WO1997018318A1 - Method for gene introduction into target cells by retrovirus - Google Patents

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Takashi Uemori
Takashi Ueno
Nobuto Koyama
Kimikazu Hashino
Ikunoshin Kato
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    • C12N2740/13045—Special targeting system for viral vectors

Definitions

  • the present invention provides a method for improving the efficiency of gene transfer into target cells in the fields of medicine, cell engineering, genetic engineering, and developmental engineering, and enabling efficient transformation of target cells, and a series of related methods.
  • About technology. Conventional technology Conventional technology
  • the retrovirus vector is a preferable gene transfer method particularly for gene therapy in which long-term gene expression is desired, since it efficiently introduces the desired foreign gene into cells and stably integrates it into its chromosomal DNA.
  • the vector has been variously modified so as not to adversely affect the organism into which the gene has been introduced. For example, the replication function in the vector is deleted so that the vector itself used for gene transfer replicates in cells and does not repeat unlimited infection (gene transfer).
  • bone marrow cells can be handled in vitro and contain hematopoietic stem cells with self-renewal ability, they are good target cells for somatic cell gene therapy. is there.
  • Umbilical cord blood has also been proven to contain numerous primitive progenitor cells, including hematopoietic stem cells.
  • Hematopoietic stem cells are one of the most difficult cells to transfect with high efficiency, despite the fact that many groups are conducting research.
  • the most efficient gene transfer protocol for hematopoietic stem cells in mice and other animals has been to co-culture hematopoietic stem cells with retrovirus-producing cells, but due to safety concerns, For clinical gene therapy in humans, gene transfer in a cell-free system with low risk of contamination with retrovirus-producing cells is desired.
  • efficient gene transfer into hematopoietic stem cells without co-culture with retrovirus-producing cells is not easy.
  • fibronectin a component of the extracellular matrix, and its fragment alone improve the efficiency of gene transfer into cells by retrovirus (J. Clin. Invest. Volume, pp. 1451-1457, 1994, Blood, 88, 855-862, 1996). Genetically produced fibronectin fragments also have similar properties, and can be used to efficiently introduce foreign genes into hematopoietic stem cells.
  • the above-described gene transfer method using fibronectin or fibronectin fragment is considered to be achieved by fibronectin or a fragment thereof having a retrovirus binding site and a target cell site on the same molecule (Nature Medicine) , Vol. 2, pp. 876-872, 1996). Therefore, in order to efficiently introduce a gene into various target cells by applying the above method, it is necessary to prepare a functional substance having a virus-cell binding site on one molecule depending on the cell. Yes, there are still problems in using it as a universal gene transfer method.
  • the above method is achieved by immobilizing fibronectin or fibronectin fragment on the surface of a plate used for culturing target cells during retrovirus infection. It requires complicated operations and cannot be said to be a simple gene transfer method.
  • the functional substances used in the above method are limited to those containing a fibronectin-derived heparin binding region as a retrovirus binding site. Therefore, finding other retrovirus-binding substances may lead to the development of even better gene transfer methods.
  • the present invention solves such a problem and provides a simpler and more efficient gene transfer. It is intended to provide a law. Summary of the Invention
  • the present inventors have found that a retroviral infection promoting effect by a functional substance represented by fibronectin or a fragment thereof is strong, and a region having a retrovirus binding site and a region having a cell binding site are present on the same molecule. Found to be acceptable even in the absence. That is, by mixing and using an effective amount of a functional substance having a retrovirus binding site and a functional substance having a binding site to a target cell for gene transfer, retrovirus-mediated gene transfer to the target cell can be performed. It has been found that the introduction efficiency can be improved.
  • the present inventors have also found that the function of promoting a retrovirus infection by a functional substance is observed even when the functional substance is not immobilized on the plate surface. They also found that the efficiency of gene transfer to target cells was improved when the retrovirus was brought into contact with target cells in the presence of beads to which a functional substance was immobilized.
  • the present inventors have also found a retrovirus-binding substance that does not contain a heparin-binding region derived from fibronectin, and that these substances and their derivatives are useful for retrovirus-mediated gene transfer into target cells. I did. Further, the present inventors have succeeded in creating a functional substance useful for introducing a gene into a target cell by a retrovirus, and have completed the present invention.
  • the first invention of the present invention relates to a method for improving the efficiency of introducing a gene into a target cell by a retrovirus.
  • Functionality Infecting target cells with a retrovirus in the presence of a mixture of the substance and another effective amount of a functional substance having a target cell binding site.
  • the functional substance having a retrovirus binding site of the first invention of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a heparin-II binding region of fibronectin, fibroblast growth factor, collagen, and polylysine. It is a functional substance selected from gin or a functional equivalent thereof.
  • the functional substance having a target cell binding site may be any substance containing a ligand that binds to a target cell.
  • Such ligands include cell adhesion proteins, hormones, cytokines, antibodies, sugar chains, carbohydrates, and metabolites of target cells.
  • Cell adhesion proteins include, for example, the fibronectin cell-binding domain polypeptide. .
  • As the cell binding region of the fibronectin is a region of the fibronectin.
  • Other ligands include erythropoietin.
  • the functional substance used in the first invention may be non-immobilized or may be immobilized.
  • the functional substance can be easily used by being immobilized on beads.
  • the first invention makes it possible to easily target gene transfer to the target cell. .
  • the retrovirus and the target cell have the same retroviral ligament site and target cell binding site. Co-location on a functional substance possessed on the molecule is essential in a mechanism for improving the efficiency of retrovirus gene transfer into target cells.
  • the present invention in the presence of a mixture of an effective amount of a functional substance having a retrovirus binding site and another effective amount of a functional substance having a target cell binding site, When gene transfer into target cells is performed by using the method, gene transfer efficiency is improved.
  • the second invention of the present invention relates to a method for retroviral target cells containing a mixture of an effective amount of a functional substance having a retrovirus binding site and another effective amount of a functional substance having a target cell binding site.
  • the present invention relates to a culture medium for target cells used for gene transfer.
  • the first invention can be easily carried out.
  • the third invention of the present invention relates to a method for arranging a retrovirus, wherein the method is contacted with a mixture of an effective amount of a functional substance having a retrovirus binding site and another effective amount of a functional substance having a target cell binding site.
  • the medium is characterized by incubating a medium containing the retrovirus.
  • a fourth invention of the present invention is a kit for use in carrying out retrovirus-mediated gene transfer into a target cell
  • each of the first and third embodiments can be easily performed.
  • the fifth invention of the present invention relates to a method for improving the efficiency of gene transfer into target cells by a retrovirus, and relates to a target cell binding site, a fibroblast growth factor, collagen, Are polylysine-derived retrovirus binding sites or functional equivalents
  • a method for improving gene transfer to a target cell by a retrovirus comprising infecting the target cell with the retrovirus in the presence of an effective amount of a functional substance having the same substance on the same molecule. .
  • the most efficient substances that can be used in a method for improving gene transfer into target cells by retrovirus include: Fragments of fibronectin have been disclosed. However, fibronectin whether fragments what functional substance with functional substances other than I can be used in a method for improving gene transfer into target cells with high efficiency retrovirus, specific disclosure is not c particular, this In the conventional method, the retrovirus binding site only discloses fibronectin repeats 12-14.
  • the present inventors have reported that fibroblast growth factor, collagen, polylysine, and the like, which have no structural correlation with fibronectin repeats 12-14, surprisingly surprisingly target retrovirus target cells. It has been found that it can be used effectively in a method for improving gene transfer in E. coli. Therefore, it has a functional equivalent to these substances, that is, it has a retrovirus binding site functionally equivalent to these substances, and has the ability to improve the efficiency of gene transfer to target cells by retrovirus. Any of the substances can be used in the fifth invention.
  • a substance containing a ligand that binds to a target cell can be used as the target cell binding site, and this is bound to the retrovirus binding site.
  • Examples of the ligand include cell-adhesive proteins, hormones, cytokins, antibodies, sugar chains, carbohydrates, and metabolites of target cells.
  • a cell adhesive protein is a fibronectin cell anchoring region polypeptide.
  • a polypeptide binding region to VLA-5 and Z or VLA-4 can be used.
  • Other ligands include erythropoietin.
  • the fibroblast growth factor used as a retrovirus binding site includes, for example, a fibroblast growth factor represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, a functional equivalent of the factor, There is a fibroblast growth factor selected from polypeptides containing the factor or a functional equivalent of the factor.
  • Examples of these functional substances include a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5 in the sequence listing.
  • the collagen used as a retrovirus binding site includes, for example, a fragment containing an insulin binding site derived from type V collagen, a functional equivalent of the fragment, and the fragment.
  • a collagen selected from polypeptides containing a functional equivalent of the fragment examples include a fragment containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • These functional substances include polypeptides having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8 in the sequence listing.
  • the polylysine used as a retrovirus binding site is a polymer of L-lysine (lysine), for example, a polylysine having a more suitable degree of polymerization than a commercially available polylysine. Can be selected and used.
  • the retrovirus binding site derived from fibroblast growth factor, collagen or polylysine has a target cell binding site at the same time, the retrovirus binding site derived from fibroblast growth factor, collagen or polylysine is used.
  • the retrovirus binding site derived from fibroblast growth factor, collagen or polylysine is used.
  • the retrovirus binding site derived from fibroblast growth factor, collagen or polylysine is used.
  • the target cell is an adherent cell
  • the retrovirus and the target cell respectively bind and adhere to the functional substance, and have a retrovirus binding site derived from this fibroblast growth factor, collagen or polylysine.
  • the efficiency of gene transfer to the target cells by the retrovirus can be improved.
  • H-271 When the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (hereinafter, referred to as H-271) has a target cell binding site at the same time, that is, when the target cell is the polypeptide, H-27 1, even in cases where there is a clotting effect, by infecting target cells with a retrovirus in the presence of an effective amount of this polypeptide, it is possible to improve the efficiency of gene transfer to the target cells by the retrovirus. I also found what I could do.
  • fibronectin repeats 12-14 are disclosed as retrovirus anchorage sites.
  • H-271 was targeted. It has been found that, depending on the type of cell, it functions effectively as a target cell binding site to enhance the efficiency of retrovirus gene transfer into target cells.
  • the retrovirus and the target cells bind to and adhere to the polypeptide, and the target cells are treated with the retrovirus in the presence of an effective amount of the polypeptide. It has also been found that infection can improve the efficiency of gene transfer into target cells by the retrovirus.
  • the functional substance may be immobilized or may not be immobilized.
  • the target cell is an adherent cell, the functional substance This is an efficient method.
  • the sixth invention of the present invention provides an effective method comprising having a target cell binding site, a retrovirus binding site derived from fibroblast growth factor, collagen or polylysine, or a functional equivalent thereof on the same molecule.
  • the present invention relates to a culture medium for target cells used for gene transfer into target cells by a retrovirus containing an amount of a functional substance.
  • a seventh invention of the present invention is to incubate a medium containing a retrovirus in contact with an effective amount of a functional substance having a retrovirus binding site derived from fibroblast growth factor, collagen or polylysine as described above. It relates to a method of arranging retroviruses. These functional substances can be effectively used for arranging retroviruses in a method for improving gene transfer into target cells by retrovirus.
  • the target cell binding site and the retrovirus binding site derived from fibroblast growth factor, collagen or polylysine, or a functional equivalent thereof are present on the same molecule. Includes incubating a medium containing the retrovirus in contact with an effective amount of the functional substance.
  • An eighth invention of the present invention is a kit for use in carrying out retrovirus-mediated gene transfer into a target cell
  • the present invention relates to a kit characterized by comprising:
  • the inventions of the first and fifth methods, the inventions of the second and sixth culture media, the inventions of the third and seventh methods, and the inventions of the fourth and eighth kits are all functional.
  • a bead-immobilized substance of the substance can be suitably used.
  • the ninth invention of the present invention relates to a method for improving the efficiency of gene transfer into target cells by a retrovirus, and relates to substantially pure fibronectin and substantially pure fibronectin in gene transfer to target cells by a retrovirus.
  • the method is characterized in that a target cell is infected with a retrovirus in the presence of a functional substance immobilized in an effective amount of a bead selected from Nectin fragments and mixtures thereof.
  • the tenth invention of the present invention also relates to a method for improving the efficiency of gene transfer into a target cell by a retrovirus.
  • substantially pure fibronectin substantially pure fibronectin is used.
  • the method is characterized in that a target cell is infected with a retrovirus in the presence of an effective amount of a non-immobilized functional substance selected from a Lonectin fragment and a mixture thereof.
  • the retrovirus and the target cell are co-located on a functional substance having a retrovirus binding site and a target cell binding site on the same molecule. Is essential in a mechanism for improving the efficiency of gene transfer into target cells by retroviruses.
  • the retrovirus anchoring site and the target cell anchoring site are combined. It becomes possible only by immobilizing a functional substance having a site on the same molecule to a culture medium.
  • the retrovirus binding site Even if a functional substance having a target cell binding site and a target cell binding site on the same molecule is not immobilized on a culture medium, the efficiency of gene transfer to target cells by retroviruses can be efficiently improved.
  • the target cells include, for example, stem cells, hematopoietic cells, non-adhesive low-density mononuclear cells, adherent cells, bone marrow cells, hematopoietic cells.
  • Stem cells peripheral blood stem cells, umbilical cord blood cells, fetal hematopoietic stem cells, embryogenic stem cells, embryonic cells, primordial germ cells, primordial germ cells, oocytes, oocyte, oocytes, spermatocytes , Spermatozoa, CD34 + cells, C-kit + cells, pluripotent hematopoietic progenitor cells, monopotent hematopoietic progenitor cells, erythroid progenitor cells, lymphocyte mother cells, mature blood cells, lymphocyte, B cells Cells, T cells, fibroblasts, neuroblasts, neurons, endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatocytes, myoblasts, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cancer cells, myeloma cells and leukemia cells Can be used.
  • a retrovirus containing a foreign gene can be used as a retrovirus.
  • Recombinant retroviral vectors can be used.
  • retrovirus for example, a recombinant retrovirus vector deficient in replication ability can be used.
  • the eleventh invention of the present invention relates to the transgenic cell obtained in the first, fifth, ninth and tenth inventions.
  • the twelfth invention of the present invention relates to a cell transplantation method for transplanting the gene-introduced cell of the eleventh invention into a vertebrate.
  • the thirteenth invention of the present invention relates to a polypeptide for improving the efficiency of introducing a retrovirus represented by SEQ ID NO: 13 into a target cell into a target cell or a functional equivalent thereof.
  • the fifteenth invention of the present invention relates to a gene encoding the polypeptide of the thirteenth invention.
  • a gene represented by SEQ ID NO: 17 in the sequence listing or a polypeptide that hybridizes to the gene under strict conditions and improves the efficiency of introduction of a gene into target cells by retrovirus. Gene to be administered.
  • CH-296 can be most efficiently used for gene transfer.
  • the present inventors have surprisingly found that the above-mentioned polypeptide having no VLA-5 binding site and no VLA-4 binding site can be used for the present invention.
  • the fifteenth invention of the present invention relates to a polypeptide or a functional equivalent thereof which improves the efficiency of gene transfer into target cells by a retrovirus represented by SEQ ID NO: 30 in the sequence listing.
  • the sixteenth invention of the present invention relates to a gene encoding the polypeptide of the fifteenth invention.
  • a gene represented by SEQ ID NO: 33 in the sequence listing or a polypeptide which hybridizes to the gene under strict conditions and improves the efficiency of gene transfer into target cells by retroviruses. Gene to be administered.
  • the seventeenth invention of the present invention relates to a polypeptide or a functional equivalent thereof, which improves the efficiency of gene transfer into target cells by the retrovirus represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
  • the eighteenth invention of the present invention relates to a gene encoding the polypeptide of the seventeenth invention.
  • An example of such a gene is represented by SEQ ID NO: 26 in the sequence listing.
  • Gene transfer method of the present invention is usually recombinant retrovirus vectors are used, in particular, c the vector replication-defective recombinant retrovirus vector is preferably replication so that it can not self-replicate in an infected cell It is non-pathogenic due to a loss of function.
  • These vectors can invade vertebrate cells, particularly host cells such as mammalian cells, and stably integrate the foreign gene inserted into the vector into their chromosomal DNA.
  • a foreign gene to be introduced into a cell is inserted into a recombinant retrovirus vector under the control of an appropriate promoter, for example, an LTR promoter or a foreign promoter present in a retrovirus vector.
  • an appropriate promoter for example, an LTR promoter or a foreign promoter present in a retrovirus vector.
  • a promoter and other regulatory elements that cooperate with the transcription start site to achieve transcription of the foreign gene may be present in the vector, for example, an enhancer sequence.
  • the introduced gene may contain a terminator sequence downstream thereof.
  • the foreign gene to be introduced may be natural or artificially created, or a DNA molecule of a different origin ligated by ligation or other means known in the art. It may be.
  • any gene desired to be introduced into a cell can be selected.
  • foreign genes include enzymes, proteins, antisense nucleic acids or ribozymes or false primers (eg, WO 90 13641), intracellular antibodies (for example, see W094 / 02610), and those encoding growth factors and the like can be used.
  • the retrovirus vector used in the present invention may have an appropriate marker gene that enables selection of a cell into which the gene has been introduced.
  • an appropriate marker gene for example, a drug resistance gene that confers resistance to an antibiotic on a cell or a reporter gene that can identify a cell into which a gene has been introduced by detecting enzyme activity can be used.
  • Vectors that can be used include, for example, retrovirus vectors such as the well-known MFG vector (ATCC No. 68754) and ⁇ -SGC (ATCC No. 68755).
  • retrovirus vectors such as the well-known MFG vector (ATCC No. 68754) and ⁇ -SGC (ATCC No. 68755).
  • the N2 / ZipTKNE0 vector TKNEO, Blood. Vol. 78, pp. 310-317, 1991
  • PM5 neo vector Exp. Hematol., Vol. 23
  • cells transfected with these vectors can be identified as cells resistant to antibiotics (neomycin, G418, etc.) inactivated by the gene product.
  • these vectors are known packaging cell lines, such as known PG13 (ATCC CRL-10686) ⁇ PG13 / Lc8 (ATC CRL-10685), PM317 (ATCC CRL-9078) and By using the cell lines described in U.S. Pat. No. 5,278,056, such as GP + E-86 (ATCC CRL 9642) and GP + en vAm-12 (ATCC CRL 9641), the vector can be packaged. Can be prepared as coated virus particles.
  • the effective amount of the functional substance refers to the retroviral standard.
  • the amount is an amount effective to cause transformation of the target cell by gene transfer into target cells, and can be selected by the method described in this specification depending on the functional substance used, the retrovirus and the type of target cell. it can.
  • the gene transfer efficiency means the transformation efficiency.
  • these assays measure the extent to which the retrovirus particles bind to the functional material that can be used according to the invention immobilized on the matrix, so that the retrovirus resists rinsing from the matrix.
  • a virus-containing supernatant is incubated in a well containing a fixed material of a functional substance having a retrovirus binding site. Then, the wells are thoroughly washed with a physiological saline buffer, and then the target cells are incubated in the wells, and the infectivity of the virus remaining in the wells is measured. The reduction in infectious activity or titer is assessed relative to the virus supernatant initially added to the wells and compared to similar control runs (eg, using BSA-immobilized wells).
  • the viral vector may contain a selectable marker gene.
  • Functional materials having such a retrovirus binding site include phytoviruses.
  • the binding between the cell binding site of the functional substance used in the present invention, that is, the substance containing the ligand capable of binding to the target cell, and the cell can be similarly performed using a conventional method.
  • a functional substance having a cell-binding site is immobilized on a culture plate, and a cell population to be cultivated is overlaid on a medium for 30 minutes to 2 hours. After this incubation period, cells that have not adhered to the functional material are collected, counted, and assayed for viability. Cells that adhere to the functional material are also harvested using trypsin or cell dissociation buffer (eg, Gibco), counted, and tested for viability.
  • trypsin or cell dissociation buffer eg, Gibco
  • the cells are cultured for an additional 12 to 14 days to confirm the colony forming properties of the cells.
  • the percentage of adherent cells is then calculated and compared to a standard or standard control, such as a culture plate on which serum albumin (BSA) is immobilized.
  • BSA serum albumin
  • the combination of functional substance cells is suitable for the present invention due to the substantial binding of the target cell to the functional substance that has been established, and the functional substance having the target cell binding site is replaced with a functional substance having a retrovirus binding site.
  • the functional substance used in the present invention can be constructed.
  • a retrovirus binding site derived from fibroblast growth factor, collagen or polylysine can be selected.
  • a ligand that has a target cell binding site and has a retrovirus-binding activity Or any substance that enhances the efficiency of retrovirus gene transfer in a target cell in the presence of a retrovirus is included in the functional equivalent of a retroviral tether derived from fibroblast growth factor, collagen or polylysine .
  • the target cell used in the gene transfer method of the present invention can be obtained by binding or coexisting the selected functional substance having a retrovirus binding site with a functional substance having a target cell binding site.
  • the effective amount of the functional substance used in the present invention can be determined by measuring the improvement of the gene transfer efficiency using a retrovirus.
  • One embodiment of the present invention is a method for increasing the efficiency of introducing a gene into a target cell by a retroviral vector. This method is based on the coexistence of a mixture of a functional substance having a retrovirus binding site and another functional substance having a target cell binding site, which is effective for increasing the efficiency of gene transfer into cells by a retrovirus vector. The method is characterized by infecting a viable target cell with a retroviral vector below.
  • This method can be used as a method for obtaining a transfected cell into which a gene has been transfected by a retrovirus vector, and allows the gene to be introduced into a living individual by transplanting the cell into the living individual.
  • the functional substance having a retrovirus binding site to be used is not particularly limited, and examples thereof include the heparin-II binding region of fibronectin, fibroblast growth factor, collagen, polylysine, and the like.
  • a substance functionally equivalent to the functional substance for example, a functional substance having a heparin binding site can also be used.
  • a mixture of the functional substance, a polypeptide containing the functional substance, a polymer of the functional substance, a derivative of the functional substance, and the like can be used.
  • These functional substances are derived from naturally occurring substances. It can be made artificially (for example, by genetic recombination technology or chemical chemistry technology), and can be used to mix naturally-occurring substances with artificially produced substances. It can also be produced by a combination.
  • the functional substance to be used may be of natural origin as long as it has a retrovirus binding site and Z or a target cell binding site capable of achieving gene transfer with high efficiency as described herein.
  • the amino acid sequence of the polypeptide may have a mutation.
  • the desired retrovirus binding A polypeptide is referred to as a functional equivalent of a polypeptide having a native amino acid sequence as long as it has a site and / or a target cell binding site.
  • the gene encoding the functional equivalent can be obtained by searching for a gene that hybridizes to the gene encoding the above-mentioned functional substance.
  • a protein having an activity similar to this enzyme can be obtained.
  • Encoding genes can be screened.
  • a DNA fragment containing only a part of the target gene may be obtained.
  • the nucleotide sequence of the obtained DNA fragment is examined to determine that the DNA fragment is a part of the target gene.
  • Part of the DNA fragment, and the ability to perform hybridization using the DNA fragment or a part thereof as a probe, or PCR using a primer synthesized based on the nucleotide sequence of the DNA fragment By doing so, the entire target gene can be obtained.
  • the above hybridization can be performed, for example, under the following conditions.
  • the DNA-immobilized membrane was prepared using 0.5% SDS, 0.1% perserum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400, 0.01% denatured salmon sperm DN In 6 SSC containing A (Ix SSC is 0.15M NaC and 0.015M sodium citrate, ⁇ 7.0) at 50 ° C for 12-20 hours with the probe Incubate. After incubation, start with a wash at 37 ° C in 2 x SSC with 0.5% SDS, the concentration of 55% varies up to 0.1 lx and the temperature varies up to 50 ° C. And wash the membrane until the signal from the immobilized DNA can be distinguished from the background.
  • BSA perserum albumin
  • Ficoll 400 0.1%
  • denatured salmon sperm DN In 6 SSC containing A Ix SSC is 0.15M NaC and 0.015M sodium citrate, ⁇ 7.0
  • the activity of the protein encoded in the new gene obtained in this manner is examined by the same method as described above to confirm whether the obtained gene is the target gene.
  • the heparin-II binding region of fibronectin is a polypeptide having a retroviral anchorage site. Fibroblast growth factor, collagen and polylysine are fibronectin Although there is no structural similarity (eg, similarity in the amino acid sequence) between the Perrin-II binding region, we believe that these materials have a retrovirus binding site. I found what I was doing.
  • the functional substance having a target cell binding site used in the present invention is also not particularly limited, and is a substance having a ligand that binds to a target cell.
  • the ligand include cell-adhesive proteins, hormones, cytokines, Examples include antibodies against cell surface antigens, polysaccharides and glycoproteins, sugar chains in glycolipids, and metabolites of target cells.
  • a polypeptide containing the functional substance, a polymer of the functional substance, a derivative of the functional substance, a functional equivalent of the functional substance, and the like can also be used.
  • These functional substances can be obtained from naturally-occurring substances, or can be artificially produced (for example, by genetic recombination technology or chemical synthesis technology).
  • Cell adhesion proteins used include fibronectin and its fragments.
  • the cell binding domain of human fibronectin corresponding to Pr 0123-Ser 1515 described in U.S. Pat. No. 5,198.443 is the polypeptide C12 described herein. It has a function equivalent to that of 74 and has been shown to bind to BHK and B16-F10 cells and the like (J. Biochera., Vol. 110, pp. 285-291, 1991). Year) .
  • the RGDS 4-amino acid sequence present in these polypeptides is a ligand for the VLA-5 receptor.
  • VLA-5 receptor expression is better expressed in undifferentiated cells than in the differentiated cells seen in a wide range of cells.
  • the CS-1 region in fibronectin is known as a ligand for the VLA-4 receptor, and cells expressing the receptor (T cells, B cells, monocytes, NK cells, eosinophils, basophils) Sphere, thymocyte, myeloid monocyte, erythroid progenitor Cells, lymphocyte precursor cells, melanoma, muscle cells, etc.).
  • the polypeptide described in No. 3-2870470 which is represented by SEQ ID NO: 29 in the sequence listing (hereinafter referred to as C277-CS1), has the above-mentioned VLA-5.
  • a polypeptide containing both ligands of 4 receptors which can be used in the method of the present invention for introducing genes into cells having these receptors.
  • the heparin-II region has been shown to bind to fibroblasts, endothelial cells and tumor cells.
  • the heparin-II region cell binding site polypeptide sequence directs retrovirus vector infection to predetermined cells in the presence of the polypeptide, a functional substance with a retrovirus binding site Above.
  • Hormones and cytokines having cell-specific actions are suitable as the functional substance having a cell binding site used in the method of the present invention.
  • erythrobotine a hematopoietic cytokine
  • Erythropoietin can be prepared and used by known methods. It is also possible to use a functional equivalent of the erythropoietin and a polypeptide containing erythropoietin or a functional equivalent of the erythropoietin.
  • a functional substance having a retrovirus binding activity for example, H-271 or fibroblast growth factor
  • a fibronectin-derived polypeptide C-27 having a cell binding activity When used in a mixture of 4 and the like, high gene transfer efficiency can be obtained.
  • the NI 11-3 cells used in these experiments express the VLA-5 receptor that can bind to 2274, and the interaction between the two contributes to an improvement in gene transfer efficiency.
  • a functional substance having a retrovirus binding site is used as a mixture with a functional substance having a binding site to another target cell.
  • the efficiency of gene transfer by the retrovirus vector into target cells having an affinity for the functional substance can be significantly increased.
  • One advantage of the present invention is that it is possible to avoid co-culture with virus-producing cells by improving gene transfer efficiency in this way.
  • Means for selectively introducing genes into target cells have high utility, and various methods have been studied so far.For example, substances that bind to receptors on the surface of target cells and DNA binding Non-Winorestor molecular conjugation vector) combined with a toxic substance.
  • retrovirus vectors which are commonly used as vectors capable of integrating genes into chromosomes, and to infect them with specific cells.
  • Gene transfer into hepatocytes by chemical modification and lactose binding J. Biol. Chem., 266, pp. 14143-14146, 1991
  • an envelope protein as a fusion protein with erythropoietin And the like utilizing recombinant virus particles having the following have been developed.
  • special virus particles need to be prepared depending on the target cells.
  • chemical modification of virus particles requires complicated operations and may inactivate viruses.
  • genetically modified virus envelopes do not always have the necessary functions (for target cells). And the construction of virus particles) are not always obtained.
  • the above-mentioned WO95 / 262000 aims to provide a retrovirus vector which is not specially modified in the presence of a fibronectin fragment to which an appropriate ligand having cell-binding activity is covalently bound. It has been suggested that it can be introduced into cells. However, in this method, a functional molecule having both a virus binding activity and a cell binding activity is used, so that an individual functional substance must be prepared for each target cell. Moreover, it is not clear whether the prepared functional substance retains both activities, and so on.
  • the combination of the functional substance having a retrovirus binding site according to the present invention and another functional substance having a binding site to a target cell can be used for a gene delivery system using a retrovirus vector to a wide range of cell types. Can be provided.
  • a functional substance having a retrovirus binding site and a functional substance having a binding site with a target cell are covalently bound. You don't need to be. Therefore, a specific functional substance in which a functional substance having a retrovirus anchorage site and a functional substance having a binding site with a target cell are covalently bonded to each target cell is produced. It is not necessary, and gene transfer into target cells can be performed easily and efficiently. Examples of gene transfer into target cells using the method of the present invention include gene transfer into hematopoietic cells. It is known that the CS-1 cell adhesion region of fibronectin is useful for gene transfer into hematopoietic stem cells.
  • cytokines are involved in the differentiation of hematopoietic cells in addition to the above-mentioned erythropoietin. System
  • G-CSF G-CSF
  • megablasts and granulocyte precursor cells can be targeted.
  • gene transfer can also be performed targeting these cells.
  • HER-2 and HER-4 receptors are overexpressed in certain types of lung cancer cells (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 92, No. 9747-9571). P. 1995). Therefore, it is possible to control the growth of lung cancer cells by combining a ligand for the receptor, heregulin, with a functional substance containing a retrovirus binding site.
  • thyroid (cancer) cells contain iodine-containing functional substances
  • liver (cancer) cells contain high-density lipoprotein (HDL)
  • HDL high-density lipoprotein
  • a partially-containing functional substance it can be targeted for gene transfer.
  • an antibody against an antigen present on the surface of a target cell preferably a monoclonal antibody as a functional substance having cell binding activity, it is possible to target any cell from which the antibody can be obtained. It becomes possible.
  • a wide variety of cells can be targeted by using the method for arranging a retroviral vector and target cells disclosed by the present invention.
  • gene transfer is performed using a novel functional substance.
  • the region itself has a binding site for a specific cell, and this activity may not be desirable depending on the target cell.
  • the purpose can be achieved by replacing this binding site with another target cell binding site.
  • the availability of a plurality of functional substances having different properties leads to broadening the application range of the gene therapy according to the present invention, and it is possible to easily target a target cell. it can.
  • Examples of the functional substance having a novel retrovirus binding site provided by the present invention include fibroblast growth factor, a polypeptide containing the factor, a collagen fragment, a mixture of the fragment, and the fragment. And a polymer of the functional substance. Also, polylysine can be used for the purpose of the present invention. These functional substances can be obtained from substances of natural origin and artificially produced (for example, It can be produced by a genetic recombination technique or a chemical synthesis technique), and can also be produced by a combination of a naturally occurring substance and a chemically synthesized substance. The functional substance can be used in the gene transfer method of the first invention of the present invention, and a chimeric molecule of the functional substance and a functional substance having a cell binding activity is also useful for gene transfer into cells. It is.
  • fibroblast growth factor used in the present invention a substantially purified natural product may be used, or a genetically engineered product may be used.
  • the fibroblast growth factor represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing can be used, and further, a derivative modified without impairing the function of these polypeptides can be used.
  • An example of the fibroblast growth factor derivative is a polypeptide represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing (hereinafter referred to as C-FGF'A). This is a polypeptide in which the fibronectin cell adhesion site polypeptide is bound to the N-terminus of the fibroblast growth factor represented by SEQ ID NO: 3, and described in US Patent No. 5,302,701.
  • the polypeptide is described in the United States Patent as FERMP-1 266 37, and is currently under the Budapest Treaty under the accession number FERMBP-52878, 1-3 1-3 Tsukuba East, Ibaraki Prefecture It can be obtained by using Escherichia coli (originally deposited on December 9, 1991) deposited at the National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH) of the Ministry of International Trade and Industry of the Ministry of International Trade and Industry of Japan.
  • NIBH National Institute of Bioscience and Human Technology
  • C-FGF-CS1 fibronectin-derived CS-1 cell contact represented by SEQ ID NO: 5
  • C-FGF-CS1 The above-mentioned derivative polypeptide of C-FGF ⁇ A (hereinafter referred to as C-FGF-CS1) having an attachment region is obtained from the above-mentioned 1-3-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki Pref.
  • This C-FGF-CS1 which can be obtained in ( 1) is particularly useful in gene transfer into target cells having CS-1 binding property, particularly hematopoietic stem cells.
  • collagen fragment a substantially purified fragment obtained by enzymatically or chemically decomposing natural collagen may be used, or a fragment produced by genetic engineering may be used. . Furthermore, those modified without impairing the function of these fragments can also be used.
  • human V-type collagen has a strong insulin binding activity (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-209899), and as a polypeptide containing an insulin binding site, amino acid represented by SEQ ID NO: 28 in the sequence listing is available.
  • SEQ ID NO: 28 amino acid represented by SEQ ID NO: 28 in the sequence listing is available.
  • Co IV polypeptide containing an acid sequence
  • Co 1 V can be prepared by the method disclosed in the examples of the present application.
  • Polypeptide represented by SEQ ID NO: 7 (hereinafter referred to as C277—C01V) is a polypeptide containing Co1V, which is a cell adhesion site of fibronectin at the N-terminus of ColV. It is a polypeptide to which a polypeptide is bound, and can be produced by genetic engineering as described in the above-mentioned JP-A-5-97698.
  • C 277—Co 1 V is listed in the publication as F ERM P-12560, and is currently under the Budapest Treaty under the accession number of F ERM B P-5277 No. 1-1 Tsukuba East, Ibaraki Prefecture No. 3 Escherichia coli deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry (Hara Deposit: October 7, 1991) can be obtained.
  • C-C01V-CS1 having a fibronectin-derived CS-1 cell adhesion region represented by SEQ ID NO: 8 is as follows: It can be manufactured by the method shown in FIG.
  • the plasmid pCH102 prepared from the above-mentioned method is type II, and is amplified by PCR using primers CS 1-S (SEQ ID NO: 9 whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 9) and M4.
  • the DNA fragment is isolated after digestion with the restriction enzymes Nhe I and Sal I.
  • a plasmid pTF7520Co1V containing the gene encoding the C277-Co1V and prepared from the E. coli FERM BP-5277 was used as a The DNA fragment amplified by the reaction is isolated after digestion with restriction enzymes AccIII and NheI.
  • SEQ ID NOS: 10 and 12 in the sequence listing show the respective nucleotide sequences of CF and CNR.
  • the recombinant plasmid has a CS-1 cell adhesion region on the C-terminal side of C277-Co1V, the second glutamate from the C-terminal of C01V is alanine, and the C-terminal threonine. Encodes a polypeptide substituted with serine, C—Co 1 V—CS1. After culturing Escherichia coli transformed with this plasmid, the desired polypeptide can be obtained from the culture.
  • This C-C01V-CS1 is inherited to target cells with CS-1 binding, especially to stem cells. It is particularly useful in introducing children.
  • a polylysine having an appropriate weight can be selected from commercially available polylysines and used.
  • derivatives of the above-mentioned functional substances can also be used.
  • the above-mentioned C-FGF—CS 1 or its functional equivalent, C_Co 1 V—CS 1 or its functional equivalent are examples.
  • a functional equivalent of the derivative can also be produced genetically using a gene encoding the derivative and a gene encoding a functional equivalent of the derivative.
  • cysteine-functional substance useful for producing an inducer of the functional substance can be produced. Further, it is easy to bind a molecule having a retrovirus binding site, which is a cysteine-functional substance, to another molecule having a target cell binding site, which is a cysteine-functional substance. Furthermore, a conjugate with another functional substance can be prepared by utilizing the reactivity of the cysteine residue of the cysteine-containing functional substance.
  • gene transfer is carried out using a polymer of the retrovirus binding site polypeptide of fibronectin, which enhances the efficiency of gene transfer into target cells by the retrovirus vector.
  • the functional substance is a polypeptide having a plurality of heparin-II binding regions of human fibronectin in one molecule and a derivative of the polypeptide described in the above-mentioned W95 / 26200.
  • the functional substance used in the present invention may be a natural substance within a range having the same activity as the functional substance.
  • Ribeptide can include functional equivalents whose amino acid sequences are partially different.
  • polymer of the functional substance to be used examples include those obtained by enzymatically or chemically mounting the above-mentioned polypeptide derived from fibronectin, and those produced by genetic engineering.
  • a polypeptide having two heparin-II binding regions in a molecule of fibronectin a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing (hereinafter, referred to as H2-545) is used.
  • H2-545 a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing
  • polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 in the sequence listing is a derivative polypeptide (hereinafter referred to as CH 2) in which the cell adhesion site polypeptide of fibronectin is bonded to the N-terminus of H 2 -544. 2—8 2 6).
  • CH 2 a derivative polypeptide
  • the polypeptide can be obtained according to the methods described herein.
  • a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 in the sequence listing is a derivative polypeptide (hereinafter, referred to as H 2) in which the CS-1 cell adhesion region of fibronectin is bound to the C-terminus of H 2 -544.
  • H 2 S-573 having a CS-1 cell adhesion region is useful for gene transfer into hematopoietic stem cells.
  • the gene when the gene is introduced into a target cell using a retrovirus vector, the gene is introduced into a cell using a retrovirus vector. Infects a replication-defective recombinant retrovirus vector into viable target cells in the presence of a functional substance immobilized on beads, which is effective for improving the efficiency of transfection.
  • a gene transfer method using a plate on which a functional substance is immobilized is not a simple method.
  • the method in which the functional substance is immobilized on the beads has the following advantages.
  • the operation of fixing the functional substance to the beads can be performed in a smaller space than in the case of the plate, and the beads can be handled in a sealable container. Since the surface of the plate on which the functional substance is immobilized is exposed to air, it is necessary to pay attention to the deterioration of the functional substance due to drying during storage if the functional substance has low stability.
  • the beads can be stored suspended in solution, so there is no danger of drying. Furthermore, the use of beads increases the surface area where the functional substance is present, so that it is possible to obtain a higher gene transfer efficiency than using a plate.
  • the functional substance may be immobilized by a conventional method, for example, it may be immobilized on a target cell culture vessel, for example, may be immobilized on a cell culture bead. It can be selected according to the purpose.
  • the bead has, for example, a round or spherical core at the center, and the surface of the core is It may be coated with a hydrophilic polymer.
  • a material of the core polymer for example, those described in JP-T-Hei 8-51092 are exemplified.
  • biodegradable beads may be used, and beads to which these functional substances are immobilized may be administered in vivo. It is also an efficient method to use a mixture of beads in which a molecule having a retrovirus binding site is immobilized and beads in which another molecule having a target cell binding site is immobilized. .
  • kit described later which is designed for carrying out the method of the present invention, makes it possible to carry out gene transfer into cells extremely easily.
  • cells into which a gene has been introduced by the method of the present invention can be transplanted into a living body, whereby gene therapy for expressing a foreign gene in a living body can be performed.
  • gene therapy using hematopoietic stem cells as target cells can be performed by the following operations.
  • a material containing hematopoietic stem cells such as bone marrow tissue, peripheral blood, and umbilical cord blood
  • these materials can be used as they are for the gene transfer operation, but usually, the ability to prepare a mononuclear cell fraction containing hematopoietic stem cells by a method such as density gradient centrifugation, Purify hematopoietic stem cells using cell surface marker molecules such as and Z or C-kit.
  • the material to be treated is subjected to the method of the present invention, in particular, in the presence of a functional substance having a binding activity to hematopoietic stem cells.
  • the gene-transfected cells thus obtained can be transplanted into a recipient, for example, by intravenous administration.
  • Recipients can also perform allogeneic transplants, preferably donors themselves. For example, allogeneic transplants are performed using umbilical cord blood.
  • Gene therapy targeting hematopoietic stem cells complements genes that are missing or abnormal in patients, such as gene therapy for ADA deficiency and Gaucy I disease.
  • a drug resistance gene may be introduced into hematopoietic stem cells, for example, in order to alleviate the damage of hematopoietic cells caused by chemotherapeutic agents used for treating cancer or leukemia.
