WO1998059040A2 - Human catalytic telomerase sub-unit and its diagnostic and therapeutic use - Google Patents

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WO1998059040A2
WO1998059040A2 PCT/EP1998/003468 EP9803468W WO9859040A2 WO 1998059040 A2 WO1998059040 A2 WO 1998059040A2 EP 9803468 W EP9803468 W EP 9803468W WO 9859040 A2 WO9859040 A2 WO 9859040A2
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telomerase
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leu
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htc
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Hans-Ulrich Siegmund
Walter Weichel
Maresa Wick
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • telomeres The genetic material of eukaryotic cells is distributed on linear chromosomes.
  • the ends of the genes are derived from the Greek words telos (end) and meros (part, segment) as telomeres.
  • Most telomeres consist of repetitions of short sequences, which are mainly composed of thymine and guanine (Zakian, 1995).
  • the telomeric sequences of related organisms are often similar and even conserved between more distant species. It is remarkable that in all vertebrates examined so far, the telomeres are built up from the sequence TTAGGG (Meyne et al., 1989).
  • telomeres perform various important functions. They prevent the fusion of chromosomes (McClintock, 1941) and thus the development of dicentric inheritance. Such chromosomes with two centromeres can lead to the development of cancer by loss of heterozygosity or doubling or loss of genes.
  • telomeres serve to distinguish intact hereditary systems from damaged ones. For example, yeast cells stopped dividing when they contained a chromosome without telomer (Sandeil and Zakian, 1993).
  • telomeres Another important task is performed by telomeres in the replication of eukaryotic DNA
  • RNA primers are required to initiate DNA replication. After cleavage of the RNA primer, extension of the Okazaki fragments and subsequent ligation, the newly synthesized DNA strand lacks the 5 'end, because there the RNA
  • telomeres also play an important role in regulating cellular aging (Olovnikov, 1973). Human somatic cells show a limited culture
  • telomeres have central functions in the aging of cells and the stabilization of genetic material and prevention of cancer.
  • telomeres synthesize the telomeres
  • telomere As described above, organisms with linear chromosomes can only partially replicate their genome without a special protective mechanism. Most eukaryotes use a special enzyme, telomerase, to regenerate the telomer sequences. Telomerase is constitutively expressed in the unicellular organisms examined so far. In contrast, telomerase activity was only measured in germ cells and tumor cells in humans, whereas neighboring somatic tissue contained no telomerase (Kim et al, 1994).
  • telomere like the telomeres, was first identified in the ciliate Tetrahymena thermophila. Telomerase activity was demonstrated by extending the single-stranded oligonucleotide d (TTGGGG) 4 in the presence of dTTP and dGTP (Greider and Blackbum, 1985). The 7etr 2y “2e” ⁇ -telomer sequence TTGGGG was repeatedly attached to the primer. Even if as a starting material
  • telomeres Oligonucleotide with the irregular telomer sequence from Saccharomyces cerevisiae, T (G) ⁇ _3, the telomerase extended the primer with the telomer sequence von Tetrahymena (Greider and Blackburn, 1985) From these results it was concluded that the telomerase itself carries with it the template for the sequence of the telomeres
  • RNA component in telomerase After the existence of an RNA component in telomerase could first be demonstrated (Greider and Blackburn, 1987), the gene for the RNA subunit of telomerase was cloned a short time later (Greider and Blackburn, 1989).
  • This RNA contains a region with the Complement to the telomeric sequence of Tetrahymena (hereinafter referred to as "complement region")
  • complement region Complement region
  • telomerase belongs to the class of RNA-dependent DNA polymerases
  • telomeres The first protein subunits of 7etr? Y / we «telomerase, p80 and p95, were identified in 1995 (Collins et al, 1995) The observation that p95 anchors the enzyme to the DNA and p80 binds the RNA component led to following model The complement region of the telomerase RNA attaches to the single-stranded 3 'overhang. The 3' overhang is extended by incorporating the corresponding nucleotides in the 5 '-3' direction. The de «ovo synthesis of telomeres likely includes an elongation and a translocation step.
  • telomere Once a telomeric sequence has been synthesized, the telomerase will likely move along the DNA until it is back in position to add a complete telomeric sequence. This model does not have to be general, since telomerases of different species exist large differences in the number of nucleotides that the enzyme adds before it dissociates from the telomer (Prowse et al, 1993)
  • telomerase subunits from other organisms were also recently identified. Two protein subunits, pl23 and p43, were found in the ciliate Euplotes aediculatus, which have no homology to the Tetrahymena T ⁇ omerasQ-
  • the telomerase subunit pl23 has one at its N-terminus basic domain and a domain for a reverse transcriptase (RT) at the C-terminus, which indicates a catalytic function of this protein (Lingner et al, 1997). Furthermore, a significant homology of pl23 to the protein Est2 found by Lundblad from Saccharomyces cerevisiae was found described (Lingner et al, 1997)
  • telomeres While no essential function for telomerase activity has been demonstrated for p80 and p95, a key function was clearly demonstrated for the potential catalytic subunits of telomerase pl23 / est2p. A mutation of the RT activity center of est2p led to a significant shortening of the telomeres in yeast cells (Lingner et al, 1997)
  • RNA components of telomerases have been cloned from various organisms, including Saccharomyces cerevisiae, mice and humans (Singer and Gottschling, 1994, Blasco et al, 1996, Feng et al, 1995). All previously known telomerase RNAs contain a region that is complementary to the telomeric sequence of the respective organism
  • the primary sequence of human telomerase RNA (hTR) is not similar to the RNA components of the ciliates or Saccharomyces cerevisiae. In contrast, conserved areas exist between human and murine telomerase.
  • hTR human telomerase RNA
  • telomerase-associated protein hTPI
  • telomeres are composed of 2627 amino acids and shows three domains in N-Teminus, which are maximally 46% homologous to p80.
  • 16 repeats of the amino acids could be found in the C-terminal region Tryptophan and asparagine are shown, which presumably mediate a protein-protein interaction Activation of telomerase in human tumors
  • telomere et al An activity of telomerase was originally only detectable in germline cells, but not in normal somatic cells (Hastie et al, 1990, Kim et al, 1994). After the development of a more sensitive detection method (Kim et al,
  • telomere activity was not yet clear in 1994, low telomerase activity was also detected in hematopoietic cells (Broccoli et al, 1995, Counter et al, 1995, Hiyama et al, 1995) However, these cells nevertheless showed a reduction in telomeres (Vaziri et al, 1994, Counter et al , 1995) It is not yet clear whether the amount of enzyme in these cells is not sufficient to compensate for telomer loss, or whether the measured telomerase activity stems from a subpopulation, e.g. incompletely differentiated CD34 + 38 + precursor cells (Hiyama et al, 1995) For clarification, evidence of telomerase activity in a single cell would be necessary
  • telomere activity was detected in a large number of the tumor tissues tested to date (1734/2031, 85%, Shay, 1997), while no activity was found in normal somatic tissue (1/196, ⁇ 1%, Shay, 1997)
  • telomeres continued to shrink and telomerase could only be discovered in the subpopulation that survived the growth crisis (Counter et al, 1992). These cells were also in these immortalized cells the telomeres are stable (Counter et al, 1992)
  • Similar findings from studies on mice support the assumption that reactivation of telomerase is a late event in tumorigenesis
  • telomerase hypothesis was developed that links the loss of telomer sequences and cell aging with the activity of telomerase and the development of cancer.
  • shrinking of telomeres can be seen as a mechanism for tumor suppression Cells that do not contain telomerase stop their cell division at a certain length of the telomeres. If such a cell mutates, a tumor can only develop from it if the cell can extend its telomeres. Otherwise the cell became telomer sequences continue to lose until their chromosomes become unstable and they eventually perish. Reactivation of telomerase is believed to be the main mechanism for tumor cells to stabilize their telomeres.
  • telomere inhibition should allow therapy of tumors.
  • Conventional cancer therapies with cytostatics or short-wave radiation damage not only the tumor cells, but all the cells that divide in the body.
  • telomerase inhibitors would attack the tumor cells more specifically and thus cause fewer undesirable side effects.
  • Telomerase activity has been demonstrated in all tumor tissues tested so far, so that these therapeutic agents could be used against all types of cancer.
  • the effect of telomerase inhibitors would occur when the telomeres of the cells have shortened to such an extent that the genome becomes unstable. Since tumor cells usually have shorter telomeres than normal somatic cells, cancer cells would first be
  • telomeres like the germ cells, would only be damaged much later. Telomerase inhibitors are therefore a pioneering way of treating cancer.
  • telomerase inhibitors will only be possible if the protein structures of the enzyme with their functions have been identified and the knowledge about various telomer-binding proteins has been deepened.
  • the invention relates to the catalytically active human telomerase subunit (phTC), if appropriate in purified form, active parts of the protein, modulators, in particular agonists of the protein, substances imitating the function of the protein and combinations of these components. continues to affect
  • genomic sequences of hTC homologous genes the genomic sequences of hTC homologous genes, the cDNA sequences of hTC homologous genes, the sequences of the mRNAs which are transcribed by hTC homologous genes,
  • the phTC protein labeled with a detection reagent, the detection reagent preferably being an enzyme, a radioactively labeled element or a fluorescent chemical.
  • this is a polyclonal antibody.
  • this is a monoclonal antibody.
  • Such antibodies can be produced, for example, by injecting a substantially immunocompetent host with an amount of a phTC polypeptide or a fragment thereof which is effective for antibody production and by subsequently obtaining this antibody.
  • an immortalized cell line which produces monoclonal antibodies can be obtained in a manner known per se.
  • the antibodies can optionally be labeled with a detection reagent.
  • fragments can also be used which have the desired specific binding properties.
  • Preferred examples of such a detection reagent are enzymes, radioactively labeled elements, fluorescent chemicals or biotin. Oligonucleotides in purified form with a sequence which is identical or exactly complementary to a 10 to 500 nucleotide long, contiguous sequence of the above-described genomic DNA, cDNA or mRNA.
  • Such an oligonucleotide can in particular be an oligodeoxyribonucleotide or an oligoribonucleotide or a peptide nucleotide acid (PNA)
  • PNA peptide nucleotide acid
  • oligonucleotides which inhibit, repress or block the activity of the telomerase when they bind to the hTC mRNA.
  • a recombinant DNA molecule which contains a DNA sequence or a degenerate variation of this sequence which encodes phTC or a fragment of phTC, the latter sequence preferably containing the DNA sequence from FIG. 1, or which contains such a DNA sequence which corresponds to the preceding one DNA sequence listed hybridized under standard hybridization conditions.
  • the DNA described is preferably linked to an expression control sequence.
  • Particularly preferred expression control sequences are e.g. the early or late
  • Promoter of SV40 or adenovirus the lac system, the trp system, the TAC system, the TRC system, the main operator and promoter regions of the phage ⁇ , the control regions of the fd coat protein, the promoter of the 3-phosphoglycerate kinase, the promoter the acid phosphatase and the promoter of the yeast ⁇ -mating factor.
  • a unicellular host which has been transformed with a recombinant DNA molecule described above, which contains the DNA sequence or a degenerate variant of this sequence which codes for the phTC protein or a part of this protein.
  • the said DNA sequence is also in this recombinant DNA molecule linked to an expression control sequence
  • Preferred examples of the unicellular host are E. coh, Psendomonas, Bacilhis, Streptomyces, yeasts, CHO, Rl 1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 and BMT10 cells, plant cells, insect cells and sucker cells in cell culture
  • a method for inhibiting telomerase activity in human cells preferably neoplastic cells, in which an exogenous polynucleotide consisting of a transcription unit is transferred into the cells.
  • This transcription unit contains a polynucleotide sequence of at least 29 consecutive nucleotides that are substantially identical or substantially complementary to the hTC RNA Is sequence and is linked to a heterologous transcription regulatory sequence which said transcription of the linked polynucleotide in said
  • heterologous transcription regulatory sequence preferably contains a promoter which is constitutively active in human cells
  • the heterologous transcription-regulatory sequence can contain a promoter that can be induced or repressed in human cells by adding a regulatory substance.
  • a promoter that can be induced or repressed in human cells by adding a regulatory substance.
  • inducible and repressible tetracycline-dependent promoters Heatshock promoters, metal ion-dependent promoters
  • the above-mentioned exogenous polynucleotide can be, for example, a viral genome with a transcription unit from the human hTC DNA component
  • the said transcription unit particularly preferably produces antisense RNA, which is substantially complementary to the human hTC RNA component
  • exogenous polynucleotide can particularly preferably contain the sequence from FIG. 1
  • Polynucleotide consists of a transcription unit which contains a polynucleotide sequence of at least 9 consecutive nucleotides, which is substantially identical or substantially complementary to the hTC RNA sequence and which is linked to a heterologous transcription regulatory sequence which controls the transcription of the linked polynucleotide in said cells
  • a method for the detection of telomerase-associated conditions in a patient comprising the following steps
  • C detection of diagnostic values that are higher or lower than standard comparison values indicate a telomerase-associated state, which in turn indicates a pathogenic state
  • This method is preferably used for the detection of a neoplastic disease of a patient.
  • the method then comprises the following steps A detection of the phTC protein in cellular samples to make a diagnostic
  • a method of determining the presence of the phTC protein in a cell or cellular sample that is complementary to the amplification of an hTC polynucleotide or hybridization of an hTC polynucleotide, primer, or hTC
  • a test kit for the detection of phTC in cellular samples and body fluids, whereby labeled, immunochemically reactive components can be, for example, polyclonal antibodies against phTC, monoclonal antibodies against phTC,
  • Telomerase its functional equivalents or its catalytically active fragments is also conceivable the use of a substance that requires the production and / or activity of phTC, a substance that can mimic the activity of phTC, a substance that inhibits the production and / or Can inhibit the activity of phTC or a mixture of these substances. Furthermore, a specific binding partner can be used
  • the method is preferably used to prevent or treat aging or cancer
  • telomerase assays are given in the context of example 15
  • Modulators of phTC are interesting for the treatment of diseases with
  • telomerase The prevention or treatment of aging processes or cancer can be mentioned here in particular
  • An antisense nucleic acid against the hTC mRNA which contains a nucleotide sequence which hybridizes with said mRNA, the antisense nucleic acid being a
  • the antisense nucleic acid preferably binds to the start codon of the respective mRNAs
  • a recombinant DNA molecule with a DNA sequence from which an antisense ribonucleic acid is produced against the hTC mRNA during transcription contains a nucleic acid sequence which can hybridize with the said hTC mRNA
  • Such a DNA molecule can be used to produce a cell line with reduced expression of phTC by transfecting a phTC-producing cell line with this recombinant DNA molecule
  • This is preferably a Tetrahymena-type ribozyme or a hammerhead-type ribozyme
  • This recombinant DNA molecule can be used to transfect a phTC-producing cell line
  • a compilation consisting of a pair of human hTC polynucleotide PCR primers, the primers preferably consisting of sequences which correspond to the sequence of the human hTC mRNA or are complementary to this sequence
  • telomerase / telomer regulation Animal models with which the telomerase / telomer regulation can be investigated in vivo. For example, tumor formation and aging can be examined directly with knockout or transgenic animals
  • Fig. 1 cDNA sequence of the human catalytic telomerase subunit (hTC) (SEQ ID No. 1).
