WO1998001578A1 - Bestimmung von analyten unter verwendung zweier markierungen - Google Patents

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WO1998001578A1
WO1998001578A1 PCT/EP1997/003480 EP9703480W WO9801578A1 WO 1998001578 A1 WO1998001578 A1 WO 1998001578A1 EP 9703480 W EP9703480 W EP 9703480W WO 9801578 A1 WO9801578 A1 WO 9801578A1
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analyte
groups
probes
sample
signal
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PCT/EP1997/003480
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ursula Giesen
Peter Wenzig
Günter Ziegler
Kurt Weindel
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
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Priority to AT97930488T priority patent/ATE221579T1/de
Priority to EP97930488A priority patent/EP0912765B1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining an analyte in a sample, a reagent kit for carrying out this method and the use of two differently labeled probes for the quantitative detection of analytes in a sample.
  • analytes in samples has become particularly important in healthcare.
  • Many analytes e.g. B. in body fluids, can be used as an indication of the presence of a disease or infection.
  • many of the analytes are not directly detectable themselves or are present in very small amounts in addition to large amounts of very similar components in the sample, so that direct detection is practically impossible in many cases.
  • detectable labeled probes Ideally, these probes only bind the analyte and label it via this binding.
  • marking groups include, for example, metals, colored compounds, fluorescent compounds, but also enzymes, electroluminescent groups and chemically activatable groups.
  • WO 92/14139 describes a device for carrying out a binding test for an analyte to be determined, which is based on electrochemiluminescence.
  • the analyte is determined via its binding to a probe marked with the aid of a metal complex and excitation by applying a voltage and detecting the light signal generated.
  • Calcium-activatable photoproteins have also been proposed as a labeling group, e.g. B. in EP 764 468.
  • the mechanism of light generation in these proteins is based on the fact that a solution containing the analyte labeled with the aid of an aequorin-labeled probe is added a solution containing calcium salt. This triggers the generation of an electromagnetic signal from the Aequorin.
  • nucleic acids are particularly valuable aids in diagnostics. For this very reason, however, special nucleic acid sequences are in very large deficits compared to very similar sequences.
  • PCR polymerase chain reaction
  • WO 93/10257 describes a method in which a PCR is first carried out and the reaction mixture is then incubated with two differently labeled probes.
  • WO 89/10552 describes an apparatus for the simultaneous measurement of two samples using different ECL-stimulable labels. Two measuring cells and two detectors are used, which generate and detect different wavelengths.
  • methods in which the excitation functions spatially and temporally separately in order to achieve sufficient dynamics and sensitivity have the disadvantage that the sample throughput is low and the sample volumes required are large.
  • DE-C-3022426 describes an immunoassay in which a chemiluminescent marker is excited to emit by applying a voltage and the oxidant generated thereby.
  • EP-0478-626 describes a detection group which is modified by different substances so that the detection groups resulting therefrom have a different kinetic behavior or a different spectrum.
  • the excitation is carried out simultaneously by the same trigger (oxidative).
  • the signals spectral or kinetic
  • overlap very strongly, so that reduced dynamics and reduced sensitivity result.
  • EP-0-199 804, US-5,238,808 and US-5,310,687 likewise describe a multiple marking concept in which the different labels are optically detected on the basis of their different spectral characteristics.
  • WO 93/01308 describes a method for the detection of an analyte by means of antibodies marked with acridinium ester and the generation of a chemiluminescence signal by oxidation at basic pH.
  • the invention therefore relates to a method for determining an analyte in a sample by likububation of the sample with at least two probes, at least one of which is specific for the analyte to be determined and wherein the at least two probes carry different labeling groups, generating a different electromagnetic signal for each different marker group and evaluation of the generated signals as a sign of the presence or amount of the analyte.
  • the invention also relates to a reagent kit for determining an analyte and the use of two probes, which can deliver a different electromagnetic signal, for the quantitative detection of analytes in a sample.
  • FIG. 2 shows the signal curve for a determination according to the invention at different analyte concentrations.
  • FIG. 3 shows a comparison between two methods according to the invention, in which the
  • FIG. 4 shows the structure of a linker molecule used to attach a label.
  • FIGS. 7 and 8 show the result of a competition experiment between two differently labeled probes for the same target.
  • An analyte in the sense of the invention is understood to mean all material which is to be the subject of the determination method.
  • ingredients of samples as are usually obtained in medical diagnostics, i. H. especially ingredients of body fluids.
  • These include in particular antigens, antibodies, cells or nucleic acids.
  • the nucleic acids can be nucleic acids which are suitable for an infection, e.g. B. viral or bacterial origin, are specific, e.g. B. viral or bacterial nucleic acids or the body's own nucleic acids, in which it is to be examined whether they have changed compared to the normal state, for. B. by mutation, deletion or insertion in one or more places.
  • Viral nucleic acids are, for example, ribonucleic acids from RNA viruses, e.g. B. HCV, HIV or HGV or genomic DNA or rRNA of bacteria, e.g. B. Chlamydia, Neisseries or Salmonella.
  • a sample in the sense of the invention is understood to mean, in particular, liquid samples in which the analyte to be determined is dissolved or suspended.
  • the sample is preferably a body fluid, e.g. Blood, urine or sputu or a liquid derived therefrom, e.g. B. serum, plasma, buffy coat or a liquid derived therefrom by performing one or more reaction steps. These reaction steps preferably take place with the addition of reagents and can have caused an enrichment, modification or increase of the analyte present in the original sample or the depletion of interfering constituents of the original sample.
  • a particularly preferred sample material are reaction mixtures, such as are usually present after performing sample preparation with subsequent PCR.
  • a probe in the sense of the invention means a component of a detection system for an analyte to be determined and / or a standard analyte.
  • Such components are, for example, those that or the standard analytes via biological interactions, e.g. immunological interactions or interactions through base pairings, between sequences of nucleobases which are sufficiently complementary for hybridization.
  • the probe is therefore preferably an antibody, an antigen, a hapten or a nucleic acid or a nucleic acid analog, which z. B. differs from natural nucleic acids in that the sugar phosphate backbone is replaced by a peptide backbone (z. B. according to WO 92/20702).
  • the method according to the invention uses at least two probes, at least one of which is specific for the analyte to be determined.
  • the probe is understood to be specific if, under the test conditions, it is less than 5% cross-reactive with others, e.g. B. not to be determined, sample components or components expected in the sample, d. H. such other ingredients less than 5% compared to the binding of the desired ingredient, e.g. B. the analyte binds.
  • At least one further probe is preferably not specific for the analyte to be determined.
  • This probe is preferably specific for a further constituent of the sample, in particular a constituent which differs only slightly, but to a defined degree, from the analyte to be determined.
  • This further component of the sample is preferably a standard analyte.
  • a standard analyte in the sense of the invention is understood to mean a material which is contained in the sample in a defined amount, preferably in a known amount, or has been added to it.
  • the standard analyte differs in a defined way from the analyte, e.g. B. in its ability to bind to the analyte-specific probe, which it preferably does not bind under the chosen test conditions essentially.
  • This standard analyte may already be present in the sample, but is preferably added to the sample before the sample is incubated with the probes.
  • the standard analyte is also a nucleic acid which differs from the analyte nucleic acid either in its nucleotide sequence or in its length.
  • an amplification method preferably a method for multiplying these sequences, e.g. B. with the aid of the polymerase chain reaction according to US-A-4,683,202.
  • primers are preferably used which are suitable both for the amplification of the analyte nucleic acid and of the standard nucleic acid. This method is generally referred to as competitive PCR and is described, for example, in US-A-5,213,961.
  • the nucleotide sequence of the first probe is selected such that it can hybridize with the analyte or the amplification product of the analyte partial sequence in a region which is not present in the standard nucleic acid
  • the second probe is chosen in its sequence so that it can only hybridize with the extension product of the primer if the extension product was formed by primer elongation using the standard nucleic acid as a template.
  • the probes are preferably oligonucleotides or peptide nucleic acids (PNA, WO 92/20702).
  • the second probe can either be chosen to be specific for the standard analyte or to bind both the standard analyte and the analyte.
  • the first case is highly preferred.
  • An essential feature of the invention is the fact that at least two of the probes carry different labeling groups.
  • two probes are used, each with a different label group.
  • one is specific to the analyte to be determined.
  • one or more of these probes can carry several identical labeling groups, e.g. B. a probe two identical marker groups. This can contribute to an increase in sensitivity.
  • B. a probe two identical marker groups.
  • each probe can have one or more identical labeling groups.
  • T should be avoided that a probe carries two different marker groups in the sense of the invention.
  • the probes are added to the sample in an amount and concentration that is suitable for sufficient binding of the probe to the analyte, the analytes or the standard analytes. Since in many cases the amount of analyte is not known, the probe is usually added in a stoichiometric excess compared to the maximum conceivable amount of analyte. This applies in particular if a quantitative evaluation of the method is intended.
  • the sample after amplification it is not necessary to divide the sample after amplification and add one of the probes to each part.
  • the probes are preferably incubated together with the sample, not separated. Therefore relatively small sample volumes are required
  • a label group in the sense of the invention is understood to mean groups which can be bound directly or indirectly to the probes.
  • the type of marker groups can be divided into two classes, namely those groups which themselves cannot deliver an electromagnetic signal sufficient for a determination and groups which themselves can deliver an electromagnetic signal. Marking groups of the last definition are also referred to below as detection groups. Groups which themselves cannot supply an electromagnetic signal sufficient for a determination are preferably all groups which are recognizable via biological interactions, as described above for the interaction of the probe with the analyte, e.g. B haptens, such as digoxigenin according to EP-B-O 324 474, or vitamins, e.g. B. Biotin. Digoxigenin can be recognized, for example, by an antibody against digoxigenin and biotin with the help of avidin, streptavidin or anti-biotin / antibodies.
  • conjugate of a component recognizing the named recognizable group is preferred in the method according to the invention.
  • This conjugate can be added to the incubation mixture of the sample with the probes at the beginning of the incubation, but it is preferred to add the conjugate after the probes have been incubated with the analyte, without separation or after separation of analyte-specific probe not bound to the analyte from the analyte-bound probe .
  • analyte-specific probe not bound to the analyte from the analyte-bound Separate a probe and other probes bound to sample components from the unbound probes.
  • This separation can advantageously be done by binding the products of the analyte or the further sample components or the standard analyte with the associated probes to one solid phase (e.g. a solid in the form of a bead) and the remaining liquid phase is separated from the solid phase.
  • the solid phase is preferably further preferred with the aid of a washing liquid v on physically adhering probes, but not specifically bound to the analyte or the other constituents
  • the binding of the analyte to the solid phase depends on the type of analyte to be determined. In this way, biological interactions (preferably of a different type and / or specificity than when the analyte or standard analyte is bound) can in turn be used for the binding.
  • the analyte is an antigen
  • the binding can take place via a solid phase, the surface of which is modified by binding an antibody against this antigen.
  • nucleic acids as analytes the binding can take place via probes which have a nucleotide sequence have that is complementary to a sequence of the analyte, the further sample components or the standard nucleic acid.
  • capture probe which is covalent or via biospecific interactions, e.g. B Biotin / streptavidin, to which the solid phase is bound or is chosen, is such that it is both complementary to a partial sequence of the analyte and also of the standard nucleic acid or further analyte nucleic acids. This is advantageous in that only one type of capture probe is required to capture both sample components. If the analyte is a cell, these cells can be immobilized by antibodies which are directed against surface antigens on these cells (eg CD3 for T cells).
  • the selection detection can be carried out with antibodies against subgroups (eg the T helper cells with CD4 with a first labeling group, the T-suppressor cells with CD8 and a second labeling group) 3
  • subgroups eg the T helper cells with CD4 with a first labeling group, the T-suppressor cells with CD8 and a second labeling group
  • an immobilizable group into copies produced during the nucleic acid amplification. This can be done by using immobilized labeled primers or immobilized labeled mononucleoside triphosphates.
  • biotin can be selected as the immobilizable group.
  • the amplificates obtained can then be captured on a streptavidin-coated surface.
  • an electromagnetic signal is now generated for each different marking or detection group.
  • the combination of groups which can be excited in different ways is particularly advantageous for the different probes.
  • the combination of a probe which can be excited electrically for luminescence (electrochemiluminescence, ECL) and a probe which can be chemically excited for luminescence (bioluminescence) is advantageous.