  • Hematopoietic stem cells are known to express the VLA-4 receptor, and it is possible to carry out gene transfer efficiently using the functional substance having a CS-1 cell adhesion region disclosed by the present invention. is there.
  • molecules such as CD34 and C-kit are also expressed on the surface of hematopoietic stem cells as described above. Antibodies against these molecules and stem cell factor (C-kit), which is a Gene transfer efficiency can also be improved by combining it with a functional substance having a binding site.
  • tumor vaccine therapy which introduces cytokine genes into cancer cells, removes their proliferative ability, returns them to the body of the patient, and enhances tumor immunity, has been studied (Human Gene Therapy, Vol. 5, pp. 153-164, 1994).
  • a functional substance having a high affinity for cancer cells By applying the method of the present invention using a functional substance having a high affinity for cancer cells, such gene therapy can be more effective. It will be fruitful.
  • T cells infected with HIV that causes AIDS are coded with nucleic acid molecules (antisense nucleic acid ribozyme, etc.) that interfere with HIV replication and gene expression. It has been considered to introduce a gene that causes the mutation (for example, J. Virol., 69, pp. 4045-4052, 1995).
  • Gene transfer into T cells is achieved by the method of the present invention using a functional substance that binds to a molecule present on the surface of T cells, such as an anti-CD4 antibody.
  • the method of the present invention does not require co-culture of target cells in the presence of retrovirus-producing cells, and does not use hexadimetrin bromide, which is problematic in clinical use in humans. Therefore, it can be said that it is suitable as a protocol for gene therapy in clinical practice.
  • embryogenic stem cells for example, primordial 'germ' cells, oocytes, oocytes, ova, spermatocytes, sperm, etc. are used as target cells.
  • oocytes for example, primordial 'germ' cells, oocytes, oocytes, ova, spermatocytes, sperm, etc.
  • sperm for example, embryogenic stem cells, primordial 'germ' cells, oocytes, oocytes, ova, spermatocytes, sperm, etc.
  • target cells for example, embryogenic stem cells, primordial 'germ' cells, oocytes, oocytes, ova, spermatocytes, sperm, etc.
  • simple creation of transgenic vertebrates can be mentioned.
  • the present invention also provides, as one embodiment thereof, a cell transplantation method for transplanting a transformed cell obtained by the method of the present invention into a vertebrate.
  • the vertebrates into which the transformed cells are transplanted include mammals (eg, mice, rats, rabbits, goats, bushes, rabbits, puppies, dogs, monkeys, chimpanzees, humans, etc.), birds ( Examples: chicks, turkeys, quails, ducks, ducks, etc.), reptiles (eg, snakes, ⁇ Turtles, etc.), amphibians (eg, lance, salamander, newt, etc.), fishes (eg, horse mackerel, mackerel, sea bass, Thailand, grouper, puri, tuna, salmon, trout, koi, fish, eel, flounder) , Sharks, rays, sturgeons, etc.).
  • mammals eg, mice, rats, rabbits, goats, bushes, rabbits, puppies, dogs,
  • the retroviral binding site of the functional substance used in the present invention allows efficient retroviral gene transfer.
  • a technique that does not have the limitations of the conventional method and that can efficiently introduce genetic material into vertebrate cells can be provided.
  • a substantially pure fibronectin, a substantially pure fibronectin fragment or a mixture thereof, having a retrovirus binding site and a target cell binding site in the same molecule having a retrovirus binding site and a target cell binding site in the same molecule.
  • An effective amount of a substance having an equivalent function is used as the functional substance.
  • Such a functional substance is a substance that transduces a gene with an efficiency equivalent to that of fibronectin, fibronectin fragment or a mixture thereof.
  • the novel retrovirus anchoring site according to the present invention described above is used.
  • the functional substance having the retrovirus binding site and the target cell anchoring site in the same molecule is, for example, a polypeptide represented by SEQ ID NOS: 21 and 22 in the sequence listing (hereinafter, respectively, CHV-181 and CHV-179).
  • peptides contain the type I analogous sequences (III-12-III-13, III-14) contained in H-271 and CHV-181 is III-112. .
  • the ⁇ -13 sequence was added to the C-terminal of the fibronectin cell adhesion polypeptide (Pro 1239—Ser 1515) via methionine. Things.
  • a plasmid for expressing the polypeptide CHV-181 can be constructed, for example, by the following method.
  • plasmid pHD101 containing a DNA fragment encoding the heparin-binding polypeptide (H-271) of fibronectin was transformed into Escherichia coli HBlOl / pHDIOl (FERM BP- 2264). After introducing H1ndill sites into the region encoding the C-terminus of the III-113 sequence on this plasmid by site-directed mutagenesis, this was digested with Nc0I and Hindill. A DNA fragment encoding the sequence of III, 112, II I-13 is obtained.
  • the plasmid vector PI ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -ompA1 is digested with HindIII and Sail to obtain a DNA fragment encoding the lipoprotein evening terminator region.
  • plasmid pTF7021 containing a DNA fragment encoding fibronectin cell adhesion polypeptide (C-279) was transformed into Escherichia coli JM109 / pTF7021 (FERM BP—1941).
  • NcoI and SalI After digestion of this plasmid with NcoI and SalI, a DNA fragment encoding the above-mentioned III-112 and III-113 sequences and a DNA fragment encoding the lipoprotein terminator region were added.
  • plasmid pCHV181 for expressing the polypeptide CHV-181 can be obtained.
  • SEQ ID No. 27 in the Sequence Listing shows the polypeptide CHV—1 on plasmid p CH V 181. The base sequence of the region encoding 81 is shown.
  • a plasmid for expressing the polypeptide CHV-179 can be constructed, for example, by the following method.
  • an Nc0I site was introduced into the region coding for the N-terminus of the III-13 sequence on the above plasmid pHD101 by a site-directed mutagenesis method. Digestion with Hindill to obtain a DNA fragment encoding the III-13, III-14 sequences. This is mixed with a DNA fragment encoding the lipoprotein terminator region and a plasmid pTF7520 digested with Nc0I and Sa1I to perform ligation. A plasmid pCHV179 for expressing the peptide CHV_179 can be obtained.
  • CHV-181 and CHV-179 can be obtained by culturing Escherichia coli transformed with the above-described plasmid, and then purifying the resulting culture.
  • the present invention provides a method comprising: (1) a mixture of an effective amount of a functional substance having a retrovirus binding site and another effective amount of a functional substance having a target cell binding site; Culture medium for target cells used for gene transfer to target cells by a retrovirus containing a functional substance having effective amounts of the above-described novel retrovirus binding site and target cell binding site in the same molecule of the present invention
  • the functional substance may be unfixed or immobilized.
  • the medium of the present invention can contain serum, cell growth factors necessary for growth of target cells, antibiotics for preventing contamination by microorganisms, and the like.
  • serum for example, in the case of NIH / 3T3 cells, 10% fetal serum (manufactured by Gibco), 50 units Zm1 penicillin, 50% g / m1 streptomycin (Both manufactured by Gibco) and Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, manufactured by JRH Biosciences) can be used as the culture medium.
  • the present invention provides (1) a mixture of a molecule having the above-described retrovirus binding site and another molecule having a target cell binding site, (2) a novel retrovirus according to the above-mentioned present invention. Incubate a functional substance having a virus binding site and a target cell binding site in the same molecule, or (3) a medium containing a retrovirus in contact with the functional substance having a retrovirus binding site described above. And a method for arranging retroviruses.
  • the functional substance may be immobilized or immobilized as described above.
  • Fin incubation can be carried out according to a conventional method, for example, it can be performed on 3 7, C_ ⁇ 2 concentration of 5% in humidity 9 9.5% conditions. These conditions can be appropriately adjusted according to the target cells to be used, and the culture time can be changed according to the cells and the purpose.
  • virus particles can be placed in a wide range of constructs that deliver the virus to target cells.
  • kits for use in performing retrovirus-mediated gene transfer into a target cell in another aspect of the present invention, there is provided a kit for use in performing retrovirus-mediated gene transfer into a target cell.
  • the kit is
  • the functional substance (a) may be non-immobilized or immobilized, and the kit further comprises a recombinant retrovirus used for gene transfer.
  • the vector may contain a necessary buffer or the like.
  • the artificial substrate a plate for cell culture, a petri dish, a flask, or the like can be used.
  • a polystyrene-made substrate can be used.
  • target cell growth factor such as interleukin-16 and stem cell factor are used for pre-stimulation when transferring genes to bone marrow cells or hematopoietic stem cells.
  • kits can be made into a dosage form such as a freeze-dried product, granule, tablet or the like, in addition to an aqueous solution, by a method known per se,
  • kit of the present invention for example, it is possible to obtain a transformed and viable target cell culture, and to easily carry out retrovirus-mediated gene transfer into target cells. Can be.
  • the present invention also provides the use of an effective amount of a non-immobilized product or a bead-immobilized product of a functional substance selected from substantially pure fibronectin, a substantially pure fibronectin fragment and a mixture thereof, or a polymer thereof. You And gene transfer into target cells by retrovirus.
  • the present invention includes the above CH2-826 and functional equivalents thereof. Further, the present invention provides a gene encoding CH2-826, an example of which is the gene represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing. The present invention also includes functional equivalents of these genes.
  • the present invention provides the above-mentioned CHV-181, and the present invention includes functional equivalents thereof.
  • the present invention also provides a gene encoding CHV-181, one example of which is the gene represented by SEQ ID NO: 27 in the sequence listing.
  • the present invention includes functional equivalents of this gene.
  • the present invention can also provide a polymer containing the polymer of the retrovirus binding site and / or the polymer of the target cell binding site.
  • Specific examples of the polymer include a polymer of fibroblast growth factor and a polymer of a polypeptide having an insulin binding site derived from type V collagen. Genes encoding these polymers are also provided.
  • the present invention is not limited by a particular theory, but by tying the retrovirus and the cell to their respective functional region sites, the gene transfer into the cell by the retrovirus can be achieved. That is, transformation is promoted.
  • Functional substances that bind to a retrovirus and are thus useful in the present invention include substantially pure fibronectin, substantially pure fibronectin fragment, or a mixture thereof.
  • the functional substance of the present invention having substantially the same function as described above improves the efficiency of retroviral gene transfer of target cells, that is, the transformation efficiency.
  • the fibronectin fragments described herein may be native or synthetic. It can be of origin, for example, Ruoslahti et al. (1981), J. Biol. Chem. 256: 7277; Patel and Lodish (1986), J. Cell. Biol. 102: 449; and substantially pure from materials of natural origin, as already described by Bernardi et al. (1987), J. Cell. Biol. 105: 489. It can be manufactured in form.
  • substantially pure fibronectin or fibronectin fragment herein means that they are essentially free of other proteins that are naturally present with fibronectin. .
  • the substantially pure fibronectin or fibronectin fragment described herein can also be produced from a genetically modified product, for example, as generally described in U.S. Pat.No.5,198.423. it can.
  • the recombinant fragments identified as H-271, H-296, CH-271 (SEQ ID NO: 23) and CH-296 (SEQ ID NO: 24) in the following Examples, and a method for obtaining them are described in this patent. It is described in detail in The C-274 fragment used in the examples below was obtained as described in US Pat. No. 5,102,988.
  • fibronectin fragments or starting materials for such fragments that can be used herein can be found in Kinizuka et al., J. Biochem. 110, 284-291 (1991) (which is hereby incorporated by reference in its entirety).
  • EMBO J., 4, 1755-1759 (1985) (which reports the structure of the human fibronectin gene); and Biochemistry, 25. , 4936-4941 (1986), which reports on the heparin-II binding region of human fibronectin.
  • a fibronectin fragment having both a CS-1 cell adhesion region and a heparin-II binding region is studied have shown that the efficiency of gene transfer into hematopoietic cells is significantly increased.
  • the fibronectin-related polypeptides described herein comprise amino acid sequences that provide the cell binding activity of the CS-1 cell adhesion region of fibronectin, and the heparin-II tether region of fibronectin that binds to viruses.
  • the virus-binding polypeptide used for enhancing the transformation with the retrovirus vector described in WO 95/26200 corresponds to (i) Alal690-Thrl960 in the heparin-II binding region of human fibronectin.
  • Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala
  • the retrovirus binding activity of the polypeptide (H-271) represented by SEQ ID NO: 1 in the above-mentioned sequence listing shows concentration dependence, and as shown in Example 8, CH- It shows activity substantially equivalent to 271. That is, it has been found by the present invention that a retrovirus and a target cell bind to at least one or more molecules of H-271 only in the presence of a high concentration of an effective amount of H-271. .
  • the strong binding between the retrovirus binding site and the retrovirus in the functional substance used in the present invention can be used to construct a delivery system for virus-based therapy in a wide range of cell types.
  • the polypeptide containing the retrovirus binding site of the functional substance used in the present invention may be bound to a substance containing an arbitrary cell binding site that confers target cell specificity as a construct, Alternatively, it may be allowed to coexist with a substance containing the cell adhesion site. That is, the functional substance having a retrovirus binding site and the functional substance having a cell binding site may be bound to each other, or may coexist as different molecules.
  • This method avoids the necessity of constructing a special retrovirus cell line for each target cell.
  • the selection of substances becomes easier. Therefore, by using the functional substance of the present invention, targeting specific to a target cell to be used can be easily carried out.
  • the method of the present invention using a mixture of functional substances having a binding site is extremely useful for improving the efficiency of gene transfer into target cells of interest.
  • a novel functional substance provided by the present invention is a method for improving the efficiency of gene transfer into target cells by a retrovirus and a related method. It is extremely useful in the technology described above.
  • GP + E-86 cells (ATC C CRL-9642) containing retrovirus plasmid and the PM5 neo vector (Exp. Hematol., Vol. 23, pp. 630-638, 1995) are 10% fetal embryos.
  • Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, JRH Biosciences) containing serum (FCS, Gibco) and 50 units of Znil penicillin and 50 / zgZml of streptomycin (both from Gibco) Cultured.
  • the DMEM used in the subsequent operations all contained penicillin at 50 units / ml and streptomycin at 50 gZmI.
  • the supernatant containing PM5 neovirus was prepared by adding 4 ml of DMEM containing 10% FCS to a plate (10 cm diameter gelatin-coated cell culture dish, manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.) on which the above producing cells were grown in a semi-confluent. It added, and harvested the c harvested culture supernatant prepared by 0.45 micron filter (manufactured by Mi Ripoa Co.) Delo spent with virus supernatant Sutotsuku after overnight incubation, one 80 ° until use C
  • GP + env Am-12 cells ATC C CRL-9641 were used. The same operation as above was performed to prepare a TKNE0 virus supernatant.
  • the virus titer of the supernatant was measured using NIH / 3T3 cells according to a standard method (J. Virol., 62, 1120-1124, 1988). You That is, DMEM containing 2000 NIH / 3T3 cells (AT CCCRL-168) was added per 1-well of a 6-well tissue culture plate, cultured overnight, and serially diluted. The virus supernatant and a final concentration of 7.5 g / ml of hexadimetrin * bromide (polybrene: manufactured by Aldrich) were added to each well.
  • polypeptide derived from human fibronectin, H-271 (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, whose amino acid sequence is shown) is a recombinant plasmid containing DNA encoding the polypeptide, pHD1 Prepared from Escherichia coli HB101 / pHD101 (FE RM BP—2264) by the method described in US Pat. No. 5,198,423. did.
  • polypeptide CH-271 (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 23 in the sequence listing) was prepared by the following method. That is, Escherichia coli, Escherichia coli HB101 / pCH101 (F ERM BP-27999) was used, and this was cultured by the method described in the above publication. 7 got 1.
  • polypeptide CH—296 (SEQ ID NO: 24 in the sequence listing) (Showing an acid sequence) was prepared by the following method. That is, using Escherichia coli, Escherichia coli HB101 / pCH102CFERMBP-2800), this was cultured by the method described in the above-mentioned publication, and CH-296 was obtained from the culture.
  • Polypeptide C-274 (SEQ ID NO: 25 in the sequence listing, whose amino acid sequence is shown) was prepared by the following method. That is, Escherichia coli JM109 / pTF7221 (FERM BP 1915) was used and cultured by the method described in US Pat. No. 5,102,988 to obtain C-274 from the culture.
  • polypeptide C277-CS1 (the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing) was prepared by the following method. That is, it is described as FERM P-11339 in Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-284700, and is currently under the Budapest Treaty. Using Escherichia coli HB101 / pCS25 (deposited on the original; stated on March 5, 1990) deposited with the Institute of Technology, Accession No. F ERM B P-5723, C277-CS1 was obtained from the culture.
  • Polypeptide C-FGF ⁇ A (the amino acid composition of which is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) was prepared according to the following method. That is, a recombinant plasmid containing DNA encoding the above polypeptide, Escherichia coli containing pYMH—CF ⁇ A, Escherichia coli JMl09 / pYMH-CF-A
  • a plasmid for expressing the polypeptide C-FGF-CS1 (the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) was constructed using Escherichia coli as a host.
  • Escherichia coli HB101 / pCH102 (FERM BP-2800) was cultured, and a plasmid PCH102 was prepared from the obtained cells by an alkali-SDS method.
  • This plasmid was designated as type I, primer M4 (Takara Shuzo) and primer Brimer CS showing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • the amplified DNA fragment in the reaction solution was recovered by ethanol precipitation.
  • the obtained DNA fragment was digested with Nhe USa1I (both from Takara Shuzo), agarose gel electrophoresis was performed to recover a DNA fragment of about 970 bp from the gel.
  • Escherichia coli JM109 / PYMH-CFA (FERM BP-5278) was cultured, and a plasmid pYMH-CFA was prepared from the obtained cells by an alkali-SDS method.
  • This plasmid was designated as type I, and PCR was performed using a primer, Primer, which has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 10 and a primer, FNR, which has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, followed by ethanol precipitation.
  • the amplified DNA fragment in the reaction solution was recovered.
  • the obtained DNA fragment was digested with Ec0 ⁇ 2I (Takara Shuzo) and NheI, followed by agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 320 bp was recovered from the gel.
  • the above plasmid pYMH—CF • ⁇ is digested with Eco 52 I and Sal1, and then subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the approximately 4.1 kb DNA fragment isolated is subjected to the above approximately 970 bp DNA fragment.
  • the fragment and the DNA fragment of about 32 Obp were mixed and ligated, and the resulting recombinant plasmid was introduced into E. coli JMl09. Plasmid was prepared from the obtained transformant, and one containing each of the above three DNA fragments was selected and named as plasmid pCFS100.
  • Escherichia coli JMl09 transformed with the plasmid pCFS100 was named Escherichia coli JM109 / pCFS100.
  • Plasmid p CF S100 is a polypeptide with a CS-1 cell adhesion region derived from fipronectin at the C-terminal side of C-FGF.A, and alanine substituted for the second lysine from the C-terminal of FGF. , C-I code FGF-CS1.
  • Polypeptide C-FGF_CS1 was prepared according to the method described below. That is, the above Escherichia coli, Escherichia coli JM109 / pCFS100, was placed in 5 LB LB medium containing 100 / gZml of ampicillin in 3 ml. For 8 hours. This preculture solution was inoculated into 50 Oml of an 8 medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin and lmM of Iju-cho, cultured overnight at 37 ° C., and collected.
  • the obtained cells were suspended in 10 ml of PBS (phosphate-buffered saline) containing 0.5 M NaCl, lmM PMSF, and 0.05% Nonidet P-40, and sonicated. After crushing, centrifugation was performed to obtain a supernatant. The supernatant was applied to a high-trap column previously equilibrated with PBS containing 0.5 M NaCl, and the unadsorbed fraction was washed with PBS containing 0.5 M NaCl. The adsorbed fraction was eluted with PBS having a NaC1 concentration gradient.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the eluate was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and fractions containing a polypeptide of about 50 kd were collected to prepare purified C-FGF-CS1, which was used in the following procedures.
  • the amino acid sequence from the N-terminal to the fifth position of the purified C-FGF-CS1 thus obtained was examined, it was identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
  • the molecular weight of purified C-FGF-CS1 measured by mass spectrometry was also consistent with that expected from the above amino acid sequence.
  • Polypeptide C 277—C 01 V (the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) was purified by the following procedure. That is, recombinant plasmid containing the DNA encoding the above polypeptide, E. coli containing pTF7520 Co1V, Escherichia coli JM109 / pTF7520 Co1V (F ERM BP-5277) was added at 100 g / rol. The cells were cultured at 37 ° C for 6.5 hours in 5 ml of LB medium containing ampicillin. This preculture was inoculated into 500 ml of LB medium containing 100 g / ml ampinulin, and The cells were cultured at 7 ° C.
  • IPTG IPTG was added to a final concentration of 1 mM, cultured overnight, and then collected.
  • the obtained cells were suspended in 10 ml of PBS containing ImM EDTA, 0.05% Nonidet P-40 and 2 mM PMSF, and sonicated for 10 minutes to disrupt the cells.
  • the supernatant obtained by centrifuging the cell lysate was applied to a Resource Q column (Falmana) equilibrated with PBS to obtain a non-adsorbed fraction containing the target polypeptide.
  • This fraction is applied to a high-trap column equilibrated with PBS, washed with non-adsorbed fraction with PBS, and eluted with PBS with a NaCl concentration gradient of 0 to 0.5M. Was done.
  • the eluate was analyzed by SDS-PAGE, and fractions containing the 48 kd polypeptide were collected to prepare purified C277-Co1V, which was used in the following procedures.
  • a plasmid was constructed for expressing the polypeptide CoIV (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) using Escherichia coli as a host.
  • BP-5277 was cultured, and plasmid pTF7520Co 1 V was prepared from the obtained cells by alkaline SDS method. After digesting this plasmid with NcoI and BamHI (both from Takara Shuzo), agarose gel electrophoresis was performed, and a DNA fragment of about 0.58 kb was recovered from the gel. This was mixed with plasmid vector pET8C (manufactured by Novazidin) which had been digested with Nc0I and BamHI in advance to perform ligation.
  • NcoI and BamHI both from Takara Shuzo
  • Plasmid was prepared from a transformant obtained by introducing the obtained recombinant plasmid into Escherichia coli BL21, and a plasmid containing only the above-mentioned approximately 0.58 kb DNA fragment was selected. This was named plasmid pETC01V.
  • E. coli BL21 Es transformed with the above plasmid p ETC01V cherichia coli BL-21 ZPETC o 1 V was cultured overnight at 37 ° C in 1 Oml of LB medium containing 5 ⁇ g / ml of ampicillin.
  • the preculture solution (0.2ral) was inoculated into 100 ml of an LB medium containing 50 g of ampicillin, and cultured at 37 ° C. When the absorbance at 600 ⁇ reached 0.4, IPTG was added to a final concentration of lmM, cultured overnight, and then collected.
  • the obtained cells were washed with ImM EDTA, 0.05% Nonidet P_40, 10 ig / ml aprotinin (aprotinin), 10 zml leupeptin (leupeptin), and 5 ml of PBS (phosphate buffered physiological saline) containing 2 mM PMS F. were suspended in saline), was disrupted by performing sonication, subjected to Parinkaramu the c the supernatants the supernatant by centrifugation to high Bok lap one equilibrated with PBS, PBS After washing the non-adsorbed fraction with, the adsorbed fraction was eluted with PBS containing 0.5 M NaCl. The eluate SDS- polyacrylamide gel was analyzed by electrophoresis motion, using almost single approximately 18 kd purified C 01 V which Poribe peptide was obtained c thus confirmed the following operations.
  • PBS phosphate buffered physiological s
  • a plasmid for expressing the polypeptide H2-547 (the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing) was constructed according to the following procedure. Escherichia coli HB101 / pCH102 (F ERM BP-2800) was cultured, and plasmid pCH102 was prepared from the obtained cells by alkaline-SDS method. This plasmid was designated as type I.
  • Gavage gel electrophoresis was performed, and a DNA fragment of about 0.8 kb encoding a heparin-binding polypeptide of fibronectin was recovered from the gel.
  • the obtained DNA fragment was digested with Nc0I and BamHI (both from Takara Shuzo), and then NcoI, Ligation was carried out by mixing with pTV118N (manufactured by Takara Shuzo) digested with BamHI and introduced into E. coli JMl09.
  • a plasmid was prepared from the obtained transformant, and a plasmid containing the above-mentioned DNA fragment was selected and designated as a plasmid pRH1.
  • the plasmid vector p I NIH—ompAi (The EMBO Journal, Vol. 3, pp. 2437-2442, 1984) is digested with BamHI and Hincun (Takara Shuzo) to obtain a plasmid containing a lipoprotein terminator. A 0.9 kb DNA fragment was recovered. This was mixed with the above plasmid pRH1, which had been digested with BamHI and HindIII, and ligated. The DNA fragment and the lipoprotein that encode the 1ac promoter, the heparin-binding polypeptide, and A brasmid p RH 1-T containing a minator in this order was obtained.
  • Plasmid pRHl—T is digested with Nhe I and Se I (both from Takara Shuzo), a DNA fragment of about 3. lkb, and digested with S pel (Takara Shuzo) and Seal An approximately 2.5 kb DNA fragment was prepared, and the two fragments were ligated to each other.
  • the 1 ac promoter an open reading frame encoding a polypeptide in which two heparin-binding polypeptides were linked in tandem, And a plasmid pRH2-T containing the lipoprotein terminator in this order.
  • the nucleotide sequence of the above open reading frame is shown as SEQ ID NO: 17 in the sequence listing.
  • Polypeptide H 2—547 was prepared by the following method. Prepare four 500 ml baffled Erlenmeyer flasks containing 120 ml of LB medium containing 100 g / ra 1 ampicillin, and add Escherichia coli HB101 and Escherichia transformed with the above plasmid pRH2-T. coli HBlOl / pRH2-T was inoculated and cultured at 37 ° C for 1 ⁇ .
  • the cells were collected from the culture by centrifugation, and 40 ml of the disruption buffer (5 OmM Tris-HC and 1 mM ED TA, 15 OmM NaC], 1 mM DT, 1 mM PMS F, pH 7.5), and the cells were disrupted by sonication.
  • the supernatant obtained by centrifugation was applied to a high-trap-1 equilibrated with a purification buffer (5 OmM Tris-HCl, pH 7.5) on a Palin column (Pharmacia). After washing the non-adsorbed fraction in the column with the same buffer, elution was carried out with a purification buffer having a concentration gradient of 0 to 1 M NaCl.
  • the eluate was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and fractions containing a polypeptide having a molecular weight of about 60,000 were collected to obtain a purified H2-547 preparation.
  • the protein content of the obtained sample was measured by BCA Protein Assay Reagent (manufactured by Pierce) using standard serum albumin as a standard. As a result, about 1 Omg of H2-547 was obtained.
  • the amino acid sequence of H2-547 predicted from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing was determined. It was identical to the one from which the N-terminal methionine had been removed (the sequence is shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing).
  • the molecular weight of purified H 2-547 measured by mass spectrometry was consistent with that expected from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
  • a plasmid for expressing the polypeptide CH2-826 (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing) was constructed according to the following procedure. After the above-described plasmid pCH102 was type II, a PCR reaction was performed using a primer CLS having a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing and a primer CLA having a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing, Agarose gel electrophoresis was performed, and a DNA fragment of about 8 kb encoding a fibronectin cell adhesion polypeptide was recovered from the gel. The obtained DNA fragment was placed in N col.
  • Plasmid was prepared from the obtained transformant, a plasmid containing the above DNA fragment was selected, and this was designated as plasmid pRCl. About 2.5 kb of a DNA fragment obtained by digesting this plasmid pRCl with Spel and Seal, and about 3.about.3 obtained by digesting the above plasmid pRH2-T with Nhel and Seal.
  • a 9 kb DNA fragment is mixed and ligated, and a plasmid pR that encodes a polypeptide in which two heparin-binding polypeptides are tandemly linked to the C-terminus of the cell adhesion polypeptide.
  • the nucleotide sequence of the open reading frame on the plasmid pRCH2-T that encodes this polypeptide is shown in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing.
  • Polypeptide C H2-826 was prepared by a method similar to that used for polypeptide H 2-547 described in Example 2- (6). Fractions containing a polypeptide with a molecular weight of about 90,000 were collected from the eluate of the high trap heparin column to obtain purified CH2-826 sample.
  • a plasmid for expressing the polypeptide H2S-537 (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing) was constructed according to the following procedure.
  • the above plasmid pCH102 was designated as type II, and a primer CS1S having a base sequence shown in SEQ ID NO: 31 of the Sequence Listing and a primer CS1A having a base sequence shown in SEQ ID NO: 32 of the Sequence Listing were used.
  • an R-galose gel electrophoresis was performed to recover a DNA fragment of about 0.1 kb encoding the CS-1 cell adhesion region of fibronectin from the gel.
  • the obtained DNA fragment was digested with Nc0I and BamHI, then mixed with a plasmid vector pTV118N digested with NcoI and BamHI, and ligated. Introduced in Ml09. Plasmid was prepared from the obtained transformant, and a plasmid containing the above-described DNA fragment was selected and used as plasmid pRSl. Plasmid vector pI ⁇ -omp was digested with BamHI and HincII to recover a 0.91 ⁇ 1 ⁇ NA fragment containing a lipoprotein terminator region.
  • Plasmid pRS1—T was digested with NheI and ScaI, and a DNA fragment of about 2.4 kb and plasmid pRH2—T were converted into SpeI and Seal.Ps ⁇ I ( A DNA fragment of about 3.3 kb obtained by digestion with Takara Shuzo Co., Ltd. was prepared, and the two fragments were ligated to form a 1-ac peptide motor and two heparin-binding polypeptides arranged in tandem.
  • a plasmid pRH2S-T containing, in this order, an open reading frame encoding a polypeptide having a structure in which a CS-1 region is further linked to the C-terminal side thereof, and a lipoprotein terminator was obtained.
  • the nucleotide sequence of the above open reading frame is shown as SEQ ID NO: 32 in the sequence listing.
  • Polypeptide H2S-573 was prepared by a method similar to that used for polypeptide H2-547 described in Example 2- (6). Fractions containing a polypeptide having a molecular weight of about 60,000 were collected from the eluate of the high trap heparin column to obtain purified H 2 S-573 preparation.
  • the immobilization procedure was performed according to the following procedure. That is, the above implementation Add 2 ml of a solution prepared by dissolving the various functional substances described in the examples to an appropriate concentration in PBS per 1 ⁇ l (bottom area: 9.6 cm 2 ), and cover the plate under UV irradiation. Incubated for 1 hour at open, closed for 1 hour at room temperature. Next, the functional substance solution was replaced with 2 ml of PBS containing 2% serum albumin (BSA, Boehringer, Mannheim), and incubated for 30 minutes at room temperature. The plate was washed with PBS containing HEPES). The control plate on which BSA was immobilized was prepared by omitting the incubation with the polypeptide solution in the above procedure.
  • BSA serum albumin
  • the plate on which CH-296 is immobilized which is used for culturing the suspension cells (TF-1, HL-60) after gene transfer, has a capacity of 48 pmol Zcni 2 (3 ⁇ g / cm 2 ) CH-296.
  • the solution was immobilized by the above operation using a solution.
  • all virus infection of target cells was performed in a medium containing no polybrene.
  • the non-adherent cells were collected by decantation, and the cells adhering to the plate were collected by detaching from the plate after trypsin treatment, and these were combined.
  • the mixture was cultured at 37 ° C for 10 days with DMEM containing DMEM containing 0.75 mg Zn and G418 at a final concentration of 0.75 mg, and the number of colonies that appeared was counted. G for number of colonies 41
  • the ratio of the number of resistant colonies was defined as the gene transfer efficiency, and the results are shown in Fig. 1.
  • the horizontal lines indicate the functional substances used, and the vertical axis indicates the gene transfer efficiency, respectively.
  • Example 3 The same experiment was performed as described above except that the polypeptide having the retrovirus binding site was replaced with C01V.
  • C-274 and C01 V were mixed at various molar ratios. That is, Co 1 V of 3 30 pmol / cm 2 (6 ig / cm 2 ), C-- 27 4 of 33 Opraol / cm 2 (10 gZcm 2 ) and Co 1 V of 33 Opmol Zcm 2 (Molar ratio of C-274 and Co 1 V is 10: 10), 10 Opmol / cm 2 (3 ug / c ⁇ ) of C-274 and 33 ( ⁇ !
  • the obtained cell suspension was divided into two, and one was cultured at 37 ° C for 10 days with DMEM containing DMEM containing 0.75 mg Zral G418, and the number of colonies that appeared was counted.
  • the ratio of the number of G418-resistant colonies to the number of colonies obtained in the medium containing no G418 was defined as the gene transfer efficiency, and the results are shown in FIG. In the figure, the horizontal axis indicates the functional substance used, and the vertical axis indicates the gene transfer efficiency.
  • C 277-CS 1 as a substance having a cell binding site and mixing it with a substance having a binding site to retrovirus to examine the effect on infection efficiency when immobilized on a plate
  • Substances that bind to the retrovirus include polylysine [(Lys) n, poly-L-lysine hydrobromide, molecular weight 50,000 to 100,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries], and H-27 TF-1 cells (ATCC CRL-2003), which are floating cells, were used.
  • immobilization to a plate was performed using the following solution.
  • one of the culture media is the above medium, and the other is the final concentration of 0.
  • the medium was replaced with the above medium containing 75 mg / ml of G418, and cultured at 37 ° C for 8 days, and the number of colonies that appeared was counted. From the number of colonies that appeared in the presence and absence of G418, the appearance rate (gene transfer efficiency) of G418-resistant colonies was calculated.
  • FIG. 5 shows the results obtained.
  • $$ means the functional substance used
  • the vertical axis indicates the gene transfer efficiency.
  • FIG. 5 (a) shows the case where polylysine was used as the retrovirus-binding substance
  • FIG. 5 (b) shows the case where H-271 was used.
  • GST-Ep0 a derivative polypeptide obtained by using erythropoietin as a fusion polypeptide with glutathione-s-transferase, was prepared.
  • SEQ ID NO: 34 in the sequence listing shows the amino acid sequence of GST-Epo. The amino acid sequence at positions 233 to 398 in the sequence corresponds to erythrobotine.
  • a plasmid for expressing GST-Ep0 was constructed according to the following procedure.
  • a human fetal liver-derived cDNA library (Clontech) was designated as type I, and primers EPF 1 and EPR 1 (SEQ ID NOS: 35 and 36 in the sequence listing were replaced with the nucleotide sequences of primers EPF 1 and EPR 1 respectively) (Shown) was performed.
  • a portion of this reaction solution was taken to form type II, and PCR was again performed using primers EPF2 and EPR2 (SEQ ID NOs: 37 and 38 in the sequence listing show the nucleotide sequences of primers EPF2 and EPR2, respectively). Went.
  • An amplified DNA fragment was recovered from this reaction solution, digested with EcoRI and BamHI (both from Takara Shuzo Co., Ltd.), and subjected to agarose gel electrophoresis to obtain about 52 Obp containing the erythropoietin-encoding region. DNA fragments were recovered. The obtained fragment was mixed with EcoRI (manufactured by Takara Shuzo) and plasmid vector pTVl18N (manufactured by Takara Shuzo) digested with BamHI, ligated, and then introduced into Escherichia coli JM109.
  • EcoRI manufactured by Takara Shuzo
  • plasmid vector pTVl18N manufactured by Takara Shuzo
  • plasmid pEPO plasmid pEPO
  • EcoRI and SalI manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • agarose gel electrophoresis was performed to recover a DNA fragment of about 0.5 ⁇ .
  • This fragment was mixed with a plasmid vector pGEX5X-3 (manufactured by Pharmacia) digested with EcoR SalI, ligated, and then introduced into E. coli JM109.
  • the above DNA fragment was obtained from the obtained transformant.
  • a plasmid containing a plasmid containing was selected, and this plasmid was prepared and named as plasmid pGSTEP ⁇ .
  • GST-Ep0 a fusion platform polypeptide in which the amino acid sequence of erythropoietin was inserted into the C-terminal part of glutathione-1 S-transferase derived from the vector, was encoded in the plasmid. I have.
  • the nucleotide sequence encoding GST-EP0 on plasmid pGSTEP0 is shown in SEQ ID NO: 39 in the sequence listing.
  • Polypeptide GST-Ep0 was prepared by the following procedure. Prepare seven 5 nil LB media containing 100 g Zral ampicillin, inoculate E. coli JM109 and Escherichia coli J109 no. did. Next, seven 2-liter triangular flasks each containing 50 Oral of the same medium were prepared, and 5 ml each of the above-mentioned culture solution was inoculated into the flask and cultured at 37 ° C. 3.5 hours after the start of culture, IPTG was added to a final concentration of ImM, and the cells were further cultured for 3.5 hours.
  • the cells were collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 100 ml of PBS containing ImM PMSF and ImM EDTA, and sonicated to disrupt the cells.
  • 100 ml of PBS containing ImM PMSF, IraM EDTA and 2% Triton X-110 was added to the obtained lysate, left on ice for 30 minutes, and then centrifuged to collect the supernatant.
  • the obtained supernatant was filtered through a 0.45 m filter (Millipore) and applied to a glutathione-sepharose 4B column (Falmana, 3 ml) equilibrated with PBS.
  • a fraction containing a polypeptide having a molecular weight of about 44,000 was collected, concentrated by ultrafiltration using Centricon 10 (manufactured by Amicon) to about 501, and further ultra-free C 3 GVSTRL After filtration using (Millipore), the filtrate was subjected to gel filtration chromatography using a Superdex 200 column (Pharmacia, equilibrated with PBS). An eluted fraction containing a polypeptide having a molecular weight of about 44,000 was collected and used as a GST-Ep0 polypeptide solution in the subsequent experiments. This GST-Ep0 solution contained about 50% of GST-Epo of the total protein.
  • Example 2- 34pniol / cm 2 according to the method described in (9) (1. 5 g / cm 2) equivalent GST- E po, 133 mol / cm 2 (10 poly-lysine and 34 ⁇ 11101 / / The immobilization to the plate was performed using a mixture of 11 2 0 ST—Epo and 133P niolZcm 2 polylysine, and 1 ⁇ 10 4 cfuZ TKNE 0 virus was added to each of these plates. And medium containing 1 x 10 4 cells for 24 hours at 37 ° C. The incubation was over.
  • TF-1 was used for RPMI 1640 medium (supplemented with 5 ng Zn GM-CFS, 50 units Zral penicillin, 50 g / ml streptomycin), and HL-60 was used for RPMI medium ( Nissi, 10% FCS, 50 units Zml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin) were used, respectively.
  • RPMI 1640 medium supplied with 5 ng Zn GM-CFS, 50 units Zral penicillin, 50 g / ml streptomycin
  • HL-60 was used for RPMI medium ( Nissi, 10% FCS, 50 units Zml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin) were used, respectively.
  • the non-adherent cells were collected by decantation, and the cells adhering to the plate were subjected to tribcine treatment and collected. Transfer 1Z5 of the cell suspension obtained from each plate to two plates on which CH-296 is immobilized and incubate for
  • the medium was replaced with the above medium containing G418 at a concentration of 0.7 SmgZnil, and cultured at 37 ° C for 8 days, and the number of colonies that appeared was counted. From the number of colonies that appeared in the presence or absence of G418, the appearance rate (gene transfer efficiency) of G418-resistant colonies was calculated.
  • Figure 6 shows the results.
  • the horizontal axis shows the functional substance used, and the vertical axis shows the gene transfer efficiency.
  • the vertical axis shows the gene transfer efficiency.
  • the horizontal axis shows the functional substance used
  • the vertical axis shows the gene transfer efficiency.
  • the horizontal axis shows the functional substance used
  • the vertical axis shows the gene transfer efficiency.
  • the TF-1 cells shown in Fig. 6 (a) even when plates containing immobilized polylysine alone have a certain level of gene transduction ⁇ GST-Ep 0 High gene transfer efficiency was also obtained.
  • HL-60 cells shown in FIG. 6 (b) no increase in gene transfer efficiency was observed due to the presence of GST-Epo. From the above results, it was shown that the use of erythropoietin enables gene transfer specific to target cells.
  • the horizontal axis represents the functional substance immobilized on the plate, and the villi represents the gene transfer efficiency. As shown in the figure, it was shown that even when H2- ⁇ 47 was used, the coexistence of GST-— ⁇ 0 improved the efficiency of gene transfer into TF-1 cells.
  • Beads having the polypeptide immobilized thereon were prepared by the following method.
  • the beads used were polystyrene beads with a particle size of 1.14 ⁇ (PolyBeads Polystyrene Microspheres, manufactured by Polyscience) c.