  • Fig. 2 Derived amino acid sequence from the hTC DNA sequence shown in Fig. 1 (SEQ ID No. 2).
  • the DNA sequence shown in FIG. 1 can be completely translated into an amino acid sequence from position 64 to position 3461.
  • the amino acid residues are shown according to their one-letter code.
  • the picture shows an 0.8% agarose gel stained with ethidium bromide.
  • Two different DNA size standards are plotted in lanes 1 and 8, the DNA fragment lengths 3, 2, 0.5 and 0.4 kb being highlighted.
  • the AA281296 DNA in pT7T3D was with the restriction enzymes Eco RI / Not I (lane 3), Pst I
  • Lane 6 (Lane 6) and Xho 1 (lane 7) digested. Undigested AA281296 DNA was applied to lane 2 in pT7T3D. Lanes 4 and 5 were 1/10 of a PCR approach (1 minute 94 ° C, 2 minutes 60 ° C, 3 minutes 72 ° C) with the hTC cDNA in pT7T3D and the primers 1 (5 'GAGTGTGTACGTC-GTCGAGCTGCTCAGGTC 3 ') and 4 (5' CACCCTCGAGGTGAGACGCTCGGCC 3 ' ) [lane 4] or with the
  • Fig. 4 Detail from a protein sequence comparison of the catalytic telomerase subunits of Euplotes pl23 ( ⁇ l23) and humans (phTC).
  • Rectangles symbolize sequence sections coding for protein, while the light gray areas 5 'and 3' symbolize untranslated cDNA regions or represent intron sequences.
  • the dark gray blocks in the rectangle for the filling length cDNA either represent the telomerase-specific motif (T) or the seven Reverse transcriptase motifs (number 1-7)
  • the DNA fragments that are necessary to display the complete hTC cDNA are also shown as rectangles and marked according to their origin. All rectangles are arranged in their position relative to each other.
  • the origin of the DNA fragment, for which the rectangle AA261296 stands, is in Describe Example 2
  • Fig. 13 Detail sections from a protein sequence comparison of the catalytic telomerase subunits of Euplotes and humans (hTC).
  • the figure shows excerpts from a protein sequence comparison between the catalytic telomerase subunits of Euplotes and humans (hTC).
  • the motifs for reverse transcriptase are highlighted in the outlined boxes. The numbers below the borders relate to the respective amino acid position in FIG. 2.
  • the amino acid residues are shown in accordance with their one-letter code. Identical amino acids are printed in bold.
  • RT consensus consensus sequence for the reverse transcriptase
  • telomerase-specific motif is described in Example 9.
  • Fig. 14 Generated DNA sequence from Example 11 (3 'variant) (SEQ ID No. 7). The region that is not homologous to the DNA sequence shown in FIG. 1 is highlighted in bold.
  • Fig. 15 hTC expression in cancer cells and in normal human tissue.
  • Fig. A According to the manufacturer (Clontech), about 2 ⁇ g poly A + RNA from various human cell lines were immobilized on the Northern blot. Specifically, the RNA came from melanoma (G361), lung carcinoma (A549), colon adenocarcinoma (SW480), Burkitt's lymphoma Raji, leukemia cell line (MOLT-4), chronic leukemia cell line (K - 562), from a cervical tumor (HeLa) and from the leukemia cell line HL60. The labeled 4.4 kb, 6 kb and 9.5 kb transcripts are specific for hTC (see Example 10).
  • Fig. B According to the manufacturer (Clontech), approximately 2 ⁇ g poly A + RNA from various human tissues were immobilized on the Northern blot. In detail, the RNA from the heart, brain, placenta,
  • RNA size standard is shown.
  • Fig. 16 Western blot analysis of the rabbit sera against peptides from the human telomerase amino acid sequence (Example 12). In each case 20 ⁇ l of the bacterial lysates from Example 13 were analyzed with the aid of the antisera from Example 12 in a Western blot (Ausubel et al, 1987). In lanes 1, 2, 6 and 7, lysates from bacteria containing the pMALEST construct were applied. Lanes 3 from bacteria, which contain the pMALAl construct, were applied in lanes 3, 4, 8 and 9. In lanes 1, 3, 6 and 8, lysates are not made with IPTG
  • Fig. A with lanes 1 to 4 was incubated with preimmune sera against peptide B (compare example 12).
  • the PNDF membrane in Fig. B with lanes 6 to 9 was incubated with preimmune sera against peptide C (see example 12).
  • the PVDF membrane in Fig. B with lanes 1 to 4 was incubated with immune sera against peptide B (see example 12).
  • Fig. 17 Autoradiogram of 35 S-labeled, in vitro translated protein. The complete in vitro translated hTC was plotted in lane 1 (see example
  • Lane 3 shows one supplied by the manufacturer (see example 15) Positive control for in vitro translation
  • a protein size standard is marked on the right side
  • TRAP assay approach with partially purified human telomerase from HeLa cells was applied as a positive control.
  • lanes 5 and 6 a TRAP assay approach with in vitro translated was applied undiluted phTC
  • lanes 7 and 8 a TRAP assay approach with in vitro translated phTC was applied in a 1 4 dilution.
  • lanes 9 and 10 a TRAP assay approach with in vitro translated phTC in a 1 16 dilution was applied In lanes 1 1 and 12, a TRAP assay approach with in vitro translated luciferase was applied as a negative control
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Reading frame +1 is referred to below as EST +] .
  • the homology between pl23 and the EST + i is most noticeable in two sequence regions, which are separated by 30 amino acids.
  • the second homology block extends from amino acid 513 to 530 in the pl23 protein and has a 44% identity to the corresponding sequence section in the identified EST + i, taking amino acid residues into account similar properties there is a match of 61%
  • P Probabi ty
  • P indicates the probability with which a specific segment pair was also found in a BLAST search with a random sequence and ranges numerically between 0 (result highly significant) and 1 (result irrelevant)
  • hTPl Telomerase-associated protein 1
  • the corresponding gene is therefore abbreviated to hTC (human telomerase, catalytic) and the derived protein to phTC.
  • the EST identified by comparison with pl23 was entered in the EST database on April 2, 1997 and is not published in any journal.
  • the cDNA library in which this EST clone is present was prepared as follows, according to the National Center for Biotechnology Information:
  • Restriction enzyme interfaces Not I and Eco RI cloned into the vector pT7T3D-Pac.
  • the 389 bp fed into the EST database was sequenced using the - 28ml3 rev2 primer from Amersham (DNA sequence see FIG. 1 position 1685 to 2073).
  • the derived protein sequence from EST + i is composed of 129 amino acids, including 27 basic, 11 acidic, 51 hydrophobic and 28 polar amino acid residues.
  • the EST (AA 281296) identified in Example 1 was purchased commercially from Research Genetics, Inc. (Huntsville) in the form of a plasmid transformed in E. coli and analyzed experimentally: As shown in the ethidium bromide-stained agarose gel of FIG. 3, an approximately 2.2 kb fragment from the vector pT7T3D is released after restriction digestion of the plasmid DNA produced by EST AA 281296 using a polymerase chain (PCR) reaction carried out in parallel with specific internal reactions The AA AA121296 was checked for primers. The length of the expected PCR products is 325 and 380 bp and corresponds to the length of the fragments found experimentally (cf. lanes 4 and 5 in FIG. 3). It was thus possible to show that the length obtained by Research Genetics, Int (Huntsville) sent E coli clone contains the identified EST as a plasmid
  • the DNA sequence of clone AA281296 is thus composed of the sequence information from FIG. 1 (positions 1685 to 2351 and positions 2534 to 4042)
  • pl23 from Euplotes aediculatus and est2p from Saccharomyces cerevisiae are homologous to each other around the degree of relationship
  • the region of pl23 (amino acids 437-554) described above was also compared with est2p using the Lipman-Pearson protein comparison using identical parameters. It was found that p123 and est2p are 21% identical in this selected region or 22% identical amino acids or biochemically similar amino acid residues (see FIG. 5). Accordingly, the homology between EST +] and the pl23 of Euplotes is significantly higher than between the pl23 and est2p.
  • est2p was compared to EST + i under the conditions mentioned in Example 3 (see FIG. 6). It turned out that EST + i has 20% identity to est2p, a comparable one
  • hydrophobic amino acids such as leucine and isoleucine and the amino acids lysine and arginine in certain positions (Fig. 7 and 13)
  • Subunit of human telomerase represents
  • sequence information from the RACE rounds was used to amplify the individual fragments as a coherent cDNA clone by PCR
  • the PCR product was diluted 1,50. Five ⁇ l of this dilution were mixed in a second “nested” PCR together with 10 pmol dNTP mix in 1 ⁇ Kien Taq PCR reaction buffer and 1 ⁇ Advantage Kien Taq polymerase mix as well 10 pmol of the primer GSP2 and 10 pmol of the “nested” marathon adapter primer AP2 (5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3 ', Clontech) were used.
  • the PCR conditions corresponded to the parameters selected in the first PCR. The only exception were in the last PCR step only 16 cycles selected instead of 22 cycles A 1,153 bp DNA fragment was obtained as the product of this nested RACE PCR. This was cloned into the TA cloning vector pCR2 1 from InVitrogen and completely double-stranded sequenced (FIG. 8 and SEQ ID No. 3).
  • Nucleotides 974 to 1153 represent the nucleotide region 1629 to 1808 of the hTC cDNA shown in FIG. 1.
  • the nucleotide region extending from bp 1-973, which has no homology to the hTC cDNA sequence shown in FIG. 1, is intron sequences of the hTC gene (data not shown)
  • a 3'-splice consensus sequence can be found at the exon-intron junction.
  • the presence of intron sequences could be due to incompletely spliced mRNA as the starting substance for cDNA synthesis. Genomic DNA contamination in the cDNA could explain the discovery of intron sequences
  • a second RACE was carried out with the gene-specific primer GSP5 from the 5 'region of RACE product 1 (5'-GGCAGTGACCAGGAGGCAACGAGAGG-3') and the API primer.
  • Marathon was used as the cDNA source -Ready cDNA from human testis (Clontech, catalog number 7414-1) was used.
  • the same PCR conditions were used as in the first
  • PCR selected in RACE round 1 Also in RACE round 2, a 2 "nested” PCR with diluted PCR product was connected to the 1 PCR as a cDNA source.
  • the gene-specific primer GSP6 from FIG. 5 ' was used as the "nested” PCR primer.
  • Region of RACE product 1 (5'-GGCACACTCGGCAGGAAACGCACATGG-3 ') and the AP2 primer used. The conditions corresponded to the parameters of the nested PCR from the RACE round
  • the 412 bp long PCR product of the nested PCR from RACE round 2 was cloned into the TA cloning vector pCRII-Topo from Invitrogen and completely sequenced (FIG. 9 and SEQ ID No 4).
  • the sequence section from bp 267 to bp 412 is completely homologous to the 5 'area of the product from RACE 1
  • This RACE product 2 is probably completely an intron region of the hTC gene (data not shown).
  • a third round of RACE led to the identification of further 5'-located hTC cDNA regions.
  • a gene-specific primer GSP9 (5'-CCTCCTCTGTTCACTGCTCTGGCC-3 ') from the 5' range of RACE product 2 was selected and together with the API primer and marathon-ready cDNA from human Testis (from Clontech) used in a new RACE.
  • RACE conditions were the same as for the 1st PCR in RACE 1 and 2.
  • a 1012 bp fragment (Fig. 10 and SEQ ID No. 5) was amplified and into the TA-cloning vector pCRII-
  • Consensus sequence can be found at the exon-intron junction.
  • a PCR was carried out on RACE 2 and the clone AA281296. Marathon-Ready cDNA from human testis (Clontech; catalog number 7414-1) was used as the cDNA source. The PCR was carried out as described under RACE 1 (compare Example 6), but with the primers C5F (5'-CGAGTGGACACGGTGATCTCTGCC-3 ') from the 5' region of RACE 2 and the primer C3B (5'-GCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-
  • a 2486 bp DNA fragment hereinafter referred to as the C5F fragment, was obtained as the product of this PCR. This was used in the TA cloning vector pCRII-TOPO
  • Clontech, cat. No. HL5016b from the human leukemia cell line K562. About 3x10 p soda of this random and oligo dT primed library were plated as in Ausubel et al, (1987) and used for screening. A 719 bp long (position 1685 to 2404, corresponding to FIG. 1) radioactively labeled hTC-DNA fragment was used as the sample.
  • ⁇ clone 12 was verified as positive after rescreening with the same hTC probe. After plaque purification and ⁇ DNA preparation (Ausubel et al, 1987), the 4 kb insert was cloned into the vector pBluescript and sequenced (FIG. 11 and SEQ ID No. 6). A comparison of the ⁇ clone 12 sequence with the sequences of the RACE clones and the DNA sequence from clone AA281296 showed that this clone identified in the homology screening codes for a 5 ' part of the hTC cDNA and a putative ATG start codon in position 63 corresponding to FIG. 1.
  • Reading frame over about 400 bp is identical to various ESTs that are not related to the hTC cDNA.
  • the ⁇ clone 12 is thus a chimeric clone, which is composed essentially of the 5 'end of the hTC cDNA and another cDNA clone of unknown function.
  • FIG. 1 A summary schematic representation with the relative orientation of the RACE products and the homology screening is shown in FIG. The complete sequence of the hTC cDNA (FIG. 1) was obtained from the ⁇ clone 12 (positions 21 to 1655 corresponding to FIG. 11), the PCR product C5F (positions 1636 to 3908 corresponding to FIG. 1) and the EST AA281296 (Position 3909 to 4042 according to FIG. 1) composed.
  • RT motifs motifs for reverse transcriptases
  • FIG. 13 A consensus sequence of reverse transcriptases (Poch et al., 1989, Xiong and Eickbush, 1990) identified a total of seven motifs for reverse transcriptases (RT motifs) (FIG. 13). Within these motifs, some amino acids are highly conserved not only between the RT consensus sequence and the phTC, but also in comparison to the telomerase protein from Euplotes. For example, in RT motif 5 two aspartic acids
  • telomerase motif positions 553 and 565 in FIG. 2 is a structure specific for this protein family, since it does not occur in any protein known to date.
  • Another feature only identified in the catalytic telomerase proteins is the distance between the RT motifs 3 and 4, which at 107 amino acids is significantly larger than in other RTs.
  • telomerase RNA subunit does not correlate with the telomerase activity, but is observed ubiquitously (Feng et al, 1995). This raises the question of whether the expression of the catalytic telomerase subunit is associated with the telomease activity.
  • Northern blot experiments (Ausubel et al, 1987) were carried out to analyze the level of hTC expression.