  • ECL electroly for luminescence
  • bioluminescence bioluminescence
  • the selective, ie, targeted excitation of the signal formation has the effect, for example, that cross excitation, ie co-excitation even of the marking group that is not currently to be detected, can be greatly reduced or even avoided. This results in a large dynamic measuring range and relatively low background signals (high sensitivity) for the overall process.
  • a first group of labeling groups is characterized in that the signal is generated by contacting the labeling group with certain (e.g. chemical) reagents.
  • a preferred group of detection groups are groups that can be excited for bioluminescence, e.g. B. allosterically triggerable groups.
  • the detection groups of different probes preferably belong to different classes of substances (e.g. a low-molecular organic metal complex and a protein).
  • Labeling groups include, for example, the ion-activatable photoproteins (apo-photoproteins, produced natively or preferably recombinantly).
  • photoproteins include, for example, aequorin, obelin, mitrocomin, thalassicolin and clytin. These proteins have the property that they emit a light signal when activated so that their amount or presence can be determined by measuring the light measurement.
  • the use of such photoproteins in conventional tests and the mechanism that leads to signal formation is described, for example, in Cormier, ML et al., Photochem & Photobiol. 49/4, 509-512 (1989) or Smith, DF et al., In "Bioiuminescence and Chemiluminescence: Current Status (P. Stanley & L. Kricka, eds.), John Wiley and Sons, Chichester, UK 1991, 529-532. In this case the activation takes place by adding calcium ions to the labeled, bound probes.
  • Adequate direct chemiluminescent labels with a lightning-like signal profile are e.g. B. also acridinium aryl esters, acridinium acyl sulfonamides or isoluminol derivatives such as ABEI, AEEI and AHEI.
  • marker groups are metal complexes which can be excited for electrochemical luminescence. Such complexes are described, for example, in EP-A-0 199 804, EP-A-0 265 519, WO 89/04302 and WO 92/14139. These are preferably ruthenium complexes which have bipyridyl units as ligands. Nucleic acid probes which are labeled with special ruthenium complexes are also described, for example, in EP-A-0 340 605. Immunological probes which can be used particularly well and which are labeled with ruthenium complexes are described, for example, in EP-A-0 178 450. In addition to ruthenium complexes, other appropriately triggerable transition metals (osmium, iridium, etc.) or other heterocyclic aromatic complex ligands suitable for electrochemiluminescence can also be used.
  • transition metals osmium, iridium, etc.
  • the detection groups are stimulated to form a detectable signal which can be attributed to the group.
  • This signal is preferably a luminescence signal.
  • Luminescence is usually understood to mean a process in which a chemically excited, metastable molecular state changes into a low-energy state with the emission of a photon (electromagnetic radiation)
  • independent generation of a signal is understood to mean actions by which a specific marker group is selectively excited without marker groups being excited on probes different therefrom.
  • an electromagnetic signal is preferably understood to mean a light signal. Flashes of light are particularly preferred.
  • the different electromagnetic signals can be generated both simultaneously and in succession. This depends in particular on whether the signals are so different that they can also be specifically detected at the same time. However, it has proven to be expedient to generate and detect the different electromagnetic signals one after the other. It is therefore preferred to select marker groups that can be selectively activated, e.g. B. a first group by chemical and / or allostene triggering and the second by electrochemical triggering. This has the particular advantage that the reaction conditions that may be required for signal generation do not have to be set in the same solution. In the event that the first type of label group is an ion-activatable photoprotein and the second label group is a metal complex that can be excited by electrochemiluminescence, it is possible to determine the two signals simultaneously or in succession. Simultaneous measurement is possible when using marking groups with different emission wavelengths. The module used for light detection must have a spectroscopic separation of the signals, e.g. B. allow by choosing suitable filters, prisms or gratings.
  • the conditions for generating the photoprotein signal it is possible to first set the conditions for generating the photoprotein signal, but preferably to first set the conditions for generating electrochemiluminescence.
  • a solution of potassium phosphate, tripropylamine and Thesit TM is brought into contact with the analytes bound to the solid phase, standard analytes and, if appropriate, other constituents to be determined, to which the probes are bound . This can either be done by pipetting the solution into the solid phase, but it is also possible to add the solid phase to a solution of the reagents or to let the solution flow past the solid phase.
  • the electrochemiluminescence is now generated by applying a voltage.
  • the flash of light generated is used as a signal with the aid of a suitable instrument, e.g. B. using a photomultiplier, converted into a measured value.
  • a suitable instrument e.g. B. using a photomultiplier
  • the electrical signal generation does not interfere with the activity of the photoproteins.
  • reaction conditions are set as required for the generation of a signal based on the presence of the photoprotein.
  • the appropriate reagents can be added to the solution already present or to a corresponding washing solution or to the solid phase.
  • the reagent solution required for generating the electrochemiluminescence is replaced by the reagent solution for the activation of the photoprotein.
  • the contacting of the photoprotein with the activating ion also produces a light signal, the intensity of which can be determined instrumentally and converted into a measured value.
  • the signals are preferably and advantageously flash signals. This means that excitation and measurement of the signal can take place very quickly. As a result, the total measurement time for two detection reactions is not significantly longer (> 2.5 x) than that for one of the two individual measurements (e.g. electrochemiluminescence: 4 seconds, electrochemiluminescence with subsequent bioluminescence with aequorin: 5 seconds). This enables a maximum increase in throughput, especially on an analyzer, since the principle of the dual marking detection is not diminished by a significant widening of the measurement time window.
  • the signals generated by different detection groups are preferably measured using the same measuring arrangement, e.g. B. in the same measuring cell.
  • the measuring cell is preferably selected in such a way that no changes in the detected wavelengths are required for both detection groups.
  • the measuring cell is preferably a measuring cell designed for the electrochemical triggering of a detection group. The preferably downstream detection based on a different substance class as the detection group does not use the electrical arrangement of the ECL measuring cell to excite the luminescence, but only for detection.
  • the sequential sequence of the determination of the different detection groups makes it possible that the groups do not have to have different kinetic characteristics or have to differ in their spectral behavior.
  • the ruthenium complex can be replaced by a fluorophore, which, like aequorin, emits in a blue-green area.
  • the evaluation of the signals or the measured values for these signals now depends on the intended statement of the determination method. In any case, however, the presence of a measured value which differs from a measured value of a comparative measurement in which no probe or no analyte was present is an indication of the presence of the analyte. The same applies to the measured value for the other constituents or a standard analyte. This can be used to obtain a qualitative statement about the presence of the analyte or other analytes. The result of the measurement for the standard analyte can be used in a qualitative measurement for the calibration of the system and as a positive control.
  • Binding of the analyte and, if appropriate, a further analyte or standard analyte to a solid phase e.g. a magnetic particle
  • a quantitative determination means the determination of the amount of an analyte in the sample and thus also the determination of the amount of analyte in a primary sample used for the preparation of the sample.
  • the quantitative determination preferably uses at least one probe which is specific for the analyte to be determined. If several analytes are to be determined, additional probes / labeling groups are required.
  • a probe is used which is specific for the standard analyte. Since the amount of standard analyte is defined and known, the measured value for the standard analyte can be used to calibrate the measured value for the analyte.
  • the calibration of the system can e.g. B. can be carried out as follows:
  • solutions e.g. B. 5, with different but known concentrations of analyte nucleic acid, are mixed with the same known amount of standard nucleic acids (z. B. 1000 copies).
  • Solutions with the at least 2 probes e.g. ruthenium labeling on the analyte probe, aequorin labeling on the standard probe
  • the measurement signals for the known concentrations of analyte and standard are determined. From this, a calibration curve is created by taking the signal ratio of the measurements for analyte to Standard is applied depending on the known analyte concentration used.
  • the same concentration of standard nucleic acids as in the preparation of the calibration curve (e.g. 1000 copies) is added to the sample with the unknown analyte concentration and the corresponding measurement signals for the analyte and the standard are determined.
  • the signal ratio of analyte to standard is calculated and the analyte concentration is read from the calibration curve.
  • the ratio formation from 2 or more signals generated together is a simple way to compensate for any fluctuations that may occur in the signal generation.
  • any fluctuations in the amplification reaction of the different probes for the analyte or standard are corrected.
  • Such fluctuations affect e.g. B. variable efficiency factors from sample to sample, or for one and the same sample from cycle to cycle and stem from, among other things, fluctuations in the quality of the sample preparation (e.g. degree of purification, separation of inhibitors) by internal, co-amplified standard and ratiometric evaluation, such fluctuations are calculated for each reaction batch.
  • this signal ratio can be determined in advance by the manufacturer of the device or the reagents and implemented in the evaluation software for evaluation using a correction factor or correction function. The customer then only needs to create a calibration curve from different concentrations of analyte nucleic acid.
  • FIG. 1 shows the schematic structure of a device for carrying out the method according to the invention.
  • a suitable device that simply meets the requirements can be adapted to the described method is available from Boehringer Mannheim GmbH (Elecsys 2010 or 1010).
  • the device is available for re-recording a sample to be measured (step 1).
  • the method is suitable for carrying out quantitative determinations of analytes.
  • the amount of sample liquid required is reduced, if necessary halved.
  • only a single device is required for the detection and evaluation.
  • the temporal separation of the signals is made possible by independent excitation. This enables a large dynamic range and high sensitivity.
  • FIG. 2 shows the signal curve of an exemplary determination of two detection groups (ruthenium complex and aequorin) which takes place in succession. It can be seen that the signal intensities are of the same order of magnitude, i. H. Surprisingly, a sufficient signal yield can also be achieved for aequorin labels in devices actually intended for determining electrochemiluminescence.
  • the curves 1 to 7 mean:
  • FIG. 3 shows the course of the signal intensities (with the same concentration ratios) during a measurement time in seconds for a first case in which the aequorin label of MDP (mono-biotin-mono-digoxigenin hepta peptide, obtainable from the enzyme test) is first ® DNA Detection, Boehringer Mannheim GmbH, FRG, order no. 1447777) and then the ECL signal of oligonucleotide 1 (SEQ.ID.NO. 1) is measured (curve 1) and a second case in which the ECL Signal and then the Aequorinsignal is measured (curve 2).
  • MDP mono-biotin-mono-digoxigenin hepta peptide, obtainable from the enzyme test
  • the intensity of the aequorin signal before the ECL measurement differs only insignificantly from the intensity of the signal after the ECL measurement.
  • the trigger voltage for the ECL measurement is beyond the decomposition voltage of water, ie the water oxidation is in full swing during the ECL process, large quantities of oxygen are generated at the anode (where the equorin is located).
  • the environment of the protein becomes so significantly disturbed. Surprisingly, this does not affect the Signa level caused by the protein. It must also be ensured that residues of the reaction solutions for the previous determination no longer remain in the measuring cell to a disruptive extent.
  • the invention also relates to a reagent kit for determining an analyte containing two or more probes in one or separate containers, at least one of which is specific for the analyte to be determined, the at least two probes carrying different labeling groups which can deliver different electromagnetic signals.
  • the specificity of the further probes can be found in the above description of the method according to the invention.
  • the reagent kit preferably contains a container with a / 9
  • the reagent kit can also contain other reagents that are required to determine the labeling groups.
  • reagents for the pretreatment of samples for the preparation of an analyte-containing solution suitable for the determination can also be contained. These are preferably contained in separate containers. Suitable reagents are, for example, primers, enzyme and mononucleoside triphosphates for carrying out a competitive PCR.
  • Other possible components of the reagent kit are a suspension of magnetic particles to which the analyte can be bound.
  • Another object of the invention is the use of two probes, which can deliver different electromagnetic signals, for the quantitative detection of analytes in a sample.
  • a 200 ⁇ l buffer solution was prepared, the biotinylated aequorin (in the concentrations 1 pM to 10 nm) and that at the 5 'end with Bio-Link I (company Applied Biosystems Inc., Biotin Amidite, order no. No. 401395) biotinylated and at the 3 'end via AM III (incorporation during oligonucleotide synthesis on CPG (Controlled Pore Glass) and removal of the protective group Fmoc, FIG. 4) by means of BPRu (produced according to Clin. Chem. 37/9, 1534 - 1539 (1991)) contains labeled oligonucleotide I (SEQ.ID.NO.