  • BSA and PBS were added to prepare 4ral 1% BS AZP BS suspension.
  • the beads recovered from this suspension by centrifugation were suspended again in 5 ral of 1% BSA / PBS, and allowed to stand at room temperature for 1 hour to obtain a suspension of beads immobilized on the polypeptide.
  • Polypeptide solutions include 100 / g / nil C—274, 100 ⁇ / ml H—271, 100 zg / ml CH—271, 100 g / ml CH—296, and 100 w / ml H—271. Beads immobilized using a mixture of 10 / ig / ral C-274 and using a 2% BSA solution as a control were similarly prepared.
  • Figure 8 shows the results.
  • the horizontal axis indicates the functional substance immobilized on the beads
  • the vertical axis indicates the gene transfer efficiency.
  • FGF Becton. Dickinson
  • C—FGF.A polypeptide represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing on retrovirus infection
  • NIH / 3T 3 cell colony formation Investigated by Atsushi. That is, 132 pmo 1 / cm 2 (2.25 ig / cm 2 ) of FGF and 133 pmo 1 / cm 2 (6.3 g / cm 2 ) by the method described in Example 2 (9).
  • the resulting cell suspension was divided into two equal parts, and one was cultured at 37 ° C for 10 days with DMEM containing DMEM containing 5 mg Zral G418 for the other, and the number of colonies that appeared was determined. Counting, the ratio of the number of G418-resistant colonies to the number of colonies obtained in a medium containing no G418 was defined as the gene transfer efficiency.
  • Fig. 10 shows the obtained results.
  • the horizontal axis indicates the concentration of C-FGF ⁇ A used for the plate immobilization operation
  • the vertical axis indicates the gene transfer efficiency.
  • the experimental results in the control plate were plotted at a polypeptide concentration of 0 / raolZcm 2 . As shown in FIG. 10, an increase in gene transfer efficiency was observed depending on the concentration of C-FGF-A used for immobilization.
  • FIG. 11 shows the number of G418-resistant colonies obtained using each polypeptide.
  • the horizontal axis shows the functional substance immobilized on the plate, and the vertical axis shows the number of G418-resistant colonies that appeared.
  • the number of G418-resistant colonies was significantly increased in the plate on which C—FGF A and C—FGF—CS1 were immobilized, as compared with the BSA-immobilized plate.
  • Bolibeptide was shown to promote retroviral infection of HL-60 cells.
  • mice Six- to eight-week-old mice (C3H / HeJ) were intraperitoneally administered with 15-mg / Kg of 5-fluoroperacil (5_FU, manufactured by Amresco), and two days later, the femur and tibia were removed. The bone marrow was harvested. The obtained bone marrow was subjected to density gradient centrifugation using Ficoll-Hypac (density 1.0875-1111, manufactured by Pharmacia) to prepare a low-density mononuclear cell fraction, which was used as mouse bone marrow cells.
  • Ficoll-Hypac density 1.0875-1111, manufactured by Pharmacia
  • Mouse bone marrow cells were pre-stimulated before retrovirus infection according to the method of Lusky et al. (Blood, Vol. 80, pp. 396-402, 1992). 20% FCS, 100 units Zml recombinant human interleukin-6 (rh IL-6, Amjun), 10 OngZml recombinant mouse stem cell factor (iSCF, Amdyne), 50 units
  • the above-mentioned mouse bone marrow cells were added at a cell density of 1 ⁇ 10 ⁇ cellsZml to Hiichi MEM (manufactured by Gibco) containing 1 / ml penicillin and 50 igZml of streptomycin. % In C_ ⁇ 2 and incubated for 48 hours at 3 7 ° C.
  • the prestimulated cells, including those attached to the container, were aspirated and collected using pipets.
  • Example 2 FGF of 2 36 raolZcm 2 (4 g / z ⁇ ), C—FGF ⁇ A of 16 pmol / cni 2 (8 gZcm 2 ), or 15 according to the method described in (9) 1 x 10 6 pre-stimulated on plates immobilized with 9 ⁇ mol / cm 2 (8 ⁇ g / cm 2 ) C-FGF-CSI and BSA-immobilized plate (control plate) cells and were Ichiboku Incubate at 1 x 1 0 4 cfu of PM5 ne 0 viruses and the including the above 3 was added to the culture medium 2 ml used to prime 7 ° C.
  • the HPP-CFC assay was performed according to the method of Bradley et al. (Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., Vol. 44, pp. 287-293, 1966).
  • the medium used was 1% Z0.66% overlay ⁇ agar medium, with and without G418 at a final concentration of 1.5 oig / ml.
  • the 1 X 1 0 4 single infected cells were added per ⁇ El, in 1 0% C 0 2, was Incubate 1 3 days at 3 7 ° C. After the incubation, the colonies that appeared were observed with an inverted microscope, and the number of high-density colonies (0.5 or more in diameter) derived from ⁇ 1?? (Gene transfer efficiency) The obtained results are shown in Fig. 12.
  • the horizontal axis represents the machine used.
  • the vertical axis indicates gene transfer efficiency.
  • G418-resistant colonies did not appear in the BSA-immobilized plate used as a control, while the plate immobilized with each of the above polypeptides was used. G4 18 resistant colonies were obtained.
  • the gene transfer efficiency increases in the order of FGF, C-FGFA, C-FGF-CS1, and the cell binding site polypeptide derived from fibronectin, which has cell binding activity, and CS-1
  • the presence of the polypeptide moiety increased the efficiency of retrovirus infection of bone marrow cells.
  • polylysine [(Lys) n] and the retrovirus were examined by the following procedure.
  • Poly-L-lysine hydrobromide molecular weight 50,000 to 100,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • DMEM medium containing 63 nmolZml of each polypeptide (H-271, CH-271, H2-546, CH2-826) and incubate at 37 ° (:, 24 hours, non-adherent) Cells were collected by decantation, and cells adhered to the plate were collected by detaching from the plate by treatment with trypsin, and the two were combined, and the same was applied to the case where no polypeptide was added as a control. The resulting cell suspension was divided into two equal parts, and one was incubated with DMEM containing DMEM containing G418 at a final concentration of 0.75 mg ZnI at 37 ° C for 1 ⁇ day for 1 ⁇ day.
  • the ratio of the number of G418-resistant colonies to the number of colonies obtained in the medium without G418 was taken as the gene transfer efficiency, and the results are shown in Fig. 15.
  • the horizontal axis is used in the figure. Functional material, vertical axis is gene transfer Shows the rate.
  • Mouse bone marrow cells were prepared and prestimulated according to the method described in the above example.
  • the plate at the time of retrovirus infection was prepared by immobilizing H 2 S—573 [16 Opniol / cm 2 (10 g / cin 2 )] and CH—296.
  • FIG. 17 shows the results obtained by HPP-CFC Atsee.
  • the horizontal axis indicates the functional substance used, and the vertical axis indicates the gene transfer efficiency.
  • the obtained cell suspension was divided into two, and one was DMEM and the other was cultured at 37 ° C for 10 days with DMEM containing 5 mg / ml of G418 at 37 ° C for 10 days.
  • DMEM containing 5 mg / ml of G418 at 37 ° C for 10 days.
  • the ratio of the number of G418-resistant colonies to the number of colonies obtained in a medium containing no G418 was defined as the gene transfer efficiency, and the results are shown in FIG.
  • the horizontal axis indicates the functional substance used, and the vertical axis indicates the gene transfer efficiency.
  • the plate was washed with Hanks balanced salt solution (HBSS, Gibco) containing 25 ⁇ HE (ESPES). Then the virus supernatant 2 ml of Te in addition to the plate 37 containing PM5 ne 0 viruses 100 OCF u, After incubation for 30 minutes, added DM EM of 2ml plate washed c in this play Bok with PBS After incubating for 24 hours, non-adherent cells were collected by decantation, and cells adhering to the plate were collected by trypsin treatment and detached from the plate, and the two were combined. The obtained cell suspension was bisected, and one was cultured for 10 days at 37 ° C.
  • HBSS Hanks balanced salt solution
  • ESPES Hanks balanced salt solution
  • the ratio of the number of G418-resistant colonies to the number of colonies obtained in the medium not containing G418 was defined as the gene transfer efficiency.
  • the results are shown in FIG. In the figure, the horizontal axis indicates the functional substance used, and the vertical axis indicates the gene transfer efficiency.
  • the following procedure was used to determine whether retroviral infection efficiency could be increased using beads to which functional substances were immobilized.
  • the beads used were polystyrene beads having a particle diameter of 1.14 ⁇ ⁇ ⁇ (Polybeads, polystyrene microspheres, manufactured by Polyscience).
  • BSA and PBS 4 ml of a 1% BSA / PBS suspension was used.
  • the beads recovered from this suspension by centrifugation were suspended again in 5 ml of 1% BSA / PBS, and allowed to stand at room temperature for 1 hour to obtain a suspension of CH-296-immobilized beads.
  • beads immobilized using 2% BSA instead of the CH-296 solution were prepared in the same manner.
  • Mouse bone marrow cells were prepared according to the method described in Example 41- (4) and subjected to preliminary stimulation.
  • Example 2 A plate on which BSA was immobilized according to the method described in (9), and a plate containing CH—296 immobilized bead prepared by the method described in Example 7— (1).
  • 2 ml of the medium used for the above pre-stimulation containing 1 ⁇ 10 6 pre-stimulated bone marrow cells and 1 ⁇ 10 4 cfu of PM5 neovirus was added to each of the cells to which 1 volume was added. And incubated at 37 ° C. Two hours later, a similar medium (2 ml) containing the same amount of virus was newly added to the plate, and incubation was continued for another 22 hours.
  • the non-adherent cells are collected by decantation, and the cells adhering to the plate are collected using a cell dissociation buffer (CDB, enzyme-free, manufactured by Gibco), and collected. After washing twice with the same buffer, the number of cells was counted. The collected cells were subjected to HP P_C FC Assy according to the method described in Example 41- (4).
  • CDB cell dissociation buffer
  • H-271 on retroviral infection was determined after preincubation of virus supernatant in a plate on which H-271 and CH-271, which is known to promote retroviral infection, were immobilized. Then, the plate was thoroughly washed, the amount of the virus remaining there was measured by the NIH / 3 T3 cell colony formation assay, and the results were compared by evaluation. That is, by using the method described in Example 2 (9), various concentrations of H—
  • FIG. 25 shows the results.
  • FIG. 25 is a graph showing the relationship between the functional substance and the gene transfer efficiency. The horizontal axis indicates the functional substance used, and the vertical axis indicates the number of G418-resistant colonies.
  • Example 8 using a plate immobilized with 124 mol / cm 2 (6.4 / cni 2 ) of C277-CoV, and a control plate immobilized with BSA. — Evaluated by the same method as (1).
  • Figure 26 shows the results.
  • FIG. 26 is a graph showing the relationship between the functional substance and the gene transfer efficiency. The horizontal axis shows the functional substance and BSA used, and the vertical axis shows the number of G418-resistant colonies.
  • the present invention provides a method for efficiently introducing a gene into a target cell using a retrovirus.
  • a target cell into which a gene has been introduced simply and efficiently without the need for a special retrovirus vector is provided.
  • Transgenic animals can be easily prepared by transplanting the transfected cells into vertebrates, and the method of the present invention is useful in medical, cell engineering, genetic engineering, developmental engineering, etc. is there.
  • a medium containing the functional substance of the present invention and a mixture thereof, and a kit for introducing retrovirus-mediated genes into target cells are also provided.By using these mediums and kits, Retrovirus arrangement, introduction of foreign genes into target cells, etc. can be performed easily and efficiently.
  • Fig. 1 shows fibroblast growth factor, functional material containing fibroblast growth factor, and polyadhesion site of fibroblast growth factor and fibronectin. It is a graph which shows the gene transfer efficiency to a target cell by the mixture of peptides.
  • Fig. 2 is a graph showing the gene transfer efficiency to target cells by fibroblast growth factor, a mixture of polypeptides of fibroblast growth factor and fibronectin cell adhesion site polypeptide, and fibronectin cell adhesion site polypeptide.
  • Figure 3 shows the efficiency of gene transfer to target cells by collagen fragment, fibronectin cell adhesion site polypeptide, a mixture of collagen fragment, functional material containing collagen fragment, and fibronectin cell adhesion site polypeptide. It is a graph shown.
  • FIG. 4 is a graph showing the efficiency of gene transfer to target cells by a fibronectin fragment and a mixture of a fibronectin fragment and a cell adhesion site polypeptide of fibronectin.
  • Figure 5 shows the targeting of fibronectin cell adhesion site polypeptide, polylysine, a mixture of polylysine and fibronectin cell adhesion site polypeptides, a fibronectin fragment, and a mixture of fibronectin fragment and fibronectin cell adhesion site polypeptides.
  • 5 is a graph showing the efficiency of gene transfer into cells.
  • FIG. 6 is a graph showing the efficiency of gene transfer to target cells by an erythropoietin derivative, polylysine, and a mixture of an erythropoietin derivative and polylysine.
  • FIG. 7 is a graph showing the gene transfer efficiency to target cells by an erythropoietin derivative, a fibronectin fragment polymer, and a mixture of an erythropoietin derivative and a fibronectin fragment polymer.
  • FIG. 9 is a graph showing the efficiency of gene transfer to target cells using beads in which a mixture of a polypeptide of a cell adhesion site of a fragment and fibronectin is immobilized.
  • FIG. 9 is a graph showing gene transfer to target cells by fibroblast growth factor and a functional substance containing fibroblast growth factor.
  • FIG. 10 is a graph showing the relationship between the amount of a functional substance containing a fibroblast growth factor and the introduction of a gene into a target cell.
  • FIG. 11 is a graph showing gene transfer into target cells by a functional substance containing fibroblast growth factor.
  • FIG. 12 is another graph showing the efficiency of gene transfer into target cells by a functional substance containing fibroblast growth factor.
  • FIG. 13 is a graph showing the relationship between the amount of a functional substance containing a collagen fragment and the gene transfer into target cells.
  • FIG. 14 is a graph showing the efficiency of gene transfer into target cells by polylysine.
  • FIG. 15 is a graph showing the efficiency of gene transfer into target cells by the fibronectin fragment and the fibronectin fragment polymer.
  • FIG. 16 is another graph showing the efficiency of gene transfer into target cells by the fibronectin fragment and the fibronectin fragment polymer.
  • FIG. 17 is yet another graph showing the efficiency of gene transfer into target cells by the fibronectin fragment and the fibronectin fragment polymer.
  • FIG. 18 is a graph showing the efficiency of gene transfer into target cells by a functional substance containing fibroblast growth factor, a collagen fragment, and a functional substance containing a collagen fragment.
  • FIG. 19 is a graph showing the efficiency of gene transfer into target cells by the fibronectin fragment.
  • FIG. 20 is a graph showing the efficiency of gene transfer into target cells by a functional substance containing a fibronectin fragment and a fibroblast growth factor.
  • FIG. 21 is a graph showing the efficiency of gene transfer into target cells by a functional substance containing fibroblast growth factor and a fibronectin fragment.
  • FIG. 22 is a graph showing the efficiency of gene transfer into target cells using beads immobilized with fibronectin fragments.
  • FIG. 23 is a graph showing the relationship between the amount of fibronectin fragment used and the introduction of genes into target cells.
  • FIG. 24 is a graph showing the introduction of a gene into a target cell by a functional substance containing fibroblast growth factor and a fibronectin fragment.
  • FIG. 25 is another graph showing gene transfer into target cells by fibronectin fragment and a functional substance containing fibroblast growth factor.
  • FIG. 26 is a graph showing gene transfer into target cells by a functional substance containing a collagen fragment.
  • Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
  • Lys Leu Gin Leu Gin Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser lie Lys 65 70 75
  • Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
  • Phe Phe Leu Arg lie His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg
  • Lys Ala lie Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
  • Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
  • 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
  • Phe Phe Leu Arg lie His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg
  • Lys Ala lie Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Ala Ser Asp Glu Leu
  • Gly Glu lie Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu
  • 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Ala Ala Ser Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin
  • Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr
  • Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser
  • Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr
  • 485 490 495 lie lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val
  • 545 550 555 lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr
  • Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro
  • Gly Tyr lie He Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Pro Arg Glu
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type Other nucleic acids (Taishi DNA)
  • Sequence type Other nucleic acids (DNA encoding artificial polypeptide) Sequence:

Description

明 細 書 レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入方法 発明の分野
本発明は、 医学、 細胞工学、 遺伝子工学、 発生工学などの分野において 標的細胞への遺伝子導入効率を向上させ、 標的細胞の形質転換を効率良く 行うことを可能にする方法およびそれに関連する一連の技術に関する。 従来の技術
多数のヒ ト疾病についてその機構が解明され、 また、 組換え D N A技術、 および細胞への遺伝子導入技術が急速に進歩したことより、 近年、 重篤な 遺伝病を治療するための体細胞遺伝子治療法のプロ トコールの開発が進め られている。 また、 最近では遺伝病のみならず A I D Sのようなウィルス 感染症やガンの治療にも遺伝子治療を適用しょうという試みがなされてい る
これまでに米国食品医薬品局 （F D A ) が承認したヒ 卜での遺伝子導入 試験の大部分は組換えレトロウィルスベクターを用いて細胞への遺伝子導 入を行うものである。 レ 卜ロウィルスべクタ一は目的の外来遺伝子を細胞 内に効率的に導入し、 その染色体 D N A中に安定に組み込むので、 特に長 期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療にとって好ましい遺伝子導入 手段である。 該ベクターは遺伝子導入された生物に悪影響を与えないよう に様々な工夫が施されている。 例えば、 遗伝子導入に用いられたベクタ一 自体が細胞内で複製を行い、 無制限な感染 （遺伝子導入） を繰り返さない よう、 ベクター中の複製機能は欠損させてある。 これらのベクター （複製 能欠損レ トロウイルスベクタ一） は自己複製できないため、 一般的にはレ トロウィルス産生細胞 （パッケージング細胞） を使用してウィルス粒子に 包まれたレ トロウイルスべク夕一を調製する。
—方、 骨髄細胞はイン—ビトロ （in vitro) での取り扱いが可能なこと、 および自己複製能を有する造血幹細胞を含有していることから、 体細胞遺 伝子治療法の良好な標的細胞である。 また、 臍帯血液も造血幹細胞を含む 多数の原始前駆細胞を含有していることがこれまでに証明されている。 こ れらの標的細胞に遺伝子を導入して生体に移植する遺伝子治療を行うこと により、 導入された遺伝子が血液細胞中で長期にわたり発現され、 疾病を 生涯治癒することができる。
し力、し、 多数のグループによって研究が進められているにもかかわらず、 造血幹細胞は高効率の遺伝子導入の難しい細胞の一つである。 これまで、 マウスやその他の動物の造血幹細胞に関して最も効率の良い遺伝子導入の プロ トコールは、 造血幹細胞をレ卜ロウィルス産生細胞とともに共培養す るという方法であつたが、 安全性についての懸念から、 ヒ 卜における臨床 的な遺伝子治療法には、 レ トロウィルス産生細胞の混入の危険性の低い無 細胞系での遺伝子導入が望まれている。 残念ながら、 レ トロウイルス産生 細胞との共培養を行わずに造血幹細胞に効率的に遺伝子を導入することは 容易ではない。
最近、 細胞外マトリックスの成分であるフィブロネクチンや、 そのフラ グメン卜が、 単独でレ卜ロウィルスによる細胞への遺伝子導入効率を向上 させることが報告されている （J. Cl in. Invest. , 第 93巻、 第 1451〜1457 頁、 1994年、 Blood、 第 88巻、 第 855〜862頁、 1996年） 。 また、 遺伝子ェ 学的に生産されたフイブロネクチンフラグメン 卜も同様の性質を有してお り、 これを利用して造血幹細胞に効率よく外来遺伝子を導入させることが
- - 可能であることも示された （WO 9 5 / 2 6 2 0 0号） 。 こうしたフィブ ロネクチンによる遺伝子導入効率の向上には、 フィブロネクチン中のへパ リン結合領域と、 レ トロウィルスとの結合が関与していることが示唆され ている。 これらのフイブロネクチンや、 フイブロネクチンフラグメントを 利用した方法は、 全てフイブロネクチンや、 そのフラグメントを固定化し たプレー卜中で細胞にレ卜ロウィルスベクターを感染させるものである。 発明の目的
上記のフイブロネクチンや、 フイブロネクチンフラグメン卜を利用した 遺伝子導入法は、 レトロウィルス結合部位と標的細胞部位を同一の分子上 に有するフィブロネクチンあるいはそのフラグメント分子によって達成さ れると考えられている（Nature Medicine, 第 2卷、 第 876〜872頁、 1996年）。 したがって、 上記の方法を応用して種々の標的細胞に効率良く遺伝子を導 入するためには、 細胞に応じて一つの分子上にウィルスと細胞の結合部位 を有する機能性物質を作製する必要があり、 普遍的な遺伝子導入法として 利用するためには、 なお問題を有している。
また、 上記の方法は、 レトロウイルス感染時に標的細胞の培養に使用す るプレー トの表面にフイブロネクチンあるいはフイブロネクチンフラグメ ントを固定化することによって達成されているが、 プレー卜への固定化は 煩雑な操作を要し、 簡便な遺伝子導入法とは言えない。
さらに、 上記の方法に使用される機能性物質は、 レ トロウイルス結合部 位としてフィブロネクチン由来のへパリン結合領域を含むものに限られて いる。 このため、 これ以外のレ トロウイルス結合物質を見いだすことによ り、 さらに優れた遺伝子導入方法を開発する可能性がある。
本発明は、 このような問題を解決し、 より簡便かつ効率のよい遺伝子導 入法を提供すべくなされたものである。 発明の概要
本発明者らは、 フィブロネクチンあるいはそのフラグメン卜に代表され る機能性物質によるレトロウィルス感染促進作用力く、 レトロウィルス結合 部位を有する領域と、 細胞結合部位を有する領域とが同一分子上に存在し ない場合においても認められることを見いだした。 すなわち、 レ トロウイ ルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、 遺伝子導入の標的細胞への 結合部位を有する機能性物質とを混合して使用することにより、 標的細胞 へのレ トロウィルスによる遺伝子導入効率を向上させることができること を見いだした。
また、 本発明者らは、 機能性物質によるレ トロウイルス感染促進作用が、 機能性物質をプレー卜の表面に固定化しない状態であっても認められるこ とも見いだした。 また、 機能性物質を固定化したビーズの存在下にレトロ ウィルスを標的細胞に接触させた場合にも、 標的細胞への遺伝子導入効率 が向上されることを見いだした。
本発明者らは、 また、 フイブロネクチン由来のへパリン結合領域を含ま ないレトロウィルス結合性物質を見いだし、 該物質およびそれらの誘導体 がレトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入に有用であることも見い だした。 さらに、 本発明者らは、 レ トロウイルスによる標的細胞への遺伝 子導入に有用な機能性物質を創成することに成功し、 本発明を完成させる に至った。
かく して、 本発明の第 1の発明はレトロウィルスによる標的細胞への遺 伝子導入効率を向上させる方法に関し、 レトロウィルスによる標的細胞へ の遺伝子導入において、 レトロウィルス結合部位を有する有効量の機能性 物質と、 標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質との混台物の 存在下で、 標的細胞をレトロウィルスで感染させることを特徴とする。 本発明の第 1の発明のレ トロウイルス結合部位を有する機能性物質は特 に限定するものではなく、 例えば、 フイブロネクチンのへパリ ン一 I I結 合領域、 線維芽細胞增殖因子、 コラーゲン、 ポリ リ ジンまたはそれらと機 能的な同等物から選択される機能性物質である。 また、 標的細胞結合部位 を有する機能性物質とは、 標的細胞に結合するリガンドを含有する物質で あればよい。 当該リガンドとしては、 細胞接着性のタンパク質、 ホルモン、 サイ トカイン、 抗体、 糖鎖、 炭水化物または標的細胞の代謝物等があり、 細胞接着性のタンパク質としては、 例えば、 フイブロネクチンの細胞結合 領域ポリベプチドがある。 当該フィブロネクチンの細胞結合領域としては、