  • the commercially available Northern blots were either with a series of RNA preparations from normal human tissue (Clontech; catalog number 7760-1) or with RNA samples from human cancer cells (Clontech;
  • RNA transcripts were approximately the size 9.5 kb and 4.4 kb and an RNA subtranscript of approximately 6 kb were detected, which cross-hybridize with the sample (FIG. 15, FIG. A).
  • the hTC mRNA was most strongly expressed in the leukemia cell lines K-562 and HL-60 (FIG. 15, FIG. A).
  • the hTC transcript could not be detected in the normal tissues tested (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney and pancreas)
  • PCR reaction took place in 3 steps. First the DNA was denatured for 3 min at 94 ° C. 34 cycles followed, in which the DNA was denatured successively for 45 sec at 94 ° C, then for 1 min at 68 ° C the primer was attached and then the DNA chain was extended for 3 min at 72 ° C. In the last PCR step, a final chain extension was carried out for 10 min at 72 ° C. The resulting PCR products were added to the TA cloning vector pCR2 1 cloned by InVitrogen
  • the cDNA synthesis kit from Boehringer Mannheim made from 2 ⁇ g DNasel-treated poly A-RNA of the human pramyeloid cell line, was first used
  • HL60 a cDNA synthesis was carried out according to the manufacturer's instructions. In a final volume of 50 ⁇ l, 1 ⁇ l of this HL60 cDNA was then mixed with 10 pmol each of the primers GSPlvor and HTRT3A and 10 pmol of dNTP mix and after addition of 1.25 ⁇ l of DMSO A PCR reaction was carried out in 1 x Kien Taq PCR reaction buffer and 1 x Advantage Kien Taq Polymerase Mix (Clontech). The PCR reaction was carried out in 3 steps.
  • Variant 1 of the human hTC cDNA is distinguished by a 182 bp deletion of nucleotides 2345 to 2526. This deletion results in a shift in the ORF and a shortened hTC protein is read, which lacks the RT motifs 4 to 7
  • Variant 2 of the human hTC cDNA has a 36 bp deletion of nucleotides 2184 to 2219.
  • the RT motif 3 is lost as a result of this deletion. However, the reading frame is retained and a protein is produced which selectively lacks the RT motif 3
  • Variant 3 of the human hTC cDNA represents a combination of variants 1 and 2. It has both a deletion of bp 2184 to 2219 and bp 2345 to 2526
  • Variant 4 of the human hTC cDNA is characterized by the loss of the nucleotide region from bp 3219 to 3842. This missing sequence is replaced by a sequence which is not homologous to hTC. From bp 3843, the sequence is again completely identical to the hTC shown in FIG Sequence The sequence of variant 4 is shown in FIG. 14. According to the selected 5 'primer, it begins with bp 1783 of the hTC cDNA shown in FIG 14 and SEQ ID No 7) at DNA level 98.7% with an EST (Accession No. AA299878) from a human uterine tumor
  • FIG. 1 In order to obtain antisera with specificity for the catalytic subunit of human telomerase, the existing nucleotide sequence (FIG. 1) was translated into an amino acid sequence (FIG. 2) with the aid of a program for secondary structure prediction (PROTEAN, from the software package DNAStar, DNASTAR Ine, Madison, WI, USA), two peptides were selected that are likely to elicit an immune response The following peptides are shown in the one-letter code for amino acids:
  • underlined cysteines do not come from the telomerase sequence, but have been added as linkers for the coupling
  • the peptides were isolated via the thiol-reactive coupling reagent m-maleimido-benzoyl-N-
  • MMS Hydroxysuccinimide ester
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • pMalAl contains the nucleotide sequence of FIG. 1 from position 1789 to position 3908. This DNA fragment was PCR-primed with the primers C5A (5'- ACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTG-3 ') and C3B (5'-
  • TA cloning vector pCRII-TOPO from Invitrogen.
  • the PCR conditions were carried out as described in Example 7.
  • the insert was cut out with the restriction enzyme Eco RI, the cut-outs filled in with the Klenow fragment (Ausubel et al, 1987) and in the bacterial expression vector pMAL-C2 (Fa.
  • the protein expression using these constructs was carried out in the bacterial strain E. coli DH5 ⁇ .
  • the expression conditions were as described in the operating instructions from New England Biolabs (catalog number 800).
  • the bacterial lysates produced were tested in a Western blot experiment (Ausubel et al, 1987).
  • Example 13 The bacterial lysates from Example 13 were analyzed with the aid of the antisera from Example 12 in a Western blot (Ausubel et al, 1987).
  • fusion proteins in the size of approximately 74 kDa and 106 kDa are expected for the constructs pMalEST and pMalAl, respectively.
  • Protein component can be reconstituted together with the RNA component in vitro
  • HTR2BAM (5'-CGCGGATCCCGGCGAGGGGTGACGGATGC-3) from a 293 cell cDNA library containing a PCR of 293 cell cDNA in one of the nucleotides HTRotid 100 AMP 3 ⁇ l cDNA from 293 cells were mixed with 10 pmol dNTP mix and in 1 x PCR reaction buffer with 0.5 ⁇ l
  • Taq polymerase (Gibco) carried out a PCR reaction. 10 pmol each of the primers HTR9BAM and HTR2BAM were added. The PCR was carried out in 3 steps. A ten-minute denaturation at 94 ° C was followed by 35 PCR cycles, in which the DNA was first denatured for one minute at 94 ° C and then the primers were attached for 2 min at 62 ° C and the DNA chain was extended This was followed by a chain extension at 72 ° C for 4 min. The resulting PCR products were cloned into the Bam HI site of the vector pUC19 after restriction digestion with Bam HI, so that the RNA component is under the control of the T7 promoter. This construct is referred to below as HTR504
  • the 341 1 bp long cDNA fragment (position 60 to position 3470, FIG. 1) was cloned into the vector PCRII TOPO (Invitrogen). Detailed information on the cloning is provided described in Examples 8 and 7, and in Fig. 12, respectively.
  • the T7 promoter lies 5 'in front of the hTC cDNA.
  • the catalytic telomerase protein component was synthesized after addition of the hTC FL construct in a commercially available transcription / translation system according to the manufacturer's instructions (Promega; catalog number L4610).
  • the successful in vitro translation of the expected 127 kDa product was checked using 35 S-labeled cysteine in an SDS-PAGE (Ausubel et al, 1987) (FIG. 17).
  • telomerase RNA component was carried out with a transcription system according to the manufacturer (Ambion; catalog number 1344) or according to the method described by Pokrovskaya and Gurevich (1994).
  • Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Be. 89, 10114-10118.
  • RNA component of human telomerase Science 269, 1236-1241.
  • telomere terminal transferase of Tetrahymena IS a ⁇ bonucleoprotein enzyme with two kinds of p ⁇ mer specificity Cell 51, 887-898
  • TCGTGGAGAC CATCTTTCTG GGTTCCAGGC CCTGGATGCC AGGGACTCCC CGCAGGTTGC 1200
  • TGCAAGCCAC CGTGCCCGGC ATACCTTGAT CTTTTAAAAT GAAGTCTGAA ACATTGCTAC 540
  • TTTTATGTCA CGGAGACCAC GTTTCAAAAG AACAGGCTCT TTTTCTACCG GAAGAGTGTC 1140
  • MOLEK type cDNA
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • GCCGCTGTAC CAGCTCGGCG CTGCCACTCA GGCCCGGCCC CCGCCACACG CTAGTGGACC 660
  • CCGAAGGCGT CTGGGATGCG AACGGGCCTG GAACCATAGC GTCAGGGAGG CCGGGGTCCC 720 CCTGGGCCTG CCAGCCCCGG GTGCGAGGAG GCGCGGGGGC AGTGCCAGCC GAAGTCTGCC 780
  • CTCTGTGGCG GCCCCCGAGG AGGAGGACAC AGACCCCCGT CGCCTGGTGC AGCTGCTCCG 1440
  • GGTGTGCACC AACATCTACA AGATCCTCCT GCTGCAGGCG TACAGGTTTC ACGCATGCGT 1320

Abstract

The invention relates to the nucleotide sequence and the protein sequence derived therefrom, which encodes for the human catalytic telomerase sub-unit. The invention furthermore relates to methods involving a pharmaceutical, diagnostic or therapeutic use of this gene/protein, principally for treating cancer and ageing.

Description

Humane katalvtische Telomerase-Untereinheit und deren diagnostische und therapeutische VerwendungHuman telomerase catalytic subunit and its diagnostic and therapeutic use
Aufbau und Funktion der ChromosomenendenStructure and function of the chromosome ends
Das genetische Material eukaryontischer Zellen ist auf linearen Chromosomen verteilt. Die Enden der Erbanlagen werden, abgeleitet von den griechischen Wörtern telos (Ende) und meros (Teil, Segment), als Telomere bezeichnet. Die meisten Telomere bestehen aus Wiederholungen von kurzen Sequenzen, die überwiegend aus Thymin und Guanin aufgebaut sind (Zakian, 1995). Die Telomersequenzen verwandter Organismen sind oft ähnlich und sogar zwischen phyllogenetisch weiter entfernten Spezies konserviert. Bemerkenswert ist, daß in allen bislang untersuchten Wirbeltieren die Telomere aus der Sequenz TTAGGG aufgebaut werden (Meyne et al., 1989).The genetic material of eukaryotic cells is distributed on linear chromosomes. The ends of the genes are derived from the Greek words telos (end) and meros (part, segment) as telomeres. Most telomeres consist of repetitions of short sequences, which are mainly composed of thymine and guanine (Zakian, 1995). The telomeric sequences of related organisms are often similar and even conserved between more distant species. It is remarkable that in all vertebrates examined so far, the telomeres are built up from the sequence TTAGGG (Meyne et al., 1989).
Die Telomere üben verschiedene wichtige Funktionen aus. Sie verhindern die Fusion von Chromosomen (McClintock, 1941) und damit die Entstehung von dizentrischen Erbanlagen. Solche Chromosomen mit zwei Centromeren können durch Verlust der Heterozygotie bzw. Verdopplung oder Verlust von Genen zur Entwicklung von Krebs fuhren.The telomeres perform various important functions. They prevent the fusion of chromosomes (McClintock, 1941) and thus the development of dicentric inheritance. Such chromosomes with two centromeres can lead to the development of cancer by loss of heterozygosity or doubling or loss of genes.
Desweiteren dienen Telomere dazu, intakte Erbanlagen von beschädigten zu unterscheiden. So stellten Hefezellen ihre Zellteilung ein, wenn sie ein Chromosom ohne Telomer enthielten (Sandeil und Zakian, 1993).Furthermore, telomeres serve to distinguish intact hereditary systems from damaged ones. For example, yeast cells stopped dividing when they contained a chromosome without telomer (Sandeil and Zakian, 1993).
Eine weitere wichtige Aufgabe erfüllen Telomere bei der DNA-Replikation eukaryontischerAnother important task is performed by telomeres in the replication of eukaryotic DNA
Zellen. Im Gegensatz zu den zirkulären Genomen von Prokaryonten können die linearen Chromosomen der Eukaryonten von dem DNA Polymerase-Komplex nicht vollständig repliziert werden. Zur Initiation der DNA-Replikation sind RNA-Primer notwendig. Nach Abspaltung der RNA-Primer, Verlängerung der Okazaki-Fragmente und anschließender Ligation fehlt dem neu-synthetisierten DNA-Strang das 5'-Ende, denn dort kann der RNA-Cells. In contrast to the circular genomes of prokaryotes, the linear chromosomes of the eukaryotes cannot be completely replicated by the DNA polymerase complex. RNA primers are required to initiate DNA replication. After cleavage of the RNA primer, extension of the Okazaki fragments and subsequent ligation, the newly synthesized DNA strand lacks the 5 'end, because there the RNA
Primer nicht durch DNA ersetzt werden. Ohne besondere Schutzmechanismen würden daher die Chromosomen mit jeder Zellteilung schrumpfen ("end-replication problem"; Harley et al, 1990). Die nicht-kodierenden Telomersequenzen stellen vermutlich eine Pufferzone dar, um dem Verlust von Genen vorzubeugen (Sandeil und Zakian, 1993).Primer cannot be replaced by DNA. Without special protective mechanisms, the chromosomes would shrink with every cell division ("end-replication problem"; Harley et al, 1990). The non-coding telomer sequences presumably represent a buffer zone to prevent the loss of genes (Sandeil and Zakian, 1993).
Darüberhinaus spielen Telomere auch eine wichtige Rolle bei der Regulation der zellulären Alterung (Olovnikov, 1973). Humane somatische Zellen zeigen in Kultur eine limitierteIn addition, telomeres also play an important role in regulating cellular aging (Olovnikov, 1973). Human somatic cells show a limited culture
Replikationskapazität; sie werden nach einer gewissen Zeit seneszent. In diesem Zustand teilen sich die Zellen selbst nach Stimulierung mit Wachstumsfaktoren nicht mehr, sterben aber nicht, sondern bleiben metabolisch aktiv (Goldstein, 1990). Verschiedene Beobachtungen sprechen für die Hypothese, daß eine Zelle anhand der Länge ihrer Telomere bestimmt, wie oft sie sich noch teilen kann (Allsopp et al., 1992).Replication capacity; after a certain time they become senese. In this state, the cells no longer divide even after stimulation with growth factors, but do not die, but remain metabolically active (Goldstein, 1990). Various observations support the hypothesis that a cell uses the length of its telomeres to determine how often it can still divide (Allsopp et al., 1992).
Zusammenfassend besitzen die Telomere somit zentrale Funktionen bei der Alterung von Zellen sowie der Stabilisierung des genetischen Materials und Verhinderung von Krebs.In summary, the telomeres have central functions in the aging of cells and the stabilization of genetic material and prevention of cancer.
Das Enzym Telomerase synthetisiert die TelomereThe enzyme telomerase synthesizes the telomeres
Wie oben beschrieben können Organismen mit linearen Chromosomen ohne einen speziellen Schutzmechanismus ihr Genom nur unvollständig replizieren. Die meisten Eukaryonten verwenden zur Regeneration der Telomersequenzen ein spezielles Enzym, die Telomerase. In den bislang untersuchten Einzellern wird Telomerase konstitutiv expremiert. Dagegen wurde in Menschen die Telomerase- Aktivität nur in Keimzellen und Tumorzellen gemessen, wogegen benachbartes somatisches Gewebe keine Telomerase enthielt (Kim et al, 1994).As described above, organisms with linear chromosomes can only partially replicate their genome without a special protective mechanism. Most eukaryotes use a special enzyme, telomerase, to regenerate the telomer sequences. Telomerase is constitutively expressed in the unicellular organisms examined so far. In contrast, telomerase activity was only measured in germ cells and tumor cells in humans, whereas neighboring somatic tissue contained no telomerase (Kim et al, 1994).
