WO1996012030A1 - Adenovirus defectifs comprenant un gene therapeutique et un gene immunoprotecteur - Google Patents

Adenovirus defectifs comprenant un gene therapeutique et un gene immunoprotecteur Download PDF

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WO1996012030A1
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adenovirus
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recombinant
genes
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Martin Lee
Michel Perricaudet
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Rhone-Poulenc Rorer S.A.
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    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to new viral vectors, their preparation and their use in gene therapy. It also relates to pharmaceutical compositions containing said viral vectors. More particularly, the present invention relates to recombinant adenoviruses as vectors for gene therapy.
  • Gene therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) by introducing genetic information into the affected cell or organ.
  • This genetic information can be introduced either in vitro into a cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the organism, or directly in vivo into the appropriate tissue.
  • different techniques exist, among which various transfection techniques involving complexes of DNA and DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol.
  • viruses as vectors for gene transfer has emerged as a promising alternative to these physical transfection techniques.
  • retroviruses RSV, HMS, MMS, etc.
  • the HSV virus adeno-associated viruses
  • adenoviruses adenoviruses
  • adenoviruses have certain properties of interest for use in gene therapy. In particular, they have a fairly broad host spectrum, are capable of infecting quiescent cells and do not integrate into the genome of the infected cell.
  • Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses approximately 36 kb in size. Their genome includes in particular an inverted -repeated sequence (ITR) at their end, an encapsulation sequence, early genes and late genes (see FIG. 1).
  • the main early genes are the El (El a and Elb), E2, E3 and E4 genes.
  • the main late genes are the L1 to L5 genes.
  • adenoviruses Given the properties of the adenoviruses mentioned above, these have already been used for gene transfer in vivo. To this end, different vectors derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different genes (B-gal, OTC, ⁇ -1AT, cytokines, etc.). In each of these constructs, the adenovirus was modified from so as to make it incapable of replication in the infected cell.
  • the constructs described in the prior art are adenoviruses deleted from the El (Ela and / or Elb) and possibly E3 regions into which a heterologous DNA sequence is inserted (Levrero et al. Gene 101 (1991) 195 ; Gosh-Choudhury et al.,
  • the present invention indeed relates to new vectors derived from adenoviruses having a very reduced or even suppressed immunogenicity. Vectors of the invention are therefore particularly suitable for gene therapy applications, in particular in humans.
  • a first object of the present invention relates to a defective adenovirus, the genome of which comprises a first recombinant DNA containing a therapeutic gene and a second recombinant DNA containing a immunoprotective gene.
  • the present invention stems in part from the demonstration that it is possible to incorporate several genes of interest into adenoviruses, and to obtain a significant expression of these different genes in the infected cells.
  • the present invention also stems from the construction of adenoviral vectors capable of incorporating several therapeutic genes under conditions allowing their optimal expression. It also follows from the demonstration that the co-expression, in the infected cell, of certain genes is capable of inducing an immunoprotective effect and thus of escaping the vectors of the invention and / or the infected cells from the immune system. .
  • the present invention thus provides viral vectors having immunological and therapeutic properties which are entirely advantageous with a view to their use in gene or cell therapy.
  • the recombinant DNAs according to the present invention are DNA fragments containing the gene under consideration (therapeutic or immunoprotective) and optionally signals allowing its expression, constructed in vitro and then inserted into the genome of the adenovirus.
  • the recombinant DNAs used in the context of the present invention may be complementary DNAs (cDNAs), genomic DNAs (gDNAs), or hybrid constructs consisting for example of a cDNA in which one or more introns would be inserted. They can also be synthetic or semi-synthetic sequences. These DNAs can be of human, animal, plant, bacterial, viral, etc. origin. Particularly advantageously, cDNAs or gDNAs are used.
  • the insertion of the genes considered in the form of recombinant DNAs according to the invention offers greater flexibility in the construction of adenoviruses, and allows better control of the expression of said genes.
  • the recombinant DNAs (and therefore the two genes of interest) incorporated into the adenoviral vectors according to the present invention can be arranged in different ways. - _ They can firstly be inserted at the same site of the adenovirus genome, or at different, selected sites. In particular, the recombinant DNAs can be inserted at least in part at the level of the E1, E3 and / or E4 regions of the adenovirus genome, as a replacement or in addition to viral sequences.
  • This configuration makes it possible to obtain higher levels of expression, and offers better control of the expression of genes.
  • the two genes can be inserted in the same orientation or in the opposite orientations.
  • the two recombinant DNAs are designed 'gus and positioned such that the two genes are under the control of a single promoter and give rise to a single premessenger RNA. This arrangement is advantageous since it allows the use of a single transcriptional promoter.
  • recombinant DNAs makes it possible to use transcriptional promoters of different nature, and in particular strong or weak, regulated or constitutive promoters, tissue-specific or ubiquitous, etc.
  • the choice of expression signals and of the respective position of the recombinant DNAs is particularly important for obtaining a high expression of the therapeutic gene and a significant immunoprotective effect.
  • a therapeutic gene which can be used for the construction of the vectors of the present invention, mention may be made of any gene coding for a product having a therapeutic effect.
  • the product thus coded can be a protein, a peptide, an RNA, etc.
  • a protein product Being a protein product, it can be homologous with respect to the target cell (that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology).
  • the expression of a protein makes it possible for example to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein.
  • the therapeutic gene can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, modified activity, etc.
  • the protein product can also be heterologous towards the target cell.
  • an expressed protein can for example supplement or provide a deficient activity in the cell, allowing it to fight against a pathology, or stimulate an immune response.
  • therapeutic protein products within the meaning of the present invention, there may be mentioned more particularly enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, etc. (FR 9203120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotrophin, etc; apolipoproteins: ApoAI, ApoATV, ApoE, etc.
  • enzymes blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, etc. (FR 9203120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotrophin, etc; apolipoproteins
  • FR 93 05125 dystrophin or a minidystrophin
  • FR 9111947 the CFTR protein associated with cystic fibrosis
  • tumor suppressor genes p53, Rb, RaplA, DCC, k- rev, etc.
  • FR 93 04745 the genes coding for factors involved in coagulation: Factors VII, VTJJ, TX, the genes involved in DNA repair, etc.
  • the therapeutic gene can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs.
  • Such sequences may, for example, be transcribed in the target cell ⁇ in complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in Patent EP 140 308.
  • Antisense sequences also include encoding ribozymes, which are capable of selectively destroying target RNAs (EP 321,201).
  • the therapeutic gene can also include one or more genes coding for an antigenic peptide, capable of generating in humans or animals an immune response.
  • the invention therefore makes it possible to produce either vaccines or immunotherapeutic treatments applied to humans or animals, in particular against microorganisms, viruses or cancers.
  • These may in particular be antigenic peptides specific for the Barrstein virus, the HV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, or even specific for tumors (EP 259 212) .
  • no immune response will be generated against the vector virus or the infected cell, but the selected antigen will be produced and only capable of being immunogenic.
  • the therapeutic genes can be of human, animal, plant, bacterial, viral, etc. origin. They can be obtained by any known technique of those skilled in the art, and in particular by screening of banks, by chemical synthesis, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of banks.
  • the immunoprotective gene used in the context of the present invention can be of different types. More preferably, the Applicant has now shown that the use of a gene whose product acts on the activity of the major histocompatibility complex (MHC) or on the activity of cytokines makes it possible to considerably reduce or even suppress any reaction. immune to the infected vector or cells.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the vectors thus obtained are particularly advantageous since they have a much longer duration of action in vivo and therefore a greater therapeutic effect, that they have no inflammatory and immunogenic effect, and that they can be used with a reduced number of injections
  • the antigen presenting cells display antigenic pepudes on their surface, in association with molecules of the major histocompatibility class I complex (MHC-I).
  • MHC-I major histocompatibility class I complex
  • CTL cytotoxic T cell receptors
  • the Applicant has now shown that it is possible to co-express in a adenoviral vector a therapeutic gene and a gene capable of altering the expression of MHC-I molecules, and that this co-expression produces a lasting therapeutic effect. immune or inflammatory.
  • genes whose product acts on the activity of the major histocompability complex it is preferred to use, within the framework of the invention, genes whose product at least partially inhibits the expression of MHC proteins or the antigen presentation.
  • genes whose product at least partially inhibits the expression of MHC proteins or the antigen presentation are preferred examples.
  • the E3 region of the adenovirus genome contains different reading phases which, by alternative splicing, give rise to different proteins.
  • the protein Gpl9k (or E3-19k) is a glycosylated transmembrane protein located in the membrane of the endoplasmic reticulum (ER).
  • This protein includes a luminal domain that binds MHC-I molecules and a C-terminal cytoplasmic end capable of binding microtubules (or tubulin), which acts to anchor the gpl9k protein in the ER membrane.
  • G ⁇ l9k is thus capable prevent the expression of MHC-I molecules on the surface of cells by interaction and sequestration at the ER level.
  • the gpl9k protein is weakly expressed by adenoviruses.
  • the native promoter indeed contains certain regulatory elements such as binding elements of the NF-kB type which limit the conditions for expression of this protein.
  • the expression of gpl9k is also conditioned on the realization of an alternative splicing.
  • the introduction into the vectors of the invention of a recombinant DNA containing a sequence (preferably cDNA) coding for gpl9k makes it possible to control and optimize the expression of said protein.
  • the use of constitutive promoters and the suppression of the other reading phases makes it possible to greatly increase the expression of this protein and to overcome the dependence on viral replication and the presence of inducing elements.
  • the examples of the present application describe in particular the construction of a defective adenovirus carrying a recombinant DNA comprising a marker gene under the control of the RSV promoter and a second recombinant DNA carrying a sequence coding for the gpl9k protein under the control of the constitutive promoter RSV (Ad- ⁇ gal-gpl9k).
  • the results presented demonstrate that cells infected with this vector express ⁇ -galactosidase at levels as high as cells infected with an adenovirus containing only the £ - gay gene.
  • the presence of the second recombinant DNA does not affect the expression levels of the first.
  • the results presented show that the cells infected with the adenovirus Ad- ⁇ gal-gpl9k are protected against lysis by CTLs, which is not the case for cells infected with an adenovirus Ad- ⁇ gal.
  • the presence of the second recombinant DNA in the vectors of the invention inhibits the clonal expansion of lymphocytes directed against the infected cells.
  • the vectors of the invention therefore induce a significant reduction in the immune response by the CTLs against the infected cells.
  • proteins encoded by the E3 region of the adenovirus genome such as the 10.4k and 14.5k proteins have certain properties of interest with a view to their incorporation into the vectors of the invention.
  • the ICP47 gene of the herpes simplex virus constitutes another immunoprotective gene which is particularly advantageous within the meaning of the present invention.
  • the Herpes simplex virus infected cells exhibit resistance to CTL-induced lysis. It has been shown that this resistance can be conferred by the ICP47 gene, which is capable of reducing the expression of MHC-I molecules on the surface of cells.
  • the incorporation of the ICP47 gene into a recombinant DNA according to the invention also allows the recombinant viruses of the invention to escape the immune system.
  • the UL18 gene of cytomegalovirus constitutes another preferred example of an immunoprotective gene according to the invention.
  • the UL18 gene product is capable of binding ⁇ 2-microglobulin (Bro ne et al. Nature 347 (1990) 770).