V L A— 5およびノまたは V L A— 4への結合領域ポリベプチドがぁる。 また、 他のリガンドとしてはエリスロポェチンが挙げられる。
第 1の発明に使用する機能性物質は非固定化でも、 固定化されていても よく、 特にビーズに固定化することにより、 簡便に使用できる。 また、 標 的細胞に結合部位を有する機能性物質として、 標的細胞に特異的なリガン ドを選択することにより、 第 1の発明により、 簡便に標的細胞への遺伝子 導入のターゲッテングが可能になる。
上記のごとく、 従来の W O 9 5 X 2 6 2 0 0号や、 Nature Medicineに 開示される方法においては、 レ トロウイルスと標的細胞が、 レトロウィル ス結台部位と標的細胞結合部位とを同一分子上に有する機能性物質上で共 配置することが、 レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向 上させる機構において必須とされている。 しかしながら、 本発明により、 レトロウィルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、 標的細胞結合部 位を有する他の有効量の機能性物質との混合物の存在下でレ トロウィルス による標的細胞への遺伝子導入を行うと、 遺伝子導入効率が向上する。 本発明の第 2の発明は、 レトロウィルス結合部位を有する有効量の機能 性物質と、 標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質との混合物 を含有するレトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用する標的 細胞の培養培地に関する。
第 2の発明の培地を使用することにより、 第 1の発明が簡便に実施する ことができる。
本発明の第 3の発明はレトロウィルスの配置方法に関し、 レトロウィル ス結合部位を有する有効量の機能性物質と、 標的細胞結合部位を有する他 の有効量の機能性物質との混合物と接触したレトロウィルスを含有する培 地を、 インキュベートすることを特徴とする。
本発明の第 4の発明は、 標的細胞内へのレトロウイルス介在遺伝子導入 の実施に使用するためのキッ 卜であって、
( a ) レトロウィルス結合部位を有する有効量の機能性物質および/ま たは標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質、
( b ) レトロウィルスと接触した標的細胞をィンキュベ一卜するための 人工基質、 および
( c ) 上記標的細胞を予備刺激するための標的細胞増殖因子、 を含んでなることを特徴とするキッ 卜に関する。
第 4の発明のキッ 卜を使用することにより、 第 1および第 3の態様をそ れぞれ簡便に行うことができる。
本発明の第 5の発明は、 レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入 効率を向上させる方法に関し、 レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子 導入に際し、 標的細胞結合部位と、 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまた はポリ リジン由来のレトロウィルス結合部位またはそれらと機能的な同等 物とを同一分子上に有する有効量の機能性物質の存在下で、 標的細胞をレ 卜ロウィルスで感染させることを特徴とするレ 卜ロウィルスによる標的細 胞への遺伝子導入を向上させる方法である。
上記の W 0 9 5 / 2 6 2 0 0号公報および Nature Medicineに記載され る従来の方法においては、 最も効率よく、 レトロウィルスによる標的細胞 への遺伝子導入を向上させる方法に使用できる物質として、 フィブロネク チンのフラグメントが開示されている。 しかしながら、 フイブロネクチン フラグメン卜以外の機能性物質でどのような機能性物質が効率よく レトロ ウィルスによる標的細胞への遺伝子導入を向上させる方法に使用できるか については、 具体的な開示はない c 特に、 この従来の方法において、 レト ロウィルス結合部位とは、 フィブロネクチンのリピート 1 2— 1 4が開示 されているのみである。
本発明者らは、 このフィブロネクチンのリ ピート 1 2— 1 4とは、 構造 的相関の全くない、 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲン、 ポリ リ ジン等が、 意外にも、 レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入を向上させる方 法において有効に使用できることを見いだした。 したがって、 これらの物 質と機能的な同等物、 すなわち、 これらの物質と機能的に同等のレトロゥ ィルス結合部位を有し、 レ 卜ロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入効 率を向上させる能力を有する物質は、 いずれも第 5の発明において使用す ることができる。
第 5の発明において、 標的細胞結合部位には、 標的細胞に結合するリガ ンドを含有する物質が使用でき、 これはレトロウィルス結合部位と結合し ている。
当該リガンドとしては、 例えば、 細胞接着性のタンパク質、 ホルモン、 サイ 卜力イン、 抗体、 糖鎖、 炭水化物または標的細胞の代謝物等が挙げら
—Ί一 れる。 細胞接着性のタ ンパク質の一例としては、 フイブロネクチンの細胞 結台領域ポリペプチドが挙げられ、 例えば、 V L A— 5および Zまたは V L A - 4への結合領域ポリぺプチドが使用できる。 他のリガン ドとしては、 ェリスロポェチンが挙げられる。
第 5の発明において、 レトロウィルス結合部位として供される線維芽細 胞增殖因子としては、 例えば、 配列表の配列番号 3で表される線維芽細胞 増殖因子、 該因子の機能的同等物や、 該因子または該因子の機能的同等物 を含有するポリぺプチドから選択される線維芽細胞増殖因子がある。
これらの機能性物質としては、 例えば、 配列表の配列番号 4または 5で 表されるアミノ酸配列を有するポリべプチドが挙げられる。
第 5の発明において、 レ卜ロウィルス結合部位として供されるコラーゲ ンとしては、 例えば、 V型コラーゲン由来のイ ンスリ ン結合部位を含有す るフラグメント、 該フラグメン卜の機能的同等物や、 該フラグメントまた は該フラグメン卜の機能的同等物を含有するポリぺプチドから選択される コラーゲンがある。 また、 当該フラグメ ントとしては、 例えば、 配列表の 配列番号 6で表されるアミノ酸配列を含有するフラグメン卜が挙げられる。 これらの機能性物質としては、 配列表の配列番号 7または 8で表される ァミノ酸配列を有するポリぺプチドが挙げられる。
第 5の発明において、 レトロウィルス結合部位として供されるポリ リジ ン （polylysine) とは L一 リ ジン （lysine) の重合体であって、 例えば、 市販のポリ リジンより適当な重合度のポリ リジンを選択し使用することが できる。
線維芽細胞増殖因子、 コラーゲン、 またはポリ リ ジン由来のレトロウイ ルス結合部位が同時に標的細胞結合部位を有する場合においては、 この線 維芽細胞增殖因子、 コラーゲンまたはポリ リジン由来のレトロウィルス結 台部位を有する有効量の機能性物質の存在下で、 標的細胞をレトロウィル スで感染させることによって、 レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子 導入効率を向上させることができる。 また、 標的細胞が接着性細胞の場合 には、 該機能性物質にレトロウイルスと標的細胞とがそれぞれ結合、 接着 し、 この線維芽細胞增殖因子、 コラーゲンまたはポリ リジン由来のレトロ ウィルス結合部位を有する有効量の機能性物質の存在下で、 標的細胞をレ トロウィルスで感染させることによって、 レ トロウィルスによる標的細胞 への遺伝子導入効率を向上させることができる。
なお、 配列表の配列番号 1で表されるポリべプチド （以下、 H— 2 7 1 と称す） が同時に標的細胞結合部位を有する場合、 すなわち、 標的細胞が 該ポリべプチド、 H— 2 7 1、 に結台性を有する場合においても、 有効量 のこのポリベプチドの存在下で、 標的細胞をレ卜ロウィルスで感染させる ことによって、 レ卜ロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上 させることができることも見いだした。
すなわち、 上記 Nature Medicineによれば、 フイブロネクチンのリ ピー ト 1 2— 1 4がレトロウィルス結台部位と開示されているが、 本発明者ら は、 意外にも、 この H— 2 7 1が標的細胞の種類によっては、 標的細胞結 合部位として、 レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率の向上 に有効に機能することを見いだした。 また、 標的細胞が接着性細胞の場合 にも、 このポリペプチドにレ トロウイルス、 標的細胞がそれぞれ結台、 接 着し、 有効量のこのポリペプチドの存在下で、 標的細胞をレ トロウイルス で感染させることによって、 レ卜ロウィルスによる標的細胞への遺伝子導 入効率を向上させることができることも見いだした。
第 5の発明において当該機能性物質は固定化されていてもよく、 固定化 されていなくてもよいが、 標的細胞が接着性細胞の場合は、 固定化して用 し、るのが効率の良い方法である。
本発明の第 6の発明は、 標的細胞結合部位と、 線維芽細胞増殖因子、 コ ラーゲンまたはポリ リ ジン由来のレ 卜ロウィルス結合部位またはそれらと 機能的な同等物とを同一分子上に有する有効量の機能性物を含有するレト ロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用する標的細胞の培養培地 に関する。
本発明の第 7の発明は、 上記した線維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまた はポリ リジン由来のレトロウィルス結合部位を有する有効量の機能性物質 と接触したレトロウィルスを含有する培地をィンキュベ一卜するレ トロゥ ィルスの配置方法に関する。 これらの機能性物質は、 レトロウイルスによ る標的細胞への遺伝子導入を向上させる方法において、 レ卜ロウィルスの 配置に有効に使用できる。
また、 本発明のレトロウイルスの配置方法では、 標的細胞結合部位と線 維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまたはポリ リジン由来のレトロウィルス結 合部位またはそれらと機能的な同等物とを同一分子上に有する有効量の機 能性物質と接触したレ卜ロウィルスを含有する培地をィンキュベー 卜する ことも包含する。
本発明の第 8の発明は、 標的細胞内へのレトロウィルス介在遺伝子導入 の実施に使用するためのキッ 卜であって、
( a ) 標的細胞結台部位と、 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまたはポ リ リジン由来のレ卜ロウィルス結合部位またはそれらと機能的な同等物と を同一分子上に有する有効量の機能性物質、
( b ) レ トロウィルスと接触した標的細胞をィンキュペートするための 人工基質、 および
( c ) 上記標的細胞を予備刺激するための標的細胞增殖因子、 を含んでなることを特徴とするキッ 卜に関する。
これらの第 1および第 5の方法の発明、 第 2および第 6の培地の発明、 第 3および第 7の方法の発明ならびに第 4および第 8のキッ 卜の発明、 い ずれにおいても、 機能性物質のビーズ固定化物が好適に使用できる。 本発明の第 9の発明は、 レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入 効率を向上させる方法に関し、 レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子 導入において、 実質的に純粋なフイブロネクチン、 実質的に純粋なフイブ ロネクチンフラグメ ン卜およびそれらの混合物より選択される有効量のビ ーズに固定化された機能性物質の存在下で、 標的細胞をレ卜ロウィルスで 感染させることを特徴とする。
本発明の第 1 0の発明もレトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入 効率を向上させる方法に関し、 レ 卜ロウィルスによる標的細胞への遺伝子 導入において、 実質的に純粋なフイブロネクチン、 実質的に純粋なフイブ ロネクチンフラグメントおよびそれらの混合物より選択される有効量の固 定化されていない機能性物質の存在下で、 標的細胞をレトロウィルスで感 染させることを特徴とする。
上記の W O 9 5 / 2 6 2 0 0号および Nature Medicineの方法において は、 レトロウイルスと標的細胞が、 レトロウイルス結合部位と標的細胞結 合部位を同一分子上に有する機能性物質上で共配置することが、 レトロゥ ィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる機構において必須 である。 この方法において、 レ トロウイルスと標的細胞を、 レトロウィル ス結合部位と標的細胞結台部位を同一分子上に有する機能性物質上に共配 置させるには、 レトロウィルス結台部位と標的細胞結合部位を同一分子上 に有する機能性物質を培養基に固定化させることによりはじめて可能にな る。 しかしながら、 本発明によれば、 これらの実質的に純粋なフイ ブロネク チン、 実質的に純粋なフイブロネクチンフラグメ ン トおよびそれらの混合 物を用いる場合においても、 意外にも、 上記レトロウィルス結合部位と標 的細胞結合部位を同一分子上に有する機能性物質上が培養基に固定化され た状態でなくても、 効率よく、 レ トロウイルスによる標的細胞への遺伝子 導入効率が向上する。
第 1、 第 5、 第 9および第 1 0の発明において、 標的細胞としては、 例 えば、 幹細胞 （stem cells) 、 造血細胞、 非接着性低密度単核細胞、 接着 性細胞、 骨髄細胞、 造血幹細胞、 末梢血幹細胞、 臍帯血液細胞、 胎児性造 血幹細胞、 胚形成幹細胞、 胚細胞、 プライモディアル · ジャーム ' セル （p rimordial germ cell) 、 卵母細胞、 卵原細胞、 卵子、 精母細胞、 精子、 C D 3 4 +細胞、 C一 k i t +細胞、 多能性造血前駆細胞、 単能性造血前 駆細胞、 赤血球系前駆細胞、 リ ンパ球母細胞、 成熟血球、 リ ンパ球、 B細 胞、 T細胞、 線維芽細胞、 神経芽細胞、 神経細胞、 内皮細胞、 血管内皮細 胞、 肝細胞、 筋芽細胞、 骨格筋細胞、 平滑筋細胞、 ガン細胞、 骨髄腫細胞 および白血病細胞から選択される細胞が使用できる。
第 1、 第 3、 第 5、 第 7、 第 9および第 1 ◦の発明において、 レトロゥ ィルスとしては、 外来遺伝子を含有するレトロウィルスを使用することが でき、 また、 レトロウイルスとしては、 例えば、 組換え体レトロウィルス ベクターが使用できる。 さらに、 レ トロウイルスとしては、 例えば、 複製 能を欠損した組換え体レトロウィルスべクターを使用することができる。 本発明の第 1 1の発明は、 上記の第 1、 第 5、 第 9および第 1 0の発明 で得られる遺伝子導入細胞に関する。
本発明の第 1 2の発明は、 第 1 1の発明の遺伝子導入細胞を脊椎動物に 移植する細胞移植方法に関する。 本発明の第 1 3の発明は、 配列表の配列番号 1 3で表されるレ トロウイ ルスによる標的細胞への遺伝子導人効率を向上させるポリぺプチ ドまたは その機能的同等物に関する。
本発明の第 1 4の発明は、 第 1 3の発明のポリベプチドをコ一ドする遺 伝子に関する。 かかる遺伝子の例としては、 配列表の配列番号 1 7で表さ れる遺伝子または厳密な条件下で該遺伝子にハイブリダィズし、 レ卜ロウ ィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリベプチドをコ 一ドする遺伝子が挙げられる。
上記 W O 9 5 / 2 6 2 0 0号および Nature Medicineの方法において、 最も効率よく遺伝子導入に使用できるのは C H— 2 9 6である。 一方、 本 発明者らは、 V L A— 5結合部位、 V L A— 4結合部位を有さない、 上記 ポリべプチドが意外にも、 本発明に使用できることを見いだした。
本発明の第 1 5の発明は、 配列表の配列番号 3 0で表されるレトロウイ ルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリぺプチドまたは その機能的同等物に関する。
本発明の第 1 6の発明は、 第 1 5の発明のポリベプチドをコ一ドする遺 伝子に関する。 かかる遺伝子の例としては、 配列表の配列番号 3 3で表さ れる遺伝子または厳密な条件下で該遺伝子にハイブリダィズし、 レトロゥ ィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリべプチドをコ -ドする遺伝子が挙げられる。
本発明の第 1 7の発明は配列表の配列番号 5で表されるレ トロウイルス による標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリベプチドまたはその 機能的同等物に関する。
本発明の第 1 8の発明は、 第 1 7の発明のポリぺプチドをコ一ドする遺 伝子に関する。 かかる遺伝子の例としては、 配列表の配列番号 2 6で表さ れる遺伝子または厳密な条件下で該遺伝子にハイプリダイズし、 レトロゥ ィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリベプチドをコ 一ドする遺伝子がある。 発明の詳細な説明
本発明の遺伝子導入方法には、 通常、 組換えレ トロウイルスベクターが 使用され、 特に、 複製能欠損組換えレトロウイルスベクターが好適である c 該ベクターは感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させ てあり、 非病原性である。 これらのベクタ一は脊椎動物細胞、 特に、 哺乳 動物細胞のような宿主細胞に侵入し、 その染色体 D N A中にベクターに挿 入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。
本発明では、 細胞に導入しょうとする外来遺伝子は適当なプロモータ一、 例えば、 レ卜ロウィルスベクター中に存在する L T Rのプロモーターや外 来プロモーターの制御下に、 組換えレトロウィルスベクター内に挿入して 使用することができる。 また、 外来遺伝子の転写を達成するためにはプロ モーターおよび 写開始部位と共同する他の調節要素、 例えば、 ェンハン サ一配列がベクター内に存在していてもよい。 さらに、 好ましくは、 導入 ざれた遺伝子はその下流にターミネーター配列を含有することができる。 導入される外来遺伝子は天然のものでも、 または人工的に作製されたもの でもよく、 あるいは起源を異にする D N A分子が、 ライゲーシヨ ンや当該 技術分野で公知の他の手段によって結台されたものであってもよい。
レトロウィルスベクタ一に挿入される外来遺伝子は、 細胞中に導入する ことが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。 例えば、 外来遺伝子は, 治療の対象となる疾患に関連している酵素や、 タンパク質、 アンチセンス 核酸もしくはリボザィムまたはフォルスプライマー （例えば、 W O 9 0ノ 13641号参照） 、 細胞内抗体（例えば、 W094/02610号参照）、 増殖因子等をコ一ドするものを使用することができる。
本発明で用いるレ トロウイルスベクターは、 遺伝子導入された細胞の選 択を可能にする適当なマーカー遺伝子を有していてもよい。 マーカー遺伝 子としては、 例えば、 細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤耐性遺 伝子や、 酵素活性の検出によって遺伝子導入された細胞を見分けることが できるレポーター遺伝子が利用できる。
使用できるベクターには、 例えば、 公知の MFGベクタ一 （ATCC No. 68754 ) や α— SGC (ATCC No. 68755 ) 等のレ トロウィルスベクターがある。 また、 本願明細書の下記の実施例において 使用した N2/ZipTKNE 0ベクター （TKNEO、 Blood. 第 78巻、 第 310〜317頁、 1991年） および PM5 n e oベクター （Exp. Hematol.、 第 2 3巻、 第 630~638頁、 1995年） は、 いずれもマーカー遺伝子としてネオマ イシン耐性遺伝子 （ネオマイシンホスホ トランスフェラ一ゼ遺伝子） を含 有している。 したがって、 これらのベクターによって遺伝子導入された細 胞は該遺伝子産物により不活化される抗生物質 （ネオマイシン、 G418 等） に対する耐性を有する細胞として確認することができる。 また、 これ らのベクターは公知のパッケージング細胞株、 例えば、 公知の PG 13 (A TCC CRL- 10686) ^ PG 13/L c 8 (ATC C CRL - 10685) 、 PM317 (ATCC CRL— 9078) や米国特許 5, 278, 056号に記載の細胞株、 GP + E— 86 (ATCC CRL 9642) や GP+ e n vAm— 12 (ATCC CRL 9641) 等の 細胞株を使用することにより、 該べクターがパッケージングされたウィル ス粒子として調製することができる。
本明細書において、 機能性物質の有効量とは、 レ トロウイルスによる標 的細胞への遺伝子導入により、 標的細胞の形質転換が生じるのに有効な量 であり、 用いる機能性物質、 レ トロウイルスおよび標的細胞の種類により、 本明細書記載の方法により、 選定することができる。 また、 遺伝子導入効 率とは、 形質転換効率を意味する。
レ トロウイルスと結合し、 その結果、 本発明で有効に役立つ機能性物質 の能力は、 下記実施例に記載したような、 定型的な方法を使用して確認す ることができる。
これらのアツセィは、 レ トロウィルス粒子がマトリ ックス上に固定され た本発明に使用できる機能性物質と結合して、 その結果、 レ トロウイルス がマトリックスからの洗い流しに抵抗する程度を測定する。 簡単に言えば、 例えば、 ウィルス含有上清液を、 レ トロウイルス結合部位を有する機能性 物質の固定物を含有するゥエル中でインキュべ一卜する。 ついで、 このゥ エルを生理的食塩緩衝液で徹底的に洗浄し、 その後、 標的細胞をゥエル内 でインキュベー トしてゥエル内に残存しているウィルスの感染活性値を測 定する。 最初にゥエルに添加されたウィルス上清液と比較して、 感染活性 または力価の減少を評価し、 類似する対照実施 （例えば、 B S A固定化ゥ エルを使用して） と比較する。 対照ゥエルと比較して、 本発明の機能性物 質を固定化したゥエル内の残存力価が顕著に高いことは、 当該物質が本発 明のレトロウィルス結合部位を有する機能性物質として用いることができ ることを意味する。
このスクリ一二ング方法を促進するために、 ウィルスべクターは選択可 能なマーカー遺伝子を含有することができる。
この方法により、 本発明で使用するレトロウィルス結合部位を有する機 能性物質のスクリ一二ングを行うことができる。
このようなレ 卜ロウィルス結合部位を有する機能性物質としては、 フィ ブロネクチンのへパリン一 I 1結合領域、 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲ ンまたはポリ リジン由来のレ卜ロウィルス結合部位を有する機能性物質が 挙げられる。
本発明で使用される機能性物質の細胞結合部位、 すなわち、 標的細胞結 合性のリガンドを含有する物質と、 細胞との結合は慣用の方法を使用して 同様にアツセィすることができる。 例えば、 このような方法には、 Nature 3 5 2 : 4 3 8〜4 4 1 ( 1 9 9 1年） に記載された方法が含まれる。 簡単に言えば、 細胞結合部位を有する機能性物質を培養プレー 卜上に固 定化し、 アツセィすべき細胞集団は培地に重層して 3 0分から 2時間置く。 このィンキュベーション期間後に、 機能性物質に接着していない細胞を回 収し、 計数し、 生存性についてアツセィする。 機能性物質と接着した細胞 も ト リプシンまたは細胞解離緩衝液 （例えば、 Gibco) を使用して回収し、 計数し、 そして生存性を試験する。 場合によっては、 例えば、 造血コロニ 一形成細胞では、 細胞をさらに 1 2〜 1 4日間培養して細胞のコロニー形 成特性を確認する。 ついで、 接着細胞の割合を計算し、 ゥシ血清アルブミ ン （B S A ) を固定化した培養プレートのような標準ないし標準対照と比 較する。 標的細胞とアツセィした機能性物質の実質的な結合によって、 機 能性物質 細胞の組合せが本発明に適しており、 この標的細胞結合部位を 有する機能性物質を、 レトロウィルス結合部位を有する機能性物質と結合 または共存させて、 ウィルスベクタ一による標的細胞の感染を測定するこ とによって、 本発明に使用する機能性物質を構築することができる。
本発明に使用できるレトロウィルス結合部位を有する機能性物質として は、 上記のように、 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまたはポリ リ ジン由 来のレトロウィルス結合部位が選択できるが、 これらの物質と同等のレト ロウィルス結合活性を有し、 標的細胞結合部位を有するリガン ドとの結台 または共存において、 レ トロウィルスによる標的細胞の遺伝子導入効率を 向上させる物質は全て、 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまたはポリ リ ジ ン由来のレトロウィルス結台部位と機能的な同等物に包含される。
上記方法により、 選定されたレ トロウィルス結合部位を有する機能性物 質と、 標的細胞結合部位を有する機能性物質との結合または共存下におい て、 本発明の遺伝子導入方法に使用する標的細胞、 レ トロウイルスを使用 し、 その遺伝子導入効率の向上性を測定することにより本発明に使用する 機能性物質の有効量が決定できる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の 1つの態様は、 レトロウィルスベクタ一による標的細胞への遺 伝子導入効率を高める方法である。 この方法は、 レ トロウイルスベクタ一 による細胞への遺伝子導入効率を高めるのに有効な、 レトロウィルス結合 部位を有する機能性物質と、 標的細胞結合部位を有する他の機能性物質と の混合物の共存下にレトロウィルスべクターを生存可能な標的細胞に感染 させることを特徴とする。
この方法は、 レ卜ロウィルスべクターによって遺伝子導入された遺伝子 導入細胞を得る方法として使用でき、 該細胞を生物個体に移植することに よる生物個体への遺伝子導入を可能にする。
用いるレトロウィルス結合部位を有する機能性物質としては、 特に限定 はなく、 例えば、 フイブロネクチンのへパリ ン一 I I結合領域、 線維芽細 胞增殖因子、 コラーゲン、 ポリ リ ジン等があり、 またこれらの機能性物質 と機能的に同等な物質、 例えば、 へパリ ン結合性部位を有する機能性物質 も使用することができる。 また、 該機能性物質の混合物、 該機能性物質を 含有するポリペプチド、 該機能性物質の重合体、 該機能性物質の誘導体等 を使用することができる。 これらの機能性物質は、 天然起源の物質から得 ることができ、 また、 人為的に作製する （例えば、 遺伝子組換え技術や化 学台成技術によって作製する） ことができ、 さらに、 天然起源の物質と人 為的に作製された物質との組合せにより作製することもできる。
なお、 用いる機能性物質は、 本明細書中に示される高効率での遺伝子導 入の達成が可能なレトロウィルス結合部位および Zまたは標的細胞結合部 位を有している範囲においては、 天然起源のポリぺプチドのァミノ酸配列 に変異が生じたものであってもよい。 本明細書においては天然起源のポリ ペプチドのアミノ酸配列中の 1あるいは、 例えば、 数個までの複数のアミ ノ酸が欠失、 置換、 挿入および Zまたは付加されていても、 所望のレトロ ウィルス結合部位および/または標的細胞結合部位を有する限り、 そのポ リベプチドを天然ァミノ酸配列を有するポリべプチドの機能的同等物と呼 ぶ。 これらの機能的同等物は、 該機能的同等物をコードする遺伝子を作製、 使用して当該機能的同等物を作製したうえ、 その生物活性を確認すること により得ることができる。
この点に関して、 関連バイオテクノロジー技術は、 対象の機能的領域中 のアミノ酸の欠失、 置換、 付加または他の修飾を定型的に実施することが できる状態にまで進歩している。 つぎに、 得られたアミノ酸配列は、 所望 の細胞結合活性またはウィルス結合活性について定型的に上記のスクリ一 ニングに付すことができる。
また、 該機能性同等物をコードする遺伝子は、 上記の機能性物質をコー ドする遺伝子にハイブリダイズする遺伝子を検索することにより、 得るこ とができる。
すなわち、 上記の機能性物質をコードする遺伝子またはその塩基配列の
—部をハイプリダイゼーンョンのプローブまたは P C R等の遺伝子増幅法 のプライマーに用いることにより、 本酵素類似の活性を有するタンパクを コードする遺伝子をスクリーニングすることができる。 なお、 該方法では 目的の遺伝子の一部のみを aむ DNA断片が得られることがある力、、 その 際には、 得られた DN A断片の塩基配列を調べてそれが目的の遺伝子の一 部であることを確かめた上、 該 DN A断片またはその一部をプローブとし てハイプリダイゼーションを行う力、、 または該 DN A断片の塩基配列に基 づいて合成されたプライマーを用いて P CRを行うことにより、 目的の遺 伝子全体を取得することができる。
上記のハイブリダィゼーシヨンは、 例えば、 以下の条件で行うことがで きる。
すなわち、 DNAを固定したメンブレンを 0. 5% SDS、 0. 1 % ゥシ血清アルブミ ン （B S A) 、 0. 1% ポリビニルピロリ ドン、 0. 1% フイコール 400、 0. 01 % 変性サケ精子 DN Aを含む 6 S S C (l x S S Cは 0. 15M N a C し 0. 015M クェン酸ナ卜リゥ 厶、 ρΗ7. 0を示す） 中で、 50°Cにて 12〜20時間、 プローブとと もにインキュベートする。 インキュベーション終了後、 0. 5% SD S を含む 2 x S S C中、 37 °Cでの洗浄から始めて、 55じ濃度は0. l x までの範囲で、 また、 温度は 50°Cまでの範囲で変化させ、 固定された D NA由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメ ン プレンを洗浄する。
また、 こうして得られた新たな遺伝子について、 そこにコードされてい るタンパクの有する活性を、 上記と同様の方法によって調べることにより、 得られた遺伝子が目的とするものであるかどうかを確認することができる: 上記 W095/26200号に記載のように、 フィブロネクチンのへパ リンー I I結合領域はレトロウィルス結台部位を有するポリべプチドであ る。 繊維芽細胞増殖因子、 コラーゲン、 ポリ リジンはフイブロネクチンの ペリン一 I I結合領域との間に構造的な類似 （例えば、 アミ ノ酸配列上 の類似性） が見られる物質ではないが、 本発明者らは、 これらの物質がレ トロウィルス結合部位を有していることを見いだした。
本発明に使用される標的細胞結合部位を有する機能性物質も、 特に限定 はないが、 標的細胞に結合するリガンドを有する物質であり、 該リガンド としては細胞接着性のタンパク質、 ホルモンやサイ トカイン、 細胞表面の 抗原に対する抗体、 多糖類や糖タンパク、 糖脂質中の糖鎖、 あるいは標的 細胞の代謝物などが挙げられる。 また、 該機能性物質を含有するポリぺプ チド、 該機能性物質の重合体、 該機能性物質の誘導体、 該機能性物質の機 能的同等物等を使用することもできる。 これらの機能性物質は天然起源の 物質から得ることができ、 また、 人為的に作製する （例えば、 遺伝子組換 え技術や化学合成技術によって作製する） ことができ、 さらに、 天然起源 の物質と人為的に作製された物質との組合せにより作製することもできる。 使用される細胞接着タンパク質としては、 フィブロネクチンやそのフラ グメン卜がある。 例えば、 米国特許第 5 , 1 9 8 . 4 2 3号に記載の、 P r 0 1239- S e r 1515に対応するヒ トフイブロネクチンの細胞結合ドメイン は、 本明細書に記載のポリベプチド C一 2 7 4と同等の機能を有しており、 B H Kおよび B 1 6— F 1 0細胞等と結合することが示されている （J. Bi ochera.、 第 110巻、 第 285〜291頁、 1991年） 。 これらのポリペプチド中に 存在する R G D Sの 4ァミノ酸からなる配列は V L A— 5レセプターのリ ガンドである。 V L A— 5レセプターの発現は広範な細胞において見られ る力 \ 分化した細胞よりも未分化なものによく発現している。 また、 フィ ブロネクチン中の C S— 1領域は V L A— 4レセプターのリガンドとして 知られており、 該レセプターを発現している細胞 （T細胞、 B細胞、 単球、 N K細胞、 好酸球、 好塩基球、 胸腺細胞、 骨髄単球系細胞、 赤芽球系前駆 細胞、 リ ンパ球系前駆細胞、 メラノ一マ、 筋細胞等） に結台する。 特開平
3 - 2 8 4 7 0 0号に記載のポリベプチドで、 配列表の配列番号 2 9で表 されるポリぺプチド （以下 C 2 7 7 - C S 1と称す） は上記の V L A— 5 . および V L A— 4レセプターのリガンドの両方を含有するポリぺプチドで あり、 本発明の方法において、 これらのレセプターを有する細胞への遺伝 子導入に使用することができる。 さらに、 へパリン一 I I領域は繊維芽細 胞、 内皮細胞および腫瘍細胞と結合することが示されている。 へパリ ン一 I I領域の細胞結合部位ポリべプチド配列はレトロウィルス結合部位を有 する機能性物質のポリぺプチドの存在下で、 レ トロウィルスべクターの感 染を予め定められた細胞に向けるうえで有用である。
細胞特異的な作用を有するホルモンやサイ トカイン類は本発明の方法に 使用される細胞結合部位を有する機能性物質として適している。 例えば、 造血系のサイ トカインであるエリスロボェチンを使用することにより、 赤 血球系の細胞への遺伝子導入を行うことができる。 エリスロポェチンは公 知の方法にて作製し、 使用することができる。 また、 該エリスロポエチン の機能的同等物およびェリスロポェチンまたは該ェリス口ポェチンの機能 的同等物を含有するポリぺプチドも使用することができる。
下記実施例に示されるように、 レトロウィルス結合活性を有する機能性 物質 （例えば、 H— 2 7 1や繊維芽細胞増殖因子） をフイブロネクチン由 来の細胞結合活性を有するポリぺプチド C一 2 7 4等との混合物で使用し た場合には高い遺伝子導入効率を得ることができる。 これらの実験に用い た N I 11ノ3丁3細胞は〇一 2 7 4と結合可能な V L A— 5レセプターを 発現しており、 この両者の相互作用が遺伝子導入効率の向上に寄与してい る。
さらに、 同様な現象はエリスロポエチンレセプターを発現する T F— I 細胞 （Blood、 第 7 3巻、 第 3 7 5〜 3 8 0頁、 1 9 8 9年） への遺伝子 導入にエリスロポェチン誘導体を共存させた場合にも観察される。 しかも. この効果はェリスロボェチンレセプターを有していない細胞では認められ ない。
これらの結果より、 レトロウィルス結合部位を有する機能性物質と細胞 結合部位を有する他の機能性物質との共存による細胞特異的な遺伝子導入 効率の上昇が起こることが明らかにされた。
本発明のこの態様においては、 レトロウィルス結合部位を有する機能性 物質を、 他の標的細胞との結合部位を有する機能性物質との混合物として 使用する。 これによつて、 当該機能性物質に親和性を有する標的細胞への レ卜ロウィルスベクターによる遺伝子導入の効率を顕著に高めることがで きる。 こう して、 遺伝子導入効率が向上することにより、 ウィルス産生細 胞との共培養の回避が可能となることは、 本発明の 1つの利点である。 目的とする細胞に選択的に遺伝子を導入する手段は利用価値が高く、 こ れまでにも様々な方法が研究されており、 例えば、 目的細胞の表面に存在 するレセプターに結合する物質と D N A結合性物質とを結合させた非ウイ ノレスヘクター molecular conjugation vector) 力ある。 該へク夕一を Ll 用した遺伝子導入の例としては、 ァシァロ糖タンパクを用いた肝ガン細胞 への導入 （J. Biol. Chen！.、 第 262巻、 第 4429〜4432頁、 1987年） 、 トラ ンスフヱリ ンを用いたリ ンパ芽球細胞への導入 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第 89巻、 第 6099〜6103頁、 1992年） 、 抗 E G Fレセプター抗体を用 いたガン細胞への導入 （FEBS Letters, 第 338巻、 第 167〜169頁、 1994年） 等が知られている。 このような非ウィルスベクターを用いた遺伝子導入法 は、 導入された遺伝子が細胞の染色体 D N A上に組み込まれないため、 導 入された遺伝子の長期にわたる発現が望まれる場合には好ましい方法では ない。 染色体上への遺伝子組み込みが可能なべクターとして繁用されるレ トロウィルスベクタ一を用い、 これを特定の細胞に感染させようとする試 みも行われており、 例えば、 レ トロウイルス粒子を直接化学修飾してラク トースを結合させることによる肝細胞への遺伝子導入 （J. Biol. Chem.、 第 266巻、 第 14143~ 14146頁、 1991年） 、 エリスロポエチンとの融合タン パクとしたエンベロープ夕ンパクを有する組換えウィルス粒子を利用した エリスロポエチンレセプター発現細胞への遺伝子導入 （Science、 第 266卷、 第 1373〜1376頁、 1994年） 等が開発されている。 しかし、 この目的のため には標的細胞に応じて特別なウィルス粒子の調製を要する。 さらに、 ウイ ルス粒子の化学修飾は煩雑な操作を必要とする上に、 ウィルスの不活化を 招くおそれがあり、 また、 遺伝子工学的に改変したウィルスエンベロープ については、 必ずしも必要な機能 （標的細胞への結台、 およびウィルス粒 子の構築） を有するものが得られるとは限らない。
上記 W0 9 5ノ 2 6 2 0 0号には、 細胞結合活性を有する適当なリガン ドを共有結合させたフィブロネクチンのフラグメント共存下においては、 特別な修飾をしていないレトロウィルスベクターを目的とする細胞に導入 することが可能であることが示唆されている。 しかし、 該方法ではウィル ス結合活性と細胞への結合活性の両方を有する機能性分子を用し、るため、 標的細胞ごとに個別の機能性物質を作製しなければならない。 また、 作製 された機能性物質に両活性が保持されているかどうかは明らかでなし、。 本発明によるレ トロウィルス結合部位を有する機能性物質と、 標的細胞 との結合部位を有する他の機能性物質との組み合わせは、 広範囲の細胞種 に対してレトロウィルスベクターを用いた遺伝子の送達系が提供できる。 この目的のためには、 レトロウィルス結合部位を有する機能性物質と、 標 的細胞との結合部位を有する機能性物質とが共有結合によって結合されて いる必要はない。 したがって、 標的となる細胞ごとに、 レ トロウイルス結 台部位を有する機能性物質と、 標的細胞との結合部位を有する機能性物質 とが共有結合によって結合された、 特定の機能性物質を作製する必要がな く、 目的の細胞への遺伝子導入を簡便、 かつ効率よく行うことができる。 本発明の方法を用いた標的細胞への遺伝子導入の例としては、 造血系の 細胞への遺伝子導入が挙げられる。 上記のフィブロネクチンの C S— 1細 胞接着領域は造血幹細胞への遺伝子導入に有用なことが知られている。 ま た、 造血系の細胞の分化には上記のエリスロポェチンの他にも多数の細胞 特異的なサイ トカインが関与していることが知られており、 これらを利用 することによって目的とする細胞 （細胞系） に特異的に遺伝子を導入でき る。 例えば、 G— C S Fを用いた場合には巨芽球、 および顆粒球前駆細胞 を標的とすることが可能である。
細胞結合活部位を有する機能性物質として、 悪性細胞と、 特異的または 優先的に結合する物質を用いることにより、 これらの細胞を標的として遺 伝子導入を行うこともできる。
例えば、 ある種の肺癌細胞においては H E R— 2、 H E R— 4というレ セプターが過剰発現していることが知られている （Proc. Nat. Acad. Sci. USA、 第 92卷、 第 9747〜9751頁、 1995年） 。 したがって、 該レセプターに 対するリガンドのへリグリ ン （heregulin) をレトロウイルス結合部位を 含有する機能性物質と組み合わせることにより、 肺癌細胞の増殖を制御す ることが可能となる。
また、 例えば、 甲状腺 （癌） 細胞に対してはヨウ素を有する機能性物質 を、 また、 肝臓 （癌） 細胞は高密度リポタンパク質 （High- density lipop rotein、 H D L ) やァシァ口糖タンパク質またはこれらの一部を含有する 機能性物質を使用することによって遺伝子導入の標的とすることができる。 さらに、 標的細胞の表面に存在する抗原に対する抗体、 好適にはモノ ク ローナル抗体を、 細胞結合活性を有する機能性物質として使用することに より、 抗体が入手できる任意の細胞を標的とすることが可能となる。 こう して、 本発明により開示されるレトロウィルスベクターと標的細胞との配 置方法を使用することにより、 広範囲の種類の細胞を標的とすることがで きる。
特に、 好ましい態様は、 レトロウィルスベクタ一による標的細胞への遺 伝子導入効率を高める方法において、 新規な機能性物質を用いて遺伝子導 入を行う。
これまでレトロウィルスによる細胞への遺伝子導入に有効とされたレ卜 ロウィルス結合部位を有する機能性物質はフイブロネクチンのへパリ ン—
I I領域のみである。
上記のように該領域は、 それ自体特定の細胞に対して結合部位を有して おり、 標的細胞によってはこの活性が望ましくない場合がある。 このよう な場合には、 この結合部位を他の標的細胞結合部位に置き換えることによ り、 目的を達成することが可能となる。 このように、 性質の異なる複数の 機能性物質が使用可能なことは、 本発明による遺伝子治療の適用範囲を広 げることにつながり、 目的の標的細胞へのターゲッテングも容易に行うこ とができる。
本発明により提供される、 新規なレトロウィルス結合部位を有する機能 性物質としては、 線維芽細胞増殖因子、 該因子を含有するボリペプチド、 コラーゲンのフラグメ ン 卜、 該フラグメ ン 卜の混合物、 該フラグメン トを 含有するポリペプチド、 該機能性物質の重合体等が挙げられる。 また、 ポ リ リジンも本発明の目的に使用することができる。 これらの機能性物質は. 天然起源の物質から得ることができ、 また、 人為的に作製する （例えば、 遺伝子組換え技術または化学合成技術によって作製する） ことができ、 さ らに、 天然起源の物質と化学的に合成された物質との組合せにより作製す ることもできる。 該機能性物質は、 本発明の第 1の発明の遺伝子導人方法 にも使用でき、 また、 該機能性物質と細胞結合活性を有する機能性物質と のキメラ分子も細胞への遺伝子導入に有用である。
上記の新規な機能性物質はいずれもレトロウイルス結合活性を有してい る。 しかしながら、 これらの物質は上記 W O 9 5ノ2 6 2 0 0号に記載の、 ヒ トフィブロネクチンのへパリン一 I I結合領域またはそれに類似したァ ミノ酸配列を有するポリぺプチドを含有するものではない。
本発明に使用される線維芽細胞増殖因子としては、 実質的に純化された 天然物を使用しても良く、 また、 遺伝子工学的に作製されたものを使用し ても良い。 本発明には、 配列表の配列番号 3で表される線維芽細胞増殖因 子を使用することができ、 さらに、 これらのポリペプチドの機能を損なう ことなく改変された誘導体も使用することができる。 線維芽細胞増殖因子 誘導体の例としては、 配列表の配列番号 4で表されるポリペプチド （以下、 C一 F G F ' Aと称する） がある。 これは配列番号 3で表される線維芽細 胞増殖因子の N末端にフィブロネクチンの細胞接着部位ポリベプチドが結 合したポリべプチドであり、 米国特許第 5， 3 0 2 , 7 0 1号に記載の方法 により遺伝子工学的に製造することができる。 該ポリベプチドは該米国特 許に F E R M P— 1 2 6 3 7として記載され、 現在はブタぺス 卜条約の 下、 F E R M B P - 5 2 7 8の受託番号で茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I B H ) に寄託され ている大腸菌 （原寄託日 ：平成 3年 1 2月 9日） を使用することによって 得ることができる。
また、 配列番号 5で表される、 フイブロネクチン由来の C S— 1細胞接 着領域を有する上記の C一 F G F · Aの誘導体ポリペプチド （以下、 C一 F G F - C S 1と称する） は、 上記の茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、 ブタペス ト条約の下、 F E RM B P— 5654の受託番号で寄託されている大腸菌 （原寄託日 ：平 成 8年 9月 6曰） を使用し、 本願明細書に記載の方法で得ることができる c この C一 FGF— C S 1は C S— 1結合性を有する標的細胞、 特に造血幹 細胞への遺伝子導入において特に有用である。
コラーゲンのフラグメントとしては、 天然型のコラーゲンを酵素学的、 化学的に分解し、 実質的に純化したフラグメントを使用しても良く、 また、 遺伝子工学的に作製されたものを使用しても良い。 さらに、 これらのフラ グメン卜の機能を損なうことなく改変されたものも使用することができる。 コラーゲンの中で、 ヒ 卜 V型コラーゲンは強いィンスリン結合活性を有し (特開平 2— 209899号） 、 インスリン結合部位を含有するポリぺプ チドとしては配列表の配列番号 28で表されるァミノ酸配列を含有するポ リペプチドがあり （特開平 5— 97698号） 、 その例としては、 配列表 の配列番号 6で表されるポリペプチド （以下、 C o I Vと称する） が挙げ られる。 C o 1 Vは本願明細書実施例に開示の方法で作製することができ る。 C o 1 Vを含有するポリぺプチドであって、 配列番号 7で表されるポ リベプチド （以下、 C 277— C 0 1 Vと称する） は、 C o l Vの N末端 にフィブロネクチンの細胞接着部位ポリぺプチドが結合したポリぺプチド であり、 上記特開平 5— 97698号に記載されているように遺伝子工学 的に製造することができる。 C 277— C o 1 Vは該公開公報に F ERM P— 1 2560として記載され、 現在はブタぺスト条約の下、 F ERM B P- 5277の受託番号で茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の通産省 工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている大腸菌 （原寄託曰 ： 平成 3年 10月 7曰） を使用することによって得ることができる。
配列番号 8で表される、 フィブロネクチン由来の C S— 1細胞接着領域 を有する上記の C 277— C 0 1 Vの誘導体ポリぺプチド （以下、 C一 C 0 1 V - C S 1と称する） は以下に示す方法によって作製することができ る。 ブタペスト条約の下、 FERM B P— 2800の受託番号で茨城県 つくば巿東 1丁目 1番 3号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に 寄託されている大腸菌 （原寄託日 ：平成 1年 5月 12曰） より調製される プラスミ ド p CH 102を铸型とし、 プライマー C S 1— S (配列表の配 列番号 9にその塩基配列を示す） および M4を用いた P C R反応により增 幅される DNA断片を制限酵素 Nh e I、 S a l Iで消化した後に単離す る。
