5) 390m l (鉄 濃度： 56mgZm 1 ) を得る。 磁性酸化鉄の粒子径： 5.1 nm、 全 体の粒子径： 53 nm、 C P S Z鉄重量比： 2.04、 1テスラにおけ る磁ィヒ： 45 emuZl g鉄、 T2 緩和能力： 40 (mM · s e c) 一1、 全鉄中の二価鉄割合： 13%。
比較例 1
分子量 20, 000のデキストラン 75 gを水 56m lと 25%アン モニァ水 100m lの混合液に溶解し、 そこへ塩化第一鉄 ·六水塩 20.
5 gおよび塩化第二鉄 ·四水塩 11.3 gを含有する 150m lの溶液 を激しく撹拌しながら 5分間かけて徐々に加える。 生成したスラリーを 超音波破碎 （20分） し、 80°Cで 30分撹拌したのち、 塩酸で pHを 7.6とし、 次いで加熱 （100°C、 1時間） 、 冷却し、 2, 100 xG で 30分遠心分離する。 得られる上清液 420m lにエタノール 320 m lを加えて、 複合体を沈緞させ、 2, 100 XGで 10分遠心分離す る。 得られた沈澱物を水に溶解させ （400m l ) 、 エタノール （20 5m l ) を加えて複合体を再沈激させ、 2, 100 XGで 10分遠心分 離する。 得られた沈殿物を水に溶解し、 16時間流水透析する。 透析液 の pHを水酸化ナトリウムで 7.6に調整し、 減圧濃縮し、 次いでメン ブレンフィルター （ポア一サイズ： 0.45 ^m) で濾過を行なって目 的とする微小球水性ゾル （115m I (鉄濃度： 57mg/m 1 ) を得 る。 酸化磁性酸化鉄の粒子径： 7.4 nm、 全体の粒子径： 96 nm、 CP SZ鉄重量比： 1.25、 1テスラにおける磁化： 90 emu/1 g鉄、 T2 緩和能力： 220 (mM · s e c) 、 全鉄中の二価鉄割合 ： 14%。
実施例 1
参考例 1で用いたと同じカルボキシデキストラン 1, 050 gを参考 例 2に従って水 3， 500mlに溶解し、 これに 1 M—塩化第二鉄水溶 液 1, 400ml (塩化第二鉄 ·六水塩 378 g相当） に塩化第一鉄， 四水塩 136 gを窒素気流下で溶解した水溶液を加え、 さらに加温しな がら、 撹拌下に 3規定水酸化ナトリゥム水溶液を 2, 420ml添加す る。 次いで 6規定塩酸を加え pHを 7.1に調整した後、 2時間加熱還 流する。 冷後 2， 100 xGで 30分間遠心分離し、 上清をメンブレン フィルター （ポア一サイズ： 0.2 m) で濾過し、 その濾過液に水を 加えて 101とし、 限外濾過 （分画分子量： 10万ダルトン） で 1.5 1まで濃縮した後、 濃縮液に水を加えながら排出液量が 121になるま で限外濾過 （分画分子量： 10万ダルトン） を行なって、 カルボキシデ キストランと鉄の重量比が 0.4 ： 1となった複合体水性ゾル 1.91 (鉄濃度： 57mgZm 1 ) の pHを水酸化ナトリウムで 7.5に調整 した後、 水酸化ナトリウムで反応 P Hが 4.2以下にならないように調 整しながら酸素ガスを用いて 95°Cで 3時間 30分酸化する。 冷却後、 反応液を限外濾過 （分画分子量： 10万ダルトン） で 1 1に濃縮し、 濃 縮液に水を加えながら排出液量が 121になるまで限外濾過 （分画分子 量： 10万ダルトン） を行ない、 濾過内液にカルボキシデキストランと 鉄の重量比が 1 ： 1になるように所定量のカルボキシデキストランを添 加した後、 pHを水酸化ナトリウムで 7.0に調整し、 遠心分離し、 上 清をメンブレンフィルター （ポア一サイズ： 0.2 wm) で瀘過を行なつ て目的とする複合体水性ゾル （実施例 1) 1. 75 1 (鉄濃度： 56m g/m 1 ) を得る。 酸化磁性酸化鉄の粒子径： 8.5 nm、 全体の粒子 径： 67 nm、 CP S 鉄重量比： 1.08、 1テスラにおける磁化： 87 emuZl g鉄、 T2 緩和能力： 210 (mM - s e c) "\ 全鉄 中の二価鉄割合： 3.4%。