  • ⁇ 2-microglobulin is one of the chains of MHC-I molecules.
  • the incorporation of the UL18 gene into a recombinant DNA according to the invention thus makes it possible to reduce the number of functional molecules of B2-microglobulin in the cells infected with the viruses of the invention, and therefore to decrease the capacities of these cells to produce complete and functional MHC-I molecules. This type of construction therefore makes it possible to protect the infected cells from lysis by the CTLs.
  • the immunoprotective gene used in the context of the present invention is, in another preferred embodiment, a gene whose product acts on the activity or signaling pathways of cytokines.
  • Cytokines are a family of secreted proteins that act as signaling molecules for the immune system. They can attract cells of immunity, activate them, induce their proliferation and even act directly on infected cells to kill them.
  • genes whose product acts on the activity or signaling pathways of cytokines mention may be made of the genes involved in the synthesis of cytokines, or whose product is capable of sequestering cytokines, of antagonizing their activity or of interfere with intercellular signaling pathways.
  • the vaccinia virus B15R gene codes for a soluble protein capable of binding interleukin-l ⁇ (the secreted form of interleukin-1), and thus preventing this cytokine from binding to its cellular receptors.
  • Interleukin-1 is indeed one of the first cytokines produced in response to antigenic attack, and it plays a very important role in signaling the immune system at the onset of infection.
  • the possibility of incorporating the B15R gene into a vector according to the invention advantageously makes it possible to reduce the activity of lTL-lfl, in particular on the activation of immune cells, and thereby locally protect cells infected with viruses from the invention against an important immune response. Genes homologous to the B15R gene can also be used, such as the co pox virus gene.
  • the vaccinia virus B18R gene codes for a protein homologous to the interleukin-6 receptor.
  • This gene, or any functional homolog can also be used in the vectors of the invention to inhibit the binding of interleukin-6 to its cellular receptor and thus locally reduce the immune response.
  • the crmB gene of the cowpox virus can be advantageously used.
  • This gene in fact codes for a secreted protein capable of binding TNF and of competing with TNF receptors on the surface of cells. This gene therefore makes it possible, in the viruses of the invention, to locally decrease the concentration of active TNF capable of destroying the infected cells.
  • Other genes encoding proteins capable of binding TNF and at least partially inhibiting its binding to its receptors can also be used.
  • the cowpox virus crmA gene codes for a protein having a spermine-like protease inhibitor activity, which is capable of inhibiting the synthesis of interleukin-1 ⁇ .
  • the Epstein Barr virus BCRF1 gene codes for an interleukin 10 analogue.
  • the product of this gene is a cytokine capable of reducing the immune response and changing its specificity, while inducing the proliferation of B lymphocytes.
  • the cytomegalovirus US28 gene codes for a protein homologous to the receptor for the inflammatory protein of macrophages la (MlP-la). This protein is therefore capable of acting as a competitor for MIP receptors, and therefore of inhibiting its activity locally
  • the product of the E3-14.7, E3-10.4 and E3-14.5 genes of the adenovirus is capable of blocking the transmission of the intercellular signal mediated by certain cytokines.
  • cytokines When cytokines bind to their receptor on the surface of an infected cell, a signal is transmitted to the nucleus to induce cell death or stop protein synthesis. This is particularly the case with tumor necrosis factor (TNF).
  • TNF tumor necrosis factor
  • Local and transient inhibition can be particularly advantageous. This can be obtained in particular by the choice of particular expression signals (cytokine-dependent promoters for example) as indicated below.
  • genes which are homologous or have similar functional properties can be used for the construction of the vectors of the invention.
  • These different genes can be obtained by any technique known to those skilled in the art, and in particular by screening of banks, by chemical synthesis, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of banks.
  • these different genes can be used alone or in combination (s).
  • One of the other important aspects of the present invention concerns the choice of transcriptional promoters used to direct the expression of genes. As indicated above, it may be particularly important to use a promoter capable of constitutively expressing the gene placed under its control. This is the case, for example, of the gpl9k gene or of a homolog, if it is desired to obtain significant immunoprotection. On the other hand, to control the expression of an immunoprotective gene acting on the activity of cytokines, regulated expression may be desirable. With regard to the expression of the therapeutic gene, the choice of expression signals depends on the nature of the therapeutic product, the pathology concerned and the tissue targeted.
  • the promoters which can be used for the construction of the recombinant DNAs of the invention can be the promoters which are naturally responsible for the expression of the therapeutic or immunoprotective gene considered when these are capable of functioning in the infected cell. However, they are preferably sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic), in particular for controlling the expression of the immunoprotective gene.
  • they may be gene promoter sequences eukaryotic or viral.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus, including the adenovirus used.
  • promoters of the E1A, MLP, CMV, RSV, etc. genes can be modified by adding activation, regulation sequences or allowing tissue-specific expression.
  • recombinant DNA when it does not contain expression sequences, it can be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence.
  • a preferred promoter for the production of the vectors of the invention consists of the LTR of the roux sarcoma virus (LTR-RSV). This promoter being constitutive and strong, makes it possible to induce an immunoprotection by important gpl9k.
  • Mammalian promoters may also be of great interest, such as the promoter of the PGK genes, albumin, etc. It may be particularly advantageous to use regulated or tissue-specific promoters so as to be able to target the synthesis of therapeutic and / or immunoprotective products. In particular, for the expression of an immunoprotective gene inhibiting the activity of cytokines, it may be particularly advantageous to use an inducible promoter to obtain a localized effect. Inducible promoters are, for example, promoters induced by cytokines, so that the immunoprotective effect occurs only in response to an immune reaction.
  • the recombinant DNA may also include a signal sequence directing the product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence can be the natural signal sequence of the gene considered (therapeutic or immunoprotective) if appropriate, but it can also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • the vectors of the invention can first of all contain the two genes in the form of a single transcriptional entity.
  • the two recombinant DNAs are contiguous, arranged in such a way that the two genes are under the control of a single promoter, and give rise to a single premessenger RNA.
  • This configuration is interesting since it allows the use of a single transcriptional promoter to regulate the expression of the 2 genes.
  • this unique transcriptional entity can be incorporated into the adenoviral vector in the two possible orientations.
  • the two recombinant DNAs contain their own transcriptional promoter. This configuration makes it possible to obtain higher levels of expression, and offers better control of gene expression.
  • the two recombinant DNAs can be inserted in the same orientation or in the opposite orientations, in the same site of the genome of the adenovirus or in different sites.
  • the recombinant DNAs are inserted, at least in part, at the level of the El, E3 or E4 regions of the adenovirus genome.
  • the regions E1 and E3 or E1 and E4 are used.
  • the recombinant DNAs are inserted to replace viral sequences.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention consists of a defective adenovirus comprising a first recombinant DNA containing a therapeutic gene and a second recombinant DNA containing an immunoprotective gene, in which the two recombinant DNAs are inserted at the region El.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention consists of a defective adenovirus comprising a first recombinant DNA containing a therapeutic gene, inserted at the level of the E1 region, and a second recombinant DNA containing a immunoprotective gene, inserted at the level of the E3 region.
  • the adenoviruses of the present invention are defective, that is to say that they are unable to replicate autonomously in the target cell.
  • the genome of the defective adenoviruses according to the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by therapeutic genes.
  • the defective nature of the adenoviruses of the invention is an important element, since it ensures the non-dissemination of the vectors of the invention after administration.
  • the adenoviruses of the invention comprise the ITR sequences and a sequence allowing the encapsidation, and have a deletion of all or part of the E1 gene.
  • the inverted repeat sequences constitute the origin of replication of adenoviruses. They are located at the 3 ′ and 5 ′ ends of the viral genome (cf. FIG. 1), from which they can be easily isolated according to the conventional techniques of molecular biology known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequence of the ITR sequences of human adenoviruses (in particular the Ad2 and Ad5 serotypes) is described in the literature, as well as canine adenoviruses (in particular CAV1 and CAV2).
  • the left ITR sequence corresponds to the region comprising nucleotides 1 to 103 of the genome.
  • the packaging sequence (also called Psi sequence) is necessary for the packaging of viral DNA. This region must therefore be present to allow the preparation of defective recombinant adenovims according to the invention.
  • the packaging sequence is located in the genome of the adenoviruses, between the left ITTR (5 ′) and the El gene (see FIG. 1). It can be isolated or artificially synthesized by conventional molecular biology techniques.
  • the nucleotide sequence of the packaging sequence of human adenoviruses (in particular serotypes Ad2 and Ad5) is described in the literature, as well as canine adenoviruses (in particular CAV1 and CAV2).
  • the packaging sequence corresponds to the region comprising nucleotides 194 to 358 of the genome.
  • the adenoviruses of the invention comprise the ITR sequences and a sequence allowing the packaging, and have a deletion of all or part of the E1 and E4 genes.
  • the genome of the adenoviruses according to the invention is deleted from all or part of the El, E3 and E4 genes, and, even more preferably, from all or part of the El, E3, L5 and E4 genes.
  • the adenoviruses of the invention can be prepared from adenoviruses of various origins. There are in fact different serotypes of adenoviruses, the structure and properties of which vary somewhat, but which have a comparable genetic organization. Thus, the lessons described in the present application can be easily reproduced by a person skilled in the art for any type of adenovirus. More particularly, the adenoviruses of the invention can be of human, animal, or mixed (human and animal) origin.
  • adenoviruses of human origin it is preferred to use those classified in group C. More preferably, among the various serotypes of human adenovirus, it is preferred to use, within the framework of the present invention, adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5).
  • the adenoviruses of the invention can also be of animal origin, or contain sequences derived from adenoviruses of animal origin.
  • the Applicant has indeed shown that adenoviruses of animal origin are capable of infecting human cells with great efficiency, and that they are unable to propagate in the human cells in which they have been tested (see request FR 93 05954).
  • the Applicant has also shown that adenoviruses of animal origin are in no way trans-complemented by adenoviruses of human origin, which eliminates any risk of recombination and of propagation in vivo, in the presence of a human adenovirus, which can lead to the formation of an infectious particle.
  • the use of adenoviruses or adenovirus regions of animal origin is therefore particularly advantageous since the risks inherent in the use of viruses as vectors in gene therapy are even lower.
  • the adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention can be of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, avian or else simienne (example: after-sales service).
  • serotypes 1 to 10 accessible to ATCC such as for example the strains Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR- 827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-ll (ATCC VR-921) or the strains referenced ATCC VR- 831 to 835.
  • ATCC VR-432 the strains Phelps
  • Fontes ATCC VR-280
  • P7-A ATCC VR- 827
  • IBH-2A ATCC VR-828
  • J2-A ATCC VR-829
  • T8-A ATCC VR-830
  • K-ll ATCC VR-921
  • the bovine adenoviruses it is possible to use the various known serotypes, and in particular those available at ATCC (types 1 to 8) under the references ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 and 769.
  • murine adenoviruses FL (ATCC VR-550) and E203 ⁇ 8 (ATCC VR-528), the sheep adenovirus type 5 (ATCC VR-1343), or type 6 (ATCC VR-1340); porcine adenovirus 5359), or simian adenoviruses such as in particular adenoviruses referenced in the ATCC under the numbers VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.
  • adenoviruses or regions of adenoviruses of origin are used in the context of the invention.