一方、 上記 C 277 -C o 1 Vをコードする遺伝子を含み、 上記大腸菌 FERM B P— 5277より調製されるプラスミ ド pTF 7520 C o 1 Vを铸型とし、 プライマー C F、 および CNRを用いた P CR反応によ り增幅される DN A断片を制限酵素 A c c III、 Nh e Iで消化した後に 単離する。 配列表の配列番号 10および 12に C Fおよび CNRのそれぞ れの塩基配列を示す。 上記の 2つの DNA断片を、 プラスミ ド p TF 75 20 C 0 1 Vを制限酵素 A c cIII、 S a i lで消化して得られる約 4.4 k bの DNA断片と混合し、 ライゲーションを行って得られる組換えブラ スミ ドは C 277— C o 1 Vの C末端側に C S— 1細胞接着領域を有し、 C 0 1 Vの C末端より 2番目のグルタミ ン酸がァラニンに、 C末端のスレ ォニンがセリンにそれぞれ置換されたポリべプチド、 C— C o 1 V— C S 1をコードしている。 このプラスミ ドで形質転換された大腸菌を培養した 後、 培養物より目的のポリべプチドを取得することができる。 この C一 C 0 1 V- C S 1は C S— 1結合性を有する標的細胞、 特に幹細胞への遺伝 子導入において特に有用である。
ポリ リジンとしては、 上記のごとく、 市販のポリ リ ジンより適当な重台 度のポリ リ ジンを選択し、 使用することができる。
本発明で使用する機能性物質としては、 上記の機能性物質の誘導体も使 用することができる。 上記の C一 F G F— C S 1またはその機能的同等物、 C _ C o 1 V— C S 1またはその機能的同等物はその例である。 また、 こ れらの機能性物質を複数の分子結合させた重合体や、 機能性物質を公知方 法により修飾したもの （糖鎖の付加等） も本発明に使用することができる c これら誘導体および該誘導体の機能的同等物は、 該誘導体をコードする遺 伝子および該誘導体の機能的同等物をコ一ドする遺伝子を用いて遺伝子ェ 学的に製造することもできる。 さらに、 これらの機能性物質のアミノ酸配 列中にシスティ ンを付加、 挿入、 置換することにより、 機能性物質の誘導 体の作製に有用なシスティン化機能性物質を作製することができる。 また、 システィン化機能性物質であって、 レトロウィルス結合部位を有する分子 と、 システィン化機能性物質であって標的細胞結合部位を有する他の分子 とを結合させることも容易である。 さらに、 システィ ン化機能性物質のシ スティン残基の反応性を利用して他の機能性物質との結合体を作製するこ とができる。
別の好ましい態様では、 レトロウィルスべクターによる標的細胞への遺 伝子導入効率を高めるフィブロネクチンのレトロウィルス結合部位ポリベ プチドの重合体を用いて遺伝子導入を行う。
該機能性物質は上記 W〇 9 5 / 2 6 2 0 0号に記載の、 ヒ トフイブロネ クチンのへパリンー I I結合領域を一分子内に複数個有するポリぺプチド、 および該ポリペプチドの誘導体である。 なお、 本発明に使用する機能性物 質としては、 該機能性物質と同等の活性を有する範囲内で、 天然起源のポ リベプチドとはそのァミ ノ酸配列が一部異なっている機能的同等物を含む ことができる。
用いる機能性物質の重合体としては上記のフィブロネクチン由来のポリ ぺプチドを酵素学的または化学的に重台させたものや、 遺伝子工学的に作 製されたものがある。 フイブロネクチンのへパリ ン一 I I結合領域を一分 子内に 2個有するポリベプチドとしては配列表の配列番号 1 3にアミ ノ酸 配列を示すポリペプチド （以下、 H 2— 5 4 7と称す） が挙げられる。 H 2— 5 4 7はブタペスト条約の下、 F E R M B P— 5 6 5 6の受託番号 で茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の通産省工業技術院生命工学工業技術 研究所に寄託されている大腸菌 （原寄託日 ：平成 8年 9月 6曰） を使用し、 本明細書に記載の方法によって取得することができる。 また、 配列表の配 列番号 1 4にァミノ酸配列を示すポリべプチドは、 H 2— 5 4 7の N末端 にフィブロネクチンの細胞接着部位ポリぺプチドが結合した誘導体ポリぺ プチド （以下、 C H 2— 8 2 6と称す） である。 該ポリべプチドは本明細 書に記載の方法にしたがって取得することができる。 さらに、 配列表の配 列番号 3 0にァミノ酸配列を示すポリぺプチドは、 H 2— 5 4 7の C末端 にフイブロネクチンの C S - 1細胞接着領域を結合した誘導体ポリベプチ ド （以下、 H 2 S— 5 7 3と称す） である。 該ポリベプチドはブタべス 卜 条約の下、 F E R M B P— 5 6 5 5の受託番号で茨城県つくば市東 1丁 目 1番 3号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている 大腸菌 （原寄託日 ：平成 8年 9月 6日） を使用し、 本明細書に記載の方法 によって取得することができる。 C S— 1細胞接着領域を有する H 2 S - 5 7 3は造血幹細胞への遺伝子導入に有用である。
また、 別の好ましい態様においては、 、 レトロウイルスベクタ一による 標的細胞への遺伝子導入において、 レトロウィルスベクターによる細胞へ の遺 ί云子導入効率を向上させるのに有効な、 ビーズ上に固定された機能性 物質との共存下に複製能欠損組換えレトロウィルスべクターを生存可能な 標的細胞に感染させる。
従来の、 上記の W O 9 5 / 2 6 2 0 0号および Nature Medicineに記載 の機能性物質を用いてレトロウィルスベクターによる標的細胞への遺伝子 導入効率を向上させる方法は、 これまではウィルスを細胞に感染させる際 に使用する容器 （細胞培養用のプレート） の表面に該機能性物質を固定化 することにより実施されてきた。 この方法では、 プレー卜を機能性物質を 含有する溶液で処理した後、 さらに余分の機能性物質を洗い流すなど、 煩 雑な操作を要する。
このように、 機能性物質が固定化されたプレー卜を使用する遺伝子導入 方法は簡便な方法とは言い難い。 これに対して、 機能性物質をビーズ上に 固定して使用する方法はつぎのような利点を有している。
機能性物質をビーズに固定する操作はプレー卜の場合に比べて小さなス ペースで行うことができ、 また、 ビーズを密閉可能な容器中で取り扱える。 機能性物質が固定化されたプレートはその表面が空気にさらされるため、 安定性の低い機能性物質の場合には保存中の乾燥による機能性物質の変質 等に気を配る必要があるが、 ビーズは溶液中に懸濁して保存することがで きるため、 乾燥の危険はない。 さらにビーズの使用は機能性物質の存在す る表面積を大きくすることから、 プレート使用に比べて高い遗伝子導入効 率を得ることも可能となる。
機能性物質の固定化は常法により行えばよく、 例えば、 標的細胞培養容 器に固定化しても良く、 例えば、 細胞培養用のビーズに固定化しても良い ビーズの素材、 材質等は使用する目的によって選択することができる。 ビ ーズとしては、 例えば、 中心の丸い、 または球状の核を持ち、 核の表面は 親水性のポリマーで被覆されているものでもよい。 この核ゃポリマーの素 材としては、 例えば、 特表平 8— 5 0 1 0 9 2号に記載のものが例示され る。 例えば、 生分解性ビーズを使用し、 これらの機能性物質が固定化され たビーズを生体内に投与することもできる。 また、 レ トロウイルス結合部 位を有する分子が固定化されたビーズと、 標的細胞結合部位を有する他の 分子が固定化されたビーズとを混合して使用するのも効率の良い方法であ る。
これらの機能性物質を固定化せずに使用する場合は、 例えば、 標的細胞 培養容器を、 予め、 該機能性物質の吸着を防止する物質、 例えば、 牛血清 アルブミ ン （B S A ) で前処理し、 これらの機能性物質の非特異的吸着を 防止して使用すればよい。
本発明によれば、 このような非固定の系においても、 本発明に使用する 機能性物質により、 遺伝子導入が効率良く達成される。
また、 後に説明する、 本発明の方法の実施用に設計されたキッ トは、 細 胞への遺伝子導入を極めて簡便に実施することを可能にする。
上記のごとく、 本発明の方法によって遺伝子を導入された細胞は生体に 移植することが可能であり、 これによつて生体内で外来遺伝子を発現させ る遺伝子治療を行うことができる。
例えば、 造血幹細胞を標的細胞とした遺伝子治療は以下のような操作に よって実施することができる。 まず、 ドナーより造血幹細胞を含有する材 料、 例えば、 骨髄組織、 末梢血液、 臍帯血液等を採取する。 これらの材料 はそのまま遺伝子導入操作に用いることも可能であるが、 通常は、 密度勾 配遠心分離等の方法により造血幹細胞が含まれる単核細胞画分を調製する 力、、 さらに、 C D 3 4および Zまたは C一 k i t といった細胞表面のマー カー分子を利用した造血幹細胞の精製を行う。 これらの造血幹細胞を含有 する材料について、 必要に応じて適当な細胞増殖因子等を用いた予備刺激 を行った後、 本発明の方法、 とりわけ、 造血幹細胞への結合活性を有する 機能性物質の存在下に、 目的とする遺伝子を挿入された組換えレトロウイ ルスベクターを感染させる。 こう して得られた遺伝子導入された細胞は、 例えば、 静脈内投与によってレシピエン トに移植することができる。 レシ ピエントは、 好ましくはドナー自身である力^ 同種異系移植を行うことも 可能であり、 例えば、 臍帯血液を材料とした場合には同種異系移植が行わ れる。
造血幹細胞を標的とした遺伝子治療としては、 患者において欠損してい るか、 異常が見られる遺伝子を補完するものがあり、 例えば、 A D A欠損 症やゴーシ I病の遺伝子治療がこれにあたる。 この他、 例えば、 ガンや白 血病の治療に使用される化学療法剤による造血細胞の障害を緩和するため に、 造血幹細胞への薬剤耐性遺伝子の導入が行われることがある。
造血幹細胞は V L A— 4レセプターを発現していることが知られており、 本発明により開示された C S— 1細胞接着領域を有する機能性物質を利用 して効率よく遺伝子導入を行うことが可能である。 また、 造血幹細胞表面 には上記のように C D 3 4、 C - k i tといった分子も発現されており、 これらの分子に対する抗体や C— k i tのリガンドである幹細胞因子 （st era cell factor) をレトロウィルス結合部位を有する機能性物質と組み合 わせることによつても、 遺伝子導入効率を向上させることができる。
また、 癌の遺伝子治療法としては、 癌細胞にサイ トカイン類の遺伝子を 導入した後にその増殖能力を奪って患者の体内に戻し、 腫瘍免疫を増強さ せる腫瘍ワクチン療法が研究されている （Human Gene Therapy, 第 5巻、 第 153〜164頁、 1994年） 。 癌細胞に高い親和性を有する機能性物質を用い て本発明の方法を適用することにより、 このような遺伝子治療も、 より効 果の高いものとなる。
また、 A I D Sを遺伝子治療法によって治療しようという試みも行われ ている。 この場合には、 A I D Sの原因である H I V (ヒ 卜免疫不全ウイ ルス） の感染する T細胞に、 H I Vの複製や遺伝子発現を妨げるような核 酸分子 （アンチセンス核酸ゃリボザィム等） をコー ドする遺伝子を導入す ることが考えられている （例えば、 J. Virol.、 第 69巻、 第 4045〜4052頁、 1995年） 。 T細胞への遺伝子導入は、 T細胞表面に存在する分子に結合す る機能性物質、 例えば抗 C D 4抗体等を利用し、 本発明の方法により達成
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することができる。 5 このように、 遺伝子導入される標的細胞としては、 上記した本発明の態 様に従って、 該標的細胞結合部位を有する機能性物質が入手、 あるいは作 製可能な範囲の任意の細胞を使用することができる。
また、 本発明の方法は標的細胞をレトロウィルス産生細胞の存在下で共 培養する必要のないこと、 およびヒ トにおいては臨床での使用に問題のあ るへキサジメ トリン ·ブロミ ドを使用しないこと等の点から、 臨床におけ る遺伝子治療のプロ トコールとしても適したものといえる。
さらに、 遺伝子治療以外の分野への本発明の適用として、 例えば、 標的 細胞として胚形成幹細胞、 プライモディアル ' ジャーム ' セル、 卵母細胞、 卵原細胞、 卵子、 精母細胞、 精子等を使用した、 トランスジエニック脊椎 動物の簡便な作成を挙げることができる。
すなわち、 本発明は、 その 1つの態様として、 本発明の方法で得られる 形質転換細胞を脊椎動物に移植する細胞移植方法も提供する。 形質転換細 胞が移植される脊椎動物としては、 哺乳類 （例、 マウス、 ラッ 卜、 ゥサギ、 ャギ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ィヌ、 サル、 チンパンジー、 ヒ ト等） 、 鳥類 （例 、 ニヮ トリ、 七面鳥、 ゥズラ、 ァヒル、 カモ等） 、 爬虫類 （例、 へビ、 ヮ 二、 カメ等） 、 両生類 （例、 力エル、 サンショウゥォ、 ィモリ等） 、 魚類 (例、 アジ、 サバ、 スズキ、 タイ、 ハタ、 プリ、 マグロ、 サケ、 マス、 コ ィ、 ァュ、 ゥナギ、 ヒラメ、 サメ、 エイ、 チョウザメ等） が挙げられる。 かく して、 本発明のこの態様によれば、 実質的に純粋なフイブロネクチ ン、 実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物 と同様に、 本発明に使用する機能性物質のレトロウィルス結合部位と標的 細胞結合部位により、 レトロウィルスによる遺伝子導入が効率良く行われ る。 それにより、 従来の方法の限界を有していない、 遺伝子材料の脊椎動 物細胞内への効率的な導入可能な技術が提供できる。
本発明のさらなる別の態様においては、 レ 卜ロウィルス結合部位と、 標 的細胞結合部位とを同一分子中に有する、 実質的に純粋なフィブロネクチ ン、 実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物 と同等の機能を有する物質の有効量を機能性物質として使用する。
かかる機能性物質としては、 フイブロネクチン、 フイブロネクチンフラ グメン卜またはそれらの混合物と同等の効率で遺伝子導入を行う物質であ り、 典型的には、 上記した本発明による新規なレトロウイルス結台部位と 標的細胞結合部位とを同一分子中に有する機能性物質が挙げられる。 これ らの機能性物質を使用する場合は、 少なくとも 1以上の機能性物質にレト ロウィルスと標的細胞とが結合すると考えられる。
上記したレ トロウィルス結合部位と、 標的細胞結台部位とを同一分子中 に有する機能性物質は、 例えば、 配列表の配列番号 2 1および 2 2で表さ れるポリぺプチド （以下、 各々、 C H V— 1 8 1および C H V— 1 7 9と 称する） が包含される。
これらのぺプチドは H— 2 7 1中に含まれる ΠΙ型類似配列 （III一 1 2 - III - 1 3 、 III - 1 4 ) を含むものであり、 C H V— 1 8 1は III一 1 2 . ΙΠ- 13配列が、 また、 C H V— 1 79は III一 13 、 III— 14配列が それぞれフィブロネクチンの細胞接着ポリぺプチド （P r o 1239— S e r 1515) の C末端にメチォニンを介して付加されたものである。
ポリぺプチド CH V— 181を発現するためのブラスミ ドは、 例えば、 以下に示す方法によって構築することができる。
まず、 フイブロネクチンのへパリン結合ポリべプチド （H— 271) を コードする DNA断片を含有するプラスミ ド pHD 101を ェシ リヒ ァ · コリ （Escherichia coli) HB l O l/pHD I O l (FERM B P— 2264) より調製する。 このプラスミ ド上の III一 13配列の C末 端をコードする領域に部位特異的変異導人方法によって H 1 n dillサイ 卜を導入した後、 これを N c 0 I、 H i n dillで消化し、 III一 12、 II I一 13配列をコ一ドする DN A断片を得る。 一方、 プラスミ ドベクター P I ΝΠΙ— omp A1を H i n dIII、 S a i lで消化し、 リポプロティ ン夕一ミネーター領域をコ一ドする DN A断片を得る。
つぎに、 フイブロネクチンの細胞接着ポリべプチド （C一 279) をコ 一ドする DN A断片を含有するプラスミ ド pTF 7021を ェシエリヒ ァ ' コ リ (Escherichia coli) JM109/pTF 7021 (FERM B P— 1941) より調製し、 このプラスミ ド上の C一 279の停止コ ド ンの直前に部位特異的変異導入方法によって Nc 0 Iサイ 卜を導入したプ ラスミ ド pTF 7520を作製する。 このプラスミ ドを N c o I、 S a l Iで消化した後、 上記の III一 12、 III一 13配列をコ一ドする DN A断 片、 およびリポプロテインターミネーター領域をコ一ドする DN A断片と 混合してライゲ一ションを行うことにより、 ポリべプチド CHV— 181 を発現するためのプラスミ ド p CHV 181を得ることができる。 配列表 の配列番号 27にブラスミ ド p CH V 181上のポリぺプチド C H V— 1 81をコードする領域の塩基配列を示す。
また、 ポリペプチド C HV— 179を発現するためのプラスミ ドは、 例 えば、 以下に示す方法によって構築することができる。
まず、 上記のプラスミ ド pHD l 01上の III— 13配列の N末端をコ ―ドする領域に部位特異的変異導入方法によって N c 0 Iサイ トを導入し た後、 これを N c 0 I、 H i n dillで消化し、 III— 13、 III- 14配 列をコードする DN A断片を得る。 これと、 上記のリポプロテインターミ ネーター領域をコードする DN A断片と、 N c 0 Iおよび S a 1 Iで消化 したプラスミ ド p T F 7520とを混合してライゲーシヨ ンを行うことに より、 ポリべプチド CHV_ 179を発現するためのプラスミ ド p CHV 179を得ることができる。
CHV- 181および CHV— 179はそれぞれ上記のプラスミ ドで形 質転換された大腸菌を培養した後、 得られた培養物より精製を行って取得 することができる。
これらの機能性物質も、 非固定でも、 上記と同様に、 例えば、 ビーズに 固定しても使用できる。
さらに別の態様では、 本発明は、 （1) 上記のレ 卜ロウィルス結合部位 を有する有効量の機能性物質と、 標的細胞結合部位を有する他の有効量の 機能性物質の混合物または （2) 上記の本発明の新規なレ トロウイルス結 合部位および標的細胞結合部位の有効量を同一分子中に有する機能性物質 を含有するレトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用する標的 細胞の培養培地を提供するもので、 機能性物質は非固定でも、 固定化され ていてもよい。
本発明の培養培地の他の成分は、 標的細胞の培養に使用できるものであ れば特に制限はなく、 市販の細胞培養用培地を使用してもよい。 また、 本 発明の培地は、 血清や標的細胞の生育に必要な細胞増殖因子、 微生物など による汚染を防ぐための抗生物質等を含むことができる。 例えば、 N I H /3 T 3細胞の場合には、 1 0%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） と、 5 0単 位 Zm 1 のぺニシリ ン、 5 0〃 g/m 1 のス ト レプトマイシン （共にギブ コ社製） とを含有するダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM、 J RHバ ィォサイエンス社製） を培養培地に用いることができる。
さらに別の態様では、 本発明は、 （1 ) 上記したレ トロウイルス結合部 位を有する分子と、 標的細胞結合部位を有する他の分子との混合物、 （2) 上記した本発明による新規なレトロウィルス結合部位と、 標的細胞結合部 位とを同一分子中に有する機能性物質、 または （3) 上記したレトロウイ ルス結合部位を有する機能性物質と接触したレ トロウイルスを含有する培 地をインキュベー卜することを特徴とするレ卜ロウィルスの配置方法を提 供する。
該機能性物質は、 非固定でも、 上記のごとく、 固定化されていてもよい。 ィンキュベーションは、 常法に従って行うことができ、 例えば、 3 7て、 C〇2濃度 5%、 湿度 9 9. 5%の条件で行うことができる。 この条件は、 使用する標的細胞に応じて適宜調整し、 また、 培養時間も細胞や目的に応 じて変更することができる。
本発明の方法を使用すれば、 例えば、 標的細胞にウィルスを送達する広 範囲の構築物中にゥィルス粒子を配置させることができる。
本発明の別の態様では、 標的細胞内へのレ卜ロウィルス介在遺伝子導入 の実施に使用するためのキッ 卜を提供する。
該キッ 卜は、
(a ) 有効量の、 （1 ) 上記したレ トロウイルス結合部位を有する分子 と、 標的細胞結合部位を有する他の分子との混台物または （2) 上記した 本発明による新規なレトロウィルス結合部位と、 標的細胞結合部位とを同 一分子中に有する機能性物質、
( b ) 標的細胞と接触したレ 卜ロウィルスをイ ンキュベー 卜するための 入ェ基質、 および
( c ) 上記標的細胞を予備刺激するための標的細胞増殖因子、
を含んでなるキッ 卜を提供するもので、 （a ) の機能性物質は、 非固定で も、 固定化されていてもよく、 このキッ トは、 さらに、 遺伝子導入に使用 する組換えレトロウィルスベクタ一や、 必要な緩衝剤等を含有していても よい。
人工基質としては、 細胞培養用のプレート、 ペト リ皿、 フラスコ等を用 いることができ、 例えば、 ボリスチレン製のものを使用できる。
標的細胞が G o期の細胞である場合には、 レ卜ロウィルスが感染しない ため、 予備刺激によって細胞周期に誘導することが好ましく、 この目的で、 レ トロウィルスの感染に先立って、 標的細胞を適当な標的細胞增殖因子の 存在下で培養する。 例えば、 骨髄細胞や造血幹細胞に遺伝子導入を行う場 合の予備刺激には、 インターロイキン一 6および幹細胞因子のような標的 細胞増殖因子が使用される。
キッ 卜の各構成成分は、 各々、 自体公知の方法により、 水溶液の他、 凍 結乾燥物、 顆粒、 錠剤等の剤形とすることができ、
本発明のキッ トを使用することにより、 例えば、 形質転換された生存可 能な標的細胞培養物を得ることができ、 標的細胞内へのレ トロウィルス介 在の遺伝子導入を簡便に実施することができる。
本発明はまた、 実質的に純粋なフイブロネクチン、 実質的に純粋なフィ ブロネクチンフラグメントおよびそれらの混合物より選択される機能性物 質またはその重合体の有効量の非固定化物またはビーズ固定化物を使用す る、 レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入も包含する。
本発明は、 上記の C H 2— 8 2 6およびその機能的同等物を包含する。 また、 本発明は、 C H 2— 8 2 6をコードする遺伝子を提供し、 配列表の 配列番号 2 0で表される遺伝子がその 1例である。 本発明はこれらの遺伝 子の機能的同等物も包含する。
さらに、 本発明は、 上記の C H V— 1 8 1を提供し、 本発明はその機能 的同等物を包含する。 また、 C H V— 1 8 1をコードする遺伝子を提供し、 配列表の配列番号 2 7で表される遺伝子がその 1例である。 本発明はこの 遺伝子の機能的同等物を包含する。
本発明はまた、 レトロウィルス結合部位の重合体および/または標的細 胞結合部位の重合体を含有する重合体を提供することができる。 重合体の 具体例としては線維芽細胞増殖因子の重合体、 V型コラーゲン由来のィン スリン結合部位を有するポリべプチドの重合体が例示される。 これらの重 合体をコ一ドする遺伝子も提供する。
以下に考察するように、 本発明は特定の理論によって限定されるもので はないが、 レトロウィルスと細胞とをそれぞれの機能領域部位に結台させ ることによって、 レトロウイルスによる細胞への遺伝子導入、 すなわち形 質転換が促進される。
レトロウイルスと結合し、 その結果、 本発明で有効に役立つ機能性物質 としては、 実質的に純粋なフイブロネクチン、 実質的に純粋なフイブロネ クチンフラグメ ン トまたはそれらの混合物がある力 <、 本発明者らは、 上記 したような、 これらと実質的に同等な機能を有する本発明の機能性物質が 標的細胞のレトロウィルスによる遺伝子導入効率、 すなわち形質転換効率 を向上させることを見出したのである。
本明細書中に記載のフィブロネクチンのフラグメ ントは天然または台成 起源のものであることができ、 例えば、 ルォスラチ （Ruoslahti) ら （ 1 981年）、 J. Biol. Chem. 256 ： 7277 ； パテル （Patel) および 口ディ ッ シュ （Lodish) ( 1986年）、 J. Cell. Biol. 102 : 449 ； およびべルナルディ （Bernardi) 等 （1987年）、 J. Cell. Biol. 1 05 : 489 によって既に記載されたようにして、 天然起源の物質から 実質的に純粋な形態で製造することができる。 この点に関して、 本明細書 で実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメン卜 と称しているのは、 これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在 する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。
本明細書中に記載の実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネ クチンフラグメ ン卜は、 例えば、 米国特許第 5, 198.423号に一般的 に記載されているようにして、 遺伝子組換え体より製造することもできる。 特に、 下記実施例で H— 271、 H— 296、 CH— 271 (配列番号 2 3) および CH— 296 (配列番号 24) として同定された組換え体フラ グメントならびにこれらを取得する方法はこの特許に詳細に記載されてい る。 下記実施例で使用した C一 274フラグメ ントは米国特許第 5, 10 2, 988号に記載されているようにして得た。 これらフラグメントまた はこれらフラグメン卜から定型的に誘導できるフラグメン 卜は、 米国特許 第 5, 198, 423号にも記載されているように、 ブタぺスト条約の下、 茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM P— 10721 (H— 296) (原寄託曰 ：平成 1年 5月 12日） 、 FERM BP— 2799 (メチォニンを介して H— 271と S合した C— 277、 すなわち、 CH— 271) (原寄託日 ：平成 1年 5月 12曰） 、 FERM B P— 2800 (メチォニンを介して H— 296と結合した C— 277、 すなわち、 CH— 296) (原寄託曰 ：平成 1年 5月 12日） および FERM BP— 2264 (H—271) (原寄託日 ：平成 1年 1 月 30曰） の受託番号のもとで寄託された大腸菌を培養することによって 入手することができる。
さらに、 本明細書で使用できるフイブロネクチンフラグメントまたはこ のようなフラグメントの出発物質に関する有用な情報は、 キミヅカ （Kini zuka) ら、 J. Biochem. 110、 284〜 291 (1991年） （これは 上記した組換体フラグメン卜に関してさらに報告している） ； EMBO J.、 4、 1755〜1759 (1985年） （これはヒ トフイブロネクチン遺 伝子の構造を報告している） ； および Biochemistry、 25、 4936〜 4941 (1986年） （これはヒ トフィブロネクチンのへパリン一 I I 結合領域について報告している） 中に見ることができる。 例えば、 下記実 施例に報告されているような種々の組換え体フラグメン卜中に含まれるよ うな C S— 1細胞接着領域とへパリンー I I結合領域との両方を有するフィ ブロネクチンフラグメントは、 これまでの研究で造血細胞内への遺伝子導 入効率を顕著に高めることが分かっている。
かく して、 本明細書中に記載のフイブロネクチン関連ポリペプチドは、 フイブロネクチンの C S— 1細胞接着領域の細胞結合活性を提供するアミ ノ.酸配列ならびにウィルスと結合するフィブロネクチンのへパリンー I I 結台領域のァミノ酸配列を提供する。
なお、 上記 WO 95/26200号に記載の、 レトロウィルスベクター による形質転換を高めるために使用されるウィルス結合ポリベプチドは ( i )ヒ トフィブロネクチンのへパリ ンー I I結合領域の Alal690— Thrl9 60に相当する、 下記の式 （配列番号 1) で表される第 1のアミノ酸配列：
Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys P e T r Gin Val T r Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gi n Leu Thr Gly Tyr Arg Val
Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met し ys Glu lie Asn Leu Ala
Pro Asp Ser Ser Ser Val Val VAl Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr
Glu Val Ser val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin
Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val
Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu
Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Cys Pro Asp VAl Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu
Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala
Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser
Asn し en Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin
Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Cys Pro Gly
Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala
Thr He Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala
Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr ; またはレトロウィルスと結合する能力を有し、 上記の配列に十分類似した ァミノ酸配列および （i i) ヒ トフイブロネクチンの I I I C S結合ドメィ ンの 1部分に相当する、 下記の式 （配列番号 2 ) で表される第 2のァミノ 酸配列 （ C S— 1 ) ：
Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly
Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr ; または原始前駆細胞およびノまたは長期再定住 （幹） 細胞のような造血細 胞と結合する能力を有し、 上記の配列に十分類似したァミノ酸配列を含む。 なお、 上記の配列表の配列番号 1で表されるポリペプチド （H— 2 7 1 ) のレトロウィルス結合活性は濃度依存性を示し、 実施例 8に示すように高 濃度下においては、 C H— 2 7 1と実質的に同等の活性を示す。 すなわち、 高濃度の有効量の H— 2 7 1の存在下ではじめてレトロウィルスと標的細 胞とは、 少なくとも 1分子以上の H— 2 7 1に結合することが本発明によ り見い出された。
本発明で使用する機能性物質中のレトロウィルス結合部位とレトロウイ ルスとの強力な結合は、 広範囲の細胞種においてウィルスを用いた治療法 のための送達系を構築するために使用することができる。 この目的のため に、 本発明で使用する機能性物質のレ 卜ロウィルス結合部位を含むポリベ プチドは、 構築物として標的細胞特異性を与える任意の細胞結合部位を含 む物質と結合させる場合もあり、 またはその細胞接着部位を含む物質と共 存させる場合もある。 すなわち、 レ トロウイルス結合部位を有する機能性 物質性と、 細胞結合部位を有する機能性物質性物質は結合していても良く、 また異なる分子として共存していても良い。
この方法は、 各標的細胞用に特別のレトロウィルス細胞株を構築するこ れまでの必要性を回避することができ、 目的の標的細胞の種類により、 最 適の標的細胞結合部位を有する機能性物質の選択が容易になる。 したがつ て、 本発明の機能性物質を使用することにより、 使用する標的細胞に特異 的なタ一ゲティ ングが容易に実施され、 特にレトロウィルス結合部位を有 する機能性物質性と、 細胞結合部位を有する機能性物質性物質の混合物を 使用する本発明の方法は、 目的の標的細胞への目的の遺伝子導入効率の向 上に、 極めて有用である。 また本発明が提供する新規機能性物質はレ トロ ウィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率の向上させる方法および関連 の技術において、 極めて有用である。
以下に実施例を挙げて、 さらに詳しく本発明を説明するが、 本発明は下 記実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例 1
(1) ウィルス上清液の調製
レ トロウイルスプラスミ ド、 PM5 n e oベクター （Exp. Hematol.、 第 23卷、 第 630〜638頁、 1995年） を含有する G P + E— 86細胞 （ATC C CRL— 9642) は 10% ゥシ胎児血清 （FCS、 ギブコ社製） ならびに 50単位 Znilのぺニシリンおよび 50 /zgZmlのス ト レプトマイ シン （共にギブコ社製） を含有するダルベッコ改変イーグル培地 （DME M、 J RHバイオサイエンス社製） 中で培養した。 なお、 以降の操作に使 用した DM EMはすべて 50単位/ mlのぺニシリンおよび 50 gZmIの ストレプトマイシンを含んだものである。 PM5 n e oウィルス含有上清 液は上記産生細胞をセミ コンフルェン卜に生育させたプレート （ 10cm径 のゼラチンコー卜細胞培養用ディシュ、 岩城硝子社製） に 10% F C S を含有する 4 mlの D MEMを添加し、 一夜培養した後に採集して調製した c 採集した培地上清を 0. 45ミ クロンのフィルター （ミ リポア社製） でろ 過してウィルス上清液ストツクとし、 使用するまでは一 80°Cで保存した c また、 レトロウイルスプラスミ ド、 TKNEOベクター （Blood、 第 78 巻、 第 310〜317頁、 1991年） については G P+ e n v Am- 12細胞 （A TC C CRL- 9641) を使用し、 上記同様の操作を行って T K N E 0ウィルス上清液を調製した。
(2) 上清液のウィルス力価の測定
上清液のウィルス力価は N I H/3 T 3 細胞を使用して標準的な方法 (J. Virol.、 第 62巻、 第 1120〜1124頁、 1988年） に従って測定した。 す なわち、 6ゥエルの組織培養プレー 卜の 1ゥエルあたりに 2 0 00個の N I H/3 T 3細胞 （AT C C C R L - 1 6 5 8) を含む D M E Mを添加 し、 一夜培養した後、 系列希釈したウィルス上清液と終濃度 7. 5 g/m 1のへキサジメ トリ ン *ブロミ ド （ポリブレン ： アルドリ ツチ社製） とを 各ゥエルに加えた。 これを 3 7°Cで 2 4時間インキュベートした後、 培地 を終濃度 0. 7 5^/^1の G 4 1 8 (ギブコ社製） を含有するものと交換 してさらにインキュベー トを続けた。 1 0〜1 2曰後に生育した G 4 1 8 耐性 （G 4 1 8つ コロニーをクリスタルバイオレッ 卜で染色しその数を 記録した。 ゥエルあたりのコロニー数にウィルス上清液の希釈倍率を乗じ た値より、 上清 lml当たりに含まれる感染性粒子数 （cfuZml) を算出し、 これを上清液の力価として以降の実験におけるウィルス上清液の添加量を 決定した。
実施例 2
( 1 ) フイブロネクチン由来ポリペプチドの調製
ヒ トフイブロネクチン由来のポリペプチド、 H— 2 7 1 (配列表の配列 番号 1にそのァミノ酸配列を示す） は該ポリべプチドをコ一ドする DNA を含む組換えプラスミ ド、 p HD 1 0 1を含有する大腸菌、 Escherichia coli HB 1 0 1 /p HD 1 0 1 (F E RM B P— 2 2 6 4 ) より、 米国特許第 5, 1 9 8, 4 23号公報に記載の方法により調製した。
また、 ポリペプチド C H— 2 7 1 (配列表の配列番号 2 3にそのアミノ 酸配列を示す） は以下に示す方法により調製した。 すなわち、 大腸菌、 Es cherichia coli H B 1 0 1/p C H 1 0 1 (F ERM B P— 2 7 9 9) を用い、 これを上記の公報に記載の方法で培養し、 該培養物より CH - 2 7 1を得た。
また、 ポリペプチド C H— 2 96 (配列表の配列番号 2 4にそのアミ ノ 酸配列を示す） は以下に示す方法により調製した。 すなわち、 大腸菌、 Es cherichia coli HB 101/pCH102 CF E RM BP— 280 0) を用い、 これを上記の公報に記載の方法で培養し、 該培養物より CH -296を得た。
ポリべプチド C一 274 (配列表の配列番号 25にそのアミ ノ酸配列を 示す） は以下に示す方法により調製した。 すなわち、 大腸菌、 Escherichi a coli JM109/pTF7221 (FERM BP 1915) を 用い、 これを米国特許第 5, 102, 988号公報に記載の方法で培養し、 該培養物より C一 274を得た。
さらに、 ポリペプチド C 277— C S 1 (配列表の配列番号 29にその アミノ酸配列を示す） は以下に示す方法により調製した。 すなわち、 特開 平 3— 284700号公報に FERM P— 11339として記載され、 現在はブタぺス卜条約の下、 上記の茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の通 産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM B P-57 23として寄託されている大腸菌、 Escherichia coli H B 101 /p C S 25 (原寄託曰 ；平成 2年 3月 5曰） を用い、 これを上記公報に記載 の方法で培養し、 該培養物より C277— CS 1を得た。
(2) C— FGF · Aの調製
ポリべプチド C一 FGF · A (配列表の配列番号 4にそのァミノ酸配歹り を示す） は以下に示す方法に従って調製した。 すなわち、 上記ポリべプチ ドをコ一ドする DN Aを含有する組み換えプラスミ ド、 p YMH— CF · Aを含む大腸菌、 Escherichia coli JMl 09/pYMH-CF - A
(FERM BP— 5278) を 100 gZnilのアンピシリ ンを含む 5 m 1の LB培地中、 37 °Cで 8時間培養した。 この前培養液を 100 ^g/ l のアンピシリ ン、 IraMの I PTG (イソプロピル一 3— D—チォガラク トビラノシド） を含む L B培地 50 Omlに接種し、 37 °Cで一夜培養した 後集菌した。 得られた菌体を lmM PMS F (フヱニルメ タンスルホ二 ゥムフルオリ ド） 、 0. 05% ノニデッ 卜 P— 40を含む 1 Oralの PB S (リン酸緩衝生理食塩水） に懸濁し、 超音波処理を行って菌体を破砕し た後、 遠心分離を行って上清を得た。 この上清の 26 Onmにおける吸光度 を測定して、 これに上清の液量 （ml) を乗じた値を算出し、 この値 400 0に対して lmlの割合で 5%ポリエチレンィ ミ ンを加えた後、 遠心分離し て上清を得た。 この上清をあらかじめ P B Sで平衡化したハイ トラップ一 へパリンカラム （フアルマシア社製） にかけ、 PBSで非吸着の画分を洗 浄した後、 0. 5Mから 2Mの Na C 1濃度勾配を持つ PBSで吸着画分 の溶出を行った。 溶出液を SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （S DS-PAGE) により分析すると約 47 kdのポリべプチドを含む 2つの 画分が存在していたが、 このうちの高 N a C 1濃度で溶出された方の画分 を集めて 1. 5M N a C 1を含む P B Sで平衡化したスーパーロース 6 カラム （フアルマシア社製） にかけた。 溶出液を SDS— PAGEにより 分析し、 約 47 kdのボリべプチドを含む画分を集めて精製 C— F G F · A を調製し、 以下の操作に使用した。
(3) C-FGF-CS 1の調製
まず、 ポリペプチド C一 FG F— C S 1 (配列表の配列番号 5にそのァ ミノ酸配列を示す） を大腸菌を宿主として発現させるためのプラスミ ドを 構築した。
Escherichia coli HB 101/pCHl 02 (FERM BP - 28 00) を培養し、 得られた菌体よりアルカリ一 SDS法によってプラスミ ド P CH 102を調製した。 このプラスミ ドを铸型とし、 プライマー M 4 (宝酒造社製） 及び配列表の配列番号 9に塩基配列を示すブライマ一 C S 1一 Sを用いた P C R反応を行った後、 エタノ一ル沈殿によって反応液中 の増幅 DN A断片を回収した。 得られた DNA断片を N h e U S a 1 I (ともに宝酒造社製） で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い約 9 70 bpの DN A断片をゲルより回収した。
次に Escherichia coli J M 109 / P YMH - C F · A (FERM B P— 5278) を培養し、 得られた菌体よりアルカリ一 SD S法によつ てプラスミ ド p YMH— C F · Aを調製した。 このプラスミ ドを铸型とし、 配列番号 10に塩基配列を示すブライマ一 C F及び配列表の配列番号 11 に塩基配列を示すプライマ一 FN Rを用いた P CR反応を行った後、 エタ ノール沈殿によって反応液中の増幅 DN A断片を回収した。 得られた DN A断片を E c 0 δ 2 I (宝酒造社製） 、 Nh e Iで消化した後、 ァガロー スゲル電気泳動を行い約 320 bpの DN A断片をゲルより回収した。
上記のプラスミ ド p YMH— CF · Αを E c o 52 I、 S a l 1で消化 した後にァガロースゲル電気泳動を行って単離される約 4. 1 k bの DN A断片を上記の約 970 bpの DN A断片及び約 32 ObpのDNA断片と混 合し、 ライゲーシヨンを行って得られる組換えプラスミ ドを大腸菌 J Ml 09に導入した。 得られた形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の 3 つの DN A断片が 1分子ずつ含まれたものを選んでプラスミ ド p C F S 1 00と命名した。 また、 プラスミ ド p C F S 100で形質転換された大腸 菌 J Ml 09を Escherichia coli J M109/p C F S l 00と命名 した。 プラスミ ド p CF S 100は C— FGF . Aの C末端側にフィプロ ネクチン由来の C S— 1細胞接着領域を有し、 FG Fの C末端より 2番目 のリジンがァラニンに置換されたポリべプチド、 C一 FGF— C S 1をコ ―ドしている。
ポリべプチド C一 FGF_C S 1は以下に示す方法に従って調製した。 すなわち、 上記の大腸菌、 Escherichia coli JM109/pCFS l 00を 100 / gZmlのアンピシリンを含む 5ralの L B培地中、 3 Ί。にで 8時間培養した。 この前培養液を 100〃g/mlのアンピシリ ン、 lmMの I卩丁〇を含むし8培地50 Omlに接種し、 37 °Cで一夜培養した後集菌 した。 得られた菌体を 0. 5M NaC l、 lmM PMSF、 0. 05 % ノニデッ ト P— 40を含む 10 mlの PBS (リン酸緩衝生理食塩水） に懸濁し、 超音波処理を行って菌体を破砕した後、 遠心分離を行って上清 を得た。 この上清をあらかじめ 0. 5M N a C 1を含む P B Sで平衡化 したハイ トラップ一へパリンカラムにかけ、 0. 5M NaC lを含む P B Sで非吸着の画分を洗浄した後、 0. 5Mから 2Mの N a C 1濃度勾配 を持つ PBSで吸着画分の溶出を行った。 溶出液を SDS—ポリアクリル アミ ドゲル電気泳動により分析し、 約 50 k dのポリペプチドを含む画分 を集めて精製 C一 FGF— CS 1を調製し、 以下の操作に使用した。 こうして得られた精製 C— FGF— CS 1の N末端から 5番目までのァ ミノ酸配列を調べたところ、 配列表の配列番号 5に示されたァミノ酸配列 のものと一致した。 また、 質量分析法によって測定された精製 C— FGF 一 C S 1の分子量も上記のァミノ酸配列から予想されるものと一致した。
(4) C 277 -CO 1 Vの調製
ポリベプチド C 277— C 01 V (配列表の配列番号 6にそのァミノ酸 配列を示す） は以下に示す操作によって精製した。 すなわち、 上記ポリべ プチドをコードする DNAを含有する組み換えプラスミ ド、 pTF752 0 C o 1 Vを含む大腸菌、 Escherichia coli JM109/pTF75 20 C o 1 V (F ERM BP— 5277) を 100 g/rolのアンピシ リ ンを含む 5mlの L B培地中、 37°Cで 6. 5時間培養した。 この前培養 液を 100 g/mlのアンピンリンを含む L B培地 500mlに接種し、 3 7°Cで培養した。 66 Onmにおける吸光度が 0. 6に達した時点で I PT Gを終濃度 1 mMになるように添加して一夜培養した後に集菌した。 得ら れた菌体を ImM EDTA、 0. 05% ノニデッ ト P— 40、 2mM PMS Fを含む 10 mlの P B Sに懸濁し、 超音波処理を 10分間行って菌 体を破砕した。 この菌体破砕液を遠心分離して得た上清を P B Sで平衡化 したリソース Qカラム （ファルマンァ社製） にかけ、 目的のポリペプチド を含む非吸着画分を得た。 この画分を PB Sで平衡化したハイ トラップ一 へパリンカラムにかけ、 P B Sで非吸着の画分を洗浄した後、 0Mから 0. 5MのN a C 1濃度勾配を持つ P B Sで吸着画分の溶出を行った。 溶出液 を SDS— PAGEにより分析し、 48 kdのポリべプチドを含む画分を集 めて精製 C 277— Co 1 Vを調製し、 以下の操作に使用した。
(5) Co l Vの調製
まず、 ポリペプチド Co I V (配列表の配列番号 6にそのアミノ酸配列 を示す） を大腸菌を宿主として発現させるためのプラスミ ドを構築した。
Escherichia coli HB 101/pTF7520Co l V (FERM