  • ECL electrochemiluminescence
  • a trigger solution with the composition 10 mM Tris / HCl, pH 7.4, 100 mM calcium chloride is sucked into the measuring cell and the resulting signal is measured.
  • the measured signal is shown on the right branch of the curves in FIG. 2. It can be seen that the signal of the aequorin measurements depends on the concentration of the aequorin-labeled compounds.
  • the real situation of a dual label assay using an internal standard is such that an internal standard nucleic acid of known concentration has to be detected in the presence of an analyte nucleic acid of unknown concentration.
  • the potential concentration range of the analyte nucleic acid extends over several orders of magnitude
  • the standard signal must remain constant regardless of the concentration of the sample and that the analyte signal varies linearly with the sample concentration, regardless of the concentration of the standard nucleic acid which is also present
  • the capture probes are biotinylated 40-mer (20-mer (or 19-mer) (non-chlamydia-specific) spacer sequence + 20-mer (or 21-mer) hybridization sequence). Both hybridization sequences originate from the Chlamydia trachomatis genome Hybridization zone the sequence 5'-CA GAG TTC TAT AGT GCT ATG-3 '(SEQ ID NO 2) The associated indicator probe 5'CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG-3' (SEQ.ID.NO.
  • GCT ATG-3 '(SEQ.ID.NO. 5) is coupled to Ru (bipy) 3 via NHS chemistry.
  • Chlamydia targets is kept constant at 0. InM, while the concentration of the other is serially at 1 * 10 "9 , 1 * 10 * 10 , l * 10 " u , 1 * 10 * 12 M is diluted.
  • concentration of the two indicator probes is constant (10nM).
  • the hybrids formed at 37 ° C. are immobilized on streptavidin-coated ECL beads (720 ⁇ g / ml from Elecsys® TSH) and then measured using the dual label cycle as described in Example 1.
  • a competitive test with dual label detection as a model assay takes place with regard to quantitative PCR (qPCR) via co-amplification of an internal standard, whereby a label (a label) is definitely assigned to a polynucleotide to be amplified.
  • the indicator probes represent the amount of detectable PCR product, which is variable due to competition for primer binding, based on analyte DNA or internal standard DNA (hybridization rate as a function of the respective number of starting copies).
  • SA streptavidin
  • a complementary 20-mer indicator probe in its base sequence (5'-CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG-3 '(SEQ.ID.NO.
  • the ECL-labeled indicator probe is kept constant at 0.4 nmol / 1
  • the aequorin-labeled probe varies in the range 0.1 - 10 nmol 1
  • the aequorin probe concentration is set at 1 nmol / 1
  • the ECL probe concentration is varied in the range 0.4 - 40 nmol / 1.
  • 0.8 nmol / l, ie 0.8 nmol / l Ru 2+ ( bipy) 3- labeled probe are equi-efficient to 1.0 nmol / I aequorin-labeled probe, which reflects the expected molar mass effect (Aequorin: 22000 Da, Ru 2+ (bi ⁇ y) 3 ⁇ 1000 Da).
  • aequorin-labeled probe is varied, an intersection at about 2 nmol / l is obtained, ie 2 nmol l are equi-efficient with 0.4 nmol / l Ru 2+ (bipy) 3-labeled probe.
  • a raw sample is prepared so that the nucleic acid is available in an accessible form (e.g. lysis of cells etc.).
  • the nucleic acids can be amplified according to EP-B-0 201 184 (polymerase chain reaction).
  • EP 0 420 260 biotin is incorporated using labeled primers.
  • probes are added, one of which contains a ruthenium label (preferably the analyte-specific probe) and the other contains an aequorin label (preferably the standard-specific probe).
  • the probes are dissolved in a hybridization solution with the composition phosphate buffer, pH 6.5, sodium chloride and bovine albumin. 200 ⁇ l of this hybridization solution are added to the previously generated reaction mixture. The reaction mixture was incubated at 37 ° C for 20 minutes.

Abstract

Die Kombination zweier Detektionsmechanismen in einem einzigen Gerät ergibt Verfahren, die eine einfache Quantifizierung von Analytbestimmungen erlaubt. Geeignete Formate und Reagenzkits werden vorgeschlagen.

Description

Bestimmung von Analyten unter Verwendung zweier Markierungen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, ein Reagenzkit zur Ausfuhrung dieses Verfahrens und die Verwendung zweier unterschiedlich markierter Sonden zum quantitativen Nachweis von Analyten in einer Probe.
Der Nachweis von Analyten in Proben hat insbesondere im Gesundheitswesen eine erhebliche Bedeutung erlangt. Viele Analyten, z. B. in Körperflüssigkeiten, können als Indiz für das Vorliegen einer Erkrankung oder Infektion verwendet werden. Viele der Analyten sind jedoch selbst nicht direkt nachweisbar oder sind in sehr geringen Mengen neben großen Mengen ganz ähnlicher Komponenten in der Probe enthalten, so daß ein direkter Nachweis in vielen Fällen praktisch unmöglich ist. Aus diesem Grund wird immer öfter versucht, die zu bestimmenden Analyten mit Hilfe nachweisbar markierter Sonden spezifisch nachweisbar zu machen. Diese Sonden binden im Idealfall nur den Analyten und markieren ihn über diese Bindung. Mittlerweile stehen eine Vielzahl von Markierungsgruppen zur Verfugung. Dazu gehören beispielsweise Metalle, farbige Verbindungen, fluoreszierende Verbindungen, aber auch Enzyme, Elek- trolumineszenzgruppen und chemisch aktivierbare Gruppen.
In WO 92/14139 ist beispielsweise ein Gerät zur Durchf hrung eines Bindetests für einen zu bestimmenden Analyten beschrieben, welches auf Elektrochemilumineszenz beruht. Hierbei wird der Analyt über seine Bindung an eine mit Hilfe eines Metallkomplexes markierte Sonde und Anregung durch Anlegen einer Spannung sowie Detektion des erzeugten Lichtsignales bestimmt.
Ebenfalls als Markierungsgruppe wurden kalziumaktivierbare Photoproteine vorgeschlagen, z. B. in EP 764 468. Der Mechanismus der Lichterzeugung beruht bei diesen Proteinen darauf, daß eine Lösung, welche den über einen mit Hilfe einer aequorinmarkierten Sonde markierten Analyten enthält, eine kalziumsalzhaltige Lösung zugegeben wird. Hierdurch wird die Erzeugung eines elektromagnetischen Signals aus dem Aequorin getriggert. Nukleinsäuren sind aufgrund ihrer in der Basensequenz gespeicherten Information besonders wertvolle Hilfsmittel in der Diagnostik. Spezielle Nukleinsäuresequenzen liegen jedoch gerade deshalb in sehr großem Unterschuß gegenüber ganz ähnlichen Sequenzen vor. Es hat sich daher als vorteilhaft erwiesen, die nachzuweisenden Nukleinsäuren vor ihrem Nachweis spezifisch zu an-plifizieren, d. h. eine Vielzahl von Kopien einer bestimmten Sequenz herzustellen. Ein solches Verfahren stellt die Polymerasekettenreaktion (PCR) dar (US-A-4,683,202). Gerade bei dieser Ampüfikationsreaktion hat es sich jedoch erwiesen, daß ein quantitativer Nachweis von Nukleinsäuren nicht oder nur unter sehr günstigen Bedingungen möglich ist, da die Ampli- fikationseffizienz sehr stark von unterschiedlichsten Faktoren beeinflußt wird. Es wurde daher vorgeschlagen, den analythaltigen Proben vor der Amplifikation einen Standardanalyten in bekannter Menge zuzusetzen, der sich in einer detektierbaren Eigenschaft von dem zu bestimmenden Analyten unterscheidet, sich jedoch in Bezug auf die Amplifikationseffizienz ähnlich verhält wie der Anaiyt. Eine solche Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines internen Standards ist beispielsweise beschrieben in US-A-5,213,961 oder US-A-5, 219,727. Ähnliche Verfahren sind beschrieben in WO 92/01812, WO 94/04706, EP-A-0 525 882, WO 95/02067 und WO 94/09156. In letztgenannter Patentanmeldung wird ein Verfahren beschrieben, bei dem in der PCR immobilisierbare Primer eingesetzt werden und die Menge an Ampli- fikaten über Sonden nachgewiesen wird.
In WO 93/10257 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem zunächst eine PCR durchgeführt und die Reaktionsmischung anschließend mit zwei unterschiedlich markierten Sonden inkubiert wird.
In WO 89/10552 ist ein Apparat zur simultanen Messung zweier Proben mittels verschiedener ECL-anregbarer Label beschrieben. Es werden zwei Messzellen und zwei Detektoren verwendet, die unterschiedliche Wellenlängen generieren und detektieren. Verfahren, bei denen die Anregung räumlich und zeitlich getrennt funktioniert, um eine ausreichende Dynamik und Sensitivität zu erzielen, haben jedoch den Nachteil, daß der Probendurchsatz gering und die benötigten Probenvolumina groß sind.
In DE-C-3022426 ist ein Immunoassay beschrieben, bei dem ein Chemilumineszenzmarker durch Anlegen einer Spannung und dadurch erzeugtes Oxidans zur Emission angeregt wird.
In EP-0478-626 wird eine Detektionsgruppe beschrieben, die durch unterschiedliche Substanzen so modifiziert wird, daß die daraus resultierenden Detektionsgruppen ein unterschied- liches kinetisches Verhalten oder ein unterschiedliches Spektrum aufweisen. Die Anregung erfolgt gleichzeitig durch denselben Trigger (oxidativ). Die Signale (spektral oder kinetisch) überlappen sich jedoch in der Praxis sehr stark, so daß eine verringerte Dynamik und eine erniedrigte Sensitivität resultiert.
In EP-0-199 804, US-5,238,808 und US-5,310,687 ist ebenfalls ein Mehrfach-Markierungs- konzept beschrieben, bei dem die unterschiedlichen Label optisch aufgrund ihrer unterschiedlichen spektralen Charakteristika delektiert werden.
In WO 93/01308 ist ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten mittels Acridiniumester-mar- kierter Antikörper und Erzeugung eines Chemilumineszenzsignals durch Oxidation bei basischem pH-Wert beschrieben.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung war es daher, den Stand der Technik teilweise oder vollständig zu verbessern und insbesondere Verfahren bereitzustellen, bei denen der Nachteil der bei gleichzeitiger Fluoreszenzanregung nicht oder schlecht zu trennenden Signale bei gleichzeitig erhöhtem Durchsatz gegenüber getrennt nacheinander geführten Nachweisreaktionen vermieden wird.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch Likubation der Probe mit mindestens zwei Sonden, von denen mindestens eine für den zu bestimmenden Analyten spezifisch ist und wobei die mindestens zwei Sonden unterschiedliche Markierungsgruppen tragen, Erzeugung jeweils eines unterschiedlichen elektromagnetischen Signals für jede unterschiedliche Markierungsgruppe und Auswertung der erzeugten Signale als Zeichen für die Anwesenheit oder Menge des Analyten. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Bestimmung eines Analyten und die Verwendung zweier Sonden, die ein unterschiedliches elektromagnetisches Signal liefern können, zum quantitativen Nachweis von Analyten in einer Probe.
In Figur 1 ist der schematische Aufbau eines Gerätes zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gezeigt.
In Figur 2 ist der Signalverlauf für eine erfindungsgemäße Bestimmung bei unterschiedlichen Analytkonzentrationen gezeigt. «/ In Figur 3 ist ein Vergleich zwischen zwei erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt, bei denen die
Detektionsreaktionen seitlich vertauscht wurden.
In Figur 4 ist die Struktur eines für die Anknüpfung eines Labels verwendeten Linkermoleküls gezeigt.
In Figur 5 und 6 ist gezeigt, daß die Bestimmungen völlig unabhängig voneinander ablaufen.
In Figur 7 und 8 ist das Ergebnis eines Kompetitionsversuches zweier unterschiedlich markierter Sonden um dasselbe Target gezeigt.
