WO1994005786A1 - Herstellung von heterodimerem pdgf-ab mit hilfe eines bicistronischen vektorsystems in säugerzellen - Google Patents

Herstellung von heterodimerem pdgf-ab mit hilfe eines bicistronischen vektorsystems in säugerzellen Download PDF

Info

Publication number
WO1994005786A1
WO1994005786A1 PCT/EP1993/002295 EP9302295W WO9405786A1 WO 1994005786 A1 WO1994005786 A1 WO 1994005786A1 EP 9302295 W EP9302295 W EP 9302295W WO 9405786 A1 WO9405786 A1 WO 9405786A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pdgf
cells
arg
rpdgf
expression unit
Prior art date
Application number
PCT/EP1993/002295
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfram Eichner
Volker Achterberg
Albrecht DÖRSCHNER
Wolfgang Meyer-Ingold
Heiko Mielke
Wilhelm Dirks
Manfred Wirth
Hansjörg HAUSER
Original Assignee
Beiersdorf Ag
Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beiersdorf Ag, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH filed Critical Beiersdorf Ag
Priority to US08/387,845 priority Critical patent/US5665567A/en
Priority to DK93919177T priority patent/DK0658199T3/da
Priority to EP93919177A priority patent/EP0658199B1/de
Priority to DE59309088T priority patent/DE59309088D1/de
Priority to AU49538/93A priority patent/AU4953893A/en
Priority to JP50683294A priority patent/JP3515111B2/ja
Publication of WO1994005786A1 publication Critical patent/WO1994005786A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Definitions

  • the invention relates to the recombinant production of PDGF-AB (rPDGF-AB) in mammalian cells as host cells, which is essentially free of the homodimeric accompanying products PDGF-AA and -BB.
  • the genes are integrated separately into expression vectors and then transferred to the cells in a suitable ratio. This presupposes that several plasmid copies are stably recorded at the same time and carried on during the division.
  • the ratio of the expression of the various genes to one another depends both on the number of copies and on the integration site in the genome of the host cell. Complex screening methods make it possible to isolate cell clones which express the individual gene products in the desired ratio to one another.
  • the various genes are placed in independent transcription units on a vector. This largely ensures the stoichiometric representation of the genes, but this method also has problems. Even if expression units with promoters of the same strength are used, it is by no means ensured that the mRNAs which code for the different proteins have the same stability and translation efficiency. Also the transcription efficiency the two genes do not necessarily have to be identical. In this case, the stoichiometry of the expression is produced step by step with the help of genetic engineering tricks (positioning the transcription units relative to one another, modulating the strength of the individual promoters by removing or adding individual elements).
  • bi- or multicistronic vectors have been developed.
  • the individual reading frames of the gene sections encoding the protein chains - cistrons - lie on a transcription unit (expression unit).
  • the multicistronic gene is expressed by a single promoter. With such vectors, the first cistron is normally translated very efficiently, but the subsequent ones depending on the intercistronic sequences.
  • Translation plays the key role when using bi- or multicistronic vectors. Translation is normally initiated in eukaryotes by the "cap” -dependent mechanism, in the course of which a pre-initiation complex of proteins and RNA is built up at the 5 'end of an mRNA with “cap” (methylated nucleotide). From there, a suitable one Translation initiation codon selected, from which the translation is started. It is believed that this is a “scanning" process expires, ⁇ wherein the pre-initiation complex along the mRNA moved in 3 'direction. With a few exceptions, the cestron at the 5 'end is always efficiently translated in this way (Kozak, 1989). All subsequent cistrons are not translated at all or are translated very inefficiently.
  • the translation efficiency of the subsequent cistrons could be improved by optimizing the distance between the genes (intercistro- tic regions; Kozak, 1987; Wirth et al., 1991) or by using so-called "high efficiency leader” sequences (HEL, see above) (e.g. Falcone and Andrews, 1991 and Ref. therein).
  • HEL's are those 5 'untranslated regions of genes or other sequences which stimulate the initiation of the "cap” dependent translation. Even with such constructs, however, the achievable expression values for the second and subsequent cistrons are always significantly lower than those of the first cistron, which is regulated depending on the "cap".
  • a mechanism for internal translation initiation uses specific nucleic acid sequences. These sequences include the untranslated areas of individual picoma viruses, eg polio virus, encephalomyocarditis virus (Pelletier and Sonenberg, 1988; Jang et al., 1988; Jang et al., 1989) and some cellular ones Proteins, e.g. BiP (Macejak and Sarnow, 1991).
  • polio virus encephalomyocarditis virus
  • BiP Macejak and Sarnow, 1991.
  • IRES internal ribosomal entry site
  • IRES elements can thus act as initiators for the efficient translation of reading frames. They do not influence the "ca" -dependent translation of the first cistron. Conversely, influencing the IRES-dependent initiation appears to be independent of the "cap” -dependent translation initiation.
  • the mechanisms of both processes also differ significantly in the use of different cellular factors (Meerovitch et al., 1989; Jang and Wimmer, 1990).
  • bicistronic expression plasmids Adam et al., 1991; Ghattas et al., 1991; Kauf an et al., 1991; Wood et al., 1991; Wirth et al., 1991).
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • the protein chains PDGF-A and -B are encoded by different genes.
  • the complete structure of both gene products could be elucidated by cDNA cloning (Ratner et al., 1985, Betsholtz et al., 1986). It was found that both PDGF molecules are first synthesized as unusually long precursor molecules, so-called precursors, and then processed intracellularly to form the mature PDGF chains.
  • Alternative splitting can be used to explain two different PDGF-A transcripts, which differ in the 3 'range due to the presence or absence of a 69 bp segment (Betsholtz et al., 1986; Wise et al., 1989).
  • This insert results in a change in the coding section with the result that a short (PDGF-A K , 110 amino acids) and a long (PDGF-A L , 125 amino acids) form of the PDGF-A chain is formed . Both variants can be detected side by side as normal cellular proteins, the shorter form being the more common species (Matoskova et al., 1989; Young et al., 1990).
  • Both genes are located on different chromosomes and show a high degree of homology. A large number of studies show that both genes are subject to different regulatory mechanisms. One consequence of this is that both PDGF chains are naturally produced in different cell types in different ratios to one another.
  • PDGF-AB All three possible isoforms of PDGF (AA, AB and BB) occur naturally and are stored in platelets in so-called ct granules. From overlaid human platelets In addition to the main PDGF-AB heterodimer, PDGF-BB can also be isolated to around 30% (Hammacher et al., 1988). Freshly prepared platelets also contain a high proportion (27%) of 3 DGF-AA (Hart et al., 1990). It can therefore be assumed that the proportion of both homodimers in the platelet progenitor, the megakaryocyte, corresponds approximately to the AB heterodimer proportion. Since the concentration of each PDGF species in the platelet should correlate directly with its individual importance in the wound healing process, the most common isoform, the PDGF-AB, is of particular importance in the search for a "wound healing hormone".
  • Each of the different isoforms has biological activity in vitro. Only the availability of the high-purity, recombinant PDGF isoforms (Hoppe et al., 1989; Hoppe et al., 1990) made it possible to carry out comparative studies to differentiate the different activity spectra of the different PDGF species.
  • PDGF-BB recombinant PDGF homodimers
  • a manufacturing process for high-purity PDGF-AB was developed by Hoppe et al. (1990, see also PCT / EP 90/00 063).
  • the inactive monomers produced separately in different E. coli cells are converted into biologically active PDGF-AB by in tro renaturation.
  • the object of the invention is therefore to create an expression system with the aid of which PDGF-AB can be produced without substantial contamination by the respective homopolymers.
  • the object could be achieved by using a construct which makes use of the IRES sequence between the first and second cistrons in a manner known per se, but introduces the gene coding for PDGF-B into the first cistron.
  • the host cells secrete PDGF-AB after transfection with these constructs without any noteworthy proportion of homodimers.
  • the yield and economy of the downstream protein purification processes are thereby considerably improved.
  • the invention accordingly relates to a bicistronic expression unit for the recombinant production of heterodimeric PDGF-AB in mammalian cells as host cells, which is characterized by the general formula
  • p is a transcriptional promoter
  • 5'UTR is an untranslated nucleotide sequence
  • Ci is a cistron which contains a gene coding for the B chain of PDGF, a biologically active analogue or a fragment thereof,
  • IRES is a nucleotide sequence of viral, cellular or synthetic origin which is responsible for the internal initiation in the translation stage,
  • C 2 is a cistron which contains a gene coding for the A chain of PDGF or a biologically active analogue or a fragment thereof,
  • 3'UTR is an untranslated nucleotide sequence
  • polyA is a polyadenylation signal
  • Promoters which can be used are all those promoters which are active in eukaryotic cells, ie which can initiate gene expression in eukaryotic cells.
  • all constitutive and inducible promoters of viral for example the "long terminal repeats, LTR's, of retroviruses or herpes simplex thymidine kinase promoter), cellular (for example interferon or ubiquitin promoter) or synthetic origin can be used.
  • the SV40 promoter is preferred.
  • the 5'UTR and the 3'UTR are arbitrary, generally non-translated nucleotide sequences which can contain regulatory elements. For example, the sequences from SV-40 according to Artelt et al. Are suitable according to the invention. (1988).
  • the first cistron, Cx can contain the complete PDGF-B precursor sequence (SEQ ID No. 3), its analogues and any fragment which codes for a biologically active PDFG-B chain.
  • the v-sis gene product of the Simian Sarcoma Virus (SSV)
  • SSV Simian Sarcoma Virus
  • the second cistron, C 2 can contain the long or short PDGF-A precursor sequence (PDGF-A L or PDGF-A K - SEQ ID No. 1) and any fragments which code for a biologically active PDGF-A chain.
  • the fragment according to base pairs 353 to 682 according to SEQ ID No. 1, which codes for the mature PDGF-A chain, comes into consideration.
  • IRES immunoglobulin heavy chain binding protein
  • the IRES from poliovirus type 1 according to SEQ ID No. 5 is preferred.
  • the invention further relates to recombinant DNA vectors which contain the expression unit according to the invention.
  • a vector preferred according to the invention is shown in FIG. 4B and its production in FIGS. 1 to 3.
  • the invention further includes host cells which are mammalian cells and which are transformed with a vector which carries the expression unit according to the invention. They are preferably CHO or BHK cells, the latter being particularly preferred.
  • a BHK cell transformed according to the invention was deposited under the name 91-21-4D on August 11, 1992 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSM). She was assigned the deposit number DSM ACC2045.
  • the invention also includes methods for the production of heterodimeric rPDGF-AB, in the course of which mammalian cells as host cells, which contain the expression unit according to the invention surgically inserted, are cultivated in a suitable medium and the rPDGF-AB thus generated is produced by the cells and the Medium is separated. All known media for cultivating mammalian cells, including synthetic, protein-free or low-protein production media, are suitable as the medium. According to the invention, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), enriched with 4.5 g / 1 glucose and 5 to 10% FCS, was preferred.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the rPDGF-AB is separated from the cells and the medium by conventional methods (cf. for example ⁇ stmann et al. 1988). According to the invention, a highly efficient method developed for PDGF-AA (Eichner et al., 1989) is preferably used.
  • the invention relates to heterodimeric rPDGF-AB, which is essentially free of homodimeric by-products and which can be obtained by culturing the host cells according to the invention described above. Surprisingly it has been shown that the host cells transformed with the construct according to the invention secrete the heterodimeric PDGF-AB with a purity of 90% and more, based on the total amount of the PDGF formed.
  • Preferred according to the invention is PDGF-AB, which is transformed by culturing BHK cells with the construct according to the invention, for example those cells which are sold under the name 91-21-4D on August 11, 1992 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSM) (deposit number DSM ACC2045), is accessible.
  • DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
  • the rPDGF-AB according to the invention differs from the previously known recombinant PDGF-AB products primarily in its high degree of purity. As stated at the beginning, no recombinant process has been described in which 90% or more of the product obtained consists of the heterodimer. Since the complete separation of the homodimers from the heterodimer is almost impossible, the known products are inevitably mixtures of all 3 isoforms.
  • PDGF-B expressed in yeast cells is at least partially incompletely processed and / or proteolytically broken down (cf. WO 912/01716). Products of this type thus have a changed carbohydrate pattern and they are contaminated with proteolytic breakdown products.
  • WO 92/01716 describes methods for producing modified PDGF chains in which the consensus sequences for the glycosylation or the protease-sensitive domains have been removed.
  • WO 90/08163 discloses the recombinant production of PDGF-AB in bacterial cells, in particular in E. coli, which inevitably leads to a non-glycosylated product.
  • a PDGF-B chain expressed in E. coli cells according to this method is shortened by 12 amino acids at the amino terminal.
  • the product must be renatured from bacteria in vitro, a process in which the correct inter- and intramolecular formation of the disulphide bridges and the correct folding of the protein is not guaranteed, with the consequence that the immunological properties of the product changed and the biological activity can be influenced.
  • the heterodimeric rPDGF-AB according to the invention is preferably formulated together with pharmaceutically acceptable auxiliaries and excipients as a pharmaceutical preparation, in particular for wound healing.
  • it can be contained as an active ingredient in plasters, wound dressings and the like. It is particularly suitable for topical administration, but applications are also possible in the course of which the active ingredient is introduced into the wound or administered subcutaneously.
  • the PDGF-AB can be administered subcutaneously in a suitable matrix with a depot function in the wound edge area or injected directly subcutaneously.
  • the rPDGF-AB according to the invention is suitable for the production of cosmetic preparations, for example for skin regeneration, for smoothing the skin, for preventing scarring or aging, and for use in the case of sunburn.
  • Suitable auxiliaries and carriers include aqueous cellulose gels, biodegradable polymers and any ointment and cream base and sprays.
  • additional active substances which influence wound healing such as collagen, fibronectin, factor XIII, fibroblast growth factor (aFGF, bFGF), transforming growth factor type ⁇ or ⁇ , epidermis growth factor, insulin or "insulin-like growth factor” (IGF I, II) or other growth factors may be contained in the preparations according to the invention.
  • the products according to the invention can, for example, also be present in wound dressings in aqueous solution.
  • Vector M13BCL1 the vector map shows the c-sis (PDGF-B) homologous region from pMVW-2.
  • the area of the mature PDGF-B and the Ncol / Sall (SEQ ID No. 8 + 9) adapter are highlighted by black bars.
  • FIG. 4A + B Schematic representation of the construction of the bicitronic comparison vector pSBC-A / B (FIG. 4A) and the expression vector pSBC-PDGF-B / A (FIG. 4B) from the base vectors pSBC-1 and pSBC-2.
  • the expression vectors pSBC-PDGF-A / B and pSBC-PDGF-B / A differ in the orientation of the coding cDNA sequences of the PDGF-A and -B chain, i.e. by their location on the plasmid as the first or second cistron in the reading direction.
  • Polystyrene plates were coated with sheep anti-mouse IgG and then with a mouse hybridoma
  • AB from human platelets, from PROMEGA Corp. No. G 5161; BB: recombinant from yeast, from PROMEGA Corp. No. G 5191;
  • AA recombinant BHK cells, about 70% strength (Eichner et al., 1989).
  • PDGF-AB from human platelets
  • PDGF-BB PDGF-BB
  • the PDGF which can be isolated from pSBC-B / A culture supernatants, has a slightly lower molecular weight than the PDGF-AA applied as reference. Approximately equal amounts of both monomers can be detected under reducing conditions.
  • the upper bands correspond to the monomer bands of the PDGF-A chain.
  • PDGF-AA For recombinant PDGF-AA from BHK cells, it has already been shown that this material consists in approximately equal proportions of the complete PDGF-A chain and a C-terminally truncated species (Eichner et al., 1989).
  • the monomeric PDGF-A chains band at an M .. of about 17 KD.
  • the PDGF-B chain (M ..
  • the PDGF-AA expressed as reference and also expressed in BHK cells is not glycosylated (Eichner et al., 1989), whereas PDGF expressed in CHO cells contains about 7% carbohydrate (Kolvenbach et al., 1991) .
  • the PDGF-A monomers from both the PDGF-AA homodimer and the AB heterodimer match well in their running behavior in the SDS-PAGE.
  • the plasmid pBEH was linearized with Eco RI and the following oligonucleotide sequences were hybridized and inserted:
  • the plasmid pMVW-2 contains the cDNA of the human PDGF-B gene, which is incomplete in the 5 'translated region of the precursor sequence (Weich et al., 1986).
  • a CT exchange was carried out in the 5'-terminal area of the precursor introduced a BclI interface in position 30 of the codogenic section of the clone pMVW-2. In the end, this step means that only a short section of the coding region is lost and the locally coded amino acid (aspartic acid) is retained.
  • the fragment containing this interface must either be cloned into a dam ' strain or amplified using a PCR step.
  • the missing region of the precursor is then used as a synthetic Sall / Bell fragment [oligomers PPDGFB1 and PPDGFB2 (SEQ ID No. 11 + 12)].
  • the 914 bp BamHI / NcoI fragment from pMVW-2 was first inserted into the BamHI / Sall-split bacteriophage M13mpl9 (Pharmacia) via a synthetic adapter [oligomers NCCLSA1 and NCCLSA2 (SEQ ID No. 8 + 9)].
  • This construct provided the necessary single-stranded DNA for the subsequent in vitro mutagenesis step, which was carried out using the oligomer-directed in vitro mutagenesis system (version 2) from Amersham, based on the method of Eckstein et al. [Taylor J.W., Ott J. and Eckstein F. (1985) Nucl. Acids Res.
  • the synthetic primer [PDGBBCL (SEQ ID No. 10)] achieves a base exchange (C to T) in position 144 of the sequence shown under SEQ ID No. 3 and thus in the 5 ′ region of the PDGF B precursors introduced a BclI interface.
  • This mutagenesis derivative was designated M13BCL1 (Fig. 2).
  • a 1100 bp fragment from M13BCL1 was amplified by means of a PCR step using the primers M1317MER and M1324MER (SEQ ID No. 6 + 7), then subjected to a BclI / HindIII restriction and the resulting 770 bp fragment ment isolated.
  • the synthetic oligomers PPDGFB1 and PPDGFB2 (SEQ ID No. 11 + 12) form the missing 5 'region of the PDGF-B precursor up to the BclI interface.
  • this double-stranded oligomer was then ligated, together with the 770 bp PDGF-B fragment, into the vector pGEM-2 (Promega) prepared with a SalI / HindIII restriction (FIG. 3). The authentic sequence of PDGF-B was verified by full sequencing.
  • the complete coding cDNA for the PDGF-B precursor (Ratner et al., 1985) is in the vector pGEM2-PDGF-B as described under 1.2.
  • the complete cDNA sequence of the short variant of the PDGF-A chain (Betsholtz et al., 1986) is contained in the expression vector pODA (Eichner et al., 1989).
  • This vector was obtained by cloning the Rsal fragment from pPGF -1 (Hoppe et al., 1987) in the SV-40 expression vector pBEH (Artelt et al., 1988).
  • the coding cDNA sequences of the PDGF-A and -B chain were inserted into the monocistronic vectors pSBC-1 and -2 using EcoRI / HindiII restrictions (FIG. 4).
  • the fusion of both vectors to a bicistronic expression unit was carried out using the restriction enzyme Xmnl / Notl.
  • the transfection of the mono- and bicistronic expression vectors which carry the coding sequences of the A and B chains of PDGF was carried out using the calcium phosphate precipitation technique in BHK cells ( Wigler et al., 1979; Graham & van der Eb, 1973).
  • a medium change with DME medium was carried out four hours before the transfection.
  • the selection for stably transfected cells was started by changing the medium from DME to double selection medium (5 ⁇ g / ml puromycin; 500 ⁇ g / ml G418, Wirth et al., 1988) and a population of cell clones secreting PDGF was obtained .
  • a representative clone mixture of these cells was deposited with the DSM on August 11, 1992 under the number DSM ACC2045.
  • RNA from transformed BHK cells was isolated according to Purchio et al., (1979), fractionated over a 1% agarose-formaldehyde gel (Lehrach et al., 1977), blotted onto a nylon membrane and with [ 2 P] -labeled PDGF -A- and -B-chain specific probes hybridized (Fig. 5).
  • the BHK cells were transformed analogously to 2.4. After the colonies had been counted, the cells were trypsinized, taken up in fresh selection medium and adjusted to a cell number of 10 5 cells / ml. Each 10 ml of this cell suspension was transferred to a bottle with a floor area of 65 cm 2 and cultivated for a further 48 h. After that it was Medium removed and replaced by 10 ml production medium (DMEM, without serum and selection antibiotics). After 24 h, the medium was removed and replaced by a selection medium containing serum. The harvested supernatants were stored at -20 ° C until analysis. At the time of harvest, the cell count / bottle was 0.8-1.2xl0 7 .
  • the measurement of the stimulation of the DNA synthesis rate of sealed tear-fibroblasts allows a determination of the mitogenic activity of the PDGF. A distinction between the isoforms is not possible.
  • the assay was carried out according to Shipley et al. (1984) with AKR-2B mouse fibroblasts in 24-well plates. Pure PDGF shows half-maximum stimulation at a concentration of about 5 ng / l in the test. This value was used to determine productivity. The results from the mitogen test are compared in FIG. 7 with the values from the PDGF-AB-ELISA.
  • a 'two-antibody sandwich assay' was set up which allows a specific quantification of PDGF-AB in addition to PDGF-AA and -BB.
  • Polystyrene plates with 96 cavities are coated in the following order (4 x washing with PBS with 0.05% Tween 20 between each step):
  • Figure 7 shows the results of three different analyzes for PDGF from culture supernatants of recombinant BHK cells.
  • the mitogen test provides a useful value for the
  • the specific proportion of heterodimeric PDGF-AB can be determined with sufficient accuracy by the PDGF-AB-specific ELISA.
  • the percentage of PDGF homodimers can be calculated from the difference between this analysis and the result of the mitogen test (Table 1).
  • the result of the ELISA shows that only in culture supernatants of transfected cell lines of the type pSBC-PDGF-B / A does the measurable biological activity in the mitogen test correlate with high PDGF-AB values.
  • Both PDGF chains should be clearly identified by protein sequence analysis in order to rule out that shortened, processed forms are only present in one PDGF chain (see FIG. 8).
  • the automatic sequence analysis was carried out on the Model 477A (Applied Biosystems) with the BLOTTl cycle.
  • the Analysis of the phenylthiohydantoin amino acid derivatives was carried out on the online coupled 120A PTH analyzer.
  • the disulfide bridges of the sample are reduced with dithiothreitol and alkylated with 4-vinylpyridine. It is separated on a horizontal SDS electrophoresis gel according to Shugger and Jagow, modified as described (Westermeier et al. SD 092/89, Pharmacia LKB Biotechnologie). The sample is blotted onto a PVDF membrane (Problot, Applied Biosystems) with a discontinuous buffer system as described (Westermeier et al. SDRE-072, Pharmacia LKB Biotechnologie) and stained with Comassie Brillant Blau R250. The two double bands at 17 and 16 KD are cut out and sequenced together.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • Betsholtz C Johnsson A., heroine C.-H., B. Westermark r Lind P. Urdea MS, Eddy, R., Shows TB r Philpott K., Mellor AL, Knot TJ, and Scott J. (1986) Nature 320 , 695-699.
  • GAATTCCCAC TGAATTTCGC CGCCACAGGA GACCGGCTGG AGCGCCCGCC CCGCGCCTCG 60
  • AAG AAG GCC ACG GTG ACG CTG GAA GAC CAC CTG GCA TGC AAG TGT GAG 582 Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala Cys Lys Cys Glu 85 90 95 100
  • GAG CAG CGA GCC AAA ACG CCC CAA ACT CGG GTG ACC ATT CGG ACG GTG 678 Glu Gin Arg Ala Lys Thr Pro Gin Thr Arg Val Thr Ile Arg Thr Val 120 125 130
  • ORGANISM Polioviru ⁇ type 1 (Mahoney strain)

