WO1998018959A1 - Procede de diagnostic de maladies genetiques par peignage moleculaire et coffret de diagnostic - Google Patents

Procede de diagnostic de maladies genetiques par peignage moleculaire et coffret de diagnostic Download PDF

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WO1998018959A1
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combing
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Aaron Bensimon
David Bensimon
Xavier Michalet
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Institut Pasteur
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates in particular to a method for detecting and positioning polynucleotide sequences (which may or may not contain genes or parts of genes) in a genome or part of a genome by means of the technique known as molecular combing.
  • the present invention also relates to a method for detecting and positioning reagents of biological, natural or synthetic origin, by association of said reagents with all or part of the comb DNA.
  • the present invention is based on the demonstration that, by means of probes, that is to say polynucleotides containing a sequence of nucleotide sequences such as labeled DNA molecules which specifically recognize parts of DNA aligned, which is hybridized to the combed DNA, we can directly visualize the position of the complementary sequence on the combed genome.
  • the present invention therefore relates, in particular, to the diagnosis of genetic diseases characterized, preferably, by significant alterations in the genome, either in its structure, deletion, translocation for example, or in the number of copies of certain sequences (trisomy for example where the sequence represents an entire chromosome), as well as methods for quickly locating and mapping genes. Genetic diagnosis can be divided into several areas:
  • cancerous conditions constitute an important class affecting a growing part of the population.
  • Current understanding of the process of the onset of a cancerous condition involves a stage in the proliferation of proto-oncogenes (mutations in the cell genome) which precedes the transformation of the cell into a cancer cell.
  • This proliferation stage is unfortunately not detectable, whereas the possibility of carrying out a treatment at this stage would certainly increase the chances of remission and would decrease the handicap of the patients.
  • chromosomal rearrangements such as translocations, deletions, partial or complete trisomies, etc.
  • molecular combing can make a major contribution, either by the speed and the small amount of biological material required, or by the quantitative precision of the results.
  • amplification techniques are not entirely satisfactory, especially for heterozygotes, since there is a normal copy of the gene in the genome, as is the case with large deletions or diseases with repeated sequences where PCR n is also not satisfactory.
  • the diagnosis of a large number of genetic diseases can now be envisaged by implementing molecular combing and labeling of DNA.
  • Molecular combing is a technique consisting in anchoring DNA molecules by their ends on surfaces under well-defined physicochemical conditions, followed by their stretching using a meniscus in recession, molecules are thus obtained.
  • DNA aligned in parallel The purified DNA used can be of any size, and therefore in particular genomic DNA extracted from human cells
  • the genome can also come from genomic material comprising at least 80% of genetic material of fetal origin
  • DNA molecules thus combed can be denatured before being hybridized with nucleic acid probes labeled by any suitable means, (in particular with biotin-dUTP, or digoxygenin-dUTP nucleotides), which are then revealed, for example using fluorescent antibody systems
  • the extension rate depends on the type of surface, but can be precisely measured, it is for example 2 kilobases (kb) per micrometer ( ⁇ m) in the case of silanized surfaces according to the protocol described in reference (1) and set used in the examples
  • kb kilobases
  • ⁇ m micrometer
  • the present invention which comprises different embodiments, essentially relates to a method for detecting the presence or the localization of one or more genes or of one or more DNA sequences specific for A or of one or more molecules reacting with DNA on B DNA, characterized in that
  • the combing product B is reacted with one or more labeled probes linked to the gene (s) or to the specific DNA sequences A or to the molecules capable of reacting with the DNA,
  • the combing technology refers to the technology described in the documents mentioned above, as well as the concept of "combing surface" which corresponds to a treated surface allowing the anchoring of the DNA and its stretching by a meniscus in recession. It should be noted that the combing surface is preferably a flat surface on which the readings are more convenient.
  • reaction between the labeled probes and the combed DNA is meant any chemical or biochemical reaction, in particular reactions of the immunological type (for example antibody directed against methylated DNA), protein / DNA or nucleic acid reactions / DNA (for example hybridization between complementary segments) or nucleic acids / RNA, or nucleic acids / RNA-DNA hybrids. Mention will also be made, for example, of the DNA-DNA chemical bonding reactions using psoralen molecules or the DNA polymerization reactions using an enzyme polymerase. Hybridization is, in general, preceded by denaturation of the fixed and combed DNA, this technique is known and will not be described in detail.
  • probe is intended to denote both a single or double stranded polynucleotide, comprising at least 20 synthetic nucleotides or a fragment of genomic DNA, as well as a “contig”, that is to say a set of probes which are contiguous or overlapping and covers the area in question, or several separate probes, marked or not.
  • probe also means any molecule covalently or noncovalently linked to at least one of the preceding entities, or any biological, natural or synthetic molecule, which can react with DNA, the meaning given to the term “reaction” having was specified above, or any molecule linked covalently or not to any molecule which can react with DNA.
  • the probes may be demonstrated by any suitable method, they may in particular be marked probes or else unlabeled probes whose presence will be demonstrated by appropriate means.
  • the probes may be labeled with methylated cytosines, they could be revealed, after reaction with the combing product, by fluorescent antibodies directed against these methylated cytosines.
  • the elements ensuring the labeling may be radioactive but will preferably be cold labeling, for example by fluorescence. They can also be nucleotide probes in which certain atoms are replaced.
  • the size of the probes may be understood to be any value measured with an extensive unit, that is to say such that the size of two probes equals the sum of the sizes of the probes taken separately. An example is given by the length, but a fluorescence intensity can for example be used.
  • the length of the probes used is between, for example, between 5 kb and 40-50 kb, but can also consist of the entire combed genome.
  • At least one of the probes is a product of therapeutic interest capable of interacting with DNA.
  • the reaction of the probe with the combed DNA is modulated by one or more molecules, solvents or other relevant parameters.
  • gene will sometimes be used interchangeably to designate a “gene part” of genomic origin or else a specific synthetic "polynucleotide sequence”.
  • the method according to the invention is used to allow the diagnosis of breaks in a genome, as well as for the positional cloning of such breaks. It should be noted that the term "break" covers a large number of local genome modifications, the list of which will be explained below.
  • the method according to the present invention consists in determining the position of the possible breakpoints involved in a pathology of genetic origin by hybridization on combed genomic DNA of patients suffering from said pathology, of a genomic probe of known size (cloned or other ) located in the region of the gene sought.
  • These breakpoints consist of points in the genetic sequence whose environment changes over several kilobases (kb) between healthy individuals and sick individuals.
  • the principle of defining the breakpoint is based on the possibility of detecting, by molecular combing, a local modification of the genome studied compared to a genome already studied, at the level of the region or regions considered.
  • the present invention relates to a method for highlighting a genetic break in a genome, characterized in that: (a) a certain quantity of said genome is fixed and combed on a combing surface, (b ) the combing product is hybridized with one or more specific labeled probes corresponding to the genomic sequence of which the anomaly is sought, (c) measuring the size of the fragments corresponding to the signals of hybridization and optionally their repetition, and
  • the histogram In order to produce a histogram of the probe, the number of clones having a determined probe length is evaluated. In principle, the histogram has only one or two peaks depending on the type of break analyzed, two peaks when the probe hybridizes into two separate fragments and a single peak when it hybridizes into a single fragment.
  • the signature of the normal allele overlaps that of the abnormal allele, but can be extracted because it’s known.
  • This method can also be used to perform positional cloning, that is to say to determine the position of one or more unknown genes involved in a pathology.
  • the principle consists, as previously, in hybridizing human, animal or plant DNA clones, then serving as a probe on the combed genomic DNA of one or more patients suffering from the pathology studied.
  • the revelation of these hybridizations makes it possible to measure the size of the hybrid fragments and to construct a histogram of the different sizes observed. If the clone used as a probe covers a breakpoint in the gene, the signature of this phenomenon will be legible over the (shorter) length of the hybrid fragment.
  • Two scenarios can arise (assuming that there is a breakpoint in the region of the genome involved in the pathology): (i) the probe does not overlap the breakpoint, (ii) the probe overlaps the break point.
  • the probe being systematically hyb ⁇ dee on two pieces (or more) separated in the genomic comb DNA (by definition of the existence of a breakpoint)
  • the measurement of the lengths of the probes fluorescent hyb ⁇ dees differs from the result obtained by hybridization on non-pathological genomic DNA
  • the size of the hybrid fragments on the pathological DNA makes it possible to estimate the position of the breakpoint within the clone with an accuracy of a few kb, or even more, if a more resolving technique is used Therefore, it only remains to search for the gene in this clone
  • This technique makes it possible to determine the position of possible breakpoints in the region of the genome involved in a genetic pathology by hybridization of genomic DNA cloned onto combed genomic DNA originating from patients
  • This technique therefore applies to the search for regions of the genome responsible for pathologies due to the deletion of part or all of this region of the genome, the translocation of all or part of this region of the genome, the duplication or presence of several copies of all or part of this region of the genome within it or at any other point in the genome, - the insertion of any genetic sequence within this region of the genome
  • the process which is the subject of the present invention can be modified since it s acts to dose the genes or a particular sequence
  • the present invention relates to a method for assaying a determined genomic sequence in a genome, characterized in that (a) one fixes and combs a certain quantity of said genome on a combing surface, (b) one hybridizes the combing product with a labeled control probe of length lt corresponding to a so-called control genomic sequence, that is to say of which the number of copies in the genome is known, and with a specific labeled probe of length corresponding to the sequence genomics to be dosed, so that said probes can be identified separately,
  • the method may consist in the hybridization of a cosmid probe specific for a control chromosome (chromosome 1, for example, probe of length lt) labeled with biotinilated nucleotides, and l hybridization of a cosmid probe specific for chromosome 21 (length probe le) labeled with digoxygenin on combed genomic DNA extracted from amniotic samples, or from any other sample containing cells of fetal origin.
  • chromosome 1 for example, probe of length lt
  • a cosmid probe specific for chromosome 21 length probe le
  • digoxygenin digoxygenin
  • Red (red color) for the control probe and antidigoxygenine-FITC (green color) for the specific probe the total length of the red hybridization signals observed in a given area of the surface, LT, and the total length of the green hybridization observed in the same area, or in an equivalent area of the surface, LC, therefore lead to the numbers Nt and Ne defined above
  • the Nc / Nt ratio close to 1 will signal a normal genotype (2 chromosomes 21 for 2 chromosomes 1), while a ratio close to 1.5 will signal a Down syndrome (3 chromosomes 21 for 2 chromosomes 1).
  • Ne a significant difference between Ne and the expected value for the number of genomes present deduced from Nt is the indication of the presence of a gene abnormality.
  • the same method can be used: a control probe will be hybridized and revealed in red for example and a probe corresponding to the gene or part of the gene sought will be hybridized and revealed in green for example.
  • the Nc Nt report will give the relative abundance of the gene compared to the frequency of two copies per diploid genome.
  • the aberrant methylation of the GpC islets frequently observed in many cancers (92% of colon cancers) can also be detected by the method according to the invention by reaction between the combed DNA and fluorescent antibodies directed against the methylated cytosines.
  • This technique of determining the number of copies of a gene in a genome can optionally be used to detect the absence of part of the genome.
  • Nc / Nt ratio Statistical uncertainty on the Nc / Nt ratio is of order 1 / VNt.
  • the possibility of obtaining such a number of signals has been demonstrated: it is possible to identify a hundred signals on a silanized glass surface of 20 ⁇ 20 mm of useful surface. This density can be considerably increased as soon as a large quantity of DNA is available.
  • a few hundred thousand cells should in principle suffice to prepare a solution of genomic DNA leading to a high density of combed molecules on the analysis surfaces. It is therefore no longer in principle necessary to carry out cell cultures in most cases. The whole sample-analysis should therefore be able to be carried out in a few days.
  • the method described above can allow different types of diagnosis: chromosome counting (trisomy, monosomy, etc.), counting of copies of a gene, detection of known deletions, or other chromosomal modifications resulting in a modification of the hybridized length of d '' a genome probe given by genome. It should be noted that it is also possible to detect a partial deletion on a single allele.
  • the present invention also relates to diagnostic "kits" comprising at least one of the following elements:
  • this step of preparing the DNA requires extraction protocols, combing and the corresponding equipment (treated surfaces, molecular combing device).
  • the subject of the invention is also a genomic DNA or a part of genomic DNA capable of reacting, under molecular combing conditions, with a probe corresponding to a transcription or translation or regulation product.
  • the diagnosis itself requires the hybridization of specific nucleotide probes and the revelation of these probes, for example by antibody systems.
  • a color coding can also be performed in the case of combined diagnostics, it is therefore possible to offer lots of pre-branded probes corresponding to a catalog of specific diagnostics
  • the present invention relates to a method allowing in particular the physical mapping of a genome.
  • the aim of physical mapping being the ordering of a clone within a genome, molecular combing applies naturally.
  • the position of the clones is obtained by direct measurement of their distance to a reference clone, or to any other reference hybridization signal on the combed genome.
  • the constant extension of the combed DNA then makes it possible to establish directly in kilobases (kb) the respective position of the clones as well as their size, when this exceeds the resolution of the method
  • kb kilobases
  • precise mapping of cDNA DNA complementary to the RNA transcribed in the cell
  • precise measurement of the size of the hybrid fragments (exons) which is of the order of a few hundred bases in general.
  • this method the precise localization within genomic DNA of complete cDNA fragments or their fragments can be obtained.
  • cDNAs corresponding to a protein of interest by hybridization of cDNAs on genomic DNA or on a genomic DNA clone (cosmid, BAC, YAC, for example) at the same time as a clone serving as a benchmark
  • the use of more resolving methods may allow an additional measurement of the size of the probes (near field, electron microscopy, etc.), but a measurement of the fluorescence intensity, if it is the chosen observation mode, can also provide this information
  • the method that we propose makes it possible to minimize the number of hybridizations necessary for the scheduling of a given number of clones, being given a fixed number of colors for revealing hybridizations, or (more generally) for distinct modes for revealing hybridizations.
  • the invention relates to a method, characterized in that:
  • the combing product is hybridized with probes labeled with radioactive, fluorescent or other elements, such as beads, particles, etc. corresponding to each clone, so that said probes can be revealed specifically, by a color in particular, (c) the information corresponding to the place of each clone is taken as well as the corresponding sizes and distances on the genome, (d) operations b) and c) are repeated again by modifying the color, the marking or the method of revealing the probes, knowing that with different colors, markings or modes of disclosure, after n hybridizations, it is possible to position p n clones .
  • the number I of hybridizations necessary to map N clones using p markings, colors or modes of development increases linearly with the number of clones N.
  • the diagram in FIG. 10 represents the result of two hybridizations of 4 clones revealed with 2 different colors from one hybridization to another (for half of them).
  • the 4 hybrid clones form a pattern colored differently from one hybridization to another, the clones being identifiable via their coding (binary in this case).
  • mapping principle presented here is simple. However, in order to overcome certain possible experimental artefacts (dispersion of signal sizes, variability of saturation, breaking of molecules, etc.), it will be advantageous to use adequate image processing and statistical analysis software. The following examples will better understand other features and advantages of the present invention.
  • the present invention relates to a method allowing in particular the detection or positioning of products capable of reacting with combed DNA.
  • products capable of reacting with combed DNA For example, proteins for regulating transcription of DNA-binding genes during the cell cycle or not can be detected on combed DNA, and their preferential binding sites determined relative to the position of known and identified sequences, for example, according to the preceding method of implementing the invention.
  • molecules of therapeutic interest capable of reacting with DNA can be detected on combed DNA; their effect on other molecules capable of reacting with DNA could also be studied by comparison.
  • These molecules can also be intercalants or DNA-modifying molecules as described by:
  • the invention also relates to any molecule, solvent or process linked to a parameter demonstrated by one of the processes described above in accordance with the invention.
  • Figure l a Illustration of the case of a clone (red) straddling the gene (and therefore the breakpoint) sought.