Unter einem Analyt im Sinne der Erfindung wird alles Material verstanden, welches Gegenstand des Bestimπ-ungsverfahrens sein soll. Es handelt sich bevorzugt um Inhaltsstoffe von Proben, wie sie üblicherweise in der medizinischen Diagnostik anfallen, d. h. insbesondere Inhaltsstoffe von Körperflüssigkeiten. Hierzu gehören insbesondere Antigene, Antikörper, Zellen oder Nukleinsäuren. Bei den Nukleinsäuren kann es sich um Nukleinsäuren handeln, die für eine Infektion, z. B. viralen oder baktierellen Ursprungs, spezifisch sind, z. B. virale oder bakterielle Nukleinsäuren oder körpereigene Nukleinsäuren, bei denen untersucht werden soll, ob sie sich gegenüber dem normalen Zustand verändert haben, z. B. durch Mutation, Deletion oder Insertion in einer oder mehreren Stellen. Virale Nukleinsäuren sind beispielsweise Ribonukleinsäuren von RNA- Viren, z. B. HCV, HIV oder HGV oder genomische DNA oder rRNA von Bakterien, z. B. Chlamydien, Neisserien oder Salmonellen.
Unter einer Probe im Sinne der Erfindung werden insbesondere flüssige Proben verstanden, in denen der zu bestimmende Analyt gelöst oder suspendiert ist. Bevorzugt ist die Probe eine Körperflüssigkeit, z. B. Blut, Urin oder Sputu oder eine davon abgeleitete Flüssigkeit, z. B. Serum, Plasma, Buffy-Coat oder eine Flüssigkeit, die unter Durchführung eines oder mehrerer Reaktionsschritte davon abgeleitet wurde. Diese Reaktionsschritte finden bevorzugt unter Zugabe von Reagenzien statt und können eine Anreicherung, Modifizierung oder Vermehrung des in der ursprünglichen Probe vorhandenen Analyten oder die Abreicherung störender Bestandteile der ursprünglichen Probe bewirkt haben. Ein besonders bevorzugtes Probenmaterial sind Reaktionsmischungen, wie sie üblicherweise nach Durchführung einer Probenvorbereitung mit anschließender PCR vorliegen. Unter einer Sonde im Sinne der Erfindung wird eine Komponente eines Nachweissystemes für einen zu bestimmenden Analyten oder/und einen Standardanalyten verstanden. Solche Komponenten sind beispielsweise solche, die den Analy- ten oder den Standardanalyten über biologische r Wechselwirkungen, z B. immunologische Wechselwirkungen oder Wechselwirkungen durch Basenpaarungen, zwischen für eine Hybridisierung ausreichend komplementären Sequenzen von Nukleobasen, erkennen. Bei der Sonde handelt es sich daher bevorzugt um einen Antikörper, ein Antigen, ein Hapten oder eine Nukl einsäure oder ein Nukleinsäureanaloges, welches sich z. B. dadurch von natürlichen Nukleinsäuren unterscheidet, daß das Zuckerphosphatgrundgerüst durch ein Peptidgrundgerüst ersetzt ist (z. B. gemäß WO 92/20702).
Das erfindungsgemäße Verfahren benutzt mindestens zwei Sonden, von denen mindestens eine für den zu bestimmenden Analyten spezifisch ist. Als spezifisch wird die Sonde verstanden, wenn sie unter den Testbedingungen weniger als 5 % Kreuzreaktivität mit anderen, z. B. nicht zu bestimmenden, Probenbestandteilen oder in der Probe zu erwartenden Bestandteilen aufweist, d. h. solche andere Bestandteile zu weniger als 5 % verglichen mit der Bindung des gewünschten Bestandteiles, z. B. des Analyten, bindet.
Bevorzugt ist mindestens eine weitere Sonde nicht für den zu bestimmenden Analyten spezifisch. Bevorzugt ist diese Sonde spezifisch für einen weiteren Inhaltsstoffder Probe, insbesondere einen Bestandteil, der sich in seiner Struktur nur geringfügig, jedoch in definiertem Maß von dem zu bestimmenden Analyten unterscheidet. Bevorzugt ist dieser weitere Bestandteil der Probe ein Standardanalyt.
Unter einem Standardanalyten im Sinne der Erfindung ist ein Material zu verstehen, welches in der Probe in einer definierten Menge, bevorzugt einer bekannten Menge, enthalten ist oder ihr zugesetzt wurde. Der Standardanalyt unterscheidet sich auf definierte Weise von dem Analyten, z. B. in seiner Bindefähigkeit zu der analytspezifischen Sonde, die er unter den gewählten Testbedingungen bevorzugt im wesentlichen nicht bindet. Dieser Standardanalyt kann bereits ursprünglich in der Probe enthalten sein, bevorzugt wird er der Probe jedoch vor Inkubation der Probe mit den Sonden zugegeben. Für den Fall einer Bestimmung einer spezifischen Nukleinsäure in einer Probe ist es bevorzugt, daß der Standardanalyt ebenfalls eine Nuklein- säure ist, die sich von der Analytnukleinsäure entweder in ihrer Nukleotidsequenz oder ihrer Länge unterscheidet. Besonders bevorzugt wird zur Herstellung einer Standardnukl einsäure nach rekombinanten Technologien ein Teilstück einer Nukleinsäure mit der Analytsequenz entfernt und hierfür ein Stück einer anderen, bevorzugt nicht im Analyten enthaltenen, Sequenz eingefügt. Für diesen Fall ist es nicht erforderlich, daß sich die Analytnukleinsäure in ihrer Länge in größerem Umfang von der Standardnukleinsäure unterscheidet. Bevorzugt wird so- C wohl ein Teil der Analytnukleinsäure als auch ein Teil der Standardnukleinsäure einem Ampli- fikationsverfahren, bevorzugt einem Verfahren zur Vermehrung dieser Sequenzen, z. B. mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion nach US-A-4,683,202, unterzogen. Hierfür werden bevorzugt Primer eingesetzt, welche sowohl zur A plifikation der Analytnukleinsäure als auch der Standardnukleinsäure geeignet sind. Dieses Verfahren wird im allgemeinen als kompetitive PCR bezeichnet und ist beispielsweise in US-A-5,213,961 beschrieben.
Für den oben genannten Fall einer Standardnukleinsäure wird die Nukleotidsequenz der ersten Sonde (Analytsonde) so gewählt, daß sie mit dem Analyten oder dem Arnplifikationsprodukt der Analytteilsequenz in einem Bereich hybridisieren kann, der in der Standardnukleinsäure nicht vorhanden ist, während die zweite Sonde (Standardsonde) in ihrer Sequenz so gewählt wird, daß sie mit dem Verlängerungsprodukt der Primer nur dann hybridisieren kann, wenn das Veriängerungsprodukt durch Primerelongation unter Verwendung der Standardnukleinsäure als Matrize gebildet wurde. Bevorzugt handelt es sich bei den Sonden um Oligonukleotide oder Peptidnukleinsäuren (PNA, WO 92/20702). Wenn die erste Sonde analytspezifisch ist und den Standardanalyten im wesentlichen nicht bindet, kann die zweite Sonde entweder so gewählt werden, daß sie für den Standardanalyten spezifisch ist, oder daß sich sowohl den Standardanalyten als auch den Analyten bindet. Der erste Fall ist stark bevorzugt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es jedoch prinzipiell auch möglich, zwei oder mehr Sonden einzusetzen, die spezifisch für entsprechend viele unterschiedliche, zu bestimmende Analyten sind. Auch hier ergeben sich einige der erfindungsgemäßen Vorteile.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist die Tatsache, daß mindestens zwei der Sonden unterschiedliche Markierungsgruppen tragen. Im einfachsten Falle werden zwei Sonden eingesetzt, von denen jede eine unterschiedliche Markierungsgruppe trägt. Von diesen zwei Sonden ist eine spezifisch für den zu bestimmenden Analyten. In weiteren Fällen kann eine oder mehrere dieser Sonden mehrere identische Markierungsgruppen tragen, z. B. eine Sonde zwei gleiche Markierungsgruppen. Dies kann zu einer Erhöhung der Sensitivität beitragen. Es ist jedoch auch möglich, z. B. für die Bestimmung mehrerer Analyten mehr als zwei Sonden einzusetzen, welche dann mehr als zwei unterschiedliche Markierungsgruppen tragen. Auch hier kann jede Sonde ein oder mehrere gleiche Markierungsgruppen aufweisen. Vermieden werden sollte der Fall, daß eine Sonde zwei unterschiedliche Markierungsgruppen im Sinne der Erfindung trägt. T
Die Sonden werden der Probe in einer Menge und Konzentration zugesetzt, die für eine ausreichende Bindung der Sonde an den Analyten, die Analyten oder den Standardanalyten geeignet ist. Da in vielen Fällen die Menge an Analyt nicht bekannt ist, wird die Sonde üblicherweise in einem stόchiometrischen Überschuß gegenüber der maximal denkbaren Menge an Analyt zugegeben Dies gilt insbesondere, wenn eine quantitative Auswertung des Verfahrens beabsichtigt ist.
Hierzu ist es erfindungsgemaß nicht erforderlich, die Probe, nach Amplifikation, zu teilen und jedem Teil eine der Sonden zuzugeben. Bevorzugt werden die Sonden zusammen mit der Probe inkubiert, nicht getrennt. Daher sind relativ geringe Probenvolumina erforderlich
Unter einer Markierungsgruppe im Sinne der Erfindung werden Gruppen verstanden, die direkt oder indirekt an die Sonden gebunden sein können. Darüber hinaus können die Markierungsgruppen ihrer Art nach in zwei Klassen eingeteilt werden, nämlich solche Gruppen, die selbst kein für eine Bestimmung ausreichendes elektromagnetisches Signal liefern können und Gruppen, die selbst ein elektromagnetisches Signal liefern können. Markierungsgruppen der letzten Definition werden im Folgenden auch als Detektionsgruppen bezeichnet. Gruppen, die selbst kein für eine Bestimmung ausreichendes elektromagnetisches Signal liefern können, sind bevorzugt alle über biologische Wechselwirkungen, wie sie oben für die Wechselwirkung der Sonde mit dem Analyt beschrieben sind, erkennbare Gruppen, z. B Haptene, wie Digoxigenin gemäß EP-B-O 324 474, oder Vitamine, z. B. Biotin. Digoxigenin kann beispielsweise durch einen Antikörper gegen Digoxigenin und Biotin mit Hilfe von Avidin, Streptavidin oder Anti- biotin/Antikorpem erkannt werden.
Für den Fall der indirekten Markierung ist im erfindungsgemäßen Verfahren die Verwendung eines Konjugates aus einer die genannte erkennbare Gruppe erkennenden Komponente (Antikörper, Avidin etc.) und einer Gruppe, die ein elektromagnetisches Signal liefern kann (Detektionsgruppe), bevorzugt. Dieses Konjugat kann der Inkubationsmischung der Probe mit den Sonden bereits zu Anfang der Inkubation zugegeben werden, bevorzugt ist jedoch die Zugabe des Konjugates nach erfolgter Inkubation der Sonden mit dem Analyten, ohne Abtrennung oder nach Abtrennung nicht an den Analyten gebundener analytspezifischer Sonde von der analytgebundenen Sonde.