Abstract

Die Erfindung betrifft die rekombinante Herstellung von PDGF-AB in Säugerzellen unter Verwendung eines bicistronischen Vektorsystems, in welchem sich zwischen dem ersten und dem zweiten Cistron eine IRES-Sequenz befindet und das für die B-Kette codierende Gen in dem ersten Cistron positioniert ist. Die erfindungsgemäße Expressionseinheit führt zu einer äquimolaren Expression der Polypeptidketten A und B.

Description

HerStellung von he erp'" p-r--ffl- PDGF-AB mit Hilfe eineB bicistronischen Vektorβvstems in Säuσerzellen
Die Erfindung betrifft die rekombinante Herstellung von PDGF-AB (rPDGF-AB) in Säugerzellen als Wirtszellen, welches im wesentli¬ chen frei ist von den homodimeren Begleitprodukten PDGF-AA und -BB .
Seit vielen Jahren ist es möglich/ einzelne Proteine, deren Gene durch Klonierung isoliert wurden, nach Manipulation und Gen¬ transfer in verschiedenen prokaryontischen und eukaryontisehen Zellen herzustellen. Für das Erreichen der vollen biologischen Aktivität vieler Proteine sind korrekte Faltungen, richtiges Prozessieren und gegebenenfalls auch posttranslationale Modifikationen erforderlich, welche in prokaryontischen und niederen eukaryontisehen ExpressionsSystemen oftmals nicht kor¬ rekt ausgeführt werden. Aus diesem Grund bedient man sich häufig Säugerzellen als Wirte. Säugerzellen sind darüber hinaus in der Lage, große Mengen von Proteinen zu sekretieren.
Aus verschiedenen Gründen bedarf es oftmals der simultanen Her¬ stellung zweier oder mehrerer Proteinketten. Zum Beispiel sind viele natürliche Proteine in ihrer funktionellen Form aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt (z.B. Antikörper). Na¬ türlicherweise erfolgt die Assoziation verschiedener Unterein¬ heiten von komplexen Proteinen nach der Proteinsynthese. An dieser Assoziation sind häufig andere Komponenten des zellulären Apparates als Katalysatoren oder Kontrollelemente beteiligt, wobei es gelegentlich auch zu Umfaltungen der ursprünglichen Strukturen kommt. Störungen der Assoziation, z.B. durch unglei¬ che Synthese der einzelnen Komponenten, können sowohl für die zu bildenden Proteine als auch für die Wirtszelle negative Konse- quenzen haben. Natürlicherweise unterliegt dieses System einer ausgefeilten, meist zellspezifischen Regulation. Da diese Regu¬ lation in genetisch manipulierten Zellen im allgemeinen nicht nachstellbar ist, wurden die nachfolgend erläuterten Alternati¬ ven zur simultanen Herstellung mehrerer Fremdproteine entwickelt und angewandt:
1) Die Gene werden getrennt in Expressionsvektoren integriert und dann in einem geeigneten Verhältnis in die Zellen co- transferiert. Dies setzt voraus, daß mehrere Plasmidkopien gleichzeitig stabil aufgenommen und bei der Teilung weiter¬ getragen werden. Das Verhältnis der Expression der verschie¬ denen Gene zueinander hängt sowohl von der Kopienzahl als auch von der Integrationsstelle im Genom der Wirtszelle ab. Durch aufwendige Screeningverfahren ist es möglich, Zell- klone zu isolieren, welche die einzelnen Genprodukte im gewünschten Verhältnis zueinander exprimieren.
2) Um die Kopienzahl zu nivellieren, werden die verschiedenen Gene in unabhängigen Transkriptionseinheiten auf einem Vek- tor plaziert. Dies sichert weitgehend die stöchiometrische Repräsentanz der Gene, aber auch dieses Verfahren ist mit Problemen behaftet. Selbst wenn nämlich Expressionseinheiten mit Promotoren gleicher Stärke verwendet werden, ist keines¬ wegs sichergestellt, daß die mRNAs, welche für die verschie- denen Proteine kodieren, die gleiche Stabilität und Transla¬ tionseffizienz aufweisen. Auch die Transkriptionseffizienz beider Gene muß nicht zwangsläufig identisch sein. In diesem Fall wird mit Hilfe von gentechnischen Tricks (Positionie¬ rung der Transkriptionseinheiten zueinander, Modulation der Stärke der einzelnen Promotoren durch Wegnehmen oder Hinzu- fügen einzelner Elemente) die Stöchiometrie der Expression schrittweise hergestellt.
) Zur Vermeidung der Probleme im Zusammenhang mit der Stabili¬ tät der mRNA verschiedener Transkripte wurden bi- oder mul- ticistronische Vektoren entwickelt. Hierzu liegen die ein¬ zelnen Leseraster der die Proteinketten kodierenden Genab¬ schnitte - Cistrons - auf einer Transkriptionseinheit (Ex¬ pressionseinheit). Die Expression des multicistronischen Gens erfolgt durch einen einzigen Promotor. Bei derartigen Vektoren wird normalerweise das erste Cistron sehr effizient translatiert, die nachfolgenden aber in Abhängigkeit von den intercistronischen Sequenzen. Verwendet man für diese inter- cistronischen Sequenzen normale 5' nicht translatierte Se¬ quenzen (5'UTR) aus monocistronisehen Genen, so ist die Expression des nachfolgenden Cistrons meist sehr niedrig (in der Regel um 0,5 bis 2% der Translation des ersten Cistrons, Kaufman et al., 1987; Boel et al., 1987). Diese Effizienz konnte zunächst durch Einfügen von Leadersequenzen (High Efficiency Leadern, HEL) auf etwa 20% gesteigert werden. Mit der Entdeckung und Verwendung von bestimmten zellulären und viralen Sequenzen, welche eine interne Translationsinitia¬ tion ermöglichen (IRES; Jackson et al., 1990), war es mög¬ lich, ein Translationsverhältnis zwischen dem ersten und dem nachfolgenden Cistron von 3:1 zu erzielen.
Die Schlüsselrolle bei der Verwendung bi- oder multicistroni- scher Vektoren spielt die Translation. Normalerweise erfolgt die Initiation der Translation in Eukaryonten nach dem "cap"-abhän¬ gigen Mechanismus, im Verlaufe dessen ein Prä-Initiationskomplex aus Proteinen und RNA am 5'Ende einer mRNA mit "cap" (methylier- tes Nukleotid) aufgebaut wird. Von dort aus wird ein geeignetes Translationsinitiationskodon ausgesucht, von dem ausgehend die Translation gestartet wird. Man glaubt, daß dies über einen "Scanning"-Prozeß abläuft,^ wobei sich der Prä-Initiationskomplex entlang der mRNA in 3'Richtung bewegt. Auf diese Weise wird, von einigen Ausnahmen abgesehen, immer das am 5'Ende liegende Ci¬ stron effizient translatiert (Kozak, 1989). Alle nachfolgenden Cistrons werden gar nicht oder sehr ineffizient translatiert. Die Translations-Effizienz der nachfolgenden Cistrons konnte durch Optimierung des Abstandes zwischen den Genen (intercistro- nische Regionen; Kozak, 1987; Wirth et al., 1991) oder durch Verwendung von sogenannten "high efficiency leader"-Sequenzen (HEL, s.o.) verbessert werden (z.B. Falcone und Andrews, 1991 und Ref. darin). HEL's sind solche 5'nicht translatierten Be¬ reiche von Genen oder auch anderen Sequenzen, welche die Initia- tion der "cap"-abhängigen Translation stimulieren. Auch bei derartigen Konstrukten sind jedoch die erreichbaren Expressions¬ werte für das zweite und die nachfolgenden Cistrons immer deut¬ lich geringer als die des "cap"-abhängig regulierten ersten Cistrons.
Ein in den letzten Jahren aufgedeckter Mechanismus zur internen Translationsinitiation benutzt spezifische Nukleinsäuresequen- zen. Zu diesen Sequenzen zählen die nicht translatierten Berei¬ che einzelner Picoma-Viren, z.B. Polio-Virus, Encephalomyocar- ditis-Virus, (Pelletier und Sonenberg, 1988; Jang et al., 1988; Jang et al., 1989) sowie einiger zellulärer Proteine, z.B. BiP (Macejak und Sarnow, 1991). Bei den Picoma-Viren sorgt ein kur¬ zer Abschnitt des 5'nicht translatierten Bereichs, das sogenann¬ te IRES (internal ribosomal entry site), für die interne Bindung eines Prä-Initiationskomplexes. Darüber hinaus sind weitere Bereiche aus dieser Region für die effiziente Initiation dieser Translation notwendig. So zeigt es sich z.B., daß für eine effi¬ ziente Translation nicht nur die 400 Basenpaare stromaufwärts des IRES, sondern auch der extreme 5'Teil der Picorna-Virus nicht-translatierten Region notwendig ist (Simoes und Sarnow, 1991). Auf der anderen Seite führt das "capping", die Voraus- Setzung für den normalen Initiationsmechanismus der Translation, zu einer Reduktion der Effizienz der internen Initiation von Polio-Virus IRES, wenn er am 5'Ende einer entsprechenden mRNA lokalisiert ist (Hambidge und Sarnow, 1991). Der negative Effekt wird aufgehoben, wenn die IRES für die Initiation des zweiten Cistrons verantwortlich ist, also zwischen "cap" und IRES ein Cistron liegt.
IRES-Elemente können also als Initiatoren für die effiziente Translation von Leserastern fungieren. Dabei beeinflussen sie die "ca "-abhängige Translation des ersten Cistrons nicht. Auch umgekehrt scheint eine Beeinflussung der IRES-abhängigen Ini¬ tiation unabhängig von der "cap"-abhängigen Translationsinitia¬ tion zu sein. Die Mechanismen beider Vorgänge unterscheiden sich auch deutlich in der Verwendung verschiedener zellulärer Fakto¬ ren (Meerovitch et al., 1989; Jang und Wimmer, 1990). In der vergangenen Zeit wurden mehrere Untersuchungen publiziert, bei denen bicistronische Expressionsplasmide verwendet wurden (Adam et al., 1991; Ghattas et al., 1991; Kauf an et al.,1991; Wood et al., 1991; Wirth et al., 1991). Da aber offensichtlich die "cap"-abhängige Translation stärker ist als die IRES-abhängige Translation, konnte eine stöchiometrische Expression zweier Proteinketten nicht erreicht werden. Die bisherigen Verwendungen konzentierten sich deshalb auf die Verwendung von Selektions- markern im zweiten Cistron. Die enge Expressionskoppelung des Selektionsmarkers mit dem zu exprimierenden Gen, welches das erste Cistron darstellt, ist besonders vorteilhaft bei der Se¬ lektion auf Hochexpression, insbesondere, wenn eine vorausge¬ hende Gena plifikation erforderlich ist.
Die Synthese äquimolarer Proteinmengen von bi- oder multicistro- nischen Expressionsvektoren ist jedoch bisher nicht erreicht worden. Die äquimolare Expression zweier verschiedener Protein¬ ketten ist für die rekombinante Herstellung des Wachstumsfak- tors aus Blutplättchen, "Platelet-Derived-Growth-Factor" (PDGF), einem der Hauptmitogene im menschlichen Blutserum, von besonde- rer Bedeutung. Aus menschlichen Thrombozyten aufgereinigtes PDGF besteht aus zwei unterschiedlichen, aber nahe verwandten Poly- peptidketten, die durch Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Unter reduzierenden Bedingungen zerfällt das dimere PDGF in seine monomeren Untereinheiten, wovon die größere (M.. 15- 17.000 D) als PDGF-A-Kette und die kleinere (M.. 14.000 D) als PDGF-B-Kette bezeichnet wurde (Johnsson et al., 1984).
Die Proteinketten PDGF-A und -B werden von verschiedenen Genen kodiert. Die vollständige Struktur beider Genprodukte konnte durch cDNA-Klonierung aufgeklärt werden (Ratner et al., 1985, Betsholtz et al., 1986). Dabei zeigte es sich, daß beide PDGF- Moleküle zunächst als ungewöhnlich lange Vorläufermoleküle, sog. Precursoren, synthetisiert und anschließend intrazellulär zu den reifen PDGF-Ketten prozessiert werden. Durch alternatives Spli- cen lassen sich zwei verschiedene PDGF-A-Transkripte erklären, die sich durch An- oder Abwesenheit eines 69-bp Segmentes im 3'- Bereich unterscheiden (Betsholtz et al., 1986; Wise et al., 1989). Durch dieses Insert kommt es zu einer Änderung im codie- renden Abschnitt mit der Folge, daß eine kurze (PDGF-AK, 110 Aminosäuren) und eine lange (PDGF-AL, 125 Aminosäuren) Form der PDGF-A-Kette gebildet wird. Beide Varianten sind als normale zelluläre Proteine nebeneinander nachweisbar, wobei die kürzere Form die häufigere Spezies ist (Matoskova et al., 1989; Young et al., 1990).
Beide Gene sind auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert und zeigen einen hohen Homologiegrad. Eine Vielzahl von Arbeiten zeigt, daß beide Gene unterschiedlichen Regulationsmechanismen unterliegen. Eine Folge davon ist, daß beide PDGF-Ketten natür¬ licherweise in verschiedenen Zelltypen in unterschiedlichem Verhältnis zueinander produziert werden.
Alle drei möglichen Isoformen des PDGF (AA, AB und BB) kommen natürlicherweise vor und sind in Thrombozyten in sogenannten ct-Granula gespeichert. Aus überlagerten menschlichen Blutplätt- chen kann neben dem die Hauptmenge bildenden PDGF-AB Heterodimer auch PDGF-BB zu etwa 30 % isoliert werden (Hammacher et al., 1988). Frisch präparierte Blutplättchen enthalten auch einen hohen Anteil (27%) an 3DGF-AA (Hart et al., 1990). Es kann daher angenommen werden, daß n den Vorläuferzellen der Thrombozyten, den Megakaryozyten, der Anteil beider Homodimere zusammen etwa dem AB-Heterodimer-Anteil entspricht. Da die Konzentration jeder PDGF-Spezies im Thrombozyten direkt korrelieren sollte mit ihrer individuellen Bedeutung im Wundheilungsgeschehen, kommt insbe- sondere der häufigsten Isoform, dem PDGF-AB, eine herausragende Bedeutung auf der Suche nach einem "Wundheilungshormon" zu.
Jede der verschiedenen Isoformen besitzt biologische Aktivität in vitro. Erst die Verfügbarkeit der hochreinen, rekombinanten PDGF-Isoformen (Hoppe et al., 1989; Hoppe et al., 1990) machte vergleichende Studien zur Differenzierung der unterschiedlichen Wirkungsspektren der verschiedenen PDGF-Spezies möglich. Inzwi¬ schen belegen eine Reihe von Untersuchungen die unterschiedliche Potenz von PDGF-AA, AB und BB im Chemotaxis- und DNA-Prolifera- tionstest (Hosang et al., 1989; Nister et al., 1988; Reilly & Broski, 1989; Siegbahn et al., 1990), sowie deren unterschiedli¬ chen Einfluß auf die Freisetzung von Inositol-l,4,5-trisphos- phat, Produktion von Diacylglycerol und [Ca2+^-Mobilisierung (Block et al., 1989; Sachinidis et al., 1990 A, 1990 B) . Zwei unterschiedliche PDGF-Rezeptorpopulationen, von denen der PDGF-α-Rezeptor alle PDGF-Isoformen und der ß-Rezeptor nur PDGF-BB bindet (Hart et al., 1988; Heldin et al., 1988) liefern eine plausible Erklärung dafür, wie sich Wirkungsunterschiede der PDGF-Isoformen über deren unterschiedliche Potenz zur Rezep- toraktivierung entfalten können. Die meßbaren unterschiedlichen in vitrσ-Effekte der PDGF-Isoformen, zusammen mit dem Nachweis zweier verschiedenener Rezeptorpopulationen, lassen Rückschlüsse auf unterschiedliche in vivo Wirkungsspektren von PDGF-AA, AB und BB zu. Daher ist die Produktion von reinem PDGF-AB, ohne PDGF-BB oder PDGF-AA als Begleitproteine, wünschenswert. Um ein homogenes, gut charakterisiertes Heterodimer zu erhalten, müßten die Homodimere sonst durch Reinigung vollständig eliminiert werden, was durch die sehr ähnlichen chromatographischen Eigen¬ schaften aller PDGF Spezies zusätzlich erschwert wird.
Eine Reihe verschiedener Wege zur Herstellung von rekombinanten PDGF-Homodimeren, insbesondere PDGF-BB, sind zum Teil schon seit längerer Zeit bekannt (Kelly et al., 1985; Heldin et al., 1986; Hoppe et al., 1989; Beckmann et al., 1988; Bywater et al., 1988; Stroobant & Waterfield 1984). Ein Herstellungsverfahren für hochreines PDGF-AB wurde von Hoppe et al. (1990, s.a. PCT/EP 90/00 063) beschrieben. Hier werden die getrennt in unterschied¬ lichen E.coli-Zellen hergestellten, inaktiven Monomere durch in v tro-Renaturierung in biologisch aktives PDGF-AB überführt.
Die bislang synthetisierten Genprodukte der drei PDGF-Isoformen weisen, trotz variierender Länge der A- bzw. B-Einzelstränge, weitgehend übereinstimmende biologische Aktivität auf.
Für die heterologe Expression von PDGF-AB Heterodimeren in euka- ryontischen Systemen gelten die eingangs erwähnten Kriterien der simultanen Expression zweier (oder mehrerer) Proteine. Die bisher publizierten Strategien zur Herstellung von PDGF-AB in rekombinanten CHO-Zellen (Östman et al., 1988) und mit Hilfe von Hefe-Expressionssystemen [EP 0 259 632] entsprechen dem oben unter 2) erläuterten Fallbeispiel, wo sich beide PDGF-Gene in unabhängigen Transkriptionseinheiten auf einem Vektor befinden. Die Quantifizierung der auf diese Weise in CHO-Zellen exprimier- ten unterschiedlichen PDGF-Dimere ergab 19% für PDGF-AA, 69% für PDGF-AB und 12% für PDGF-BB (Östman et al., 1988).
Eine Grundvoraussetzung für die bevorzugte Synthese von PDGF-AB Heterodimeren mit Hilfe eukaryontischer Expressionssysteme ist daher nicht nur in der stöchiometrischen Repräsentanz beider Gene, sondern in erster Linie auch in deren koordinierter Ex- pression zu sehen. Daher bieten sich bicistronische Expressions¬ einheiten als mögliche Hilfsmittel für die Expression heterodi- erer Proteine und damit des PDGF-AB an. In WO 90/01550 wird ein derartiges System auch für die Expression von PDGF beschrieben. Wie unter Punkt 3) oben näher erläutert, liefern diese Konstruk- te jedoch nur sehr limitierte Expressionsraten für das zweite (und nachfolgende) Cistron. Abhängig von der im ersten Cistron lokalisierten PDGF-Kette werden vorwiegend Homodimere dieses Typs gebildet. Bisher in der Literatur beschriebene Versuche, beide PDGF-Gene mit Hilfe anderer Expressionssysteme in einer eukaryontisehen Zelle zu exprimieren, führten zu Homodimer-Ne- benproduktanteilen im Bereich von 30% oder mehr. Um dennoch mit diesen Zellsystemen PDGF-AB zu erhalten, müssen aufwendige und extrem verlustreiche Reinigungstechniken angewendet werden.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Expressionssystem zu schaffen, mit Hilfe dessen PDGF-AB ohne wesentliche Verunreini¬ gung durch die jeweiligen Homopolymere hergestellt werden kann.