  • the hatched areas must be imagined as absent, which implies in particular that when two segments of probes are on either side, they in fact make only one segment of a length equal to the sum of their lengths.
  • the underlying chromosome (s) are represented by white bars. (a) situation in a healthy patient.
  • duplication (s) of part of the gene (possibly with inversion).
  • duplication (s) of the whole gene (possibly with inversion).
  • Figure 1b Ideal histograms of the lengths of hybrid clones corresponding to the preceding situations. In all cases (one or two peaks), the situation is clearly distinguishable from that of the entire clone (a).
  • the histograms in this figure correspond to the signals of the abnormal allele and are therefore obtained after subtracting the contribution due to the normal allele, shown in (a), from the raw histograms, shown in Figure l e.
  • On the abscissa is the size of the hybrid fragments, the (arbitrary) scale taking that of figure la.
  • On the ordinate is the number of fragments observed, in arbitrary units, only important the proportions between the different populations.
  • Figure le Ideal histograms of the lengths of hybrid clones corresponding to the preceding situations and taking into account the normal allele.
  • the contribution of the normal allele is represented by the peak corresponding to the position of the normal case represented in (a).
  • case (d3) the contribution of the normal allele can generally be considered equivalent to the value of an abnormal peak.
  • Figure 2a Illustration of the case of a clone partially overlapping the gene sought.
  • Figure 2b Ideal histograms of the lengths of hybrid clones corresponding to the preceding situations. In all cases (one or two peaks), the situation is clearly distinguishable from that of the entire clone (a).
  • the histograms in this figure correspond to the signals of the abnormal allele and are therefore obtained after subtracting the contribution due to the normal allele, represented in (a), from the raw histograms, represented in FIG. 2c.
  • On the abscissa is the size of the hybrid fragments, the (arbitrary) scale taking up that of Figure 2a. On the ordinate is the number of fragments observed, in arbitrary units, only the proportions between the different populations matter.
  • Figure 2c Ideal histograms of the lengths of hybrid clones corresponding to the preceding situations and taking into account the normal allele. The contribution of the normal allele is represented by the peak corresponding to the position of the normal case represented in
  • Figure 3a Illustration of the case of a clone fully included in the gene sought.
  • Figure 3b Ideal histograms of the lengths of hybrid clones corresponding to the preceding situations. In all cases (one or two peaks), the situation is clearly distinguishable from that of the entire clone (a).
  • the histograms in this figure correspond to the signals of the abnormal allele and are therefore obtained after subtracting the contribution due to the normal allele, represented in (a), from the raw histograms, represented in FIG. 3c.
  • On the abscissa is the size of the hybrid fragments, the (arbitrary) scale taking that of Figure 3a.
  • On the ordinate is the number of fragments observed, in arbitrary units, only important the proportions between the different populations.
  • Figure 3c Ideal histograms of the lengths of hybrid clones corresponding to the preceding situations and taking into account the normal allele. The contribution of the normal allele is represented by the peak corresponding to the position of the normal case represented in
  • Figure 4 Histograms of the lengths of the staircase model. Study of the influence of the characteristic size.
  • Figure 5 Histograms of the lengths of the staircase model. Study of the influence of the break rate.
  • Figure 6 Histograms of the lengths of the Gaussian model. Study of the influence of the characteristic size.
  • Figure 7 Histograms of the lengths of the Gaussian model. Study of the influence of the break rate.
  • Figure 8 Simulation of histograms in the case of hybridization of a BAC (125 kb) on a breakpoint:
  • Figure 10 illustration of the principle of cartography with color coding.
  • the same subclones are hybridized, giving rise to the same pattern (pattern) of hybridization if we disregard the color information.
  • the two color palettes used allow unambiguous identification of each of the subclones (coding principle).
  • Figure 1 1 Total genomic yeast DNA containing an artificial chromosome (YAC774G4) was combed on treated surfaces. Cosmids belonging to two neighboring contigs separated by an unknown interval have been hybridized two by two so as to be able to reconstruct a precise map of their arrangement.
  • 1F1 1 contains the major part of the calpain 3 gene sequence, the mutations of which are responsible for myopathy of type 2A belts.
  • the figure shows characteristic images of each hybridization (one cosmid being hybrid and revealed in red, on the left, the other in green, on the right) as well as the map reconstituted from the measurements, to approximately 3 kb.
  • the scale is given by the 20 kb bar.
  • FIG. 12 Total human genomic DNA was combed on treated surfaces. Cosmids belonging to 3 neighboring contigs of the region of chromosome 9 containing the gene (non clone) of the "Tuberous Sclerosis 1" (TSC 1) were hybridized in pairs and revealed in 2 different colors in order to measure the size of the intervals separating these contigs. The figure shows 3 characteristic images of each of these measurements giving the distances between cosmids with an accuracy of 1.5 to 3 kb for 50 to 80 measurements. The code of the cosmids used is indicated, as well as the contig to which they belong (in brackets). The green color is represented in white and the red color in gray. MATERIALS AND METHODS Histogram method
  • the diagram in FIG. 1a presents a certain number of situations in the case of a probe completely covering the sought-after region of the genome (region containing any genomic sequence whose modification leads to the appearance of pathology).
  • the probe covers a part of the genome not involved in the break, that is to say on either side of the deletion for example.
  • FIG. 1 e represents the raw results before extraction of the contribution of the normal allele. Similar situations are represented in the case where the clone used does not completely cover the gene (or the region of the genome) sought for in the diagrams of FIGS. 2a and 3a.
  • this region of the genome (implied implicated in the pathology) or "the gene” will be used interchangeably, insofar as the technique does not allow the actual determination of a gene, but a region of the genome undergoing alterations (resulting in a "break point").
  • the set of situations represented in the preceding diagrams gives an idea of the expected difference between a situation where the cloned probe used hybridizes on a region of the genome of a healthy individual which is modified in the case of a sick individual.
  • the simple data of the histogram of the lengths and the length Le of the clone (obtained for example using a hybridization on the DNA of a healthy individual and obtaining the peak of the corresponding histogram) therefore makes it possible to find out if the studied clone covers a breakpoint (in the broad sense understood here).
  • the anomalies observed in the histogram can be grouped into several categories: (a) a peak for a length Li ⁇ Le
  • FIG. 1b indeed shows that it is not possible a priori to distinguish between a partial translocation (cl) or (c2), total (c3) or an insertion in the case of a clone which would cover the whole gene. It is the same for the case where the clone would only partially cover the gene (diagram of Figures 2b and 3b).
  • the length data corresponding to the peaks of the histogram makes it possible in certain cases to specify the position in the clone of the end of the part of the gene deleted, translocated, duplicated or in contact with an insertion.
  • the measurement of a histogram distinct from that expected in the case of a normal genome signals the presence in the genome studied, of an anomaly in the sequence contained in the clone used.
  • the detected deletion may represent only part of the actual deletion of the gene (see diagram 2a (bl) for example).
  • the clone can completely or partially cover the gene.
  • the sequences may possibly be inverted, but this cannot be detected in the case where the clone completely covers the gene.
  • the position of the duplication (s) cannot be determined.
  • the characteristic size defines approximately the limit size reached by molecules subjected to a large number of manipulations.
  • An example of possible manipulation is pipetting: depending on the diameter of the pipette tip, the maximum size limit of the molecules will be more or less important.
  • Another example of manipulation is the vortexing of the DNA solution.
  • the break rate is supposed to model the number of manipulations: for example, the more the number of pipetting increases, the more the molecules are likely to be broken.
  • This model makes it possible to simulate the histograms expected during a hybridization of a probe of known length LQ according to the parameters of the model.
  • FIG. 4 represents, for different rates (or number of steps) of breakage, the shape of the theoretical histograms obtained for values of characteristic size (LQ, Lbreak) of 1, ⁇ > 4 or 8 times the size of the probe. It is clear that the closer the characteristic size is to the size of the probe, the more the histogram differs from the single peak described in part 2, the tail of the distribution at lengths less than the length LQ of the probe taking more importance until practically making the peak disappear for the expected value LQ. A.2. Influence of the break rate on the histogram.
  • FIG. 5 shows, for different characteristic sizes, the evolution of the theoretical histogram as a function of the break rate, that is to say the number of random break steps (N time steps). It naturally appears that the peak at the expected length LQ decreases when the fracture rate increases.
  • the main advantage of the previous model is to provide a rapid means for evaluating the probable shape of the histogram of the lengths of the hybrid probe fragments, so as to be able to interpret the results of the observations.
  • a slightly more realistic model consists of a similar model of successive breaking stages, but with a breaking law different from the "all or nothing" law of the staircase model.
  • a simple way to "round” this law is to replace the previous probability with a Gaussian break probability law:
  • FIG. 6 represents, for different break rates, the shape of the theoretical histograms obtained for characteristic size values (LQ, f-break) of I, 2, 4 or 8 times the size of the probe, identical to those used in the simulation performed as part of the staircase model.
  • LQ characteristic size values
  • f-break characteristic size values
  • FIG. 5 shows, for different characteristic sizes, the evolution of the theoretical histogram as a function of the break rate, that is to say the number of random break steps (N time steps). It naturally appears that the peak at the expected length LQ decreases when the fracture rate increases.
  • the Gaussian model being more realistic, will be the one we will use later to simulate histograms of lengths of hybridized probe fragments.
  • FIG. 8a presents the results of the simulation of a histogram of the lengths of hybrid fragments in the case where the 125 kb BAC hybridizes into two unrelated parts of the genome, of very different sizes (35 and 90 kb), as in the case described in diagram 2a (cl).
  • FIG. 8b represents the result of simulations in the case of two fragments of size little different from each other. Again, the corresponding peaks are sharp and distinct from each other. In this case, we can predict that with less sampling, it will still be possible to identify these two peaks.
  • FIG. 8c represents the result of simulations in the case of two fragments of very close sizes. In both cases, the peaks stand out clearly from the histogram of the small fragments, but it is to be feared that the limited precision of the measurements will confuse them into one.
  • the previous simulations show that, under conditions avoiding excessively breaking the DNA before and during combing, it is possible to distinguish unambiguously between a control situation where the probe hybridizes to a normal human genome, and a situation where the probe hybridizes to a genome modified by the presence of a breakpoint.
  • the heuristic parameters characterizing the combing show that it is however preferable to have a characteristic size greater than or equal to the maximum length of the hybridization. As this is unknown, a simple criterion is therefore a characteristic size of the order of or greater than the length of the clone used as probe.
  • FIG. 8e illustrates an experimental embodiment of the example previously described in Figure 8a.
  • Human genomic DNA was combed according to the protocol described below.
  • Five contiguous cosmid probes of chromosome 9 (280A6, 37A1, 149B8, 134A1 1, 99B4 belonging to the contig of the TSCl gene) totaling approximately 155 kb were hybridized on this DNA, then revealed with fluorescent antibodies.
  • Cosmid DNA is marked by an extension starting from a random primer with nucleotides modified by digoxygenin or which are biotinylated.
  • the Bioprime TM DNA labeling "kit” (Gibco-BRL) is used containing statistical octamer primers and biotin-14-dCTP.
  • dNTPs a different mixture of dNTPs is used which contains dCTP, dATP and dGTP (0.1 mM), dTTP (0.065 m M) and dig-1 1 -dUTP (0.033 mM).
  • the size and the concentration of the labeled DNA fragments are confirmed by electrophoresis on 0.6% agarose gel and by band densitometry.
  • the efficiency of labeling is evaluated from spots deposited on nylon membranes using successive dilutions of digoxigenin probes and biotin probes. After incubation with an anti-dig alkaline phosphatase (AP) (Boehringer Mannheim) or streptavidin AP (Gibco-BRL), the spots are revealed with N BT (NitroBIue Tetrazolium) and BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-lndolylphosphate) from Gibco-BRL. The positive spots are compared with the results obtained from control DNA samples labeled with dig or with biotin.
  • AP anti-dig alkaline phosphatase
  • streptavidin AP Gibco-BRL
  • strains are finally purified on Bio-Spin 6 columns (Biorad) by centrifugation for 5 min at 1500 g. Yeast DNA solution
  • Yeast DNA containing YAC 774G4 (1600 kb) is prepared in 100 ⁇ l blocks of 0.8% LMP agarose (1 ⁇ g / block) using a standard PFGE block preparation protocol.
  • the blocks are stored in 0.5 M EDTA at 4 ° C. and rinsed with 15 ml TE buffer (10 mM Tris / I mM EDTA, pH 8) for 2 hours before being used.
  • Each block is stained with 3.3 ⁇ M YOYO- 1 (Molecular Probes) in 100 ⁇ l T40E2 (Tris 40 mM / EDTA 2 mM, pH 8) for 1 hour at room temperature (RT).
  • the agarose is then melted for 45 minutes at 68 ° C and digested for 2 hours at 40 ° C using 2 U of ⁇ -agarase I in NEB l agarase buffer (Biolabs) per block.
  • the DNA dilution (0.25 ⁇ g / ml) in 50 mM MES (pH 5.5) is carried out very carefully so as to avoid breakage of the DNA strands.
  • the solution is then poured into a 4 ml Teflon TM tank allowing the introduction of 3 22x22 mm silanized blades for combing.
  • the DNA solution can also be stored at 4 ° C for several days.
  • the silanized slides are soaked in the Teflon TM tank containing a solution of total yeast DNA (0.25 g / ml in 50 mM MES, pH 5.5), incubated at RT and extracted from the tank after 10 minutes of incubation using a simple mechanical device. During the incubation, the DNA molecules are anchored on the surface at their ends. By extracting the surface of the reservoir, this has the same effect as the evaporation provided for in the "drop method", the meniscus moves relative to the surface and exerts a constant pulling force on the molecules remaining in the reservoir. The surfaces covered with the combed DNA are then observed with an epifluorescence microscope so as to control the characteristics of the combing. A recording of the representative fields of view for each slide is carried out for the post-hybridization control.
  • the surfaces are then bonded to microscope slides (cyanocrylate) and heated overnight to 60 ° C. They can be stored for several months if they are protected from humidity at -20 ° C or at room temperature. The surfaces are then dehydrated before denaturing using a bath comprising increasing concentrations of ethanol (70%, 90%, 100%). Denaturation and hybridization
  • the surfaces are denatured in 70% deionized formamide / 30% 2xSSC, pH 7.0) for 4 minutes at 70 ° C. and immediately immersed for 5 minutes in a cold ethanol bath (0 ° C) at increasing concentrations (70%, 90%, 100%). The surfaces are then put to dry.
  • the slides are washed for 5 minutes at RT in 3 baths (50% deionized formamide / 2xSSC, pH 7) and for 5 minutes at 5 'at RT in 3 baths of 2xSSC.
  • the slides are incubated for 30 minutes at 37 ° C (HC) with 50 ⁇ l per slide of a blocking solution (1.5% w / v) of reagent (Boehringer Mannheim) in 4xSSC / Tween 20 0.05% , pH 7.2).
  • Detections of probes labeled with biotin and digoxigenin are carried out simultaneously using the same protocol for each detection layer, each antibody layer being incubated for 30 minutes at 37 ° C., the slides being washed after each layer (3 times 5 minutes at RT in 4xSSC / Tween 20 0.05%).
  • the following layers are used (50 ⁇ l of hybridization buffer per slide): (1) 40 mg / ml of Avidin-Texas Red (Vector). (2) 5 mg / ml of biotinilated goat anti-avidin (Vector). (3) 40 mg / ml Avidin-Texas Red (Vector).
  • the total length of combed DNA per field of view was estimated from 30 to 50 fields of view evenly distributed over the whole of each surface.
  • Biotin-dUTP-labeled phage ⁇ DNA was then hybridized and revealed using an antibody system coupled to FITC (green).
  • the total length of hybridized DNA per field of view was estimated from 100 fields of view distributed uniformly over the whole of each surface.
  • the feasibility study has been extended to mammalian genomic DNA.