Des weiteren hat es sich als höchst empfehlenswert erwiesen, nach Inkubation der Probe mit den Sonden nicht an den Analyten gebundene analytspezifische Sonde von der analytgebunde- e nen Sonde sowie weitere an Probenbestandteile gebundene Sonden von den nicht gebundenen Sonden abzutrennen Dasselbe gilt für die Abtrennung nicht gebundenen Konjugats Diese Abtrennung kann vorteilhafterweise dadurch geschehen, daß die Bindeprodukte des Analyten bzw. der weiteren Probenbestandteile bzw. des Standardanalyten mit den zugehörigen Sonden an eine feste Phase (z B einen Festkörper in Form eines Beads) gebunden werden und die verbleibende flussige Phase von der festen Phase getrennt wird Dies kann beispielsweise geschehen durch Zurückhalten der festen Phase an einem Filter, wahrend die Flüssigkeit durch das Filtermaterial durchtreten kann Eine weitere Möglichkeit ergibt sich durch Verwendung magnetischer fester Phasen, und Anlegung eines Magnetfeldes, so daß sich die magnetischen Phasen an einer bestimmten Stelle sammeln und die Flüssigkeit mit den nicht gebundenen Sonden entfernt werden kann Weiter bevorzugt wird die feste Phase mit Hilfe einer Waschflussig- keit von physikalisch anhaftenden, nicht jedoch an den Analyten bzw die anderen Bestandteile spezifisch gebundenen Sonden entfernt wird
Die Bindung des Analyten an die feste Phase hangt wiederum von der Art des zu bestimmenden Analyten ab. So können wiederum biologische Wechselwirkungen (bevorzugt jedoch einer anderen Art oder/und Spezifitat als bei der Bindung des Analyten bzw Standardanalyten) für die Bindung ausgenutzt werden. Sofern es sich bei dem Analyten um ein Antigen handelt, kann die Bindung über eine feste Phase geschehen, die an ihrer Oberflache durch Bindung eines Antikörpers gegen dieses Antigen modifiziert ist Für den Fall von Nukleinsäuren als Analyten kann die Bindung über Sonden geschehen, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, die komplementär zu einer Sequenz des Analyten, der weiteren Probenbestandteile bzw der Standardnukleinsäure ist Bevorzugt wird die Sequenz dieser sogenannten Fangsonde, die kovalent oder über biospezifische Wechselwirkungen, z. B Biotin/Streptavidin, an die feste Phase gebunden ist oder wird, so gewählt, daß sie sowohl komplementär zu einer Teilsequenz des Analyten als auch der Standardnukleinsäure oder weiterer Analytnukleinsauren ist. Dies ist insofern vorteilhaft, als dann für das Abfangen beider Probenbestandteile nur eine einzige Art von Fangsonde erforderlich ist. Ist der Analyt eine Zelle, so können diese Zellen durch Antikörper, die gegen Oberflachenantigene auf diesen Zellen gerichtet sind (z. B CD3 für T-Zellen), immobilisiert werden Die Selektion Detektion kann mit Antikörpern gegen Untergruppen (z B der T- Helferzellen mit CD4 mit einer ersten Markierungsgruppe, der T-Supressorzellen mit CD8 und einer zweiten Markierungsgruppe) vorgenommen werden 3 Eine weitere Möglichkeit der Bindung der Analytnukleinsäure bzw. der Standardnukleinsäure oder weiterer Analytnukleinsäuren an eine feste Phase ist der Einbau einer immobilisierbaren Gruppe in erzeugte Kopien während der Nukleinsäureamplifikation. Dies kann geschehen durch Verwendung -mmobilisierbar markierter Primer oder immobilisierbar markierte Mono- nukleosidtriphosphate. Als immobilisierbare Gruppe kann beispielsweise Biotin gewählt werden. Die erhaltenen Amplifikate können dann an einer streptavidinbeschichteten Oberfläche abgefangen werden.
Basierend auf der Anwesenheit der Markierungs- bzw. Detektionsgruppen wird nun ein elektromagnetisches Signal für jede unterschiedliche Markierungs- bzw. Detektionsgruppe erzeugt. Überraschenderweise hat es sich herausgestellt, daß die Kombination von auf unterschiedliche Weise anregbaren Gruppen für die unterschiedlichen Sonden besonders vorteilhaft ist. Vorteilhaft ist zum Beispiel die Kombination einer Sonde, die elektrisch zur Lumineszenz angeregt werden kann (Elektrochemilumineszenz, ECL), mit einer Sonde, die chemisch zur Lumineszenz angeregt werden kann (Biolumineszenz). Die selektive, d. h., gezielte Anregung der Signalbildung bewirkt beispielsweise, daß Kreuzanregung, d. h., Mitanregung auch der gerade nicht nachzuweisenden Markierungsgruppe stark reduziert oder sogar vermieden werden kann. Dies bewirkt für das Gesamtverfahren einen großen dynamischen Meßbereich und relativ niedrige Hintergrundsignale (hohe Sensitivität). Die Art der Erzeugung hängt von den jeweiligen Erfordernissen im Hinblick auf die Signalerzeugung ab. Eine erste Gruppe von Markierungsgruppen zeichnet sich dadurch aus, daß das Signal durch Inkontaktbringen der Markierungsgruppe mit bestimmten (z. B. chemischen) Reagenzien erzeugt wird. Eine bevorzugte Gruppen von Detektionsgruppen sind zur Biolumineszenz anregbare Gruppen, z. B. allo- sterisch triggerbare Gruppen. Die Detektionsgruppen unterschiedlicher Sonden gehören bevorzugt unterschiedlichen Substanzklassen an (z. B. ein niedermolekularer organischer Metallkomplex und ein Protein). Zu Markierungsgruppen gehören beispielsweise die durch Ionen aktivierbaren Photoproteine (Apo-Photoproteine, nativ oder bevorzugt recombinant hergestellt). Zu diesen Photoproteinen gehören beispielsweise Aequorin, Obelin, Mitrocomin, Thalassicolin und Clytin. Diese Proteine haben die Eigenschaft, daß sie ein Lichtsignal abgeben, wenn sie aktiviert werden, so daß ihre Menge oder Anwesenheit durch Messung der Lichtmessung bestimmt werden kann. Die Verwendung solcher Photoproteine in herkömmlichen Tests und der Mechanismus, der zur Signalbildung führt, ist beispielsweise in Cormier, M.L. et al., Photochem & Photobiol. 49/4, 509 - 512 (1989) oder Smith, D.F. et al., in "Bioiuminescence and Chemiluminescence: Current Status (P. Stanley & L. Kricka, eds.), John Wiley and Sons, Chichester, U.K. 1991, 529 - 532 beschrieben. In diesem Fall findet die Aktivierung durch Zugabe von Kalziumionen zu den markierten, gebundenen Sonden statt.
Adequate Chemilumineszenzdirektmarkierungen mit blitzartigem Signalprofil sind z. B. auch Acridinium-Arylester, Acridinium-Acyl-Sulfonamide oder Isoluminolderivate, wie ABEI, AEEI und AHEI.
Eine weitere, besonders geeignete Gruppe von Markierungsgruppen sind zur Elektrochemi- luminszenz anregbare Metallkomplexe. Solche Komplexe sind beispielsweise beschrieben in EP-A-0 199 804, EP-A-0 265 519, WO 89/04302 und WO 92/14139. Bevorzugt handelt es sich um Rutheniumkomplexe, welche als Liganden Bipyridyleinheiten aufweisen. Nukleinsäure- sonden, die mit speziellen Rutheniumhomplexen markiert sind, sind beispielsweise auch in EP- A-0 340 605 beschrieben. Besonders gut einsetzbare immunologische Sonden, welche mit Rutheniumkomplexen markiert sind, sind beispielsweise in EP-A-0 178 450 beschrieben. Neben Rutheniumkompiexen können auch andere entsprechend triggerbare Übergangsmetalle (Osmium, Iridium, etc.) bzw. andere zur Elektrochemilumineszenz geeignete heterocylisch aromatische Komplexliganden verwendet werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Detektionsgruppen zu einer Bildung eines detek- tierbaren, auf die Gruppe zurückzuführenden Signals, angeregt. Bevorzugt ist dieses Signal ein Lumineszenzsignal. Unter Lumineszenz wird üblicherweise ein Vorgang verstanden, bei dem ein chemisch angeregter, metastabiler Molekülzustand unter Emission eines Photons (elektromagnetische Strahlung) in einen niederenergetischen Zustand übergeht
Unter unabhängigen Erzeugungen eines Signals werden im Sinne vorliegenden Erfindung Handlungen verstanden, durch die selektiv eine bestimmte Markierungsgruppe angeregt wird, ohne daß Markierungsgruppen auf davon unterschiedlichen Sonden angeregt werden.
Unter einem elektromagnetischen Signal wird im Sinne der Erfindung bevorzugt ein Lichtsignal verstanden. Besonders bevorzugt sind Lichtblitze.
Von unterschiedlichen elektromagnetischen Signalen wird im folgenden gesprochen, wenn sich die Signale in ihrer Herkunft unterscheiden, z.B. herkommend von unterschiedlichen Substanzklassen von Markierungsgruppen. Wenn im Folgenden von der Kombination von Elektrochemilumineszenz und Biolumineszenz durch Photoproteine gesprochen wird, so ist dies nur II als bevorzugte Ausführungsform eines Systems zweier unterschiedlich anregbarer Lumineszenzmarkierungen zu verstehen.
Die Erzeugung der unterschiedUchen elektromagnetischen Signale kann sowohl gleichzeitig als auch nacheinander vorgenommen werden. Dies hängt insbesondere davon ab, ob die Signale so stark unterschiedlich sind, daß sie auch gleichzeitig spezifisch detektiert werden können. Es hat sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, die unterschiedlichen elektromagnetischen Signale nacheinander zu erzeugen und zu detektieren. Daher ist es bevorzugt, Markierungsgruppen zu wählen, die selektiv aktivierbar sind, z. B. eine erste Gruppe durch chemische oder/und allo- stenische Triggerung und zweite durch elektrochemische Triggerung. Dies hat insbesondere den Vorteil, daß die für die Signalerzeugung eventuell erforderlichen Reaktionsbedingungen nicht in derselben Lösung eingestellt werden müssen. Für den Fall, daß es sich bei der ersten Art von Markierungsgruppe um ein durch Ionen aktivierbares Photoprotein und bei der zweiten Markierungsgruppe um einen zur Elektrochemilumineszenz anregbaren Metallkomplex handelt, ist es möglich, die beiden Signale gleichzeitig oder nacheinander zu bestimmen. Eine gleichzeitige Messung ist möglich bei Verwendung von Markierungsgruppen mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen. Das zur Lichtdetektion verwendete Modul muß dabei eine spektroskopische Auftrennung der Signale, z. B. durch Wahl geeigneter Filter, Prismen oder Gitter erlauben.
Bei Bestimmung der Signale nacheinander ist es möglich, zuerst die Bedingungen für die Erzeugung des Photoproteinsignales einzustellen, aber bevorzugt, zunächst die Bedingungen für die Erzeugung der Elektrochemilumineszenz einzustellen. Hierzu wird (für das Beispiel der Markierung mit einem Rutheniumtrisbipyridylkomplex) eine Lösung von Kaliumphosphat, Tri- propylamin und Thesit™ mit den an die feste Phase gebundenen Analyten, Standardanalyten und gegebenenfalls anderen zu bestimmenden Bestandteilen, an welche die Sonden gebunden sind, in Kontakt gebracht. Dies kann entweder durch Zupipettieren der Lösung zu der festen Phase geschehen, es ist jedoch auch möglich, die feste Phase in eine Lösung der Reagenzien zuzugeben oder die Lösung an der festen Phase vorbeifließen zu lassen. Der letzte Fall ist bevorzugt, da hierbei auch eine Reinigungswirkung erzeugt wird. In Anwesenheit der zwei oder mehr Sonden wird nun die Elektrochemilumineszenz durch Anlegen einer Spannung erzeugt. Der erzeugte Lichtblitz wird als Signal mit Hilfe eines geeigneten Instrumentes, z. B. unter Anwendung eines Photomultipliers, in einen Meßwert umgewandelt. Für die Meßbedingungen und Reagenzien wird auf die Publikation Uland, J.K. and Powell, M.J. in J. Electrochem. Soc. . 2. 137. pp. 3127-3127 (1990) verwiesen. Überraschenderweise stört die elektrische Signalerzeugung die Aktivität der Photoproteine nicht.
Anschließend werden Reaktionsbedingungen eingestellt, wie sie für die Erzeugung eines Signales basierend auf der Anwesenheit des Photoproteins erforderlich sind. Auch hier können die entsprechenden Reagenzien zu der bereits vorliegenden Lösung oder einer entsprechenden Waschlösung oder der festen Phase zugegeben werden. Bevorzugt ist jedoch die Verdrängung der für die Erzeugung der Elektrochemilumineszenz erforderlichen Reagenzlösung durch die Reagenzlösung für die Aktivierung des Photoproteins. Das Inkontaktbringen des Photoproteins mit dem aktivierenden Ion bewirkt ebenfalls die Erzeugung eines Lichtsignals, dessen Intensität instrumentell bestimmt und in einen Meßwert umgewandelt werden kann. Es war möglich, das Signal, welches mit Hilfe von Aequorin erzeugt worden war, mit derselben apparativen Anordnung wie der für die Detektion des Lichtblitzes, welcher mit Hilfe von Rutheniumbipyridylkomplexen erzeugt worden war, zu messen, vorausgesetzt der Photo- multiplier hat eine genügende Empfindlichkeit bei beiden Emissionswellenlängen. Für die Bedingungen zur Erzeugung eines Lichtsignales bei Verwendung von Aequorin als Label wird hiermit Bezug genommen auf die Publikation Smith, D.F. et alt Bioiuminescence and Chemiluminescence; Current Status (P. Stanley and L. Kricha, eds.), John Wiley, Chichester, U.K., pp. 529-532 (1991).