Erfindungsgemäß konnte die Aufgabe durch die Verwendung eines Konstrukts gelöst werden, welches in an sich bekannter Weise von der IRES-Sequenz zwischen dem ersten und zweiten Cistron Gebrauch macht, jedoch das für PDGF-B kodierende Gen in das erste Cistron einbringt. Überraschenderweise hat es sich erfin¬ dungsgemäß gezeigt, daß die Wirtszellen nach Transfektion mit diesen Konstrukten PDGF-AB ohne nennenswerten Anteil an Homodi- meren sezernieren. Ausbeute und Wirtschaftlichkeit der nachge¬ schalteten Proteinreinigungsverfahren wird dadurch beträchtlich verbessert.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß eine bicistronische Ex- pressionseinheit zur rekombinanten Herstellung von heterodimerem PDGF-AB in Säugerzellen als Wirtszellen, welche gekennzeichnet ist durch die allgemeine Formel
p - 5'UTR - Cj - IRES - C2 - 3'UTR - polyA, in der
p ein transkriptionaler Promotor ist,
5'UTR eine nicht translatierte Nukleotidsequenz ist,
Ci ein Cistron ist, welches ein für die B-Kette von PDGF, ein biologisch aktives Analogon oder ein Fragment derselben kodierendes Gen enthält,
IRES eine Nukleotidsequenz viralen, zellulären oder synthetischen Ursprungs ist, die in der Stufe der Translation für die interne Initiation verantwortlich ist,
C2 ein Cistron ist, welches ein für die A-Kette von PDGF oder ein biologisch aktives Analogon oder ein Fragment derselben kodierendes Gen enthält,
3'UTR eine nicht translatierte Nukleotidsequenz,
und polyA ein Polyadenylierungssignal ist,
wobei Clf IRES und C operativ miteinander verknüpft sind.
Als Promotoren kommen alle diejenigen Promotoren in Betracht, die in eukaryontisehen Zellen wirksam sind, d. h., die die Gen¬ expression in eukaryontisehen Zellen initiieren können. Insbe- sondere können alle konstitutiven und induzierbaren Promotoren viralen (beispielweise die "Long terminal repeats, LTR's, von Retroviren oder Herpes Simplex Thymidin-Kinase Promotor), zel¬ lulären (beispielsweise Interferon- oder Ubiquitin-Promotor) oder synthetischen Ursprungs verwendet werden. Erfindungsgemäß ist der SV40-Promotor bevorzugt. Die 5'UTR und die 3'UTR sind beliebige, in der Regel nichttrans- latierte Nukleotidseguenzen, die regulierende Elemente enthalten können. Erfindungsgemäß geeignet sind beispielsweise die Sequen¬ zen aus SV-40 nach Artelt et al. (1988).
Das erste Cistron, Cx, kann die vollständige PDGF-B Vorläuferse¬ quenz (SEQ ID Nr. 3), deren Analoga und jegliches Fragment ent¬ halten, welches für eine biologisch wirksame PDFG-B Kette ko¬ diert. Insbesondere kommen in diesem Zusammenhang das zur PDGF- B-Kette homologe v-sis-Gen (Produkt des Simian Sarcoma Virus (SSV)) sowie die Basenpaare 283 bis 609 gemäß SEQ ID Nr. 3 in Betracht, welche die reife PDFG-B Kette kodieren.
Analog kann das zweite Cistron, C2, die lange oder kurze PDGF-A Vorläufersequenz (PDGF-AL oder PDGF-AK - SEQ ID Nr. 1) sowie jegliche Fragmente enthalten, welche für eine biologisch aktive PDGF-A Kette kodieren. In Betracht kommt insbesondere das Frag¬ ment gemäß den Basenpaaren 353 bis 682 gemäß SEQ ID Nr. 1, wel¬ ches für die reife PDGF-A Kette kodiert.
Als IRES können alle diejenigen Sequenzen viralen, zellulären oder synthetischen Ursprungs verwendet werden, welche eine in¬ terne Bindung der Ribosomen vermitteln. Beispiele für derartige Sequenzen sind die IRES aus Poliovirus Typ 1 gemäß SEQ ID Nr. 5, welche die ersten 628 Nukleotide der 5' nicht-translatierten Region des Poliovirus Typ 1 einschließt, sowie ferner die 5'UTR des Enzephalomyocarditis Virus (EMV), des "Theilers murine ence- phalomyelitis virus" (TMEV), des "foot and outh disease virus" (FMDV), des "bovine enterovirus" (BEV), des "coxsackie B virus" (CBV), des "human rhinovirus" (HRV) und die "human immunoglobu- lin heavy chain binding protein" (BIP) 5'UTR, die Drosophila Antennapediae 5'UTR, die Drosophila Ultrabithorax 5'UTR oder genetische Hybride oder Fragmente aus den oben angeführten Se¬ quenzen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die IRES aus Poliovirus Typ 1 gemäß SEQ ID Nr. 5. Gegenstand der Erfindung sind ferner rekombinante DNA Vektoren, welche die erfindungsgemäße Expressionseinheit enthalten. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Vektor ist in Figur 4B und dessen Herstellung in den Figuren 1 bis 3 dargestellt.
Die Erfindung schließt ferner Wirtszellen ein, welche SäugerZei¬ len sind und mit einem Vektor transformiert sind, der die erfin¬ dungsgemäße Expressionseinheit trägt. Vorzugsweise handelt es sich um CHO- oder BHK-Zellen, wobei letztere besonders bevorzugt sind. Eine erfindungsgemäß transformierte BHK-Zelle wurde unter der Bezeichnung 91-21-4D am 11. 8. 1992 bei der Deutschen Samm¬ lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) hinterlegt. Ihr wurde die Hinterlegungsnummer DSM ACC2045 zugeteilt.
Die Erfindung schließt darüber hinaus Verfahren zur Herstellung von heterodimerem rPDGF-AB ein, in deren Verlauf Säugerzellen als Wirtszellen, welche die erfindungsgemäße Expressionseinheit operativ insertiert enthalten, in einem geeigneten Medium kulti¬ viert werden und das so erzeugte rPDGF-AB von den Zellen und dem Medium abgetrennt wird. Als Medium kommen alle bekannten Medien zum Kultivieren von Säugerzellen in Betracht, einschließlich synthetischer, proteinfreier oder proteinarmer Produktionsme¬ dien. Erfindungsgemäß wurde DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), angereichert mit 4,5 g/1 Glukose und 5 bis 10 % FCS, bevorzugt.
Das rPDGF-AB wird nach herkömmlichen Verfahren (vgl. beispiels¬ weise Östmann et al. 1988) von den Zellen und dem Medium abge¬ trennt. Vorzugsweise wird erfindungsgemäß ein für PDGF-AA ent- wickeltes und hoch effizientes Verfahren (Eichner et al., 1989) angewendet.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich heterodimeres rPDGF-AB, welches im wesentlichen frei ist von homodimeren Begleitproduk- ten und welches erhältlich ist durch Kultivieren der oben be¬ schriebenen, erfindungsgemäßen Wirtszellen. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß die mit dem erfindungsgemäßen Konstrukt transformierten Wirtszellen das heterodimere PDGF-AB mit einer Reinheit von 90% und mehr, bezogen auf die Gesamtmenge des ge¬ bildeten PDGF, sezernieren. Erfindungsgemäß bevorzugt ist PDGF- AB, welches durch Kultivieren von BHK-Zellen, transformiert mit dem erfindungsgemäßen Konstrukt, beispielsweise derjenigen Zel¬ len, welche unter der Bezeichnung 91-21-4D am 11. 8. 1992 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) hinterlegt wurden (Hinterlegungsnummer DSM ACC2045), zu- gänglich ist.
Das erfindungsgemäße rPDGF-AB unterscheidet sich von den bisher bekannten rekombinanten PDGF-AB Produkten in erster Linie durch seinen hohen Reinheitsgrad. Wie eingangs ausgeführt, ist bisher kein rekombinarites Verfahren beschrieben worden, bei dem 90% und mehr des erhaltenen Produktes aus dem Heterodimeren besteht. Da die vollständige Abtrennung der Homodimeren von dem Heterodime¬ ren nahezu unmöglich ist, sind die bekannten Produkte zwangs¬ läufig Gemische aus allen 3 Isoformen.
Darüberhinaus haften den bekannten Produkten, abhängig von deren Herstellung, in mehrfacher Hinsicht Nachteile an. So ist es be¬ kannt, daß die heterologe Genexpression in Hefezellen, wie in EP 259 632 oder 288 307 beschrieben, zu Proteinprodukten mit gegen- über dem humanen Produkt veränderten Glykosylierungsmustern führt. Zudem ist in Hefezellen exprimiertes PDGF-B zumindest teilweise unvollständig prozessiert und/oder proteolytisch abge¬ baut (vgl. WO 912/01716). Derartige Produkte weisen somit ein verändertes Kohlenhydratmuster auf und sie sind mit proteoly- tischen Abbauprodukten verunreinigt. Zur Vermeidung der vorge¬ nannten Nachteile beschreibt die WO 92/01716 Verfahren zur Her¬ stellung modifizierter PDGF-Ketten, bei denen die Konsensus- Sequenzen für die Glykosylierung bzw. die Protease sensitiven Domänen entfernt sind. Derartige Modifikationen beeinflussen jedoch die biologische Aktivität des Produktes (vgl. WO 92/01716). Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch Kultivieren von erfindungsgemäß transformierten BHK- Zellen, und insbesondere durch Kultivieren der Wirtszellen 91- 21-4D mit der Hinterlegungs-Nr. : DSM ACC2045 heterodimeres rPDGF-AB gewonnen.
Ferner ist aus der WO 90/08163 die rekombinante Herstellung von PDGF-AB in Bakterienzellen, insbesondere in E. coli bekannt, welche zwangläufig zu einem nicht glykosylierten Produkt führt. Eine nach diesem Verfahren in E. coli Zellen exprimierte PDGF-B- Kette ist jedoch aminoterminal um 12 Aminosäuren verkürzt. Dar- überhinaus muß das Produkt aus Bakterien in vitro renaturiert werden, ein Vorgang, bei dem die korrekte inter- und intramole¬ kulare Bildung der Disulphidbrücken und die korrekte Faltung des Proteins nicht gewährleistet ist mit der Folge, daß die immuno¬ logischen Eigenschaften des Produkts verändert und die biologi¬ sche Aktivität beeinflußt werden können.
Das heterodimere rPDGF-AB gemäß der Erfindung wird vorzugsweise zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfs- und Trägerstof¬ fen als pharmazeutisches Präparat, insbesondere für die Wundhei¬ lung formuliert. In diesem Zusammenhang kann es als Wirkstoff in Pflastern, Wundverbänden und dergleichen enthalten sein. Es ist besonders für die topische Verabreichung geeignet, es kommen jedoch auch Applikationen in Betracht, in deren Verlauf der Wirkstoff in die Wunde eingebracht oder subkutan verabreicht wird. Beispielsweise kann das PDGF-AB in einer geeigneten Matrix mit Depotfunktion im Wundrandbereich subkutan appliziert werden oder direkt subkutan injiziert werden.
Ferner eignet sich das erfindungsgemäße rPDGF-AB zur Herstellung von kosmetischen Präparaten, zum Beispiel zur Hautregeneration, zur Hautglättung, zur Verhinderung der Narbenbildung oder der Hautalterung sowie zur Anwendung bei Sonnenbrand. Geeignete Hilfs- und Trägerstoffe schließen Cellulose-Gele auf wässriger Basis, biologisch abbaubare Polymere sowie jegliche Salben- und Cremebasis und Sprays ein. Ferner können zusätzliche Wirkstoffe, welche die Wundheilung beeinflussen, wie beispiels- weise Kollagen, Fibronektin, Faktor XIII, Fibroblasten Wachs¬ tumsfaktor (aFGF, bFGF), Transformierender Wachstumsfaktor Typ α oder ß, Epidermis Wachstumsfaktor, Insulin oder "Insulin-like Growth Factor" (IGF I, II) oder weitere Wachstumsfaktoren in den erfindungsgemäßen Präparaten enthalten sein. Die erfindungsgemä- ßen Produkte können beispielsweise auch in Wundverbänden in wässriger Lösung vorliegen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert:
1. Beschreibung der Figuren:
Fig. 1) Schematische Darstellung der Herstellung der Basis¬ vektoren pSBC-1 und pSBC-2.
Fig. 2) Vektor M13BCL1; in der Vektorkarte ist der c-sis (PDGF- B) homologe Bereich aus pMVW-2 angegeben. Der Bereich des reifen PDGF-B und der Ncol/Sall (SEQ ID Nr. 8 + 9) Adapter sind durch schwarze Balken hervorgehoben.
Fig. 3) Schematische Darstellung der Rekonstruktion der voll¬ ständigen PDGF-B-Vorläufersequenz.
Fig. 4A +B) Schematische Darstellung der Konstruktion des bici- stronischen Vergleichs-Vektors pSBC-A/B (Fig. 4A) und des erfindungsgemäßen Expressionsvektors pSBC-PDGF-B/A (Fig. 4B) aus den Basisvektoren pSBC-1 und pSBC-2. Die Expressionsvektoren pSBC-PDGF-A/B und pSBC-PDGF-B/A unterscheiden sich dabei durch die Orientierung der ko- dierenden cDNA-Sequenzen der PDGF-A- und -B-Kette, d.h. durch ihre Lokalisierung auf dem Plasmid als in Lese¬ richtung erstes bzw. zweites Cistron.
Fig. 5) Northern-Blot Analyse transformierter BHK-Zellen. Es wurde die mRNA aus dem Gesamtpool der BHK-Zellen unter¬ sucht, die stabil mit den monocistronischen bzw. bici- stronischen PDGF-Expressionskonstrukten transfiziert worden waren. Erwartungsgemäß zeigen die monocistroni¬ schen mRNAs eine Größe von etwa 1.300 nt, während bei den bicistronischen mRNAs die Größe der codierenden
Sequenzen beider PDGF-Ketten (2.500 Nucleotide) vor¬ handen ist. Hiermit ist gezeigt, daß die entsprechenden Genprodukte von einer einzigen bicistronischen mRNA abgelesen werden. Als Referenz wurde die murine α-Actin Probe verwendet [Minty, A.J. et al., J. Biol. Chem.
256, 1008 - 1014, (1981)]. Fig. 6) Sandwich-ELISA zum Nachweis von PDGF-AB mit Hilfe eines monoklonalen und eines polyklonalen Anti-PDGF-Antikör- pers: Eichkurven von PDGF-Standards.
Polystyrolplatten wurden mit Schaf-Anti-Maus-IgG be- schichtet und anschließend mit einem Maus-Hybridoma-
Überstand (von Klon 1B3, enthält monoklonale Antikörper gegen die B-Kette in PDGF-AB und -BB) inkubiert; nach Inkubation mit verschiedenen PDGF Standards wurde das gebundene PDGF mit Hilfe eines polyklonalen Kaninchen- Anti-PDGF-AA, gefolgt von Peroxidase-markiertem Anti-
Kaninchen-IgG nachgewiesen; Quelle der PDGF-Standards:
AB: aus humanen Thrombozyten, von PROMEGA Corp. No. G 5161; BB: rekombinant aus Hefe, von PROMEGA Corp. No. G 5191;
AA: rekombinant aus BHK-Zellen, ca. 70%ig (Eichner et al., 1989).
Für PDGF's aus eukaryontisehen Quellen ergibt sich ein spezifisches Signal mit PDGF-AB (aus humanen Thrombozy- ten) mit einer geringen Kreuzreaktion mit PDGF-BB.
Fig. 7) Nachweis von PDGF-AB in Kulturüberständen von rekombi¬ nanten BHK-Zellen mittels PDGF-AB-ELISA: (Eichkurven von Standards s. Fig. 6). Die dargestellten Proben stammten von BHK-Zellen, die mit folgenden Vektorkon- strukten transfiziert worden waren:
Probe: Nr.l: pSBC-A/B, Nr.2: pSBC-B/A, Nr.3: pSBC-2-PDGF-A +pSBC-2-PDGF-B,
Nr.4: pSBC-2-PDGF-A, Nr.5: pSBC-2-PDGF-B, Nr.6: pSBC-2-Kontrolle Fig. 8) Analyse von gereinigtem rPDGF über-SDS-PAGE. Die Proben wurden auf einem 13,5%igen Polyacrylamidgel in der Gegenwart von SDS aufgetrennt und anschließend mit Coomassieblau gefärbt.
1, 6, 11 = LMW (PHARMACIA) [14400, 20100, 30000,
43000, 67000, 94000 D]
2 = pSBC-B/A
3 = pSBC-2-PDGF-A + pSBC-2-PDGF-B 4 = pSBC-A/B
5 = pSBC-2-PDGF-A
7-10 = gleiche Auftragsreihenfolge wie 2-5,un¬ ter Zugabe von jeweils 10% (v/v) ß-Mer- captoethanol (10 min, 95°C)
Die Analyse der gereinigten Sekretionsprodukte über SDS-PAGE korreliert mit den Ergebnissen aus der Analyse der Kultur¬ überstände (Tab. 2). Insbesondere an den unter reduzierenden Bedingungen auftretenden Banden der PDGF-Monomere kann man gut erkennen, daß Transfektionszellpools der Konstellation pSBC-2PDGF-A + pSBC-2-PDGF-B (Cotransfer) und pSBC-A/B (PDGF-A-Kette im ersten Cistron) überwiegend PDGF-AA-Homodi- mere sekretieren.
Das aus pSBC-B/A-Kulturüberständen isolierbare PDGF bandiert gegenüber dem als Referenz aufgetragenen PDGF-AA bei einem geringfügig niedrigeren Molekulargewicht. Unter reduzieren¬ den Bedingungen lassen sich beide Monomere zu etwa gleichen Teilen nachweisen. Die oberen Banden korrespondieren mit den Monomer-Banden der PDGF-A-Kette. Für rekombinantes PDGF-AA aus BHK-Zellen wurde bereits gezeigt, daß dieses Material zu etwa gleichen Anteilen aus der vollständigen PDGF-A-Kette, sowie einer C-terminal verkürzten Spezies besteht (Eichner et al. , 1989) . Die monomeren PDGF-A-Ketten bandieren bei einer M.. von etwa 17 KD. Darunter bandiert die PDGF-B-Kette (M.. 16 KD), die bei dem aus pSBC-B/A-Überständen isolierten Material eben¬ falls in einer verkürzten Form auftritt. Die Subspezies beider Ketten wurden gemeinsam durch Proteinsequenzanalyse analysiert und eindeutig als PDGF-A und PDGF-B identifi¬ ziert. Molekulargewichtsunterschiede für PDGF-B sind daher, genau wie bei PDGF-A, möglicherweise auf C-terminale Verkür¬ zungen oder veränderte Glycosylierungsmuster zurückzuführen. PDGF aus Überständen von pSBC-B/A besteht demnach zu etwa gleichen Teilen aus PDGF-A und PDGF-B-Ketten.
Das als Referenz aufgetragene, ebenfalls in BHK-Zellen exprimierte PDGF-AA ist nicht glykosyliert (Eichner et al., 1989), während in CHO-Zellen exprimiertes PDGF einen Kohlen- hydratanteil von etwa 7% enthält (Kolvenbach et al., 1991). Die PDGF-A-Monomere sowohl aus dem PDGF-AA-Homodimer als auch aus dem AB-Heterodimer stimmen in ihrem Laufverhalten in der SDS-PAGE gut überein.
2. Expression von PDGF-AB Heterodimer mit Hilfe des bicistroni¬ schen Vektorsystems
2.1 Herstellung der Basisvektoren pSBC-1 und pSBC-2 (Fig.l.