  • canine and in particular all the strains of the CAV2 adenoviruses (Manhattan or A26 / 61 strain (ATCC VR-800) for example).
  • Canine adenoviruses have been the subject of numerous structural studies. Thus, complete restriction maps of the CAV1 and CAV2 adenoviruses have been described in the prior art (Spibey et al., J. Gen. Virol.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared in different ways.
  • a first method consists in transfecting the DNA of the defective recombinant virus prepared in vitro (either by ligation or in the form of a plasmid) in a competent cell line, that is to say carrying in trans all the functions necessary for complementation of the defective virus. These functions are preferably integrated into the genome of the cell, which makes it possible to avoid the risks of recombination, and confers increased stability on the cell line.
  • a second approach consists in co-transfecting into a suitable cell line the DNA of the defective recombinant virus prepared in vitro (either by ligation or in the form of a plasmid) and the DNA of a helper virus.
  • a competent cell line capable of complementing all the defective functions of the recombinant adenovirus. Part of these functions is indeed complemented by the helper virus.
  • This helper virus must itself be defective and the cell line carries in trans the functions necessary for its complementation.
  • the human embryonic kidney line 293, KB cells, Hela cells, MDCK, GHK, etc. there may be mentioned in particular the human embryonic kidney line 293, KB cells, Hela cells, MDCK, GHK, etc. (cf. examples).
  • the vectors which have multiplied are recovered, purified and amplified according to conventional techniques of molecular biology.
  • the vectors of the invention advantageously have a deletion of all or part of certain viral genes, in particular the El, E3, E4 and / or L5 genes.
  • This deletion can correspond to any type of deletion affecting the gene considered. It may especially be the deletion of all or part of the coding region of said gene, and / or of all or part of the promoter region of the transcription of said gene.
  • Deletion is generally carried out on the DNA of the defective recombinant virus, for example by digestion using appropriate restriction enzymes, then ligation, according to molecular biology techniques, as illustrated in the examples.
  • the recombinant DNAs can then be inserted into this DNA by enzymatic cleavage then ligation, at the level of the selected regions and in the chosen orientation.
  • the DNA thus obtained which therefore carries the appropriate deletions and the two reoombinating DNAs, makes it possible to directly generate the defective recombinant adenovirus carrying said deletions and recombinant DNAs.
  • This first variant is particularly suited to the production of recombinant adenoviruses in which the genes are arranged in the form of a single transcriptional unit or, under the control of separate promoters but inserted at the same site of the genome.
  • the DNA of a first recombinant virus carrying the appropriate deletions (or a part of said deletions) and one of the recombinant DNAs is constructed, by ligation or in the form of a plasmid.
  • This DNA is then used to generate a first recombinant virus carrying said deletions and a recombinant DNA
  • the DNA of this first virus is then isolated and co-transfected with a second plasmid or the DNA of a defective second recombinant virus carrying the second Recombinant DNA, appropriate deletions
  • This second step thus generates the defective recombinant virus carrying the two recombinant DNAs.
  • This preparation variant is particularly suitable for the preparation of recombinant viruses carrying two recombinant DNAs inserted in two different regions of the genome of the adenovirus.
  • the present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising one or more defective adenoviruses as described above.
  • the pharmaceutical compositions of the invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation
  • n may in particular be saline solutions (monosodium phosphate, disodium, chloride of sodium, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition according to the case of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutions.
  • the doses of virus used for the injection can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 14 pfu / ml, and preferably 10 6 to 10 10 pfu / ml.
  • the term pfu (“plaque fcrming unit”) corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 5 days, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the adenoviruses of the invention can be used for the treatment or prevention of many pathologies.
  • the adenoviruses of the invention can be used in particular for the treatment or prevention of genetic diseases (dystrophy, cystic fibrosis, etc.), neurodegenerative diseases (alzheimer, parkinson, ALS, etc.), hyperproliferative pathologies (cancers, restenosis, etc.), pathologies linked to coagulation disorders or dyslipoproteinemias, pathologies linked to viral infections (hepatitis, AIDS, etc.), etc.
  • Figure 1 Genetic organization of the Ad5 adenovirus. The complete sequence of Ad5 is available on the database and allows those skilled in the art to select or create any restriction site, and thus to isolate any region of the genome.
  • Figure 2 Restriction map of the CAV2 adenovirus strain Manhattan (after Spibey et al above).
  • Figure 3 Construction of the vector pAD5-gpl9k- ⁇ gal.
  • Figure 4 Construction of the adenovirus Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El, ⁇ E3.
  • the pBR322, pUC and phage plasmids of the M13 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations.
  • the filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease SI.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 . (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham. Cell lines used
  • - Human cell line KB From a human epidermal carcinoma, this line is accessible to the ATCC (ref. CCL17) as well as the conditions allowing its culture.
  • - Human cell line Hela From a carcinoma of the human epithelium, this line is accessible to the ATCC (ref. CCL2) as well as the conditions allowing its culture.
  • MDCK canine cell line The culture conditions of MDCK cells have been described in particular by Macatney et al., Science 44 (1988) 9. - gm DBP6 cell line (Brough et al., Virology 190 (1992) 624) .
  • This line consists of Hela cells carrying the E2 gene of adenovirus under the control of the LTR of MMTV.
  • Example 1 Construction of defective recombinant adenoviruses comprising a therapeutic gene 0e LacZ gene of E. coli) under the control of the RSV LTR promoter and the gpl9k gene under the control of the RSV LTR promoter, both inserted at the level of the El region.
  • adenoviruses were constructed by homologous recombination between a plasmid carrying the left part of the adenovirus Ad5, the two recombinant DNAs and a region of the adenovirus Ad5 (corresponding to protein IX) and the DNA of a defective adenovirus carrying different deletions.
  • the plasmid ⁇ AD5-gpl9k- ⁇ gal contains a cDNA sequence coding for the protein gpl9k of adenovirus. This plasmid was constructed as follows. The Shard
  • Xbal of the genome of the wild-type Ad5 adenovirus containing the E3 region has been isolated and cloned at the corresponding site of the plasmid pGEM (Promega) to generate the plasmid pGEM-E3.
  • the Hinfl fragment containing the coding sequence of gpl9k was then isolated from the plasmid pGEM-E3. The ends of this fragment were made blunt by the action of the Klenow fragment of DNA polymerase I of E. coli (cf. general molecular biology techniques), then the fragment obtained was cloned at the SmaI site of the plasmid pGEMzf + (Promega).
  • the plasmid obtained was designated pGEM-gpl9k ( Figure 3).
  • This example describes the construction of a plasmid containing one of the two recombinant DNAs comprising their own promoter, the left part of the adenovirus genome and an additional part (pIX protein) allowing homologous recombination.
  • This vector was constructed from the plasmid pAd.RSV ⁇ Gal as follows
  • the plasmid pA RSV ⁇ Gal contains, in the 5 '-> 3' orientation,
  • the PVUH fragment corresponding to the left end of the Ad5 adenovirus comprising: the TTR sequence, the origin of replication, the packaging signals and the El A amplifier;
  • the plasmid pAdRSV ⁇ Gal was first cut by the enzymes EagI and
  • the PvuII fragment corresponding to the left end of the Ad5 adenovirus comprising: the ITR sequence, the origin of replication, the encapsidation signals and the amplifier El A;
  • the vector pAD5-gpl9k- ⁇ gal was linearized and cotransfected with an adenoviral vector deficient in the El gene, in helper cells (line 293) providing in trans the functions coded by the El regions (El A and E1B) of adenovirus.
  • the adenovirus Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El is obtained by homologous recombination in vivo between the adenovirus Ad-RSV ⁇ gal (Cf Stratford-Perricaudet et al cited above) and the vector pAD5-gpl9k- ⁇ gal, according to the protocol.
  • the plasmid pAD5-gpl9k- ⁇ gal, linearized by Xmnl and the adenovirus Ad-RSV ⁇ gal, linearized by the enzyme Clal, are co-transfected in line 293 in the presence of calcium phosphate, to allow homologous recombination.
  • the recombinant adenoviruses thus generated are then selected by plaque purification. After isolation, the DNA of the recombinant adenovirus is amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately 10 10 pfu ml.
  • the viral particles are generally purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
  • Adenovirus Ad-gpl9k- ⁇ gal- ⁇ El can be stored at -80 ° C in 20% glycerol 2.2. Construction of a recombinant adenovirus deleted in the El and E3 regions, carrying the two recombinant DNAs inserted in the same orientation, in the El region (FIG. 4).
  • the vector pAD5-gpl9k- ⁇ gal was linearized and cotransfected with an adenoviral vector deficient in the El and E3 genes, in helper cells (line 293) providing in trans the functions coded by the El (E1A and E1B) regions of adenovirus .
  • the adenovirus Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El f ⁇ E3 was obtained by homologous recombination in vivo between mutant adenovirus Ad-dll324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) and the vector pAD5-gpl9k- ⁇ gal , according to the following protocol: the plasmid pAD5-gpl9k- ⁇ gal and the adenovirus Ad-dll324, linearized by the enzyme Clal, were co-transfected in line 293 in the presence of calcium phosphate, to allow homologous recombination. The recombinant adenoviruses thus generated were then selected by plaque purification.
  • the DNA of the recombinant adenovirus is amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing non-purified recombinant defective radenovirus having a titer of approximately 10 10 pfu / ml.
  • the viral particles are generally purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456). The genome of the recombinant adenovirus was then verified by southern blot analysis.
  • Adenovirus Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El, ⁇ E3 can be stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • transcripts coding for gpl9k in cells infected with the adenovirus Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El, ⁇ E3 was demonstrated by Northern blot analysis of the total cellular RNAs. For this, 5.10 ⁇ 3T3 cells were infected with 40 pfu / virus cell. After 36 hours, the total cellular RNAs were recovered using RNAzol (Cinna / Biotecx), precipitated and then resuspended in water. 10 ⁇ g were then deposited on formaldehyde gel containing 1.5% agarose.
  • RNAs were then denatured in the presence of 0.05M NaOH, then transferred to a nylon support (Hybond + Amersham) by capillary transfer with 20xSSC.
  • the nylon membrane was pre-hybridized in 6xSSC, 5x Denhardt's medium, 0.5% SDS, 100 ⁇ g of denatured salmon sperm DNA for 2 h at 60 ° C.
  • a probe corresponding to the DNA of the E3 region of the Ad5 adenovirus labeled with 32p using the MegaPrime kit (Amersham) was then added to the solution and left for hybridization overnight. After hybridization, the membrane was washed twice in 2x SSC medium, 0.1% SDS at room temperature, then twice in O.lx SSC medium, 0.5% SDS at 45 ° C, then finally in 0.1 x medium SSC at room temperature and exposed.
  • results obtained show the appearance of a 1.6 kb band in cells infected with the adenovirus Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El, ⁇ E3.
  • This band corresponds to an mRNA comprising the sequence coding for gpl9k and going to the polyA site located in the RSV promoter controlling the transcrption of the LacZ gene.
  • no equivalent band is detected in the cells infected with the Ad- ⁇ -gal adenovirus.
  • ⁇ 2-microglobulin is a non-transmembrane protein located on the surface of cells in association with MHC-I molecules, and which is necessary for the presentation of the antigen on the surface of cells. In particular, it is necessary for the correct folding of the MHC-I molecules and for the presentation of the antigenic peptides on the surface of the cells, and therefore constitutes a good marker of the functionality of the MHC-I molecules.