Bei den Signalen handelt es sich bevorzugt und vorteilhafterweise um Blitzsignale. Dies bedeutet, daß Anregung und Messung des Signals sehr schnell ablaufen können. Dadurch wird die Gesamtmeßzeit für zwei Nachweisreaktionen nicht wesentlich länger (> 2,5 x) als die für eine der beiden Einzelmessungen (z. B. Elektrochemilumineszenz: 4 Sekunden, Elektrochemilumineszenz mit nachfolgender Biolumineszenz mit Aequorin: 5 Sekunden). Dies ermöglicht einen maximalen Zugewinn bezüglich des Durchsatzes, besonders auf einem Analyzer, da das Prinzip des dualen Markierungsnachweises nicht gemindert wird durch eine signifikante Aufweitung des Meßzeitfensters. Es ergeben sich für die genannte Kombination keine Interferenzen zwischen den beiden einer Probe zugeordneten Signalreaktionen durch vollständige zeitliche Trennung innerhalb eines Meßschrittes, so daß eine saubere, voneinander unabhängige Auswertung der beiden Signale direkt möglich wird, ohne Notwendigkeit für letztlich nur Nährungswerte liefernde mathematische Korrektoralgorithmen. Die jeweilige Leistungsfähigkeit der beiden Markierungsgruppen (z. B. im Hinblick auf Kriterien, wie analytische Sensitivi- .3 tat, Serien- und Tag-Tag-Präzision, dynamischer Meßbereich und linearer Meßbereich) bleibt auch in Kombination erhalten.
Die Messung der von unterschiedlichen Detektionsgruppen erzeugten Signale erfolgt bevorzugt mit derselben Messanordnung, z. B. in derselben Messzelle. Bevorzugt wird die Messzelle so gewählt, daß an ihr keine Änderungen bezüglich der detektierten Wellenlängen für beide Detektionsgruppen erforderlich ist. Die Messzelle ist bevorzugt eine für das elektrochemische Triggern einer Detektionsgruppe ausgelegte Messzelle. Die bevorzugt nachgeschaltete Detek- tion beruhend auf einer anderen Substanzklasse als Detektionsgruppe benutzt nicht die Elektroanordnung der ECL-Messzelle zur Anregung der Lumineszenz, sondern nur zur Detek- tion.
Die sequentielle Abfolge der Bestimmung der unterschiedlichen Detektionsgruppen macht es möglich, daß die Gruppen keine unterschiedliche kinetische Charakteristik aufweisen müssen, oder sich in ihrem spektralen Verhalten unterscheiden müssen. So ist beispielsweise der Ruthenium-Komplex durch einen Fluorophor ersetzbar, der wie Aequorin in blaugrünem Bereich emittiert.
Die Auswertung der Signale bzw. der Meßwerte für diese Signale hängt nun von der beabsichtigten Aussage des Bestimmungsverfahrens ab. In jedem Fall jedoch ist das Vorhandensein eines Meßwertes, der sich von einem Meßwert einer Vergleichsmessung unterscheidet, bei der keine Sonde oder kein Analyt vorhanden war, ein Anzeichen für die Anwesenheit des Analyten. Dasselbe gilt für den Meßwert für die übrigen Bestandteile oder einen Standardanalyten. Dies kann benutzt werden, um eine qualitative Aussage über die Anwesenheit des Analyten bzw. weitere Analyten zu erhalten. Das Ergebnis der Messung für den Standardanalyten kann in einer qualitativen Messung für die Eichung des Systems und als Positivkontrolle verwendet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die Schritte:
- Bindung des Analyten und gegebenenfalls eines weiteren Analyten bzw. Standardanalyten an eine feste Phase (z. B. ein Magnetpartikel),
- Bindung einer Sonde an den Analyten bzw. an den weiteren Analyten bzw. den Standardanalyten, m
- Bestimmung der gebundenen ersten Sonde (in Anwesenheit, jedoch unabhängig von der zweiten Sonde),
- Bestimmung der Bindung der zweiten Sonde (in Anwesenheit und unabhängig von der ersten Sonde),
- Ermittlung der Anwesenheit bzw. Konzentration des mindestens einen Analyts aufgrund der erhaltenen Signale der ersten Sonde. Hierbei können jedoch auch weitere Sonden, markiert mit weiteren Markierungsgruppen und unter Verwendung weiterer unabhängiger Anregungen, eingesetzt werden. Bevorzugt wird der Analyt, der weitere Analyt bzw. Standardanalyt und die daran gebundenen Sonden nach Durchführung der Bestimmung vom Anregungsbzw. Meßort entfernt, so daß dieser für die Durchführung einer weiteren Bestimmung, z. B. der Bestimmung eines Analyten aus einer weiteren Probe, zur Verfügung steht.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch besonders geeignet für eine quantitative Bestimmung eines Analyten. Unter einer quantitativen Bestimmung wird die Bestimmung der Menge eines Analyten in der Probe und somit auch die Bestimmung der Menge an Analyt in einer für die Herstellung der Probe verwendeten Primärprobe verstanden. Die quantitative Bestimmung verwendet bevorzugt mindestens eine Sonde, die für den zu bestimmenden Analyten spezifisch ist. Sollen mehrere Analyten bestimmt werden, sind weitere Sonden/Markierungsgruppen erforderlich. Darüber hinaus wird eine Sonde eingesetzt, welche für den Standardanalyten spezifisch ist. Da die Menge an Standardanalyt definiert und bekannt ist, kann der Meßwert für den Standardanalyt zur Eichung des Meßwertes für den Analyt verwendet werden.
Die Eichung des Systems kann z. B. folgendermaßen durchgeführt werden:
I. Erstellung einer Eichkurve:
Verschiedene Lösungen, z. B. 5, mit unterschiedlichen, aber bekannten Konzentrationen an Analytnukleinsäure, werden mit jeweils der gleichen bekannten Menge an Standardnukleinsäuren (z. B. 1000 Kopien) versetzt. Zu jeder dieser Lösungen werden Lösungen mit den mindestens 2 Sonden (z. B. Rutheniummarkierung an der Analytsonde, Aequorinmarkierung an der Standardsonde) gegeben. Nach Hybridisierung werden die Meßsignale für die bekannten Konzentrationen an Analyt und Standard ermittelt. Daraus wird eine Eichkurve erstellt, indem das Signalverhältnis der Messungen für Analyt zu Standard in Abhängigkeit der eingesetzten bekannten Analytkonzentration aufgetragen wird.
Probenmessung und Auswertung
Der Probe mit der unbekannten Analytkonzentration wird vor der Messung die gleiche Konzentration an Standardnukleinsäuren wie bei der Erstellung der Eichkurve (z. B. 1000 Kopien) zugegeben und die entsprechenden Meßsignale für den Analyt und den Standard ermittelt. Das Signalverhältnis von Analyt zu Standard wird berechnet und die Analytkonzentration aus der Eichkurve abgelesen.
Die Verhältnisbildung aus 2 oder mehr gemeinsam (d. h. aus einem Reaktionsansatz) erzeugten Signalen ist eine einfache Möglichkeit, eventuell auftretende Schwankungen in der Signalgenerierung zu kompensieren. Vorallem werden eventuelle Schwankungen in der Amplifikationsreaktion der unterschiedlichen Sonden für den Analyten bzw. Standard korrigiert. Solche Schwankungen betreffen z. B. variable Effizienzfaktoren von Probe zu Probe, oder für ein und dieselbe Probe von Cyclus zu Cyclus und rühren unter anderem von Schwankungen in der Qualität der Probenvorbereitung her (z. B. Aufreinigungsgrad, Abtrennung von Inhibitoren), per internem, co-amplifiziertem Standard und ratiometrischer Auswertung werden solche Schwankungen für jeden Reaktionsansatz herausgerechnet. Sollte sich das Signalverhältnis zwischen den einzelnen Geräten und über die Zeit pro Gerät ausreichend konstant verhalten, kann dieses Signalverhältnis beim Hersteller des Gerätes bzw. der Reagenzien vorab ermittelt werden und zur Auswertung mittels Korrekturfaktor bzw. Korrekturfünktion in der Auswertesoftware implementiert werden. Dann ist kundenseitig nur noch die Erstellung einer Eichkurve aus verschiedenen Konzentrationen an Analytnukleinsäure notwendig.
Vor Erstellung der Eichkurve erfolgt zweckmäßigerweise eine experimentelle Prüfung auf vergleichbare Amplifikationseffizienz von Proben-DNA und Standard-DNA (interner Standard), erkennbar z. B. an parellel-linearen Verläufen bei Auftragung von log Signal (Y) über log Ausgangskopienzahl N0 (X)
In Figur 1 ist der schematische Aufbau eines Gerätes zur Durchführung des erfindungs- gemäßen Verfahrens gezeigt. Ein entsprechendes Gerät, das einfach auf die Anforderun- gen des beschriebenen Verfahrens adaptiert werden kann, ist von der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Elecsys 2010 oder 1010) erhältlich.
Bevorzugt laufen folgende Schritte ab:
1. Amplifikation mittels PCR einer Analytnukleinsäure in einer Probe in Anwesenheit und Coamplifikation einer bekannten Menge an Standardnukleinsäure.
2. Denaturierung durch Zugabe von NaOH-Lösung.
3. Aufbewahrung dieser Probe im Probenrotor 5.
4. Überführung eines Aliquots in ein Gefäß des Inkubators.
5. Zugabe der analytspezifischen und der standardanalytspezifischen Sonde.
6. Inkubation mit streptavidinbeschichteten Magnetpartikeln in Inkubator 4.
7. Aufiiahme eines Aliquots der Lösung aus dem Inkubator 4 über die Pipettiemadel 6 in die Meßzeile 13.
8. Aufnahme der Konditionierlösung aus Behälter 1 zum Transport des Aliquots durch das Liquid Flow System. Die Magnetteilchen mit gebundenen Analyt, Standardanalyt und Sonden werden durch den Magneten an der Arbeitselektrode festgehalten.
9. Aufiiahme von Konditionierlösung aus Behälter 1 zum Waschen der Beads auf der Arbeitselektrode.
10. Anlegen einer Spannung zwischen Arbeits- und Gegenelektrode 10 und 11 (kontrolliert über Referenzelektrode 9) führt zur Aussendung eines Lichtblitzes. Messung des Lichtblitzes mit dem Photomultiplier 7.
11. Aufsaugen der kalziumhaltigen Triggerlösung aus Gefäß 3 in die Meßzelle 13, dabei Messung der entstehenden Lumineszenz. Die Teilchen sind hierbei durch den Magneten 8 in der Meßzeile 13 festgehalten.
12. Entfernen des Magneten 8 und somit Abführung der gebundenen Magnetteilchen mit durchgepumpter Reinigungslösung aus Gefäß 2. n-
13. Auswertung der Signalintensitäten.
14. Das Gerät steht zur erneuten Aufnahme einer zu vermessenden Probe (Schritt 1) zur Verfügung.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung kann in vielerlei Hinsicht vorteilhaft genutzt werden. Zunächst ist das Verfahren für die Durchführung quantitativer Bestimmungen von Analyten geeignet. Die Menge an benötigter Probenflüssigkeit wird reduziert, gegebenenfalls halbiert. Bei Verwendung der bevorzugten Detektionsmarkierungen ist nur ein einziges Gerät zur Detelction und Auswertung erforderlich. Außerdem ist es möglich, auch immunologische Tests mit auf Nukleinsaurebasis funktionierenden Tests zu kombinieren. Auf jeden Fall wird der Durchsatz von Proben auf Testgeraten (Analyzer) ganz erheblich verbessert. Durch unabhängige Anregung wird die zeitliche Trennung der Signale ermöglicht. Dies ermöglicht einen großen dynamischen Bereich und die hohe Sensitivität.