Für die Konstruktion des Vektors pSBC-1 wurde ein 627 bp Msel/Ball-Fragment aus dem Plasmid pGEM3-5' Polio (M) (Sar¬ now, 1989) als Matrize für eine PCR mit folgenden Primern verwendet:
5'-Pθliθl 5'TTT CTGCAG AAGCTT AAAACAGCTCTGGGG3'
PstI Hindlll
(SEQ ID Nr. 13)
3'-Poliθ2 5>TT GCGGCCGC AATCCAATTCGCTTTATG3'
Notl
(SEQ ID Nr. 14) Das nach der Amplifikation erhaltene 652 bp Fragment wurde mit Pol I K behandelt, anschließend mit PstI gespalten und in den entsprechend präparierten Vektor pBEH (Artelt et al., 1988) insertiert.
Für die Konstruktion des Vektors ρSBC-2 wurde das Plasmid pBEH mit Eco RI linearisiert und die folgenden Oligonukleo- tidsequenzen hybridisiert und insertiert:
E-N-El 5>AATT GCGGCCGC G3' (SEQ ID Nr. 15)
E-N-E2 3'CGCCGGCG CTTAA5' (SEQ ID Nr. 16)
2.2 Rekonstitution der vollständigen PDGF-B-Vorläuferseguenz
Das Plasmid pMVW-2 enthält die cDNA des humanen PDGF-B Gens, welches im 5'-translatierten Bereich der Vorläufersequenz unvollständig ist (Weich et al., 1986). Für die Rekonstitu- tion des authentischen PDGF-B precursors wurde in den 5'- terminalen Bereich des Vorläufers durch einen C-T-Austausch in Position 30 des codogenen Abschnittes des Klons pMVW-2 eine BclI-Schnittstelle eingeführt. Durch diesen Schritt geht letzlich nur ein kurzer Abschnitt des kodierenden Be¬ reiches verloren und die lokal codierte Aminosäure (Aspara- ginsäure) bleibt dabei erhalten. Da die BclI-Schnittstelle in den meisten E.coii-Stämmen durch Methylierung resistent gegenüber enzymatischer Spaltung ist, muß das diese Schnitt¬ stelle enthaltene Fragment entweder in einen dam'-Stamm um- kloniert, oder über einen PCR-Schritt amplifiziert werden. Der fehlende Bereich des Vorläufers wird dann als syntheti¬ sches Sall/Bell-Fragment [Oligomere PPDGFB1 und PPDGFB2 (SEQ ID Nr. 11 + 12)] eingesetzt.
Hierfür wurde zunächst das 914 bp BamHI/NcoI-Fragment aus pMVW-2 über einen synthetischen Adapter [Oligomere NCCLSA1 und NCCLSA2 (SEQ ID Nr. 8 + 9)] in den BamHI/Sall-gespal- tenen Bakteriophagen M13mpl9 (Pharmacia) insertiert. Dieses Konstrukt lieferte die notwendige Einzelstrang-DNA für den nachgeschalteten in vitro Mutageneseschritt, der mit Hilfe des Oligomer-directed in vitro mutagenesis System (Version 2) der Fa. Amersham, basierend auf der Methode von Eckstein et al. [Taylor J. W., Ott J. and Eckstein F. (1985) Nucl. Acids Res. 13, 8764-8785; Nakamaye K. and Eckstein F. (1986) Nucl. Acids Res. 14, 9679-9698; Sayers J. R. , Schmidt W. and Eckstein F. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 791-802] durchge¬ führt wurde. Durch den synthetischen Primer [PDGBBCL (SEQ ID Nr. 10)] wird nach der Mutagenese ein Basenaustausch (C zu T) in Position 144 der unter SEQ ID Nr. 3 dargestellten Se¬ quenz erreicht und dadurch im 5'-Bereich des PDGF-B precur- sors eine BclI-Schnittstelle eingeführt. Dieses Mutagenese- derivat wurde als M13BCL1 bezeichnet (Fig. 2).
Ein 1100 bp Fragment aus M13BCL1 wurde über einen PCR- Schritt mit Hilfe der Primer M1317MER und M1324MER (SEQ ID Nr. 6 + 7) amplifiziert, anschließend einer Bcll/Hindlll- Restriktion unterworfen und das resultierende 770 bp Frag- ment isoliert. Die synthetischen Oligomere PPDGFB1 und PPDGFB2 (SEQ ID Nr. 11 + 12) bilden den fehlenden 5'-Bereich des PDGF-B-Vorläufers bis zur BclI-Schnittstelle. Nach dem Annealing wurde dieses doppelsträngige Oligomer anschlie- ßend, zusammen mit dem 770 bp PDGF-B Fragment, in den mit einer Sall/Hindlll Restriktion vorbereiteten Vektor pGEM-2 (Promega) ligiert (Fig. 3). Die authentische Sequenz von PDGF-B wurde durch vollständige Sequenzierung verifiziert.
2.3 Konstruktion der bicistronischen Expressionsvektoren pSBC- PDGF-A/B und pSBC-PDGF-B/A für die PDGF-A- und B-Kette (Fig. 4A und B.
Die vollständige codierende cDNA für den PDGF-B precursor (Ratner et al., 1985) liegt in dem Vektor pGEM2-PDGF-B vor, wie unter 1.2 beschrieben. Die vollständige cDNA-Sequenz der kurzen Variante der PDGF-A-Kette (Betsholtz et al., 1986) ist im Expressionsvektor pODA (Eichner et al., 1989) enthal¬ ten. Dieser Vektor wurde erhalten durch Klonierung des Rsal- Fragments aus pPGF-1 (Hoppe et al., 1987) in den SV-40 Ex¬ pressionsvektor pBEH (Artelt et al., 1988).
Die kodierenden cDNA-Sequenzen der PDGF-A- und -B-Kette wurden unter Verwendung von EcoRI/HindiII Restriktionen in die monocistronischen Vektoren pSBC-1 und -2 insertiert (Abb. 4). Die Fusion beider Vektoren zu einer bicistroni¬ schen Expressionseinheit wurde mit Hilfe der Restriktions¬ enzyme Xmnl/Notl durchgeführt.
2.4 Herstellung transformierter BHK-Zellen
Die Transfektion der mono- und bicistronischen Expressions¬ vektoren, die die codierenden Sequenzen der A- und B-Kette von PDGF tragen (vgl. Fig.l, 4A+B) wurde mit der Calcium- phosphat-Präzipitationstechnik in BHK-Zellen durchgeführt (Wigler et al., 1979; Graham & van der Eb, 1973). Einen Tag vor der Transfektion wurden 2-3 x 10 BHK-Zellen/24 cm in neue Kulturflaschen umgesetzt. Vier Stunden vor der Trans¬ fektion wurde ein Medienwechsel mit DME-Medium durchgeführt. 5 μg der o. g. Plasmid-DNA zusammen mit 0,5 μg der Selek- tionsplasmide pAG60 und pSVpac (Colbere-Garapin, 1981; Vara et al., 1986), welche für ein Neomycinresistenzgen bzw. für eine Puromycin-Resistenz kodieren, in 250 μl 250 mM CaCl2 suspendiert. Die Lösung wurde langsam unter ständiger Ver- wirbelung durch steril eingeblasene Luft zu 250 μl 2 x HEPES-Puffer (280 mM NaCl; 50 mM HEPES; 1,5 mM NaH2P04 pH 7,1) gegeben und und das erhaltene Präzipitat dem Nährmedium zugesetzt. Zwei Tage nach der Transfektion wurde durch Me¬ dienwechsel von DME- auf Doppelselektionsmedium (5 μg/ml Puromycin; 500 μg/ml G418, Wirth et al., 1988) die Selektion auf stabil transfizierte Zellen begonnen und eine Population von PDGF sekretierenden Zellklonen erhalten. Ein repräsenta¬ tives Klongemisch dieser Zellen wurde bei der DSM am 11. 8. 1992 unter der Nummer DSM ACC2045 hinterlegt.
2.5 Northern Blot Analyse
Polyadenylierte RNA aus transformierten BHK-Zellen wurde nach Purchio et al., (1979) isoliert, über ein l%iges Agarose-Formaldehydgel fraktioniert (Lehrach et al., 1977), auf eine Nylonmembran geblottet und mit [ 2P]-markierten PDGF-A- und -B-Ketten spezifischen Sonden hybridisiert (Fig. 5).
2.6 Gewinnung konditionierter Zellkulturüberstände
Die Transformation der BHK-Zellen erfolgte analog 2.4. Nach dem Auszählen der Kolonien wurden die Zellen abtrypsini- siert, in frischem Selektionsmedium aufgenommen und auf eine Zellzahl von 105 Zellen/ml eingestellt. Je 10 ml dieser Zellsuspension wurden in eine Flasche mit 65 cm2 Bodenfläche überführt und für weitere 48 h kultiviert. Danach wurde das Medium entfernt und durch 10 ml Produktionsmedium (DMEM, ohne Serum und Selektions-Antibiotoka) ersetzt. Nach 24 h wurde das Medium abgenommen und durch serumhaltiges Selek¬ tionsmedium ersetzt. Die geernteten Überstände wurden bis zur Analyse bei -20°C gelagert. Zum Zeitpunkt der Ernte betrug die Zellzahl/Flasche 0.8-1.2xl07.
2.7 Nachweis von PDGF in den Kulturüberständen mit Hilfe des Mitogentests
Die Messung der Stimulierung der DNA-Syntheserate von dich¬ tearretierten Fibroblasten erlaubt eine Bestimmung der mitogenen Aktivität des PDGF. Eine Unterscheidung zwischen den Isoformen ist dabei nicht möglich.
Der Assay wurde gemäß Shipley et al. (1984) mit AKR-2B-Maus- fibroblasten in 24-Well-Platten durchgeführt. Reines PDGF zeigt in dem Test eine halbmaximale Stimulierung bei einer Konzentration von etwa 5 ng/ l. Dieser Wert wurde benutzt, um Produktivitäten zu bestimmen. Die Ergebnisse aus dem Mitogentest sind in Fig. 7 den Werten aus dem PDGF-AB-ELISA gegenübergestellt.
2.8 Nachweis von PDGF-AB Heterodimer in den Kulturüberständen mit Hilfe eines spezifischen PDGF-AB ELISA's
Es wurde ein 'two-antibody Sandwich assay' aufgebaut, der eine spezifische Quantifizierung von PDGF-AB neben PDGF-AA und -BB erlaubt.
Sandwich-Assay mit Hilfe eines monoklonalen und eines poly¬ klonalen Anti-PDGF-Antikörpers:
Polystyrolplatten mit 96 Kavitäten (Fa. Dynatech, U-Platte, No. M124B) werden in folgender Reihenfolge beschichtet (zwischen jedem Schritt jeweils 4 x Waschen mit PBS mit 0,05% Tween 20) :
1) Schaf-Anti-Maus-IgG (Fa. Boehringer Mannheim, Nr. 1097 105), 3 μg/ml.
2) 1% BSA (Fa. E. Merck, Nr. 12018) in PBS, pH 7,5, 100 μl für 1 h bei R.T.
3) Maus-Hybridoma-Überstand von Klon 1B3 [erhalten durch Fusion von SP2/0-Myelomzellen mit Milzzellen von Mäu¬ sen, die mit rekomb. PDGF-AB (aus E. coli gemäß Hoppe et al. (1990) immunisiert worden waren], 2 μg/ml IgG2a/ml. Der monoklonale Antikörper bindet spezifisch an der B-Kette von PDGF-Dimeren.
4) PDGF-haltige Lösungen, verdünnt in PBS mit 0,1 % BSA und 0,05 % Tween 20 (PBS+), 50 μl für 1 h bei R.T.
5) Polyklonales Kaninchen-Anti-PDGF-AA-IgG (Fa. Genzyme, No. ZP-214, bindet an der A-Kette von dimerem PDGF), 2 μg/ml in PBS+, 50 μl für 1 h bei R.T.
6) POD-markiertes Ziege-Anti-Kaninchen IgG (Fa. Pierce, No. 31460), 0,1 μg/ml in PBS+, 50 μl für 1 h bei R.T.,
Detektion mit dem Substrat Tetramethylbenzidin gemäß E.S. BOS et al. (J.Immunoassay 2_ (1981), 187-204).
2.8.1 Ergebnisse:
In der Abbildung 7 sind die Resultate von drei unter¬ schiedlichen Analysen für PDGF aus Kulturüberständen rekombinanter BHK-Zellen dargestellt.
Der Mitogentest liefert einen brauchbaren Wert für die
Gesamtmenge des in den Kulturüberständen vorhandenen rPDGF, ohne zwischen den verschiedenen Isoformen (PDGF-AA, AB oder BB) differenzieren zu können.
Der spezifische Anteil an heterodimerem PDGF-AB kann mit ausreichend hoher Genauigkeit durch den PDGF-AB- spezifischen ELISA bestimmt werden. Aus der Differenz dieser Analyse zum Ergebnis des Mitogentests kann der prozentuale Anteil von PDGF-Homodimeren rechnerisch ermittelt werden (Tabelle 1).
Das Ergebnis des ELISA's zeigt, daß nur in Kulturüber¬ ständen von transfizierten Zellinien des Typs pSBC- PDGF-B/A die meßbare biologische Aktivität im Mitogen- test mit hohen PDGF-AB-Werten korreliert.
2.9 Reinigung des sekretierten PDGF-AB
Für die Reinigung der Sekretionsprodukte aus 1,5 - 2,5 Litern konditionierter Kulturüberstände der unterschiedli- chen Transfektions-Zellpools wurde ein für die Reinigung von rPDGF-AA aus Zellkulturüberständen entwickeltes Verfahren angewendet (Eichner et al., 1989). Das nach dem HPLC-Schritt hoch- oder teilgereinigte PDGF wurde auf einem Polyacryla- midgel nach Lae mli (1970) in der Gegenwart von SDS aufge- trennt und nach anschließender Coomassieblaufärbung analy¬ siert (Fig. 8).
2.10 Aminoterminale Seguenzierung von PDGF-Polvpeptiden
Durch Proteinsequenzanalyse sollten beide PDGF-Ketten eindeutig identifiziert werden um auszuschließen, daß hier verkürzte, prozessierte Formen nur einer PDGF-Kette vorlie¬ gen (s. Fig. 8) .
Die automatische Sequenzanalyse wurde am Modell 477A (Ap¬ plied Biosystems) mit dem Zyklus BLOTTl durchgeführt. Die Analyse der Phenylthiohydantoin-Aminosäuren-Derivate erfolg¬ te auf dem online gekoppelten 120A PTH-Analyser.
Die Disulfidbrücken der Probe werden mit Dithiothreitol reduziert und mit 4-Vinylpyridin alkyliert. Sie wird auf einem horizontalen SDS-Elektrophorese-Gel nach Schägger und von Jagow, modifiziert wie beschrieben (Westermeier et al. SD 092/89, Pharmacia LKB Biotechnologie) getrennt. Die Probe wird auf eine PVDF-Membran (Problot, Applied Biosystems) mit einem diskontinuierlichen Puffersystem wie beschrieben (We¬ stermeier et al. SDRE-072, Pharmacia LKB Biotechnologie) geblottet und mit Comassie Brillant Blau R250 gefärbt. Die beiden Doppelbanden bei 17 und 16 KD werden ausgeschnitten und zusammen sequenziert.
Nach den Ergebnissen der Proteinbestimmung wurden 10 μg Probe analysiert. Es konnten die N-terminalen Aminosäuren der PDGF-A- und PDGF-B-Kette in gleicher Ausbeute nachgewie¬ sen werden (Tabelle 2). Nebensequenzen wurden nicht detek- tiert.
Tabelle 1 pSBC-A/B pSBC-B/A pSBC-2-PDGF-A + pSBC-2-PDGF-A pSBC-2-PDGF-B pSBC-Kontroll pSBC-2-PDGF-B
Figure imgf000030_0001
Anteil PDGF-AB 40 95 56
Tabelle 2
Figure imgf000031_0001
* Ausbeute aus beiden Ketten Abkürzungen:
BHK - Hamsterzellinie (Baby Hamster Kidney) bp - Basenpaar(e)
CHO - Hamsterzellinie (Chinese Hamster Ovary)
BSA - Rinderserumalbumin
D - Dalton
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium
ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay
HEPES - 4-(2-Hydroxyl)-l-piperazinethansulfonsäure
HPLC - HochdruckflüssigkeitsChromatographie
IgG - Immunglobulin der Klasse G
IRES - internal ribosomal entry site nt - Nukleotid(e)
PAGE - Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS - phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PCR - Polymerase Kettenreaktion
PDGF - Wachstumsfaktor aus Thrombozyten
POD - Peroxidase
PVDF - Polyvinylidenfluorid
SDS - Natriumdodecylsulfat
UTR - nicht translatierte Region
LITERATUR
Adam M. A., Ra esh N.r Miller A. D., and Osborne W. R. A. (1991) J. Virol. 65, 4985-4990.
Artelt P., Morelle C, Ausmeier M. , Fitzek M. , and Hauser H. (1988) Gene 68, 213-219.
Beckmann M. P., Betsholtz C, Heldin C.-H., Westeππark B., Di Marc E., Di. Flore P. P., Robbins K. C, and Aaronson S. A. (1988 Science 241, 1344-1349.
Betsholtz C, Johnsson A., Heldin C.-H., Westermark B.r Lind P. Urdea M. S., Eddy R., Shows T. B.r Philpott K. , Mellor A. L., Knot T. J., and Scott J. (1986) Nature 320, 695-699.
Block L. H., Emmons L. R., Vogt E., Sachinidis A., Vetter W., an Hoppe J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 2388-2392.
Boel E., Berkner K. L.f Nexoe B. A. , and Schwartz T. W. (1987) FEB Lett. 219, 181-188.
Bywater M. , Rorsman F., Bongcam-Rudloff E., Mark G., Hammacher A. Heldin C.-H., Westermark B., and Betsholtz C. (1988) Mol. Cell Biol. 8, 2753-2762.
Colbέre-Garapin F., Horodniceanu F. , Kourilsky P., and Garapin A. C (1981) J. Mol. Biol. 150, 1-14.
Eichner W., Jäger V., Herbst D., Häuser H. and Hoppe J. (1989) Eur J. Biochem. 185, 135-140.
Falcone D., and Andrews D.W. (1991) Mol. Cell. Biol. 11 (5), 2656 2664.
Ghattas I. R., Sanes J. R. , and Majors J. E. (1991) Mol. Cell. Biol 22, 5848-5859.
Graham F., and van der Eb L. (1973) Virology 52, 456-487.
Hambidge S. J., and Sarnow P. (1991) J. Virol. 65, 6312-6315.
Hammacher A., Hellmann U., Johnsson A., östman A., Gunnarsson K. Westermark B., Wasteson . , and Heldin C.-H. (1988) J. Biol. Chem 263, 16493-16499.
Hart C. E., Forstrom J. W. , Kelly J. D., Seifert R. A., Smith R. A. Rose R. , Murray M. J., and Bowen-Pope D. F. (1988) Science 240 1529-1531.
Hart C. E., Bailey M. , Curtis D. A. , Osborn S., Raines E., Ross R. and Forstrom J. W. (1990) Biochemistry 29, 166-172. Heldin C.-H., Johnsson A., Wennergren S., Wernstedt C, Betsholtz C, and Westermark B. (1986) Nature 319, 511-514.
Heldin C.-H., Bäckström G., östman A., Hammacher A. , Rönnstrand L., Rubin K., Nister M. , and Westermark B. (1988) EMBO J. 7, 1387-1393.
Hoppe J., Schumacher L. , Eichner W. and Weich H.A. (1987), FEBS Lett. 223, 243-246.
Hoppe J., Weich H. A. , and Eichner W. (1989) Biochemistry 28, 2956- 2960.
Hoppe J., Weich H. A., and Eichner W., and Tatje D. (1990) Eur. J. Biochem. 187, 207-214.
Hosang M., Rouge M. , Wipf B., Eggiman B., Kaufmann F., and Hunziker W. (1989) J. Cell. Physiol. 149, 558-564.
Jackson R. J., Howell M. T., and Kaminski A. (1990) Trends Biochem. Sei. 15, 477-483.
Jang S. K., Kräusslich H., Nicklin M. J. H., Duke G. M., Palmenberg A. C, and Wi mer E. (1988) J. Virol. 62, 2636.
Jang S. K., Davies M. V., Kaufmann R. J., and Wimmer E. (1989) J. Virol. 63 (4), 1651-1660.
Jang S. K., and Wimmer E. (1990) Genes Dev. 4, 1560-1572.
Johnsson A., Heldin C.-H., Wasteson A., Westermark B., Deuel T. F., Huang J. S., Seeburg P. H., Gray A., Ullrich A., Scrace G., Stroobant P., Waterfield M. D. (1984) EMBO J. 136, 921-928.
Kaufman R. J., Murtha P., and Davies M. V. (1987) EMBO J. 6, 187- 193.
Kaufman R. J., Davies M. V. Waβley L. C, and Michnick D. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490.
Kelly J. D., Raines E. W., Ross R., and Murray M. J. (1985) EMBO J. 4, 3399-3405.
Kolvenbach C. G., Langley K. E., Strickland T. W., Kenney W. C, and Arakawa T. (1991) J. Biochem. Biophys. Meth. 23, 295-300.
Kozak M. (1987) Mol. Cell. Biol. 7 (10), 3438-3445.
Kozak M. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 5134-5142.
Laemmli U. K. (1970) Nature 227, 680-685.
Lehrach H., Diamond D., Wozney J. M., and Boedtker H. (1977) Bioche¬ mistry 16, 4743-4751. Macejak D. G., and Sarnow P. (1991) Nature (London) 353, 90-94.
Matoskova B., Rorsman ."" , Svensson V. and Betsholtz C. (1989), Mol Cell. Biol. 9, 3148-3150.
Meerovitch K., Pelletier J., and Sonenberg N. (1989) Genes Dev. 3 1026-1034.