実施例 2
参考例 1に従って調製した複合体水性ゾル 1 1 (鉄濃度： 56mgZ m l ) を、 酸素ガスを用いて 95 °Cで 7時間酸化し、 冷却後、 実施例 1 と同様に処理して目的とする複合体水性ゾル （実施例 2) 950m l (鉄濃度： 55mgZm 1 ) を得る。 酸化磁性酸化鉄の粒子径： 8.8 nm、 全体の粒子径： 68 nm、 CP SZ鉄重量比： 1.05、 1テス ラにおける磁化： 88 emu/1 g鉄、 T2 緩和能力： 220 (mM · s e c) "\ 全鉄中の二価鉄割合： 3.3%。
実施例 3
参考例 2に従って合成反応を行ない、 その加熱還流液の濾過液に水を 加えて 10 1とした複合体反応液を、 限外濾過 （分画分子量： 10万ダ ルトン） で 1.5 1まで濃縮してカルボキシデキストランと鉄の重量比 が 1.4 ： 1となった複合体水性ゾル 1 1 (鉄濃度： 56mgZm l ) を、 酸素ガスを用いて 95 °Cで 7時間酸化し、 冷却後、 実施例 1と同様 に処理して目的とする複合体水性ゾル （実施例 3) 960m l (鉄濃度 ： 56mg/m l ) を得る。 酸化磁性酸化鉄の粒子径： 8.6 nm、 全 体の粒子径： 69 nm、 CP SZ鉄重量比： 1.07、 1テスラにおけ る磁化： 86 emu/1 g鉄、 T2 緩和能力： 220 (mM · s e c)' 全鉄中の二価鉄割合： 3.6%。
実施例 4
参考例 4に従って調製した複合体水性ゾル 300ml (鉄濃度： 56 mg/m 1 ) を実施例 1と同様にして酸素ガスを用いて 95°Cで 3時間 30分酸化し、 冷却後、 16時間流水透析する。 透析液の pHを水酸化 ナトリウムで 7.2に調整し、 減圧濃縮し、 次いでメンブレンフィルタ 一 （ポア一サイズ： 0.2 m) で濾過を行ない目的とする複合体水性 ゾル （実施例 4) 285ml (鉄濃度： 55mg/ml) を得る。 酸化 磁性酸化鉄の粒子径： 7.7 n m、 全体の粒子径： 78nm、 CPSノ 鉄重量比： 0.97、 1テスラにおける磁化： 84 emuZl g鉄、 T2 緩和能力： 205 (mM - s e c) "1, 全鉄中の二価鉄割合： 1.7%。
実施例 5
参考例 3に従って調製した複合体水性ゾル 300m 1 (鉄濃度： 56 mg/m 1 ) を実施例 1と同様にして酸素ガスを用いて 90°Cで 3時間 酸化し、 冷却後、 16時間流水透析する。 透析液にカルボキシデキスト ランと鉄の重量比が 1 ： 1になるように所定量のカルボキシデキストラ ンを添加した後、 pHを水酸化ナトリウムで 7.2に調整し、 減圧濃縮 し、 次いでメンブレンフィルター （ポア一サイズ： 0.2 m) で濾過 を行ない目的とする複合体水性ゾル （実施例 5) 285ml (鉄濃度： 54mg/m 1 ) を得る。 酸化磁性酸化鉄の粒子径： 6.4 nm、 全体 の粒子径： 88 nm、 C P SZ鉄重量比： 1.10、 1テスラにおける 磁化： 85 emu/1 g鉄、 T2 緩和能力： 220 (mM - s e c) "1 全鉄中の二価鉄割合： 2.1%。