Telomerase in CiliatenTelomerase in ciliates
Die Telomerase wurde, wie auch die Telomere, zuerst im Ciliaten Tetrahymena thermophila identifiziert. Die Telomerase-Aktivität wurde durch Verlängerung des einzel- strängigen Oligonukleotides d(TTGGGG)4 in Gegenwart von dTTP und dGTP nachgewiesen (Greider und Blackbum, 1985). Dabei wurde an den Primer wiederholt die 7etr 2y»2e«α-Telomersequenz TTGGGG angehängt. Selbst wenn als Ausgangsmaterial einThe telomerase, like the telomeres, was first identified in the ciliate Tetrahymena thermophila. Telomerase activity was demonstrated by extending the single-stranded oligonucleotide d (TTGGGG) 4 in the presence of dTTP and dGTP (Greider and Blackbum, 1985). The 7etr 2y “2e” α-telomer sequence TTGGGG was repeatedly attached to the primer. Even if as a starting material
Oligonukleotid mit der unregelmäßigen Telomersequenz von Saccharomyces cerevisiae, T(G)ι_3, angeboten wurde, verlängerte die Telomerase den Primer mit der Telomersequenz von Tetrahymena (Greider und Blackburn, 1985) Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, daß die Telomerase selbst die Vorlage für die Sequenz der Telomere mit sich führtOligonucleotide with the irregular telomer sequence from Saccharomyces cerevisiae, T (G) ι_3, the telomerase extended the primer with the telomer sequence von Tetrahymena (Greider and Blackburn, 1985) From these results it was concluded that the telomerase itself carries with it the template for the sequence of the telomeres
Nachdem zunächst die Existenz einer RNA-Komponente in der Telomerase nachgewiesen werden konnte (Greider und Blackburn, 1987), wurde kurze Zeit spater das Gen für die RNA-Untereinheit der Telomerase kloniert (Greider und Blackburn, 1989) Diese RNA enthalt eine Region mit dem Komplement zur Telomersequenz von Tetrahymena (nachfolgend "Komplement-Region" genannt) Die Telomerase-Aktivitat war abhangig von der RNA-Komponente, was durch Verdau der RNA mit nachfolgendem Verlust derAfter the existence of an RNA component in telomerase could first be demonstrated (Greider and Blackburn, 1987), the gene for the RNA subunit of telomerase was cloned a short time later (Greider and Blackburn, 1989). This RNA contains a region with the Complement to the telomeric sequence of Tetrahymena (hereinafter referred to as "complement region") The telomerase activity was dependent on the RNA component, which was caused by digestion of the RNA with subsequent loss of
Aktivität gezeigt werden konnte Wurde die Telomerase-RNA in ihrer Komplement-Region mutiert, so wurden die entsprechenden Mutationen in vivo in die Telomere von Tetrahymena eingebaut (Yu et al, 1990) Die Telomerase gehört demnach zur Klasse der RNA-abhangigen DNA-PolymerasenActivity could be shown If the telomerase RNA was mutated in its complement region, the corresponding mutations were incorporated into the telomeres of Tetrahymena in vivo (Yu et al, 1990). The telomerase therefore belongs to the class of RNA-dependent DNA polymerases
Die ersten Protein-Untereinheiten der 7etr ?y/we« -Telomerase, p80 und p95, wurden 1995 identifiziert (Collins et al, 1995) Die Beobachtung, daß p95 das Enzym an der DNA verankert und p80 die RNA-Komponente bindet, führte zu folgendem Modell Die Telomerase-RNA lagert sich mit ihrer Komplement-Region an den einzelstrangigen 3'- Überhang an Die Verlängerung des 3 '-Überhangs geschieht durch Einbau der entsprechenden Nukleotide in 5 '-3 '-Richtung Die de «ovo-Synthese von Telomeren beinhaltet wahrscheinlich einen Elongations- und einen Translokationsschπtt Ist eine Telomersequenz synthetisiert worden, bewegt sich die Telomerase vermutlich an der DNA entlang, bis sie wieder in einer Position ist, um eine vollständige Telomersequenz hinzuzufügen Dieses Modell muß nicht allgemeingültig sein, denn zwischen Telomerasen unterschiedlicher Spezies bestehen große Unterschiede in der Anzahl der Nukleotide, die das Enzym addiert bevor es vom Telomer dissoziiert (Prowse et al, 1993)The first protein subunits of 7etr? Y / we «telomerase, p80 and p95, were identified in 1995 (Collins et al, 1995) The observation that p95 anchors the enzyme to the DNA and p80 binds the RNA component led to following model The complement region of the telomerase RNA attaches to the single-stranded 3 'overhang. The 3' overhang is extended by incorporating the corresponding nucleotides in the 5 '-3' direction. The de «ovo synthesis of telomeres likely includes an elongation and a translocation step. Once a telomeric sequence has been synthesized, the telomerase will likely move along the DNA until it is back in position to add a complete telomeric sequence.This model does not have to be general, since telomerases of different species exist large differences in the number of nucleotides that the enzyme adds before it dissociates from the telomer (Prowse et al, 1993)
Darüberhinaus wurden kurzlich auch Telomerase-Untereinheiten anderer Organismen identifiziert In dem Ciliaten Euplotes aediculatus wurden zwei Protein-Untereinheiten, pl23 und p43, gefunden, welche keine Homologie zu den Tetrahymena-TύomerasQ-In addition, telomerase subunits from other organisms were also recently identified. Two protein subunits, pl23 and p43, were found in the ciliate Euplotes aediculatus, which have no homology to the Tetrahymena TύomerasQ-
Proteinen zeigen Die Telomerase-Untereinheit pl23 weist an ihrem N-Terminus eine basische Domäne und am C-Terminus eine Domäne für eine Reverse Transkriptase (RT) auf, was auf eine katalytische Funktion dieses Proteins hindeutet (Lingner et al, 1997) Darüberhinaus wurde eine signifikante Homologie von pl23 zu dem von Lundblad gefundenen Protein Est2 aus Saccharomyces cerevisiae beschrieben (Lingner et al , 1997)Show proteins The telomerase subunit pl23 has one at its N-terminus basic domain and a domain for a reverse transcriptase (RT) at the C-terminus, which indicates a catalytic function of this protein (Lingner et al, 1997). Furthermore, a significant homology of pl23 to the protein Est2 found by Lundblad from Saccharomyces cerevisiae was found described (Lingner et al, 1997)
Wahrend für p80 und p95 bisher keine essentielle Funktion für die Telomeraseaktivitat nachgewiesen wurde, konnte für die potentiellen katalytischen Untereinheiten der Telomerase pl23/est2p eindeutig eine Schlusselfünktion aufgezeigt werden Eine Mutation des RT-Aktivitatzentrums von est2p führte zu einer signifikanten Verkürzung der Telomere in Hefezellen (Lingner et al , 1997)While no essential function for telomerase activity has been demonstrated for p80 and p95, a key function was clearly demonstrated for the potential catalytic subunits of telomerase pl23 / est2p. A mutation of the RT activity center of est2p led to a significant shortening of the telomeres in yeast cells (Lingner et al, 1997)
Telomerase-Komponenten aus SaugerzellenTelomerase components from suction cells
Inzwischen wurden die RNA-Komponenten der Telomerasen von verschiedenen Or- ganismen, unter anderem von Saccharomyces cerevisiae, Mausen und Menschen (Singer und Gottschling, 1994, Blasco et al, 1996, Feng et al, 1995), kloniert Alle bislang bekannten Telomerase-RNAs enthalten eine Region, die komplementär zu der Telomersequenz des jeweiligen Organismus ist Die Primarsequenz der humanen Telomerase-RNA (hTR) weist jedoch keine Ähnlichkeiten mit den RNA-Komponenten der Ciliaten oder Saccharomyces cerevisiae auf Dagegen existieren konservierte Bereiche zwischen der humanen und der murinen Telomerase-RNA (Feng et al , 1995)In the meantime, the RNA components of telomerases have been cloned from various organisms, including Saccharomyces cerevisiae, mice and humans (Singer and Gottschling, 1994, Blasco et al, 1996, Feng et al, 1995). All previously known telomerase RNAs contain a region that is complementary to the telomeric sequence of the respective organism The primary sequence of human telomerase RNA (hTR), however, is not similar to the RNA components of the ciliates or Saccharomyces cerevisiae. In contrast, conserved areas exist between human and murine telomerase. RNA (Feng et al, 1995)
Vor kurzem wurde die Isolation eines humanen Telomerase-assoziertes Proteins (hTPl) beschrieben (Harrington et al, 1997) Das korrespondierende Gen wurde aufgrund seiner Homologie zu der Tetrahymena Telomerase Untereinheit p80 in einer nicht derThe isolation of a human telomerase-associated protein (hTPI) has recently been described (Harrington et al, 1997). The corresponding gene was not found in a p80 gene because of its homology to the Tetrahymena telomerase subunit
Allgemeinheit zuganglichen EST Datenbank gefunden (Harrington et al , 1997) hTPl ist aus 2627 Aminosäuren zusammengesetzt und zeigt im N-Teminus drei Domänen, welche maximal zu 46% homolog zu p80 sind Als weiteres Strukturelement konnten im C- terminalen Bereich 16 Wiederholungen aus den Aminosäuren Tryptophan und Asparagin aufgezeigt werden, die vermutlich eine Protein-Protein Interaktion vermitteln Aktivierung der Telomerase in menschlichen TumorenCommonly accessible EST database found (Harrington et al, 1997) hTPl is composed of 2627 amino acids and shows three domains in N-Teminus, which are maximally 46% homologous to p80. As a further structural element, 16 repeats of the amino acids could be found in the C-terminal region Tryptophan and asparagine are shown, which presumably mediate a protein-protein interaction Activation of telomerase in human tumors
Eine Aktivität der Telomerase konnte in Menschen ursprunglich nur in Keimbahnzellen, nicht aber in normalen somatischen Zellen (Hastie et al, 1990, Kim et al, 1994) nach- gewiesen werden Nach der Entwicklung eines sensitiveren Nachweisverfahrens (Kim et al,An activity of telomerase was originally only detectable in germline cells, but not in normal somatic cells (Hastie et al, 1990, Kim et al, 1994). After the development of a more sensitive detection method (Kim et al,
1994) wurde auch in hematopoietischen Zellen eine geringe Telomeraseaktivitat detektiert (Broccoli et al, 1995, Counter et al, 1995, Hiyama et al, 1995) Allerdings wiesen diese Zellen trotzdem eine Reduktion der Telomere auf (Vaziri et al, 1994, Counter et al , 1995) Noch ist nicht geklart, ob die Menge an Enzym in diesen Zellen nicht ausreichend für eine Kompensation des Telomerverlustes ist, oder ob die gemessene Telomerase-Aktivitat von einer Subpopulation, z B unvollständig ausdifferenzierten CD34+38+- Vorlauferzellen, herrührt (Hiyama et al, 1995) Zur Klarung wäre ein Nachweis der Telomerase-Aktivitat in einer einzelnen Zelle notigIn 1994, low telomerase activity was also detected in hematopoietic cells (Broccoli et al, 1995, Counter et al, 1995, Hiyama et al, 1995) However, these cells nevertheless showed a reduction in telomeres (Vaziri et al, 1994, Counter et al , 1995) It is not yet clear whether the amount of enzyme in these cells is not sufficient to compensate for telomer loss, or whether the measured telomerase activity stems from a subpopulation, e.g. incompletely differentiated CD34 + 38 + precursor cells (Hiyama et al, 1995) For clarification, evidence of telomerase activity in a single cell would be necessary
Interessanterweise wurde jedoch in einer großen Zahl der bislang getesteten Tumorgeweben eine signifikante Telomerase-Aktivitat nachgewiesen (1734/2031, 85%, Shay, 1997), wahrend in normalem somatischen Gewebe keine Aktivität gefunden wurde (1/196, <1%, Shay, 1997) Verschiedene Untersuchungen zeigten außerdem, daß in seneszenten Zellen, die mit viralen Oncoproteinen transformiert wurden, die Telomere weiterhin schrumpften und Telomerase nur in der Subpopulation entdeckt werden konnte, die die Wachstumskrise überlebte (Counter et al , 1992) In diesen immortahsierten Zellen waren auch die Telomere stabil (Counter et al, 1992) Ahnliche Befunde aus Untersuchungen an Mausen (Blasco et al, 1996) stutzen die Annahme, daß eine Reaktivierung der Telomerase ein spates Ereignis in der Tumorgenese istInterestingly, however, significant telomerase activity was detected in a large number of the tumor tissues tested to date (1734/2031, 85%, Shay, 1997), while no activity was found in normal somatic tissue (1/196, <1%, Shay, 1997) Various studies also showed that in senescent cells transformed with viral oncoproteins, the telomeres continued to shrink and telomerase could only be discovered in the subpopulation that survived the growth crisis (Counter et al, 1992). These cells were also in these immortalized cells the telomeres are stable (Counter et al, 1992) Similar findings from studies on mice (Blasco et al, 1996) support the assumption that reactivation of telomerase is a late event in tumorigenesis
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine "Telomerase-Hypothese" entwickelt, die den Verlust von Telomersequenzen und Zellalterung mit der Aktivität von Telomerase und der Entstehung von Krebs verbindet In langlebigen Spezies wie dem Menschen kann das Schrumpfen der Telomere als ein Mechanismus zur Tumorsuppression angesehen werden Ausdifferenzierte Zellen, die keine Telomerase enthalten, stellen bei einer bestimmten Lange der Telomere ihre Zellteilung ein Mutiert eine solche Zelle, so kann aus ihr nur dann ein Tumor entstehen, wenn die Zelle ihre Telomere verlangern kann Ansonsten wurde die Zelle weiterhin Telomersequenzen verlieren, bis ihre Chromsomen instabil werden und sie schließlich zugrunde geht. Die Reaktivierung der Telomerase ist vermutlich der Hauptmechanismus von Tumorzellen zur Stabilisation ihrer Telomere.Based on these results, a "telomerase hypothesis" was developed that links the loss of telomer sequences and cell aging with the activity of telomerase and the development of cancer. In long-lived species such as humans, the shrinking of telomeres can be seen as a mechanism for tumor suppression Cells that do not contain telomerase stop their cell division at a certain length of the telomeres. If such a cell mutates, a tumor can only develop from it if the cell can extend its telomeres. Otherwise the cell became telomer sequences continue to lose until their chromosomes become unstable and they eventually perish. Reactivation of telomerase is believed to be the main mechanism for tumor cells to stabilize their telomeres.