  • the 3T3-Balb-c cells at confluence were infected with 200 pfu / cell of Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El, ⁇ E3, then incubated for 40 h at 37 ° C., under a humid atmosphere, 5% CO 2, in DMEM medium. containing 10% fetal calf serum.
  • the cells were then harvested in a 20 mM EDTA PBS buffer, and suspended in DMEM 10% S VF medium. 1 (the cells are then introduced into each well of a 96-well plate. The plates are centrifuged at 250 g for 3 min then incubated for 6 hours.
  • the wells are then washed with PBS buffer 1% beef albumin (BSA) and then incubated with a 500th dilution of sheep anti- ⁇ 2-microglobulin antibodies (The Binding Site, Birmingham, UK) in 1% SAB-PBS for 20 min at 37 ° C.
  • the cells were then washed in 1% SAB-PBS and then fixed in PBS buffer 0.37% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, washed twice and incubated with a dilution with 35,000 in 1% SAB-PBS of 2nd anti-sheep antibody conjugated to alkaline phosphatase (PA) (Sigma) for 1 hour at 4 ° C.
  • PA activity was then detected using the PA substrate kit (Biorad).
  • the optical density of the wells read at 450 nm, the mean OD and the standard deviation were calculated.
  • DBA 2 (H-2d) mice received a first intravenous injection of 10 * pfu of Ad- ⁇ gal virus, followed, 3 weeks later, by a new intraperitoneal injection of the same amount of virus.
  • the mice were sacrificed 2 weeks later (at the earliest), their ground spleen and the spleen cells are suspended in 10 ml of RPMI 1640 (Gibco) containing 10% of decomplementized SFV, 50 ⁇ g / ml of streptomycin, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g ml kanamycin and 100 ⁇ g / ml gentamycin.
  • CTL lymphocytes The cells thus obtained (CTL lymphocytes) were then incubated in the presence of 3T3 cells infected with the adenovirus Ad- ⁇ gal. This leads to a lysis of around 40% of the stained (ie infected) cells.
  • these same cells CTL lymphocytes
  • CTL lymphocytes have practically no effect on uninfected fibroblasts or on fibroblasts infected with the adenovirus Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El, ⁇ E3.
  • This example shows that the cells infected with the adenovirus Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El, ⁇ E3 are protected from lysis by CTL compared to the cells infected with an adenovirus Ad- ⁇ gal.
  • the cells of the spleen of mice having received injections of Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El, ⁇ E3 were prepared under the conditions described above. Under the conditions described above, these CTLs stimulated in the presence of 3T3 cells infected with Ad-gpl9k- ⁇ gal, ⁇ El, ⁇ E3 do not induce lysis of said cells, or non-infected fibroblasts, or fibroblasts infected with Ad- ⁇ gal. Furthermore, it was verified that this absence of lysis was not due to poor viability of the cells.
  • lymphocytes were then stimulated in the presence of 3T3 cells infected with Ad- ⁇ gal, in order to amplify all the anti-BGal or anti adenovirus clones.
  • the lymphocytes thus obtained are capable of lyzing the 3T3 cells infected with Ad- ⁇ gal, in the same manner as those taken from mice having received Ad- ⁇ gal.
  • Example 3 Construction of defective recombinant adenoviruses comprising a therapeutic gene under the control of a promoter inserted at the level of the E1 region and the gpl9k gene under the control of the LTR promoter of the RSV inserted at the level of the E3 region.
  • adenoviruses were constructed by homologous recombination between the DNA of a first defective virus carrying the first recombinant DNA (therapeutic gene + promoter) inserted at the level of the E1 region and the DNA of a second defective adenovirus carrying the second Recombinant DNA (gpl9k + RSV promoter) inserted at the E3 region.
  • An Xbal-EcoRI fragment is then derived from the plasmid pAd-gpl9k- ⁇ gal carrying the sequence coding for gpl9k under the control of the RSV promoter, then inserted at said sites in the DNA of Add1324 opened as above.
  • the DNA thus obtained therefore comprises a deletion at the level of the E1 region and a recombinant DNA at the level of the E3 region carrying the gpl9k gene under RSV control.
  • BamHI BamHI
  • line 293. in the presence of calcium phosphate, to allow homologous recombination.
  • the recombinant adenoviruses thus generated were then selected by plaque purification.
  • the DNA of the recombinant adenovirus is amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately 10 10 pfu / ml.
  • the viral particles are generally purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al, Virology 52 (1973) 456).

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux dérivés des adénovirus, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique. Elle concerne plus particulièrement des adénovirus défectifs dont le génome comprend un premier ADN recombinant contenant un gène thérapeutique et un second ADN recombinant contenant un gène immunoprotecteur.

Description

ADENOVIRUS DEFECTIFS COMPRENANT UN GENE THERAPEUTIQUE ET
UN GENE IMMUNOPROTECTEUR
La -présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits vecteurs viraux. Plus particulièrement, la présente invention concerne des adénovirus recombinants comme vecteurs pour la thérapie génique.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transf ection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.BioLChem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
Parmi ces virus, les adénovirus présentent certaines propriétés intéressantes pour une utilisation en thérapie génique. Notamment, ils ont un spectre d'hôte assez large, sont capables d'infecter des cellules quiescentes et ne s'intègrent pas au génome de la cellule infectée. Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée -répétée (ITR) à leur extrémité, une séquence d'encapsidatiσn, des gènes précoces et des gènes tardifs (Cf figure 1). Les principaux gènes précoces sont les gènes El (El a et Elb), E2, E3 et E4. Les principaux gènes tardifs sont les gènes Ll à L5.
Compte tenu des propriétés des adénovirus mentionnées ci-dessus, ceux-ci ont déjà été utilisés pour le transfert de gènes in vivo. A cet effet, différents vecteurs dérivés des adénovirus ont été préparés, incorporant différents gènes (B-gal, OTC, α- 1AT, cytokines, etc). Dans chacune de ces constructions, .'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés des régions El (Ela et/ou Elb) et éventuellement E3 au niveau desquelles est insérée une séquence d'ADN hétérologue (Levrero et al.. Gène 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al.,
Figure imgf000004_0001
Cependant, comme pour tous les virus connus, l'administration d'un adénovirus sauvage induit une réponse immunitaire importante (Routes et al., J. Virol. 65 (1991) 1450). Cette immunogénicité a également été observée consécutivement à l'administration d'adénovirus recombinants défectifs pour la réplication (Yang et al., PNAS (1994) 4407). L'un des rôles majeurs du système immtuiitaire consiste en effet à détruire les éléments non-soi ou soi-altéré. L'administration d'un vecteur de thérapie génique d'origine adénovirale introduit des motifs non-soi dans l'organisme. De même, les cellules infectées par un tel vecteur et exprimant de ce fait un gène thérapeutique exogène deviennent des éléments soi-altérés. Il est donc normal que le système immunitaire réagisse contre ces vecteurs et cellules infectées comme s'il s'agissait de corps étrangers. Cette réponse immunitaire contre les cellules infectées constitue un obstable majeur au développement de ces vecteurs viraux puisque (i) en induisant une destruction des cellules infectées elle limite la durée d'expression du gène thérapeutique et donc l'effet thérapeutique, (ϋ) elle induit parallèlement une réponse inflammatoire importante, et (iii) elle entraîne l'élimination rapide des cellules infectées après des injections répétées. Ainsi, l'expression de la β-galactosidase codée par un adénovirus recombinant administré dans le muscle de souris immunocompétentes est réduite à des niveaux minimum 40 jours après l'injection (Kass-Eisler et al., PNAS 90 (1993) 11498). De même, l'expression de gène transférés par des adénovirus dans le foie est significativement réduite après 4 mois (Li et al., Hum. Gène Ther. 4 (1993) 403) et l'expression du facteur IX transféré par adénovirus dans des hépatocytes de chiens hémophiles disparait 100 jours après l'injection (Kay et al., PNAS 91 (1994) 2353).
H semble donc que l'exploitation en thérapie génique de vecteurs dérivés des adénovirus implique la possibilité de réduire la réponse immunitaire contre ces vecteurs ou les cellules infectées. Ceci constitue précisément l'objet de la présente invention. La présente invention concerne en effet de nouveaux vecteurs dérivés des adénovirus présentant une immunogénicité très réduite voire supprimée. Les vecteurs de l'invention sont donc particulièrement appropriés pour des applications de thérapie génique, notamment chez l'homme.
Un premier objet de la présente invention concerne un adénovirus défectif dont le génome comprend un premier ADN recombinant contenant un gène thérapeutique et un second ADN recombinant contenant un gène immtmoprotecteur.
La présente invention découle en partie de la mise en évidence qu'il est possible d'incorporer plusieurs gènes d'intérêt dans des adénovirus, et d'obtenir une expression importante de ces différents gènes dans les cellules infectées. La présente invention découle également de la construction de vecteurs adénoviraux capables d'incorporer plusieurs gènes thérapeutiques dans des conditions permettant leur expression optimale. Elle découle encore de la mise en évidence que la co-expression, dans la cellule infectée, de certains gènes est capable d'induire un effet immunoprotecteur et ainsi de faire échapper les vecteurs de l'invention et/ou les cellules infectées au système immunitaire. La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux présentant des propriétés immunologiques et thérapeutiques tout à fait avantageuses en vue de leur utilisation en thérapie génique ou cellulaire.
Les ADN recombinants selon la présente invention sont des fragments d'ADN contenant le gène considéré (thérapeutique ou immunoprotecteur) et éventuellement des signaux permettant son expression, construits in vitro puis insérés dans le génome de l'adénovirus. Les ADN recombinants utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être des ADN complémentaires (ADNc), des ADN génomiques (ADNg), ou des constructions hybrides consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques. Ces ADN peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. De manière particulièrement avantageuse, on utilise des ADNc ou des ADNg.
L'insertion des gènes considérés sous forme d'ADN recombinants selon l'invention offre une plus grande flexibilité dans la construction des adénovirus, et permet un meilleur contrôle de l'expression desdits gènes.
Ainsi, les ADN recombinants (et donc les deux gènes d'intérêt) incorporés dans les vecteurs adénoviraux selon la présente invention peuvent être agencés de différentes manières. — _ Us peuvent tout d'abord être insérés en un même site du génome de l'adénovirus, ou en des sites différents, sélectionnés. En particulier, les ADN recombinants peuvent être insérés au moins en partie au niveau des régions El, E3 et/ou E4 du génome de l'adénovirus, en remplacement ou en supplément de séquences virales.
Us peuvent ensuite comporter chacun un promoteur transcriptionnel, identique ou différent Cette configuration permet d'obtenir des niveaux d'expression supérieurs, et offre un meilleur contrôle de l'expression des gènes. Dans ce cas, les deux gènes peuvent être insérés dans la même orientation ou dans les orientations opposées.
Ils peuvent également constituer une entité transcriptionnelle unique. Dans cette configuration, les deux ADN recombinants sont conù'gus et positionnés de telle sorte que les deux gènes soient sous le contrôle d'un promoteur unique, et donnent lieu à un ARN prémessager unique. Cette disposition est avantageuse puisqu'elle permet d'utiliser un seul promoteur transcriptionnel.