実施例 6 参考例 2に従って調製した複合体水性ゾル 500ml (鉄濃度： 56 mgZml) に室温で 35%過酸化水素水 6.7m 1を加え、 2時間撹 拌し、 亜硫酸ナトリウム 13 gを加えた後、 流水で 16時間透析する。 透析液の pHを水酸化ナトリウムで 7.2に調整し、 減圧濃縮し、 次い でメンブレンフィルター （ポア一サイズ： 0.2^m) で濾過を行ない 目的とする複合体水性ゾル （実施例 6) 450ml (鉄濃度： 56mg Zm 1 ) を得る。 酸化磁性酸化鉄の粒子径： 8.7 nm、 全体の粒子径 ： 58nm、 CP SZ鉄重量比： 0.76、 1テスラにおける磁化： 8 9 emu/1 g鉄、 T2 緩和能力： 200 (mM - s e c) ~ 全鉄中 の二価鉄割合： 5.3%。
実施例 7
参考例 5で得られた複合体水性ゾル 300m 1を、 水酸化ナトリウム で反応液の p Hが 4.3以下にならないように調整しながら、 酸素ガス を用いて 95°Cで 3時間 30分間酸化する。 冷後、 16時間流水透析し、 以下実施例 4と同様にして目的とする酸化複合体水性ゾル （実施例 7 ) 290ml (鉄濃度： 55mgZml) を得る。 酸化酸化鉄の粒子径： 5.6 nm、 全体の粒子径： 45 nm、 CP SZ鉄重量比： 1.53、 1 テスラにおける磁化： 43 emu/1 g鉄、 T2緩和能力： 37 (mM · s e c) 1、 全鉄中の二価鉄割合： 3.4%。
試験例 1
参考例 1〜 5、 比較例 1および実施例 1〜 7で製造した各複合体水性 ゾルについて血圧試験を行なった。 体重 2.5〜3 k gの兎を用い、 シ リコンチューブによって水銀マノメーターに繫がれた力ニューレを兎頸 動脈内に挿入し、 血圧の変動に伴う水銀の動きをガラス製フロート付き ヘーベルを介して煤煙紙上に描かせる観血法を行なった。 被検液は、 複 合体濃度が鉄として 1 OmgZm 1となるように生理食塩水を用いて希 釈調製したものを用い、 1 Omg鉄 Zk g兎体重の投与量を耳介静脈内 に投与した。 血圧測定の結果を表 1に示す。 試験例 2 参考例 1〜 5、 比較例 1および実施例 1〜 7で製造した各複合体水性 ゾルについて血小板数に与える影響を調べた。 体重 2〜3 k gの兎を用 い、 対照血を採血した後、 被検液を鉄として 5m g/ 0.5ml Zkg の量ずつ静脈内投与し、 その 5分後および 60分後に採血し、 ブレツヒャ 一一クロンカイ ト （Brecher-Cronkite) 法により、 EDTA加血とし、 1%シユウ酸アンモニゥム液で 101倍希釈し、 血球計算板に入れて位 相差顕微鏡で血小板数を測定した。 血小板数の測定結果を対照血の血小 板数に対する比率 （残存率） として表 1に示す。 表 1. 血圧測定結果および血小板数測定結果 血小板数 (残存率：％)
複合体番号 血 圧 投与後時間
5分 1時間
参考例 1 36mmH g低下 3 9
参考例 2 44 mmH g低下 4 12
参考例 3 3 ImmHg低下 6 10
参考例 4 49 mmH g低下 2 8
参考例 5 26mmHg低下 15 63
比較例 1 5 OmmHg低下 1 7
実施例 1 低下せず 68 105
実施例 2 低下せず 57 101
実施例 3 低下せず 52 83
実施例 4 低下せず 56 90
実施例 5 低下せず 20 60
実施例 6 低下せず 38 85
実施例 7 低下せず 66 90 922586
試験例 3
参考例 1〜 5、 比較例 1および実施例 1〜 7で得られた各複合体水性 ゾルについて、 牛製アルブミン （和光純薬株式会社製、 一級試薬） との 相互作用を調べた。 各複合体水性ゾルをマクルバイン （Mcllvaine) の 緩衝液 （リン酸水素ニナトリウム一クェン酸緩衝液： PH3.4) で 1 00倍に希釈した液 （鉄濃度 0.55mgZml相当） と、 等容量の 1 %アルブミン水溶液を混合し、 60°Cの恒温槽中で 60分間放置した。 反応液を室温まで放冷した後、 波長 800 nmでの透過率を測定した。 なお、 対照品として緩衝液とアルブミン水溶液の代わりに蒸留水のみで 各複合体水性ゾルを測定濃度に希釈した液 （透過率 100%とする） を 用いた。 結果を表 2に示す。