Aus diesen Beobachtungen und Überlegungen ergibt sich, daß eine Inhibition der Telomerase eine Therapie von Tumoren erlauben sollte. Konventionelle Krebstherapien mit Zytostatika oder kurzwelligen Strahlen schädigen nicht nur die Tumorzellen, sondern alle sich teilenden Zellen des Körpers. Da aber außer Tumorzellen nur Keimbahnzellen eine signifikante Telomerase-Aktivitat enthalten, würden Telomerase-Inhibitoren spezifischer die Tumorzellen angreifen und somit weniger unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen. In allen bislang getesteten Tumorgeweben wurde eine Telomerase-Aktivitat nachgewiesen, so daß diese Therapeutika gegen alle Krebsarten eingesetzt werden könnten. Die Wirkung von Telomerase-Inhibitoren würde dann eintreten, wenn die Telomere der Zellen sich soweit verkürzt haben, daß das Genom instabil wird. Da Tumorzellen meist kürzere Telomere aufweisen als normale somatische Zellen, würden zuerst Krebszellen durch Telomerase-It follows from these observations and considerations that inhibition of telomerase should allow therapy of tumors. Conventional cancer therapies with cytostatics or short-wave radiation damage not only the tumor cells, but all the cells that divide in the body. However, since only germline cells contain significant telomerase activity in addition to tumor cells, telomerase inhibitors would attack the tumor cells more specifically and thus cause fewer undesirable side effects. Telomerase activity has been demonstrated in all tumor tissues tested so far, so that these therapeutic agents could be used against all types of cancer. The effect of telomerase inhibitors would occur when the telomeres of the cells have shortened to such an extent that the genome becomes unstable. Since tumor cells usually have shorter telomeres than normal somatic cells, cancer cells would first be
Inhibitoren eliminiert werden. Zellen mit langen Telomeren, wie die Keimzellen, würden dagegen erst viel später geschädigt werden. Telomerase-Inhibitoren stellen somit einen zukunftsweisenden Weg für die Therapierung von Krebs dar.Inhibitors are eliminated. Cells with long telomeres, like the germ cells, would only be damaged much later. Telomerase inhibitors are therefore a pioneering way of treating cancer.
Eindeutige Antworten auf die Frage nach der Art und den Angriffspunkten physiologischerClear answers to the question about the type and the points of attack physiological
Telomerase-Inhibitoren werden aber erst möglich sein, wenn auch die Proteinstrukturen des Enzyms mit ihren Funktionen identifiziert und die Erkenntnisse über verschiedene Telomer- bindende Proteine vertieft sind.However, telomerase inhibitors will only be possible if the protein structures of the enzyme with their functions have been identified and the knowledge about various telomer-binding proteins has been deepened.
Die Erfindung betrifft die katalytisch aktive humane Telomerase-Untereinheit (phTC) gegebenenfalls in aufgereinigter Form, aktive Teile des Proteins, Modulatoren, insbesondere Agonisten des Proteins, die Funktion des Proteins imitierende Substanzen sowie Kombinationen aus diesen Komponenten. ndung betrifft weiterhinThe invention relates to the catalytically active human telomerase subunit (phTC), if appropriate in purified form, active parts of the protein, modulators, in particular agonists of the protein, substances imitating the function of the protein and combinations of these components. continues to affect
Die Nucleinsauresequenz, die für das humane Protein phTC kodiert, im einzelnenThe nucleic acid sequence encoding the human protein phTC in detail
- die genomische Sequenz des hTC-Gens, die cDNA-Sequenz des hTC-Gens , die DNA-Sequenz von hTC-Varianten die Sequenz der mRNA, die vom hTC Gen transkribiert wird, Teile aus den oben genannten Sequenzen, darunter die in der Fig 1 gezeigte DNA Sequenz (SEQ ID No 1) von hTC- The genomic sequence of the hTC gene, the cDNA sequence of the hTC gene, the DNA sequence of hTC variants, the sequence of the mRNA that is transcribed by the hTC gene, parts from the above-mentioned sequences, including those shown in FIG 1 DNA sequence shown (SEQ ID No 1) from hTC
Die Nucleinsauresequenzen, die in anderen Saugern für dem hTC homologe Proteine kodieren, im einzelnenThe nucleic acid sequences which code for proteins homologous to the hTC in other suckers in detail
- die genomischen Sequenzen hTC-homologer Gene, die cDNA- Sequenzen hTC-homologer Gene, die Sequenzen der mRNAs, die von hTC-homologen Genen transkribiert werden,the genomic sequences of hTC homologous genes, the cDNA sequences of hTC homologous genes, the sequences of the mRNAs which are transcribed by hTC homologous genes,
Teile aus den oben genannten SequenzenParts from the above sequences
Nucleinsauresequenzen, die für dem Protein phTC verwandte Proteine im Menschen und anderen Saugern kodieren, im einzelnen-Nucleic acid sequences that code for proteins related to the phTC protein in humans and other suckers, in detail-
die genomischen Sequenzen hTC-verwandter Gene in Mensch und anderen Saugern, die cDNA-Sequenzen hTC-verwandter Gene in Mensch und anderenthe genomic sequences of hTC-related genes in humans and other suckers, the cDNA sequences of hTC-related genes in humans and others
Saugern, die Sequenzen der mRNAs, die von hTC-verwandten Genen transkribiert werden in Mensch und anderen Saugern, - Teile aus den oben genannten Sequenzen Das oben beschriebene phTC Protein, isoliert aus Säugerzellen (vgl. Fig. 2 und SEQ ID No. 2).Suckers, the sequences of mRNAs that are transcribed by hTC-related genes in humans and other suckers, - parts from the above-mentioned sequences The phTC protein described above, isolated from mammalian cells (see FIG. 2 and SEQ ID No. 2).
Das phTC Protein, markiert mit einem Nachweis-Reagenz, wobei das Nachweis- Reagenz bevorzugt ein Enzym, ein radioaktiv markiertes Element oder eine fluoreszierende Chemikalie ist.The phTC protein, labeled with a detection reagent, the detection reagent preferably being an enzyme, a radioactively labeled element or a fluorescent chemical.
Einen Antikörper, der gegen das phTC Protein gerichtet ist.An antibody directed against the phTC protein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist dies ein polyklonaler Antikörper.According to a preferred embodiment, this is a polyclonal antibody.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist dies ein monoklonaler Antikörper.According to a further preferred embodiment, this is a monoclonal antibody.
Solche Antikörper können beispielsweise produziert werden durch die Injektion eines substantiell immunkompetenten Wirts mit einer für die Antikörper-Produktion effektiven Menge eines phTC Polypeptids oder eines Fragments davon und durch nachfolgende Gewinnung dieses Antikörpers.Such antibodies can be produced, for example, by injecting a substantially immunocompetent host with an amount of a phTC polypeptide or a fragment thereof which is effective for antibody production and by subsequently obtaining this antibody.
Weiterhin läßt sich in an sich bekannter Weise eine immortalisierte Zellinie erhalten, die monoklonale Antikörper produziert.Furthermore, an immortalized cell line which produces monoclonal antibodies can be obtained in a manner known per se.
Die Antikörper können gegebenenfalls mit einem Nachweisreagenz markiert sein.The antibodies can optionally be labeled with a detection reagent.
Anstelle des vollständigen Antikörpers können auch Fragmente eingesetzt werden, die die gewünschten spezifischen Bindungseigenschaften besitzen.Instead of the complete antibody, fragments can also be used which have the desired specific binding properties.
Bevorzugte Beispiele für ein solches Nachweis-Reagenz sind Enzyme, radioaktiv markierte Elemente, fluoreszierende Chemikalien oder Biotin. Oligonukleotide in aufgereinigter Form mit einer Sequenz, die identisch oder exakt komplementär ist zu einer 10 bis 500 Nukleotide langen, zusammenhängenden Sequenz der oben beschriebenen genomischen DNA, cDNA oder mRNA.Preferred examples of such a detection reagent are enzymes, radioactively labeled elements, fluorescent chemicals or biotin. Oligonucleotides in purified form with a sequence which is identical or exactly complementary to a 10 to 500 nucleotide long, contiguous sequence of the above-described genomic DNA, cDNA or mRNA.
Ein solches Oligonukleotid kann insbesondere ein Oligodesoxyribonucleotid oder ein Oligoribonucleotid oder eine Peptidnukleotidsäure (PNA) seinSuch an oligonucleotide can in particular be an oligodeoxyribonucleotide or an oligoribonucleotide or a peptide nucleotide acid (PNA)
Bevorzugt sind Oligonukleotide, welche die Aktivität der Telomerase inhibieren, reprimieren oder blockieren, wenn sie an die hTC mRNA binden.Preferred are oligonucleotides which inhibit, repress or block the activity of the telomerase when they bind to the hTC mRNA.
Eine DNA Sequenz oder eine degenerierte Variation dieser Sequenz, die das Protein phTC oder ein Fragment dieses Proteins kodiert, gegebenenfalls enthaltend die DNA Sequenz aus Abbildung 1, oder DNA Sequenz, die mit der vorgehend aufgeführten DNA Sequenz unter Standard-Hybridisierungsbedingungen hybridisiert.A DNA sequence or a degenerate variation of this sequence which encodes the protein phTC or a fragment of this protein, optionally containing the DNA sequence from FIG. 1, or DNA sequence which hybridizes with the above-mentioned DNA sequence under standard hybridization conditions.
Ein rekombinantes DNA Molekül, das eine DNA Sequenz oder eine degenerierte Variation dieser Sequenz beinhaltet, die phTC oder ein Fragment von phTC kodiert, wobei letztere Sequenz bevorzugt die DNA Sequenz aus Abbildung 1 enthält, oder das eine solche DNA Sequenz beinhaltet, die mit der vorgehend aufgeführten DNA Sequenz unter Standard-Hybridisierungsbedingungen hybridisiert.A recombinant DNA molecule which contains a DNA sequence or a degenerate variation of this sequence which encodes phTC or a fragment of phTC, the latter sequence preferably containing the DNA sequence from FIG. 1, or which contains such a DNA sequence which corresponds to the preceding one DNA sequence listed hybridized under standard hybridization conditions.
Bevorzugt ist in dem oben genannten rekombinanten DNA Molekül die beschriebene DNA mit einer Expressions-Kontrollsequenz verbunden.In the recombinant DNA molecule mentioned above, the DNA described is preferably linked to an expression control sequence.
Besonders bevorzugt als Expressions-Kontrollsequenz sind z.B. der frühe oder späteParticularly preferred expression control sequences are e.g. the early or late
Promotor des SV40- oder Adenovirus, das lac System, das trp System, das TAC System, das TRC System, die Haupt-Operator- und Promotorregionen des Phagen λ, die Kontrollregionen des fd Hüllproteins, der Promotor der 3-Phospoglycerat Kinase, der Promotor der Sauren Phosphatase und der Promotor des α-Mating Faktors der Hefe. Einen einzelligen Wirt, der mit einem oben beschriebenen rekombinanten DNA Molekül transformiert wurde, das die DNA Sequenz oder eine degenerierte Variante dieser Sequenz enthalt, die für das phTC Protein oder einen Teil dieses Protein kodiert In diesem rekombinanten DNA-Molekul ist die besagte DNA Sequenz mit einer Expressions-Kontrollsequenz verknüpftPromoter of SV40 or adenovirus, the lac system, the trp system, the TAC system, the TRC system, the main operator and promoter regions of the phage λ, the control regions of the fd coat protein, the promoter of the 3-phosphoglycerate kinase, the promoter the acid phosphatase and the promoter of the yeast α-mating factor. A unicellular host which has been transformed with a recombinant DNA molecule described above, which contains the DNA sequence or a degenerate variant of this sequence which codes for the phTC protein or a part of this protein. The said DNA sequence is also in this recombinant DNA molecule linked to an expression control sequence
Bevorzugte Beispiele für den einzelligen Wirt sind E. coh, Psendomonas, Bacilhis, Streptomyces, yeasts, CHO, Rl 1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 und BMT10 Zellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Saugerzellen in ZellkulturPreferred examples of the unicellular host are E. coh, Psendomonas, Bacilhis, Streptomyces, yeasts, CHO, Rl 1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 and BMT10 cells, plant cells, insect cells and sucker cells in cell culture
Einen rekombinanten Virus, der mit einem der vorstehend beschriebenen DNA Moleküle oder einem Derivat oder Fragment dieses Moleküls transformiert wirdA recombinant virus that is transformed with one of the DNA molecules described above or a derivative or fragment of this molecule
Eine Methode zur Inhibition der Telomeraseaktivitat in humanen Zellen, bevorzugt neoplastische Zellen, bei der ein exogenes Polynukleotid in die Zellen transferiert wird, das aus einer Transkriptionseinheit besteht Diese Transkriptionseinheit beinhaltet eine Polynukleotidsequenz aus mindestens 29 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die substantiell identisch oder substantiell komplementär zur hTC RNA Sequenz ist und die mit einer heterologen Transkriptions-regulatorischen Sequenz verknüpft ist, die die Transkription des verknüpften Polynukleotids in besagtenA method for inhibiting telomerase activity in human cells, preferably neoplastic cells, in which an exogenous polynucleotide consisting of a transcription unit is transferred into the cells. This transcription unit contains a polynucleotide sequence of at least 29 consecutive nucleotides that are substantially identical or substantially complementary to the hTC RNA Is sequence and is linked to a heterologous transcription regulatory sequence which said transcription of the linked polynucleotide in said
Zellen steuertControls cells
Bevorzugt enthalt die oben genannte heterologe Transkriptions-regulatorische Sequenz einen Promotor, der in humanen Zellen konstitutiv aktiv istThe abovementioned heterologous transcription regulatory sequence preferably contains a promoter which is constitutively active in human cells
Alternativ kann die heterologe Transkriptions-regulatorische Sequenz einen Promotor enthalten, der in humanen Zellen durch Zugabe einer regulatorischen Substanz induziert oder reprimiert werden kann Dazu zahlen beispielsweise induzierbare und reprimierbare Tetrazyklin- abhangige Promotoren, Heatshock- Promotoren, Metallionen-abhangige Promotoren Das obengenannte exogene Polynukleotid kann beispielsweise ein virales Genom mit einer Transkriptionseinheit aus der humanen hTC DNA-Komponente seinAlternatively, the heterologous transcription-regulatory sequence can contain a promoter that can be induced or repressed in human cells by adding a regulatory substance. For example, inducible and repressible tetracycline-dependent promoters, Heatshock promoters, metal ion-dependent promoters The above-mentioned exogenous polynucleotide can be, for example, a viral genome with a transcription unit from the human hTC DNA component
Besonders bevorzugt produziert die besagte Transkriptionseinheit antisense RNA, die substantiell komplementär zur humanen hTC RNA-Komponente istThe said transcription unit particularly preferably produces antisense RNA, which is substantially complementary to the human hTC RNA component