Nister M., Hammacher A., Mellström K. , Siegbahn A. , Rönnstrang L. Westermark B., and Heldin C.-H. (1988); Cell 52, 791-799. östman A., Rall L., Hammacher A., Wormstead M. A., Coit D., Valen zuela F., Betsholtz C, Westermark B., and Heldin C.-H. (1988) J Biol. Che . 263, 16202-16208.
Pelletier J., and Sonenberg N. (1988) Nature 334, 320.
Purchio A. F. and Fareed G. C. (1979) J. Virol. 29, 763-769.
Ratner L., Josephs S. F., Jarrett R., Reitz M. S. and Wong-Staal F (1985), Nucl. Acids Res. 13, 5007-5018.
Reilly C. F. and Broski J. E. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun 160, 1047-1054.
Sachinidis A., Locher R., Vetter W., Tatje D., and Hoppe J. (1990 J. Biol. Chem. 265, 10238-10243.
Sachinidis A., Locher R., Hoppe J., and Vetter W. (1990) FEBS Lett 275, 95-98.
Sarnow P. (1989) J. Virol. 63, 467-470.
Shipley G. D., Childes C. B., Volkenant M. E. and Moses H. L. (1984 Cancer Res. 44, 710-716.
Siegbahn A., Hammacher A., Westermark B. , and Heldin C.-H. (1990) J Clin. Invest. 85, 916-920.
Simoes E. A. F., and Sarnow P. (1991) J. Virol. 65, 913-921.
Stroobant P., and Waterfield M. D. (1984) EMBO J. 3, 2963-2967.
Vara J., Portela A., Oritin J. and Jimenez A. (1986) Nucl. Acid Res. 14, 4617-4624.
Weich H. A., Sebald W., Schairer H. U., and Hoppe J. (1986), FE Lett. 198, 344-348.
Wigler M., Sweet R., Sim G. K. , Wold B., Pellicer A. , Lacy E. Maniatis T., Silverstein S., and Axel R. (1979) Cell 16, 777-785.
Wirth M., Bode J., Zettlmeifil G., and Hauser H. (1988) Gene 73, 419 426. Wirth M., Schumacher L., and Hauser H. (1991) In Modern Approaehes to Animal Cell Technology, Griffiths B., Spier R., and Meigner R. , eds. Butterworths) , pp. 338-343.
Wise R. J., Orkin S. H. and Collins T. (1989) Nucl. Acids Res. 17, 6591-6601.
Wood C. R., Morris G. E., Alderman E. M., Fouser L., and Kaufman R. J. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 8006-8010.
Young R. M., Mendoza A. E., Collins T. and Orkin S. H. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 6051-6054.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Beiersdorf AG
(B) STRASSE: Unnastr. 48
(C) ORT: Hamburg
(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 20245
(A) NAME: GBF - Gesellschaft fuer Biotechnologische
Forschung mbH
(B) STRASSE: Mascheroder Weg 1
(C) ORT: Braunschweig
(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 38124
(ii) ANMELDETITEL: Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit
Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Saeugerzellen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 16
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy dis
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 748 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: pODA (Eichner et al., 1989)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 95..682
(D) SONSTIGE ANGABEN: /product- "PDGF-A Vorlaeufersequenz (kurze Splicefor )"
/note= "humanes PDGF-A Gen (kurze Spliceform, [2]) aus pODA, flankiert von 5'-EcoRI und 3'-HindIII Restriktionsschnittsteilen" /citation«* ([2])
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat peptide
(B) LAGE: 353..682
(D) SONSTIGE ANGABEN: /product "mature PDGF-A Kette" (x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION: (A) AUTOREN: Eichner, W. Jaeger, V. Herbst, D. Hauser, H. Hoppe, J.
(C) ZEITSCHRIFT: Eur. J. Biochem.
(D) BAND: 185
(F) SEITEN: 135-140
(G) DATUM: 1989
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION: (A) AUTOREN: Hoppe, J.
Schumacher, L. Eichner, W. Weich, H. A.
(C) ZEITSCHRIFT: FEBS Lett.
(D) BAND: 223
(F) SEITEN: 243-246
(G) DATUM: 1987
( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GAATTCCCAC TGAATTTCGC CGCCACAGGA GACCGGCTGG AGCGCCCGCC CCGCGCCTCG 60
CCTCTCCTCC GAGCAGCCAG CGCCTCGGGA CGCG ATG AGG ACC TTG GCT TGC 112
Met Arg Thr Leu Ala Cys -86 -85
CTG CTG CTC CTC GGC TGC GGA TAC CTC GCC CAT GTT CTG GCC GAG GAA 160 Leu Leu Leu Leu Gly Cys Gly Tyr Leu Ala His Val Leu Ala Glu Glu -80 -75 -70 -65
GCC GAG ATC CCC CGC GAG GTG ATC GAG AGG CTG GCC CGC AGT CAG ATC 208 Ala Glu Ile Pro Arg Glu Val Ile Glu Arg Leu Ala Arg Ser Gin Ile -60 -55 -50
CAC AGC ATC CGG GAC CTC CAG CGA CTC CTG GAG ATA GAC TCC GTA GGG 256 His Ser Ile Arg Asp Leu Gin Arg Leu Leu Glu Ile Asp Ser Val Gly -45 -40 -35
AGT GAG GAT TCT TTG GAC ACC AGC CTG AGA GCT CAC GGG GTC CAC GCC 304 Ser Glu Asp Ser Leu Asp Thr Ser Leu Arg Ala His Gly Val His Ala -30 -25 -20
ACT AAG CAT GTG CCC GAG AAG CGG CCC CTG CCC ATT CGG AGG AAG AGA 352 Thr Lys His Val Pro Glu Lys Arg Pro Leu Pro Ile Arg Arg Lys Arg -15 -10 -5
AGC ATC GAG GAA GCT GTC CCC GCT GTC TGC AAG ACC AGG ACG GTC ATT 400 Ser Ile Glu Glu Ala Val Pro Ala Val Cys Lys Thr Arg Thr Val Ile 1 5 10 15
TAC GAG ATT CCT CGG AGT CAG GTC GAC CCC ACG TCC GCC AAC TTC CTG 448 Tyr Glu Ile Pro Arg Ser Gin Val Asp Pro Thr Ser Ala Asn Phe Leu 20 25 30
ATC TGG CCC CCG TGC GTG GAG GTG AAA CGC TGC ACC GGC TGC TGC AAC 496 Ile Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Lys Arg Cys Thr Gly Cys Cys Asn 35 40 45
ACG AGC AGT GTC AAG TGC CAG CCC TCC CGC GTC CAC CAC CGC AGC GTC 544 Thr Ser Ser Val Lys Cys Gin Pro Ser Arg Val His His Arg Ser Val 50 55 60 AAG GTG GCC AAG GTG GAA TAC GTC AGG AAG AAG CCA AAA TTA AAA GAA 592 Lys Val Ala Lys Val Glu Tyr Val Arg Lys Lys Pro Lys Leu Lys Glu 65 70 75 80
GTC CAG GTG AGG TTA GAG GAG Ci.T TTG GAG TGC GCC TGC GCG ACC ACA 640 Val Gin Val Arg Leu Glu Glu His Leu Glu Cys Ala Cys Ala Thr Thr 85 90 95
AGC CTG AAT CCG GAT TAT CGG GAA GAG GAC ACG GAT GTG AGG 682
Ser Leu Asn Pro Asp Tyr Arg Glu Glu Asp Thr Asp Val Arg 100 105 110
TGAGGATGAG CCGCAGCCCT TTCCTGGGAC ATGGATGTGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCC 742
AAGCTT 748
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 196 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Arg Thr Leu Ala Cys Leu Leu Leu Leu Gly Cys Gly Tyr Leu Ala -86 -85 -80 -75
His Val Leu Ala Glu Glu Ala Glu Ile Pro Arg Glu Val Ile Glu Arg -70 -65 -60 -55
Leu Ala Arg Ser Gin Ile His Ser Ile Arg Asp Leu Gin Arg Leu Leu -50 -45 -40
Glu Ile Asp Ser Val Gly Ser Glu Asp Ser Leu Asp Thr Ser Leu Arg -35 -30 -25
Ala His Gly Val His Ala Thr Lys His Val Pro Glu Lys Arg Pro Leu -20 -15 -10
Pro Ile Arg Arg Lys Arg Ser Ile Glu Glu Ala Val Pro Ala Val Cys -5 1 5 10
Lys Thr Arg Thr Val Ile Tyr Glu Ile Pro Arg Ser Gin Val Asp Pro 15 20 25
Thr Ser Ala Asn Phe Leu Ile Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Lys Arg 30 35 40
Cys Thr Gly Cys Cys Asn Thr Ser Ser Val Lys Cys Gin Pro Ser Arg 45 50 55
Val His His Arg Ser Val Lys Val Ala Lys Val Glu Tyr Val Arg Lys 60 65 70
Lys Pro Lys Leu Lys Glu Val Gin Val Arg Leu Glu Glu His Leu Glu 75 80 85 90 Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ser Leu Asn Pro Asp Tyr Arg Glu Glu Asp 95 100 105
Thr Asp Val Arg 110
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 868 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: pMVW-2 (Weich et al., 1986)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 40.. 62
(D) SONSTIGE ANGABEN: /product- "PDGF-B Vorlaeufersequenz"
/note- "humanes PDGF-B Gen aus pGEM2-PDGF-B, flankiert von 5'-EcoRI und 3'-HindIII RestriktionsSchnittstellen"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide
(B) LAGE: 283..609
(D) SONSTIGE ANGABEN: /product- "mature PDGF-B Kette"
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION: (A) AUTOREN: Weich, H. A. Sebald, W. Schairer, H. U. Hoppe, U.
(C) ZEITSCHRIFT: FEBS Lett.
(D) BAND: 198
(F) SEITEN: 344-348
(G) DATUM: 1986
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
GAATTCGAGC TCGCCCGGGG ATCCTCTAGA GTCGACACC ATG AAT CGC TGC TGG 54
Met Asn Arg Cys Trp -81 -80
GCG CTC TTC CTG TCT CTC TGC TGC TAC CTG CGT CTG GTC AGC GCC GAG 102 Ala Leu Phe Leu Ser Leu Cys Cys Tyr Leu Arg Leu Val Ser Ala Glu -75 -70 -65
GGG GAC CCC ATT CCC GAG GAG CTT TAT GAG ATG CTG AGT GAT CAC TCG 150 Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met Leu Ser Asp His Ser -60 -55 -50 -45 ATC CGC TCC TTT GAT GAT CTC CAA CGC CTG CTG CAC GGA GAC CCC GGA 198 Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gin Arg Leu Leu His Gly Asp Pro Gly -40 -35 -30
GAG GAA GAT GGG GCC GAG TTG GAC CTG AAC ATG ACC CGC TCC CAC TCT 246 Glu Glu Asp Gly Ala Glu Leu Asp Leu Asn Met Thr Arg Ser His Ser -25 -20 -15
GGA GGC GAG CTG GAG AGC TTG GCT CGT GGA AGA AGG AGC CTG GGT TCC 294 Gly Gly Glu Leu Glu Ser Leu Ala Arg Gly Arg Arg Ser Leu Gly Ser -10 -5 1
CTG ACC ATT GCT GAG CCG GCC ATG ATC GCC GAG TGC AAG ACG CGC ACC 342 Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys Lys Thr Arg Thr 5 10 15 20
GAG GTG TTC GAG ATC TCC CGG CGC CTC ATA GAC CGC ACC AAC GCC AAC 390 Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn Ala Asn 25 30 35
TTC CTG GTG TGG CCG CCC TGT GTG GAG GTG CAG CGC TGC TCC GGC TGC 438 Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gin Arg Cys Ser Gly Cys 40 45 50
TGC AAC AAC CGC AAC GTG CAG TGC CGC CCC ACC CAG GTG CAG CTG CGA 486 Cys Asn Asn Arg Asn Val Gin Cys Arg Pro Thr Gin Val Gin Leu Arg 55 60 65
CCT GTC CAG GTG AGA AAG ATC GAG ATT GTG CGG AAG AAG CCA ATC TTT 534 Pro Val Gin Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys Lys Pro Ile Phe 70 75 80
AAG AAG GCC ACG GTG ACG CTG GAA GAC CAC CTG GCA TGC AAG TGT GAG 582 Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala Cys Lys Cys Glu 85 90 95 100
ACA GTG GCA GCT GCA CGG CCT GTG ACC CGA AGC CCG GGG GGT TCC CAG 630 Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Ser Pro Gly Gly Ser Gin 105 110 115
GAG CAG CGA GCC AAA ACG CCC CAA ACT CGG GTG ACC ATT CGG ACG GTG 678 Glu Gin Arg Ala Lys Thr Pro Gin Thr Arg Val Thr Ile Arg Thr Val 120 125 130
CGA GTC CGC CGG CCC CCC AAG GGC AAG CAC CGG AAA TTC AAG CAC ACG 726 Arg Val Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg Lys Phe Lys His Thr 135 140 145
CAT GAC AAG ACG GCA CTG AAG GAG ACC CTT GGA GCC TAGGGGCATC 772
His Asp Lys Thr Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly Ala 150 155 160
GGCAGGAGAG TGTGTGGGCA GGGTTATTTA ATATGGTATT TGCTGTATTG CCCCCATGGC 832
CCAATCGATC CCGTCGACCT GCAGGCATGC AAGCTT 868 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK^:
(A) LÄNGE: .241 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear-
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Ser Leu Cys Cys Tyr Leu Arg -81 -80 -75 -70
Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met -65 -60 -55 -50
Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gin Arg Leu Leu -45 -40 -35
His Gly Asp Pro Gly Glu Glu Asp Gly Ala Glu Leu Asp Leu Asn Met -30 -25 -20
Thr Arg Ser His Ser Gly Gly Glu Leu Glu Ser Leu Ala Arg Gly Arg -15 -10 -5
Arg Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu 1 5 10 15
Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp 20 25 30
Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gin 35 40 45
Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gin Cys Arg Pro Thr 50 55 60
Gin Val Gin Leu Arg Pro Val Gin Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg 65 70 75
Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu 80 85 90 95
Ala Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Ser 100 105 110
Pro Gly Gly Ser Gin Glu Gin Arg Ala Lys Thr Pro Gin Thr Arg Val 115 120 125
Thr Ile Arg Thr Val Arg Val Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg 130 135 140
Lys Phe Lys His Thr His Asp Lys Thr Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly 145 150 155
Ala 160 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 628 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Polioviruε Typ 1 (Mahoney strain)
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: pGEM3-5'Polio (M) (4708 bp) , (Sarnow, 1989)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..628
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "abgebildet sind die ersten 628 nt der 5' nicht-translatierten Region des Poliovirus Typ 1 (Mahoney)"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 610
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "nicht-authentische Sequenz auf Grund einer Basenpaarsubstitution von C nach G an der Position 610"
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION: (A) AUTOREN: Sarnow, P.
(C) ZEITSCHRIFT: J. Virol.
(D) BAND: 63
(F) SEITEN: 467-470
(G) DATUM: 1989
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
TTAAAACAGC TCTGGGGTTG TACCCACCCC AGAGGCCCAC GTGGCGGCTA GTACTCCGGT 60
ATTGCGGTAC CCTTGTACGC CTGTTTTATA CTCCCTTCCC GTAACTTAGA CGCACAAAAC 120
CAAGTTCAAT AGAAGGGGGT ACAAACCAGT ACCACCACGA ACAAGCACTT CTGTTTCCCC 180
GGTGATGTCG TATAGACTGC TTGCGTGGTT GAAAGCGACG GATCCGTTAT CCGCTTATGT 240
ACTTCGAGAA GCCCAGTACC ACCTCGGAAT CTTCGATGCG TTGCGCTCAG CACTCAACCC 300
CAGAGTGTAG CTTAGGCTGA TGAGTCTGGA CATCCCTCAC CGGTGACGGT GGTCCAGGCT 360
GCGTTGGCGG CCTACCTATG GCTAACGCCA TGGGACGCTA GTTGTGAACA AGGTGTGAAG 420
AGCCTATTGA GCTACATAAG AATCCTCCGG CCCCTGAATG CGGCTAATCC CAACCTCGGA 480
GCAGGTGGTC ACAAACCAGT GATTGGCCTG TCGTAACGCG CAAGTCCGTG GCGGAACCGA 540
CTACTTTGGG TGTCCGTGTT TCCTTTTATT TTATTGTGGC TGCTTATGGT GACAATCACA 600
GATTGTTATG ATAAAGCGAA TTGGATTG 628 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..17
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- M1317MER
/note- "synthetische DNA; M13 Sequenzierprimer (New England Biolabs GmbH), eingesetzt fuer PCR"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6: GTAAAACGAC GGCCAGT 17
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..24
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- M1324MER
/note- "synthetische DNA; M13 reverser Sequenzierprimer (New England Biolabs GmbH), eingesetzt fuer PCR"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7: AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA ~ 24
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..19
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- NCCLSA1
/note- "synthetische DNA; synthetischer Linker zur Umklonierung des verkuerzten PDGF-B Vorlaeufers aus pMVW-2 in den Bakteriophagen M13mpl9"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8: CATGGCCCAA TCGATCCCG 19
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..19
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- NCCLSA2
/note- "synthetische DNA; synthetischer Linker zur Umklonierung des verkuerzten PDGF-B Vorlaeufers aus pMVW-2 in den Bakteriophagen M13mpl9"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9: TCGACGGGAT CGATTGGGC 19
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear ~~
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..37
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- PDGBBCL
/note- "synthetische DNA; Mutageneseprimer zur Einfuehrung einer BclI-Schnittstelle in den 5'-Bereich des PDGF-B Vorlaeufers"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10: GCTTTATGAG ATGCTGAGTG ATCACTCGAT CCGCTCC 37
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK.:
(A) LÄNGE: 110 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..110
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- PPDGFB1
/note- "synthetische DNA; synthetischer Linker zur Rekonstitution der maturen PDGF-B Vorlaeufersequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11: TCGACACCAT GAATCGCTGC TGGGCGCTCT TCCTGTCTCT CTGCTGCTAC CTGCGTCTGG 60 TCAGCGCCGA GGGGGACCCC ATTCCCGAGG AGCTTTATGA GATGCTGAGT 110 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 110 Basenpaare
(B) ART: Nuklt .säure
(C) STRANGFORM. Zinzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..110
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- PPDGFB2
/note- "synthetische DNA; synthetischer Linker zur Rekonstitution der maturen PDGF-B Vorlaeufersequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12: GATCACTCAG CATCTCATAA AGCTCCTCGG GAATGGGGTC CCCCTCGGCG CTGACCAGAC 60 GCAGGTAGCA GCAGAGAGAC AGGAAGAGCG CCCAGCAGCG ATTCATGGTG 110
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..30
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- 5'-POLI01
/note- "synthetische DNA; synthetischer PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13: TTTCTGCAGA AGCTTAAAAC AGCTCTGGGG 30
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..28
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- 3'-P0LI02
/note- "synthetische DNA; synthetischer PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14: TTGCGGCCGC AATCCAATTC GCTTTATC 28
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK.:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..13
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- E-N-El
/note- "synthetische DNA; synthetischer Linker"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15: AATTGCGGCC GCG 13
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK.:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) LAGE: 1..13
(D) SONSTIGE ANGABEN: /label- E-N-E2
/note- "synthetische DNA; synthetischer Linker"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16: AATTCGCGGC CGC 13