Enfin, l'emploi d'ADN recombinants selon l'invention permet d'utiliser des promoteurs transcriptionnels de nature différente, et notamment des promoteurs forts ou faibles, régulés ou constitutifs, tissu-spécifiques ou ubiquitaires, etc.
Le choix des signaux d'expression et de la position respective des ADN recombinants est particulièrement important pour obtenir une expression élevée du gène thérapeutique et un effet immunoprotecteur important
Comme gène thérapeutique utilisable pour la construction des vecteurs de la présente invention, on peut citer tout gène codant pour un produit ayant un effet thérapeutique. Le produit ainsi codé peut être une protéine, un peptide, un ARN, etc.
S'agissant d'un produit protéique, il peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une -protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits protéiques thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoATV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VTJJ, TX, les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, etc.
Comme indiqué plus haut, le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites^ dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les antisens comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, le gène thérapeutique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus dΕpstein Barr, du virus H V, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Dans ce mode de réalisation, aucune réponse immunitaire ne sera générée contre le virus vecteur ou la cellule infectée, mais l'antigène sélectionné sera produit et seul susceptible d'être immunogène.
Les gènes thérapeutiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Us peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques.
Le gène immunoprotecteur utilisé dans le cadre de la présente invention peut être de différents types. Plus préférentiellement, la demanderesse a maintenant montré que l'utilisation d'un gène dont le produit agit sur l'activité du complexe majeur d'histocompaubilité (MHC) ou sur l'activité des cytokines permettait de réduire considérablement, voire de supprimer toute réaction immunitaire à rencontre du vecteur ou des cellules infectées. Les vecteurs ainsi obtenus sont particulièrement avantageux puisqu'ils possèdent une durée d'action beaucoup plus longue in vivo et donc un effet thérapeutique plus important, qu'ils sont dépourvus d'effet inflammatoire et immunogène, et qu'ils peuvent être utilisés avec un nombre d'injections réduit
Les cellules présentatrices de l'antigène présentent des pepudes antigéniques à leur surface, en association avec des molécules du complexe majeur d'histocompaubilité de classe I (MHC-I). Les récepteurs des cellules T cytotoxiques (CTL) reconnaissent les complexes formés entre lesdites molécules MHC classe I et lesdits peptides antigéniques. Cette reconnaisance induit la mort des cellules par les CTL. La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de co-exprimer dans un vecteur adénoviral un gène thérapeutique et un gène capable d'altérer l'expression des molécules MHC-I, et que cette co-expression produit un effet thérapeutique durable sand réactions immunitaire ou inflammatoire. Parmi les gènes dont le produit agit sur l'activité du complexe majeur d'histocompaubilité, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention des gènes dont le produit inhibe au moins partiellement l'expression des protéines du MHC ou la présentation antigénique. A titre d'exemples préférés, on peut citer certains gènes contenus dans la région E3 de l'adénovirus, le gène ICP47 du virus de l'herpès, ou le gène UL18 du cytomégalovirus.
La région E3 du génome de l'adénovirus contient différentes phases de lecture qui, par épissage alternatif, donnent naissance à des protéines différentes. Parmi celles- ci, la protéine Gpl9k (ou E3-19k) est une protéine transmembranaire glycosylée localisée dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Cette protéine comprend un domaine luminal liant les molécules du MHC-I et une extrémité cytoplasmique C-terminale capable de lier les microtubules (ou la tubuline), qui agit pour ancrer la protéine gpl9k dans la membrane du RE. Gρl9k est ainsi capable d'empêcher l'expression des molécules MHC-I à la surface des cellules par interaction et séquestration au niveau du RE. Cependant, en l'absence de réplication virale, la protéine gpl9k est faiblement exprimée par les adénovirus. Le promoteur natif contient en effet certains éléments de régulation tels que des éléments de liaison de type NF-kB qui limitent les conditions d'expression de cette protéine. Par ailleurs, l'expression de la gpl9k est également conditionnée à la réalisation d'un épissage alternatif. L'introduction dans les vecteurs de l'invention d'un ADN recombinant contenant une séquence (ADNc de préférence) codant pour la gpl9k permet de contrôler et d'optimiser l'expression de ladite protéine. En particulier, l'emploi de promoteurs constitutifs et la suppression des autres phases de lecture permet d'augmenter fortement l'expression de cette protéine et de s'affranchir de la dépendance vis-à-vis de la réplication virale et la présence d'éléments inducteurs. Ceci permet de manière particulièrement avantageuse de diminuer considérablement la lyse par les CTL des cellules infectées et ainsi d'augmenter et de prolonger la production in vivo du gène thérapeutique. Les exemples de la présente demande décrivent notamment la construction d'un adénovirus défectif portant un ADN recombinant comprenant un gène marqueur sous contrôle du promoteur RSV et un second ADN recombinant portant une séquence codant pour la protéine gpl9k sous contrôle du promoteur constitutif RSV (Ad-βgal-gpl9k). Les résultats présentés démontrent que les cellules infectées par ce vecteur expriment la β-galactosidase à des niveaux aussi élevés que des cellules infectées par un adénovirus contenant uniquement le gène £- gai. Ceci montre que la présence du second ADN recombinant n'affecte pas les niveaux d'expression du premier. Ensuite les résultats présentés montrent que les cellules infectées par l'adénovirus Ad-βgal-gpl9k sont protégées contre la lyse par les CTL, ce qui n'est pas le cas des cellules infectées par un adénovirus Ad-βgal. De plus, la présence du second ADN recombinant dans les vecteurs de l'invention inhibe l'expansion clonale de lymphocytes dirigés contre les cellules infectées. Les vecteurs de l'invention induisent donc une réduction significative de la réponse immunitaire par les CTL contre les cellules infectées.
D'autres protéines codées par la région E3 du génome de l'adénovirus telles que les protéines 10,4k et 14,5k présentent certaines propriétés intéressantes en vue de leur incorporation dans les vecteurs de l'invention.
Le gène ICP47 du virus de l'herpès simplex constitue un autre gène immunoprotecteur particulièrement intéressant au sens de la présente invention. Les cellules infectées par le virus de l'herpès simplex présentent une résistance à la lyse induite par les CTL. Il a été montré que cette résistance pouvait être conférée par le gène ICP47, qui est capable de réduire l'expression des molécules MHC-I à la surface des cellules. L'incorporation du gène ICP47 dans un ADN recombinant selon l'invention permet également aux virus recombinants de l'invention d'échapper au système immunitaire.
Le gène UL18 du cytomégalovirus constitue un autre exemple préféré de gène immunoprotecteur selon l'invention. Le produit du gène UL18 est capable de lier la β2-microglobuline (Bro ne et al. Nature 347 (1990) 770). La β2-microglobuline est l'une des chaines des molécules MHC-I. L'incorporation du gène UL18 dans un ADN recombinant selon l'invention permet ainsi de diminuer le nombre de molécules de B2- microglobuline fonctionnelles dans les cellules infectées par les virus de l'invention, et donc de diminuer les capacités de ces cellules à produire des molécules MHC-I complètes et fonctionnelles. Ce type de construction permet donc de protéger les cellules infectées de la lyse par les CTL.
Comme indiqué ci-avant, le gène immunoprotecteur utilisé dans le cadre de la présente invention est, dans un autre mode de réalisation préféré, un gène dont le produit agit sur l'activité ou les voies de signalisation des cytokines. Les cytokines constituent une famille de protéines sécrétées qui agissent comme des molécules de signalisation pour le système immtuiitaire. Elles peuvent attirer les cellules de l'immunité, les activer, induire leur prolifération et même agir directement sur les cellules infectées pour les tuer.
Parmi les gènes dont le produit agit sur l'activité ou les voies de signalisation des cytokines, on peut citer les gènes intervenant sur la synthèse des cytokines, ou dont le produit est capable de séquestrer les cytokines, d'antagoniser leur activité ou d'interférer avec les voies de signalisation intercellulaires. A titre d'exemple préférentiels, on peut citer en particulier le gène BCRF1 du virus d'Epstein Barr, les gènes αmA et crmB du virus de co pox, les gènes B15R et B18R du virus de la vaccine, le gène US28 du cytomégalovirus, les gènes E3-14.7, E3-10.4 et E3-14.5 de l'adénovirus.
Le gène B15R du virus de la vaccine code pour une protéine soluble capable de lier l'interleukine-lβ (la forme sécrétée de l'interleukine-1), etainsi d'empêcher cette cytokine de se lier à ses récepteurs cellulaires. L'interleukine-1 est en effet l'une des premières cytokines produites en réponse à une agression antigénique, et elle joue un rôle très important dans la signalisation du stsème immunitaire au début de l'infection. La possibilité d'incorporer le gène B15R dans un vecteur selon l'invention permet avantageusement de réduire l'activité de lTL-lfl, notamment sur l'activation des cellules immunitaires, et de ce fait de protéger localement les cellules infectées par les virus de l'invention contre une réponse immunitaire importante. Des gènes homologues au gène B15R peuvent également être utilisés, tel que le gène — du virus de co pox.
De la même manière, le gène B18R du virus de la vaccine code pour une protéine homologue au récepteur de l'interleukine-6. Ce gène, ou tout homologue fonctionnel, est également utilisable dans les vecteurs de l'invention pour inhiber la liaison de l'interleukine-6 sur son récepteur cellulaire et ainsi réduire localement la réponse immunitaire.
Toujours de la même façon, le gène crmB du virus de cowpox peut être avantageusement utilisé. Ce gène code en effet pour une protéine sécrétée capable de lier le TNF et d'entrer en compétition avec les récepteurs du TNF à la surface des cellules. Ce gène permet donc, dans les virus de l'invention, de diminuer localement la concentration de TNF actif susceptible de détruire les cellules infectées. D'autres gènes codant pour des protéines capables de lier le TNF et d'inhiber au moins partiellement sa liaison sur ses récepteurs peuvent également être utilisés. Le gène crmA du virus de cowpox code lui pour une protéine ayant une activité d'inhibiteur de protéases du type spermine, qui est capable d'inhiber la synthèse de l'interleukine-lβ. Ce gène peut donc être utilisé pour diminuer localement la concentration en interleukine-1 et ainsi réduire le développement de la réponse immunitaire et inflammatoire. Le gène BCRF1 du virus d'Epstein Barr code pour un analogue de l'interleukine 10. Le produit de ce gène est une cytokine capable de diminuer la réponse immunitaire et de changer sa spécificité, tout en induisant la prolifération des lymphocytes B.
Le gène US28 du cytomégalovirus code pour une protéine homologue au récepteur de la protéine inflammatoire des macrophages la (MlP-la). Cette protéine est donc capable d'agir comme compétiteur des récepteurs du MIP, et donc d'inhiber son activité localement
Le produit des gènes E3-14.7, E3-10.4 et E3-14.5 de l'adénovirus est capable de bloquer la transmission du signal intercellulaire médié par certaines cytokines. Lorsque les cytokines se lient à leur récepteur à la surface d'une cellule infectée, un signal est transmis au noyau pour induire la mort cellulaire ou stoper la synthèse protéique. C'est le cas en particulier du facteur de nécrose des tumeurs (TNF). L'incorporation des gènes E3-14.7, E3-10.4 et/ou E3-14.5 dans un ADN recombinant selon l'invention en vue de leur expression constitutive ou régulée permet de bloquer la signalisation intercellulaire induite par le TNF, et ainsi de -protéger les cellules infectées par les virus recombinants de l'invention des effets toxiques de cette cytokine.