  • the system chosen is the DNA of 2 lines of hamster lung fibroplasts (lines 618 and GMA32) containing respectively 1 and 2 copies of the target gene AMP 1 per haploid genome.
  • Genomic DNA from cells supplied in solution was combed on silanized surfaces, with an estimated density of 100 diploid genomes per surface of 22x22 mm
  • a cosmid probe (D3S 1, ⁇ 40 kb) specific for the region of the target gene was labeled with dig-dUTP.
  • Another cosmid probe (565 5A 1, ⁇ 40 kb), specific for a region located approximately 1 Mb from the target gene was used as a control, and labeled with biotin-dUTP.
  • the probes were hybridized on the previously denatured combed genomic DNA, and revealed in red (biotinilated probes) and green (digoxygenated probes) in one case, and with inverted colors in the other.
  • the hybridization signals of each color were measured on a number of fields of view representative of the surface.
  • YAC 774G4 contains a human genomic DNA clone of chromosome 15 containing the calpain gene (CANP3), the mutation of which is responsible for belt dystrophy (LGMD 2A)
  • CPP3 calpain gene
  • LGMD 2A belt dystrophy
  • the six cosmids were hybridized two by two and the measurement of their respective size and distance was carried out by constituting histograms of the sizes and distances. The mean and the standard deviation of the main peak of each histogram was extracted therefrom. using specific software The standard deviation of the measurements turns out to be of the order of 2 to 4 kb (figure 1 1) D4
  • the genomic DNA used was extracted from cell cultures and put in block of Low Melting agarose at the rate of 10 ° cells per block. 3 blocks treated according to the previous protocol (4 ml reservoir, use of a final molarity of MES pH 5.5 of 150 mM), were used for combing genomic DNA.
  • the cosmids were hybridized 2 by 2 on similar slides, a total of several tens of double signals (red / green aligned) per slide being observed on average. The same measurement protocol as previously was observed, giving rise to final values having the same precision as in the previous experiment.
  • Figure 12 presents some typical images that allowed the sizes of the 2 gaps studied to be measured.
  • Restriction segment mapping This mapping technique is naturally applicable to any other type of combed DNA or subclone.
  • a possible extension of the technique would consist, for example, no longer of subclones of a clone, but directly of restriction fragments of the combed DNA (for example a clone of the type
  • the applicability of this technique is based on the good separation of the restriction bands, and the sufficient size (> 10 kb) of the main fragments, as well as on the subsequent subcloning of the DNA of these bands (subcloning in small vectors, after additional enzyme restriction, for sequencing).

Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection de la présence ou de la localisation d'un ou plusieurs gènes ou d'une ou plusieurs séquences d'ADN spécifique A ou d'une ou plusieurs molécules réagissant avec l'ADN sur un ADN B, caractérisé en ce que: (a) on fixe et on peigne une certaine quantité dudit ADN B sur une surface de peignage; (b) on fait réagir le produit du peignage B avec une ou plusieurs sondes liées au(x) gène(s) ou aux séquences d'ADN spécifiques A, ou aux molécules susceptibles de réagir avec l'ADN; (c) on prélève l'information correspondant à l'une au moins des catégories suivantes: (1) la position des sondes; (2) la distance entre sondes; (3) la taille des sondes (la somme totale des tailles permettant de quantifier le nombre de sondes hybridées) pour en déduire la présence, la localisation et/ou la quantité des gènes ou des séquences d'ADN spécifique A. Ce procédé peut être utilisé notamment pour le diagnostic de maladies génétiques.

Description

PROCEDE DE DIAGNOSTIC DE MALADIES GENETIQUES PAR PEIGNAGE MOLECULAIRE ET COFFRET DE DIAGNOSTIC
La présente invention concerne notamment un procédé de détection et de positionnement de séquences polynucléotidiques (pouvant contenir ou non des gènes ou parties de gènes) dans un génome ou une partie de génome grâce à la technique dite du peignage moléculaire. La présente invention concerne également un procédé de détection et de positionnement de réactifs d'origine biologique, naturelle ou synthétique, par association desdits réactifs avec tout ou partie de l'ADN peigne.
La technique du peignage moléculaire, telle que décrite dans les références ci-après : PCT/F 95/00164 du 10/02/95 et PCT/FR95/00165 du 10/02/95, appliquée aux acides nucléiques, et plus particulièrement à l'ADN g nomique, permet l'extension uniforme et la visualisation de l'ADN ou de l'ARN sous forme de filaments rectilignes et pratiquement alignés.
La présente invention repose sur la mise en évidence du fait que, grâce à des sondes, c'est-à-dire des polynucléotides contenant un enchaînement de séquences nucleotidiques telles que des molécules d'ADN marquées qui reconnaissent spécifiquement des parties de l'ADN aligné, qu'on hybride sur l'ADN peigné, on peut directement visualiser sur le génome peigné la position de la séquence complémentaire.
Dans ces conditions, il est possible, par exemple en utilisant deux sondes marquées avec des chromophores différents tels que visualisables avec une coloration, rouge et vert par exemple, de mesurer la distance qui les sépare. Mais il est possible également, en utilisant différentes sondes ou une série de sondes contiguè's (ci-après dénommées '"contig"), de mesurer directement la longueur de la zone intéressante, et d'en mesurer les éventuelles altérations dans le cas d'un génome anormal.
La présente invention concerne donc, notamment, le diagnostic des maladies génétiques se caractérisant, de préférence, par des altérations importantes du génome, soit dans sa structure, délétion, translocation par exemple, soit dans le nombre de copies de certaines séquences (trisomie par exemple où la séquence représente la totalité d'un chromosome), ainsi que des procédés permettant de localiser et de caπographiεr rapidement des gènes. Le diagnostic génétique peut être divisé en plusieurs domaines:
- prénatal,
- pathologies à composante génétique,
- cancer et susceptibilité au cancer. Diagnostic nré-natal La majeure partie (95 %) des anomalies fœtales sont ducs à des trisomies ces chromosomes 2 1 , 18, 13 , X ou Y. Leur diagnostic indubitable est pius ou moins tardif (17ème semaine d'aménorrhée, par amniocentésc peir exemple). L amniocentese demande une ponction importante de liquide amniotique (quelques dizaines de millilitres) duquel des cellules fœtales en suspension sont extraites et cultivées pendant plusieurs jouis (voir la technique decnte par S Merciei et J L Bresson (1995) Ann Genêt , 3_S. 151 -157) Un caryotype de ces cellules est elfectuc par observation microscopique et comptage des chromosomes par un personnel très spécialisé.
Une technique faisant appel au prélèvement de villosités choriales permet de se dispenseï de l'étape de mise en culture et évite le piélèvement de liquide amniotique L'analyse du caryotype demande cependant le même travail (voir Médecine Prénatale Biologie Clinique du Foetus Andié Boue, ed Flammarion, 1989) Ces deux techniques peuvent être appliquées plus précocement (jusqu'à 7 semaines de gestation pour le prélèvement de villosités choriales et 13- 14 semaines pour l'amniocentese), mais avec un risque légèrement acciu d'avortement Enfin, un prélèvement direct de sang foetal au niveau du cordon ombilical permet le caryotypage sans culture mais suppose une équipe de cliniciens spécialises dans cette technique (Donner C et al , 1996, Fetal Diagn Ther , I0, 192-199)
D'autres anomalies comme des translocations ou des délétions/insertions de parties importantes de chromosomes peuvent être détectées à ce stade, ou en employant des techniques comme l'hybridation fluorescente in situ (FISH). Cependant, là encoie, ce type de diagnostic ne peut être réalisé que par un personnel très qualifié
Des études montrent, par ailleurs, qu'il n'existe pas encore de méthodes immunologiques permettant la détection de marqueurs foetaux dans le sang maternel permettant un diagnostic indubitable de la trisomie 21 ou d'autres anomalies (voir, par exemple, Wald N J et al , 1996, Br J Obstet Gynaecol , 103, 407-412 pour le syndrome de Down hé à la trisomie 21)
Les diagnostics prénataux actuels ont donc de nombreux désavantages ils ne peuvent être effectués qu'à un stade relativement tardif du développement de l'embryon, ils ne sont pas totalement dénués de risque pour le foetus ou pour la mère, les résultats sont souvent obtenus après un temps assez long (environ 1 à 3 semaines suivant la technique) et sont coûteux Enfin, un certain nombre d'anomalies chromosomiques passent inaperçues. Diagnostic de pathologies à composante génétique
De nombreuses maladies ont une composante génétique reconnue (diabète, hypertension, obésité, etc ) qui est le résultat de delétions, insertions et/ou remaniements chromosomiques de tailles variables La mise en culture de cellules ne pose pas de problème a ce stade, mais les techniques de FISH, décrites par Lichter G D et al. ( 1993), Genomics, 16, 320-324 ; Brandritt B. et al. ( 1991 ), Genomics, 0, 75-82 et Van den Hengh G. et al. ( 1992), Science, 257, 1410- 1412). ont une résolution limitée et font appel à un personnel très qualifié, rendant ces tests peu accessibles.
Le développement d'un test plus performant et bon marché permettrait l'adoption générale de thérapies adaptées, à un stade précoce des pathologies impliquées, susceptible d'améliorer leur rémission. Diagnostic cancéreux
Parmi les pathologies à composante génétique, les affections cancéreuses constituent une classe importante affectant une partie croissante de la population. La compréhension actuelle du processus d'apparition d'un affection cancéreuse fait intervenir une étape de prolifération de proto-oncogènes (mutations dans le génome des cellules) qui précède la transformation de la cellule en cellule cancéreuse. Cette étape de prolifération n'est malheureusement pas détectable, alors que la possibilité d'effectuer un traitement à ce stade augmenterait assurément les chances de rémission et diminuerait le handicap des patients.
Enfin, nombre de tumeurs sont caractérisées par des remaniements chromosomiques tels que translocations, délétions, trisomies partielles ou complètes, etc.
Dans chacun de ces domaines, le peignage moléculaire peut apporter une contribution majeure, soit par la rapidité et la faible quantité de matériel biologique nécessaire, soit par la précision quantitative des résultats.
L'intérêt de la technique apparaît tout particulièrement dans le cas où le matériel génétique provient de cellules qui ne se divisent plus ou ne peuvent être mises en culture, voire de cellules mortes dans lesquelles l'ADN n'est pas significativement dégradé.
Dans le cas du diagnostic prénatal, il en est ainsi après extraction des cellules foetales circulant dans le sang maternel (Cheung et al., 1996, Nature Genetics 14, 264-268). Il en est de même dans le cas de cellules cancéreuses provenant de certaines tumeurs. Le peignage moléculaire permet d'améliorer les possibilités de diagnostic de maladies génétiques, mais il peut également permettre l'étude et la mise en évidence des séquences génomiques responsables desdites maladies. D'ailleurs, actuellement, la mise au point d'un "kit" ou coffret de diagnostic commence par la recherche du gène impliqué dans la pathologie. La recherche de gènes impliqués dans des pathologies (humaines ou autres) est aujourd'hui effectuée en général en plusieurs étapes : (i) Etablissement d'une population cible d'individus atteints par la pathologies, de leurs descendants, ascendants et collatéraux, et prélèvement d'échantillon sanguins et/ou cellulaires en vue du stockage de matériel génétique (sous forme d'ADN ou de souches cellulaires). (ii) Localisation génétique par analyse de probabilité de co-ségrégation avec des marqueurs génétiques (linkage analysis). A ce stade de l'étude, on dispose de quelques marqueurs proches localisés sur un (ou plusieurs) chromosome(s) donné(s) qui permettent de passer à l'étape de localisation physique.
(iii) Cartographie physique : à partir des marqueurs génétiques obtenus à l'étape précédente, un criblage de banques de clones d'ADN humain (YACs, BACs, cosmides ou autres) spécifiques de la ou des régions déterminées à l'étape précédente est effectué. On obtient ainsi un certain nombre de clones contenant les marqueurs précédents. La zone d'intérêt peut être alors cartographiée précisément en utilisant des clones de taille décroissante. Un clonage de la partie du génome considérée peut également être effectuée à nouveau à partir de l'ADN humain.
(iv) Recherche du gène : plusieurs techniques peuvent être utilisées à ce stade: exon "trapping" (utilisation de librairies de cDNA (ADN couplémentaires obtenus à partir d'ARN messager)), ilôts CpG, conservation de séquences interspécifiques, etc, qui permettent d'assigner une séquence codante à l'un (ou plusieurs) des clones sélectionnés aux étapes précédentes.
L'ensemble de cette stratégie représente un travail important (jusqu'à plusieurs années, éventuellement). Aussi, toute technique permettant d'arriver plus rapidement à l'étape (iv) constitue un atout pour la recherche de gènes mais également dans le diagnostic. Dans l'état actuel de la technique, lorsque le gène a été localise, par exemple par la méthode précédente, sa détection est en général effectuée grâce à des sondes spécifiques correspondant à la séquence en cause, celle-ci étant amplifiée par des méthodes de type PCR par exemple ou de type LCR (telle que décrite dans le brevet EP 0 439 182) ou une technique de type NASBA (kit commercialisé par la société Organon Teknika).
Toutefois, les techniques d'amplification ne sont pas totalement satisfaisantes, notamment pour les hétérozygotes, puisqu'il existe une copie normale du gène dans le génome, de même que dans le cas de grande délétion ou de maladies à séquences répétées où la PCR n'est pas non plus satisfaisante. Le diagnostic d'un grand nombre de maladies génétiques peut être maintenant envisagé en mettant en oeuvre le peignage moléculaire et le marquage de l'ADN. Le peignage moléculaire est une technique consistant a ancrer des molécules d'ADN par leurs extrémités sur des surfaces dans des conditions physico- chimiques bien définies, suivi de leur etirement a l'aide d'un ménisque en recession , on obtient ainsi des molécules d'ADN alignées parallèlement L'ADN purifie utilise peut être de toute taille, et donc notamment de l'ADN genomique extrait de cellules humaines Le génome peut également provenir d'un matériel genomique comportant au moins 80 % de matériel génétique d'origine foetale
Les molécules d'ADN ainsi peignées peuvent être dénaturées avant d'être hybπdees avec des sondes d'acides nucléiques marquées par tout moyen approprie, (notamment avec des nucléotides biotine-dUTP, ou digoxygénine-dUTP), lesquelles sont alors révélées, par exemple à l'aide de systèmes d'anticorps fluorescents
Le peignage moléculaire se caractérisant par une extension constante des molécules peignées, la mesure des longueurs des fragments fluorescents observes a l'aide d'un microscope a épifluorescence (par exemple) donne donc directement la taille des fragments de sondes hybrides
Le taux d'extension dépend du type de surface, mais peut être précisément mesure, il est par exemple de 2 kilobases (kb) par micromètre (μm) dans le cas de surfaces silanisées suivant le protocole décrit dans la référence (1) et mis en oeuvre dans les exemples Lorsque cela est nécessaire, il est possible de prévoir un standard interne, c'est-a-dire un ADN de longueur connue dit de calibrage, qui permettra d'étalonner la manipulation, c'est-à-dire de calibrer chaque mesure
La présente invention, qui comporte différents modes de mises en oeuvre, concerne essentiellement un procède de détection de la présence ou de la localisation d'un ou plusieurs gènes ou d'une ou plusieurs séquences d'ADN spécifique A ou d'une ou plusieurs molécules réagissant avec l'ADN sur un ADN B, caractérise en ce que
(a) on fixe et on peigne une certaine quantité dudit ADN B sur une surface de peignage,
(b) on fait reagir le produit de peignage B avec une ou plusieurs sondes marquées, liées au(x) gene(s) ou aux séquences d'ADN spécifiques A ou aux molécules susceptibles de réagir avec l'ADN,
(c) on prélevé l'information correspondant à l'une au moins des catégories suivantes
(1) la position des sondes,
(2) la distance entre sondes,
(3) la taille des sondes (la somme totale des tailles permettant de quantifier le nombre de sondes hybπdees) pour en déduire la présence, la localisation et/ou la quantité des gènes ou des séquences d'ADN spécifique A Dans la présente description, la technologie de peignage fait référence à la technologie décrite dans les documents mentionnés précédemment, de même que la notion de "surface de peignage" qui correspond à une surface traitée permettant l'ancrage de l'ADN et son étirement par un ménisque en récession. II faut noter que la surface de peignage est, de préférence, une surface plane sur laquelle les lectures sont plus commodes.