Claims

Patentansprüche
1. Bicistronisehe Expressionseinheit zur rekombinanten Herstel¬ lung von heterodimerem PDGF-AB in Säugerzellen als Wirtszel¬ len, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel
p - 5'UTR - Cx - IRES - C2 - 3'UTR - polyA,
in der
p ein transkriptionaler Promotor ist,
5'UTR eine nicht translatierte Nukleotidsequenz ist,
Cj ein Cistron ist, welches ein für die B-Kette von PDGF, ein biologisch aktives Analogon oder ein Fragment der¬ selben kodierendes Gen enthält,
IRES eine Nukleotidsequenz viralen, zellulären ode synthetischen Ursprungs ist, die in der Stufe der Trans¬ lation für die interne Initiation verantwortlich ist,
C2 ein Cistron ist, welches ein für die A-Kette von PDG oder ein biologisch aktives Analogon oder ein Fragmen derselben kodierendes Gen enthält,
3'UTR eine nicht translatierte Nukleotidsequenz ist,
und polyA ein Polyadenylierungssignal ist,
wobei Cl IRES und C2operativ miteinander verknüpft sind.
2. Expressionseinheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Cx die vollständige PDGF-B Vorläufersequenz (SEQ ID Nr. 3) , deren allelische Varianten oder Fragmente derselben ent¬ hält, welche für eine biologisch wirksame PDFG-B Kette ko¬ diert.
3. Expressionseinheit nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Ci das v-sis-Gen aus Simian Sarcoma Virus oder die Basen¬ paare 283 bis 609 gemäß SEQ ID Nr. 3 enthält.
4. Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß C2 die PDGF-AK- (SEQ ID Nr. 1) oder die PDGF-A Vorläufer-Sequenz enthält.
5. Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß IRES die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr.
.5 ist.
6. Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß IRES die 5'UTR des Enzephalomyocarditi Virus (EMV), des "Theilers murine encephalomyelitis virus" (TMEV), des "foot and mouth disease virus" (FMDV) , des "bovin enterovirus" (BEV), des "coxsackie B virus" (CBV), des "huma rhinovirus" (HRV) oder die "human immunoglobulin heavy chai binding protein" (BIP) 5'UTR, die Drosophila Antennapedia 5'UTR, die Drosophila Ultrabithorax 5'UTR oder genetisch Hybride oder Fragmente aus den oben angeführten Sequenzen ist.
7. Rekombinanter DNA-Vektor, welcher die Expressionseinheit nac den Ansprüchen 1 bis 6, operativ verknüpft mit Expressionskon trollSequenzen, enthält.
8. Wirtszelle, welche eine Säugerzelle transformiert mit de Vektor gemäß Anspruch 7 ist.
9. Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine CHO- oder BHK-Zelle ist.
10. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine BHK-Zelle ist und von dem Klon 91-24-4D mit der Hinter- legungs-Nr. DSM ACC2045 abstammt.
11. Verfahren zur Herstellung von heterodimerem rPDGF-AB, dadurch gekennzeichnet, daß man Säugerzellen als Wirtszellen, die eine Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 6 operativ insertiert enthalten, in einem geeigneten Medium kultiviert und das so erzeugte rPDGF-AB von den Zellen und dem Medium ab¬ trennt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Zelle nach den Ansprüchen 9 bis 11 ist.
13. Heterodimeres rPDGF-AB, im wesentlichen frei von homodimeren Begleitprodukten, erhältlich durch Kultivieren von Säuger¬ zellen als Wirtszellen, die eine Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 6 operativ verknüpft enthalten, in einem geeigneten Medium und Abtrennen des so erzeugten rPDGF-AB von den Zellen und dem Medium.
14. Heterodimeres rPDGF-AB, im wesentlichen frei von homodimeren Begleitprodukten, erhältlich durch Kultivieren von BHK- oder CHO-Zellen als Wirtszellen, die eine Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 6 operativ verknüpft enthalten, in einem geeigneten Medium und Abtrennen des so erzeugten rPDGF-AB von den Zellen und dem Medium.
15. Heterodimeres, im wesentlichen von homodimeren Begleitproduk¬ ten freies PDGF-AB, erhältlich durch Kultivieren von Wirts- zellen gemäß Anspruch 10, die eine Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 6 operativ verknüpft enthalten, in einem geeigneten Medium und Abtrennen des so erzeugten rPDGF-AB von den Zellen und dem Medium.
16. Pharmazeutisches und/oder kosmetisches Präparat, enthaltend rPDGF-AB hergestellt nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 11 oder 12 zustimmen mit pharmazeutisch und/oder kosmetisch verträglichen Hilfs- und TrägerStoffen.
17. Pharmazeutisches und/oder kosmetisches Präparat, enthaltend rPDGF-AB nach den Ansprüchen 13 bis 15 zusammen mit pharmazeutisch und/oder kosmetisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen.
18. Pharmazeutisches Präparat nach den Ansprüchen 16 oder 17 in Form einer Salbe, eines Gels, eines Sprays, eines Pflasters, eines Wundverbandes oder einer Wundauflage.
PCT/EP1993/002295 1992-08-27 1993-08-26 Herstellung von heterodimerem pdgf-ab mit hilfe eines bicistronischen vektorsystems in säugerzellen WO1994005786A1 (de)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/387,845 US5665567A (en) 1992-08-27 1993-08-26 Preparation of heterodimeric PDGF-AB using a bicistronic vector system in mammalian cells
DK93919177T DK0658199T3 (da) 1992-08-27 1993-08-26 Fremstilling af heterodimer PDGF-AB ved hjælp af en bicistronisk vektorsystem i pattedyrceller
EP93919177A EP0658199B1 (de) 1992-08-27 1993-08-26 Herstellung von heterodimerem pdgf-ab mit hilfe eines bicistronischen vektorsystems in säugerzellen
DE59309088T DE59309088D1 (de) 1992-08-27 1993-08-26 Herstellung von heterodimerem pdgf-ab mit hilfe eines bicistronischen vektorsystems in säugerzellen
AU49538/93A AU4953893A (en) 1992-08-27 1993-08-26 Production of heterodimer pdgf-ab by means of a bicistronic vector system in mammalian cells
JP50683294A JP3515111B2 (ja) 1992-08-27 1993-08-26 哺乳動物細胞における複シストロンベクター系を用いるヘテロダイマーｐｄｇｆ−ａｂの調製

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DEP4228457.0 1992-08-27
DE4228457A DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1992-08-27 Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1994005786A1 true WO1994005786A1 (de) 1994-03-17

Family

ID=6466527

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1993/002295 WO1994005786A1 (de) 1992-08-27 1993-08-26 Herstellung von heterodimerem pdgf-ab mit hilfe eines bicistronischen vektorsystems in säugerzellen

Country Status (8)

Country Link
US (2) US5665567A (de)
EP (1) EP0658199B1 (de)
JP (1) JP3515111B2 (de)
AU (1) AU4953893A (de)
DE (2) DE4228457A1 (de)
DK (1) DK0658199T3 (de)
ES (1) ES2124321T3 (de)
WO (1) WO1994005786A1 (de)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996033272A1 (de) * 1995-04-18 1996-10-24 KLINIKUM DER ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITäT FREIBURG Vektoren zur transfektion von eukaryotischen zellen, deren verwendung und damit transfizierte zielzellen
WO1998017814A2 (en) * 1996-10-18 1998-04-30 Valentis Inc. Gene expression and delivery systems and uses
EP0859058A2 (de) * 1997-01-16 1998-08-19 Hoechst Aktiengesellschaft Nukleinsäurekonstrukt zur Expression von durch Proteasen aktivierbare Wirksubstanzen, sowie Herstellung und Verwendung
FR2762615A1 (fr) * 1997-04-28 1998-10-30 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes et vecteur le contenant
WO2001011063A2 (de) * 1999-08-10 2001-02-15 Develogen Ag Für Entwicklungsbiologische Forschung Kombinationsvektoren für den gentransfer, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
WO2002002783A2 (en) * 2000-07-03 2002-01-10 Gala Design, Inc. Expression vectors
US6852510B2 (en) 2000-07-03 2005-02-08 Gala Design Inc Host cells containing multiple integrating vectors
US8222188B2 (en) 2002-03-28 2012-07-17 Catalent Pharma Solutions, Llc Antibody libraries

Families Citing this family (162)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6605712B1 (en) * 1990-12-20 2003-08-12 Arch Development Corporation Gene transcription and ionizing radiation: methods and compositions
DE4228458A1 (de) * 1992-08-27 1994-06-01 Beiersdorf Ag Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung
US6613956B1 (en) * 1996-04-04 2003-09-02 Chiron Corporation PI 3-kinase fusion mutants and uses thereof
US6706687B1 (en) * 1998-11-10 2004-03-16 Ludwig Institute For Cancer Research Platelet-derived growth factor D
BR0010322A (pt) 1999-05-06 2002-04-09 Univ Wake Forest Vetor de expressão, vacina e seu método de uso para eliciar uma resposta imune dirigida contra um antìgeno em um mamìfero
DE60045350D1 (de) 1999-06-01 2011-01-20 Baylor College Medicine Zusammensetzungen und verfahren zur therapeutischen anwendung einer mit dem gen atonal assoziierten sequenz
EP1226273A4 (de) * 1999-10-15 2003-01-02 Mclean Hospital Corp Multimerisierte enhancerdomänen von dhb
US7037715B2 (en) * 1999-10-15 2006-05-02 The Mclean Hospital Multimerized DBH enhancer domains
CZ2003444A3 (cs) * 2000-08-08 2003-10-15 M. G. V. S. Ltd. Konstrukty nukleové kyseliny, vaskulární buňky jimi transformované a farmaceutické prostředky a způsoby používající je k indukci angiogenesy
US7575924B2 (en) 2000-11-13 2009-08-18 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
US20040242523A1 (en) * 2003-03-06 2004-12-02 Ana-Farber Cancer Institue And The Univiersity Of Chicago Chemo-inducible cancer gene therapy
US8034791B2 (en) 2001-04-06 2011-10-11 The University Of Chicago Activation of Egr-1 promoter by DNA damaging chemotherapeutics
ATE541937T1 (de) * 2001-04-06 2012-02-15 Univ Chicago Chemotherapeutische einleitung der egr-1-promoter-aktivität in gentherapie
US7629153B2 (en) * 2001-08-02 2009-12-08 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
WO2003023000A2 (en) * 2001-09-07 2003-03-20 Baylor College Of Medicine Linear dna fragments for gene expression
AU2002343458B2 (en) * 2001-10-02 2008-03-20 Institut Clayton De La Recherche Methods and compositions relating to restricted expression lentiviral vectors and their applications
US7585962B2 (en) 2001-10-19 2009-09-08 The Mclean Hospital Corporation Multimerized enhancer domains for cell-specific expression
AR037038A1 (es) 2001-10-26 2004-10-20 Baylor College Medicine Una composicion y metodo para alterar la masa corporal magra y las propiedades oseas en un sujeto
US7256016B2 (en) * 2001-11-02 2007-08-14 Rice University Recycling system for manipulation of intracellular NADH availability
US20030157641A1 (en) * 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
BR0214869A (pt) 2001-12-11 2005-03-08 Advisys Inc Suplementação mediada por plasmìdeo para tratamento de indivìduos cronicamente doentes
CN100340668C (zh) * 2002-04-26 2007-10-03 国家健康医学研究所 改进的嵌合糖蛋白和假型化慢病毒载体
WO2003093303A1 (en) 2002-05-06 2003-11-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting proteins to deliver therapeutic or diagnostic reagents
US20060099224A1 (en) 2002-08-12 2006-05-11 David Kirn Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
EP1563069B1 (de) * 2002-11-22 2012-06-06 Institut Clayton De La Recherche Zusammensetzungen und systeme zur genregulierung
US7404950B2 (en) 2003-02-18 2008-07-29 Baylor College Of Medicine Induced activation in dendritic cell
CA2557737C (en) 2003-03-12 2014-08-05 Advisys, Inc. Insulin-like growth factor (igf-i) plasmid-mediated supplementation for therapeutic applications
TW200424214A (en) * 2003-04-21 2004-11-16 Advisys Inc Plasmid mediated GHRH supplementation for renal failures
CN1894581B (zh) 2003-07-09 2012-02-01 生命技术公司 检测蛋白-蛋白相互作用的方法
US20070224615A1 (en) * 2003-07-09 2007-09-27 Invitrogen Corporation Methods for assaying protein-protein interactions
WO2005065722A2 (en) 2003-12-31 2005-07-21 Advisys, Inc. Reducing arthritis and lameness in subjects by growth hormone releasing hormone (ghrh) supplementation
US7923251B2 (en) * 2005-02-23 2011-04-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and apparatus for avalanche-mediated transfer of agents into cells
US8101169B2 (en) * 2005-02-23 2012-01-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ocular gene therapy using avalanche-mediated transfection
EP2468768A3 (de) 2005-07-21 2012-10-31 Abbott Laboratories Mehrfache Genexpression mit sORF-Konstrukten und Verfahren mit Polyproteinen, Pro-Proteinen und Proteolyse
US20070026012A1 (en) 2005-08-01 2007-02-01 Cornell Research Foundation, Inc. Compositions and methods for monitoring and altering protein folding and solubility
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
AU2006287441B2 (en) * 2005-09-07 2012-09-06 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using GM-CSF-expressing poxviruses
WO2008019162A2 (en) 2006-01-18 2008-02-14 University Of Chicago Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins
US8481023B2 (en) 2006-09-15 2013-07-09 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
EP2465510B1 (de) * 2006-10-19 2018-11-28 Baylor College Of Medicine Verfahren und Zusammensetzungen zur Erzeugung einer Immunreaktion mittels CD40-Induktion sowie Strukturerkennungsrezeptoren und Adapter davon
KR20080084528A (ko) 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
EP3399025A1 (de) 2007-03-23 2018-11-07 Wisconsin Alumini Research Foundation Neuprogrammierung von körperzellen
BRPI0906429B1 (pt) 2008-01-10 2021-08-03 Research Development Foundation Método de identificação de uma infecção por e. chaffeensis em um indivíduo, uso de um ou mais polipeptídeo sintético e kit
JP2011512877A (ja) * 2008-03-12 2011-04-28 ワイス・エルエルシー 組換えタンパク質の大スケール産生に適した細胞を同定する方法
WO2009126789A2 (en) 2008-04-09 2009-10-15 Maxcyte, Inc. Engineering and delivery of therapeutic compositions of freshly isolated cells
DK2297307T3 (en) 2008-06-04 2016-07-25 Cellular Dynamics Int Inc PROCEDURES FOR THE MANUFACTURE OF IPS CELLS USING NON-VIRAL METHODS
EP3330371A1 (de) * 2008-08-12 2018-06-06 Cellular Dynamics International, Inc. Verfahren zur herstellung von ips-zellen
EP2328603A4 (de) 2008-08-18 2013-01-02 Univ Maryland Apf-derivate und verwendungsverfahren
ES2840750T3 (es) 2008-09-22 2021-07-07 Baylor College Medicine Métodos y composiciones para generar una respuesta inmune induciendo CD40 y adaptadores del receptor de reconocimiento de patrones
US8209867B2 (en) * 2008-10-02 2012-07-03 The Gillette Company Shaving razors and cartridges
US20110262477A1 (en) 2008-10-06 2011-10-27 University Of Chicago Compositions and Methods Related to Bacterial EAP, EMP, and/or ADSA Proteins
AU2010271116B2 (en) 2009-04-03 2015-08-13 University Of Chicago Compositions and methods related to Protein A (SpA) variants
CN102459575A (zh) 2009-06-05 2012-05-16 细胞动力国际有限公司 重编程t细胞和造血细胞的方法
JP5879266B2 (ja) 2009-09-14 2016-03-08 シラジェン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 腫瘍崩壊性ワクシニアウイルスの併用癌療法