Weiterhin besonders bevorzugt kann das exogene Polynukleotid die Sequenz aus Abb 1 enthaltenFurthermore, the exogenous polynucleotide can particularly preferably contain the sequence from FIG. 1
Ein Polynukleotid für die Gentherapie einer menschlichen Krankheit DiesesA polynucleotide for gene therapy of a human disease
Polynukleotid besteht aus einer Transkriptionseinheit, die eine Polynukleotidsequenz aus mindestens 9 aufeinanderfolgenden Nukleotiden enthalt, die substantiell identisch oder substantiell komplementär zur hTC RNA Sequenz ist und die mit einer heterologen Transkriptions-regulatorischen Sequenz verknüpft ist, die die Transkription des verknüpften Polynukleotids in besagten Zellen steuertPolynucleotide consists of a transcription unit which contains a polynucleotide sequence of at least 9 consecutive nucleotides, which is substantially identical or substantially complementary to the hTC RNA sequence and which is linked to a heterologous transcription regulatory sequence which controls the transcription of the linked polynucleotide in said cells
Eine Methode zur Detektion Telomerase-assoziierter Zustande in einem Patienten, die folgende Schritte umfaßtA method for the detection of telomerase-associated conditions in a patient, comprising the following steps
A Detektion des phTC Proteins in Korperflussigkeiten oder zellularen Proben, um einen diagnostischen Wert zu erhalten, B Vergleich des diagnostischen Werts mit Standardwerten für das phTCA Detection of the phTC protein in body fluids or cellular samples to obtain a diagnostic value, B Comparison of the diagnostic value with standard values for the phTC
Protein in standardisierten normalen Zellen oder Korperflussigkeiten des gleichen Typs wie die Testprobe, C Detektion diagnostischer Werte, die hoher oder niedriger als Standardvergleichswerte liegen, indizieren einen Telomerase-assoziierten Zustand, der wiederum einen pathogenen Zustand indiziertProtein in standardized normal cells or body fluids of the same type as the test sample, C detection of diagnostic values that are higher or lower than standard comparison values indicate a telomerase-associated state, which in turn indicates a pathogenic state
Bevorzugt wird diese Methode eingesetzt zur Detektion einer neoplastischen Erkrankung eines Patienten Die Methode umfaßt dann folgende Schritte A Detektion des phTC Proteins in zellularen Proben, um einen diagnostischenThis method is preferably used for the detection of a neoplastic disease of a patient. The method then comprises the following steps A detection of the phTC protein in cellular samples to make a diagnostic
Wert zu erhalten, B Vergleich des diagnostischen Werts mit Standardwerten für das phTCGet value, B Comparison of the diagnostic value with standard values for the phTC
Protein in nicht-neoplastischen Zellen des gleichen Typs wie die Testprobe, C Diagnostische Werte, die deutlich hoher als Standardvergleichswerte liegen, indizieren einen neoplastischen ZustandProtein in non-neoplastic cells of the same type as the test sample, C Diagnostic values that are significantly higher than standard comparative values indicate a neoplastic state
Eine Methode zur Bestimmung der Gegenwart des phTC Proteins in einer Zelle oder zellularen Probe, die auf der Amplifikation eines hTC-Polynukleotids oder Hybridisierung eines hTC-Polynukleotids, Primers oder einer hTC komplementärenA method of determining the presence of the phTC protein in a cell or cellular sample that is complementary to the amplification of an hTC polynucleotide or hybridization of an hTC polynucleotide, primer, or hTC
Sequenz mit einem hTC Polynukleotid beruhenSequence based on an hTC polynucleotide
Ein Testkit zum Nachweis von phTC in zellularen Proben und Korperflussigkeiten, wobei markierte, immunchemisch-reaktive Komponenten beispielsweise sein können polyklonale Antikörper gegen phTC, monoklonale Antikörper gegen phTC,A test kit for the detection of phTC in cellular samples and body fluids, whereby labeled, immunochemically reactive components can be, for example, polyclonal antibodies against phTC, monoclonal antibodies against phTC,
Fragmente dieser Antikörper oder einem Gemisch aus diesen KomponentenFragments of these antibodies or a mixture of these components
Eine Methode zur Verhinderung und/oder Behandlung zellularer (Zer-) Störung und/oder Fehlfünktion und/oder anderer Krankheitsbilder im Menschen, die auf der Gabe einer therapeutisch effektiven Menge an katalytisch aktiver humanerA method of preventing and / or treating cellular (disruption) and / or malfunction and / or other disease patterns in humans based on the administration of a therapeutically effective amount of catalytically active human
Telomerase, ihrer fünktionellen Äquivalente oder ihrer katalytisch aktiven Fragmente beruht Ebenfalls denkbar ist der Einsatz einer Substanz, die die Produktion und/oder Aktivität von phTC fordert, eine Substanz, die die Aktivität von phTC imitieren kann, einer Substanz, die die Produktion und/oder Aktivität von phTC inhibieren kann oder eines Gemisches dieser Substanzen Weiterhin kann ein spezifischer Bindungspartner eingesetzt werdenTelomerase, its functional equivalents or its catalytically active fragments is also conceivable the use of a substance that requires the production and / or activity of phTC, a substance that can mimic the activity of phTC, a substance that inhibits the production and / or Can inhibit the activity of phTC or a mixture of these substances. Furthermore, a specific binding partner can be used
Bevorzugt wird die Methode eingesetzt zur Verhinderung oder Behandlung der Alterung oder von KrebserkrankungenThe method is preferably used to prevent or treat aging or cancer
Substanzen, die die Aktivität von phTC beeinflussen, d h inhibieren oder fordern, können, werden hier als Modulatoren bezeichnet Solche Modulatoren können in an sich bekannter Weise gefunden werden, wenn man in einem Telomerase-Assay ihren Einfluß auf die Telomerase-Aktivitat prüft Beispiele für Telomerase- Assays sind im Rahmen von Beispiel 15 angegebenSubstances which influence the activity of phTC, ie which can inhibit or require it, are referred to here as modulators can be found in a known manner if one examines their influence on the telomerase activity in a telomerase assay. Examples of telomerase assays are given in the context of example 15
Modulatoren der phTC sind interessant zur Behandlung von Krankheiten, die mitModulators of phTC are interesting for the treatment of diseases with
Telomerase in Zusammenhang stehen Insbesondere seien hier die Verhinderung oder Behandlung von Alterungsprozessen oder von Krebserkrankungen genanntRelated to telomerase The prevention or treatment of aging processes or cancer can be mentioned here in particular
Eine antisense-Nukleinsaure gegen die hTC mRNA, die eine Nukleotidsequenz enthalt, die mit besagter mRNA hybridisiert, wobei die antisense-Nukleinsaure eineAn antisense nucleic acid against the hTC mRNA which contains a nucleotide sequence which hybridizes with said mRNA, the antisense nucleic acid being a
RNA oder eine DNA istIs RNA or a DNA
Bevorzugt bindet die antisense-Nukleinsaure an das Start-Kodon der jeweiligen mRNAsThe antisense nucleic acid preferably binds to the start codon of the respective mRNAs
Ein rekombinantes DNA Molekül mit einer DNA Sequenz, von der bei der Transkription eine antisense-Ribonukleinsaure gegen die hTC mRNA produziert wird Diese besagte antisense-Ribonukleinsaure enthalt eine Nukleinsauresequenz, die mit der besagten hTC mRNA hybridisieren kannA recombinant DNA molecule with a DNA sequence from which an antisense ribonucleic acid is produced against the hTC mRNA during transcription. This said antisense ribonucleic acid contains a nucleic acid sequence which can hybridize with the said hTC mRNA
Ein solches DNA-Molekul kann zur Herstellung einer Zellime mit reduzierter Expression von phTC eingesetzt werden, indem man eine phTC-produzierende Zellinie mit diesem rekombinanten DNA Molekül transfiziertSuch a DNA molecule can be used to produce a cell line with reduced expression of phTC by transfecting a phTC-producing cell line with this recombinant DNA molecule
- Ein Ribozym, das die hTC mRNA spaltet- A ribozyme that cleaves the hTC mRNA
Bevorzugt ist dies ein Tetrahymena-Typ Ribozym oder ein Hammerhead-Typ RibozymThis is preferably a Tetrahymena-type ribozyme or a hammerhead-type ribozyme
- Ein rekombinantes DNA Molekül mit einer DNA Sequenz, deren Transkription zur- A recombinant DNA molecule with a DNA sequence, the transcription of which
Produktion eines solchen Ribozyms führt Dieses rekombinante DNA-Molekul kann eingesetzt werden um eine phTC- produzierende Zellinie zu transfizierenProduction of such a ribozyme leads This recombinant DNA molecule can be used to transfect a phTC-producing cell line
Eine Zusammenstellung, bestehend aus einem Paar von humanen hTC Polynukleotid-PCR Primern, wobei die Primer bevorzugt aus Sequenzen bestehen, die mit der Sequenz der humanen hTC mRNA korrespondieren oder zu dieser Sequenz komplementär sindA compilation consisting of a pair of human hTC polynucleotide PCR primers, the primers preferably consisting of sequences which correspond to the sequence of the human hTC mRNA or are complementary to this sequence
Eine Zusammenstellung, die eine Polynukleotid-Hybridisierungssonde für das humane hTC Gen enthält, wobei die Sonde bevorzugt mindestens 29 aufeinanderfolgende Nukleotide enthält, die mit der Sequenz des humanen hTC Gens korrespondieren oder zu dieser komplementär sindA compilation containing a polynucleotide hybridization probe for the human hTC gene, the probe preferably containing at least 29 consecutive nucleotides that correspond to or are complementary to the sequence of the human hTC gene
Tiermodelle, mit denen die Telomerase/Telomer-Regulation in vivo untersucht werden kann. So können z.B. mit Knockout- oder transgenen Tieren Tumorentstehung und Alterung direkt untersucht werdenAnimal models with which the telomerase / telomer regulation can be investigated in vivo. For example, tumor formation and aging can be examined directly with knockout or transgenic animals
Funktionelle Äquivalente sind im Fall von Proteinen oder Peptiden solche Verbindungen, die sich zwar hinsichtlich der Aminosauresequenz unterscheiden können, aber im wesentlichen dieselben Funktionen habenFunctional equivalents in the case of proteins or peptides are those compounds which may differ in terms of the amino acid sequence, but have essentially the same functions
Bekannte Beispiele hierfür sind Isoenzyme bzw sogenannte Mikroheterogenitaten bei Proteinen.Known examples of this are isoenzymes or so-called micro-heterogeneities in proteins.
Im Fall der Oligo- oder Polynucleinsauren sollten unter fünktionellen Äquivalenten solcheIn the case of oligo- or polynucleic acids, functional equivalents should be such
Verbindungen verstanden werden, die sich in der Nucleotid-Sequenz unterscheiden, aber für das selbe Protein codieren Dies ist z B auf den degenerierten genetischen Code zurückzuführenCompounds are understood that differ in the nucleotide sequence, but code for the same protein. This is due, for example, to the degenerate genetic code
Erläuterung der Abbildungen Fig. 1 : cDNA Sequenz der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit (hTC) (SEQ ID No. 1).Explanation of the pictures Fig. 1: cDNA sequence of the human catalytic telomerase subunit (hTC) (SEQ ID No. 1).
Fig. 2: Abgeleitete Aminosäuresequenz von der in Fig. l dargestellten hTC DNA Sequenz (SEQ ID No. 2).Fig. 2: Derived amino acid sequence from the hTC DNA sequence shown in Fig. 1 (SEQ ID No. 2).
Die in Fig. 1 dargestellte DNA Sequenz läßt sich von Position 64 bis Position 3461 vollständig in eine Aminosäuresequenz translatieren. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt.The DNA sequence shown in FIG. 1 can be completely translated into an amino acid sequence from position 64 to position 3461. The amino acid residues are shown according to their one-letter code.
Fig. 3: Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel mit unterschiedlich vorbehandelter DNA von3: Ethidium bromide-stained agarose gel with differently pretreated DNA from
AA281296.AA281296.
Die Abbildung zeigt ein Ethidiumbromid-gefärbtes 0,8%iges Agarosegel. In den Spuren 1 und 8 sind zwei verschiedene DNA Größenstandards aufgetragen, wobei die DNA Fragmentlängen 3, 2, 0.5 und 0.4 kb hervorgehoben sind. Die AA281296 DNA in pT7T3D wurde mit den Restriktionsenzymen Eco RI /Not I (Spur 3), Pst IThe picture shows an 0.8% agarose gel stained with ethidium bromide. Two different DNA size standards are plotted in lanes 1 and 8, the DNA fragment lengths 3, 2, 0.5 and 0.4 kb being highlighted. The AA281296 DNA in pT7T3D was with the restriction enzymes Eco RI / Not I (lane 3), Pst I
(Spur 6) und Xho 1 (Spur 7) verdaut. Auf die Spur 2 wurde unverdaute DNA von AA281296 in pT7T3D aufgetragen. In den Spuren 4 und 5 wurde 1/10 eines PCR- Ansatzes (1 Minute 94°C, 2 Minuten 60°C, 3 Minuten 72°C) mit der hTC cDNA in pT7T3D und den Primern 1 (5' GAGTGTGTACGTC-GTCGAGCTGCTCAGGTC 3 ') und 4 (5' CACCCTCGAGGTGAGACGCTCGGCC 3 ') [Spur 4] bzw. mit den(Lane 6) and Xho 1 (lane 7) digested. Undigested AA281296 DNA was applied to lane 2 in pT7T3D. Lanes 4 and 5 were 1/10 of a PCR approach (1 minute 94 ° C, 2 minutes 60 ° C, 3 minutes 72 ° C) with the hTC cDNA in pT7T3D and the primers 1 (5 'GAGTGTGTACGTC-GTCGAGCTGCTCAGGTC 3 ') and 4 (5' CACCCTCGAGGTGAGACGCTCGGCC 3 ' ) [lane 4] or with the
Primern 6 (5' GCTCGTAGTTGAGCACGCTGAACAGTG 3') und 7 (5' GCCAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAG 3') [Spur 5] appliziert.Primers 6 (5 'GCTCGTAGTTGAGCACGCTGAACAGTG 3 ' ) and 7 (5 ' GCCAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAG 3') [lane 5] were applied.
Fig. 4: Ausschnitt aus einem Proteinsequenzvergleich der katalytischen Telomerase- Untereinheiten von Euplotes pl23 (ρl23) und Mensch (phTC).Fig. 4: Detail from a protein sequence comparison of the catalytic telomerase subunits of Euplotes pl23 (ρl23) and humans (phTC).
Die Bedingungen (Ktuple, Gap Penalty und Gap Length Penalty) für den in dieser Abbildung dargestellten Lipman-Pearson Proteinvergleich mit der Lasergene Programmsoftware (Dnastar, Inc.) sind aufgelistet. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt. Die zwischen pl23 von Euplotes aedicidatus und dem identifizierten EST+i identischen Aminosäuren sind ebenfalls durch den entsprechenden Buchstaben aus dem Einbuchstabencode hervorgehoben. Nicht identische, aber in der Funktion ähnliche oder vergleichbare Aminosäuren sind durch ein : gekennzeichnet.The conditions (Ktuple, Gap Penalty and Gap Length Penalty) for the Lipman-Pearson protein comparison shown in this figure with the Lasergene program software (Dnastar, Inc.) are listed. The amino acid residues are shown according to their one-letter code. The amino acids identical between pl23 of Euplotes aedicidatus and the identified EST + i are also highlighted by the corresponding letter from the one-letter code. Amino acids that are not identical, but have similar or comparable functions, are identified by a:
Fig. 5: Ausschnitt aus einem Proteinsequenzvergleich der katalytischen Telomerase-Unter- einheiten von Euplotes pl23 (pl23), und Hefe (est2p).5: Detail from a protein sequence comparison of the catalytic telomerase subunits of Euplotes pl23 (pl23) and yeast (est2p).