Par "réaction entre les sondes marquées et l'ADN peigné", on entend toute réaction chimique ou biochimique, en particulier des réactions de type immunologique (par exemple anticorps dirigé contre de l'ADN méthylé), des réactions protéines/ADN ou acides nucléiques/ADN (par exemple l'hybridation entre segments complémentaires) ou acides nucléiques/ ARN, ou acides nucléiques/hybrides ARN-ADN. On citera également pour exemple les réactions de liaison chimique ADN-ADN utilisant des molécules de psoralène ou les réactions de polymérisation d'ADN à l'aide d'une enzyme polymérase. L'hybridation est, en général, précédée d'une dénaturation de l'ADN fixé et peigné, cette technique est connue et ne sera pas décrite en détail.
Par "sonde", on entend aussi bien désigner un polynucléotide mono ou bicaténaire, comportant au moins 20 nucléotides de synthèse ou un fragment d'ADN genomique, qu'un "contig", c'est-à-dire un ensemble de sondes qui sont contiguës ou chevauchantes et recouvre la zone en cause, ou plusieurs sondes séparées, marquées ou non. On entend également par "sonde" toute molécule liée de façon covalente ou non à l'une au moins des entités précédentes, ou toute molécule biologique, naturelle ou synthétique, pouvant réagir avec l'ADN, le sens donné au terme "réaction" ayant été précisé ci-dessus, ou toute molécule liée de façon covalente ou non à toute molécule pouvant réagir avec l'ADN.
De façon générale, les sondes pourront être mises en évidence par tout procédé approprié, il peut s'agir notamment de sondes marquées ou bien de sondes non marquées dont la présence sera mise en évidence par des moyens appropriés. Ainsi, dans le cas où les sondes seraient marquées par des cytosines méthylées, elles pourraient être révélées, après réaction avec le produit du peignage, par des anticorps fluorescents dirigés contre ces cytosines méthylées. Les éléments assurant le marquage pourront être radioactifs mais seront, de préférence, des marquages froids, par fluorescence par exemple. Il peut également s'agir de sondes nucleotidiques dont certains atomes sont remplacés. La taille des sondes pourra s'entendre de toute valeur mesurée avec une unité extensive, c'est-à-dire telle que la taille de deux sondes égale la somme des tailles des sondes prises séparément. Un exemple est donné par la longueur, mais une intensité de fluorescence pourra par exemple être utilisée. La longueur des sondes utilisées est comprise, par exemple, entre 5 kb et 40-50 kb, mais peut également être constituée par la totalité du génome peigné.
Avantageusement, dans le procédé conforme à l'invention, au moins l'une des sondes est un produit d'intérêt thérapeutique susceptible d'interagir avec l'ADN. De préférence, la réaction de la sonde avec l'ADN peigné est modulée par une ou plusieurs molécules, solvants ou autres paramètres pertinents.
Enfin, de façon générale, dans ce qui va suivre on parlera de "génome", il faut bien entendre qu'il s'agit d'une simplification, toute séquence d'ADN ou d'acides nucléiques susceptible d'être fixée sur une surface de peignage est englobée dans cette terminologie.
En outre, le terme de "gène" sera parfois utilisé indifférem-ment pour désigner une "partie de gène" d'origine genomique ou bien une "séquence polynucléotidique" synthétique spécifique.
Dans un premier mode de mise en oeuvre, le procédé selon l'invention est utilisé pour permettre le diagnostic de cassures dans un génome, de même que pour le clonage positionnel de telles cassures. Il convient de remarquer que le terme "cassure" recouvre un grand nombre de modifications locales du génome dont la liste sera explicitée plus loin.
Le procédé selon la présente invention consiste à déterminer la position des éventuels points de cassure impliqués dans une pathologie d'origine génétique par hybridation sur ADN genomique peigné de patients atteints de la dite pathologie, d'une sonde genomique de taille connue (clonée ou autre) située dans la région du gène recherché. Ces points de cassure consistent en points dans la séquence génétique dont l'environnement change sur plusieurs kilobases (kb) entre individu sain et individu malade.
Le principe de définition du point de cassure repose sur la possibilité de détecter par peignage moléculaire une modification locale du génome étudié par rapport à un génome déjà étudié, au niveau de la ou des régions considérées.
La mise au point de méthodes de repérage de modifications locales du génome de tailles inférieures à 1 kb est ainsi envisageable à l'aide de techniques d'observation en champ proche (AFM, STM, SNOM, etc.) ou possédant une résolution intrinsèquement supérieure (par exemple, microscopie électronique de nano billes d'or).
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de mise en évidence d'une anomalie génétique de cassure dans un génome, caractérisé en ce que: (a) on fixe et on peigne une certaine quantité dudit génome sur une surface de peignage, (b) on hybride le produit de peignage avec une ou plusieurs sondes spécifiques marquées correspondant à la séquence genomique dont on cherche l'anomalie, (c) on mesure la taille des fragments correspondant aux signaux d'hybridations et éventuellement leur répétition, et
(d) on en déduit la présence d'une cassure, soit par mesure directe soit par comparaison avec un étalon correspondant à une longueur témoin. A titre d'illustration, la mesure de la taille des fragments conduit à un histogramme, c'est-à-dire une représentation graphique des longueurs des fragments observés.
Afin de réaliser un histogramme de la sonde, on évalue le nombre de clones présentant une longueur de sonde déterminée. En principe l'histogramme ne comporte qu'un ou deux pics suivant le type de cassure analysée, deux pics lorsque la sonde s'hybride en deux fragments séparés et un seul pic lorsqu'elle s'hybride en un seul fragment.
Dans le cas d'un génome hétérozygote, dont l'un des allèles est normal pour la région considérée, la signature de l'allèle normal (l'absence de cassure) se superpose à celle de l'allèle anormal, mais peut être extraite du fait qu'elle est connue.
Ce procédé peut être également utilisé pour effectuer du clonage positionnel, c'est-à-dire pour déterminer la position d'un ou plusieurs gènes inconnus impliqués dans une pathologie. Le principe consiste, comme précédemment, à hybrider des clones d'ADN humain, ou animal ou végétal, servant alors de sonde sur l'ADN genomique peigné d'un ou de plusieurs patients atteints de la pathologie étudiée. La révélation de ces hybridations permet de mesurer la taille des fragments hybrides et de construire un histogramme des différentes tailles observées. Si le clone utilisé comme sonde recouvre un point de cassure du gène, la signature de ce phénomène sera lisible sur la longueur (plus petite) du fragment hybride. L'utilisation d'un nombre limité de clones spécifiques de la région incriminée qui pourra avoir été déduite par analyse de liaison génétique ("linkage analysis"), permettra ainsi une détermination rapide et précise de la position d'un point de cassure, d'une délétion ou de tout autre remaniement génétique de taille suffisante pour être résolue par la technique de détection associée au peignage moléculaire. Dans ce cas évidemment, on recherche la cassure afin de la cartographier, dans le diagnostic la cassure est connue, c'est sa présence ou son absence qui est recherchée.
Deux cas de figure peuvent se présenter (dans l'hypothèse où il existe un point de cassure dans la région du génome impliquée dans le pathologie): (i) la sonde ne chevauche pas le point de cassure, (ii) la sonde chevauche le point de cassure.
Dans le cas (i), la mesure des longueurs des sondes fluorescentes est comparable à celle qui serait obtenue avec la même sonde hybridée sur un ADN genomique non pathologique de même nature (c'est-a-dire essentiellement, de même taille et prépare dans les mêmes conditions)
Dans le cas (n), au contraire, la sonde étant systématiquement hybπdee sur deux morceaux (ou davantage) sépares dans l'ADN genomique peigne (par définition de l'existence d'un point de cassure), la mesure des longueurs des sondes fluorescentes hybπdees se distingue du résultat obtenu par hybridation sur un ADN genomique non pathologique De surcroît, la taille des fragments hybrides sur l'ADN pathologique permet d'estimer la position du point de cassure au sein du clone avec une précision de quelques kb, voire davantage, si une technique plus résolutive est utilisée De ce fait, il ne reste alors plus qu'a rechercher le gène dans ce clone
Pratiquement, il s'agira de repeter ces mesures pour l'ensemble des clones susceptibles de recouvrir partiellement la zone correspondant au gène Le nombre de lames d'hybridations pourra être réduit en hybπdant simultanément plusieurs sondes marquées différemment, ou en utilisant une méthode de codage par combinaison de couleurs, comme cela sera décrit ci-apres
Cette technique permet de déterminer la position des éventuels points de cassure de la région du génome impliquée dans une pathologie génétique par hybridation d'ADN genomique clone sur de l'ADN genomique peigné provenant de patients Cette technique s'applique donc à la recherche de régions du génome responsables de pathologies dues à la déletion d'une partie ou de la totalité de cette région du génome, la translocation de toute ou partie de cette région du génome, la duplication ou présence de plusieurs copies de toute ou partie de cette région du génome en son sein ou en tout autre endroit du génome, - l'insertion de toute séquence génétique a l'intérieur de cette région du génome
Dans un second mode de mise en oeuvre et dans certains cas particuliers, notamment lorsque l'anomalie génétique recherchée comporte des deletions importantes ou des duplications (cas des trisomies par exemple), le procède objet de la présente invention peut être modifié puisqu'il s'agit alors de doser les gènes ou une séquence particulière
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procède de dosage d'une séquence genomique déterminée dans un génome, caractérise en ce que (a) on fixe et on peigne une certaine quantité dudit génome sur une surface de peignage, (b) on hybride le produit de peignage avec une sonde témoin marquée de longueur lt correspondant a une séquence genomique dite témoin, c'est-a-dire dont on connaît le nombre de copies dans le génome, et avec une sonde spécifique marquée de longueur le correspondant a la séquence genomique a doser, de sorte que lesdites sondes pourront être identifiées séparément,
(c) on mesure alors la longueur totale des signaux d'hybridation pour les deux sondes, soit Le et Lt,
(d) on calcule pour chacune le nombre de copies de la séquence correspondant par le rapport
Lt Le
Nt = et Ne
lt le
et on en déduit le nombre de copies de la séquence à doser par rapport à la séquence témoin.
Dans le cas du diagnostic prénatal de la trisomie 21, la méthode pourra consister en l'hybridation d'une sonde cosmidique spécifique d'un chromosome témoin (chromosome 1 , par exemple- sonde de longueur lt) marquée avec des nucléotides biotinilés, et l'hybridation d'une sonde cosmidique spécifique du chromosome 21 (sonde de longueur le) marquée à la digoxygénine sur de l'ADN genomique peigné extrait de prélèvements amniotiques, ou de tout autre prélèvement contenant des cellules d'origine foetale. Par exemple, on pourra utiliser un système de révélation avidine-Texas
Red (couleur rouge) pour la sonde témoin et antidigoxygénine-FITC (couleur verte) pour la sonde spécifique: la longueur totale des signaux d'hybridation rouges observés dans une zone donnée de la surface, LT, et la longueur totale des signaux d'hybridation verts observés dans la même zone, ou dans une zone équivalente de la surface, LC, conduisent donc aux nombres Nt et Ne définis ci-dessus
Le rapport Nc/Nt proche de 1 signalera un génotype normal (2 chromosomes 21 pour 2 chromosomes 1), alors qu'un rapport proche de 1,5 signalera un génotype trisomique (3 chromosomes 21 pour 2 chromosomes 1).
De façon générale, une différence significative entre Ne et la valeur attendue pour le nombre de génomes présents déduit de Nt est l'indication de la présence d'une anomalie génique.
Dans le cas du diagnostic d'oncogènes ou proto-oncogènes, la même méthode pourra être employée: une sonde témoin sera hybridée et révélée en rouge par exemple et une sonde correspondant au gène ou à une partie du gène recherché sera hybridée et révélée en vert par exemple. Après les mesures effectuées comme ci-dessus, le rapport Nc Nt donnera l'abondance relative du gène par rapport à la fréquence de deux copies par génome diploïde. La méthylation aberrante des ilôts GpC observée fréquemment dans de nombreux cancers (92% des cancers du colon) peut aussi être détectée par le procédé selon l'invention par réaction entre l'ADN peigné et des anticorps fluorescents dirigés contre les cytosines méthylées. En effet, la perte de l'hétérozygotie sur le chromosome 9p21 est l'une des altérations génétiques les plus fréquentes identifiées dans les cancers humains. Le gène suppresseur de tumeur CDKN2/p 16/MTS 1 localisé dans cette région est fréquemment inactivé dans beaucoup de cancers humains par déletion homozygote. Toutefois, on a rapporté un autre mode d'inactivation qui implique la perte de la transcription associée avec une méthylation de novo des ilôts 5' GpC de CDKN2/p l6 dans les cancers des poumons, les gliomes et les carcinomes à desquamation de la tête et du cou. Ces méthylations aberrantes des ilôts GpC arrivent également fréquemment dans des lignées cellulaires de cancers du sein (33%), de la prostate (60%), du rein (23%) et du colon (92%) (Herman J.G. et al. (1995) Cancer Res., Oct. 15, 55(20) : 4525-30 ; Wales M.M. et al. (1995) Nature Med., Jun., 1(6) : 570-607).
La localisation précise des aires de méthylation sur un gène est d'une très grande importance pour la compréhension du mécanisme du développement du cancer et pour un test de "screening" possible. Le peignage moléculaire peut détecter avec une précision de quelques kb la localisation de tels ilôts GpC impliqués dans le développement du cancer.
Cette technique permettant de déterminer le nombre de copies d'un gène dans un génome peut éventuellement être utilisée pour détecter l'absence d'une partie du génome.
Dans le cas d'une pathologie caractérisée par la déletion d'une partie importante d'un chromosome, il suffit en effet de prendre pour séquence cible un clone contenu dans la zone délétée, et pour séquence témoin un clone extérieur à cette zone. Il est de la sorte possible de détecter des délétions de la taille d'un clone cosmidique (30-50 kb) ou supérieure.
Si l'on dispose d'une densité de molécules peignées suffisante, il est envisageable de détecter des déletion plus petites (quelques kb), correspondant à une partie de la séquence cible utilisée. C'est la raison pour laquelle il est particulièrement intéressant de disposer, sur la surface peignée, au moins une dizaine de copies de génome.
L'incertitude statistique sur le rapport Nc/Nt est d'ordre
Figure imgf000013_0001
1/VNt. Avantageusement, il convient de disposer sur la surface peignée d'un nombre suffisant de signaux pour avoir une incertitude statistique de moins de 20 % sur le rapport Nc/Nt. Il importe donc d'avoir un grande nombre de sondes hybridées, typiquement Ne, Nt > 100. Cependant, dans la pratique, il est aussi possible d'augmenter la précision de ces mesures en utilisant, non pas un mais plusieurs types de sondes témoins et de sondes cibles, sans nécessairement chercher à distinguer entre ces types de sondes, c'est- à-dire en les révélant toutes de la même façon. La possibilité d'obtenir un tel nombre de signaux a été démontrée: il est possible de recenser une centaine de signaux sur une surface de verre silanisée de 20 x 20 mm de surface utile. Cette densité pourra être considérablement augmentée dès lors qu'on dispose d'une quantité importante d'ADN.
Il apparaît qu'un nombre suffisant de génome par surfaces de 20 x 20 mm d'aire utile se situe aux alentours de 100, lorqu'une seule sonde est utilisée. Dans le cas de l'utilisation de plusieurs sondes, ou de sondes plus grandes, il est envisageable de pouvoir réduire soit:
- la surface de peignage et donc la surface analysée.