BP— 5277) を培養し、 得られた菌体よりアルカリ一 SDS法によ- てプラスミ ド pTF7520Co 1 Vを調製した。 このプラスミ ドを N c o I、 B amH I (ともに宝酒造社製） で消化後、 ァガロースゲル電気泳 動を行い、 約 0. 58kbの DNA断片をゲルより回収した。 これをあらか じめ Nc 0 Iと B amH Iで消化しておいたプラスミ ドベクター pET8 C (ノバジヱン社製） と混合してライゲーシヨ ンを行った。 得られた組換 えプラスミ ドを大腸菌 BL 21に導入して得られた形質転換体よりプラス ミ ドを調製し、 上記の約 0. 58 kbDN A断片 1分子のみが含まれたもの を選び、 これをプラスミ ド p ETC 0 1 Vと命名した。
上記のプラスミ ド p ETC 01 Vで形質転換された大腸菌 B L 21、 Es cherichia coli B L— 21 Z P E T C o 1 Vを 5◦〃g/mlのアンピシ リ ンを含む 1 Omlの L B培地中、 37 °Cで一夜培養した。 この前培養液 0. 2ralを 50 gノ mlのアンピシリン、 を含む LB培地 100mlに接種し、 37 °Cで培養した。 600^の吸光度が0. 4に達した時点で I P TGを 終濃度 lmMとなるように添加し、 一夜培養した後に集菌した。 得られた 菌体を ImM EDTA、 0. 05% ノニデッ ト P_40、 10 ig/ml ァプロチニン （aprotinin) 、 10 z ml ロイぺプチン （leupeptin) 、 2mM PMS Fを含む 5 mlの P B S (リン酸緩衝生理食塩水） に懸濁 し、 超音波処理を行って菌体を破砕した後、 遠心分離を行って上清を得た c この上清を P B Sで平衡化したハイ 卜ラップ一へパリンカラムにかけ、 P B Sで非吸着の画分を洗浄した後、 0. 5Mの N a C 1を含む P B Sで吸 着画分の溶出を行った。 溶出液を S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳 動により分析した結果、 ほぼ単一な約 18 kdのポリべプチドが確認された c こうして得られた精製 C 01 Vを以下の操作に使用した。
(6) H2 - 547の調製
ポリべプチド H2— 547 (配列表の配列番号 13にそのァミノ酸配列 を示す） を発現させるためのプラスミ ドは以下に示す操作に従って構築し た。 Escherichia coli HB 101/p CH 102 (F ERM BP— 2 800) を培養し、 得られた菌体よりアルカリ一 SDS法によってプラス ミ ド p CH 102を調製した。 このプラスミ ドを铸型とし、 配列表の配列 番号 15に塩基配列を示すブライマ一 12 Sと配列表の配列番号 16に塩 基配列を示すプライマー 14 Aとを用いた P CR反応の後、 ァガ口一スゲ ル電気泳動を行い、 フィブロネクチンのへパリン結合ポリベプチドをコ一 ドする約 0. 8kbの DNA断片をゲルより回収した。 得られた DNA断片 を N c 0 I、 B amH I (ともに宝酒造社製） で消化した後、 N c o I、 B amH Iで消化した pTV 118N (宝酒造社製） と混合してライゲー ションを行い、 大腸菌 J Ml 09に導入した。 得られた形質転換体よりプ ラスミ ドを調製し、 上記の DN A断片を含むプラスミ ドを選んでこれをプ ラスミ ド p RH 1とした。
プラスミ ドベクター p I NIH—ompAi (The EMBO Journal, 第 3巻、 第 2437~2442頁、 1984年） を BamH Iと H i n c n (宝酒造社製） とで 消化し、 リポプロテインターミネータ一領域を含む約 0. 9kbの DNA断 片を回収した。 これを B amH Iと H i n c Πで消化した上記のプラスミ ド pRH 1と混合してライゲーションを行い、 1 a cプロモータ一、 へパ リン結合ポリぺプチドをコ一ドする DN A断片およびリポプロティンター ミネーターをこの順に含むブラスミ ド p RH 1— Tを得た。
プラスミ ド pRHl— Tを Nh e Iと S e a I (ともに宝酒造社製） で 消化して得られる約 3. lkbの DNA断片と、 S p e l (宝酒造社製） と S e a lで消化して得られる約 2. 5 kbの DN A断片をそれぞれ調製し、 この 2つをライゲーシヨンさせることによって 1 a cプロモーター、 へパ リン結合ポリベプチドが 2個タンデムに連結されたポリベプチドをコ一ド するオープンリーディ ングフレーム、 およびリポプロテインターミネータ 一をこの順に含むプラスミ ド pRH2— Tを得た。 上記のオープンリーディ ングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 17に示す。
ポリべプチド H 2— 547は以下の方法により調製した。 100 g/ra 1のアンピシリンを含む 120 mlの L B培地を入れた 500 mlバッフル付 き三角フラスコを 4本用意し、 これに上記のプラスミ ド pRH2— Tで形 質転換された大腸菌 HB 101、 Escherichia coli HB l O l/pRH 2— Tを接種して 37°Cで 1晚培養した。 培養液より遠心分離によって菌 体を集め、 40 mlの破砕用緩衝液 （5 OmM ト リスー HCし 1 mM ED TA、 15 OmM N a C】、 1 mM DT丁、 1 mM PMS F、 p H 7. 5) に懸濁し、 超音波処理を行って菌体を破砕した。 遠心分離を行って得られ た上清を精製用緩衝液 （5 OmM 卜リス一 HC l、 pH 7. 5) で平衡化 されたハイ トラップ一へパリンカラム （フアルマシア社製） にかけた。 同 緩衝液でカラム内の非吸着画分を洗浄した後、 0〜1M Na C 1濃度勾 配を持つ精製用緩衝液で溶出を行った。 溶出液を SDS—ポリアクリルァ ミ ドゲル電気泳動で分析し、 分子量約 6万のポリペプチドを含む画分を集 めて精製 H 2— 547標品を得た。 得られた標品の蛋白量を BCAプロテ インアツセイ リエージヱン 卜 （ピアス社製） により、 ゥシ血清アルブミ ン をスタンダードとして測定したところ、 約 1 Omgの H2— 547が得られ ていた。
こうして得られた精製 H2— 547の N末端から 5残基までののアミノ 酸配列を調べたところ、 配列表の配列番号 17に示される塩基配列から予 想される H 2— 547のアミノ酸配列より N末端のメチォニンが除去され たもの （配列表の配列番号 13にその配列を示す） と一致した。 また、 質 量分析法によって測定された精製 H 2 - 547の分子量は配列表の配列番 号 13に示されるアミノ酸配列から予想されるものと一致した。
(7) CH2 - 826の調製
ポリべプチド CH 2— 826 (配列表の配列番号 14にそのアミノ酸配 列を示す） を発現させるためのプラスミ ドは以下に示す操作に従って構築 した。 上記のプラスミ ド p CH 102を铸型とし、 配列表の配列番号 18 に塩基配列を示すプライマー C L Sと配列表の配列番号 19に塩基配列を 示すプライマー CL Aとを用いた P CR反応の後、 ァガロースゲル電気泳 動を行い、 フイブロネクチンの細胞接着ポリべプチドをコ一ドする約◦. 8 kbの DN A断片をゲルより回収した。 得られた DNA断片を N c o l . B g 1 Π (宝酒造社製） で消化した後、 N c ο I、 B amH Iで消化した P TV 1 18 Nと混合してライゲーションを行い、 大腸菌 J M 109に導 入した。 得られた形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の DNA断片 を含むプラスミ ドを選んでこれをプラスミ ド pRC lとした。 このプラス ミ ド pRC lを S p e lと S e a lで消化して得られる約 2. 5kbのDN A断片と、 上記のプラスミ ド pRH2— Tを Nh e l と S e a lで消化し て得られる約 3. 9 kbの DN A断片とを混台してライゲーションを行い、 細胞接着ポリべプチドの C末端にへパリン結合ポリべプチドが 2個タンデ ムに連結されたポリベプチドをコ一ドするプラスミ ド p R CH 2—丁を得 た。 このポリぺプチドをコ一ドするブラスミ ド p R C H 2— T上のオーブ ンリ一ディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 20に示す。
ポリぺプチド C H 2— 826は実施例 2— （ 6 ) に記載のポリぺプチド H 2 - 547について用いられたものと同様の方法により調製した。 ハイ トラップへパリンカラムの溶出液のうち分子量約 9万のポリベプチドを含 む画分を集めて精製 CH 2— 826標品を得た。
(8) H2 S- 537の調製
ポリべプチド H2 S— 537 (配列表の配列番号 30にそのァミノ酸配 列を示す） を発現させるためのプラスミ ドは以下に示す操作に従って構築 した。 上記のプラスミ ド p CH 102を铸型とし、 配列表の配列番号 31 に塩基配列を示すプライマー C S 1 Sと、 配列表の配列番号 32に塩基配 列を示すプライマー C S 1 Aとを用いた P CR反応の後、 了ガロースゲル 電気泳動を行ってフイブロネクチンの C S - 1細胞接着領域をコードする 約 0. Ikbの DNA断片をゲルより回収した。 得られた DNA断片を N c 0 I、 B amH Iで消化した後、 N c o I、 B a mH Iで消化したプラス ミ ドベクター p TV 1 18 Nと混合してライゲーションを行い、 大腸菌 J Ml 09に導入した。 得られた形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記 の DN A断片を含むプラスミ ドを選んでこれをプラスミ ド pRS lとした。 プラスミ ドベクター p I ΝΙΠ— omp を B amH I と H i n c I I とで消化し、 リポプロテインターミネータ一領域を含む約 0. 91^ 1}の0 N A断片を回収した。 これを B amH Iと H i n c IIとで消化した上記の ブラスミ ド p R S 1と混合してライゲーションを行い、 1 a cプロモータ 一、 C S— 1領域ポリベプチドをコ一ドする DN A断片及びリポプロティ ンタ一ミネーターをこの順に含むプラスミ ド p R S 1一 Tを得た。
プラスミ ド p RS 1— Tを Nh e Iと S c a Iで消化して得られる約 2. 4 k bの DNA断片と、 プラスミ ド p RH2— Tを S p e I、 S e a l . P s ΐ I (宝酒造社製） で消化して得られる約 3. 3 k bのDNA断片を それぞれ調製し、 この 2つをライゲーシヨンさせることによって 1 a cプ 口モーター、 タンデムに並んだ 2個のへパリン結合ポリべプチドの C末端 側にさらに C S— 1領域が連結された構造のポリぺプチドをコ一ドするォ —プンリーディ ングフレーム、 及びリポプロテインターミネータ一をこの 順に含むプラスミ ド pRH2 S— Tを得た。 上記のオープンリーディ ング フレームの塩基配列を配列表の配列番号 32に示す。
ポリペプチド H2 S— 573は実施例 2— (6) に記載のポリペプチド H 2 - 547について用いられたものと同様の方法により調製した。 ハイ トラップへパリンカラムの溶出液のうち分子量約 6万のポリぺプチドを含 む画分を集めて精製 H 2 S— 573標品を得た。
(9) 機能性物質のプレー卜への固定化
機能性物質を固定化されたプレート （6ゥエルの組織培養プレート、 ファ ルコン社製） をレトロウィルスの細胞への感染実験に使用する場合には、 以下に示す操作にしたがって固定化操作を行った。 すなわち、 上記の実施 例に記載の各種機能性物質を適当な濃度となるように P B Sに溶解した溶 液を 1ゥエル （底面積 9. 6 cm2) あたり 2ml添加し、 紫外線の照射下に おいてプレートのふたを開けて 1時間、 さらにふたを閉めて 1時間、 室温 でインキュベートした。 次に機能性物質溶液を 2%のゥシ血清アルブミ ン (B S A、 ベーリ ンガー .マンハイム社製） を含む P B S 2mlに交換し てさらに 3 0分間、 室温でィンキュベー卜した後、 25mM へべス （H E P E S) を含む P B Sでプレートを洗浄した。 B S Aを固定化した対照プ レー卜は、 上記の操作のうちポリぺプチド溶液とのィンキュベ一ションを 省略して作製した。
なお、 以降に示す実施例での遺伝子導入 （ウィルス感染） 実験において は、 特に断らない限り上記の 6ゥエルの組織培養プレートを使用し、 プレ 一卜への固定化に使用した機能性物質の濃度を示す場合には、 ゥエルの単 位底面積あたりの機能性物質量を pmolZcm2 (および ^ gZcm2) を単位と して記載する。 たとえば上記のプレート （底面積 9. 6 cm2) について 4 8 g/mlの H— 2 7 1溶液 2mlを用いて固定化を行った場合には、 「3 33pmol/cra2 ( 1 0
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の H— 2 7 1を用いて固定化した」 と記 載する。 また、 遺伝子導入後の浮遊細胞 （TF— 1、 H L - 60) を培養 する際に用いる CH— 2 96を固定化したプレートは、 4 8pmolZcni2 (3 ^g/cm2) の C H— 2 96溶液を用い、 上記の操作によって固定化を行つ たものである。 以降の実施例において、 標的細胞へのウィルス感染はすべ てポリブレンを含有しない培地中で行った。 また、 使用するウィルス、 細 胞、 培地等の量を示す場合には特に断らない限り 1ゥエルあたりの量を記 載する。
実施例 3
( 1 ) 機能性物質の混台物を用いた遺伝子導入 細胞に結合する物質と、 レ トロウィルスに結合する物質とを混台してプ レー卜に固定化した場合の遺伝子導入効率への影響を調べるために以下に 示す実験を行った。 まず、 実施例 2— (9) に記載の方法に従って 32pra ol/cin2 ( 1. 5 ig/cra2) の C一 FGF ' A、 32 oiol/cm2 (1 g/c in2) の C— 274と 32pmol/cm2 (0. δ ug/cm2) の F GFとの混台 物、 および 32pmol/cm2 (0. δ / g/cm2) の FGF (べク トン *デイ ツ キンソン社製） のそれぞれを用い、 各ポリペプチドをプレートに固定化し た。 これらのプレー卜、 および B S Aを固定化した対照プレートのそれぞ れに 100 Ocfuの PM5 n e 0ウィルスを含む 2 mlのウィルス上清液を 加えて 3 7° (：、 30分間プレインキュベーションした後、 P B Sを用いて プレートを徹底的に洗浄した。 このプレー卜に 2000個の N I HZ3T 3細胞を含む 2nilの DMEM培地を加え、 ポリプレンの非存在下に 3 Ί。に、 2時間ィンキュベーションした後、 非付着細胞はデカンテ一シヨンによつ て、 またプレー卜に付着した細胞はトリブシン処理の後にプレー卜から剥 がすことによってそれぞれ採取し、 これらを合わせた。 得られた細胞懸濁 液を二分して一方を DMEM、 もう一方を終濃度 0. 75mgZn の G 41 8を含む DMEMとともに 37°Cで 10日間培養し、 出現したコロニー数 を数えた。 G 418を含まない培地で得られたコロニー数に対する G 41 8耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、 その結果を図 1に示す。 図中、 横蚰は使用した機能性物質、 縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。 図 1に示されるように、 レトロウィルスの感染時間を 2時間とした場台 には F G F単独では C— F G F · Aに比べて低い遺伝子導入効率しか得ら れないが、 C一 274と FG Fの混合物を固定化したプレートを用いた場 台には、 この 2つのポリぺプチドが共有結合した C— F G F . Aを用いた 場合と同様の効率で G 4 18耐性コロニーが得られた。 詳細な検討を行うために、 C— 2 7 4のみ、 および F G Fのみを固定化 した場合とこれらの混台物を固定化した場合との比較を行った。 すなわち 32 iDol/cm2 ( l //g/cm2) の C一 27 4、 32pmol/cm2 (0. δ g /cm2) の F G F、 および 3 2pmolZc!n2の C— 2 7 4 と 3 2pmol/cm2の F G Fとの混合物のそれぞれを用いて実施例 2— (9 ) に記載の方法によ- てプレートへの固定化を行い、 これらのプレー卜を用いて上記同様の操作 でレ トロウイルス感染への効果を調べた。 得られた結果を図 2に示す。 図 中、 横 $由は使用した機能性物質、 縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ^:す。 図 2に示されるように C一 2 7 4と F G Fとの混合物を固定化したプレ 一トを用いた場合には F G Fのみを固定化したものに比べて高い遺伝子導 入効率を示した。 またレ トロウィルス結合部位を有しない C一 2 7 4のみ を固定化したプレートでは G 4 1 8耐性コロニーは得られなかった。 以上 の実験結果より、 レトロウィルス結合部位を有する F G Fに細胞結合部位 を有する C一 2 7 4を組み合わせることによって F G F単独で使用した場 合に比べて高い感染効率が得られること、 およびこのようなポリべプチド の組み合わせによる効果の発現には必ずしもポリぺプチド鎖が共有結合で 結ばれている必要がないことが示された。
(2) 機能性物質の混合物を用いた遺伝子導入
レトロウィルス結合部位を有するポリべプチドを C 0 1 Vに置き換えて、 実施例 3— ( 1 ) 同様の実験を行った。 本実験においては C一 2 7 4と C 0 1 Vとを種々のモル比で混合した場合を比較した。 すなわち、 3 30pm ol/cm2 (6 ig/cm2) の C o 1 V、 3 3 Opraol/cm2 ( 1 0 gZcm2) の C— 2 7 4と 3 3 OpmolZcm2の C o 1 Vとの混合物 （C一 2 7 4と C o 1 Vのモル比は 1 0 : 1 0) 、 1 0 Opmol/cm2 ( 3 ug/c^) の C— 2 7 4と 3 3 (^！^丄 じ^の。 0 1 Vとの混合物 （3 : 1 0) 、 3 3pmol/c m2 ( 1 ^g/cm2) の C— 2 7 4と 3 3 0ロ11101 (；1112のじ o 1 Vとの混台物 ( 1 ： 1 0 ) 、 3 3 0 pmol/cm2 ( 1 6〃 g/cm2) の 2 7了ー（： 0 1 、 および 3 3 Opmol/cm2 ( 1 0 g/cm2) の C一 2 74のそれぞれを用い て実施例 2— (9) に記載の方法によってプレートへの固定化を行い、 作 製されたプレートを用いて上記同様の操作でレ 卜ロウィルス感染への効果 を調べた。 得られた結果を図 3に示す。 図中、 横轴は使用した機能性物質、 縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。
図 3に示されるように感染時間を 2時間とした場合には C 0 1 Vを固定 化したプレート上での感染効率は C 2 7 7 - C 0 1 V固定化プレートの 1 / 2以下であるが、 （： 0 1 ¥とその 1 1 0量 （分子数として） の C 2 7 4の混合物を固定化したプレー卜を用いた場合には C 2 7 7— C 0 I Vと 同等の感染効率が得られており、 0 の場合同様に〇— 2 74分子のレ トロウィルス感染の促進効果が確かめられた。 なお、 C o 1 V分子に対す る C— 2 7 4分子の割合が上昇した場合にはこの効果はむしろ低下し、 等 量の C 0 1 V、 C - 2 7 4を含む混合物を固定化した場合には C 0 1 Vの みを固定化した場合とほとんど差はみられない。
(3) 機能性物質の混合物を用いた遺伝子導入
細胞結合部位を有する物質と、 レトロウィルス結合部位を有する物質と を混合してプレー卜への固定化を行った場合の遺伝子導入効率への影響を 調べるために以下に示す実験を行った。 まず、 実施例 2— (9) に記載の 方法に従い、 32piDol/cm2 ( 1 ug/cm2) の C一 2 7 4、 3 3 3pmol/c m2 ( 1 0 / g/cm2) の H— 2 7 1、 および 32pmolノ cm2 ( 1 g/cm2) の C一 2 74と 3 3 3pmolノ cm2 ( 1 0 ^g/cm2) の H_ 2 7 1との混合 物のそれぞれを用いてプレー卜への固定化を行った。 これらのプレートそ れぞれに 1 00 Ocfuの PM5 n e oウィルスを含む 2 mlのウィルス上清 液を加え、 3 7°C、 3 0分間プレインキュベーショ ンした後、 P B Sを用 いてプレー卜を徹底的に洗浄した。 このプレートに 2 0 0 0個の N I HZ 3 T 3細胞を含む 2 mlの DM EM培地を加えて 3 7°C、 2時間インキュべ ーションした後、 非付着細胞はデカンテーションによって、 またプレート に付着した細胞はトリブシン処理の後にプレー卜から剥がすことによって それぞれ採取し、 これらを合わせた。 得られた細胞懸濁液を二分して一方 を DMEM、 もう一方を終濃度 0. 7 5mgZralの G 4 1 8を含む DMEM とともに 3 7 °Cで 1 0日間培養し、 出現したコロニー数を数えた。 G 4 1 8を含まない培地で得られたコロニー数に対する G 4 1 8耐性コロニー数 の割合を遺伝子導入効率とし、 その結果を図 4に示す。 図中、 横軸は使用 した機能性物質、 縦轴は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。
図 4に示されるように、 C— 2 7 4と H— 2 7 1の混合物 （モル比 1 ： 1 0) を固定化したプレー卜を用いた場合には H— 27 1のみを固定化し たものに比べて感染効率が大きく上昇した。 なお、 C— 2 7 4のみを固定 化したプレー卜では遺伝子導入は見られなかった。
(4 ) C 277— C S 1を用いた遺伝子導入
細胞結合部位を有する物質として C 277— C S 1を用い、 これとレ トロ ウィルスに結合部位を有する物質とを混合してプレー卜への固定化を行つ た場合の感染効率への影響を調べるために以下に示す実験を行った。 レ卜 ロウィルスに結台する物質としてはポリ リ ジン [ (L y s ) n、 ポリ一 L ーリジン臭化水素酸塩、 分子量 5万〜 1 0万、 和光純薬社製] 、 および H - 2 7 1の 2種を用い、 また細胞には浮遊細胞である T F— 1細胞 （AT C C CRL- 2 003) を用いた。 まず、 実施例 2— (9) に記載の方 法に従い、 以下に示す溶液でプレートへの固定化を行った。 3 3pmolZcm 2 ( 1. 1 g/cm2) の C — C S 1、 1 3 3pmolXcm2 ( 1 0 fig/cm2) のポリ り ジン、 33pmol/cm2の C 277— C S 1と 133pmol/'cm2のポリ リ ジンとの混台物、 333 mol/cm2 ( 10 /ig/cm2) の H— 27 1、 3 3pmolZcm2の C 277— C S 1と 333 pmol/cm2の H— 271との混合物、 および 33pmol/cm2 (2. 1 ^g/cm2) の CH— 296。 これらのプレ ―トそれぞれに 1 x 104 1)ノの TKNE〇ウィルス、 1 X 104個の T F一 1細胞を含む R PM I 1640培地 [5ngZml GM— C F S (ぺト 口 テツク社製） 、 50単位 Zml ぺニシリン、 50 gZmlストレプトマ ィシンを含むもの] を加えて 37°Cで 24時間ィンキュベーションした。 インキュベーショ ン終了後、 非付着細胞はデカンテーシヨ ンによって、 ま たプレー卜に付着した細胞は卜リブシン処理を行ってそれぞれ採取し、 こ れらを台わせた。 得られた細胞懸濁液のうちの 1ノ5づっを CH— 296 を固定化したプレート 2枚に移して 24時間ィンキュベー卜した後、 培地 を一方は上記の培地、 またもう一方は終濃度 0. 75mg/mlの G 418を 含む上記の培地に交換して 37 °Cで 8日間培養し、 出現したコロニー数を 数えた。 G418の存在下、 非存在下に出現したコロニー数より G 418 耐性コロニーの出現率 （遺伝子導入効率） を算出した。
図 5に得られた結果を示す。 図中、 橫$由は使用した機能性物質、 縦軸は 遺伝子導入効率をそれぞれ示す。 なお図 5の （a) はレ トロウイルス結合 性物質としてポリ リ ジンを用いた場合、 （b) は H— 271を用いた場合 である。 細胞へ結合部位を有する C 277— C S 1をポリ リジン、 あるいは H— 271と併用することにより、 遺伝子導入効率はこれらのレトロウイ ルス結合性物質のみを固定化したプレー卜に比べて著しく上昇することが 示された。
(5) エリスロポエチン誘導体ポリペプチ ドの調製
ェリスロポェチンに対するレセプターを有する細胞への遺伝子導入に使 用するために、 エリスロポェチンをグルタチオン一 s— トランスフヱラ一 ゼとの融合ポリぺプチドとした誘導体ポリぺプチド、 G S T— E p 0を調 製した。 配列表の配列番号 34に GST— Ep oのアミ ノ酸配列を示す。 該配列中 233番目〜 398番目のァミノ酸配列がェリスロボェチンに相 当する。
まず、 GST— E p 0を発現させるためのプラスミ ドを以下に示す操作 に従って構築した。 ヒ ト胎児肝臓由来の cDN Aライブラリー （クロンテツ ク社製） を铸型とし、 プライマー EPF 1、 E PR 1 (配列表の配列番号 35、 36にそれぞれプライマ一 E P F 1、 E P R 1の塩基配列を示す） を用いた PCRを行った。 この反応液の一部をとつてこれを铸型とし、 プ ライマー EPF2、 E P R 2 (配列表の配列番号 37、 38にそれぞれプ ライマー EPF2、 E PR 2の塩基配列を示す） を用いて再度 PCRを行つ た。 この反応液より増幅 DN A断片を回収し、 これを E c oR I、 B am H I (ともに宝酒造社製） で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行つ てエリスロポエチンをコードする領域を含む約 52 ObpのDNA断片を回 収した。 得られた断片を E c oR I (宝酒造社製） 、 B amH Iで消化し たプラスミ ドベクター pTVl 18N (宝酒造社製） と混合してライゲー ションを行った後、 大腸菌 JM109に導入した。 得られた形質転換体よ り上記の DNA断片を含むプラスミ ドを保持するものを選択し、 プラスミ ドを調製してこれをプラスミ ド pEPOと命名した。 次に、 こうして得ら れたプラスミ ド pEPOを E c oR I、 S a l I (宝酒造社製） で消化し た後、 ァガロースゲル電気泳動を行って約 0. 5^ のDNA断片を回収し た。 この断片を E c oR S a l Iで消化したプラスミ ドベクター pG E X 5 X- 3 (フアルマシア社製） と混合してライゲーシヨ ンを行った後、 大腸菌 JM109に導入した。 得られた形質転換体より上記の DNA断片 を含むプラスミ ドを保持するものを選択し、 このプラスミ ドを調製してこ れをプラスミ ド p G S T E P〇と命名した。 該プラスミ ドにはベクター由 来のグル夕チオン一 S—トランスフヱラーゼの C末端部分にエリスロポェ チンのァミ ノ酸配列が挿入された融台ポリベプチド、 G S T— E p 0がコ ードされている。 プラスミ ド p G S TE P 0上の G S T— E P 0をコード する塩基配列を配列表の配列番号 39に示す。
ポリべプチド GST— E p 0は以下に示す操作によって調製した。 10 0 gZralのアンピシリンを含む 5 nilの L B培地を 7本準備し、 それぞれ に上記のプラスミ ド pGSTEPOで形質転換された大腸菌 JM109、 Escherichia coli J 109ノ p G S T E P 0を接種して 37 で1晚 培養した。 次に、 同様の培地 50 Oralずつを入れた 2リ ツ トル容三角フラ スコを 7本用意し、 これに上記の培養液 5mlずつを接種して 37°Cで培養 した。 培養開始より 3. 5時間後に終濃度 ImMとなるように I PTGを 添加し、 さらに 3. 5時間培養した。 培養終了後、 遠心分離を行って培養 液より菌体を回収し、 これを ImM PMSFおよび ImM EDTAを含む 100mlの PB Sに懸濁し、 超音波処理を行って菌体を破砕した。 得られ た破砕液に ImM PMSF、 IraM E D T Aおよび 2 %の Triton X— 1 ひ 0を含む 100mlの PB Sを加え、 氷上に 30分間静置した後に遠心分 離を行って上清を集めた。 得られた上清を 0. 45 mのフィルター （ミ リポア社製） でろ過した後、 P B Sで平衡化したグルタチオン一セファロ ース 4Bカラム （ファルマンァ社製、 3ml) にアプライした。 カラムを P BSで洗浄後、 10mM グルタチオンを含む 5 OmM トリス _HCし H 8. 0を用いて溶出を行った。 溶出液を SDS—ポリアクリルァミ ドゲ ル電気泳動で分析し、 分子量約 4. 4万のポリペプチドを含む画分を集め てこれを P B Sに対して透析した。 透析後の試料を P B Sで平衡化したリ ソース Qカラム （フアルマシア社製、 6ml) にアプライし、 カラムを PB Sで洗浄後、 0〜0. 6M N a C 1濃度勾配を持つ P B Sにより溶出を 行った。 上記同様にグルタチオンを aむ 5 OmM 卜リス— HC 1、 H 8. 0を用いて溶出を行った。 分子量約 4. 4万のポリペプチドを含む画分を 集め、 これをセン ト リコン 10 (アミコン社製） を用いた限外ろ過によつ て約 50 1まで濃縮し、 さらにウルトラフリー C 3 GVSTRL (ミ リ ポア社製） を用いてろ過した後、 ろ液をスーパーデックス 200カラム （フ アルマシア社製、 PB Sにて平衡化） を用いたゲルろ過クロマトグラフィ 一に供した。 分子量約 4. 4万のポリペプチドを含む溶出画分を集め、 こ れを GST— E p 0ポリべプチド溶液として以降の実験に使用した。 この G S T- E p 0溶液中には総タンパクの約 50%の G ST— E p oが含ま れていた。
(6) エリスロポエチンレセプター発現細胞への遺伝子導入
細胞結合活性を有する機能性物質としてエリスロポエチンを使用した場 合の遺伝子導入への効果を、 エリスロポエチンのレセプターを発現する T F— 1、 およびエリスロポエチンのレセプターを発現しない HL— 60 (A TC C CC L一 240) の 2種の細胞を用いて調べた。 なお、 エリス口 ボェチンとしては上記のエリスロポエチン誘導体ポリべプチド （GST—
E p o) を、 また、 レトロウィルスに結合する物質としてポリ リジンをそ れぞれ使用した。 まず、 実施例 2— (9) に記載の方法に従って 34pniol /cm2 (1. 5 g/cm2) 相当の GST— E p o、 133 mol/cm2 ( 10 のポリ リジンおよび 34卩11101// 112の0 ST— E p oと 133P niolZcm2のポリ リジンとの混合物のそれぞれを用いてプレー 卜への固定化 を行った。 これらのプレー 卜それぞれに 1 x 104cfuZの TKNE 0ウイ ルス、 および 1 X 104個の細胞を含む培地を加えて 37°Cで 24時間ィ ンキュベ一シヨ ンした。 なお培地としては、 T F— 1については R PM I 1640培地 （ 5 ngZnil G M— C F S、 50単位 Zral ペニシリ ン、 50 g/mlス トレプトマイシンを添加したもの） 、 HL— 60には RPMI 培地 （二ッスィ社製、 10% F C S、 50単位 Zml ぺニシリ ン、 50〃 g/ml ストレプトマイシンを添加したもの） をそれぞれ使用した。 インキ ベ一ション終了後、 非付着細胞はデカンテーションによって、 またプレー 卜に付着した細胞は卜リブシン処理を行ってそれぞれ採取し、 これらを合 わせた。 各プレー卜より得られた細胞懸濁液のうちの 1Z5づっを CH— 296を固定化したプレート 2枚に移して 24時間ィンキュベー卜した後、 培地を一方は上記の培地、 またもう一方は終濃度 0. 7 SmgZnilの G 41 8を含む上記の培地に交換して 37°Cで 8日間培養し、 出現したコロニー 数を数えた。 G418の存在下、 非存在下に出現したコロニー数より G 4 18耐性コロニーの出現率 （遺伝子導入効率） を算出した。
図 6に結果を示す。 図中、 横軸は使用した機能性物質、 縦軸は遺伝子導 入効率をそれぞれ示す。 図 6 (a) に示した TF— 1細胞の場合、 ポリ リ ジンのみを固定化したプレー卜においてもある程度の遺伝子導入が起こつ ている力^ GST-Ep 0が共存する場合にはこれよりも高い遺伝子導入 効率が得られた。 一方、 図 6 (b) に示した H L— 60細胞では、 GST -E p oの共存による遺伝子導入効率の上昇は見られなかった。 以上の結 果より、 エリスロポエチンを利用することにより、 標的とする細胞に特異 的な遺伝子導入が可能なことが示された。
さらに、 レトロウィルス結合部位を有する物質を H 2 - 547にかえて TF— 1細胞への遺伝子導入実験を行った。 実施例 2— (9) に記載の方 法に從つて 33 SpmolZcm2 (20 zg/cni2) の H 2— 547、 34pmol /cm2 (1. 5/ig/cm2) 相当の GST— Epo、 および 34 pmol/cra2の GST— Ep oと 333pmolZcm2 (20 g/cm2) の H2— 547との 混台物のそれぞれを用いてプレー 卜への固定化を行った。 同時に B S Aを 固定化したプレートを使用した対照実験も行った。 図 7に得られた結果を 示す。 図中、 横軸はプレー 卜に固定化された機能性物質、 絨铀は遺伝子導 入効率をそれぞれ示す。 図に示されるように H2— δ 47を使用した場合 にも GST— Ερ 0の共存によって TF— 1細胞への遺伝子導入効率が向 上することが示された。
(7) 機能性物質の混合物を固定化したビーズを用いた遺伝子導入 細胞結合部位を有する物質とレトロウィルス結合部位を有する物質の両 者を固定化したビーズを用いて、 レトロウィルス感染効率を上げることが 可能かどうかを調べた。
ポリべプチドを固定化したビーズは以下に示す方法により調製した。 ビ 一ズには粒子径 1. 14 πιのポリスチレンビーズ （ポリビーズ ポリス チレン ミクロスフエア、 ポリサイエンス社製） を用いた c 上記ビーズの 2. 5%懸濁液 20 1にエタノール 80〃1、 および各種ポリペプチドの PBS溶液 2 mlを加えて 4 °Cで一夜静置した後、 BSAおよび PBSを 加えて 4ralの 1 %B S AZP B S懸濁液とした。 この懸濁液より遠心分離 によって回収したビーズを再度 5ralの 1%BSA/PBSに懸濁し、 室温 で 1時間静置してポリべプチド固定化ビーズの懸濁液を得た。 ポリべプチ ド溶液としては 100 / g/nil C— 274、 100 ^ /ml H— 271、 100 zg/ml CH— 271、 100 g/ml CH— 296、 および 10 0 w /ml H— 271と 10 /ig/ral C— 274の混合物を用い、 また対 照として 2%B S A溶液を使用して固定化を行ったビーズも同様に調製し た。
調製されたポリべプチド固定化ビーズのうち 1Z10量を上記の懸濁液 より回収し、 それぞれを 2000個の T F— 1細胞、 l O O Ocfuの TK NE〇ウィルス上清液とともに 37 °Cで一晩培養した。 細胞を回収し、 0. 3% Bacto Agar (ディフコ社製） を含む R PM I培地 [ 10%F C S、 Sng/ml GM— C F S (ペトロ テック社製） 、 50単位/ ml ベニシリ ン、 50〃gZmlス トレプトマイシンを含むもの] に懸濁し、 これを予め 0. 5% Bacto Agarを含む上記の RPM I培地で作製した 35關 プレー ト上にまいた。 なお、 培地は 0. 75 rag/ml G418を含むもの、 含まな いものの 2通りを使用した。 プレートを 5% C02中、 37°Cで 14日間 インキュベーショ ンした後、 G 418の存在下、 非存在下に出現したコロ ニーを計数し、 G418耐性コロニーの出現率 （遺伝子導入効率） を算出 した。
図 8に結果を示す。 図中、 横軸はビーズに固定化された機能性物質、 縦 蚰は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。 H— 271と C一 274の混合物を 固定化したビーズを使用した場合には、 H— 271のみを固定化されたビ ーズ、 同一分子中にレトロウィルス結合部位と細胞結合部位の両方を有す る CH— 271や CH— 296がそれぞれ固定化されたビーズを用いた場 合に比べても高い遺伝子導入効率が得られた。
実施例 4
(1) FGF、 C— FGF · Aを用いた遺伝子導入
F G F (べク トン . ディ ッキンソン社製） 、 および配列表の配列番号 4 で表されるポリべプチド （C— FGF . A) のレ卜ロウィルス感染に対す る影響を N I H/3T 3細胞コロニー形成アツセィによって調べた。 すな わち、 実施例 2— (9) に記載の方法により 132 pmo 1 /cm2 (2. 25 i g/cm2) の FGF、 および 133 pmo 1 / c m2 (6. 3 g / cm2) の C一 FGF · Aのそれぞれを用いて固定化を行ったプレー卜、 および B S Aを固定化した対照プレートのそれぞれに 1 0 0 Ocfuの Ρλ'Ι δ n e 0ウィルスを含む 2mlのウィルス上清液を加えて 3 7°C、 3 0分間 プレインキュベ一ションした後、 P B Sを用いてプレートを徹底的に洗净 した。 このプレートに 20 0 0個の N I HZ3 T 3細胞を含む 2mlの DM EM培地を加えて 3 7°C、 2 4時間インキュベーションし、 その後 0. 7 の。 4 1 8を含む選択培地中で 1 0日間増殖させ、 それに続いて コロニーを染色し、 計数した。 図 9に得られた結果を示す。 図中、 横軸は プレー卜に固定化された機能性物質、 縦铀は出現した G 4 1 8耐性コロニ 一数をそれぞれ示す。
図 9に示されるように、 対照として使用した B S A固定化プレー卜では コロニーが出現しなかったのに対し、 F G F、 および C— F G F · Aを固 定化したプレー卜を用いた場合には G 4 1 8耐性コロニーの出現が確認さ れた。 この結果より F G F、 C一 F G F · Aがレ トロウイルス結合部位を 有していること、 および、 フイブロネクチンの細胞結合部位ポリペプチド が付加された C— F G F . Aは遺伝子導入において F G Fより優れた効果 を有することが示された。
(2) プレー卜への固定化に使用した C一 FG F · A濃度と遺伝子導入 効率との関係
種々の濃度の C一 F G F · Aで固定化を行ったプレー卜での遺伝子導入 効率の比較を行った。 すなわち実施例 2— ( 9) に記載の方法に従い、 0. 5 2 lpmol/cm2 (0. 024 7 g/cm2) 〜 5. 2 1 praol/cm2 (0. 2 4 7 ug/ ^2) の C一 FG F · Aを用いて固定化を行ったプレート、 およ び B S A固定化プレート （対照プレート） を用い、 実施例 4一 （1 ) と同 様の操作でレ トロウイルスの感染を行った。 ウィルス感染処理後、 非付着 細胞はデカンテーションによって、 またプレー卜に付着した細胞はトリブ シン処理によってプレー卜から剥がすことによってそれぞれ採取し、 両者 を台わせた。 得られた細胞懸濁液を 2等分して一方を DM EM、 他方を終 濃度 0. Ί 5mgZralの G 418を含む DM E Mとともに 37 °Cで 10日間 培養した後、 出現したコロニ一数を数え、 G 418を含まない培地で得ら れたコロニー数に対する G 418耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率 とした。
得られた結果を図 10に示す。 図中、 横車由はプレートの固定化操作に使 用された C一 FGF · Aの濃度、 縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。 なお、 対照プレー卜での実験結果はポリベプチド濃度 0 / raolZcm2として プロッ トした。 図 10に示されるように、 固定化に使用した C一 FGF - Aの濃度依存的に遺伝子導入効率の上昇が見られた。
(3) HL— 60細胞への遺伝子導入
浮遊細胞である HL— 60細胞 （ATCC CCL— 240) へのレ 卜 ロウィルスの感染に関して、 各種のポリベプチドの存在の効果を以下に示 す操作によって調べた。 すなわち、 10 Opmol/cm2の C— F G F . A (4 - 8 AigZcm2) 、 および C一 FGF— CS 1 (5. 1〃 g/cm2) を用いて 実施例 2— (9) に記載の方法で固定化を行ったプレー ト、 および BSA を固定化した対照プレー卜のそれぞれに 1 X 1 CVcfuZの TKNEOウイ ルス、 2000個の HL— 60細胞を含む 2ralの R PM I培地 （10% F C S、 50単位/ mlのぺニシリ ンおよび 50 g/mlのス 卜レプトマイ シンを添加して使用） を加えて 3了。 Cで 24時間インキュベーショ ンした。 ィンキュベ一ション終了後、 非付着細胞はデカンテ一ションによって、 ま たプレー卜に付着した細胞はピベッティングによってそれぞれ採取し、 こ れらを合わせた。 得られた細胞懸濁液のうちの 1Z2づっを CH— 296 固定化プレー卜に移して 24時間ィンキュベ一トした後、 培地を終濃度 0.
Figure imgf000074_0001
の0418を含む上記の R PM I培地に交換し、 37°Cで 12 日間培養し、 出現したコロニー数を数えた。 各ポリペプチドを使用して得 られた G 418耐性コロニー数を図 1 1に示す。 図中、 横軸はプレー卜に 固定化された機能性物質、 縦軸は出現した G 418耐性コロニー数をそれ ぞれ示す。
図 11に示されるように、 B S A固定化プレー卜に比較して C— FGF Aおよび C— FGF— C S 1を固定化したプレー 卜では G 418耐性コロ ニー数が著しく上昇しており、 これらのボリべプチドが HL— 60細胞へ のレトロウィルスの感染を促進していることが示された。
(4) マウス骨髄細胞への遺伝子導入
骨髄細胞へのレトロウィルス感染に対する FGF、 C— FGF ' Aおよ び C一 FGF— C S 1の効果を調べるため、 以下に示す実験を行った。
6〜 8週齢のマウス （C 3H/H e J ) に 15 Omg/Kgの 5—フルォロ ゥラシル （5_FU、 アムレスコ社製） を腹腔内投与し、 その 2日後に大 腿骨および脛骨を摘出して骨髄を採取した。 得られた骨髄をフィコール一 ハイパク （密度 1.0875 ノ1111、 フアルマシア社製） を用いた密度勾配遠 心分離に供し、 低密度単核細胞画分を調製してこれをマウス骨髄細胞とし た。
マウス骨髄細胞はルスキー （Luskey) 等の方法 （Blood、 第 80卷、 第 396 〜402頁、 1992年） に従い、 レ トロウイルス感染前に予備刺激を行った。 すなわち、 20% FC S、 100単位 Zml 組換えヒ 卜イ ンターロイキン —6 (rh I L— 6、 アムジュン社製） 、 10 OngZml 組換えマウス幹細 胞因子 （ iS C F、 アムジヱン社製） 、 50単位 /mlのぺニシリンおよび 50 igZmlのス卜レブ卜マイシンを含有するひ一 MEM (ギブコ社製） 中に 1 X 10 ^cellsZmlの細胞密度で上記のマウス骨髄細胞を添加し、 5 % C〇2中、 3 7°Cで 4 8時間インキュベートした。 予備刺激した細胞は 容器に付着したものを含め、 ピぺッ トを用いて吸引、 採集した。
実施例 2— (9) に記載の方法に從つて 2 3 6 raolZcm2 ( 4 g/z^) の F G F、 1 6 9pmol/cni2 (8 gZcm2) の C— F G F · A、 あるいは 1 5 9 ^mol/cm2 (8 ^g/cm2) の C— F G F— C S Iを用いて固定化を 行ったプレート、 および B S A固定化プレート （対照プレート） に 1 x 1 06個の予備刺激した細胞と 1 x 1 04cfuの PM5 n e 0ウィルスとを含 む上記の予備刺激に用いられた培地 2 mlを添加して 3 7 °Cでインキュべ 一卜した。 2時間後に同量のウィルスを含む同様の培地 （2 mi) を新たに プレートに追加し、 さらに 2 2時間インキュベートを続けた。 インキュべ ―ト終了後、 非接着細胞はデカンテ一ションによって、 またプレー卜に接 着した細胞は細胞解離緩衝液 （C D B、 酵素を含まないもの、 ギブコ社製） を使用してそれぞれ採集し、 これらを合わせて同緩衝液で 2回洗浄した後、 細胞数を計数した。 採集した細胞は H P P— C F C (High Proliferative Potential-Colony Forming Cellsヽ 高増殖能コロニー形成細胞) アツセ ィに供した。
H P P— C F Cアツセィはブラッ ドレー （Bradley) 等の方法 （Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci.、 第 44巻、 第 287〜293頁、 1966年） に従って行つ た。 培地には 1 %Z0. 6 6 %重層钦寒天培地を使用し、 終濃度 1. 5oig /mlの G 4 1 8を含むもの、 および含まないものの 2通りを用いた。 1ゥ エルあたりに 1 X 1 04個の感染細胞を添加し、 1 0% C 02中、 3 7°C で 1 3日間インキュベー ト した。 インキュベーショ ン終了後、 出現したコ ロニーを倒立顕微鏡で観察し、 ^1 ? ?ー〇 （：由来の高密度コロニー （径 0. 5随以上） を計数して G 4 1 8耐性コロニーの出現率 （遺伝子導入効 率） を算出した。 得られた結果を図 1 2に示す。 図中、 横軸は使用した機 能性物質、 縦軸は遺伝子導入効率を示す。
図 1 2に示されるように、 対照として使用した B S A固定化プレー卜で は G 4 1 8耐性コロニーは出現していないのに対し、 上記の各ポリベプチ ドを固定化したプレートを使用した場合には G4 1 8耐性コロニーが得ら れている。 また、 遺伝子導入効率は FGF、 C-FG F · A, C-FGF - C S 1の順に高くなつており、 細胞への結合活性を持つフイブロネクチ ン由来の細胞結合部位ポリぺプチド、 および C S— 1ポリベプチド部分の 存在が骨髄細胞へのレトロウイルスの感染効率を高めた。
(5) プレートの固定化に使用した C 277— C 0 1 V濃度と遺伝子導 入効率との関係
種々の濃度の C 277 - C 0 1 Vを用いて固定化を行ったプレー卜での 遺伝子導入効率の比較を以下に示す操作により行った。 0. Ipmol/cm2 (0. 1 ^g/cm2) 〜4 1 6pmol/cm2 (20 ^g/cra2) の C 277— C o 1 Vを用い、 実施例 2— (9) に記載の方法によってプレー卜への固定 化を行った。 これらのプレー卜のそれぞれに 100 Ocfuの PM5 n e 0 ウィルスを含む 2 nilのウィルス上清液を加えて 37°C、 30分間プレイン キュベーシヨンした後、 P B Sを用いてプレートを徹底的に洗浄した。 こ のプレートに 2000個の N I HZ3 T 3細胞を含む 2!111の0^[£1^培地 を加えて 37°C、 24時間インキュベーショ ンした後、 非付着細胞はデカ ンテーションによって、 またプレー卜に付着した細胞はトリプシン処理の 後にプレー卜から剥がすことによってそれぞれ採取し、 これらを合わせた c 得られた細胞懸濁液を二分し、 一方には DMEM、 もう一方には終濃度 0.