Die Bedingungen (Ktuple, Gap Penalty und Gap Length Penalty) für den in dieser Abbildung dargestellten Lipman-Pearson Proteinvergleich mit der Lasergene Programmsoftware (Dnastar, Inc.) sind aufgelistet. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt. Die zwischen pl23 von Euplotes aediculatus und est2p von Hefe identischen Aminosäuren sind ebenfalls durch den entsprechenden Buchstaben aus dem Einbuchstabencode hervorgehoben. Nicht identische, aber in der Funktion ähnliche oder vergleichbare Aminosäuren sind durch ein : gekennzeichnet.The conditions (Ktuple, Gap Penalty and Gap Length Penalty) for the Lipman-Pearson protein comparison shown in this figure with the Lasergene program software (Dnastar, Inc.) are listed. The amino acid residues are shown according to their one-letter code. The amino acids identical between pl23 from Euplotes aediculatus and est2p from yeast are also highlighted by the corresponding letter from the one-letter code. Amino acids that are not identical, but have similar or comparable functions, are identified by a:
Fig. 6: Ausschnitt aus einem Proteinsequenzvergleich der katalytischen Telomerase-6: Detail from a protein sequence comparison of the catalytic telomerase
Untereinheiten von Hefe (est2p) und Mensch (phTC).Subunits of yeast (est2p) and human (phTC).
Die Bedingungen (Ktuple, Gap Penalty und Gap Length Penalty) für den in dieser Abbildung dargestellten Lipman-Pearson Proteinvergleich mit der Lasergene Programmsoftware (Dnastar, Inc.) sind aufgelistet. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt. Die zwischen est2p von Hefe und dem identifizierten EST+i identischen Aminosäuren sind ebenfalls durch den entsprechenden Buchstaben aus dem Einbuchstabencode hervorgehoben. Nicht identische, aber in der Funktion ähnliche oder vergleichbare Aminosäuren sind durch ein : gekennzeichnet.The conditions (Ktuple, Gap Penalty and Gap Length Penalty) for the Lipman-Pearson protein comparison shown in this figure with the Lasergene program software (Dnastar, Inc.) are listed. The amino acid residues are shown according to their one-letter code. The amino acids identical between est2p of yeast and the identified EST + i are also highlighted by the corresponding letter from the one-letter code. Amino acids that are not identical, but have similar or comparable functions, are identified by a:
Fig. 7: Ausschnitt aus einem Proteinsequenzvergleich der katalytischen Telomerase- Untereinheiten von Euplotes pl23 (pl23), Hefe (est2p) und Mensch (phTC). Der in der Fig. 5 dargestellte Vergleich zwischen Euplotes pl23 (ρl23), Hefe (est2p) und Mensch (phTC) wurde mit dem Clustal Method Subprogramm der Lasergene Programmsoftware (Dnastar, Inc. ) unter Standardtbedingungen durchgeführt. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt. Die zwischen est2p von Hefe, pl23 von Euplotes aediculatus und dem ldentifizierten EST+] identischen Aminosäuren sind ebenfalls durch den entsprechenden Buchstaben aus dem Einbuchstabencode hervorgehoben Zusätzlich sind die Bereiche, die zwischen allen drei Proteinen identisch sind, durch einen hellgrauen Balken oberhalb der Proteinsequenz gekennzeichnet7: Detail from a protein sequence comparison of the catalytic telomerase subunits of Euplotes pl23 (pl23), yeast (est2p) and human (phTC). The comparison shown in FIG. 5 between Euplotes pl23 (ρl23), yeast (est2p) and human (phTC) was carried out with the Clustal Method subroutine of the Lasergene program software (Dnastar, Inc.) under standard conditions. The amino acid residues are shown according to their one-letter code. The between est2p of yeast, pl23 of Euplotes aediculatus and the Identified EST +] identical amino acids are also highlighted by the corresponding letter from the one-letter code. In addition, the regions that are identical between all three proteins are identified by a light gray bar above the protein sequence
Generierte DNA Sequenz aus Beispiel 6 (RACE Runde 1) (SEQ ID No 3)Generated DNA sequence from example 6 (RACE round 1) (SEQ ID No 3)
Generierte DNA Sequenz aus Beispiel 6 (RACE Runde 2) (SEQ ID No 4)Generated DNA sequence from example 6 (RACE round 2) (SEQ ID No 4)
Generierte DNA Sequenz aus Beispiel 6 (RACE Runde 3) (SEQ ID No 5)Generated DNA sequence from example 6 (RACE round 3) (SEQ ID No 5)
Generierte DNA Sequenz aus Beispiel 8 (RACE Runde 3) (SEQ ID No 6)Generated DNA sequence from example 8 (RACE round 3) (SEQ ID No 6)
Übersicht zur Klonierung der vollständigen hTC cDNA Die Positionen der Start- und Stopcodons sind mit Pfeilen gekennzeichnet Die schwarzen Bereiche derOverview of the cloning of the complete hTC cDNA The positions of the start and stop codons are marked with arrows The black areas of the
Rechtecke symbolisieren für Protein kodierende Sequenzabschnitte, wahrend die hellgrauen Bereiche 5' und 3 ' untranslatierte cDNA Regionen symbolisieren bzw für Intronsequenzen stehen Die dunkelgrauen Blocke im Rechteck für die Füll length cDNA stehen entweder für das Telomerase-spezifische Motiv (T), oder für die sieben Reverse Transkriptase Motive (Nummer 1-7)Rectangles symbolize sequence sections coding for protein, while the light gray areas 5 'and 3' symbolize untranslated cDNA regions or represent intron sequences. The dark gray blocks in the rectangle for the filling length cDNA either represent the telomerase-specific motif (T) or the seven Reverse transcriptase motifs (number 1-7)
Die DNA-Fragmente, die zur Darstellung der vollständigen hTC cDNA notwendig sind, sind ebenfalls als Rechtecke dargestellt und entsprechend ihrer Herkunft gekennzeichnet Alle Rechtecke sind in ihrer Position relativ zueinander angeordnet Die Herkunft des DNA-Fragments, für das das Rechteck AA261296 steht, ist in Beispiel 2 beschreiben Die relative Position der 182 bp Deletion in diesem FragmentThe DNA fragments that are necessary to display the complete hTC cDNA are also shown as rectangles and marked according to their origin. All rectangles are arranged in their position relative to each other. The origin of the DNA fragment, for which the rectangle AA261296 stands, is in Describe Example 2 The relative position of the 182 bp deletion in this fragment
(vergleiche Beispiel 2) ist durch eine Lücke im Rechteck gekennzeichnet Die Herkunft der DNA-Fragmente, für die die Rechtecke RACE1, RACE2 und RACE3 stehen, sind in Beispiel 6 beschreiben Die Herkunft des DNA-Fragments, für das das Rechteck C5F-Fragment steht, ist in Beispiel 7 beschreiben Die Herkunft des DNA-Fragments, für das das Rechteck Lambdal2 steht, ist in Beispiel 9 beschreiben Der 3 ' Teil in dem DNA-Fragment Lambda 12, der für eine nicht mit hTC in Verbindung stehende cDNA codiert (vergleiche Beispiel 9), ist in dieser Ab- bildung nicht dargestellt. Die vollständige hTC-cDNA Sequenz wurde unter Verwendung der in dieser Abbildung dargestellten DNA-Fragmente Lambda 12 und C5F an den 5' und 3' Splicestellen zusammengefügt (vergleiche Beispiel 7) Diese Splicestellen wurden in diversen Fragmenten identifiziert (RACE 1, RACE 3, Lambda 12 und C5F).(see example 2) is characterized by a gap in the rectangle. The origin of the DNA fragments for which the rectangles RACE1, RACE2 and RACE3 stand are described in example 6. The origin of the DNA fragment for which the rectangle C5F fragment stands is described in Example 7. The origin of the DNA fragment for which the rectangle Lambdal2 stands is described in Example 9. The 3 'part in the DNA fragment Lambda 12 which codes for a cDNA not related to hTC (cf. Example 9), is in this education not shown. The complete hTC cDNA sequence was assembled using the DNA fragments Lambda 12 and C5F shown in this figure at the 5 'and 3' splice sites (see Example 7). These splice sites were identified in various fragments (RACE 1, RACE 3, Lambda 12 and C5F).
Fig.13 : Detailausschnitte aus einem Proteinsequenzvergleich der katalytischen Telomerase- Untereinheiten von Euplotes und Mensch (hTC). Die Abbildung zeigt Ausschnitte aus einem Proteinsequenzvergleich zwischen den katalytischen Telomerase-Untereinheiten von Euplotes und Mensch (hTC). In den umrandeten Boxen sind die Motive für die Reverse Transkriptase hervorgehoben. Die Ziffern unter den Umrandungen beziehen sich auf die jeweilige Aminosäureposition in der Fig. 2. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt. Identische Aminosäuren sind fett gedruckt. In der Konsensussequenz für das Reverse Transkriptase (RT consensus)-Motiv steht h für eine hydrophobe Aminosäure und p bezeichnet eine polare Aminosäure Sind diese Gruppen von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von Euplotes und hTC erhalten, sind p bzw. h fettgedruckt. Sehr hoch konservierte Aminosäuren sind grau unterlegt. In RT3 ist die umrandete Box erweitert, um zusätzliche homologe Aminosäuren zu erfassen. Das Telomerase-spezifische Motiv ist in Beispiel 9 beschrieben.Fig. 13: Detail sections from a protein sequence comparison of the catalytic telomerase subunits of Euplotes and humans (hTC). The figure shows excerpts from a protein sequence comparison between the catalytic telomerase subunits of Euplotes and humans (hTC). The motifs for reverse transcriptase are highlighted in the outlined boxes. The numbers below the borders relate to the respective amino acid position in FIG. 2. The amino acid residues are shown in accordance with their one-letter code. Identical amino acids are printed in bold. In the consensus sequence for the reverse transcriptase (RT consensus) motif, h stands for a hydrophobic amino acid and p denotes a polar amino acid. If these groups of amino acids are preserved in the amino acid sequence of Euplotes and hTC, p and h are printed in bold. Very highly conserved amino acids are highlighted in gray. In RT3 the box is expanded to include additional homologous amino acids. The telomerase-specific motif is described in Example 9.
Fig.14: Generierte DNA-Sequenz aus Beispiel 11 (3 ' Variante) (SEQ ID No. 7). Der nicht zu der in Fig. 1 dargestellten DNA-Sequenz homologe Bereich ist fett hervor- gehoben.Fig. 14: Generated DNA sequence from Example 11 (3 'variant) (SEQ ID No. 7). The region that is not homologous to the DNA sequence shown in FIG. 1 is highlighted in bold.
Fig.15: hTC Expression in KrebszeUinien und in normalem humanen Gewebe. Abb. A: Auf dem Northern-Blot wurden nach Angaben des Herstellers (Fa. Clontech) etwa 2 μg poly A+ RNA aus verschiedenen humanen Zellinien immobilisiert. Im einzelnen stammte die RNA aus einem Melanom (G361), einem Lungenkarzinom (A549), aus einem Adenokarzinom des Kolons (SW480), aus einem Burkitt Lymphom Raji, aus einer Leukämie Zellinie (MOLT-4), aus einer chronischen Leukämie Zellinie (K- 562), aus einem Cervixtumor (HeLa) und aus der Leukämie Zellinie HL60. Die gekennzeichneten 4,4 kb, 6 kb und 9,5 kb Transkripte sind spezifisch für hTC (vergleiche Beispiel 10). Abb. B: Auf dem Northern-Blot wurden nach Angaben des Herstellers (Fa. Clontech) etwa 2 μg poly A+ RNA aus verschiedenen humanen Geweben immobilisiert. Im einzelnen wurde die RNA aus Herz, Gehirn, Plazenta,Fig. 15: hTC expression in cancer cells and in normal human tissue. Fig. A: According to the manufacturer (Clontech), about 2 μg poly A + RNA from various human cell lines were immobilized on the Northern blot. Specifically, the RNA came from melanoma (G361), lung carcinoma (A549), colon adenocarcinoma (SW480), Burkitt's lymphoma Raji, leukemia cell line (MOLT-4), chronic leukemia cell line (K - 562), from a cervical tumor (HeLa) and from the leukemia cell line HL60. The labeled 4.4 kb, 6 kb and 9.5 kb transcripts are specific for hTC (see Example 10). Fig. B: According to the manufacturer (Clontech), approximately 2 μg poly A + RNA from various human tissues were immobilized on the Northern blot. In detail, the RNA from the heart, brain, placenta,
Lunge, Leber, Skelettmuskulatur, Niere und Pankreas isoliert. Ein RNA- Größenstandard ist dargestelt.Lungs, liver, skeletal muscles, kidneys and pancreas isolated. An RNA size standard is shown.
Fig.16: Western-Blot Analyse der Kaninchenseren gegen Peptide aus der humanen Telomerase- Aminosäuresequenz (Beispiel 12). Jeweils 20 μl der bakteriellen Lysate aus Beispiel 13 wurden unter Zuhilfenahme der Antiseren aus Beispiel 12 in einem Western-Blot (Ausubel et al, 1987) analysiert. In den Spuren 1, 2, 6 und 7 wurden Lysate aus Bakterien, die das pMALEST-Konstrukt beinhalten, aufgetragen. In den Spuren 3, 4, 8 und 9 wurden Lysate aus Bakterien, die das pMALAl-Konstrukt beinhalten, aufgetragen. In den Spuren 1, 3, 6 und 8 sind Lysate aus nicht mit IPTGFig. 16: Western blot analysis of the rabbit sera against peptides from the human telomerase amino acid sequence (Example 12). In each case 20 μl of the bacterial lysates from Example 13 were analyzed with the aid of the antisera from Example 12 in a Western blot (Ausubel et al, 1987). In lanes 1, 2, 6 and 7, lysates from bacteria containing the pMALEST construct were applied. Lanes 3 from bacteria, which contain the pMALAl construct, were applied in lanes 3, 4, 8 and 9. In lanes 1, 3, 6 and 8, lysates are not made with IPTG
(Isopropyl-beta-thiogalaktopyranosid) induzierten Bakterien aufgetragen. In den Spuren 2, 4, 7 und 9 sind Lysate aus mit IPTG induzierten Bakterien aufgetragen. In der Spur 5 wurde ein Standardgrößenmmarker (10 kDa Protein-Leiter der Firma Life Technologies, Kat. Nr. 10064-012) aufgetragen. Die 50 kDa- und 120 kDa- Banden sind am Rande der Membranen gekennzeichnet. Die PVDF-Membran in der(Isopropyl-beta-thiogalactopyranoside) induced bacteria. Lysates from bacteria induced with IPTG are plotted in lanes 2, 4, 7 and 9. A standard size marker (10 kDa protein ladder from Life Technologies, Cat. No. 10064-012) was applied in lane 5. The 50 kDa and 120 kDa bands are marked on the edge of the membranes. The PVDF membrane in the
Abb. A mit den Spuren 1 bis 4 wurde mit Preimmunseren gegen das Peptid B (vergleiche Beispiel 12) inkubiert. Die PNDF-Membran in Abb. B mit den Spuren 6 bis 9 wurde mit Preimmunseren gegen das Peptid C (vergleiche Beispiel 12) inkubiert. Die PVDF-Membran in der Abb. B mit den Spuren 1 bis 4 wurde mit Immunseren gegen das Peptid B (vergleiche Beispiel 12) inkubiert. Die PVDF-Membran in Abb.Fig. A with lanes 1 to 4 was incubated with preimmune sera against peptide B (compare example 12). The PNDF membrane in Fig. B with lanes 6 to 9 was incubated with preimmune sera against peptide C (see example 12). The PVDF membrane in Fig. B with lanes 1 to 4 was incubated with immune sera against peptide B (see example 12). The PVDF membrane in Fig.