- la densité d'ADN utilisée, donc le nombre de génomes peignés en surface. Suivant la contrainte principale (rapidité exigée, ou ADN en quantité limitée), l'une ou l'autre de ces deux voies pourra être utilisée.
La technique exposée implique l'utilisation de protocoles de préparation stricts mais sans difficultés techniques particulières. Au niveau de l'analyse des signaux, aucune qualification particulière n'est nécessaire, rendant de la sorte la technique genéralisable à tous les laboratoires possédant un personnel avec des compétences minimales en biologie moléculaire.
Quelques centaines de milliers de cellules devraient en principe suffire pour préparer une solution d'ADN genomique conduisant à une densité importante de molécules peignées sur les surfaces d'analyse. Il n'est donc plus en principe nécessaire de réaliser de cultures cellulaires dans la plupart des cas. L'ensemble prélèvement-analyse devrait donc pouvoir être réalisé en quelques jours.
La simplicité des signaux à analyser (parallèles et distincts du bruit de fond d'hybridation) permet d'envisager une automatisation complète du processus d'analyse des signaux (scan des surfaces, acquisition et exploitation des mesures). L'intégration avec un système de stockage de surfaces correspondant à différents patients permet d'envisager des rendements important, donnant la possibilité de fournir divers types de diagnostics en quelques jours.
Le procédé décrit précédemment peut permettre différents types de diagnostics: comptage de chromosome (trisomie, monosomie, etc.), comptage des exemplaires d'un gène, détection de délétions connues, ou autres modifications chromosomiques se traduisant par une modification de la longueur hybridée d'une sonde genomique donnée par génome. Il est à noter qu'il est aussi possible de détecter une déletion partielle sur un seul allèle.
Il est pareillement possible d'effectuer l'hybridation de clones sur plusieurs génomes différents peignés sur une même surface. Par exemple, le peignage simultané du génome d'un organisme principal et du génome d'organismes hôtes (parasites, bactéries, virus ...) et l'utilisation de sondes spécifiques, d'une part de l'organisme principal, et, d'autre part des organismes hôtes, permet en principe de déterminer le rapport nombre d'hôtes/nombre de cellules de l'organisme principal. Dans le cas d'un organisme infecté par un virus, cela permet la mesure de la charge virale. Les chiffres cités plus haut limitent probablement la sensibilité de cette méthode de diagnostic à des situations où l'on trouve plus d'un organisme infectieux pour 100 cellules hôtes environ.
Ces différents types de diagnostics peuvent être combinés grâce à l'utilisation de systèmes de révélation multiples (plusieurs couleurs, ou combinaison de couleurs), ou tout autre méthode permettant la distinction entre les signaux d'hybridation provenant de sondes distinctes et destinées à un diagnostic précis.
La présente invention concerne également des "kits" de diagnostic comportant au moins l'un des éléments suivants :
• une surface de peignage, • des sondes marquées ou destinées à être marquées, correspondant aux anomalies à détecter,
• un dispositif permettant le peignage de l'ADN,
• un génome témoin et/ou des sondes témoins, ledit génome étant éventuellement fixé sur la surface à peigner, • un ou plusieurs résultats particuliers obtenus en utilisant les protocoles précédents dans une ou plusieurs situations témoins, de façon à fournir une grille d'interprétation des résultats obtenus dans les diagnostics effectifs, par exemple sous la forme d'un système expert (par exemple logiciel),
• un système expert permettant de faciliter la réalisation de diagnostics selon le procédé de l'invention.
Le principe de la technique reposant sur le peignage de l'ADN du patient, cette étape de préparation de l'ADN nécessite des protocoles d'extraction, peignage et le matériel correspondant (surfaces traitées, appareil de peignage moléculaire).
L'invention a également pour objet un ADN genomique ou une partie d'ADN genomique capable de réagir, dans des conditions de peignage moléculaire, avec une sonde correspondant à un produit de transcription ou de traduction ou de régulation.
Le diagnostic lui-même nécessite l'hybridation de sondes nucleotidiques spécifiques et la révélation de ces sondes, par exemple par des systèmes d'anticorps. Un codage par couleur pouvant en outre être effectue dans le cas de diagnostics combines, il est donc possible de proposer des lots de sondes pre-marquees correspondant a un catalogue de diagnostics particuliers
L'analyse nécessitant la mesure de la longueur des signaux ou plus généralement de l'une des trois catégories d'information décrites précédemment, un système d'analyse de ces signaux (logiciel et matériel automatique) fait également partie de cette invention
Dans un troisième mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne un procédé permettant notamment la cartographie physique d'un génome Le but de la cartographie physique étant l'ordonnancement de clone au sein d'un génome, le peignage moléculaire s'applique naturellement à cet objectif, par simple hybridation des clones sur le génome peigné (par exemple, dans le cas d'un YAC, le génome entier de la levure peut être peigné, pour faire l'économie de la séparation du chromosome artificiel des chromosomes naturels de la levure) La position des clones est obtenue par mesure directe de leur distance a un clone de référence, ou à tout autre signal d'hybridation de référence sur le génome peigné L'extension constante de l'ADN peigné permet alors d'établir directement en kilobases (kb) la position respective des clones ainsi que leur taille, lorsque celle-ci dépasse la résolution de la méthode Notamment, dans le cas de la microscopie classique par épifluorescence, dont la résolution est d'une demi-longueur d'onde, la cartographie précise d'ADNc (ADN complémentaire des ARN transcrits dans la cellule) est possible, mais sans possibilité de mesure précise de la taille des fragments hybrides (exons), qui est de l'ordre de quelques centaines de bases en général Cependant, par cette méthode, la localisation précise au sein de l'ADN genomique de fragments d'ADNc complets ou de leurs fragments peut être obtenue Par exemple, on peut déterminer la présence ou l'absence et la position des ADNc correspondant à une protéine d'intérêt par hybridation des ADNc sur l'ADN genomique ou sur un clone d'ADN genomique (cosmide, BAC, YAC, par exemple) en même temps qu'un clone servant de repère
L'utilisation de multiples fragments obtenus à partir d'un ADNc conduit au repérage de la présence ou non d'un ou plusieurs ADN genomiques dans un vecteur de type cosmide ou YAC par exemple
L'emploi de méthodes plus résolutives peut permettre une mesure supplémentaire de la taille des sondes (champ proche, microscopie électronique, etc ), mais une mesure de l'intensité de fluorescence, s'il s'agit du mode d'observation choisi, peut également fournir cette information
La méthode que nous proposons permet de minimiser le nombre d'hybridations nécessaires à l'ordonnancement d'un nombre donne de clones, étant donne un nombre fixé de couleurs de révélation des hybridations, ou (plus généralement) de modes distincts de révélation des hybridations.
L'invention concerne un procédé, caractérisé en ce que :
(a) on fixe et on peigne une certaine quantité dudit génome sur une surface de peignage,
(b) on hybride le produit de peignage avec des sondes marquées avec des éléments radioactifs, fluorescents ou autres, tels que billes, particules, etc. correspondant à chaque clone, de sorte que lesdites sondes pourront être révélées spécifiquement, par une couleur notamment, (c) on prélève l'information correspondant à la place de chaque clone ainsi que les tailles et les distances correspondantes sur le génome, (d) on réitère les opérations b) et c) n fois en modifiant la couleur, le marquage ou le mode de révélation des sondes, sachant qu'avec pcouleurs, marquages ou modes de révélation différents, au bout de n hybridations on peut positionner pn clones. Dans le cadre des méthodes standards de cartographie, le nombre I d'hybridations nécessaires pour cartographier N clones à l'aide de p marquages, couleurs ou modes de révélation, croît linéairement avec le nombre de clones N.
Ainsi, avec 3 couleurs, il est aujourd'hui nécessaire d'effectuer au moins 15 hybridations du type précédent pour cartographier 30 clones. Ce nombre d'hybridation est important, et le nombre de couleurs disponibles est en pratique limité (même en utilisant des combinaisons de fluorophores). Par ailleurs, une fois la totalité des mesures accomplies, il faut procéder à la sélection des différentes positions possibles des clones, ce qui peut ne pas être toujours aisé, si l'on tient compte des incertitudes de mesure. La méthode proposée ici permet de cartographier un nombre de clone croissant exponentiellement avec le nombre d'hybridations effectuées.
A titre d'illustration, le schéma de la figure 10 représente le résultat de deux hybridations de 4 clones révélés avec 2 couleurs différentes d'une hybridation à l'autre (pour la moitié d'entre eux). Les 4 clones hybrides forment un canevas coloré de façon différente d'une hybridation à l'autre, les clones étant repérable via leur codage (binaire dans ce cas). Dans cet exemple de 4 clones, il suffit d'un code composé d'une succession de 2 couleurs pour distinguer chaque clone : A = Rouge puis Rouge B = Vert puis Vert C = Rouge puis Vert D = Vert puis Rouge
De 5 à 8 clones, 3 hybridations seront nécessaires, pour distinguer les clones par une succession de 3 couleurs. Plus généralement, à l'aide de p couleurs, pour cartographier N clones, il suffira d'un nombre d'hybridations I tel que : N = p'
Par comparaison avec la méthode standard, 30 clones pourront être cartographiés en 5 hybridations (au lieu de 30) si l'on ne dispose que de 2 couleurs, et en seulement 4 hybridations (au lieu de 15) si l'on dispose de 3 couleurs.
Le principe de cartographie présenté ici est simple. Cependant, afin de surmonter certains artefacts expérimentaux possibles (dispersion de tailles des signaux, variabilité de la saturation, cassure des molécules, etc.), l'on utilisera avec avantage un logiciel de traitement d'images et d'analyse statistique adéquat. Les exemples ci-après permettront de mieux comprendre d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
Enfin, dans un quatrième mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne un procédé permettant notamment la détection ou le positionnement de produits susceptibles de réagir avec l'ADN peigné. Par exemple, des protéines de régulation de la transcription de gène se liant à l'ADN au cours du cycle cellulaire ou non pourront être détectées sur ADN peigné, et leurs sites de liaison préférentielle déterminés par rapport à la position de séquences connues et repérées, par exemple, suivant le procédé précédent de mise en oeuvre de l'invention.
De façon analogue, des molécules d'intérêt thérapeutique susceptibles de réagir avec l'ADN pourront être détectées sur ADN peigné ; leur effet sur d'autres molécules susceptibles de réagir avec l'ADN pourrait également être étudié par comparaison.
Parmi les molécules susceptibles de réagir avec l'ADN peigné, il faut citer les protéines de régulation telles que décrites par : • Laughon et Matthew (1984), Nature, 310 : 25-30 pour les protéines de régulation s'attachant sur de l'ADN de drosophile,
• Struhl K. et al. (1987), Cell, 5_0_: 841-846 pour des protéines de régulation se liant à l'ADN dans leur domaine de liaison spécifique (« binding-domain »).
Ces molécules peuvent également être des intercalants ou des molécules modifiant l'ADN comme décrits par :
• Echols H. et al. (1996), Science, 222 : 1050-1056 sur les multiples interactions de l'ADN induisant, par exemple, des transcriptions ;
• dans la revue An. Rev. of Bioch. (1988), 57, : 159-167, Gross et Ganard décrivent l'hypersensibilité des sites nucléases dans la chromatine ; • Hanson et al. (1976), Science, 193 : 62-64 décrivent le psoralène comme agent photoactif dans le clivage sélectif des séquences nucleotidiques ;
• Cartwright et al. (1984), NAS, K) : 5835-5852. L'invention concerne également toute molécule, solvant ou procédé relié à un paramètre mis en évidence par l'un des procédés ci-dessus décrits conformément à l'invention.
Légendes des figures Figure l a: Illustration du cas d'un clone (rouge) chevauchant le gène (et donc le point de cassure) recherché. Les zones hachurées doivent être imaginées comme absentes, ce qui implique notamment que lorsque deux segments de sondes se trouvent de part et d'autre, ils ne font en fait qu'un segment d'une longueur égale à la somme de leurs longueurs.
Le(s) chromosome(s) sousjacents sont représentés par des barres blanches. (a) situation chez un patient sain.
(bl) délétion(s) d'une partie du gène. (b2) déletion de la totalité du gène.
(cl ) et (c2) translocation d'une partie du gène. (c3) translocation de la totalité du gène.
(d l ) duplication(s) d'une partie du gène (éventuellement avec inversion). (d2) duplication(s) de la totaiité du gène (éventuellement avec inversion). (d3) répétition(s) d'une partie du gène dans une autre partie du génome, (e) insertion(s) dans le gène, d'une partie différente du gène (et du génome clone).
Figure 1b: Histogrammes idéaux des longueurs de clones hybrides correspondant aux situations précédentes. Dans tous les cas (un ou deux pics), la situation est clairement distinguable de celle du clone entier (a).
Les histogrammes de cette figure correspondent aux signaux de l'allèle anormal et sont donc obtenus après soustraction de la contribution due à l'allèle normal, figurée en (a), des histogrammes bruts, représentés sur la figure l e. En abscisse figure la taille des fragments hybrides, l'échelle (arbitraire) reprenant celle de la figure la. En ordonnée figure le nombre de fragments observés, en unité arbitraire, seules important les proportions entre les différentes populations.
Figure le: Histogrammes idéaux des longueurs de clones hybrides correspondant aux situations précédentes et tenant compte de l'allèle normal. La contribution de l'allèle normal est représentée par le pic correspondant à la position du cas normal représenté en (a). Lorsque l'allèle anormal contribue à augmenter la valeur de ce pic (cas (d3)), la contribution de l'allèle normal peut être en général estimée équivalente à la valeur d'un pic anormal.
Figure 2a: Illustration du cas d'un clone chevauchant partiellement le gène recherché.
(a) situation chez un patient sain. (bl) délétion(s) d'une partie du gène. Une autre situation n'a pas été représentée, où la partie délétée est incluse entièrement dans le clone (cf cas correspondant du schéma 1 a).
(b2) déletion de la totalité du gène. (cl ) et (c2) translocation(s) d'une partie du gène. Une autre situation. correspondant au cas (c2) du schéma la n'a pas été représentée, où la partie transloquée est entièrement comprise dans le clone.
(c3) translocation(s) de la totalité du gène. (dl) duplication(s) d'une partie du gène repérée par une double flèche (la partie dupliquée est entièrement incluse dans le clone). (d2) duplication(s) d'une partie du gène avec inversion. (d3) duplication(s) d'une partie du gène (la partie dupliquée est partiellement incluse dans le clone).
(d4) duplication(s) de la totalité du gène (sans inversion). (d5) répétition(s) d'une partie du gène dans une autre partie du génome.
(e) insertion(s) dans le gène d'une partie différente du gène (et du génome clone).
Figure 2b: Histogrammes idéaux des longueurs de clones hybrides correspondant aux situations précédentes. Dans tous les cas (un ou deux pics), la situation est clairement distinguable de celle du clone entier (a). Les histogrammes de cette figure correspondent aux signaux de l'allèle anormal et sont donc obtenus après soustraction de la contribution due à l'allèle normal, figurée en (a), des histogrammes bruts, représentés sur la figure 2c. En abscisse figure la taille des fragments hybrides, l'échelle (arbitraire) reprenant celle de la figure 2a. En ordonnée figure le nombre de fragments observés, en unité arbitraire, seules importent les proportions entre les différentes populations.
Figure 2c: Histogrammes idéaux des longueurs de clones hybrides correspondant aux situations précédentes et tenant compte de l'allèle normal. La contribution de l'allèle normal est représentée par le pic correspondant à la position du cas normal représenté en
(a). Lorsque l'allèle anormal contribue à augmenter la valeur de ce pic (cas (d4) et (d5)), la contribution de l'allèle normal peut être en général estimée équivalente à la valeur d'un pic anormal.
Figure 3a: Illustration du cas d'un clone inclus totalement dans le gène recherché.