Une inhibition locale et transitoire peut être particulièrement avantageuse. Celle-ci peut être obtenue notamment par le choix des signaux d'expression particuliers (promoteurs cytokine-dépendants par exemple) comme indiqué ci-après.
n est entendu que d'autres gènes homologues ou ayant des propriétés fonctionnelles similaires peuvent être utilisés pour la construction des vecteurs de l'invention. Ces différents gènes peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. En outre, ces différents gènes peuvent être utilisés seuls ou en combinaison(s).
L'un des autres aspects importants de la présente invention concerne le choix des promoteurs transcriptionnels utilisés pour diriger l'expression des gènes. Comme indiqué ci-avant, il peut être particulièrement important d'utiliser un -promoteur capable d'exprimer constitutivement le gène placé sous son contrôle. Ceci est le cas par exemple du gène gpl9k ou d'un homologue, si l'on souhaite obtenir une immunoprotection importante. En revanche, pour contrôler l'expression d'un gène immunoprotecteur agissant sur l'activité des cytokines, une expression régulée peut être souhaitable. En ce qui concerne l'expression du gène thérapeutique, le choix des signaux d'expression dépend de la nature du produit thérapeutique, de la pathologie concernée et du tissu ciblé.
Les promoteurs utilisables pour la construction des ADN recombinants de l'invention peuvent être les promoteurs qui sont naturellement responsables de l'expression du gène thérapeutique ou immunoprotecteur considéré lorsque ceux-ci sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Cependant, il s'agit préférentiellement de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques), en particulier pour contrôler l'expression du gène immunoprotecteur. Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la œllule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Par ailleurs, lorsque l'ADN recombinant ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Un promoteur préféré pour la réalisation des vecteurs de l'invention est constitué par le LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV). Ce promoteur étant constitutif et fort, permet d'induire une immunoprotection par la gpl9k importante. Des promoteurs mammifères peuvent également présenter un grand intérêt, tels que le promoteur des gènes PGK, albumine, etc. A peut être particulièrement intéressant d'utiliser des promoteurs régulés ou tissu-spécifiques de manière à pouvoir cibla- la synthèse des produits thérapeutiques et/ou immunoprotecteurs. En particuliers, pour l'expression d'un gène immunoprotecteur inhibant l'activité des cytokines, il peut être particulièrement avantageux d'utiliser un promoteur inductible pour obtenir un effet localisé. Des promoteurs inductibles sont par exemple des promoteurs induits par des cytokines, de telle sorte que l'effet immunoprotecteur ne se produise qu'en réponse à une réaction immunitaire.
Par ailleurs, l'ADN recombinant peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du gène considéré (thérapeutique ou immunoprotecteur) le cas échéant, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Comme indiqué ci-avant, différentes configurations peuvent être envisagées pour la réalisation des vecteurs de l'invention. Les vecteurs de l'invention peuvent tout d'abord contenir les deux gènes sous forme d'une entité transcriptionnelle unique. Dans cette configuration, les deux ADN recombinants sont contigus, disposés de telle sorte que les deux gènes soient sous le contrôle d'un promoteur unique, et donnent lieu à un ARN prémessager unique. Cette configuration est intéressante puisqu'elle permet d'utiliser un seul promoteur transcriptionnel pour réguler l'expression des 2 gènes. Par ailleurs, cette entité transcriptionnelle unique peut être incorporée dans le vecteur adénoviral dans les deux orientations possibles. Avantageusement, les deux ADN recombinants contiennent leur propre promoteur transcriptionnel. Cette configuration permet d'obtenir des niveaux d'expression supérieurs, et offre un meilleur contrôle de l'expression des gènes. Dans ce cas, les deux ADN recombinants peuvent être insérés dans la même orientation ou dans les orientations opposées, dans un même site du génome de l'adénovirus ou en des sites différents.
Préférentiellement les ADN recombinants sont insérés, au moins en partie, au niveau des régions El, E3 ou E4 du génome de l'adénovirus. Lorsqu'ils sont insérés en deux sites différents, on préfère dans le cadre de l'invention utiliser les régions El et E3 ou El et E4. Les exemples montrent en effet que cette organisation permet une expression élevée des deux gènes, sans interférence entre les deux. Avantageusement, les ADN recombinants sont insérés en remplacement de séquences virales.
Un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre de la présente invention consiste en un adénovirus déf ectif comportant un premier ADN recombinant contenant un gène thérapeutique et un second ADN recombinant contenant un gène immunoprotecteur, dans lequel les deux ADN recombinants sont insérés au niveau de la région El.
Un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre de la présente invention consiste en un adénovirus déf ectif comportant un premier ADN recombinant contenant un gène thérapeutique, inséré au niveau de la région El, et un second ADN recombinant contenant un gène immunoprotecteur, inséré au niveau de la région E3.
Comme indiqué ci-avant, les adénovirus de la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adénovirus défectifs selon la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par les gènes thérapeutiques. Le caractère défectif des adénovirus de l'invention est un élément important, puisqu'il assure la non dissémination des vecteurs de l'invention après administration. Dans un mode de réalisation préféré, les adénovirus de l'invention comprennent les séquences ITR et une séquence permettant l'encapsidation, et possèdent une délétion de tout ou partie du gène El.
Les séquences inversées répétées (ITR) constituent l'origine de réplication des adénovirus. Elles sont localisées aux extrémités 3' et 5' du génome viral (Cf figure 1), d'où elles peuvent être isolées aisément selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. La séquence nucléotidique des séquences ITR des adénovirus humains (en particulier des serotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2). Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, la séquence ITR gauche correspond à la région comprenant les nucléotides 1 à 103 du génome.
La séquence d'encapsidation (également désignée séquence Psi) est nécessaire à l'encapsidation de l'ADN viral. Cette région doit donc être présente pour permettre la préparation d'adénovims recombinants défectifs selon l'invention. La séquence d'encapsidation est localisée dans le génome des adénovirus, entre ITTR gauche (5') et le gène El (Cf figure 1). Elle peut être isolée ou synthétisée artificiellement par les techniques classiques de biologie moléculaire. La séquence nucléotidiques de la séquence d'encapsidation des adénovirus humains (en particulier des serotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2). Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, la séquence d'encapsidation correspond à la région comprenant les nucléotides 194 à 358 du génome.
Plus préférentiellement, les adénovirus de l'invention comprennent les séquences ITR et une séquence permettant l'encapsidation, et possèdent une délétion de tout ou partie des gènes El et E4.
Dans un mode particulièrement préféré de réalisation, le génome des adénovirus selon l'invention est délété de tout ou partie des gènes El, E3 et E4, et, encore plus préférentiellement, de tout ou partie des gènes El, E3, L5 et E4.
Les adénovirus de l'invention peuvent être préparés à partir d'adénovims d'origines diverses. Il existe en effet différents serotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Ainsi, les enseignements décrits dans la -présente demande peuvent être aisément reproduits par l'homme du métier pour tout type d'adénovirus. Plus particulièrement les adénovirus de l'invention peuvent être d'origine humaine, animale, ou mixte (humaine et animale).
Concernant les adénovirus d'origine humaine, on préfère utiliser ceux classés dans le groupe C. Plus préférentiellement, parmi les différents serotypes d'adénovirus humain, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5).
Comme indiqué plus haut, les adénovirus de l'invention peuvent également être d'origine animale, ou comporter des séquences issues d'adénovirus d'origine animale. La demanderesse a en effet montré que les adénovirus d'origine animale sont capables d'infecter avec une grande efficacité les cellules humaines, et qu'ils sont incapables de se propager dans les cellules humaines dans lesquelles ils ont été testés (Cf demande FR 93 05954). La demanderesse a également montré que les adénovirus d'origine animale ne sont nullement trans-complémentés par des adénovirus d'origine humaine, ce qui élimine tout risque de recombinaison et de propagation in vivo, en présence d'un adénovirus humain, pouvant conduire à la formation d'une particule infectieuse. L'utilisation d'adénovirus ou de régions d'adénovirus d'origine animale est donc particulièrement avantageuse puisque les risques inhérents à l'utilisation de virus comme vecteurs en thérapie génique sont encore plus faibles.
Les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). Plus particulièrement, parmi les adénovirus aviaires, on peut citer les serotypes 1 à 10 accessibles à l'ATCC, comme par exemple les souches Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-ll (ATCC VR-921) ou encore les souches référencées ATCC VR-831 à 835. Parmi les adénovirus bovins, on peut utiliser les différents serotypes connus, et notamment ceux disponibles à l'ATCC (types 1 à 8) sous les référencesATCC VR-313, 314, 639-642, 768 et 769. On peut également citer les adénovirus murins FL (ATCC VR-550) et E203Θ8 (ATCC VR- 528), l'adénovirus ovin type 5 (ATCC VR-1343), ou type 6 (ATCC VR-1340); l'adénovirus porcin 5359), ou les adénovirus simiens tels que notamment les adénovirus référencée à l'ATCC sous les numéros VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.
De préférence, parmi les différents adénovirus d'origine animale, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus ou des régions d'adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. Les adénovirus canins ont fait l'objet de nombreuses études structurales. Ainsi, des cartes de restriction complètes des adénovirus CAV1 et CAV2 ont été décrites dans l'art antérieur (Spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989) 165), et les gènes Ela, E3 ainsi que les séquences ITR ont été clones et séquences (voir notamment Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linné, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525).
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés de différentes façons. Une première méthode consiste à transfecter l'ADN du virus recombinant défectif préparé in vitro (soit par ligature, soit sous forme de plasmide) dans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en trans toutes les fonctions nécessaires à la complémentation du virus défectif. Ces fonctions sont préférentiellement intégrées dans le génome de la cellule, ce qui permet d'éviter les risques de recombinaison, et confère une stabilité accrue à la lignée cellulaire.
Une seconde approche consiste à co-transfecter dans une lignée cellulaire apppropriée l'ADN du virus recombinant défectif préparé in vitro (soit par ligature, soit sous forme de plasmide) et l'ADN d'un virus helper. Selon cette méthode, il n'est pas nécessaire de disposer d'une lignée cellulaire compétente capable de complémenter toutes les fonctions défectives de l'adénovirus recombinant Une partie de ces fonctions est en effet complémentée par le virus helper. Ce virus helper doit lui-même être défectif et la lignée cellulaire porte en trans les fonctions nécessaires à sa complémentation. Parmi les lignées cellulaires utilisables notamment dans le cadre de cette seconde approche, on peut citer notamment la lignée de rein embryonnaire humain 293, les cellules KB, les cellules Hela, MDCK, GHK, etc (Cf exemples).