IN2012DN03281A (de) * 2009-10-30 2015-10-23 Abbott Lab
BR112012013664B1 (pt) 2009-12-10 2020-11-10 Turnstone Limited Partnership rabdovírus oncolítico
US10080799B2 (en) 2010-02-12 2018-09-25 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods and compositions related to glycoprotein-immunoglobulin fusions
US20130045871A1 (en) 2010-03-18 2013-02-21 Cornell University Engineering correctly folded antibodies using inner membrane display of twin-arginine translocation intermediates
JP2013523818A (ja) 2010-04-05 2013-06-17 ザ・ユニバーシティー・オブ・シカゴ 免疫反応のエンハンサーとしてのプロテインＡ（ＳｐＡ）抗体に関連する組成物および方法
US8785385B2 (en) 2010-04-19 2014-07-22 Research Development Foundation RTEF-1 variants and uses thereof
US9089520B2 (en) 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
CN103003416B (zh) 2010-06-15 2016-11-16 细胞动力学国际有限公司 从小体积的外周血产生诱导性多潜能干细胞
WO2011159797A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 Cellular Dynamics International, Inc. A compendium of ready-built stem cell models for interrogation of biological response
US8821894B2 (en) 2010-07-02 2014-09-02 The University Of Chicago Compositions and methods related to protein A (SpA) variants
JP5897002B2 (ja) 2010-07-07 2016-04-13 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド プログラミングによる内皮細胞の産生
CA2806858C (en) 2010-08-04 2021-06-15 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming immortalized b cells
EP2613791A4 (de) 2010-09-08 2015-05-13 Univ Texas Somatostatin-rezeptor-basierte krebstherapie
EP2614074A1 (de) 2010-09-09 2013-07-17 The University of Chicago Verfahren und zusammensetzungen mit schützenden staphylokokken-antigenen
CA2824277C (en) 2011-01-04 2021-08-31 Jennerex, Inc. Generation of antibodies to tumor antigens and generation of tumor specific complement dependent cytotoxicity by administration of oncolytic vaccinia virus
WO2012098260A1 (en) 2011-01-21 2012-07-26 Axiogenesis Ag A non-viral system for the generation of induced pluripotent stem (ips) cells
EP2673358B1 (de) 2011-02-08 2019-01-09 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Herstellung blutbildender vorläuferzellen durch programmierung
WO2012136653A1 (en) 2011-04-08 2012-10-11 Novvac Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
US8945588B2 (en) 2011-05-06 2015-02-03 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides
CA2872045A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
JP2014520551A (ja) 2011-07-11 2014-08-25 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 細胞のリプログラミング方法およびゲノムの改変方法
WO2013026015A1 (en) 2011-08-18 2013-02-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Muc1 ligand traps for use in treating cancers
EP2766388A1 (de) 2011-10-12 2014-08-20 Møller, Niels Iversen Peptide aus campylobacter jejuni und ihre verwendung bei der impfung
BR112014019049A2 (pt) 2012-02-02 2017-07-04 Univ Texas adenovirus imunogênico
ES2806945T3 (es) 2012-04-26 2021-02-19 Univ Chicago Antígenos de coagulasa estafilocócica y métodos para su uso
EP2846821B1 (de) 2012-05-03 2020-03-11 Indiana University Research&Technology Corporation Hydrodynamische verfahren zur abgabe von flüssigkeiten an nierengewebe und damit zusammenhängende materialien und verfahren
US10125373B2 (en) 2013-01-22 2018-11-13 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
MX2015010783A (es) 2013-02-21 2016-06-21 Children S Hospital Of Eastern Ontario Res Inst Inc Composicion de vacuna.
CN105229144A (zh) 2013-02-22 2016-01-06 细胞动力学国际有限公司 通过组合的遗传工程和化学工程经由正向编程产生肝细胞
US20160010094A1 (en) 2013-03-01 2016-01-14 University Of Pretoria Transgenic cell selection
US9434935B2 (en) 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
JP6541639B2 (ja) 2013-03-14 2019-07-10 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｔ細胞増殖をコントロールするための方法
US20210332093A9 (en) 2013-04-11 2021-10-28 Vanderbilt University Fused in sarcoma (fus) nuclear translocation inhibitors for preventing fibrosis
EP3569253A1 (de) 2013-06-05 2019-11-20 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Verfahren zur induktion von partieller apoptose mithilfe von caspasepolypeptiden
WO2015035395A1 (en) 2013-09-09 2015-03-12 Figene, Llc Gene therapy for the regeneration of chondrocytes or cartilage type cells
CA2929555A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Baylor Research Institute Nuclear localization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure
US20170002064A1 (en) 2013-11-08 2017-01-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Vh4 antibodies against gray matter neuron and astrocyte
US20160289645A1 (en) 2013-11-22 2016-10-06 Dnatrix, Inc. Adenovirus Expressing Immune Cell Stimulatory Receptor Agonist(s)
US20160368952A1 (en) 2013-12-03 2016-12-22 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
JP6908381B2 (ja) 2014-01-29 2021-07-28 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド Ｍｕｃ１−ｃ／細胞外ドメイン（ｍｕｃ１−ｃ／ｅｃｄ）に対する抗体
CA2937750A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for activating t cells using an inducible chimeric polypeptide
US20170044496A1 (en) 2014-04-10 2017-02-16 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Enhanced Expansion of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Adoptive Cell Therapy
WO2015164228A1 (en) 2014-04-21 2015-10-29 Cellular Dynamics International, Inc. Hepatocyte production via forward programming by combined genetic and chemical engineering
AU2015287833B2 (en) 2014-07-08 2018-09-13 The Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating diabetes
WO2016036746A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Costimulation of chimeric antigen receptors by myd88 and cd40 polypeptides
AU2015341481C1 (en) 2014-11-03 2021-09-16 ACADEMISCH ZIEKENHUIS LEIDEN (h.o.d.n. LUMC) T cell receptors directed against Bob1 and uses thereof
US20180169211A1 (en) 2014-11-13 2018-06-21 Evaxion Biotech Aps Peptides derived from acinetobacter baumannii and their use in vaccination
EP3224362A4 (de) 2014-11-26 2018-06-06 The Regents of The University of California Therapeutische zusammensetzungen mit transkriptionsfaktoren sowie verfahren zur herstellung und verwendung davon
CA2966241A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled activation or elimination of therapeutic cells
EP3244918A2 (de) 2015-01-12 2017-11-22 Evaxion Biotech ApS Proteine und nukleinsäuren zur verwendung für impfstoffe gegen klebsiella pneumoniae
US11421229B2 (en) 2015-02-20 2022-08-23 Baylor College Of Medicine p63 inactivation for the treatment of heart failure
CA2978171A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 J.H. Frederik Falkenburg T-cell receptors directed against the preferentially expressed antigen of melanoma and uses thereof
EP3317295B1 (de) 2015-07-04 2022-05-18 Evaxion Biotech A/S Proteine und nukleinsäuren, die in impfstoffen gegen pseudomonas aeruginosa nützlich sind
CA3002157A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for directed differentiation of pluripotent stem cells to immune cells
WO2017075395A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Tumor-specific adenovirus vectors and therapeutic uses
TW202344686A (zh) 2015-10-30 2023-11-16 美國加利福尼亞大學董事會 從幹細胞產生t細胞之方法及使用該t細胞之免疫療法
WO2017079202A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of cd40 activation and immune checkpoint blockade
WO2017079746A2 (en) 2015-11-07 2017-05-11 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer
AU2016354440B2 (en) 2015-11-09 2023-09-28 The Children's Hospital Of Philadelphia Glypican 2 as a cancer marker and therapeutic target
EP3419654B1 (de) 2016-02-22 2022-04-27 Evaxion Biotech A/S In impfstoffen gegen staphylococcus aureus nützliche proteine und nukleinsäuren
CA3019635A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 Baylor Research Institute Angiopoietin-like protein 8 (angptl8)
US10556936B2 (en) 2016-05-27 2020-02-11 Alk Abelló Immunogenic proteins and fragments thereof from allergenic mites
WO2017216384A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 Evaxion Biotech Aps Vaccination targeting ichthyophthirius multifiliis
WO2017220787A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Evaxion Biotech Aps Vaccines against aearomonas salmonicida infection
JP7099967B2 (ja) 2016-07-01 2022-07-12 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 幹細胞由来移植片からの増殖性細胞の排除
EP3487872A1 (de) 2016-07-22 2019-05-29 Evaxion Biotech ApS Chimäre proteine zur immunitätsinduktion gegen infektionen mit s. aureus
WO2018067836A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for directed differentiation of pluripotent stem cells to hla homozygous immune cells
WO2018087720A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 Novartis Ag Compositions, methods, and therapeutic uses related to fusogenic protein minion
US20200009203A1 (en) 2016-12-12 2020-01-09 Multivir Inc. Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases
US11298420B2 (en) 2016-12-21 2022-04-12 Memgen, Llc Armed oncolytic viruses
US20180169271A1 (en) 2016-12-21 2018-06-21 Memgen, Llc Armed replication-competent oncolytic adenoviruses
US11718648B2 (en) 2017-01-05 2023-08-08 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting Pseudomonas aeruginosa
EP3385373A1 (de) 2017-04-05 2018-10-10 Centro de Neurociências e Biologia Celular Zusammensetzungen zur umprogrammierung von zellen in dendritischen zellen oder antigen-präsentierende zellen, verfahren und verwendungen davon
WO2018185709A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Centro De Neurociencias E Biologia Celular Compositions for reprogramming cells into dendritic cells or antigen presenting cells, methods and uses thereof
AU2018254442B2 (en) 2017-04-18 2024-03-28 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Antigen-specific immune effector cells
WO2018208849A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods to augment or alter signal transduction
JP2020530986A (ja) 2017-07-27 2020-11-05 ノバルティス アーゲー シェダーゼ耐性ｔｒｅｍ２変異体
EP3710466A2 (de) 2017-11-13 2020-09-23 The University of Chicago Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von wunden
WO2019145399A1 (en) 2018-01-24 2019-08-01 Evaxion Biotech Aps Vaccines for prophylaxis of s. aureus infections
US20210094991A1 (en) 2018-03-19 2021-04-01 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer
WO2019183500A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Hung Chiung Yu Coccidioides antigens and methods of their use
WO2019211320A1 (en) 2018-05-01 2019-11-07 Orfoneuro Aps Treatment of neuronal ceroid lipofuscinosis
EP3843774A4 (de) 2018-08-30 2022-08-31 Tenaya Therapeutics, Inc. Herzzellenumprogrammierung mit myocardin und ascl1
WO2020083904A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting m. catharrhalis
EP3930687A4 (de) 2019-02-25 2023-06-07 The University of Chicago Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von entzündungs- und autoimmunzuständen mit ecm-affinitätspeptiden, die mit entzündungshemmenden mitteln verbunden sind
US20220143168A1 (en) 2019-02-27 2022-05-12 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting H. influenzae
US20230137971A1 (en) 2019-07-11 2023-05-04 Tenaya Therapeutics Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
JP2022541538A (ja) 2019-07-19 2022-09-26 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア グリピカン２結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体
WO2021048381A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Evaxion Biotech Aps Method for identifying stable mhc binding peptides using mass spectrometry
EP4028763A1 (de) 2019-09-13 2022-07-20 Evaxion Biotech A/S Verfahren zur identifizierung von t-zell-epitopen
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
EP4087593A1 (de) 2020-01-06 2022-11-16 Evaxion Biotech A/S Impfstoffe, die gegen neisseria gonorrhoeae gerichtet sind
AU2021230476A1 (en) 2020-03-02 2022-10-20 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene vector control by cardiomyocyte-expressed microRNAs
WO2021194343A1 (en) 2020-03-25 2021-09-30 Erasmus University Medical Center Rotterdam Reporter system for radionuclide imaging
IL298254A (en) 2020-05-29 2023-01-01 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Double layer of retinal pigment epithelium and photoreceptors and their uses
AU2021280343A1 (en) 2020-05-29 2022-12-08 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Retinal pigmented epithelium and photoreceptor dual cell aggregates and methods of use thereof
CA3192967A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Aiquan CHANG Recombinant adeno-associated virus vectors with cd14 promoter and use thereof
EP4291216A1 (de) 2021-02-09 2023-12-20 University of Houston System Onkolytisches virus zur systemischen abgabe und verbesserten antitumorwirkungen
CA3216719A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods of generating mature corneal endothelial cells
WO2022235869A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods of generating mature hepatocytes
US20220389436A1 (en) 2021-05-26 2022-12-08 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods to prevent rapid silencing of genes in pluripotent stem cells
WO2022248531A1 (en) 2021-05-26 2022-12-01 Evaxion Biotech A/S Vaccination targeting intracellular pathogens
AU2022307747A1 (en) 2021-07-05 2024-01-25 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae
WO2023148398A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Var2 Pharmaceuticals Aps Antibodies and antibody fragments and analogues specific for chondroitin sulfate
WO2023178191A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 University Of Houston System Persistent hsv gene delivery system
WO2023201207A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
WO2023213393A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Evaxion Biotech A/S Staphylococcal protein variants and truncates
US20240003871A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Ipsc-derived astrocytes and methods of use thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0259632A1 (de) * 1986-08-13 1988-03-16 Zymogenetics, Inc. Expression von biologisch-aktiven PDGF-Analogen in eukaryotischen Zellen
WO1990001550A1 (en) * 1988-07-29 1990-02-22 Zymogenetics, Inc. High efficiency translation of polycistronic messages in eucaryotic cells
WO1990008163A1 (de) * 1989-01-12 1990-07-26 Hoppe Juergen Pdgf-a, pdgf-aa, pdgf-ab, herstellungsverfahren und sie enthaltende arzneimittel
WO1993003143A1 (en) * 1991-08-07 1993-02-18 Anderson W French Retroviral vectors containing internal ribosome entry sites