(a) situation chez un patient sain.
(bl ) délétion(s) d'une partie du gène. Une autre situation n'a pas été représentée, où la partie délétée est incluse entièrement dans le clone (cf cas correspondant du schéma la).
(b2) déletion de la totalité du gène.
(cl ) et (c2) translocation(s) d'une partie du gène. Une autre situation, correspondant au cas (c2) du schéma la n'a pas été représentée, où la partie transloquée est entièrement comprise dans le clone. (c3) translocation(s) de la totalité du gène. (dl) duplication(s) d'une partie du gène repérée par une double flèche (la partie dupliquée est entièrement incluse dans le clone). (d2) duplication(s) d'une partie du gène avec inversion. (d3) duplication(s) d'une partie du gène (la partie dupliquée est partiellement incluse dans le clone). (d4) duplication(s) de la totalité du gène (sans inversion).
(d5) répétition(s) d'une partie du gène dans une autre partie du génome.
(e) insertion(s) dans le gène d'une partie différente du gène (et du génome clone).
Figure 3b: Histogrammes idéaux des longueurs de clones hybrides correspondant aux situations précédentes. Dans tous les cas (un ou deux pics), la situation est clairement distinguable de celle du clone entier (a).
Les histogrammes de cette figure correspondent aux signaux de l'allèle anormal et sont donc obtenus après soustraction de la contribution due à l'allèle normal, figurée en (a), des histogrammes bruts, représentés sur la figure 3c. En abscisse figure la taille des fragments hybrides, l'échelle (arbitraire) reprenant celle de la figure 3a. En ordonnée figure le nombre de fragments observés, en unité arbitraire, seules important les proportions entre les différentes populations.
Figure 3c: Histogrammes idéaux des longueurs de clones hybrides correspondant aux situations précédentes et tenant compte de l'allèle normal. La contribution de l'allèle normal est représentée par le pic correspondant à la position du cas normal représenté en
(a). Lorsque l'allèle anormal contribue à augmenter la valeur de ce pic (cas (c3), (d2),
(d3) et (d5)), la contribution de l'allèle normal peut être en général estimée équivalente à la valeur d'un pic anormal.
Figure 4: Histogrammes des longueurs du modèle en escalier. Etude de l'influence de la taille caractéristique.
Figure 5: Histogrammes des longueurs du modèle en escalier. Etude de l'influence du taux de cassure.
Figure 6: Histogrammes des longueurs du modèle gaussien. Etude de l'influence de la taille caractéristique. Figure 7: Histogrammes des longueurs du modèle gaussien. Etude de l'influence du taux de cassure.
Figure 8: Simulation d'histogrammes dans le cas de l'hybridation d'un BAC (125 kb) sur un point de cassure :
(a) fragments de 35 et 90 kb ; (b) fragments de 50 et 75 kb ; (c) fragments de 60 et 65 kb, (d) situation témoin ; (e) histogramme réel d'un contig de clones cosmidiques hybrides sur de l'ADN genomique humain (longueur du contig : environ 77,5 μm, soit 155 kb). L'axe des abscisses représente la taille des fragments en microns. L'axe des ordonnées représente le nombre de fragments continus de sondes hybridées. Figure 9: illustration du principe de la cartographie sans codage couleur. Chaque ligne représente le positionnement possible du nouveau sous-clone cartographie par rapport à celui avec lequel il est hybride. L'orientation des deux premiers clones est arbitraire. A chaque étape, deux positions de part et d'autre de l'ancien clone utilisé sont possibles pour le nouveau clone hybride. Figure 10: illustration du principe de la cartographie avec codage couleur. A chaque hybridation, les mêmes sous-clones sont hybrides, donnant lieu à un même motif (canevas) d'hybridation si l'on fait abstraction de l'information de couleur. Les deux palettes de couleur utilisées permettent de repérer sans ambiguïté chacun des sous- clones (principe du codage). Figure 1 1 : De l'ADN genomique total de levure contenant un chromosome artificiel (YAC774G4) a été peigné sur des surfaces traitées. Des cosmides appartenant à deux contigs voisins séparés par un intervalle inconnu ont été hybrides deux par deux de façon à pouvoir reconstituer une carte précise de leur disposition. Parmi les cosmides utilisés, 1F1 1 contient la majeure partie de la séquence du gène de la calpaine 3 dont les mutations sont responsables de la myopathie des ceintures de type 2A. La figure montre des images caractéristiques de chaque hybridation (un cosmide étant hybride et révélé en rouge, à gauche, l'autre en vert, à droite) ainsi que la carte reconstituée à partir des mesures, à environ 3 kb près. L'échelle est donnée par la barre de 20 kb. Cette expérience a notamment permis de corriger une carte de la région obtenue à l'aide de STSs (Richard et al., 1995, Mammalian Génome, 6, 754-756) et d'obtenir l'orientation chromosomale du gène.
Figure 12 : De l'ADN genomique total humain a été peigné sur des surfaces traitées. Des cosmides appartenant à 3 contigs voisins de la région du chromosome 9 contenant le gène (non clone) de la "Tuberous Sclerosis 1" (TSC 1) ont été hybrides deux par deux et révélés en 2 couleurs différentes afin de mesurer la taille des intervalles séparant ces contigs. La figure montre 3 images caractéristiques de chacune des ces mesures donnant les distances entre cosmides avec une précision de 1 ,5 à 3 kb pour 50 à 80 mesures. Le code des cosmides utilisés est indiqué, ainsi que le contig auquel ils appartiennent (entre parenthèses). La couleur verte est représentée en blanc et la couleur rouge en gris. MATERIEL ET METHODES Méthode des histogrammes
Le schéma de la figure l a présente un certain nombre de situations dans le cas d'une sonde recouvrant totalement la région cherchée du génome (région contenant toute séquence genomique dont la modification entraîne l'apparition de la pathologie). De préférence, la sonde recouvre une partie du génome non impliqué dans la cassure, c'est-à-dire de part et d'autre de la déletion par exemple.
Les histogrammes théoriques correspondants (dans l'hypothèse où l'ADN genomique peigné est intact, ce qui est naturellement peu réaliste, et qui sera discuté dans la suite) sont présentés sur le schéma de la figure l b. La figure l e représente les résultats bruts avant extraction de la contribution de l'allèle normal. Des situations similaires sont représentées dans le cas où le clone utilisé ne recouvre pas totalement le gène (ou la région du génome) recherché(e) sur les schémas des figures 2a et 3a.
Dans la suite, on utilisera indifféremment l'expression "cette région de génome" (sous-entendu impliquée dans la pathologie) ou ''le gène", dans la mesure où la technique ne permet pas de déterminer à proprement parler un gène, mais une région du génome subissant des altérations (se traduisant par un "point de cassure").
L'ensemble des situations représentées sur les schémas précédents donne une idée de la différence attendue entre une situation où la sonde clonée utilisée s'hybride sur une région du génome d'un individu sain qui est modifiée dans le cas d'un individu malade.
Dans tous les cas présentés (sauf celui d'une translocation de tout ou partie du gène contenant la totalité du clone - cf schéma 3a (c3)), l'histogramme
(théorique) se distingue de l'histogramme "normal": - soit par la présence d'un seul pic mais situé à une valeur différente de la longueur du clone (supérieure - cas (d2) par exemple, ou inférieure - cas
(bl )). soit par la présence de deux pics ou davantage.
La simple donnée de l'histogramme des longueurs et de la longueur Le du clone (obtenue par exemple à l'aide d'une hybridation sur l'ADN d'un individu sain et obtention du pic de l'histogramme correspondant) permet donc de savoir si le clone étudié recouvre un point de cassure (au sens large entendu ici).
Les anomalies observées au niveau de l'histogramme peuvent être regroupées en plusieurs catégories: (a) un pic pour une longueur Li < Le
(b) un pic pour une longueur Ls > Le
(c) plusieurs pics de longueur(s) inférieure(s) à Le
(d) plusieurs pics de longueur(s) supérieure(s) à Le (e) un pic pour une longueur L = Le et un ou plusieurs pics de longueur(s) inférieure(s) à Le
(f) un pic pour une longueur L = Le et un ou plusieurs pics de longueur(s) supérieure(s) à Le (g) un ou plusieurs pics de longueurs <, = et > à Le
Les classes d'anomalies répertiorées précédemment ne suffisent en général malheureusement pas pour définir l'anomalie génétique sous-jacente.
Le schéma de la figure lb montre en effet qu'il n'est pas possible a priori de distinguer entre une translocation partielle (c l) ou (c2), totale (c3) ou une insertion dans le cas d'un clone qui couvrirait la totalité du gène. Il en est de même pour le cas où le clone ne couvrirait que partiellement le gène (schéma des figures 2b et 3b).
Par contre, la donnée des longueurs correspondant aux pics de l'histogramme permet de préciser dans certains cas la position dans le clone de l'extrémité de la partie du gène délétée, transloquée, dupliquée ou en contact avec une insertion.
En tout état de cause, la mesure d'un histogramme distinct de celui attendu dans le cas d'un génome normal signale la présence dans le génome étudié, d'une anomalie au niveau de la séquence contenue dans le clone utilisé.
(a- un pic pour une longueur Li < Le): il s'agit presque certainement d'une (ou de plusieurs) délétion(s). Cependant, comme nous l'avons noté, il peut s'agir d'un cas où plusieurs pics se trouvent confondus. Nous verrons qu'il est en général possible de distinguer entre ces deux cas par comparaison avec une sonde correspondant à une zone différente du génome (sonde de référence).
Dans le cas d'une déletion, il est possible d'en déduire la taille par soustraction des deux longueurs restantes de la longueur du clone intact (uniquement dans le cas où le clone recouvre la totalité de la partie délétée du gène). La position par rapport au clone ne peut par contre pas être connue, seules des hybridations supplémentaires avec d'autres clones ou des sous-clones pouvant permettre cette détermination. Cependant le même type d'histogramme peut correspondre à plusieurs délétions, auquel cas il n'est possible que de mesurer la taille totale des délétions (toujours dans l'hypothèse où le clone recouvrirait la totalité de la partie délétée du gène)
Dans les cas où le clone ne recouvre que partiellement le gène, la déletion détectée peut ne représenter qu'une partie de la déletion effective du gène (cf schéma 2a (bl ) par exemple). (b: un pic pour une longueur Ls > Le): dans ce cas, il s'agit d'une ou de plusieurs duplication(s) à l'intérieur du gène ou à ses extrémités, d'une partie ou de la totalité de celui-ci. Le clone peut recouvrir totalement ou partiellement le gène. Il peut éventuellement y avoir inversion des séquences, mais ceci ne peut être détecté dans le cas où le clone recouvre totalement le gène. La position de la ou des duplications ne peut être déterminée.
(c: plusieurs pics de longueur(s) inférieure(s) à Le): il peut s'agir dans ce cas de translocations partielles du gène ou de l'insertion d'une séquence à l'intérieur du gène. Dans l'hypothèse d'une translocation, il est possible de préciser les deux extrémités du gène au sein du clone (cas où le clone recouvre totalement le gène), ou d'avancer deux possibilités pour ces extrémités (dans le cas où le clone recouvre partiellement le gène).
(d: plusieurs pics de longueur(s) supérieure(s) à Le): il s'agit dans ce cas de plusieurs duplication de tout ou partie du gène dans la région du génome couverte par le clone.
(e: un pic pour une longueur L = Le et un ou plusieurs pics de longueur(s) inférieure(s) à Le): il s'agit d'une (ou de plusieurs) duplication(s) de tout ou partie du gène dans une zone du génome distincte de la zone couverte par le clone, ceci dans le cas où le clone couvre la totalité ou un partie du gène. (f: un pic pour une longueur L = Le et un ou plusieurs pics de longueur(s) supérieure(s) à Le): bien que cette situation n'ait pas été représentée dans les schémas 1 à 3, il s'agit d'un cas de duplication du type (d) associé à un gène normal.
(g: un ou plusieurs pics de longueurs <, = et > à Le): combinaisons de (e) et (f). Dans un certain nombre de situations, l'analyse des signaux d'hybridation et de leur distance, dans le cas où ils seraient alignés, devrait par ailleurs fournir des informations supplémentaires.
L'exemple du schéma l a (e) illustrera cette idée: dans ce cas d'une insertion, il faut imaginer que tout segment non hybride, mais entouré par deux hybridations colinéaires (de tailles quelconques) est susceptible de représenter une insertion: on construira donc un histogramme de ces mesures: s'il existe réellement une insertion, il devrait donc apparaître comme un pic, au même titre que n'importe quelle hybridation.
Cette mesure servira également dans le cas de délétions ou de translocations, par exemple. La technique exposée précédemment suppose que l'ADN genomique peigné hybride soit intact. En effet, la situation de référence, celle d'un individu sain dont l'ADN correspondant au clone utilisé pour l'hybridation n'est pas modifié, est représentée théoriquement par un pic à la valeur de la longueur du clone. Dans la pratique, l'ADN est soumis à des contraintes hydro-mécaniques lors de sa préparation, et également lors du peignage, ce qui conduit à de nombreuses cassures aléatoires. Ces cassures aléatoires peuvent avoir lieu au sein de la séquence cible de la sonde, ce qui donnera lieu, après peignage, à une séparation en plusieurs morceaux de ladite séquence. Lors de l'hybridation avec la sonde, ces segments seront hybrides, et après révélation, mesurés comme des fragments de taille inférieure à celle de la séquence cible.
Ces cassures n'affecteront pas nécessairement l'ensemble des séquences cibles dans l'ensemble des génomes utilisés pour le peignage. En fonction du nombre de génomes humains peignés sur la surface étudiée, et en fonction des conditions de préparation, la proportion des séquences cibles cassées restera raisonnablement faible. Dans ce cas, l'histogramme idéal constitué par un seul pic à la longueur de la sonde sera remplacé par un pic moins important accompagné d'une queue de distribution aux longueurs inférieures.
L'expérience et des considérations pratiques élémentaires montrent qu'un nombre optimal de génomes peignés par surface étudiée est d'au moins une dizaine par surface peignée dans les conditions expérimentales décrites.
Dans ce qui suit, on étudiera des simulations de processus de cassure (consécutives à la préparation et au peignage de l'ADN) dépendant de deux paramètres, permettant d'évaluer l'influence sur l'histogramme théorique des longueurs de ces phénomènes.
Deux paramètres semblent importants dans le phénomène de cassure: la taille caractéristique et le taux de cassure.
La taille caractéristique définit approximativement la taille limite atteinte par des molécules soumises à un grand nombre de manipulations. Un exemple de manipulation possible est le pipetage: en fonction du diamètre du cône de la pipette, la taille limite maximale des molécules sera plus ou moins importante. Un autre exemple de manipulation est le vortexage de la solution d'ADN.
Le taux de cassure est sensé modéliser le nombre de manipulations: par exemple, plus le nombre de pipetage augmente, plus les molécules risquent d'être cassées. A. Modèle en marche d'escalier.
La façon la plus simple de modéliser des manipulations d'ADN en solution consiste à attribuer une probabilité de cassure nulle aux fragments de taille inférieure à la taille caractéristique LQ, et une probabilité de cassure égale à 1 pour les fragments de taille supérieure à LQ- La cassure d'un fragment de taille L s'effectue en outre aléatoirement en deux fragments quelconques: L < LO = > PO( ) = 0
L > L0 = > P0( ) = 1
De façon à introduire un taux de cassure dans ce modèle, un paramètre fixe le nombre de processus de cassure auxquels est soumise une molécule et ses fragments successifs.
Ce modèle permet de simuler les histogrammes attendus lors d'une hybridation d'une sonde de longueur connue LQ en fonction des paramètres du modèle. Les conditions choisies sont: sonde s'hybridant sur un chromosome de 50 Mb, 200 génomes peignés, LQ = 50 kb.
A.1 . Influence de la taille caractéristique sur l'histogramme.