Ensuite, les vecteurs qui se sont multipliés sont récupérés, purifiés et amplifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
Selon une variante de mise en oeuvre, il est possible de préparer in vitro, soit par ligature, soit sous forme de plasmide, l'ADN du virus recombinant défectif portant les délétions appropriées et les deux ADN recombinants. Comme indiqué ci-avant, les vecteurs de l'invention possèdent avantageusement une délétion de tout ou partie de certains gènes viraux, notammment des gènes El, E3, E4 et/ou L5. Cette délétion peut correspondre à tout type de suppression affectant le gène considéré. Il peut s'agir notamment de la suppression de tout ou partie de la région codante dudit gène, et/ou de tout ou partie de la région promotrice de la transcription dudit gène. La suppression est généralement réalisée sur l'ADN du virus recombinant défectif, par exemple par digestion au moyen d'enzymes de restriction appropriées, puis ligature, selon les techniques de biologie moléculaire, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les ADN recombinants peuvent ensuite être insérés dans cet ADN par clivage enzymatique puis ligature, au niveau des régions sélectionnées et dans l'orientation choisie.
L'ADN ainsi obtenu, qui porte donc les délétions appropriées et les deux ADN reoombinants, permet de générer directement l'adénovirus recombinant défectif portant lesdites délétions et ADN recombinants. Cette première variante est particulièrement adaptée à la réalisation d'adénovirus recombinants dans lesquels les gènes sont disposés sous forme d'une unité transcriptionnelle unique ou, sous contrôle de promoteurs séparés mais insérés en un même site du génome.
H est également possible de préparer le virus recombinant en deux étapes, permettant l'introduction successive des deux ADN recombinants. Ainsi, l'ADN d'un premier virus recombinant portant les délétions appropriées (ou une partie desdites délétions) et un des ADN recombinants est construit, par ligature ou sous forme de plasmide. Cet ADN est ensuite utilisé pour générer un premier virus recombinant portant lesdites délétions et un ADN recombinant L'ADN de ce premier virus est ensuite isolé et co-transfecté avec un second plasmide ou l'ADN d'un second virus recombinant défectif portant le deuxième ADN recombinant, les délétions appropriées
(partie non présente sur le premier virus), et une région permettant la recombinaison homologue. Cette deuxième étape génère ainsi le virus recombinant défectif portant les deux ADN recombinants. Cette variante de préparation est particulièrement appropriée pour la préparation de virus recombinants portant deux ADN recombinants insérés en deux régions différentes du génome de l'adénovirus.
La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus défectifs tels que décrits précédemment. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable, n peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque fcrming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 5 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Les adénovirus de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies. Selon le gène thérapeutique inséré, les adénovirus de l'invention peuvent être utilisés notamment pour le traitement ou la prévention des maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), des maladies neurodégénératives (alzheimer, parkinson, ALS, etc), des pathologies hyperprolifératives (cancers, resténose, etc), des pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, des pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), etc.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratif s et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1 : Organisation génétique de l'adénovirus Ad5. La séquence complète de l'Ad5 est disponible sur base de données et permet à l'homme du métier de sélectionner ou de créer tout site de restriction, et ainsi d'isoler toute région du génome. Figure 2 : Carte de restriction de l'adénovirus CAV2 souche Manhattan (d'après Spibey et al précité) .
Figure 3 : Construction du vecteur pAD5-gpl9k-βgal.
Figure 4 : Construction de l'adénovirus Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3. Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, .'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13. (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
[Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 22Ω (1985) 1350-
1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Lignées cellulaires utilisées
Dans les exemples qui suivent, les lignées cellulaires suivantes ont ou peuvent être utilisées :
- Lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Cette lignée contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de radénovirus humain Ad5 (12 %).
- Lignée de cellules humaines KB : Issue d'un carcinome épidermique humain, cette lignée est accessible à l'ATCC (réf. CCL17) ainsi que les conditions permettant sa culture. - Lignée de cellules humaines Hela : Issue d'un carcinome de l'épithelium humain, cette lignée est accessible à l'ATCC (réf. CCL2) ainsi que les conditions permettant sa culture.
- Lignée de cellules canines MDCK : Les conditions de culture des cellules MDCK ont été décrites notamment par Macatney et al., Science 44 (1988) 9. - Lignée de cellules gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624).
Cette lignée est constituée de cellules Hela portant le gène E2 d'adénovirus sous le contrôle du LTR de MMTV.
EXEMPLES
Exemple 1. Construction d'adénovirus recombinants défectifs comprenant un gène thérapeutique 0e gène LacZ de E. coli) sous le contrôle du promoteur du LTR du RSV et le gène gpl9k sous le contrôle du promoteur du LTR du RSV, tous deux insérés au niveau de la région El.
Ces adénovirus ont été construits par recombinaison homologue entre un plasmide portant la partie gauche de l'adénovirus Ad5, les deux ADN recombinants et une région de l'adénovirus Ad5 (correspondant à la protéine IX) et l'ADN d'un adénovirus défectif portant différentes délétions.
1. Construction du vecteur pAD5-gpl9k-βgal (figure 3)
1.1. Construction du plasmide pGEM-gpl9k
Le plasmide ρAD5-gpl9k-βgal contient une séquence d' ADNc codant pour la protéine gpl9k d'adénovirus. Ce plasmide a été construit comme suit. Le fragment
Xbal du génome de l'adénovirus Ad5 sauvage contenant la région E3 a été isolé et clone au site correspondant du plasmide pGEM (Promega) pour générer le plasmide pGEM-E3. Le fragment Hinfl contenant la séquence codante de la gpl9k (nucléotides 28628 à 29634 de radénovirus Ad5 sauvage) a ensuite été isolé à partir du plasmide pGEM-E3. Les extrémités de ce fragment ont été rendues franches par action du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli (Cf techniques générales de biologie moléculaire), puis le fragment obtenu a été clone au site Smal du plasmide pGEMzf+ (Promega).
Le plasmide obtenu a été désigné pGEM-gpl9k (figure 3).
1.2. Construction du vecteur pAD5-gpl9k-βgal
Cet exemple décrit la construction d'un plasmide contenant un les deux ADN recombinants comprenant leur propre promoteur, la partie gauche du génome de l'adénovirus et une partie supplémentaire (protéine pIX) permettant la recombinaison homologue. Ce vecteur a été construit à partir du plasmide pAd.RSVβGal comme suit
Le plasmide pA RSVβGal contient, dans l'orientation 5'->3',
- le fragment PVUH correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant : la séquence TTR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur El A;
- le gène codant pour la β-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAdRSVβGal et adénovirus dl324. Le plasmide pAdRSVβGal a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. 0. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
Le plasmide pAdRSVβGal a tout d'abord été coupé par les enzymes EagI et
-Clal. Ceci génère un premier fragment portant notamment la partie gauche de adénovirus Ad5 et le promoteur du LTR du RSV. Parallèlement, le plasmide pAdRSVβGal a également été coupé par les enzymes EagI et Xbal. Ceci génère un deuxième type de fragment portant notamment le promoteur du LTR du RSV, le gène
LacZ, et un fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue. Les fragments Clal-EagI et Eagl-Xbal ont ensuite été ligaturés en présence du fragment Xbal-Clal du plasmide pGEM-gpl9k (exemple 1.1) portant la séquence codante de la gpl9k (Cf figure 3). Le vecteur ainsi obtenu, désigné pAD5- gpl9k-βgal, contient donc
- le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant : la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur El A;
- la séquence codant pour la gpl9k sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sarcome de Rous) ;
- le gène codant pour la β-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sarcome de Rous), et, - un second fragment du génome de radénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue.
2. Construction des adénovirus recombinants
2.1. Construction d'un adénovirus recombinant délété dans la région El, portant les deux ADN recombinants insérés dans la même orientation, au niveau de la région El.
Le vecteur pAD5-gpl9k-βgal a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient dans le gène El, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (El A et E1B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad-gpl9k-βgal,ΔEl est obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus Ad-RSVβgal (Cf Stratford- Perricaudet et al citée plus haut) et le vecteur pAD5-gpl9k-βgal, selon le protocole suivant : le plasmide pAD5-gpl9k-βgal, linéarisé par Xmnl, et l'adénovirus Ad- RSVβgal, linéarisé par l'enzyme Clal, sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont ensuite sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu ml.
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-gpl9k-βgal-ΔEl peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycéroL 2.2. Construction d'un adénovirus recombinant délété dans les régions El et E3, portant les deux ADN recombinants insérés dans la même orientation, au niveau de la région El (figure 4).
Le vecteur pAD5-gpl9k-βgal a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient dans les gènes El et E3, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et E1B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad-gpl9k-βgal,ΔElfΔE3 a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre adénovirus mutant Ad-dll324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pAD5-gpl9k-βgal, selon le protocole suivant : le plasmide pAD5-gpl9k-βgal et l'adénovirus Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme Clal, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont ensuite été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant radénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). Le génome de l'adénovirus recombinant a ensuite été vérifié par analyse en southern blot. L'adénovirus Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3 peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol.
Exemple 2 : Mise en évidence en culture cellulaire de la fonctionnalité des adénovirus de l'invention
1. Transcription de la gp!9k dans les fibroblastes 3T3.
L'apparition de transcripts codant pour la gpl9k dans les cellules infectées par ïadénovirus Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3 a été démontrée par analyse en Northern blot des ARN cellulaires totaux. Pour cela, 5.10^ cellules 3T3 ont été infectées avec 40 pfu/cellule de virus. Au bout de 36 heures, les ARN cellulaires totaux ont été récupérés au moyen de RNAzol (Cinna/Biotecx), précipités puis resuspendus dans de l'eau. 10 μg ont ensuite été déposés sur gel de formaldéhyde contenant 1,5% d'agarose. Les ARN ont ensuite été dénaturés en présence de NaOH 0.05M, puis transférés sur un support de nylon (Hybond+ Amersham) par transfert capillaire avec 20xSSC. La membrane de nylon a été pré-hybridée en milieu 6xSSC, 5x Denhardt's, 0,5% SDS, 100 μg d'ADN de sperme de saumon dénaturé pendant 2 h à 60 °C. Une sonde correspondant à l'ADN de la région E3 de l'adénovirus Ad5 marquée au 32p en utilisant le kit MegaPrime (Amersham) a ensuite été ajoutée à la solution et laissée pour l'hybridation pendant toute la nuit Après l'hybridation, la membrane a été lavée deux fois dans un milieu 2x SSC, 0,1% SDS à température ambiante, puis deux fois dans un milieu O.lx SSC, 0,5% SDS à 45°C, puis enfin dans un milieu 0,lx SSC à température ambiante et exposée.
Les résultats obtenus montrent l'apparition d'une bande de 1,6 kb dans les cellules infectées par l'adénovirus Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3. Cette bande correspond à un ARNm comprenant la séquence codant pour la gpl9k et allant jusqu'au site polyA situé dans le promoteur RSV contrôlant la transcrption du gène LacZ. En revanche, aucune bande équivalente n'est détectée dans les cellules infectées par l'adénovirus Ad- β-gal.
2. Expression d'une gρ!9k fonctionnelle
La fonctionalité de la gpl9k produite par les cellules infectées par l'adénovirus Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3 a été vérifiée par mesure, en test ELIS A, de l'expression de la β2-microglobuline à la surface des cellules. La β2-microglobuline est une protéine non-transmembranaire localisée à la surface des cellules en association avec les molécules MHC-I, et qui est nécessaire à la présentation de l'antigène à la surface des cellules. En particulier, elle est nécessaire pour le repliement correct des molécules MHC-I et pour la présentation des peptides antigéniques à la surface des cellules, et constitue de ce fait un bon marqueur de la fonctionnalité des molécules MHC-I.