In Figur 2 ist der Signalverlauf einer beispielhaften, hintereinander ablaufenden Bestimmung zweier Detektionsgruppen (Rutheniumkomplex und Aequorin) gezeigt. Es wird erkenntlich, daß die Signalintensitäten in der gleichen Größenordnung liegen, d. h. überraschenderweise auch für Aequorinlabel in eigentlich zur Bestimmung der Elektrochemilumineszenz gedachten Geräten eine ausreichende Signalausbeute erreicht werden kann. In Figur 2 bedeuten die Kurvenverläufe 1 bis 7:
1 10 nM bio-Aeq II pM ruthenyliertes Oligonukleotid
2 1 nM bio-Aeq / 7 pM ruthenyliertes Oligonukleotid
3 100 pM bio-Aeq / 7 pM ruthenyliertes Oligonukleotid
4 10 pM bio-Aeq II pM ruthenyliertes Oligonukleotid
5 1 pM bio-Aeq / 7 pM ruthenyliertes Oligonukleotid
6 0 M bio-Aeq / 7 pM ruthenyliertes Oligonukleotid
7 0 M bio- Aequorin /0 M ruthenyliertes Oligonukleotid
Aufgetragen ist die Signalstärke bei Vermessung gegen die Zeit in Sekunden. Iθ Figur 3 zeigt, daß überraschenderweise praktisch kein Signalverlust durch vorgeschaltete ECL-
Messung zu beobachten ist. In Figur 3 ist der Verlauf der Signalintensitäten (bei gleichen Kon- zentrationsverhältnissen) während einer Meßzeit in Sekunden gezeigt für einen ersten Fall, bei dem zuerst das Aequorinlabel von MDP (Mono-biotin-Mono-DigoxigeninHepta-Peptid, erhältlich aus dem Enzymun-Test® DNA Detection, Boehringer Mannheim GmbH, BRD, Best - Nr. 1447777) und anschließend das ECL-Signal des Oligonukleotids 1 (SEQ.ID.NO. 1) gemessen wird (Kurve 1) und einem zweiten Fall, in dem zuerst das ECL-Signal und anschließend das Aequorinsignal gemessen wird (Kurve 2). Es ist erkennbar, daß sich die Intensität des Aequorinsignals vor ECL-Messung nur unwesentlich von der Intensität des Signals nach ECL-Messung unterscheidet. Dies bedeutet, daß die Biolumineszenzmarkierung überraschenderweise durch den vorgeschalteten Elektrochemielumineszenzprozess nicht wesentlich an Funktionalität verliert. Die Triggerspannung für die ECL-Messung ist jenseits der Zersetzungsspannung von Wasser, d.h., die Wasseroxidation ist während des ECL-Pro- zesses in vollem Gange, an der Anode (wo sich das Äquorin befindet), entstehen große Mengen Sauerstoff Die Umgebung des Proteins wird also erheblich gestört. Überraschenderweise wird dadurch die durch das Protein hervorgerufene Signa-hohe nicht beeinflußt. Es muß weiterhin gewährleistet werden, daß Reste der Reaktionslösungen für die vorangegangene Bestimmung nicht mehr in störendem Umfang in der Messzelle verbleiben. Das gilt insbesondere für Substanzen (z. B. Ionen), die, wenn die beiden Lösungen für die unterschiedlichen Reaktionen aufeinandertreffen, schwerlösliche Niederschläge bilden (z. B. Calziumionen aus der Aequorintriggerung und Phosphationen aus der ECL-Triggerung). Gerade die Verwendung unterschiedlich und vollständig voneinander getrennt anregbarer Markierungen in nacheinander ablaufenden Bestimmungsreaktionen insbesondere für Analysenautomaten, bei denen eine Vielzahl von Bestimmungen nacheinander durchgeführt werden soll, und wobei die später durchgeführten Bestimmungen noch genauso zuverlässig durchgeführt werden sollen, wie die ersten, war für einen Fachmann nicht zu erwarten. Dies gilt insbesondere für Analysenautomaten mit Durchflußküvetten, welche für unterschiedliche Bestimmungen eingesetzt werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Reagenzkit zur Bestimmung eines Analyten enthaltend in einem oder getrennten Behältern zwei oder mehr Sonden, von denen mindestens eine für den zu bestimmenden Analyten spezifisch ist, wobei die mindestens zwei Sonden unterschiedliche Markierungsgruppen tragen, die unterschiedliche elektromagnetische Signale liefern können. Die Spezifität der weiteren Sonden ist der obigen Schilderung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu entnehmen. Darüber hinaus enthält das Reagenzkit bevorzugt einen Behälter mit einem /9
Standardanalyten, wobei die Konzentration des Standardanalyten bekannt oder/und definiert ist. Außerdem kann das Reagenzkit weitere Reagenzien, die zur Bestimmung der Markierungsgruppen erforderlich sind, enthalten. Weiterhin können auch Reagenzien zur Vorbehandlung von Proben zur Herstellung einer analythaltigen, für die Bestimmung geeigneten Lösung, enthalten sein. Diese sind bevorzugt in getrennten Behältern enthalten. Geeignete Reagenzien sind beispielsweise Primer, Enzym- und Mononukleosidtriphosphate für die Durchführung einer kompetitiven PCR. Weitere mögliche Bestandteile des Reagenzkits sind eine Suspension von Magnetpartikeln, an welche der Analyt gebunden werden kann.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung zweier Sonden, die unterschiedliche elektromagnetische Signale liefern können, zum quantitativen Nachweis von Analyten in einer Probe.
Die folgenden Beispiele sollen den Gegenstand der Erfindung näher erläutern:
Beispiel 1
Aufeinanderfolgende Bestimmung von unterschiedlichen Detektionsgruppen an streptavidinbe- schichteten Magnetpartikeln bei gleichzeitiger Anwesenheit von Rutheniumkomplexen als zweiter Detektionsgruppe
Für die Bestimmung unterschiedlicher Detektionsgruppen wurde eine 200 μl Pufferlösung hergestellt, die biotinyliertes Aequorin (in den Konzentrationen 1 pM bis 10 nm) und das am 5'-Ende mit Bio-Link I (Firma Applied Biosystems Inc., Biotin Amidite, Best.-Nr. 401395) biotinylierte und am 3'-Ende über AM III (Einbau während der Oligonukleotidsynthese an CPG (Controlled Pore Glass) und Entfernen der Schutzgruppe Fmoc, FIG 4) mittels BPRu (hergestellt gemäß Clin. Chem. 37/9, 1534 - 1539 (1991)) markierte Oligonukleotid I (SEQ.ID.NO. 1) enthält. Diese Probelösungen wurden mit 36 μg Streptavidinbeads (Firma Boehringer Mannheim GmbH, Elecsys® TSH Immunoassay, Best.-Nr. 1731459) in 50 μl des oben genannten Puffers versetzt und 5 min. bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 120 μl dieser Reaktionslösung in die Meßzelle des Elecsys 2010- oder Elecsys 1010-Analyzers der Firma Boehringer Mannheim GmbH aufgenommen. Danach wurden 1100 μl einer Konditionierlösung mit der Zusammensetzung 300 mM Kaliumphosphat, 180 mM Tripropylamin (TPA) und 1,7 mM Thesit® durchgepumpt. Dann wurde einElektrochemilumineszenz(ECL)- Signal generiert (Spannung: 1,25 V, Zeit: 0,8 sek.). Das ECL-Signal wurde aufgenommen und ist auf dem linken Teil von Figur 2 zu sehen. Durch die konstante Konzentration des Rutheniumlabels erhält man bei allen ECL-Messungen das ungef hr gleiche Signal.
Zur Messung des Aequorinsignals wird eine Triggerlösung der Zusammensetzung 10 mM Tris/HCI, pH 7,4, 100 mM Calciumchlorid in die Meßzelle eingesaugt und dabei das entstehende Signal gemessen. Das gemessene Signal ist auf dem rechten Ast der Kurven in Figur 2 gezeigt. Es ist erkennbar, daß das Signal der Aequorinmessungen von der Konzentration der aequorinmarkierten Verbindungen abhängig ist. Beispiel 2
Nachweis zweier verschiedenen Chlamvdia - Targetsequenzen
Die reale Situation eines Dual Label Assays unter Benutzung eines internen Standards sieht so aus, daß eine interne Standardnukleinsäure bekannter Konzentration in Anwesenheit einer Analytnukleinsäure unbekannter Konzentration nachgewiesen werden muß. Dabei erstreckt sich der potentielle Konzentrationsbereich der Analytnukleinsäure über mehrere Größenordnungen
Für eine gleichbleibend gute Quantifizierungsmoglichkeit über den gesamten Konzentrations- bereich ist es notwendig, daß das Standardsignal unabhängig von der Konzentration der Probe konstant bleiben muß und das Analytsignal linear mit der Probenkonzentration variiert, unabhängig von der Konzentration der ebenfalls vorhandenen Standardnukleinsäure
Im vorliegenden Beispiel wird die Unabhängigkeit beider Signale mittels parallel geführter Bindereaktionen zwischen zwei verschiedenen Fangsonden (Standard bzw Analyt) und zwei jeweils hybridisierungsfähigen Indikatorsonden (Standard- bzw analytspezifisch), von denen eine mit Rubpy, die andere Aequorin-markiert ist. Die reale Test-Situation wird dadurch modelliert, daß die Konzentration jeweils einer Fangsonde konstant gehalten wird (diese simuliert dann den Standard), wahrend die der anderen Fangsonde ( die dann den Analyten simuliert) über vier Größenordnungen variiert wird
Bei den Fangsonden handelt es sich um biotinylierte 40mere (20mer- (bzw 19mer-) (nicht- chlamydiaspezifische) Spacersequenz + 20-mer- (bzw. 21-mer-) Hybridisierungssequenz) Beide Hybridisierungssequenzen entstammen dem Chlamydia trachomatis Genom Im einen Fall hat die Hybridisierungszone die Sequenz 5'-CA GAG TTC TAT AGT GCT ATG-3' (SEQ ID NO 2) Die zugehörige Indikatorsonde 5'CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG-3' (SEQ.ID.NO. 3) ist Aequorin-gelabelt (MH:SH Linkerchemie nach Funktionalisierung mit basisch aktivierbarem [N-Trifluoroacetamido]-aminoalkyl-phosphoramidit) 2 In der anderen Fangsonde ist die Hybridisierungssequenz 5'-G TCT CTC ATC GAG ACA
AAG TG-3' (SEQ.ID.NO. 4). Die zugehörige Indikatorsonde 5'CA GAG TTC TAT AGT
GCT ATG-3' (SEQ.ID.NO. 5) ist über NHS-Chemie mit Ru(bipy)3 gekoppelt.
Von den beiden Chlamydia-Targets ( Fangsonde ) wird jeweils eines konstant bei 0. InM gehalten, während die Konzentration des anderen seriell auf 1*10"9, 1*10*10, l*10"u, 1*10*12 M verdünnt wird. Die Konzentration der beiden Indikatorsonden ist konstant (lOnM). Die bei 37°C gebildeten Hybride werden auf Streptavidin-beschichteten ECL-Beads (720 μg/ml aus Elecsys® TSH) immobilisiert und anschließend mit dem Dual Label Zyklus wie in Beispiel 1 beschrieben vermessen.
FIG 5 und 6 zeigen daß während das Signal des jeweils gewählten Standards konstant bleibt, sich für die jeweils als Analytnukleinsäure gewählte Fangsonde eine ausgezeichnete lineare Korrelation zwischen Analytkonzentration und -signal über vier Größenordnungen hinweg ergibt, unabhängig vom Signal des Standards.