La figure 4 représente, pour différents taux (ou nombre d'étapes) de cassure, l'allure des histogrammes théoriques obtenus pour des valeurs de taille caractéristique (LQ , Lbreak) d' 1, ~> 4 ou 8 fois la taille de la sonde. Il apparaît clairement que plus la taille caractéristique est proche de la taille de la sonde, plus l'histogramme se différencie du pic unique décrit dans la partie 2, la queue de la distribution aux longueurs inférieures à la longueur LQ de la sonde prenant de l'importance, jusqu'à pratiquement faire disparaître le pic pour la valeur attendue LQ. A.2. Influence du taux de cassure sur l'histogramme. La figure 5 présente, pour différentes tailles caractéristiques, l'évolution de l'histogramme théorique en fonction du taux de cassure, c'est-à-dire le nombre d'étapes de cassure aléatoire (N time steps). Il apparaît naturellement que le pic à la longueur attendue LQ diminue lorsque le taux de cassure augmente.
Dans ce modèle cependant, le pic ne disparaît pas totalement, même lorsque le taux de cassure croît indéfiniment, puisqu'aucune cassure n'a lieu lorsque tous les fragments restant sont de taille inférieure à LQ. A.3. Intérêt du modèle.
Le modèle précédent a pour intérêt principal de fournir un moyen rapide pour évaluer l'allure probable de l'histogramme des longueurs des fragments de sonde hybrides, de façon à pouvoir interpréter les résultats des observations. B. Modèle gaussien.
Un modèle un peu plus réaliste consiste en un modèle similaire d'étapes successives de cassure, mais avec une loi de cassure différente de la loi "tout ou rien" du modèle en marche d'escalier. Une façon simple d'"arrondir" cette loi est de remplacer la probabilité précédente par une loi de probabilité de cassure gaussienne:
PG (L) = 1 - e -(L/Lo)2 B. l . Influence de la taille caractéristique sur l'histogramme
La figure 6 représente, pour différents taux de cassure, l'allure des histogrammes théoriques obtenus pour des valeurs de taille caractéristique (LQ , f-break) d' I , 2, 4 ou 8 fois la taille de la sonde, identiques à ceux utilisés dans la simulation effectuée dans le cadre du modèle en marche d'escalier. De la même façon, plus la taille caractéristique est proche de la taille de la sonde, plus l'histogramme se différencie du pic unique décrit dans la partie 2, la queue de la distribution aux longueurs inférieures à la longueur Le de la sonde prenant de l'importance, jusqu'à pratiquement faire disparaître le pic pour la valeur attendue LQ.
B.2. Influence du taux de cassure sur l'histogramme.
La figure 5 présente, pour différentes tailles caractéristiques, l'évolution de l'histogramme théorique en fonction du taux de cassure, c'est-à-dire le nombre d'étapes de cassure aléatoire (N time steps). Il apparaît naturellement qπe le pic à la longueur attendue LQ diminue lorsque le taux de cassure augmente.
Toutefois ce modèle a un comportement plus réaliste que le précédent, puisque lorsque le taux de cassure croît, le pic correspondant à LQ diminue quelle que soit la valeur da la taille caractéristique, pour disparaître" complètement lorsque le taux de cassure croît indéfiniment. B.3. Intérêt du modèle.
Le modèle gaussien, étant plus réaliste, sera celui que nous utiliserons par la suite pour simuler des histogramme de longueurs de fragments de sonde hybridées.
C. Simulation d'une hybridation sur un point de cassure. Pour étudier les conditions de l'applicabilité de notre technique, nous présentons la simulation de trois types de situations caractéristiques de l'hybridation d'un clone sur un point de cassure. Nous prendrons pour exemple le cas d'un BAC (Bacterial Artificial Chromosome) de 125 kb recouvrant un point de cassure impliqué dans une translocation (cf par exemple schéma 2a (c l )). Les simulations présentées sur la figure 8d correspondent à une situation où le clone est hybride sur un ADN genomique normal: dans ces conditions, la plupart des hybridations ont une longueur de LQ = 125 kb, mis à part les fragments cassés à cause des manipulations. Nous avons choisi deux valeurs de la taille caractéristique LQ: LQ = 100 (< LQ) et LQ = 200 (>Lç). Le taux de cassure est unique et égal à N = 10.
Ces histogrammes montrent qu'il est possible de distinguer un pic à 125 kb dans la plupart des cas, même assez défavorables comme dans le cas LQ = 100, N = 10. C.1. Fragments de 35 et 90 kb.
La figure 8a présente les résultats de la simulation d'un histogramme des longueurs de fragments hybrides dans le cas où le BAC de 125 kb s'hybride en deux parties non connexes du génome, de tailles très différentes (35 et 90 kb), comme dans le cas décrit sur le schéma 2a (cl).
Dans les deux cas (LQ = 100, LQ = 200), les deux pics à 35 et 90 kb sont reconnaissables, même si la situation est nettement plus favorable dans le cas où la taille caractéristique est nettement supérieure au plus grand fragment. Notons par ailleurs que, même dans le cas d'un échantillonage moindre, qui conduirait à un pic à 90 kb peu distinct, le pic à 35 kb subsisterait, signalant une anomalie par rapport à la taille normale du clone. C.2. Fragments de 50 et 75 kb.
La figure 8b représente le résultat de simulations dans le cas de deux fragments de taille peu différentes l'une de l'autre. Là encore, les pics correspondants sont nets et distincts l'un de l'autre. Dans ce cas, on peut prévoir qu'avec un échantillonnage moindre, il restera possible d'identifier ces deux pics. C.3. Fragments de 60 et 65 kb.
La figure 8c représente le résultat de simulations dans le cas de deux fragments de tailles très proches. Dans les deux cas, les pics ressortent nettement de l'histogramme des petits fragments, mais il est à craindre que précision limitée des mesures les confondent en un seul.
Là encore, une telle information suffira cependant pour assurer l'existence d'un point de cassure situé à mi-distance du BAC hybride. C.4. Conclusions
Les simulations précédentes montrent que, dans des conditions évitant de trop casser l'ADN avant et pendant le peignage, il est possible de distinguer sans ambiguité entre une situation témoin où la sonde s'hybride sur un génome humain normal, et une situation où la sonde s'hybride sur un génome modifié par la présence d'un point de cassure. Les paramètres heuristiques caractérisant le peignage montrent qu'il est toutefois préférable d'avoir une taille caractéristique supérieure ou égale à la longueur maximale de l'hybridation. Celle-ci étant inconnue, un critère simple est donc une taille caractéristique de l'ordre de ou supérieure à la longueur du clone utilisé comme sonde. Pour juger de façon expérimentale de la réalisation de ce critère, il paraît donc souhaitable d'utiliser, en plus des sondes destinées à la recherche d'une anomalie dans le génome, une sonde témoin de taille comparable s'hybridant sur une partie différente du génome. L'histogramme correspondant permettrait ainsi de déterminer qualitativement les paramètres du modèle reflétant la situation expérimentale. La figure 8e illustre une réalisation expérimentale de l'exemple précédemment décrit dans la figure 8a. De l'ADN genomique humain a été peigné suivant le protocole décrit ci-après. Cinq sondes cosmidiques contiguës du chromosome 9 (280A6, 37A1 , 149B8, 134A1 1 , 99B4 appartenant au contig du gène TSCl) totalisant environ 155 kb ont été hybridées sur cet ADN, puis révélées avec des anticorps fluorescents. Un histogramme des longueurs d'hybridation mesurées a été tracé qui est très comparable à l'histogramme de la figure Sd pour
Figure imgf000030_0001
100- On note Par ailleurs que l'histogramme réel a été obtenu sur un équivalent de moins de 40 génomes diploïdes (les simulations correspondant à 100 génomes diploïdes). Traitement de surface Des lames de 22 x 22 mm sont préparées et recouvertes de silane en utilisant le procédé décrit dans les demandes de brevet PCT/FR95/00164 et PCT/FR95/00165. Préparation des sondes cosmides
L'ADN cosmidique est marqué par une extension à partir d'une amorce statistique avec des nucléotides modifiés par la digoxygénine ou qui sont biotinylés. Pour les sondes marquées à la biotine, on utilise le "kit" de marquage ADN Bioprime™ (Gibco-BRL) contenant des amorces octamères statistiques et de la biotine- 14-dCTP. Pour le marquage à la digoxigénine, un mélange différent de dNTPs est utilisé qui contient dCTP, dATP et dGTP (0,1 mM), dTTP (0,065 m M) et dig-1 1 -dUTP (0,033 mM).
La taille et la concentration des fragments d'ADN marqués sont confirmées par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6% et par densitométrie de bandes. L'efficacité du marquage est évaluée à partir de taches déposées sur des membranes de nylon en utilisant des dilutions successives de sondes digoxigénine et de sondes biotine. Après incubation avec une phosphatase alcaline anti-dig (AP) ( Boehringer Mannheim) ou streptavidine AP (Gibco-BRL), les taches sont révélées avec N BT (NitroBIue Tetrazolium) et BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-lndolylphosphate) de Gibco-BRL. Les taches positives sont comparées avec les résultats obtenus à partir d'échantillons d'ADN contrôles marqués par dig ou par la biotine.
De façon à limiter le bruit de fond, les souches sont finalement purifiées sur des colonnes Bio-Spin 6 (Biorad) par centrifugation 5 mn à 1500 g. Solution d'ADN de levure
L'ADN de levure contenant le YAC 774G4 ( 1600 kb) est préparé dans des blocs de 100 μl d'agarose LMP 0,8 % (1 μg/bloc) en utilisant un protocole de préparation des blocs standard PFGE. Les blocs sont stockés dans l'EDTA 0,5 M à 4°C et rincés avec un tampon TE 15 ml (Tris 10 mM / EDTA I mM, pH 8) pendant 2 heures avant d'être utilisés. Chaque bloc est coloré avec 3,3 μM YOYO- 1 (Molecular Probes) dans 100 μl T40E2 (Tris 40 mM / EDTA 2 mM, pH 8) pendant 1 heure à température ambiante (RT). L'agarose est alors fondu pendant 45 minutes à 68°C et digéré 2 heures à 40°C en utilisant 2 U de β-agarase I dans un tampon NEB l agarase (Biolabs) par bloc.
La dilution de l'ADN (0,25 μg/ml) dans MES 50 mM (pH 5,5) est effectuée très prudemment de façon à éviter le bris des brins d'ADN. La solution est alors versée dans un réservoir de 4 ml de Teflon™ permettant l'introduction de 3 lames silanisées 22x22 mm pour peignage. La solution d'ADN peut également être stockée à 4°C pendant plusieurs jours. Peignage moléculaire
Les lames silanisées sont trempées dans le réservoir de Teflon™ contenant une solution d'ADN de levure totale (0,25 g/ml dans 50 mM MES, pH 5,5), incubées à RT et extraites du réservoir après 10 minutes d'incubation en utilisant un simple dispositif mécanique. Pendant l'incubation, les molécules d'ADN s'ancrent sur la surface par leurs extrémités. En extrayant la surface du réservoir, ceci a le même effet que l'évaporation prévue dans la "méthode de la goutte", le ménisque se déplace par rapport à la surface et exerce une force de traction constante sur les molécules demeurant dans le réservoir. Les surfaces couvertes avec l'ADN peigné sont alors observées avec un microscope en épifluorescence de façon à contrôler les caractéristiques du peignage. Un enregistrement des champs représentatifs de vue pour chaque lame est effectué pour le contrôle posthybridation.
Les surfaces sont alors collées sur des lames de microscope (cyanocrylate) et chauffées une nuit à 60°C. Elles peuvent être stockées pendant plusieurs mois si on les protège de l'humidité à -20°C ou à température ambiante. Les surfaces sont alors déshydratées avant la dénaturation en utilisant un bain comportant des concentrations croissantes en éthanol (70 %, 90%, 100%). Dénaturation et hybridation
Les surfaces sont dénaturées dans 70 % de formamide désionisé/30 % 2xSSC, pH 7,0) pendant 4 minutes à 70_C et immédiatement immergées 5 minutes dans un bain d'éthanol froid (0°C) à des concentrations croissantes (70 %,90 %, 100 %). Les surfaces sont alors mises à sécher.
50 ng de sondes marquées biotine et 50 ng de sondes marquées digoxygénine sont alors mélangés avec 3 μg d'ADN humain Cotl et 10 μg d'ADN de sperme de hareng dans 10 μl de tampon d'hybridation (50 % de formamide désionisé /
10 % de dextran sulfate / 2xSSC / 1 % Tween 20, pH 7). Les sondes sont dénaturées pendant 5 minutes à 80°C et immédiatement réfrigérées à 0°C.
10 μl de la solution de sonde sont ajoutés par lame peignée de 22x22 mm puis couverts avec une lame non traitée et scellés avec un polymère type Rubber-cement commercialisé par Sanford, USA. L'hybridation est conduite pendant une nuit à 37°C dans une chambre humide (HC). Révélation avec des sondes fluorescentes
Après hybridation, les lames sont lavées pendant 5 minutes à RT dans 3 bains (50 % formamide désionisé/ 2xSSC, pH 7) et pendant 5minut.es à 5' at RT dans 3 bains de 2xSSC. Les lames sont incubées pendant 30 minutes à 37°C (HC) avec 50 μl par lame d'une solution de blocage (1 ,5% -p/v) de réactif (Boehringer Mannheim) dans 4xSSC / Tween 20 0,05 %, pH7,2).
Les détections des sondes marquées à la biotine et à la digoxigénine sont effectuées simultanément en utilisant le même protocole pour chaque couche de détection, chaque couche d'anticorps étant incubée 30 minutes à 37°C, les lames étant lavées après chaque couche (3 fois 5minutes à RT dans 4xSSC / Tween 20 0,05 %). Pour les sondes marquées à la biotine, les couches suivantes sont utilisées (50 μl de tampon d'hybridation par lame) : (1) 40 mg/ml d'Avidin-Texas Red (Vector). (2) 5 mg/ml d'anti-avidin de chèvre biotinilée (Vector). (3) 40 mg/ml d'Avidin-Texas Red (Vector).
Pour les sondes marquées à la digoxigénine : ( 1) 34 mg/ml d'un congugué anti-dig de souris avec FITC (Jackson). (2) 28 mg/ml d'anti-souris d'âne- FITC (Jackson). (3) 30 mg/ml d'anti-lapin de souris-FITC(Jackson).
Après détection, les lames sont rincées rapidement dans PBS x l et montées avec un réactif (Vectashield , Vector) avant observation. Les lames peuvent être gardées des mois à 4°C dans l'obscurité. EXEMPLE 1
Dans le cas du peignage d'ADN genomique humain, on effectue des hybridations simultanées de deux cosmides séparés par un gap de plusieurs dizaines de kb ( 180F 1 et 50D9) : environ 80 signaux couplés (cosmide 1 - gap - cosmide 2) ont pu être mesurés sur une seule lamelle de 22x22 mm, correspondant à une distance totale de
120 kb environ (voir exemple 5).
Ce résultat permet d'assurer qu'il est possible d'observer environ une centaine d'hybridations d'un BAC entier sur un génome humain normal. Cette situation expérimentale est à comparer avec les situations théoriques envisagées dans la figure 8: les histogrammes 8d montrent en effet que pour 100 génomes diploïdes (donc 200 occurences d'une séquence clonée), et avec des paramètres particuliers, environ 10 signaux d'hybridation intacts d'un BAC de 125 kb (cas LQ = 100 kb), ou 16 signaux d'hybridation intacts (cas LQ, = 200 kb) sont attendus. Autrement dit, les paramètres théoriques utilisés dans les simulations sont beaucoup plus pessimistes que les conditions expérimentales que l'on est actuellement capable de réaliser.
L'ensemble de cette analyse théorique et expérimentale permet donc une première validation de la présente invention.