Les cellules 3T3-Balb-c à confluence ont été infectées avec 200 pfu/cellule d'Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3, puis incubées 40 h à 37°C, sous atmosphère humide, 5% CO2, dans du milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau fétal. Les cellules ont ensuite été récoltées dans un tampon PBS 20mM EDTA, et mises en suspension dans du milieu DMEM 10% S VF. l(fi cellules sont ensuite introduites dans chaque puits d'une plaque 96 puits. Les plaques sont centrifugées à 250 g pendant 3 min puis incubées 6 heures. Les puits sont ensuite lavés avec du tampon PBS 1% albumine de boeuf (SAB) puis incubées avec une dilution au 500ème d'anticorps de mouton anti- β2-microglobuline (The Binding Site, Birmingham, UK) dans 1% SAB-PBS pendant 20 min à 37°C. Les cellules ont ensuite été lavées dans 1% SAB-PBS puis fixées dans un tampon PBS 0,37% formaldéhyde, 0,2% glutaraldéhyde, lavées 2 fois et incubées avec une dilution au 35 OOOème dans 1% SAB-PBS d'un 2éme anticorps anti-mouton conjugué à la phosphatase alcaline (PA) (Sigma) pendant 1 heure à 4°C. Les plaques sont ensuite lavées 3 fois dans 1% SAB-PBS. L'activité PA a ensuite été détectée en utilisant le kit PA substrat (Biorad). La densité optique des puits lue à 450 nm, la DO moyenne et l'écart type ont été calculés.
Les résultats obtenus montrent que l'infection par l'Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3 induit une réduction de 40% environ de l'intensité du signal β2-microglobuϋne de surface révélé par le test ELISA, par rapport à l'effet produit par l'adénovirus Ad-βgal. Ces résultats indiquent clairement que .'Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3 induit la production d'une protéine gpl9k fonctionnelle, et que celle-ci induit une baisse significative de l'expression des molécules MHC-I à la surface des cellules.
Exemple 3. Effet immunoprotecteur des adénovirus de l'invention
3.1. Sensibilité aux CTL stimulés in vivo par l'adénovirus Ad-βgal Cet exemple montre que les cellules infectées par l'adénovirus Ad-gpl9k- βgal,ΔEl,ΔE3 sont protégées de la lyse par les CTL par rapport aux cellules infectées par un adénovirus Ad-βgal.
Des souris DBA 2 (H-2d) ont reçu une première injection intraveineuse de 10* pfu de virus Ad-βgal, suivie, 3 semaines après, d'une nouvelle injection intrapétitonéale de la même quantité de virus. Les souris ont été sacrifiées 2 semaines après (au plus tôt), leur rate broyée et les cellules de la rate sont mises en suspension dans 10ml de RPMI 1640 (Gibco) contenant 10% de SFV décomplémentisé, 50μg/ml de streptomycine, 100 U/ml de pénicilline , 100 μg ml de kanamycine et 100 μg/ml de gentamycine. Les cellules ainsi obtenues (lymphocytes CTL) ont alors été incubées en présence de cellules 3T3 infectées par l'adénovirus Ad-βgal. Ceci conduit à une lyse de 40% environ des cellules colorées (i.e. infectées). En revanche, ces mêmes cellules (lymphocytes CTL) n'ont pratiquement aucun effet sur les fibroblastes non infectés ni sur les fibroblastes infectés par l'adénovirus Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3. Ces résultats montrent bien que rinoorporation dans les vecteurs de l'invention d'un ADN recombinant capable de produire la gpl9k induit une immunoprotection des cellules infectées. __^ 3.2. Sensibilité aux CTL stimulés in vivo par l'adénovirus Ad-gpl9k- BgaLΔEl.ΔE3
Cet exemple montre que les cellules infectées par l'adénovirus Ad-gpl9k- βgal,ΔEl,ΔE3 sont protégées de la lyse par les CTL par rapport aux cellules infectées par un adénovirus Ad-βgal.
Les cellules de la rate de souris ayant reçu des injection d'Ad-gpl9k- βgal,ΔEl,ΔE3 ont été préparaées dans les conditions décrites ci-dessus. Dans les conditions décrites ci-dessus, ces CTL stimulés en présence de cellules 3T3 infectées par Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3 n'induisent pas de lyse desdites cellules, ni des fibroblastes non-infectes, ni des fibroblastes infectés par l' Ad-βgal. Par ailleurs, il a été vérifié que cette absence de lyse n'était pas due à une faible viabilité des cellules. Pour cela, les mêmes lymphocytes ont été stimulés ensuite en présence de cellules 3T3 infectées par l'Ad-βgal, dans le but d'amplifier tous les clones anti-BGal ou anti adénovirus. Les lymphocytes ainsi obtenus sont capables de lyser les cellules 3T3 infectées par l' Ad-βgal, de la même manière que ceux prélevés des souris ayant reçu l'Ad-βgal. Ces résultats montrent clairement (i) que les vecteurs de l'invention induisent une immunoprotection des cellules infectées, puisqu'aucun CTL spécifique efficace n'est généré, et (ϋ), que si certains lymphocytes anti- vecteur sont générés dans les rates de souris injectées par Ad-gpl9k-βgal,ΔEl,ΔE3, l'expression des antigènes pendant la stimulation ex vivo est insuffisante pour induire une expansion clonale de ces lymphocytes nécessaire à la lyse des cellules cibles infectées.
Exemple 3. Construction d'adénovirus recombinants défectifs comprenant un gène thérapeutique sous le contrôle d'un promoteur inséré au niveau de la région El et le gène gpl9k sous le contrôle du promoteur du LTR du RSV inséré au niveau de la région E3.
Ces adénovirus ont été construits par recombinaison homologue entre un l'ADN d'un premier virus défectif portant le premier ADN recombinant (gène thérapeutique + promoteur) inséré au niveau de la région El et l'ADN d'un deuxième adénovirus défectif portant le deuxième ADN recombinant (gpl9k + promoteur RSV) inséré au niveau de la région E3.
1. Construction du virus défectif portant le deuxième ADN recombinant (gp!9k + promoteur RSV) inséré au niveau de la région E3 Ce virus a été construit à partir de l'adénovirus Addl324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543). Ce virus porte une délétion au niveau de la région El et au niveau de la région E3 (fragment Xbal-EcoRI délété). L'ADN du virus Addl324 a été isolé et purifié. Cet ADN est ensuite coupé par les enzymes Xbal et EcoRI. Un fragment Xbal-EcoRI est ensuite issu du plasmide pAd-gpl9k-βgal portant la séquence codant pour la gpl9k sous contrôle du promoteur RSV, puis inséré au niveau desits sites dans l'ADN de Addl324 ouvert comme précédemment
L'ADN ainsi obtenu comporte donc une délétion au niveau de la région El et un ADN recombinant au niveau de la région E3 portant le gène gpl9k sous contrôle du RSV.
2. Construction des adénovirus portant les deux ADN recombinante.
L'ADN du virus recombinant préparé ci-dessus et l'ADN d'un adénovirus recombinant portant un gène thérapeutique au niveau de la région El, linéarisé par
BamHI, sont co-transfectés dans la lignée 293.en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont ensuite été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al, Virology 52 (1973) 456).
Bien que les exemples ci-dessus décrivent plus particulièrement l'empli du gène gpl9k, il est entendu que les approches décrites dans les exemples ci-dessus peuvent être répétées par l'homme du métier en utilisant d'autres gènes thérapeutiques, d'autres gènes immunoprotecteurs, d'autres promoteurs et d'autres sites d'insertion dans le génome de l'adénovirus.

Claims

REVENDICATIONS
1. Adénovirus défectif dont le génome comprend un premier ADN recombinant contenant un gène thérapeutique et un second ADN recombinant contenant un gène immunoprotecteur.
2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que les deux ADN recombinants constituent une entité transcriptionnelle unique.
3. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que les deux ADN recombinants comportent chacun un promoteur transcriptionnel, identique ou différent
4. Adénovirus selon la revendication 3 caractérisé en ce que les deux ADN recombinants sont insérés dans la même orientation.
5. Adénovirus selon la revendication 3 caractérisé en ce que les deux ADN recombinantssont insérés dans les orientations opposées.
6. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que les deux ADN recombinants sont insérés dans un même site du génome, de préférence au niveau des régions El, E3 ou E4.
7. Adénovirus selon la revendication 6 caractérisé en ce que les deux ADN recombinants sont insérés au niveau de la région El.
8. Adénovirus selon l'une des revendications 1, 3, 4 et 5 caractérisé en ce que les deux ADN recombinants sont insérés en des sites différents du génome.
9. Adénovirus selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'un des ADN recombinants est inséré au niveau de la région El et l'autre au niveau de la région E3 ou E4.
10. Adénovirus recombinant défectif selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'il comprend les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, et en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes El et E4.
11. Adénovirus selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comprend les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, et en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes El, E3 et E4.
12. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que son génome est délété de tout ou partie des gènes El, E3, L5 et E4.
13. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est d'origine humaine, animale, ou mixte.
14. Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine humaine sont choisis parmi ceux classés dans le groupe C, de préférence parmi les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5).
15. Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine animale sont choisis parmi les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, ovine, porcine, aviaire et simienne.
16. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en «e que le gène thérapeutique code pour une protéine thérapeutique.
17. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène thérapeutique code pour un ARN thérapeutique.
18. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène immunoprotecteur est un gène dont le produit agit sur l'activité du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) ou sur l'activité des cytokines.
19. Adénovirus selon la revendication 18 caractérisé en ce que le gène immunoprotecteur est un gène dont le produit inhibe au moins partiellement l'expression des protéines du MHC ou la présentation antigénique.
20. Adénovirus selon la revendication 19 caractérisé en ce que le gène immunoprotecteur est choisi parmi le gène de la gpl9k de radénovirus, le gène ICP47 du virus de l'herpès, ou le gène UL18 du cytomégalovirus.
21. Adénovirus selon la revendication 18 caractérisé en ce que le gène dont le produit agit sur l'activité des cytokines est choisi parmi le gène BCRFl du virus d'Epstein Barr, les gènes crmA et crmB du virus de cowpox, les gènes B15R et B18R du virus de la vaccine, le gène US28 du cytomégalovirus et les gènes E3-14.7, E3- 10,4 et E3-14.5 de l'adénovirus.
22. Adénovirus défectif caractérisé en ce qu'il comprend un premier ADN recombinant comprenant un gène thérapeutique et un deuxième ADN recombinant comprenant le gène codant pour la gpl9k, tous deux insérés au niveau de la région El du génome de ladénovirus.
23. Adénovirus selon les revendications 2 ou 3 caractérisé en ce que le ou les promoteurs transcriptionnels sont choisis parmi les promoteurs mammifères, eucaryotes ou viraux.
24. Adénovirus selon la revendication 23 caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi les promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, PGK, albumine, et les promoteurs induits par des cytokines.
25. Composition pharmaceutique comprenant au moins un adénovirus recombinant défectif selon l'une des revendications 1 à 24.
26. Composition pharmaceutique selon la revendication 25 comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable.
PCT/FR1995/001326 1994-10-17 1995-10-11 Adenovirus defectifs comprenant un gene therapeutique et un gene immunoprotecteur WO1996012030A1 (fr)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
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