Figure imgf000076_0001
の04 18を含む DM EMを加えて 37°Cで 10日間培養し、 出現したコロニー数を数えた。 G 1 8を aまない培地で得られたコロニ 一数に対する G 4 1 8耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、 その 結果を図 13に示す。 図中、 横軸は使用した機能性物質、 縦铀は遺伝子導 入効率を示す。
図 13に示されるように C 277— C o 1 Vを固定化したプレートを用 いた場合、 固定化に使用した C 277— C 0 1 Vの濃度依存的に遺伝子導 入効率が上昇した。
(6) ポリ リ ジンを用いた遺伝子導入
ポリ リジン [ (L y s ) n ] とレトロウィルスとの結合を以下に示す操 作により調べた。 ポリ リジンとしてはポリ一 L—リ ジン臭化水素酸塩 （分 子量 5万〜 10万、 和光純薬社製） を使用した。 まず、 133pmolZcm 2
(10 g/m2) の PB S溶液としたポリ リジンを用い、 実施例 2— (9) に記載の方法によってプレートへの固定化を行った。 このプレート、 およ び B S Aを固定化した対照プレー卜のそれぞれについて実施例 4— (2) に記載の方法で遺伝子導入効率を評価した。 その結果を図 14に示す。 図 中、 横軸は使用した機能性物質、 縦軸は遺伝子導入効率を示す。
図 14に示されるように B S Aを用いた対照プレートではコロニーが見 られなかったのに対し、 ポリ リジンを固定化したプレートでは G 418耐 性コロニーの出現が確認された。 このことはレ トロウイルスがプレー トに 固定化されたポリ リジンに結合するために、 洗浄後のプレー卜上にレト口 ウィルスが残存していることを示している。
実施例 5
(1) ポリペプチドの重合体を用いた遺伝子導入
ポリぺプチドの重合体を用いた遺伝子導入は、 各ポリぺプチドをプレー 卜上に固定しない状態で使用し、 実施した。 実施例 2— (9) に記載の方 法であらかじめ B S Aを固定化しておいたプレー卜に 100 Opfuの PM 5 n e oウィルス、 2000個の N I H/3 T 3細胞、 および終濃度 0. 63nmolZmlの各ポリぺプチド （H— 271、 CH— 271、 H2— 54 7、 CH 2 - 826) を含む 2 mlの DM EM培地を加えて 37° (：、 24時 間インキュベートした後、 非付着細胞はデカンテーシヨンによって、 また プレー 卜に付着した細胞はトリブシン処理によってプレー 卜から剥がすこ とによってそれぞれ採取し、 両者を合わせた。 また、 対照としてポリぺプ チドを添加しないものについても同様の操作で導入実験を行った。 得られ た細胞懸濁液を 2等分して一方を DMEM、 他方を終濃度 0. 75mgZnil の G418を含む DMEMとともに 37°Cで 1◦日間培養し、 出現したコ ロニー数を数えた。 G 418を含まない培地で得られたコロニー数に対す る G418耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、 その結果を図 1 5に示す。 図中、 横軸は使用した機能性物質、 縦軸は遺伝子導入効率を示 す。
図 15に示されるように、 H 2— 547存在下での遺伝子導入効率は C H- 271存在下に比べて著しく高く、 また CH2— 826でも。^1ー2 71と同等あるいはそれ以上の遺伝子導入効率が得られた。
さらに詳細な検討を行った。 ポリペプチドとして CH— 271、 CH- 296、 H 2— 547を使用し、 それぞれプレートあたり 0. 126nmol (終濃度 0. 063nmolZnil) 、 1. 26 nmol (終濃度 0. 63nniolZml) の 2通りの量で用いた他は上記と同様に操作した。 図 16に得られた結果 を示す。 図中、 横铀は使用した機能性物質とその量、 縦軸は遺伝子導入効 率を示す。
図 16に示されるように H2— 547を用いた場合には、 用いた 2通り のポリべプチド量のどちらでも CH— 2了 1、 CH— 296に比べて有意 に高い遺伝子導入効率が得られた。
(2) H2 S— 573を用いたマウス骨髄細胞への遺伝子導入 骨髄細胞へのレトロウイルス感染に対する H 2 S - 573の効果を調べ るため、 実施例 4一 （4) に記載の方法でマウス骨髓細胞への遺伝子導入 を実験を行った。
マゥス骨髄細胞は上記実施例に記載の方法に従つて調製し、 予備刺激を 行った。 なお、 レ トロウイルス感染時のプレートには H 2 S— 573 [ 1 6 Opniol/cm2 (10 g/cin2) ] を固定化したものの他、 CH— 296
[132 mol/cra2 (8. 3 ^g/cm2) ] を固定化したもの、 および対照 として B S Aを固定化したものを用いた。 HPP— C FCアツセィにより 得られた結果を図 1 7に示す。 図中、 横軸は使用した機能性物質、 縦軸は 遺伝子導入効率を示す。
図 17に示されるように、 対照として使用した B S A固定化プレー卜で は G418耐性の高密度コロニーの出現は見られない。 CH— 296固定 化プレートでは約 50%の遺伝子導入効率が得られているが、 H 2 S _ 5 73固定化プレートを用いた場合にはこれよりも高い効率で G 418耐性 の高密度コロニーが得られた。
実施例 6
(1) 非固定の機能性物質を用いた遺伝子導入
ポリべプチドがプレート上に固定されない状態で共存する場合にレトロ ウィルスの感染効率に与える影響について以下のようにして調べた。 すな わち、 実施例 2— (9) に記載の方法によりあらかじめ B S Aを固定化し ておいたプレートに 10 Ocfuの PM5 n e oウィルス、 2000個の N I HZ3 T 3細胞、 および終濃度 10、 40、 250 gZml (それぞれ 0. 158、 0. 632、 3. 950 nmol/mlに相当） の CH— 296を 含む 2 mlの DM EM培地を加えて 24時間ィンキュベ一ションした後、 非 付着細胞はデカンテーションによって、 またプレートに付着した細胞はト リプシン処理の後にプレー卜から剥がすことによってそれぞれ採取し、 両 者を合わせた。 得られた細胞懸濁液を 1 Ocm細胞培養用プレー 卜に移して 24時間ィンキュペートした後、 培地を終濃度 0. 75mg/nilの G 418 を含む DMEMに交換してさらに 10日間培養した。 また、 対照として C H— 296を添加しないもの、 および 32pmol/cm2 (2 ^g/cm2) 、 1 27 mol/cni2 (8 /g/cra2) の C H— 296を固定化したプレートを用 いてこれにウィルス上清液と細胞を加えたものについて上記同様に操作し た。 こうして得られた G 418耐性コロニーの数を数え、 結果を表 1にま とめた。 表 1
Figure imgf000080_0001
表 1に示されるように溶液中に細胞、 ウィルス、 CH— 296が共存す る場合には CH— 296非存在下に比べて G 418耐性コロニー数が大幅 に増加した。 また、 その数は CH— 296を固定化したプレートを用いた 場台と同等か、 もしくはそれよりも多かった。 なお、 B S A固定化プレー 卜に上記の各濃度の CH— 296溶液を添加してしばらく放置した後にプ レートを洗浄してウィルス感染実験に用いた場合には、 上記の CH— 29 6を添加しない場合と同程度の G 1 8耐性コロニーしか得られないこと から、 B S A固定化プレー卜には C H— 2 9 6が結合しないことがわかる ( 従って上記の C H— 2 9 6によるレ 卜ロウィルス感染促進効果はィンキュ ベート中に溶液中の C H— 2 96がプレー 卜に結合してもたらされたもの ではないと考えられる。
(2) 非固定の機能性物質を用いた遺伝子導入
ポリべプチドがプレー卜上に固定されない状態で共存する場合にレトロ ウィルスの感染効率に与える影響について以下のようにして調べた。 すな わち、 実施例 2— (9) に記載の方法によりあらかじめ B S Aを固定化し ておいたプレー トに 1 00 Ocfuの PM5 n e oウィルス、 2 0 0 0個の N I HZ3 T 3細胞、 および終濃度 1. 6 7 mnolZmlの C— F G F · A、 C o l V、 C 2 7 7— C o l Vをそれぞれ含む 2 nlの DM EM培地を加え て 3 7°C、 24時間ィンキュベーショ ンした後、 非付着細胞はデカンテ一 ションによって、 またプレー卜に付着した細胞はトリブシン処理の後にプ レートから剥がすことによってそれぞれ採取し、 両者を合わせた。 得られ た細胞懸濁液を二分して一方を DMEM もう一方を終濃度 0. 了 5mg/ mlの G 4 1 8を含む DM EMとともに 3 7°Cで 1 0日間培養し、 出現した コロニー数を数えた。 G 4 1 8を含まない培地で得られたコロニー数に対 する G 4 1 8耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、 その結果を図 1 8に示す。 図中、 横軸は使用した機能性物質、 縦軸は遺伝子導入効率を 示す。
図 1 8に示されるように、 各ポリべプチドがウィルス感染時に共存する 場合には高い遺伝子導入効率が得られており、 これらのポリぺプチドがプ レート上に固定されない状態でもレ卜ロウィルス感染の促進効果を有する ことが明らかとなった。 ( 3 ) 非固定の機能性物質を用いた浮遊細胞への遺伝子導入
非固定のポリベプチドが浮遊細胞への遺伝子導入効率に与える影響につ いて以下のようにして調べた。 すなわち、 実施例 2— ( 9 ) に記載の方法 により 3 3 3 mol/cm2 ( 1 0
Figure imgf000082_0001
の H— 2 7 1を固定化したプレ 一ト、 および B S Aを固定化したプレー卜のそれぞれに 1 x 1 04cfuZの TKN E Oウィルス、 1 x 1 04個の丁 ー 1細胞を含む 2 mlの R PM I 1 6 4 0培地 [ 5ngZml GM— C F S、 5 0単位/ ml ぺニシリ ン、 5 0 gZralストレプトマイシンを含むもの] を加え、 さらに B S Aを固定化 したプレー卜には終濃度 5 0 ^g ml ( 1. 6 7nmol/ml) の H— 2 7 1 を加えて 3 7°Cで 2 4時間ィンキュベーシヨンした。 インキュベーション 終了後、 非付着細胞はデカンテーシヨンによって、 またプレートに付着し た細胞はトリプシン処理を行ってそれぞれ採取し、 これらを合わせた。 得 られた細胞懸濁液のうちの 1 /5づっを C H— 2 9 6を固定化したプレー ト 2枚に移して 2 4時間ィンキュペートした後、 培地を一方は上記の培地、 またもう一方は終濃度 0. 7 5nigZinlの G 4 1 8を含む上記の培地に交換 して 3 7°Cで 8日間培養し、 出現したコロニー数を数えた。 G 4 1 8の存 在下、 非存在下に出現したコロニー数より G 4 1 8耐性コロニーの出現率
(遺伝子導入効率） を算出した。 得られた結果を図 1 9に示す。 図中、 横 寒由は使用した機能性物質とその使用形態、 縦蚰は遺伝子導入効率を示す。 図 1 9に示されるように、 非固定の H— 2 7 1を使用した場合には H— 2 7 1を固定化したプレー卜よりも高い遺伝子導入効率が得られており、 T F— 1細胞への遺伝子導入に H— 2 7 1を使用する際には、 非固定の状 態の方が好ましいことが示された。
( 4 ) ポリべプチドによるレ卜ロウィルス感染促進の機構の解明 上記実施例に示された、 非固定のポリぺプチドによる細胞へのレ トロゥ ィルス感染の促進が細胞とポリぺプチドとの結台、 およびポリぺプチドと レ卜ロウィルスとの結合を介して起こっていることを確かめるために以下 に示すような実験を行った。 まず実施例 2— (9) に記載の方法で調製し た B S A固定化プレートに 1000個の N I HZ3 T 3細胞を含む 2ralの DMEMを加え、 37 °Cで 24時間生育させた。 このプレー卜より培地を 除き、 それぞれ 2mlの 1. 67nmoIノ mlの H— 271、 CH—271、 C — F G F · Aおよび対照として P B Sを加えて 37°C、 2. 5時間インキ. ペートした後、 25πιΜへぺス （HE PES) を含むハンクス平衡塩類溶 液 （HB S S、 G i b c o社製） でプレー卜を洗浄した。 次に 100 Ocf uの PM5 n e 0ウィルスを含む 2 mlのウィルス上清液をプレートに加え て 37て、 30分間インキュベートした後、 P B Sでプレートを洗浄した c このプレー卜に 2mlの DM EMを加えて 37て、 24時間ィンキュペート した後に非付着細胞はデカンテ一ションによって、 またプレー卜に付着し た細胞はトリプシン処理の後にプレー 卜から剥がすことによってそれぞれ 採取し、 両者を合わせた。 得られた細胞懸濁液を二分して一方を DMEM、 もう一方を終濃度 0. Ί SnigZnilの G418を含む DMEMとともに 37 てで 10日間培養し、 出現したコロニー数を数えた。 G418を含まない 培地で得られたコロニー数に対する G 418耐性コロニー数の割合を遺伝 子導入効率とし、 その結果を図 20に示す。 図中、 横軸は使用した機能性 物質、 縦軸は遺伝子導入効率を示す。
図 20に示されるようにプレー卜上の細胞を上記のポリべプチド溶液で 処理した後にウイルス感染を行った場合には著しい感染効率の上昇が見ら れた。 このことは細胞にポリペプチドが結合し、 さらに細胞上のポリぺプ チドにレ卜ロウィルスが結合することによってレトロウィルスの感染効率 の上昇が起こることを示唆している。 さらに、 添加するポリペプチドを、 0. 29nmol/mlの C一 F G F · A- および 0. 79nmoiZmlの CH— 296に変更し、 上記同様の実験を行つ た。 図 21にその結果を示す。 図中、 横軸は使用した機能性物質、 縦 $由は 遺伝子導入効率を示す。 図 21に示されるように C一 FGF · A、 および CH- 296を添加した場合には遺伝子導入効率の上昇が見られており、 C-FGF · Aについて上記の活性が確認されるとともに、 CH— 296 も同じ機構でレ 卜ロウィルスの感染を促進する活性を有することが示され た。
実施例 7
( 1 ) 機能性物質を固定化したビーズを用いた遺伝子導入
機能性物質を固定化したビーズを用いてレ卜ロウィルス感染効率を上げ ることが可能かどうかを以下に示す操作によって調べた。 ビーズには粒子 径 1. 14〃πιのポリスチレンビーズ （ポリビーズ ポリスチレン ミ ク ロスフェア、 ポリサイエンス社製） を用いた。 上記ビーズの 2. 5%懸濁 液 20 1にエタノール 80 1、 および 40〃g/mlの C Η— 296溶液 2 mlを加えて 4 °Cで一夜静置した後、 B S Aおよび P B Sを加えて 4 mlの 1 %B S A/P B S懸濁液とした。 この懸濁液より遠心分離によって回収 したビーズを再度 5 mlの 1 %B S A/PB Sに懸濁し、 室温で 1時間静置 して CH— 296固定化ビーズの懸濁液を得た。 なお対照として CH— 2 96溶液のかわりに 2%B S Aを使用して固定化操作を行ったビーズも同 様に調製した。
上記のビーズ懸濁液のうち 1/10量 （0. 5 ral) をとり、 これより遠 心分離によってビーズを回収した後、 これに 100 Ocfuの PM5 n e 0 ウィルスを含む DM EMを加えて 37°C、 30分間インキュベートした。 ビーズを 1 %B S AZPB Sで 2回洗浄後、 2ralの DMEMに懸濁して 1 mlをプレートに移し、 3 x 105個の N I HZ 3 T 3細胞を含む 1 mlの D MEMを加え、 C〇2インキュベータ一中、 37 °Cで 24時間インキ二べ —卜した。 その後、 培地を終濃度 0. 75mg/mlの G 418を含む DME Mに交換し、 さらに 10日間培養し、 出現したコロニーを染色、 計数した ( 表 2にその結果を示す。
表 2に示されるように CH— 296を固定化したビーズを使用した場合 には 264個の G418耐性コロニーが出現したのに対し、 対照として用 いた B S A固定化ビーズではまったく耐性コロニーは得られなかった。 こ のことは CH— 296をビーズ上に固定化した場合でもプレー卜の場合同 様にレ卜ロウィルスの感染効率を上げる効果を持つことを示している。 表 2
Figure imgf000085_0001
( 2 ) 機能性物質を固定化したビーズを用いたマウス骨髄細胞への遺伝 子導入
機能性物質を固定化したビーズを用いてマウス骨髄細胞へのレトロウイ ルス感染効率を上げることが可能かどうかを以下に示す操作によって調べ た。
マウス骨髄細胞は実施例 4一 （4) に記載の方法に従って調製し、 予備 刺激を行った。
実施例 2— (9) に記載の方法に従って B S Aを固定化したプレート、 これに実施例 7— (1) に記載の方法で調製した CH— 296固定化ビー ズのうち 1ノ 10量を添加したもののそれぞれに 1 x 106個の予備刺激 した骨髄細胞と 1 x 104cfuの PM5 n e oウィルスとを含む上記の予備 刺激に用いられた培地 2mlを添加して 37°Cでインキュベートした。 2 時間後に同量のウィルスを含む同様の培地 （2ml) を新たにプレートに追 加し、 さらに 22時間インキュベートを続けた。 インキュベー ト終了後、 非接着細胞はデカンテ一ションによって、 またプレー卜に接着した細胞は 細胞解離緩衝液 （CDB、 酵素を含まない、 ギブコ社製） を使用してそれ ぞれ採集し、 これらを合わせて同緩衝液で 2回洗浄した後、 細胞数を計数 した。 採集した細胞は実施例 4一 (4) に記載の方法に従い HP P_C F Cアツセィに供した。
結果を図 22に示す。 図中、 横軸は使用された機能性物質とその使用形 態、 縦軸は遺伝子導入効率を示す。 この結果より、 CH— 296固定化ビ ーズを用いた場合でもマウス骨髄細胞へのレトロウィルス感染効率を上げ ることが可能であることがわかった。
実施例 8
(1) H— 271、 および CH— 271を用いた遺伝子導入
H— 271のレトロウィルス感染に対する影響を、 H— 271、 および レトロウィルス感染の促進を示すことが知られている CH— 271を固定 化したプレー卜中でウィルス上清液をプレインキュベーシヨンした後、 プ レートを徹底的に洗浄し、 そこに残存するウィルスの量を N I H/3 T3 細胞コロニー形成ァッセィで測定し、 両者の結果を比較することにより評 価した。 すなわち、 実施例 2— (9) 記載の方法により種々の濃度の H—
271 [67 mol/cm2 (2〃gZcra2) 〜333pmol/cm2 (10 g/cm2)
3 、 および CH— 271 [67praol/cra2 (4 ig/cm2) ~333ptnol/c m2 (20 / g/c!B2) ] を用いて固定化操作を行ったプレートのそれぞれに 1 000じ^の？^15 n e oウィルスを含む 2 mlのウィルス上清液を加え て 37° (：、 30分間プレインキュベーションした後、 P B Sを用いてプレ 一 卜を徹底的に洗浄した。 このプレー 卜に 2000個の N I HZ3 T3細 胞を含む 2 mlの DM EM培地を加えて 37°C、 24時間ィンキュベーショ ンし、 その後 0. Ί 5rag/mlの G 418を含む選択培地中で 1 0日間増殖 させ、 それに続いてコロニーを染色し、 計数した。 その結果を図 23に示 す。 図 23は機能性物質と遺伝子導入効率の関係を示す図であり、 横軸は ポリべプチドの使用量、 縦軸は G 418耐性コロニー数を示す。
図 23に示されるように、 CH— 27 1を用いた場合には固定化操作に 用いたポリべプチド濃度にかかわらずほぼ同程度の G 418耐性コロニー が出現した。 これに対し、 H— 271では固定化の際のポリペプチド濃度 を上げることにより濃度依存的に出現コロニー数が増加しており、 333 pmolZcm2で固定化を行ったものでは CH— 271と同程度の G 418耐 性コロニーが得られた。 このことは十分量の H— 27 1を用いてプレート の固定化を行うことにより、 CH— 271と実質上同等のウィルス感染効 率が得られることを示している。
(2) C一 FGF · Aを用いた遺伝子導入
C— FGF · Aポリベプチドのレトロウィルス感染に対する影響を N I HZ3T3細胞コロニー形成アツセィによって調べた。 すなわち、 実施例 2- (9) に記載の方法により 127pmol/cm2 (6
Figure imgf000087_0001
の C一 F G F · Aで固定化を行ったプレート、 127pmolZcni2 (7. 6 ug m2) の CH— 271で固定化を行ったプレート、 127praol/cm2(8 zg/cm2) の CH— 296で固定化を行ったプレート、 および B S Aを固定化した対 照プレートを使用した他は実施例 8— (1) と全く同じ方法で評価した。 その結果を図 24に示す。 図 24は機能性物質と遺伝子導入効率の関係を 示す図であり、 横軸に使用した機能性物質および B S Aを、 縦軸に G41 8耐性コロニー数を示す。
図 24に示されるように、 対照として使用した B S Aを固定化したプレ ―卜ではコロニーが出現しなかった。 一方、 C一 FGF . Aを固定化した プレートを用いた場合には G 418耐性コロニーの出現が確認され、 その 数は CH— 271、 および CH— 296を用いたものと同程度であった。 このことは FG F分子上に CH— 271、 および CH— 296と実質的に 同等の機能を有するレトロウィルス結合部位が存在していることを示して いる。
(3) C一 FGF— C S 1を用いた遺伝子導入
C-FGF-C S 1ポリべプチドのレトロウィルス感染に対する影響を 以下に示す操作によって調べた。 すなわち、 それぞれ 133ρπιοΐΖ η2の C-FGF-C S 1 (6. 7 g/cm2) 、 C一 FGF · A (6. 3 ^ c m2) 、 CH-271 (8 /g/cra2) 、 CH- 296 (8. 4 g/cn2) を 用いて実施例 2— (9) に記載の方法でプレートの固定化を行い、 これを 用いて実施例 8— (1) 同様の N I HZ3T3細胞コロニー形成アツセィ を行った。 その結果を図 25に示す。 図 25は機能性物質と遺伝子導入効 率の関係を示す図であり、 横軸に使用した機能性物質を、 縦軸に G 418 耐性コロニー数を示す。
図 25に示されるように、 これら 4種のポリべプチドを固定化したプレ 一卜ではほぼ同数の G 418耐性コロニーが出現しており、 C— FGF— C S 1分子も他のポリべプチドと実質的に同等のレトロウィルス結合活性 を有していることを示している。
(4) C 277 -C 0 1 Vを用いた遺伝子導入
C 277 - C 0 1 Vポリべプチドのレトロウィルス感染に対する影響を. 1 2 4 mol/cm 2 ( 6 . 4 /cni 2 ) の C 2 7 7— C o 〗 Vで固定化を行つ たプレー卜、 および B S Aを固定化した対照プレー卜を用いて実施例 8— ( 1 ) と同様の方法で評価した。 その結果を図 2 6に示す。 図 2 6は機能 性物質と遺伝子導入効率の関係を示す図であり、 横軸に使用した機能性物 質および B S Aを、 縦軸に G 4 1 8耐性コロニー数を示す。
図 2 6に示されるように B S Aを用いた対照プレー 卜ではコロニーが見 られなかったのに対し、 C 2 7 7— C 0 1 Vを固定化したプレートでは G 4 1 8耐性コロニーの出現が確認された。 このことは C 0 〗 V分子上にレ 卜ロウィルス結合部位が存在しているために洗净後のプレート上にレトロ ウィルスが残存していることを示している。
以上記載したごとく、 本発明により、 レ トロウイルスを用いて標的細胞 に効率よく遺伝子導入する方法が提供される。 目的とする標的細胞に適し た細胞結合性の物質を選択して本発明の方法を実施することにより、 特殊 なレトロウィルスベクターを必要とせず、 簡便かつ高効率で遺伝子導入さ れた標的細胞を取得することができる。 遺伝子導入された細胞の脊椎動物 への移植により、 形質転換動物が簡便に作製され、 本発明の方法は医療的 分野、 細胞工学的分野、 遺伝子工学的分野、 発生工学的分野等において有 用である。 また本発明の機能性物質、 およびその混台物を含有する培地、 標的細胞へのレ トロウィルス介在遺伝子導入を行うためのキッ トも提供さ れ、 これらの培地、 キッ 卜を用いることにより、 レトロウイルスの配置、 標的細胞への外来遺伝子の導入などを簡便に効率よく行うことができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 線維芽細胞増殖因子、 線維芽細胞增殖因子を含有する機能性物 質、 および線維芽細胞增殖因子とフィブロネクチンの細胞接着部位ポリぺ プチドの混合物による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。 図 2は、 線維芽細胞増殖因子、 線維芽細胞増殖因子とフイブロネクチン の細胞接着部位ボリぺプチドの混合物、 およびフィブロネクチンの細胞接 着部位ポリベプチドによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフであ る
図 3は、 コラーゲンフラグメント、 フイブロネクチンの細胞接着部位ポ リぺプチドとコラーゲンフラグメントの混合物、 コラーゲンフラグメント を含有する機能性物質、 およびフィブロネクチンの細胞接着部位ポリぺプ チドによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
図 4は、 フイブロネクチンフラグメント、 およびフイブロネクチンフラ グメン卜とフィブロネクチンの細胞接着部位ポリぺプチドの混合物による 標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
図 5は、 フィブロネクチンの細胞接着部位ポリぺプチド、 ポリ リジン、 ポリ リジンとフイブロネクチンの細胞接着部位ポリべプチドの混合物、 フィ ブロネクチンフラグメント、 およびフィブロネクチンフラグメントとフィ ブロネクチンの細胞接着部位ポリベプチドの混合物による標的細胞への遺 伝子導入効率を示すグラフである。
図 6は、 エリスロポエチン誘導体、 ポリ リ ジン、 およびエリス口ポェチ ン誘導体とポリ リジンの混合物による標的細胞への遺伝子導入効率を示す グラフである。
図 7は、 エリスロポェチン誘導体、 フィブロネクチンフラグメント重合 体、 およびエリス口ポェチン誘導体とフイブロネクチンフラグメ ント重台 体の混合物による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
図 8は、 フイブロネクチンフラグメント固定化ビーズ、 フイブロネクチ ンの細胞接着部位ポリぺプチド固定化ビーズ、 およびフィブロネクチンフ ラグメ ントとフィブロネクチンの細胞接着部位ポリべプチドの混台物を固 定化したビーズによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。 図 9は、 線維芽細胞増殖因子、 および線維芽細胞増殖因子を含有する機 能性物質による標的細胞への遺伝子導入を示すグラフである。
図 1 0は、 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質の使用量と、 標的 細胞への遺伝子導入の関係を示すグラフである。
図 1 1は、 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質による標的細胞へ の遺伝子導入を示すグラフである。
図 1 2は、 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質による標的細胞へ の遺伝子導入効率を示すもう一つのグラフである。
図 1 3は、 コラーゲンフラグメ ントを含有する機能性物質の使用量と、 標的細胞への遺伝子導入の関係を示すグラフである。
図 1 4は、 ポリ リジンによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフ である。
図 1 5は、 フイブロネクチンフラグメ ン トおよびフイブロネクチンフラ グメン卜重合体による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。 図 1 6は、 フイブロネクチンフラグメ ン トおよびフイブロネクチンフラ グメン卜重合体による標的細胞への遺伝子導入効率を示すもうひとつのグ ラフである。
図 1 7は、 フイブロネクチンフラグメ ン トおよびフイブロネクチンフラ グメン卜重合体による標的細胞への遺伝子導入効率を示すさらにもうひと つのグラフである。
図 1 8は、 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質、 コラーゲンフラ グメント、 およびコラーゲンフラグメ ン卜を含有する機能性物質による標 的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。 図 1 9は、 フイブロネクチンフラグメ ン卜による標的細胞への遺伝子導 入効率を示すグラフである。
図 2 0は、 フイブロネクチンフラグメ ン卜および線維芽細胞増殖因子を 含有する機能性物質による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフであ る。
図 2 1は、 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質およびフイブロネ クチンフラグメントによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフであ る。
図 2 2は、 フィブロネクチンフラグメント固定化ビーズによる標的細胞 への遺伝子導入効率を示すグラフである。
図 2 3は、 フイブロネクチンフラグメント使用量と、 標的細胞への遺伝 子導入の関係を示すグラフである。
図 2 4は、 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質およびフイブロネ クチンフラグメントによる標的細胞への遺伝子導入を示すグラフである。 図 2 5は、 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質およびフィブロネ クチンフラグメ ントによる標的細胞への遺伝子導入を示すもう 1つのグラ フである。
図 2 6は、 コラーゲンフラグメン卜を含有する機能性物質による標的細 胞への遺伝子導入を示すグラフである。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 2 7 1
配列の型： アミ ノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列：
Ala He Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro 1 5 10 15
Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr
20 25 30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
35 40 45
Lys Glu l ie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
50 55 60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
65 70 75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr
80 85 90
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala
95 100 105
Thr Clu Thr Thr lie Thr l ie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr
110 115 120 He Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr
125 130 135
Pro l ie Gin Arg Thr l ie Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie
140 145 150
Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr
155 160 165
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val l ie Asp Ala Ser
170 175 180
Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr
185 190 195
Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg l ie
200 205 210
Thr Gly Tyr He l ie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg
215 220 225
Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie
230 235 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala
245 250 255
Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Gl u Pro Leu l ie Gly Arg Lys Lys
260 265 270
Thr 配列番号： 2
配列の長さ ： 2 5
配列の型： アミノ酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ぺプチド
配列 ：
Asp Glu leu Pro Gin し eu Val Thr leu Pro His Pro Asn leu His 1 5 10 15
Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr
20 25 配列番号： 3
配列の長さ ： 1 5 5
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Ala Ala Gly Ser lie Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys
20 25 30
Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg lie His Pro
35 40 45
Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His He
50 55 60
Lys Leu Gin Leu Gin Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser lie Lys 65 70 75
Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gl y Arg
80 85 90
Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Gl u Cys Phe Phe Phe Glu
95 100 105
Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr
110 115 120
Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu
125 130 135
Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin Lys Ala l ie Leu Phe Leu Pro
140 145 150
Met Ser Ala Lys Ser
155 配列番号： 4
配列の長さ ： 4 3 2
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser l ie Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser l ie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly l ie Asp Phe Ser Asp l ie Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp He Ala Pro Arg Ala Thr l ie Thr Gly Tyr Arg
110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser l ie Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195
Leu l ie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210 l ie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gl y Arg
245 250 255
Gl y Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro l ie Ser He Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Ala Ala Gly Ser lie Thr Thr
275 280 285
Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro
290 295 300
Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly
305 310 315
Phe Phe Leu Arg l ie His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg
320 325 330
Glu Lys Ser Asp Pro His lie Lys Leu Gin Leu Gin Ala Glu Glu
335 340 345
Arg Gly Val Val Ser l ie Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu
350 355 360
Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr
365 370 375
Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn
380 385 390
Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys
395 400 405 Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin 410 415 420
Lys Ala lie Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
425 430 配列番号： 5
配列の長さ ： 4 5 7
配列の型：アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列：
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn He Gly Pro Asp Thr Met Arg
1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly He Asp Phe Ser Asp He Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105
Thr Val His Trp He Ala Pro Arg Ala Thr l ie Thr Gly Tyr Arg
110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser l ie Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser l ie Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr l ie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro He Ser He Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Ala Ala Gly Ser He Thr Thr
275 280 285 Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro
290 295 300
Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly
305 310 315
Phe Phe Leu Arg lie His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg
320 325 330
Glu Lys Ser Asp Pro His lie Lys Leu Gin Leu Gin Ala Glu Glu
335 340 345
Arg Gly Val Val Ser lie Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu
350 355 360
Ala Met lys Glu Asp Gly Arg leu leu Ala Ser Lys Cys Val Thr
365 370 375
Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn
380 385 390
Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys
395 400 405
Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gin
410 415 420
Lys Ala lie Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Ala Ser Asp Glu Leu
425 430 435
Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu
440 445 450 lie Leu Asp Val Pro Ser Thr
455 配列番号： 6
配列の長さ ： 1 8 6
配列の型： アミ ノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Gly lie Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp
1 5 10 15
Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly Asp Met Gly lie Lys Gly Asp Arg
20 25 30
Gly Glu lie Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu
35 40 45
Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu
50 55 60
Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro
65 70 75
Gly Tyr Pro Gly Arg Gin Gly Pro Lys Gly Ser lie Gly Phe Pro
80 85 90
Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro
95 100 105
Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg
110 115 120
Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly lie Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys
125 130 135 Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg
140 145 150
Gly Pro Asn Gly Pro Gin Gly Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys
155 160 165
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro
170 175 180
Gly Gin Arg Gly Glu Thr
185 配列番号 ： 7
配列の長さ ： 4 6 4
配列の型 ： アミ ノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列 ：
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp ihr Met Arg 1 5 10 15
Val Thr 丁 rp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser He Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp He Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg
110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195
Leu He Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210
He Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu He Asp Lys Pro Ser Met Gly lie Arg Gly Leu Lys Gly
275 280 285
Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly
290 295 300
Asp Met Gly lie Lys Gly Asp Arg Gly Glu lie Gly Pro Pro Gly
305 310 315
Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly
320 325 330
Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro し eu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly
335 340 345
Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gin Gly
350 355 360
Pro Lys Gly Ser lie Gly Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly
365 370 375
Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly
380 385 390
Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly
395 400 405 lie Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly
410 415 420
Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gin Gly
425 430 435
Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 440 445 450
Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro Gly Gin Arg Gly Glu Thr
455 460 配列番号： 8
配列の長さ ： 4 8 9
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg
1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser He Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn leu し eu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105 Thr Val His Trp He Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg
110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser He Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Gly He Arg Gly Leu Lys Gly
275 280 285
Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly 290 295 300
Asp Met Gly l ie Lys Gly Asp Arg Gly Glu l ie Gly Pro Pro Gly
305 310 315
Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly
320 325 330
Pro Asn Gly Asp Pro Gl y Pro Leu Gl y Pro Pro Gl y Glu Lys Gly
335 340 345
Lys Leu Gly Val Pro Gly し eu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gin Gly
350 355 360
Pro Lys Gly Ser lie Gly Phe Pro Gl y Phe Pro Gly Ala Asn Gly
365 370 375
Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly
380 385 390
Gin Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly
395 400 405 lie Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly
410 415 420
Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gin Gly
425 430 435
Pro Thr Gly Phe Pro Gl y Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
440 445 450
Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro Gly Gin Arg Gly Ala Ser Asp
455 460 465
Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr し eu Pro His Pro Asn Leu His Gly
470 475 480 Pro Glu He Leu Asp Val Pro Ser Thr
485 配列番号： 9
配列の長さ ： 36
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （合成 DNA)
配列：
AAACCATGGC AGTCAGCGAC GAGCTTCCCC AACTGG 36 配列番号： 10
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （合成 DNA)
配列：
AATTGACAAA CCATCCATGG 20 配列番号： 11
配列の長さ ： 33
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー ：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （台成 DNA)
配列 ：
CCATTAAAAT CAGCTAGCAG CAGACATTGG AAG 33
配列番号： 12
配列の長さ ： 36
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （合成 DNA)
配列 ：
TCTAGAGGAT CCTTAGCTAG CGCCTCTCTG TCCAGG 36 配列番号： 13
配列の長さ ： 547
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列 ：
Ala Ala Ser Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin
5 10 15
Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val
20 25 30 Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Va l Arg Val Thr Pro Lys Gl u Lys Thr
35 40 45
Gly Pro Met Lys Glu l ie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val
50 55 60
Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val
65 70 75
Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val
80 85 90
Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val
95 100 105
Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys
110 115 120
Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn
125 130 135
Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ser
140 145 150
Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr
155 160 165
Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie
170 175 180
Asp Ala Ser Thr Ala l ie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu
185 190 195
ALa Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg
200 205 210
Ala Arg l ie Thr Gly Tyr l ie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser 215 220 225
Pro Pro Arg Glu Val Va l Pro Arg Pro Arg Pro Gl y Val Thr Glu
230 235 240
Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr l ie Tyr
245 250 255
Val l ie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu l ie Gly
260 265 270
Arg Lys Lys Thr Ser Ala l ie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe
275 280 285
Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro
290 295 300
Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu
305 310 315
Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser
320 325 330
Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val
. 335 340 345
Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr し eu Thr Ser Arg Pro Ala Gin
350 355 360
Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala
365 370 375
Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr l ie Ser Trp Arg
380 385 390
Thr Lys Thr Glu Thr l ie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro
395 400 405 no- Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr l ie Lys Pro Asp Val
410 415 420
Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys
425 430 435 lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val
440 445 450
Val l ie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg
455 460 465
Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro
470 475 480
5 3
Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr l ie lie Lys Tyr Glu Lys Pro
485 490 495
Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val
500 505 510
Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr
515 520 525 lie Tyr Val lie Ala leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro し eu
530 540 lie Gly Arg Lys Lys Thr Ser
545
配列番号： 1 4
配列の長さ ： 8 2 6
配列の型 ： アミ ノ酸
鎖の数 ： 1本鎖 トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列 ：
Ala Ala Ser Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie 丄 y Pro Asp
5 10 15
Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr
20 25 30
Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val
35 40 45
Ala Glu Leu Ser l ie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr
50 55 60
Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val
65 70 75
Tyr Glu Gin His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr
80 85 90
Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly He Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala
95 100 105
Asn Ser Phe Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr
110 115 120
Gly Tyr Arg lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro
125 130 135
Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr
140 145 150
Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu
155 160 165 Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr
170 175 180
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
185 190 195
Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg
200 205 210
Tyr Tyr Arg l ie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val
215 220 225
Gin Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser
230 235 240
Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val
245 250 255
Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie
260 265 270
Asn Tyr Arg Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Thr Ser Ala lie Pro
275 280 285
Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu
290 295 300
Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg
305 310 315
Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie
320 325 330
Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met
335 340 345
Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr 350 355 360
Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn
365 370 375
Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr
380 385 390
Thr lie Thr He Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly
395 400 405
Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin
410 415 420
Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu
425 430 435
Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp
440 445 450
Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie
455 460 465
Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser
470 475 480
Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr
485 490 495 lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val
500 505 510
Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu
515 520 525
Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn
530 535 540 Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu l ie Gly Arg Lys Lys Thr Ser Ala
545 550 555 l ie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr
560 565 570
Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly
575 580 585
Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys
590 595 600
Glu l ie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly
605 610 615
Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys
620 625 630
Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu
635 640 645
Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr
650 655 660
Glu Thr Thr l ie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr l ie
665 670 675
Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro
680 685 690 l ie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr He Thr
695 700 705
Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu
710 715 720
Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr 725 730 735
Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro
740 745 750
Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr
755 760 765
Gly Tyr lie He Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu
770 775 780
Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr
785 790 795
Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu
800 805 810
Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr
815 820 825
Ser 配列番号： 1 5
配列の長さ ： 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （合成 D N A )
配列：
AAACCATGGC AGCTAGCGCT ATTCCTGCAC CAACTGAC 38 配列番号： 1 6 配列の長さ ： 3 6
配列の型 ：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （台成 D N A )
配列：
AAAGGATCCC TAACTAGTCT TTTTCCTTCC AATCAG 36 配列番号： 1 7
配列の長さ ： 1 6 4 4
配列の型 ：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （人工のポリぺプチドをコ一ドする D N A ) 配列：
ATGGCAGCTA GCGCTATTCC TGCACCAACT GACCTGAAGT TCACTCAGGT CACACCCACA 60
AGCCTGAGCG CCCAGTGGAC ACCACCCAAT GTTCAGCTCA CTGGATATCG AGTGCGGGTG 120
ACCCCCAAGG AGAAGACCGG ACCAATGAAA GAAATCAACC TTGCTCCTGA CAGCTCATCC 180
GTGGTTGTAT CAGGACTTAT GGTGGCCACC AAATATGAAG TGAGTGTCTA TGCTCTTAAG 240
GACACTTTGA CAAGCAGACC AGCTCAGGGT GTTGTCACCA CTCTGGAGAA TGTCAGCCCA 300
CCAAGAAGGG CTCGTGTGAC AGATGCTACT GAGACCACCA TCACCATTAG CTGGAGAACC 360
AAGACTGAGA CGATCACTGG CTTCCAAGTT GATGCCGTTC CAGCCAATGG CCAGACTCCA 420
ATCCAGAGAA CCATCAACCC AGATGTCAGA AGCTACACCA TCACAGGTTT ACAACCAGGC 480
ACTGACTACA AGATCTACCT GTACACCTTG AATGACAATG CTCGGAGCTC CCCTGTGGTC 540
ATCGACGCCT CCACTGCCAT TGATGCACCA TCCAACCTGC GTTTCCTGGC CACCACACCC 600 AATTCCTTGC TGGTATCATG GCAGCCGCCA CGTGCCAGGA TTACCGGCTA CATCATCAAG 660
TATGAGAAGC CTGGGTCTCC TCCCAGAGAA GTGGTCCCTC GGCCCCGCCC TGGTGTCACA ?20
GAGGCTACTA TTACTGGCCT GGAACCGGGA ACCGAATATA CAATTTATGT CATTGCCCTG 780
AAGAATAATC AGAAGAGCGA GCCCCTGATT GGAAGGAAAA AGACTAGCGC TATTCCTGCA 840
CCAACTGACC TGAAGTTCAC TCAGGTCACA CCCACAAGCC TGAGCGCCCA GTGGACACCA 900
CCCAATGTTC AGCTCACTGG ATATCGAGTG CGGGTGACCC CCAAGGAGAA GACCGGACCA 960
ATGAAAGAAA TCAACCTTGC TCCTGACAGC TCATCCGTGG TTGTATCAGG ACTTATGGTG 1020
GCCACCAAAT ATGAAGTGAG TGTCTATGCT CTTAAGGACA CTTTGACAAG CAGACCAGCT 1080
CAGGGTGTTG TCACCACTCT GGAGAATGTC AGCCCACCAA GAAGGGCTCG TGTGACAGAT 1140
GCTACTGAGA CCACCATCAC CATTAGCTGG AGAACCAAGA CTGAGACGAT CACTGGCTTC 1200
CAAGTTGATG CCGTTCCAGC CAATGGCCAG ACTCCAATCC AGAGAACCAT CAAGCCAGAT 1260
GTCAGAAGCT ACACCATCAC AGGTTTACAA CCAGGCACTG ACTACAAGAT CTACCTGTAC 1320
ACCTTGAATG ACAATGCTCG GAGCTCCCCT GTGGTCATCG ACGCCTCCAC TGCCATTGAT 1380
GCACCATCCA ACCTGCGTTT CCTGGCCACC ACACCCAATT CCTTGCTGGT ATCATGGCAG 1440
CCGCCACGTG CCAGGATTAC CGGCTACATC ATCAAGTATG AGAAGCCTGG GTCTCCTCCC 1500
AGAGAAGTGG TCCCTCGGCC CCGCCCTGGT GTCACAGAGG CTACTATTAC TGGCCTGGAA 1560