Outre la recherche de points de cassure à l'aide de BACs (ou autres sondes de taille équivalente ou inférieure) évoquée précédemment, il est également envisageable d'utiliser des YACs (disponibles pour la totalité du génome humain, et pour d'autres génomes). Des simulations similaires à celles présentées ci-dessus montrent qu'il est envisageable de détecter l'hybridation d'un YAC de 1600 kb en deux fragments distincts de 400 et 1200kb (par exemple), sur la base de 100 génomes peignés dans des conditions correspondant à Lo = 600, N = 10 dans le modèle gaussien. Cependant, à la différence des observations de BACs ou de sondes de taille semblable ou inférieure, qui peuvent être réalisées sans difficulté à l'aide d'un microscope à épifluorescence équipé d'un objectif x 100 ou x 63 et d'une caméra (taille maximale d'un champ de vue; respectivement 123 μm et 195 μm environ), la mesure de fragments de plusieurs centaines de kb impose l'utilisation d'objectifs de grossissement plus faible, pour lesquels des problèmes de détectabilité des signaux peuvent éventuellement se poser: x 40: champ de vue de taille maximale 307 μm environ. x 20: champ de vue de taille maximale 614 μm environ.
L'avantage d'utiliser des sondes de taille aussi importante est évidemment de réduire le nombre d'hybridations nécessaires pour trouver un clone intéressant. EXEMPLE 2
Dosage de l'ADN phage-λ dans le génome d'E.Coli
De l'ADN genomique d'E. Coli (le = 4,7 Mb) contenant un exemplaire du génome du phage λ (lignée 5243, lt = 49 kb) a été peigné sur des surfaces silanisées après avoir été contre-coloré avec une molécule fluorescente (YOYO- 1 ).
La longueur totale d'ADN peigné par champ de vue a été estimée à partir de 30 à 50 champs de vue répartis uniformément sur l'ensemble de chaque surface.
De l'ADN de phage λ marqué à la biotine-dUTP a ensuite été hybride et révélé à l'aide d'un système d'anticorps couplés à la FITC (vert). La longueur totale d'ADN hybridée par champ de vue a été estimée à partir de 100 champs de vue répartis uniformément sur l'ensemble de chaque surface.
Les résultats de 4 expériences sont représentés dans le tableau ci-dessous dans lequel Nb E. coli = Le et Nb = LT le lt
Nb E. Coli Nb λ R =λ/E. Coli ΔR
43_4 0,19 0,19 1,0 0,6
43_6 0,25 0,22 0,9 0,5
43_7 0,31 0,26 0,8 0,4
43_8 0,20 0,24 1,2 0,7
43_9 0,26 0,39 1,5 0,8
43_13 0,57 0,74 1,3 0,4
43 14 0,61 0,56 0,9 " 0,3
Ces résultats ont montré, hormis pour la lame 43_9, un rapport raisonnablement proche de la valeur attendue de 1. Cependant le principe utilisé, consistant à mesurer l'ensemble des signaux avant hybridation est peu praticable pour des génomes plus grands (l'incertitude ΔR est ici principalement due au faible nombre de génomes d'E. Coli mesurés, de l'ordre de 6 à 24). EXEMPLE 3
Dosage du nombre d'amplicons dans le génome de cellules de hamster.
L'étude de faisabilité a été étendue à de l'ADN genomique de mammifère. Le système choisi est l'ADN de 2 lignées de fibroplastes du poumon de hamster (lignées 618 et GMA32) contenant respectivement 1 et 2 copies du gène cible AMP 1 par génome haploïde. De l'ADN genomique de cellules fourni en solution a ete peigne sur des surfaces silanisées, avec une densité estimée de 100 génomes diploïdes par surface de 22x22 mm
Une sonde cosmidique (D3S 1 , ~40 kb) spécifique de la région du gène cible a été marquée avec de la dig-dUTP. Une autre sonde cosmidique (565 5A 1 , ~40 kb), spécifique d'une région située à environ 1 Mb du gène cible a été utilisée comme témoin, et marquée avec de la biotine-dUTP.
Les sondes ont été hybridées sur l'ADN genomique peigné préalablement dénature, et révélées en rouge (sondes biotinilées) et vert (sondes digoxygénées) dans un des cas, et avec des couleurs inversées dans l'autre. Les signaux d'hybridation de chaque couleur ont été mesurés sur un nombre de champs de vue représentatif de la surface.
Dans le cas de la lignée A32, la taille totale obtenue pour la sonde D3S 1
( 1400 μm environ) représente 70 copies du gène La taille obtenue sur les mêmes champs de vue pour la sonde témoin (1 180 μm environ) représente quant à elle 60 génomes haploïdes Cette mesure donne donc un rapport cible/témoin de 1,2 + 0,3 compatible avec la présence d'une copie du gène par génome haploïde.
Ces expériences montrent donc la faisabilité du dosage de gène à partir des seuls signaux d'hybridation de sondes cible et témoin, dès lors qu'un nombre suffisant de signaux peut être observé. EXEMPLE 4
Cartographie par paires de 6 cosmides sur un YAC de 1600 pb contenu dans de l'ADN genomique de levure
Le YAC 774G4 contient un clone d'ADN genomique humain du chromosome 15 contenant le gène de la calpaine (CANP3), dont la mutation est responsable d'une dystrophie des ceintures (LGMD 2A) En collaboration avec le groupe de J. Beckman du Généthon (Evry), nous avons peigné de l'ADN genomique de levure contenu dans des blocs d'agarose Low Melting (1 bloc, 1 μg d'ADN par bloc) sur des surfaces silanisées.
Les six cosmides ont été hybrides deux par deux et la mesure de leurs taille et distance respectives a été effectuée en constituant des histogrammes des tailles et distances La moyenne et l'écart-type du pic principal de chaque histogramme en a été extrait à l'aide d'un logiciel spécifique L'écart-type des mesures s'avère être de l'ordre de 2 à 4 kb (figure 1 1) J4
EXEMPLE 5
Cartographie de couples de cosmides sur ADN genomique humain
4 cosmides appartenant à 3 contigs voisins séparés par des gaps ont été utilisés dans 2 séries d'hybridations, effectuées en collaboration avec le groupe de S. Povey du MRC (Londres). Les contigs recouvrent la région du gène TSC 1 impliqué dans une des formes de la tuberous sclerosis (chromosome 9). Les sondes cosmidiques ont été préparées suivant le protocole ci-dessus.
L'ADN genomique utilisé a été extrait de cultures cellulaires et mis en bloc d'agarose Low Melting à raison de 10° cellules par bloc. 3 blocs traités suivant le protocole précédent (réservoir de 4 ml, utilisation d'une molarité finale de MES pH 5,5 de 150 mM), ont été utilisés pour le peignage de l'ADN genomique.
Les cosmides ont été hybrides 2 par 2 sur des lames semblables, un total de plusieurs dizaines de signaux doubles (rouge/vert alignés) par lame étant en moyenne observé. Le même protocole de mesure que précédemment a été observé, donnant lieu à des valeurs finales ayant la même précision que dans l'expérience précédente.
La figure 12 présente quelques images typiques ayant permis la mesure des tailles des 2 gaps étudiés.
EXEMPLE 6
Cartographie de segments de restriction Cette technique de cartographie est naturellement applicable à tout autre type d'ADN peigné ou de sous-clone. Une extension possible de la technique consisterait par exemple à cartographier non plus des sous-clones d'un clone, mais directement des fragments de restriction de l'ADN peigné (par exemple un clone de type
BAC). Ceci éviterait l'élaboration de sous-clones intermédiaires avant séquençage, la carte physique des fragments de restriction étant obtenue avec suffisamment de précision pour permettre une reconstitution de la séquence finale.
L'applicabilité de cette technique repose sur la bonne séparation des bandes de restriction, et la taille suffisante (> 10 kb) des principaux fragments, ainsi que sur le sous-clonage ultérieur de l'ADN de ces bandes (sous-clonage dans des vecteurs de petite taille, après restriction enzymatique supplémentaire, pour le séquençage).

Claims

REVENDICATIONS 1 ) Procédé de détection de la présence ou de la localisation d'un ou plusieurs gènes ou d'une ou plusieurs séquence d'ADN spécifique A ou d'une ou plusieurs molécules réagissant avec l'ADN sur un ADN B, caractérisé en ce que: (a) on fixe et on peigne une certaine quantité dudit ADN B sur une surface de peignage, (b) on fait réagir le produit du peignage B avec une ou plusieurs sondes, liées au(x) gène(s) ou aux séquences d'ADN spécifiques A, ou aux molécules susceptibles de réagir avec l'ADN, (c) on prélève l'information correspondant à l'une au moins des catégories suivantes :
(1 ) la position des sondes,
(2) la distance entre sondes, (3) la taille des sondes (la somme totale des tailles permettant de quantifier le nombre de sondes hybridées) pour en déduire la présence, la localisation et/ou la quantité des gènes ou des séquences d'ADN spécifique A.
2) Procédé selon la revendication 1 de mise en évidence d'une anomalie génétique de cassure dans un génome, caractérisé en ce que :
(a) on fixe et on peigne une certaine quantité dudit génome sur une surface de peignage,
(b) on hybride le produit de peignage avec une ou plusieurs sondes spécifiques correspondant à la séquence genomique dont on cherche l'anomalie,
(c) on mesure la taille des fragments correspondant aux signaux d'hybridations, et
(d) on en déduit la présence d'une cassure, soit par mesure directe soit par comparaison avec un témoin étalon correspondant à une longueur témoin.
3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on fait réagir le produit du peignage avec une ou plusieurs sondes marquées.
4) Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que la sonde recouvre une partie du génome non impliquée dans la cassure. 5) Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'on établit un histogramme des longueurs des sondes mesurées. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on compare l'histogramme des longueurs des sondes avec un histogramme réalisé sur un génome témoin avec des sondes similaires.
7) Procédé selon la revendication 1 de dosage d'une séquence genomique déterminée dans un génome, caractérisé en ce que :
(a) on fixe et on peigne une certaine quantité dudit génome sur une surface de peignage,
(b) on hybride le produit de peignage avec une sonde témoin marquée de longueur lt correspondant à une séquence genomique dite témoin, c'est- à-dire dont on connaît le nombre de copies dans le génome, et avec l'aide d'une sonde spécifique marquée de longueur le correspondant à la séquence genomique à doser, lesdites sondes pourront être identifiées séparément,
(c) on mesure alors la longueur totale des signaux d'hybridation pour les deux sondes, soit Le et Lt,
(d) on calcule pour chacune le nombre de copies de la séquence correspondant par le rapport
LT Le
Nt = et Ne = lt le
et on en déduit le nombre de copies de la séquence à doser par rapport à la séquence témoin.
8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence genomique dite témoin a une séquence présente à un nombre entier de copies par génome et on en déduit la présence d'une anomalie génique lorsque Ne est significativement différent de la valeur attendue pour le nombre de génomes présents déduit de Nt.
9) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence genomique dite témoin est constituée de différentes parties séparées dont la longueur totale lt par génome est connue, et en ce que la séquence à doser est constituée de différentes parties séparées dont la longueur totale le par génome normal est connue, et où on déduit la présence d'une anomalie génique lorsque Ne est significativement différent de la valeur attendue pour le nombre de génomes présents déduit de Nt. 10) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence genomique dite témoin est une séquence présente à 2 copies par génome et on déduit la présence d'une anomalie génique lorsque Ne et Nt sont significativement différents. 1 1 ) Procède selon l'une des revendications 7 a 10, caractérise en ce que la séquence a doseï correspond a une séquence d'un chromosome lie a une ti isomie et que la séquence témoin est constituée par une séquence d'un autre chromosome, le iapport Ne / Nt étant alors voisin de 1 ,5 en cas de trisomie 12) Procédé selon la revendication 7, caractérise en ce que la séquence à doser correspond à une déletion d'un génome, la séquence témoin étant de préférence une séquence du même chiomosome.
13) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 7, caractérisé en ce que la séquence à doser est une séquence répétée, la séquence normale étant alors de préférence une séquence du même chromosome
14) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence genomique dite témoin et la séquence à doser sont identiques pour un génome donné, et en ce que plusieurs génomes différents sont peignes sur la même surface de peignage et ou on détermine les quantités respectives de génomes de chaque type 15) Procède selon la revendication 1 , caractérise en ce que
(a) on fixe et on peigne une certaine quantité dudit génome sur une surface de peignage,
(b) on hybride le produit de peignage avec des sondes marquées avec des éléments radioactifs, fluorescents ou autres, tels que billes, particules, etc , correspondant à chaque clone, de sorte que lesdites sondes pourront être révélées spécifiquement, par une couleur notamment,
(c) on prélève l'information correspondant a la place de chaque clone ainsi que les tailles et les distances correspondantes sur le génome,
(d) on réitère les opérations b) et c) n fois en modifiant la couleur, le marquage ou le mode de révélation des sondes, sachant qu'avec p- couleurs, marquages ou modes de révélation différents, au bout de n hybridations on peut positionner pn clones
16) Procédé selon l'une des revendications 1 a 15, caractérisé en ce qu'on utilise des sondes marquées par des nucléotides modifiés qui sont révélés éventuellement de façons distinctes
17) Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'on utilise des sondes marquées par incorporation de nucléotides modifies par biotinylation, par D1G ou d'autres haptènes qui sont révélés par un système de couches d'anticorps ou de molécules spécifiques 18) Procède selon l'une des revendications 1 a 16, caractérise en ce qu'on utilise aussi des sondes marquées par des nucléotides fluorescents
19) Procédé selon l'une des revendications 1 a 16, caractérise en ce que 1 on utilise αes sondes nucleotidiques dont certains atomes sont remplaces 20) Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce qu'on dispose sur la surface peignée au moins une dizaine de copies du génome.
21) Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'on dispose sur la surface peignée d'un nombre suffisant de signaux pour avoir une incertitude statistique de moins de 20% sur le rapport Nc/Nt.
22) Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 , caractérisé en ce que la surface comporte un ADN de calibrage qui permet de calibrer chaque mesure.
23) Procédé selon l'une des revendications 2 à 22, caractérisé en ce que le génome provient d'un prélèvement de fluide biologique ou d'un tissu d'origine biologique.
24) Procédé selon l'une des revendications 2 à 22, caractérisé en ce que le génome provient d'un matériel biologique comportant au moins 80% de matériel génétique d'origine foetale.
25) Kit de diagnostic ou de positionnement de gènes pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 24, caractérisé en ce qu'il comporte au moins l'un des éléments suivants : une surface de peignage, des sondes marquées ou destinées à être marquées, correspondant aux anomalies à détecter, - un dispositif permettant le peignage de I'ADN, un génome témoin et/ou des sondes témoins correspondantes, ledit génome étant éventuellement fixé sur la surface à peigner, un ou plusieurs résultats particuliers obtenus en utilisant les protocoles précédents dans une ou plusieurs situations témoins, de façon à fournir une grille d'interprétation des résultats obtenus dans les diagnostics effectifs, par exemple sous la forme d'un système expert (par exemple logiciel), un système expert permettant de faciliter la réalisation de diagnostics selon le procédé de l'invention. 26) Coffret de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 24, caractérisé en ce qu'il comporte des sondes standards de référence et des marqueurs génétiques permettant la localisation d'une séquence.
27) ADN genomique ou partie d'ADN genomique capable de réagir, dans les conditions du peignage moléculaire, avec une sonde correspondant à un produit de transcription ou de traduction ou de régulation.
28) Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'au moins l'une des sondes est un produit susceptible d'interagir avec l'ADN. 29) Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'au moins l'une des sondes est un produit d'intérêt thérapeutique susceptible d'interagir avec l'ADN.
30) Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la réaction de la sonde avec l'ADN peigné est modulée par une ou plusieurs molécules, solvants ou autres paramètres pertinents.
31) Molécule capable de réagir avec l'ADN genomique capable d'êtrepeigné, isolée par l'un des procédés revendiqués précédemment.
32) Molécule, solvant ou procédé relié à un paramètre mis en évidence par l'un des procédés revendiqués précédemment.
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