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5165938A (en) * 1984-11-29 1992-11-24 Regents Of The University Of Minnesota Wound healing agents derived from platelets
US5358856A (en) * 1988-01-14 1994-10-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Gene expression in mammalian cells using a cap independent 5' noncoding region
US4902121A (en) * 1988-10-04 1990-02-20 Allergan Humphrey Range detector for eye instrument having interrogating beam
DE3834079A1 (de) * 1988-10-06 1990-04-12 Biotechnolog Forschung Gmbh Wachstumstimulierendes pdgf-bb und dessen verwendung sowie ein verfahren zu seiner herstellung und der des monomeren
US5035887A (en) * 1989-09-07 1991-07-30 Institute Of Moelcular Biology, Inc. Wound healing composition of IL-1 and PDGF or IGF-1
IL96682A0 (en) * 1989-12-15 1991-09-16 Amgen Inc Production of biologically active platelet-derived growth factor from high expression host cell systems
US5149691A (en) * 1991-03-12 1992-09-22 Creative Biomolecules, Inc. Issue repair and regeneration through the use of platelet derived growth factor (pdgf) in combination with dexamethasone

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0259632A1 (de) * 1986-08-13 1988-03-16 Zymogenetics, Inc. Expression von biologisch-aktiven PDGF-Analogen in eukaryotischen Zellen
WO1990001550A1 (en) * 1988-07-29 1990-02-22 Zymogenetics, Inc. High efficiency translation of polycistronic messages in eucaryotic cells
WO1990008163A1 (de) * 1989-01-12 1990-07-26 Hoppe Juergen Pdgf-a, pdgf-aa, pdgf-ab, herstellungsverfahren und sie enthaltende arzneimittel
WO1993003143A1 (en) * 1991-08-07 1993-02-18 Anderson W French Retroviral vectors containing internal ribosome entry sites

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. OSTMAN ET AL.: "Synthesis and assembly of a functionally active recombinant platelet-derived growth factor AB heterodimer", J. BIOL. CHEM., vol. 263, no. 31, 5 November 1988 (1988-11-05), AM. SOC. MOL. BIOL., INC.,BALTIMORE, US;, pages 16202 - 16208 *
W. EICHNER ET AL.: "Large-scale preparation of recombinant paltelet-derived growth factor AA secreted from recombinant baby hamster kidney cells", EUR. J. BIOCHEM., vol. 185, no. 1, October 1989 (1989-10-01), SPRINGER VERLAG, BERLIN, BRD;, pages 135 - 140 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996033272A1 (de) * 1995-04-18 1996-10-24 KLINIKUM DER ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITäT FREIBURG Vektoren zur transfektion von eukaryotischen zellen, deren verwendung und damit transfizierte zielzellen
WO1998017814A2 (en) * 1996-10-18 1998-04-30 Valentis Inc. Gene expression and delivery systems and uses
WO1998017814A3 (en) * 1996-10-18 1998-08-27 Genemedicine Inc Gene expression and delivery systems and uses
EP0859058A3 (de) * 1997-01-16 2003-05-28 Aventis Pharma Deutschland GmbH Nukleinsäurekonstrukt zur Expression von durch Proteasen aktivierbare Wirksubstanzen, sowie Herstellung und Verwendung
EP0859058A2 (de) * 1997-01-16 1998-08-19 Hoechst Aktiengesellschaft Nukleinsäurekonstrukt zur Expression von durch Proteasen aktivierbare Wirksubstanzen, sowie Herstellung und Verwendung
KR19980070549A (ko) * 1997-01-16 1998-10-26 야코비, 피셔 프로테아제에 의해 활성화될 수 있는 활성 물질을 발현시키기위한 핵산 작제물, 및 이의 제조 방법 및 용도
US6783977B1 (en) 1997-04-28 2004-08-31 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Internal ribosome entry site and vector containing same
WO1998049334A1 (fr) * 1997-04-28 1998-11-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Nouveau site interne d'entree des ribosomes et vecteur le contenant
FR2762615A1 (fr) * 1997-04-28 1998-10-30 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes et vecteur le contenant
WO2001011063A2 (de) * 1999-08-10 2001-02-15 Develogen Ag Für Entwicklungsbiologische Forschung Kombinationsvektoren für den gentransfer, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
WO2001011063A3 (de) * 1999-08-10 2001-11-22 Develogen Ag Kombinationsvektoren für den gentransfer, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
WO2002002783A2 (en) * 2000-07-03 2002-01-10 Gala Design, Inc. Expression vectors
WO2002002783A3 (en) * 2000-07-03 2003-01-16 Gala Design Inc Expression vectors
US6852510B2 (en) 2000-07-03 2005-02-08 Gala Design Inc Host cells containing multiple integrating vectors
AU2001270252B2 (en) * 2000-07-03 2007-02-08 Catalent Pharma Solutions, Llc Expression vectors
US7378273B2 (en) 2000-07-03 2008-05-27 Gala Design, Inc. Expression vectors
US8222188B2 (en) 2002-03-28 2012-07-17 Catalent Pharma Solutions, Llc Antibody libraries

Also Published As

Publication number Publication date
JP3515111B2 (ja) 2004-04-05
AU4953893A (en) 1994-03-29
DE4228457A1 (de) 1994-04-28
DE59309088D1 (de) 1998-11-26
DK0658199T3 (da) 1999-06-28
US5665567A (en) 1997-09-09
ES2124321T3 (es) 1999-02-01
US5935819A (en) 1999-08-10
EP0658199B1 (de) 1998-10-21
EP0658199A1 (de) 1995-06-21
JPH08502884A (ja) 1996-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0658199B1 (de) Herstellung von heterodimerem pdgf-ab mit hilfe eines bicistronischen vektorsystems in säugerzellen
EP0658198B1 (de) Multicistronische expressionseinheiten und deren verwendung
EP0409113B1 (de) Muteine des menschlichen Erythropoetins, ihre Herstellung und ihre Verwendung
DE69032600T3 (de) Rekombinanter abkömmling des menschlichen faktors iii
EP0986644B1 (de) Herstellung von erythropoietin durch endogene genaktivierung mit viralen promotoren
CH681080A5 (de)
DE3720246A1 (de) Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
EP0711835A1 (de) Selektion und Expression von Fremdproteinen mittels eines Selektions-Amplifikations-Systems
DE602005003369T2 (de) Neue sequenz um die expression einer nukleinsäure zu erhöhen
AT389892B (de) Dna-sequenz mit einem gen, das fuer human-interleukin-2 codiert
WO1992001716A1 (en) Protease resistant pdgf and methods of use
WO1996033272A1 (de) Vektoren zur transfektion von eukaryotischen zellen, deren verwendung und damit transfizierte zielzellen
EP0701616B1 (de) Multicistronische expression rekombinanter gene in bakterienzellen
CH681081A5 (de)
EP0289936B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen in Streptomyceten
WO1990008163A1 (de) Pdgf-a, pdgf-aa, pdgf-ab, herstellungsverfahren und sie enthaltende arzneimittel
DE3833897A1 (de) Klonierung und expression des transforming growth faktor-(beta)2
EP1068237A1 (de) T-zellrezeptor-expressionskassette
DD257271A1 (de) Verfahren zur herstellung von menschlichem wachstumshormon (somatotropin)
Streuli et al. STRUCTURE AND EXPRESSION OF HUMAN ALPHA—INTERFERON GENES
DD296691A5 (de) Verfahren zur herstellung von antikoerpern gegen ein epitop von amphiregulin
DD251788A5 (de) Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons
DE4021917A1 (de) Glykosyliertes ifnalpha

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BR CA HU JP KZ PL RU US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1993919177

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08387845

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1993919177

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1993919177

Country of ref document: EP