CCGGGAACCG AATATACAAT TTATGTCATT GCCCTGAAGA ATAATCAGAA GACCGAGCCC 1620
CTGATTGGAA GGAAAAAGAC TAGT 1644 配列番号： 1 8
配列の長さ ： 3 7
配列の型 核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （台成 D N A ) 配列 ：
AAACCATGGC AGCTAGCCCC ACTGACCTGC GATTCAC 37 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 3 8
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （台成 D N A )
配列：
AAAAGATCTC TAACTAGTGG ATGGTTTGTC AATTTCTG 38 配列番号： 2 0
配列の長さ ： 2 4 8 1
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （人工のポリぺプチドをコ一ドする D N A ) 配列 ：
ATGGCAGCTA GCCCCACTGA CCTGCGATTC ACCAACATTG GTCCAGACAC CATGCGTGTC 60 ACCTGGGCTC CACCCCCATC CATTGATTTA ACCAACTTCC TGGTGCGTTA CTCACCTGTG 120 AAAAATGAGG AAGATCTTGC AGAGTTGTCA ATTTCTCCTT CAGACAATGC AGTGGTCTTA 180 ACAAATCTCC TGCCTGGTAC AGAATATGTA GTGAGTGTCT CCAGTGTCTA CGAACAACAT 240 GAGAGCACAC CTCTTAGAGG AAGACAGAAA ACAGGTCTTG ATTCCCCAAC TGGCATTGAC 300 TTTTCTGATA TTACTGCCAA CTCTTTTACT GTGCACTGGA TTGCTCCTCG AGCCACCATC 360 o
Figure imgf000122_0001
ACCAAATATG AAGTGAGTGT CTATGCTCTT AAGGACACTT TGACAAGCAG ACCAGCTCAG 1920 GGTGTTGTCA CCACTCTGGA GAATGTCAGC CCACCAAGAA GGGCTCGTGT GACAGATGCT 1980 ACTGAGACCA CCATCACCAT TAGCTGGAGA ACCAAGACTG AGACGATCAC TGGCTTCCAA 2040 GTTGATGCCG TTCCAGCCAA TGGCCAGACT CCAATCCAGA GAACCATCAA GCCAGATGTC 2100 AGAAGCTACA CCATCACAGG TTTACAACCA GGCACTGACT ACAAGATCTA CCTGTACACC 2160 TTGAATGACA ATGCTCGGAG CTCCCCTGTG GTCATCGACG CCTCCACTGC CATTGATGCA 2220 CCATCCAACC TGCGTTTCCT GGCCACCACA CCCAATTCCT TGCTGGTATC ATGGCAGCCG 2280 CCACGTGCCA GGATTACCGG CTACATCATC AAGTATGAGA AGCCTGGGTC TCCTCCCAGA 2340 GAAGTGGTCC CTCGGCCCCG CCCTGGTGTC ACAGAGGCTA CTATTACTGG CCTGGAACCG 2400 GGAACCGAAT ATACAATTTA TGTCATTGCC CTGAAGAATA ATCAGAAGAG CGAGCCCCTG 2460 ATTGGAAGGA AAAAGACTAG T 2481
配列番号： 2 1
配列の長さ ： 4 7 2
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列：
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg
1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val し ys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45 Ser l ie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly He Asp Phe Ser Asp l ie Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp l ie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg
110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser l ie Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser l ie Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu l ie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195
Leu l ie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210 l ie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr l ie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp
275 280 285
Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp
290 295 300
Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
305 310 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro
320 325 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
335 340 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
350 355 360
Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
365 370 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie
380 385 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp
395 400 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr l ie Lys
410 415 420 Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr l ie Thr Gl y Leu Gin Pro Gl y Thr
425 430 435
Asp Tyr Lys l ie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
440 445 450
Ser Pro Val Val l ie Asp Ala Ser Thr Ala l ie Asp Ala Pro Ser
455 460 465
Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr
470 配列番号： 2 2
配列の長さ ： 4 5 7
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列：
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn He Gly Pro Asp Thr Met Arg
1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser l ie Asp Leu Thr Asn Phe し eu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Gl u Gin 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gl y Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly l ie Asp Phe Ser Asp l ie Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg
110 115 120
He Arg Hi s His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Gl u Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser He Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser l ie Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu He Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210 l ie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr l ie Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr l ie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro l ie Ser He Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu l ie Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg
275 280 285
Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr l ie Ser Trp
290 295 300
Arg Thr Lys Thr Glu Thr He Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val
305 310 315
Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro l ie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp
320 325 330
Val Arg Ser Tyr Thr l ie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr
335 340 345
Lys He Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro
350 355 360
Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu
365 370 375
Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin
380 385 390
Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr l ie He Lys Tyr Glu Lys
395 400 405
Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly
410 415 420
Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr
425 430 435
Thr l ie Tyr Val He Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro 440 445 450
Leu l ie Gly Arg Lys Lys Thr
455 配列番号： 2 3
配列の長さ ： 5 4 9
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn He Gly Pro Asp Thr Met Arg
1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser l ie Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly l ie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105 Thr Val Hi s Trp He Ala Pro Arg Ala Thr l ie Thr Gl y Tyr Arg
110 115 120 l ie Arg Hi s His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser He Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu l ie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195 し eu He Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210 l ie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr He Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro He Ser He Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu l ie Asp Lys Pro Ser Met Ala l ie Pro Ala Pro Thr Asp
275 280 285
Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp 290 295 300
Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
305 310 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met lys Glu lie Asn Leu Ala Pro
320 325 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
335 340 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
350 355 360
Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
365 370 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie
380 385 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp
395 400 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys
410 415 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr
425 430 435
Asp Tyr Lys l ie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
440 445 450
Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala He Asp Ala Pro Ser
455 460 465
Asn leu Arg Phe leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser leu し eu Val Ser
470 475 480 Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg l ie Thr Gl y Tyr l ie lie lys Tyr
485 490 495
Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg
500 505 510
Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr
515 520 525
Glu Tyr Thr l ie Tyr Val He Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser
530 535 540
Glu Pro Leu l ie Gly Arg Lys Lys Thr
545 配列番号： 2
配列の長さ ： 5 7 4
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列：
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn l ie Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser He Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro し eu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg
110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys
230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr He Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro l ie Ser He Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu l ie Asp Lys Pro Ser Met Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp
275 280 285
Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp
290 295 300
Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
305 310 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu He Asn Leu Ala Pro
320 325 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
335 340 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
350 355 360
Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
365 370 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr He Thr lie
380 385 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr l ie Thr Gly Phe Gin Val Asp
395 400 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro He Gin Arg Thr He Lys
410 415 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr l ie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr 425 430 435
Asp Tyr Lys l ie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
440 445 450
Ser Pro Val Val l ie Asp Ala Ser Thr Ala l ie Asp Ala Pro Ser
455 460 465
Asn Leu Arg Phe し eu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser
470 475 480
Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg l ie Thr Gly Tyr l ie lie Lys Tyr
485 490 495
Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg
500 505 510
Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr
515 520 525
Glu Tyr Thr l ie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser
530 535 540
Glu Pro Leu He Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gin Leu
545 550 555
Val Thr Leu Pro His Pro Asn leu His Gly Pro Glu lie し eu Asp
560 565 570
Val Pro Ser Thr 配列番号 ： 2 δ
配列の長さ ： 2 7 4
配列の型 ： アミ ノ酸
鎖の数 ： 1本鎖 トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： ぺプチ ド
配列 ：
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn He my Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe し eu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser He Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg
110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser He Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165 Glu Gl u Ser Pro Leu Leu l ie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195
Leu l ie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210 l ie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Gl u Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr He Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu lie Asp
配列番号： 2 6
配列の長さ ： 1 3 7 4
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （人工のポリぺプチドをコ一ドする D N A ) 配列：
ATGCCCACTG ACCTGCGATT CACCAACATT GGTCCAGACA CCATGCGTGT CACCTGGGCT 60
CCACCCCCAT CCATTGATTT AACCAACTTC CTGGTGCGTT ACTCACCTGT GAAAAATGAG 120 GAAGATGTTG CAGAGTTGTC AATTTCTCCT TCAGACAATG CAGTGGTCTT AACAAATCTC 180 CTGCCTGGTA CAGAATATGT AGTGAGTGTC TCCAGTGTCT ACGAACAACA TGAGAGCACA 240 CCTCTTAGAG GAAGACAGAA AACAGGTCTT GATTCCCCAA CTGGCATTGA CTTTTCTGAT 300 ATTACTGCCA ACTCTTTTAC TGTGCACTGG ATTGCTCCTC GAGCCACCAT CACTGGCTAC 360 AGGATCCGCC ATCATCCCGA GCACTTCAGT GGGAGACCTC GAGAAGATCG GGTGCCCCAC 420 TCTCGGAATT CCATCACCCT CACCAACCTC ACTCCAGGCA CAGAGTATGT GGTCAGCATC 480 GTTGCTCTTA ATGGCAGAGA GGAAAGTCCC TTATTGATTG GCCAACAATC AACAGTTTCT 540 GATGTTCCGA GGGACCTGGA AGTTGTTGCT GCGACCCCCA CCAGCCTACT GATCAGCTGG 600 GATGCTCCTG CTGTCACAGT GAGATATTAC AGGATCACTT ACGGAGAAAC AGGAGGAAAT 660 AGCCCTGTCC AGGAGTTCAC TGTGCCTGGG AGCAAGTCTA CAGCTACCAT CAGCGGCCTT 720 AAACCTGGAG TTGATTATAC CATCACTGTG TATGCTGTCA CTGGCCGTGG AGACAGCCCC 780 GCAAGCAGCA AGCCAATTTC CATTAATTAC CGAACAGAAA TTGACAAACC ATCCATGGCA 840 GCCGGGAGCA TCACCACGCT GCCCGCCTTG CCCGAGGATG GCGGCAGCGG CGCCTTCCCG 900 CCCGGCCACT TCAAGGACCC CAAGCGGCTG TACTGCAAAA ACGGGGGCTT CTTCCTCCGC 960 ATCCACCCCG ACGGCCGAGT TGACGGGGTC CGGGAGAAGA GCGACCCTCA CATCAAGCTA 1020 CAACTTCAAG CAGAAGAGAG AGGAGTTGTG TCTATCAAAG GAGTGTGTGC TAACCGTTAC 1080 CTGGCTATGA AGGAAGATGG AAGATTACTG GCTTCTAAAT GTGTTACGGA TGAGTGTTTC 1140 TTTTTTGAAC GATTGGAATC TAATAACTAC AATACTTACC GCTCAAGGAA ATACACCAGT 1200 TGGTATGTGG CACTGAAACG AACTGGGCAG TATAAACTTG GATCCAAAAC AGGACCTGGG 1260 CAGAAAGCTA TACTTTTTCT TCCAATGTCT GCTGCTAGCG ACGAGCTTCC CCAACTGGTA 1320 ACCCTTCCAC ACCCCAATCT TCATGGACCA GAGATCTTGG ATGTTCCTTC CACA 1374 配列番号： 2 7
配列の長さ ： 1 4 1 6
配列の型：核酸 鎖の数： 2本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （人工のボリベプチドをコ一ドする D N A 配列 ：
CCCACTGACC TGCGATTCAC CAACATTGGT CCAGACACCA TGCGTGTCAC CTGGGCTCCA 60 CCCCCATCCA TTGATTTAAC CAACTTCCTG GTGCGTTACT CACCTGTGAA AAATGAGGAA 120 GATGTTGCAG AGTTGTCAAT TTCTCCTTCA GACAATGCAG TGGTCTTAAC AAATCTCCTG 180
CCTGGTACAG AATATGTAGT GAGTGTCTCC AGTGTCTACG AACAACATGA GAGCACACCT 240
CTTAGAGGAA GACAGAAAAC AGGTCTTGAT TCCCCAACTG GCATTGACTT TTCTGATATT 300
ACTGCCAACT CTTTTACTGT GCACTGGATT GCTCCTCGAG CCACCATCAC TGGCTACAGG 360
ATCCGCCATC ATCCCGAGCA CTTCAGTGGG AGACCTCGAG AAGATCGGGT GCCCCACTCT 420
CGGAATTCCA TCACCCTCAC CAACCTCACT CCAGGCACAG AGTATGTGGT CAGCATCGTT 480
GCTCTTAATG GCAGAGAGGA AAGTCCCTTA TTGATTGGCC AACAATCAAC AGTTTCTGAT 540
GTTCCGAGGG ACCTGGAAGT TGTTGCTGCG ACCCCCACCA GCCTACTGAT CAGCTGGGAT 600
GCTCCTGCTG TCACAGTGAG ATATTACAGG ATCACTTACG GAGAAACAGG AGGAAATAGC 660
CCTGTCCAGG AGTTCACTGT GCCTGGGAGC AAGTCTACAG CTACCATCAG CGGCCTTAAA 720
CCTGGAGTTG ATTATACCAT CACTGTGTAT GCTGTCACTG GCCGTGGAGA CAGCCCCGCA 780
AGCAGCAAGC CAATTTCCAT TAATTACCGA ACAGAAATTG ACAAACCATC CATGGCTATT 840
CCTGCACCAA CTGACCTGAA GTTCACTCAG GTCACACCCA CAAGCCTGAG CGCCCAGTGG 900
ACACCACCCA ATGTTCAGCT CACTGGATAT CGAGTGCGGG TGACCCCCAA GGAGAAGACC 960
GGACCAATGA AAGAAATCAA CCTTGCTCCT GACAGCTCAT CCGTGGTTGT ATCAGGACTT 1020
ATGGTGGCCA CCAAATATGA AGTGAGTGTC TATGCTCTTA AGGACACTTT GACAAGCAGA 1080
CCAGCTCAGG GTGTTGTCAC CACTCTGGAG AATGTCAGCC CACCAAGAAG GGCTCGTGTG 1140
ACAGATGCTA CTGAGACCAC CATCACCATT AGCTGGAGAA CCAAGACTGA GACGATCACT 1200
GGCTTCCAAG TTGATGCCGT TCCAGCCAAT GGCCAGACTC CAATCCAGAG AACCATCAAG 1260 CCAGATGTCA GAAGCTACAC CATCACAGGT TTACAACCAG GCACTGACTA CAAGATCTAC 1320 CTGTACACCT TGAATGACAA TGCTCGGAGC TCCCCTGTGG TCATCGACGC CTCCACTGCC 1380 ATTGATGCAC CATCCAACCT GCGTTTCCTG GCCACC 1416
配列番号： 2 8
配列の長さ ： 3 5
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列：
Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gin Arg 1 5 10 15
Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly He Thr
20 25 30
Gly lys Pro Gly Pro
35 配列番号： 2 9
配列の長さ ： 3 0 2
配列の型： アミ ノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn l ie Gly Pro Asp Thr Met Arg
1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val し ys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn し eu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp He Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg
110 115 120
He Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser He Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 し eu l ie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr T r Arg
200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gl y Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr l ie Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr l ie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro l ie Ser He Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr
275 280 285
Leu Pro His Pro Asn leu His Gly Pro Glu He Leu Asp Val Pro
290 295 300
Ser Thr 配列番号： 3 0
配列の長さ ： 5 7 3
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Met Ala Ala Ser Ala He Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr 5 10 15
Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn
20 25 30
Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys
35 40 45
Thr Gly Pro Met Lys Glu l ie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser
50 55 60
Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser
65 70 75
Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly
80 85 90
Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg
95 100 105
Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr l ie Thr He Ser Trp Arg Thr
110 115 120
Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala
125 130 135
Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg
140 145 150
Ser Tyr Thr lie Thr Gl y Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie
155 160 165
Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val
170 175 180 l ie Asp Ala Ser Thr Ala l ie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe
185 190 195 Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro
200 205 210
Arg Ala Arg He Thr Gly Tyr lie l ie Lys Tyr Gl u Lys Pro Gly
215 220 225
Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr
230 235 240
Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr He
245 250 255
Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie
260 265 270
Gly Arg Lys Lys Thr Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe
275 280 285
Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro
290 295 300
Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu
305 310 315
Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser
320 325 330
Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val
335 340 345
Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin
350 355 360
Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala
365 370 375
Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg 380 385 390
Thr Lys Thr Glu Thr He Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro
395 400 405
Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val
410 415 420
Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys
425 430 435 lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val
440 445 450
Val He Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg
455 460 465
Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro
470 475 480
Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr He lie Lys Tyr Glu lys Pro
485 490 495
Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val
500 505 510
Thr Glu Ala Thr He Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr
515 520 525 lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu
530 535 540
He Gly Arg Lys Lys Thr Ser Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr
545 550 555
Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro
560 565 570 Ser Thr Ser 配列番号： 31
配列の長さ ： 37
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （合成 DNA)
配列
AAACCATGGC AGCTAGCAAT GTCAGCCCAC CAAGAAG 37 配列番号： 32
配列の長さ ： 37
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （合成 DNA)
配列
AAAGGATCCC TAACTAGTGG AAGGAACATC CAAGATC 37
配列番号： 33
配列の長さ ： 1722
配列の型：核酸
鎖の数： 2
トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸 （人工のポリぺプチドをコ一ドする D N A ) 配列
ATGGCAGCTA GCGCTATTCC TGCACCAACT GACCTGAAGT TCACTCAGGT CACACCCACA 60 AGCCTGAGCG CCCAGTGGAC ACCACCCAAT GTTCAGCTCA CTGGATATCG AGTGCGGGTG 120 ACCCCCAAGG AGAAGACCGG ACCAATGAAA GAAATCAACC TTGCTCCTGA CAGCTCATCC 180
GTGGTTGTAT CAGGACTTAT GGTGGCCACC AAATATGAAG TGAGTGTCTA TGCTCTTAAG 240
GACACTTTGA CAAGCAGACC AGCTCAGGGT GTTGTCACCA CTCTGGAGAA TGTCAGCCCA 300
CCAAGAAGGG CTCGTGTGAC AGATGCTACT GAGACCACCA TCACCATTAG CTGGAGAACC 360
AAGACTGAGA CGATCACTGG CTTCCAAGTT GATGCCGTTC CAGCCAATGG CCAGACTCCA 420
ATCCAGAGAA CCATCAAGCC AGATGTCAGA AGCTACACCA TCACAGGTTT ACAACCAGGC 480
ACTGACTACA AGATCTACCT GTACACCTTG AATGACAATG CTCGGAGCTC CCCTGTGGTC 540
ATCGACGCCT CCACTGCCAT TGATGCACCA TCCAACCTGC GTTTCCTGGC CACCACACCC 600
AATTCCTTGC TGGTATCATG GCAGCCGCCA CGTGCCAGGA TTACCGGCTA CATCATCAAG 660
TATGAGAAGC CTGGGTCTCC TCCCAGAGAA GTGGTCCCTC GGCCCCGCCC TGGTGTCACA 720
GAGGCTACTA TTACTGGCCT GGAACCGGGA ACCGAATATA CAATTTATGT CATTGCCCTG 780
AAGAATAATC AGAAGAGCGA GCCCCTGATT GGAAGGAAAA AGACTAGCGC TATTCCTGCA 840
CCAACTGACC TGAAGTTCAC TCAGGTCACA CCCACAAGCC TGAGCGCCCA GTGGACACCA 900
CGCAATGTTC AGCTCACTGG ATATCGAGTG CGGGTGACCC CCAAGGAGAA GACCGGACCA 960
ATGAAAGAAA TCAACCTTGC TCCTGACAGC TCATCCGTGG TTGTATCAGG ACTTATGGTG 1020
GCCACCAAAT ATGAAGTGAG TGTCTATGCT CTTAAGGACA CTTTGACAAG CAGACCAGCT 1080
CAGGGTGTTG TCACCACTCT GGAGAATGTC AGCCCACCAA GAAGGGCTCG TGTGACAGAT 1140
GCTACTGAGA CCACCATCAC CATTAGCTGG AGAACCAAGA CTGAGACGAT CACTGGCTTC 1200
CAAGTTGATG CCGTTCCAGC CAATGGCCAG ACTCCAATCC AGAGAACCAT CAAGCCAGAT 1260
GTCAGAAGCT ACACCATCAC AGGTTTACAA CCAGGCACTG ACTACAAGAT CTACCTGTAC 1320
ACCTTGAATG ACAATGCTCG GAGCTCCCCT GTGGTCATCG ACGCCTCCAC TGCCATTGAT 1380 GCACCATCCA ACCTGCGTTT CCTGGCCACC ACACCCAATT CCTTGCTGGT ATCATGGCAG 1440
CCGCCACGTG CCAGGATTAC CGGCTACATC ATCAAGTATG AGAAGCCTGG GTCTCCTCCC 1500
AGAGAAGTGG TCCCTCGGCC CCGCCCTGGT GTCACAGAGG CTACTATTAC TGGCCTGGAA 1560
CCGGGAACCG AATATACAAT TTATGTCATT GCCCTGAAGA ATAATCAGAA GAGCGAGCCC 1620
CTGATTGGAA GGAAAAAGAC TAGCGACGAG CTTCCCCAAC TGGTAACCCT TCCACACCCC 1680
AATCTTCATG GACCAGAGAT CTTGGATGTT CCTTCCACTA GT 1722 配列番号： 3 4
配列の長さ ： 4 1 2
配列の型： アミノ酸
鎖の数： 1
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin
5 10 15
Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu
20 25 30
His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys
35 40 45
Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp
50 55 60
Gly Asp Val Lys Leu Thr Gin Ser Met Ala lie lie Arg Tyr He
65 70 75
Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala 80 85 90
Glu l ie Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp He Arg Tyr Gly
95 100 105
Val Ser Arg lie Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val
110 115 120
Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp
125 130 135
Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His
140 145 150
Pro Asp Phe Met し en Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met
155 160 165
Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys
170 175 180
Lys Arg lie Glu Ala l ie Pro Gin l ie Asp Lys Tyr Leu Lys Ser
185 190 195
Ser Lys Tyr lie Ala Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala Thr Phe
200 205 210
Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu l ie Glu Gly Arg
215 220 225
Gly He Pro Arg Asn Ser Gly Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp
230 235 240
Ser Arg Val Leu Gin Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu
245 250 255
Asn l ie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
260 265 270 l ie Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 275 280 285
Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala
290 295 300
Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu Leu Val Asn
305 310 315
Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
320 325 330
Val Ser Gly Leu Arg Ser し eu Thr Thr Leu Leu Arg Ala し eu Gly
335 340 345
Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
350 355 360
Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg
365 370 375
Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
380 385 390
Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Ar し eu Ala Met Asp Pro Leu Glu
395 400 405
Ser Thr Arg Ala Ala Ala Ser
410 配列番号： 3 5
配列の長さ ： 2 4
配列の型 ：核酸
鎖の数 ： 1 トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （台成 DNA)
配列
GCTCCCTCTG GGCCTCCCAG TCCT 24
配列番号： 36
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （合成 DNA)
配列
GTTGGTGAGG GAGGTGGTGG ATAT 24 配列番号： 37
配列の長さ ： 33
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （合成 DNA)
配列
GGCCTCCCGA ATTCCGGTGC CCCACCACGC CTC 33 配列番号： 38
配列の長さ ： 33 配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （合成 D N A )
配列
CCCACGTGGA TCCATGGCTA ATCTGTCCCC TGT 33 配列番号： 3 9
配列の長さ ： 1 2 3 9
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 （人工のポリベプチドをコ一 ドする D N A ) 配列
ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC TCGACTTCTT 60 TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG AGCGCGATGA AGGTGATAAA 120 TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT 180
GGTGATGTTA AATTAACACA GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC 240
ATGTTGGGTG GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG 300
GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC TCTCAAAGTT 360
GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG AAGATCGTTT ATGTCATAAA 420
ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT 480
GTTGTTTTAT ACATGGACCC AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA 540
AAACGTATTG AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA 600
TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC AAAATCGGAT 660 >
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AGCCGCCGGTCTCCAT GCAGG i
¾CAACC CCO GAGGCTGA GGACA CACCTCGGATTAG- CTCC TACACTTT CCC CCACGCAAACT TGAC CTCCCGCTGTT.AATTT
GACGCC GAAGC CTCGGTG ACCCCC CTCTTTCAGCTGTT- AAAAACCCCTCTGCC CCC GGGAGGAGT CACCCC GTCTGOATTG GCCCGTOGGGGCC CTGTC LCC C GCCTTTTAGCC¾G__- CG TCCT JGc GTC GGCc¾TG ;一_
C ACTGAGCTT JGAGCT - T¾GTCACTGT ACACCA ΤΤΑλΤΤCΤ
CAGCCT TGAGGTA CTTTCCCCCGAG GC CAC AAAGACGAGGGGGG- CGT CCCC GT TCAG&CTCGAG¾C CACAGCCCACTTTGTG CTGCC CACG

Claims

請 求 の 範 囲
1 . レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方 法において、 レ トロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、 標 的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質との混合物の存在下で、 標的細胞をレ卜ロウィルスで感染させることを特徴とするレ トロウイルス による標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法。
2 . レ トロウイルス結合部位を有する機能性物質が、 フイブロネクチン のへパリ ンー I I結合領域、 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲン、 ポリ リ ジ ンまたはそれらと機能的な同等物から選択される機能性物質である請求項
1記載の方法。
3 . 標的細胞結合部位を有する機能性物質が、 標的細胞と特異的に結合 するリガンドである請求項 1記載の方法。
4 . リガン ドカ \ 細胞接着性のタンパク質、 ホルモン、 サイ トカイ ン、 抗体、 糖鎖、 炭水化物または代謝物である請求項 3記載の方法。
5 . 細胞接着性のタンパク質が、 フイブロネクチンの細胞結合領域ポリ ぺプチドである請求項 4記載の方法。
6 . フイブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドが、 V L A— 5およ び/または V L A— 4への結台領域ポリベプチドである請求項 5記載の方 法。
7 . リガンドが、 エリスロポエチンである請求項 4記載の方法。
8 . 機能性物質が固定化されている請求項 1〜 7いずれか 1項記載の方 法。
9. レトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、 標的細胞 結合部位を有する他の有効量の機能性物質との混合物を含有するレ トロゥ ィルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用する標的細胞の培養培地。
1 0 . レ トロウイルス結合部位を有する機能性物質が、 フイブロネクチ ンのへパリ ン一 I I結合領域、 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲン、 ポリ リ ジンまたはそれらと機能的な同等物から選択される機能性物質である請求 項 9記載の培養培地。
1 1 . 標的細胞結合部位を有する機能性物質が、 標的細胞と特異的に結 合するリガンドである請求項 9記載の培養培地。
1 2 . リガンドが、 細胞接着性のタンパク質、 ホルモン、 サイ トカイン、 抗体、 糖鎖、 炭水化物または代謝物である請求項 1 1記載の培養培地。
1 3 . 細胞接着性のタンパク質が、 フイブロネクチンの細胞結合領域ポ リベプチドである請求項 1 2記載の培養培地。
1 4 . フイブロネクチンの細胞結合領域ポリぺプチドが、 V L A— 5お よび Zまたは V L A— 4への結合領域ポリべプチドである請求項 1 3記載 の培養培地。
1 5. リガンドが、 エリスロポエチンである請求項 1 2記載の培養培地。
1 6 . 機能性物質が固定化されている請求項 9〜1 5いずれか 1項記載 の培養培地。
1 7 . レトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、 標的細 胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質との混合物と接触したレ ト口 ウィルスを含有する培地をィンキュベ一卜することを特徴とするレ 卜ロウ ィルスの配置方法。
1 8 . レトロウイルス結合部位を有する機能性物質が、 フイブロネクチ ンのへパリン— I I結台領域、 線維芽細胞增殖因子、 コラーゲン、 ポリ リ ジンまたはそれらと機能的な同等物から選択される機能性物質である請求 項 1 7記載の配置方法。
19. 標的細胞結台部位を有する機能性物質が、 標的細胞と特異的に結 合するリガンドである請求項 17記載の配置方法。
20. リガンドが、 細胞接着性のタンパク質、 ホルモン、 サイ トカイン、 抗体、 糖鎖、 炭水化物または代謝物である請求項 19記載の配置方法。
21. 細胞接着性のタンパク質が、 フイブロネクチンの細胞結合領域ポ リベプチドである請求項 20記載の配置方法。
22. フイブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドが、 VLA—5お よび/または VLA— 4への結合領域ポリべプチドである請求項 21記載 の配置方法。
23. リガンドが、 エリスロポエチンである請求項 20記載の方法。 24. 機能性物質が固定化されている請求項 17〜23いずれか 1項記 載の配置方法。
25. 標的細胞内へのレ トロウィルス介在遺伝子導入の実施に使用する ためのキッ 卜であって、
(a) レトロウィルス結合部位を有する有効量の機能性物質および/ま たは標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質、
(b) レトロウィルスと標的細胞をィンキュベー卜するための人工基質、 および
(c) 上記標的細胞を予備刺激するための標的細胞増殖因子、
を含んでなることを特徴とするキッ ト。
26. レ トロウイルス結台部位を有する機能性物質が、 フイブロネクチ ンのへパリ ン— I I結合領域、 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲン、 ポリ リ ジンまたはそれらと機能的な同等物から選択される機能性物質である請求 項 25記載のキッ 卜。
27. 標的細胞結合部位を有する機能性物質が、 標的細胞と特異的に結 台するリガン ドである請求項 25記載のキッ 卜。
28. リガン ドが、 細胞接着性のタンパク質、 ホルモン、 サイ ト力イン. 抗体、 糖鎖、 炭水化物または代謝物である請求項 27記載のキッ ト。
29. 細胞接着性のタンパク質が、 フイブロネクチンの細胞結合領域ポ リベプチドである請求項 27記載のキッ ト。
30. フイブロネクチンの細胞結台領域ポリペプチドが、 VLA— 5お よび/または VLA— 4への結合領域ポリべプチドである請求項 29記載 のキッ ト。
31. リガンドが、 エリスロポエチンである請求項 28記載のキッ ト。 32. 機能性物質が固定化されている請求項 25~31いずれか 1項記 載のキッ 卜。
33. 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまたはポリ リ ジン由来のレ トロ ゥィルス結合部位を有する有効量の機能性物質と接触したレトロウイルス を含有する培地をィンキュベー卜することを特徴とするレトロウイルスの 配置方法。
34. 機能性物質が固定化されている請求項 33記載の配置方法。
35. レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる 方法において、 標的細胞結合部位と線維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまた はポリ リ ジン由来のレトロウィルス結合部位またはそれらと機能的な同等 物とを同一分子上に有する有効量の機能性物質の存在下で、 標的細胞をレ トロウィルスで感染させることを特徴とするレ卜ロウィルスによる標的細 胞への遺伝子導入を向上させる方法。
36. 標的細胞結合部位が、 標的細胞と特異的に結合するリガン ドであ る請求項 35記載の方法。
37. リガンドが、 細胞接着性のタンパク質、 ホルモン、 サイ トカイン、 抗体、 糖鎖、 炭水化物または代謝物である請求項 3 6記載の方法。
3 8 . 細胞接着性のタンパク質が、 フイブロネクチンの細胞結合領域ポ リベプチドである請求項 3 7記載の方法。
3 9 . フイブロネクチンの細胞結合領域ポリぺプチドが、 V L A— 5お よび/または V L A— 4への結合領域ポリぺプチドである請求項 3 8記載 の方法。
4 0 . リガンド力く、 エリスロポエチンである請求項 3 7記載の方法。 4 1 . 線維芽細胞増殖因子が、 配列表の配列番号 3で表される線維芽細 胞增殖因子、 該因子の機能的同等物、 および該因子または該因子の機能的 同等物を含有するポリべプチドから選択される線維芽細胞增殖因子である 請求項 3 5 Ϊ2載の方法。
4 2 . 機能性物質が配列表の配列番号 4または 5で表されるァミ ノ酸配 列を有するポリべプチドである請求項 3 5記載の方法。
4 3 . コラーゲンが V型コラーゲン由来のィンスリン結合部位を含有す るフラグメン卜、 該フラグメン卜の機能的同等物、 および該フラグメント または該フラグメントの機能的同等物を含有するポリべプチドから選択さ れるコラーゲンである請求項 3 5記載の方法。
4 4 . V型コラーゲン由来のィンスリン結合部位を含有するフラグメン 卜が、 配列表の配列番号 6で表されるァミノ酸配列を含有するフラグメ ン 卜である請求項 4 3記載の方法。
4 5 . 機能性物質が配列表の配列番号 7または 8で表されるァミノ酸配 列を有するポリべプチドである請求項 3 5記載の方法。
4 6 . 機能性物質が固定化されている請求項 3 5〜4 5いずれか 1項記 載の方法。
4 7 . 機能性物質が固定化されていない請求項 3 5〜4 5いずれか 1項 記載の方法。
4 8 . 標的細胞結台部位と線維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまたはボリ リ ジン由来のレ 卜ロウィルス結合部位またはそれらと機能的な同等物とを 同一分子上に有する有効量の機能性物を含有するレ トロウイルスによる標 的細胞への遺伝子導入に使用する標的細胞の培養培地。
4 9 . 線維芽細胞増殖因子が、 配列表の配列番号 3で表される線維芽細 胞増殖因子、 該因子の機能的同等物および該因子または該因子の機能的同 等物を含有するポリベプチドから選択される線維芽細胞増殖因子である請 求項 4 8記載の培養培地。
5 0 . 機能性物質が、 配列表の配列番号 4または 5で表されるアミノ酸 配列を有するポリべプチドである請求項 4 8記載の培養培地。
5 1 . コラーゲン力 \ V型コラーゲン由来のインスリン結台部位を含有 するフラグメン卜、 該フラグメン卜の機能的同等物、 および該フラグメン トまたは該フラグメン トの機能的同等物を含有するポリべプチドから選択 されるコラーゲンである請求項 4 8記載の培養培地。
5 2 . V型コラーゲン由来のィンスリン結合部位を含有するフラグメン 卜力 \ 配列表の配列番号 6で表されるァミノ酸配列を有するフラグメント である請求項 4 8記載の培養培地。
5 3 . 機能性物質が、 配列表の配列番号 7または 8で表されるアミノ酸 配列を有するボリべプチドである請求項 4 8記載の培養培地。
5 4 . 機能性物質が固定化されている請求項 4 8〜5 3いずれか 1項記 載の培養培地。
5 5 . 標的細胞結合部位と線維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまたはポリ リ ジン由来のレトロウィルス結合部位またはそれらと機能的な同等物とを 同一分子上に有する有効量の機能性物質と接触したレトロウイルスを含有 する培地をィンキュベー卜することを特徴とするレ トロウィルスの配置方 法。
5 6 . 線維芽細胞増殖因子が、 配列表の配列番号 3で表される線維芽細 胞增殖因子、 該因子の機能的同等物、 および該因子または該因子の機能的 同等物を含有するポリべプチドから選択される線維芽細胞増殖因子である 請求項 5 5記載の配置方法。
5 7 . 機能性物質が、 配列表の配列番号 4または 5で表されるアミノ酸 配列を有するポリべプチドである請求項 5 5記載の配置方法。
5 8 . コラーゲン力 \ V型コラーゲン由来のインスリ ン結合部位を含有 するフラグメン卜、 該フラグメン卜の機能的同等物、 および該フラグメン 卜または該フラグメン卜の機能的同等物を含有するポリべプチドから選択 されるコラーゲンである請求項 5 5記載の配置方法。
δ 9 . V型コラーゲン由来のィンスリン結合部位を含有するフラグメン 卜が、 配列表の配列番号 6で表されるァミノ酸配列を含有するフラグメン トである請求項 5 8記載の配置方法。
6 0 . 機能性物質が、 配列表の配列番号 7または 8で表されるアミノ酸 配列を有するポリべプチドである請求項 5 5記載の配置方法。
6 1 . 機能性物質が固定化されている請求項 5 5〜6 0いずれか 1項記 載の配置方法。
6 2 . 標的細胞内へのレトロウィルス介在遺伝子導入の実施に使用する ためのキッ 卜であって、
( a ) 標的細胞結合部位と線維芽細胞増殖因子、 コラーゲンまたはポリ リジン由来のレ卜ロウィルス結合部位またはそれらと機能的な同等物とを 同一分子上に有する有する有効量の機能性物質、
( b ) レトロウィルスと標的細胞をィンキュベ一卜するための人工基質. および
( C ) 上記標的細胞を予備刺激するための標的細胞増殖因子、 を含んでなることを特徴とするキッ ト。
6 3 . 線維芽細胞増殖因子が、 配列表の配列番号 3で表される線維芽細 胞増殖因子、 該因子の機能的同等物、 および該因子または該因子の機能的 同等物を含有するポリベプチドから選択される線維芽細胞増殖因子である 請求項 6 2記載のキッ 卜。
6 4 . 機能性物質が、 配列表の配列番号 4または 5で表されるアミノ酸 配列を有するポリべプチドである請求項 6 2記載のキッ ト。
6 5 . コラーゲンが、 V型コラーゲン由来のインスリン結合部位を含有 するフラグメン卜、 該フラグメン卜の機能的同等物、 および該フラグメン トまたは該フラグメン卜の機能的同等物を含有するポリべプチドから選択 されるコラーゲンである請求項 6 2記載のキッ ト。
6 6 . V型コラーゲン由来のィンスリン結合部位を含有するフラグメン 卜が、 配列表の配列番号 6で表されるァミノ酸配列を有するフラグメ ン ト である請求項 6 5記載のキッ ト。
6 7 . 機能性物質が配列表の配列番号 7または 8で表されるァミノ酸配 列を有するポリべプチドである請求項 6 2記載のキッ ト。
6 8 . 機能性物質が固定化されている請求項 6 2〜6 7いずれか 1項記 載のキッ 卜。
6 9 . 機能性物質がビーズに固定化されている請求項 8または 4 6記載 の方法。
7 0 . 機能性物質がビーズに固定化されている請求項 1 6または 5 4記 載の培養培地。
7 1 . 機能性物質がビーズに固定化されている請求項 2 4、 3 4または 6 1記載の配置方法。
7 2 . 機能性物質がビーズに固定化されている請求項 3 2または 6 8記 載のキッ 卜。
7 3 . レ卜ロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる 方法において、 実質的に純粋なフイブロネクチン、 実質的に純粋なフイブ ロネクチンフラグメン卜およびそれらの混合物より選択される有効量のビ ーズに固定化された機能性物質の存在下で、 標的細胞をレトロウィルスで 感染させることを特徴とするレトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導 入効率を向上させる方法。
7 4 . レ卜ロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる 方法において、 実質的に純粋なフイブロネクチン、 実質的に純粋なフイブ ロネクチンフラグメントおよびはそれらの混合物より選択される有効量の 固定化されていない機能性物質の存在下で、 標的細胞をレトロウイルスで 感染させることを特徴とするレトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導 入効率を向上させる方法。
7 5 . 標的細胞が、 幹細胞 （stem cells) 、 造血細胞、 非接着性低密度 単核細胞、 接着性細胞、 骨髄細胞、 造血幹細胞、 末梢血幹細胞、 臍帯血液 細胞、 胎児性造血幹細胞、 胚形成幹細胞、 胚細胞、 プライモディアル ジャ ーム セル （primordial germ cell) 、 卵母細胞、 卵原細胞、 卵子、 精母 細胞、 精子、 C D 3 4 +細胞、 C— k i t +細胞、 多能性造血前駆細胞、 単能性造血前駆細胞、 赤血球系前駆細胞、 リンパ球母細胞、 成熟血球、 リ ンパ球、 B細胞、 T細胞、 線維芽細胞、 神経芽細胞、 神経細胞、 内皮細胞、 血管内皮細胞、 肝細胞、 筋芽細胞、 骨格筋細胞、 平滑筋細胞、 ガン細胞、 骨髄腫細胞及び白血病細胞から選択される細胞である請求項 1〜8、 3 5 〜4 7、 6 9、 7 3および 7 4いずれか 1項記戴の方法。
76. レ トロウィルス力く、 外来遺伝子を含有するレ トロウイルスである 請求項 1〜8、 17〜24、 33〜47、 55〜61、 69、 71および 73〜 75 t、ずれか 1項記載の方法。
77. レトロウィルス力く、 組換体レトロウィルスベクターである請求項 76記載の方法。
78. レトロウィルス力く、 複製能を欠損した組換え体レトロウィルスべ クタ一である請求項 76記載の方法。
79. 請求項 1〜8、 35-47 69および 73〜 78いずれか 1項 記載の方法で得られる遺伝子導入細胞。
80. 請求項 79記載の方法で得られる遺伝子導入細胞を脊椎動物に移 植する細胞移植方法。
81. 配列表の配列番号 13で表されるポリべプチドまたはその機能的 同等物。
82. 請求項 81記載のポリべプチドをコ一ドする遺伝子。
83. 配列表の配列番号 17で表される請求項 82記載の遺伝子または 厳密な条件下で該遺伝子にハイプリダイズし、 レトロウィルスによる標的 細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリべプチドをコ一ドする遺伝子。
84. 配列表の配列番号 30で表されるポリべプチドまたはその機能的 同等物。
85. 請求項 84記載のポリべプチドをコ一ドする遺伝子。
86. 配列表の配列番号 33で表される請求項 85記載の遺伝子または 厳密な条件下で該遺伝子にハイプリダイズし、 レトロウィルスによる標的 細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリべプチドをコ一ドする遺伝子。
87. 配列表の配列番号 5で表されるポリべプチドまたはその機能的同 等物。
8 8 . 請求項 8 7記載のポリぺプチドをコ一ドする遺伝子。
8 9 . 配列表の配列番号 2 6で表される請求項 8 8記載の遺伝子または 厳密な条件下で該遺伝子にハイプリダイズし、 レトロウィルスによる標的 細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリべプチドをコ一ドする遺伝子。
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