表 2. アルブミンとの相互作用
Figure imgf000030_0001
試験例 4
参考例 1〜 5及び実施例 1〜 7で製造した複合体水性ゾルについて、 インビボ MR像の撮影を行った。 即ち、 肝臓内にノビコフ （Nov i k o f f) 腫瘍を移植したウィスター （Wi s t e r) 系ラッ トに複合体 水性ゾルを金属として 20 mo 1量ずつ静脈内投与し、 シスコ （S i s c 0) 社 （米国、 カリフォルニア） 製動物用 MR I装置を用いてスピ ンエコー法により、 繰り返し時間 400ms e c. エコー時間 25ms e cの条件で MR像の撮影を行った。
複合体水性ゾル投与前の MR像では、 いずれのラッ 卜においても、 腫 瘍結節が不明瞭で、 大きさも形状も、 また、 位置すらも判別できなかつ
7 o
一方、 参考例 1 5で製造した複合体水性ゾルを投与した後の MR像 では、 いずれのラッ トにおいても、 肝臓部位の腫瘍結節が位置、 形状及 び大きさともに明確に判別できた。
また実施例 1〜7で製造した複合体水性ゾルを投与した後の MR像も、 参考例 1 5で製造した複合体水性ゾルの場合と全く同様に、 いずれの ラッ 卜においても、 肝臓部位の腫瘍結節が位置、 形状及び大きさともに 明確に判別できた。
産業上の利用可能性
以上述べたとおり、 本発明の酸化複合体は、 毒性が極めて少なく且つ. 安全性に優れており、 動物の血管内に直接投与しても血圧低下作用を殆 んどまたは全く示さず、 しかも血小板凝集作用も小さく、 生物学分野及 び医療分野において、 鉄補給剤、 X線造影剤、 MR I造影剤、 温熱療法 の際の発熱助剤、 血流の測定、 磁場を利用した局所への薬物の集中投与 の際の担体などとして利用することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 水溶性力ルボキシ多糖と磁性酸化鉄超微粒子とからなる複合体で あって、 該複合体が酸化されていることを特徵とする水溶性力ルボキシ 多糖一磁性酸化鉄酸化複合体。
2. 水溶性カルボキシ多糖がデキストラン、 デンプン及びプルランか ら選ばれる請求の範囲第 1項記載の酸化複合体。
3. 水溶性カルボキシ多糖の分子量が 500から 300， 000の範 囲内にある請求の範囲第 1または 2項記載の酸化複合体。
4. 水溶性カルボキシ多糖の分子量が 1000から 50, 000の範 囲内にある請求の範囲第 1〜3項のいずれかに記載の酸化複合体。
5. 磁性酸化鉄の粒子径が 2ないし 30 nmの範囲内にあり、 鉄 1 g あたりに換算した 1テスラにおける磁化が 10ないし 150 emuの範 囲内にある請求の範囲第 1〜 4項のいずれかに記載の酸化複合体。
6. 複合体が水性ゾルの状態で酸化されている請求の範囲第 1〜 5項 のいずれかに記載の酸化複合体。
7. 酸化が酸素ガス、 空気及び過酸化水素から選ばれる酸化剤を用い て行なわれる請求の範囲第 1〜 6項のいずれかに記載の酸化複合体。
8. 酸化が室温ないし 120°Cの範囲内の温度で行なわれる請求の範 囲第 1〜 7項のいずれかに記載の酸化複合体。
9. 請求の範囲第 1〜 8項のいずれかに記載の酸化複合体を含有する ことを特徵とする MR I造影剤。
10. 請求の範囲第 1〜8項のいずれかに記載の酸化複合体の有効量 を被験者に投与し、 MR I造影を行なうことを特徴とする MR I造影法。
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