Beispiel 3
Kompetitiver Assay
In diesem Versuch erfolgt eine competitive Testführung mit dual label-Detektion als Modell- assay im Hinblick auf quantitative PCR (qPCR) via Co-amplifikation eines internen Standards, wobei ein Label (eine Markierung) definitiv einem zu amplifizierenden Polynucleotid zugeordnet ist. Hierbei repräsentieren die Indikatorsonden die per Konkurrenz um Primer-Anbindung variable Menge an detektierbarem PCR-Produkt, ausgehend von Analyt-DNA bzw. interne Standard-DNA (Hybridisierungsrate als Funktion der jeweiligen Ausgangskopienzahl).
a. Versuchsaufbau:
Eine biotinylierte 30-mer Fangsonde (10 dT-Spacersequenz + 20-mer Hybridisierungszone: 5'-CA GAG TTC TAT AGT GCT ATG-3' (SEQ.ID.NO. 6)) wird seriell verdünnt auf 1000, 100, 10 pmol/1 (dazu 0 pmol/1 = Pufferleerwert) und jeweils auf Streptavidin (SA)-beschichte- ten ECL-Beads (720 μg ml) immobilisiert. Eine dazu in ihrer Basensequenz komplementäre 20-mer Indikatorsonde (5'-CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG-3' (SEQ.ID.NO. 7)), anknüpfend an eine Funktionalisierung mit basisch (NH3) aktivierbarem [N-Trifluoracetamido]- aminoalkyl-phosphoramidit einmal über MH:SH-Linkerchemie mit Aequorin markiert, und einmal über NHS-Chemie mit Ru2+(bipy)3, wird mit der Fangsonde zur Reaktion gebracht, wobei es zu einer Konkurrenz zwischen Aequorin- und ECL-markierter Sonde um gemeinsame Fangsondenbindestellen kommt. In einem Fall wird dabei die ECL-markierte Indikatorsonde mit 0.4 nmol/1 konstant gehalten, die Aequorin-markierte Sonde hingegen im Bereich 0.1 - 10 nmol 1 variiert, im anderen Fall wird die Aequorin-Sondenkonzentration festgesetzt auf 1 nmol/1, während die ECL-Sondenkonzentration im Bereich 0.4 - 40 nmol/1 variiert wird.
Um direkt vergleichen zu können, wurden die aus diesem Versuch erhaltenen Primärdaten normiert: die ECL-Signale relativ zu 40 nmol/1 (= großer Überschuß = 100%), die Aequorin- Signale relativ zu 10 nmol/1 (= 100%). Die relativen Änderungen, die sich bei Reaktion der verschieden konzentrierten Fangsondenkonzentrationen mit einer bestimmten Mischung der Indikatorsonden ergaben, wurden gemittelt und anschließend graphisch gegen die variierte Indikatorsondenkonzentration aufgetragen. b. Ergebnisse:
Das Ergebnisse der Messungen ist FIG 7 und 8 zu entnehmen. Bei absolut gleicher Hybridisie- rungssequenz ist zu erwarten, daß der Schnittpunkt der Kurven genau da liegt, wo die Konzentration der variierten Sonde genau der Konzentration der konstant gehaltenen Sonde entspricht (sollte in der Nähe von 50% liegen). Wird die Aequorin-markierte Sonde auf 1 nmol/l festgesetzt und die Ru2+(bipy)3-markierte Sonde variiert, so erhält man ein Schnittpunkt der Kurven bei ca. 0.8 nmol/l, d.h. 0.8 nmol/l Ru2+(bipy)3-markierte Sonde sind äqui-effizient zu 1.0 nmol/I Aequorin-markierter Sonde, was den zu erwartenden Molmasseneffekt (Aequorin: 22000 Da, Ru2+(biρy)3 < 1000 Da) wiederspiegelt. Umgekehrt erhält man bei Variation der Aequorin- markierten Sonde einen Schnittpunkt bei ca. 2 nmol/l, d.h. 2 nmol l sind äqui-effizient zu 0.4 nmol/l Ru2+(bipy)3-markierter Sonde. Diese aus Mittelwerten (s.o.) abgeleiteten Daten zeigen, daß die Hybridisierungsraten mit den beiden Indikatorsonden trotz des erheblichen Molmassenunterschiedes weitgehend ähnlich sind, und die Unterschiede gut der theoretischen Voraussage folgen, womit die prinzipielle Tauglichkeit einer erfindungsgemäßen dual label- Detektion für competitive qPCR auf Basis Co-Amplifikation eines internen Standards unterstrichen wird. Dies wird weiter bestätigt durch die Restaktivität der einen Markierungssonde bei maximalem Überschuß der anderen. Diese beträgt 4% bei konstant 1 nmol l Aequorin- markierter Sonde und 14% bei konstant 0.4 nmol l Ru2+(bipy)3-markierter Sonde, was gut den relativen Überschuß der jeweils anderen Sonde von 40: 1 im ersten und 25: 1 im letzten Fall wiederspiegelt, in der zu erwartenden Orientierung verstärkt durch den Molmasseneffekt (d.h. kinetischer Vorteil der Ru2+(bipy)3-markierten Sonde verstärkt den Effekt des Konzentrationsüberschusses dieser Sonde über die Aequorin-markierte Sonde im ersten Fall, bzw. vermindert den Effekt des Konzentrationsüberschusses der Aequorin-markierten Sonde im letzteren Fall). 2 Beispiel 4
Quantitative Bestimmung einer Nukleinsäure
Probenvorbereitung und PCR-Amplikation
Eine Rohprobe wird erforderlichenfalls so vorbereitet, daß die Nukleinsäure in zugänglicher Form vorliegen (z. B. Lyse von Zellen etc.). Die Nukleinsäuren können erforderlichenfalls gemäß EP-B-0 201 184 amplifiziert werden (Polymerasekettenreaktion). Gemäß EP 0 420 260 wird Biotin mittels markierter Primer eingebaut.
Denaturierung
10 μl dieser Reaktionsmischung wurden mit 40 μl Denaturierungslösung (Zusammensetzung 0,05 M Natriumhydroxid, 0,15 M Natriumchlorid) denaturiert.
Hybridisierung
Anschließend werden 2 Sorten von Sonden zugegeben, von denen eine Rutheniummarkierung (bevorzugt die analytspezifische Sonde) und die andere eine Aequorinmarkierung enthält (bevorzugt die standardspezifische Sonde). Die Sonden sind in einer Hybridisierungslösung mit der Zusammensetzung Phosphatpuffer, pH 6,5, Natriumchlorid und Rinderalbumin gelöst. Von dieser Hybridisierungslösung werden 200 μl zu der vorher erzeugten Reaktionsmischung zugegeben. Das Reaktionsgemisch bei 37 °C für 20 Minuten inkubiert.
Bindung an magnetische Beads
Zu der erhaltenen Reaktionslösung werden 50 μl Lösung von magnetischen Streptavidinbeads (aus Elecsys® TSH-Immunoassay, Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 1731459) (720 μg ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten bei 37 °C inkubiert.
Messung
150 μl der erhaltenen Reaktionslösung werden in dem in Figur 1 beschriebenen Gerät in die Meßzelle aufgenommen. Wie in Beispiel 1 beschrieben wird zunächst das Elektrochemi- lumineszenzsignal und dann das Aequorinsignal gemessen. B ezu gszeichenl is te
(1) Konditionierlösung für die Meßzelle
(2) Reinigungslösung Für die Meßzelle
(3) Calciuπ-chloridhaltige Triggerlösung
(4) Inkubator
(5) Primärprobenrotor
(6) beweglicher Pipettor
(7) Photomultiplier
(8) beweglicher Magnet
(9) Referenzelektrode
(10) Arbeitselektrode
(11) Gegenelektrode
(12) Pumpe
(13) Meßzelle
(14) Umschaltventil für Kolbenpumpe
2 Sequenzprotokoll
(1) ALLGEMEINE ANGABEN: (i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhoferstr. 116
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(G) TELEFON: 0621 759 4348 (H) TELEFAX: 0621 759 4457
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Bestimmung von Analyten unter Verwendung zweier Markierungen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7 (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABENZU SEQ IDNO: 1: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature (B) LAGE:1
(D) SONSTIGE ANGABEN:/note= " A am 5'-Ende mit Bio-Link I mit Biotin markiert"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSEL: misc_feature
(B) LAGE:21
(D) SONSTIGE ANGABEN:/note= "A am 3'-Ende mit AM UI mit BPRu markiert"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
AGACC ACCAA ATGCCCCTAT A 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ IDNO: 2:
CAGAGTTCTATAGTGCTATG 20
(2) ANGABENZU SEQ IDNO: 3: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
CATAGCACTA TAGAACTCTG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GTCTCTCATC GAGACAAAGT G 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE. linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(xi) SEQUENZBESCHRE-BUNG: SEQ ID O: 5:
CAGAGTTCTA TAGTGCTATG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
CAGAGTTCTA TAGTGCTATG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
CATAGCACTA TAGAACTCTG 20

Claims

3| Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch
Inkubation der Probe mit mindestens zwei Sonden, von denen mindestens eine für den zu bestimmenden Analyten spezifisch ist, wobei die mindestens zwei Sonden unterschiedliche Markierungsgruppen tragen,
unabhängige Erzeugung jeweils eines elektromagnetischen Signals für jede unterschiedliche Markierungsgruppe und
Auswertung der erzeugten Signale als Zeichen für die Anwesenheit oder Menge des Analyten.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite und gegebenenfalls weitere Sonden spezifisch ist für einen zweiten oder gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe der Probe.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Inhaltsstoff ein Standardanalyt ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß vor Erzeugung des Signals nicht an den Analyten gebundene analytspezifische Sonde von der analytge- bundenen Sonde abgetrennt wird.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die unterschiedlichen Markierungsgruppen ausgewählt sind aus Gruppen, die selbst kein für eine Bestimmung ausreichendes elektromagnetisches Signal liefern können, und die Markierungsgruppen nach erfolgter Inkubation mit Reagenzien zur Reaktion gebracht werden, die die Markierungsgruppen in Detektionsgruppen umwandeln, welche ein elektromagnetisches Signal liefern können.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die unterschiedlichen Markierungsgruppen ausgewählt sind aus der Gruppe der Haptene und/oder Vitamine
7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Markierungsgruppen um Gruppen handelt, die ein elektromagnetisches Signal liefern können. 3
8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das elektromagnetische Signal durch unterschiedliche Anregung erzeugt wird.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein Signal elektrisch und ein anderes chemisch erzeugt wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungsgruppen unterschiedlichen lumineszenzfahigen Substanzklassen angehören.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine der Detektionsgruppen ein durch Ionen aktivierbares Photoprotein und eine andere Detektionsgruppe einen zur Elektrochemilumineszenz anregbaren Metallkomplex enthält.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1, 3, 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Signale für die unterschiedlichen Markierungsgruppen zeitlich nacheinander erzeugt werden.
13 Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein erstes Signal ein Elek- trochemilumineszenzsignal ist und in Anwesenheit eines Photoproteins erzeugt wird.
14. Reagenzkit zur Bestimmung eines Analyten enthaltend in einem oder getrennten Behältern zwei oder mehr Sonden, von denen mindestens eine für den zu bestimmenden Analyten spezifisch ist, wobei die mindestens zwei Sonden unterschiedliche Lumineszenzmarkierungsgruppen tragen.
15. Kit gemäß Anspruch 12 ferner enthaltend einen Behälter mit einem Standardanalyten.
16. Verwendung zweier Sonden, die unterschiedliche Lumineszenzsignale liefern können, zum quantitativen Nachweis von Analyten in einer Probe.
17. Verfahren zum Nachweis einer Analytnukleinsäure in einer Probe enthaltend
a) Amplifikation zumindest einer Teilsequenz der Analytnukleinsäure sowie zumindest einer Teilsequenz einer definierten Menge einer Standardnukleinsäure in der Probe,
b) Zugabe einer analytnukleinsäurespezifischen Sonde und einer standardnukleinsäure- spezifischen Sonde, die unterschiedliche Markierungsgruppen tragen zu der Probe mit den amplifizierten Nukleinsäuren, c) Entfernung des Gemisches aus b) aus der Messzelle unter Verbleib der Nukleinsäuren und Sonden in der Messzelle,
d) Überführung der Nukleinsäure in dem Gemisch aus b) in eine Messzelle,
e) Anregung der ersten Markierungsgruppe zur Signalbildung,
f) Messung des durch Anregung in d) gebildeten Signals,
g) Anregung der zweiten Markierungsgruppe zur Signalbildung,
h) Messung des durch Anregung in g) gebildeten Signals und
i) Vergleich der gemessenen Signale zum Nachweis der Analytnukleinsäure.
18. Verfahren zur Bestimmung wenigstens zweier Analyten in einer Probe durch
Inkubation der Probe mit mindestens zwei Sonden, von denen jeweils eine für die zu bestimmenden Analyten spezifisch ist und wobei diese Sonden unterschiedliche Markierungsgruppen tragen,
unabhängige Erzeugung jeweils eines elektromagnetischen Signals für jede unterschiedliche Markierungsgruppe und
Auswertung der erzeugten Signale als Zeichen für die Anwesenheit oder die Menge der Analyten.
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