B mit den Spuren 6 bis 9 wurde mit Immunseren gegen das Peptid C (vergleiche Beispiel 12) inkubiert.B with lanes 6 to 9 was incubated with immune sera against peptide C (compare example 12).
Fig.17: Autoradiogramm von 35 S-markiertem, in vitro translatiertem Protein. In der Spur 1 wurde das vollständige in vitro translatierte hTC aufgetragen (vergleiche BeispielFig. 17: Autoradiogram of 35 S-labeled, in vitro translated protein. The complete in vitro translated hTC was plotted in lane 1 (see example
15). In der Spur 2 wurde eine C-terminal verkürzte Version von phTC aufgetragen.15). A C-terminal shortened version of phTC was applied in lane 2.
Die Spur 3 zeigt eine vom Hersteller (vergleiche Beispiel 15) gelieferte Positivkontrolle für die in vitro Translation Zur Abschätzung der Proteingroßen ist auf der rechten Seite ein Proteingroßenstandard gekennzeichnetLane 3 shows one supplied by the manufacturer (see example 15) Positive control for in vitro translation To estimate the protein sizes, a protein size standard is marked on the right side
Autoradiogramm von 32P-markierten Produkten aus dem TRAP-Assay (vergleiche Beispiel 15) In den Spuren 1 und 2 wurde als Negativkontrolle ein TRAP-AssayAutoradiogram of 32 P-labeled products from the TRAP assay (see Example 15). In tracks 1 and 2, a TRAP assay was used as a negative control
Ansatz ohne Zugabe von Enzym oder Protein aufgetragen In den Spuren 3 und 4 wurde als Positivkontrolle ein TRAP-Assay-Ansatz mit partiell aufgereinigter humaner Telomerase aus HeLa-Zellen aufgetragen In den Spuren 5 und 6 wurde ein TRAP-Assay-Ansatz mit in vitro translatiertem phTC unverdünnt aufgetragen In den Spuren 7 und 8 wurde ein TRAP-Assay Ansatz mit in vitro translatiertem phTC in einer 1 4 Verdünnung aufgetragen In den Spuren 9 und 10 wurde ein TRAP- Assay Ansatz mit in vitro translatiertem phTC in einer 1 16 Verdünnung aufgetragen In den Spuren 1 1 und 12 wurde als Negativkontrolle ein TRAP-Assay Ansatz mit in vitro translatierter Luziferase aufgetragenApproach applied without the addition of enzyme or protein In lanes 3 and 4, a TRAP assay approach with partially purified human telomerase from HeLa cells was applied as a positive control. In lanes 5 and 6, a TRAP assay approach with in vitro translated was applied undiluted phTC In lanes 7 and 8, a TRAP assay approach with in vitro translated phTC was applied in a 1 4 dilution. In lanes 9 and 10, a TRAP assay approach with in vitro translated phTC in a 1 16 dilution was applied In lanes 1 1 and 12, a TRAP assay approach with in vitro translated luciferase was applied as a negative control
Autoradiogramm von 2P-markierten Produkten aus dem direkten Telomerase Assay (vergleiche Beispiel 15) In der Spur 1 wurde ein radioaktiv markierter 10 bp- Marker aufgetragen In der Spur 2 wurde ein 5' radioaktiv markiertes Telo- meroligonukleotid ([TTAGGG] ) aufgetragen Bei der Spur 3 handelt es sich um eine leere Spur In der Spur 4 wurde als Positivkontrolle partiell aufgereinigte humaneAutoradiogram of 2 P-labeled products from the direct telomerase assay (see Example 15). A 1 bp radio-labeled marker was applied in lane 1. A 5 'radio-labeled telomer oligonucleotide ([TTAGGG]) was applied in lane 2 lane 3 is an empty lane. In lane 4, partially purified human was used as a positive control
Telomerase aus HeLa-Zellen im direkten Assay verwendet und das Syntheseprodukt aufgetragen In der Spur 5 wurde das in vitro translatierte phTC aus Beispiel 15 im direkten Assay verwendet und das Syntheseprodukt aufgetragen Telomerase from HeLa cells used in the direct assay and the synthesis product applied. In lane 5, the in vitro translated phTC from Example 15 was used in the direct assay and the synthesis product was applied
BeispieleExamples
Beispiel 1example 1
Es wird heute angenommen, daß weniger als 5 % des humanen Genoms tatsächlich transkribiert und in Protein translatiert werden. Durch die gezielte Untersuchung dieser kodierenden Genomanteile könnten bereits vor der kompletten Sequenzierung des Genoms wichtige Informationen über die 60 000 - 70 000 Gene in einer humanen Zelle gewonnen werden. Die Automatisierung der Hochdurchsatz-DNA-Sequenziertechnologie in den letzten 10 bis 15 Jahren ermöglichte es, viele cDNAs aus Plasmid-cDNA-Bibliotheken unterschiedlichsten Ursprungs zu sammeln und das jeweilige 5'- bzw. 3 '-Ende zu sequenzieren. Diese typischerweise 300 bis 400 bp kurzen DNA-Sequenzen werden „Expressed Sequence Tags" oder kurz ESTs genannt und sind in verschiedenen spezialisierten Datenbanken zusammengefaßt. Der EST-Ansatz wurde zuerst von Okubo et al (1992) beschrieben und von Adams et al. (1992) auf einen größeren Maßstab übertragen. Gegenwärtig sind etwa 50 000 Gene aus humanen Zellen teilweise sequenziert und als EST-Eintragung dokumentiert.It is believed today that less than 5% of the human genome is actually transcribed and translated into protein. By specifically examining these coding genome parts, important information about the 60,000-70,000 genes in a human cell could be obtained even before the genome was completely sequenced. The automation of high-throughput DNA sequencing technology over the past 10 to 15 years has made it possible to collect many cDNAs from plasmid cDNA libraries of various origins and to sequence the respective 5 'or 3' end. These typically 300 to 400 bp short DNA sequences are called "Expressed Sequence Tags" or ESTs for short and are summarized in various specialized databases. The EST approach was first described by Okubo et al (1992) and by Adams et al. (1992 ) on a larger scale, currently around 50,000 genes from human cells are partially sequenced and documented as EST entries.
Durch den Vergleich mit DNA- und Aminosäuresequenzen bekannter Gene können ver- wandte, aber bislang unbekannte Gene in diesen EST-Datenbanken identifiziert werdenBy comparison with DNA and amino acid sequences of known genes, related but previously unknown genes can be identified in these EST databases
(Gerhold and Caskey, 1996). Ein Suchalgorithmus, der sich hierfür besonders bewährt hat, ist das tBLASTn (Altschul et al, 1990). Dieser Algorithmus translatiert jede DNA-Sequenz in der EST-Datenbank in alle sechs möglichen Leserahmen und vergleicht diese Aminosäuresequenzen mit der bekannten Proteinsequenz.(Gerhold and Caskey, 1996). A search algorithm that has proven particularly useful for this is the tBLASTn (Altschul et al, 1990). This algorithm translates every DNA sequence in the EST database into all six possible reading frames and compares these amino acid sequences with the known protein sequence.
Mit der kürzlich publizierten Proteinsequenz für die katalytische Telomerase-Untereinheit aus Euplotes aediculatus, pl23 (Lingner et al, 1997), wurde die EST-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) durchsucht. Als Resultat wurde ein humaner EST mit der Accession Nummer AA281296 identifiziert, der im Leserahmen +1 eine signifikante Homologie zu pl23 aufweist. Diese Aminosäuresequenz mit demThe EST database at the National Center for Biotechnology Information (NCBI) was searched with the recently published protein sequence for the catalytic telomerase subunit from Euplotes aediculatus, pl23 (Lingner et al, 1997). As a result, a human EST with the accession number AA281296 was identified, which has a significant homology to pl23 in reading frame +1. This amino acid sequence with the
Leserahmen +1 wird im folgenden als EST+] bezeichnet. Die Homologie zwischen pl23 und dem EST+i ist am auffälligsten in zwei Sequenzbereichen, die durch 30 Aminosäuren getrennt sind Der längere Sequenzbereich, der sich bei pl23 von Aminosäure 438 bis 484 erstreckt, ist zu 38% identisch zu dem korrespondierenden Bereich im EST+i Werden auch ahnliche Aminosäuren berücksichtigt, egt die Übereinstimmung sogar bei 59% Der zweite Homologieblock erstreckt sich im pl23-Protein von Aminosäure 513 bis 530 und weist eine 44%ige Identität zu dem entsprechenden Sequenzabschnitt im identifizierten EST+i auf Unter Ber cksichtigung von Aminosaureresten mit ahnlichen Eigenschaften findet sich eine Uberstimmung von 61%Reading frame +1 is referred to below as EST +] . The homology between pl23 and the EST + i is most noticeable in two sequence regions, which are separated by 30 amino acids. The longer sequence region, which in the case of pl23 extends from amino acid 438 to 484, is 38% identical to the corresponding region in the EST + i If similar amino acids are also taken into account, the agreement is even 59%. The second homology block extends from amino acid 513 to 530 in the pl23 protein and has a 44% identity to the corresponding sequence section in the identified EST + i, taking amino acid residues into account similar properties there is a match of 61%
Ein wichtiger Parameter zur Beurteilung einer BLAST-Suche ist der Wert P (Probabi ty) P gibt an, mit welcher Wahrscheinlichkeit ein spezifisches Segmentpaar auch in einer BLAST- Suche mit einer Zufallssequenz gefunden wurde und bewegt sich numerisch zwischen 0 (Resultat hoch signifikant) und 1 (Ergebnis ohne Bedeutung) So verlief z B der Vergleich des pl23 Äquivalents aus Hefe (est2p) mit der NCBI-EST-Datenbank negativ Der gefundene EST hatte eine Wahrscheinlichkeit von P=l (Tab 1) Dagegen weist das humaneAn important parameter for evaluating a BLAST search is the value P (Probabi ty) P indicates the probability with which a specific segment pair was also found in a BLAST search with a random sequence and ranges numerically between 0 (result highly significant) and 1 (result irrelevant) For example, the comparison of the pl23 equivalent from yeast (est2p) with the NCBI EST database was negative. The EST found had a probability of P = 1 (Table 1)
Telomerase- assoziierte Protein 1 (hTPl), das in einer der Allgemeinheit nicht zuganglichen EST-Datenbank gefunden wurde (Harrington et al , 1997), eine Wahrscheinlichkeit von P=0 004 aufTelomerase-associated protein 1 (hTPl), which was found in an EST database which is not accessible to the general public (Harrington et al, 1997), had a probability of P = 0 004
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Tab 1 Vergleich dreier tBlastn-Suchlaufe mit verschiedenen bekannten GenenTab 1 Comparison of three tBlastn searches with different known genes
Der durch den Vergleich mit pl23 identifizierte humane EST AA281296 hat eine Wahrscheinlichkeit von P=3 5x10"06 Diese Daten legen nahe, daß der identifizierte EST aller Wahrscheinlichkeit nach für ein Fragment der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase kodiert. Daher wird das korrespondierende Gen im folgenden mit hTC (human Telomerase, catalytic) und das abge- leitete Protein mit phTC abgekürzt.The human EST AA281296 identified by comparison with pl23 has a probability of P = 3 5x10 "06 These data suggest that the identified EST is likely to encode a fragment of the human telomerase catalytic subunit. The corresponding gene is therefore abbreviated to hTC (human telomerase, catalytic) and the derived protein to phTC.
Beispiel 2Example 2
Der durch den Vergleich mit pl23 identifizierte EST wurde am 2. April 1997 in die EST- Datenbank eingespeist und ist in keiner Zeitschrift publiziert. Die cDNA-Bibliothek, in welcher dieser EST-Klon vorliegt, wurde laut Angaben des National Center for Biotechnology Information wie folgt hergestellt:The EST identified by comparison with pl23 was entered in the EST database on April 2, 1997 and is not published in any journal. The cDNA library in which this EST clone is present was prepared as follows, according to the National Center for Biotechnology Information:
Nach Präparation der mRNA aus den Keimzentren der Tonsillen wurde eine cDNA- Synthese durchgeführt und die doppelsträngigen cDNA-Fragmente gerichtet über dieAfter preparation of the mRNA from the germ centers of the tonsils, a cDNA synthesis was carried out and the double-stranded cDNA fragments directed over the
Restriktionsenzymschnittstellen Not I und Eco RI in den Vektor pT7T3D-Pac kloniert.Restriction enzyme interfaces Not I and Eco RI cloned into the vector pT7T3D-Pac.
Die Sequenzierung der in die EST-Datenbank eingespeisten 389 bp erfolgte über den - 28ml3 rev2-Primer der Firma Amersham (DNA-Sequenz siehe Fig. lPosition 1685 bis 2073).The 389 bp fed into the EST database was sequenced using the - 28ml3 rev2 primer from Amersham (DNA sequence see FIG. 1 position 1685 to 2073).
Unter Verwendung der Lasergene Programmsoftware (Dnastar Inc.) wurde die DNA- Sequenz von EST AA281296 entsprechend des humanen genetischen Codes translatiert. Die resultierende Aminosäuresequenz (EST+i) enstpricht der Position 542 bis 670 in Fig. 2.Using the Lasergene program software (Dnastar Inc.), the DNA sequence of EST AA281296 was translated according to the human genetic code. The resulting amino acid sequence (EST + i) corresponds to positions 542 to 670 in FIG. 2.
Die abgeleitete Proteinsequenz von EST+i setzt sich aus 129 Aminosäuren zusammen, darunter 27 basische, 11 saure, 51 hydrophobe und 28 polare Aminosäurereste.The derived protein sequence from EST + i is composed of 129 amino acids, including 27 basic, 11 acidic, 51 hydrophobic and 28 polar amino acid residues.
Der in Beispiel 1 identifizierte EST ( AA 281296) wurde kommerziell von der Research Genetics, Inc. (Huntsville) in Form eines in E. coli transformierten Plasmids erworben und experimentiell analysiert: Wie in dem Ethidiumbromid-gefarbten Agarosegel der Fig 3 gezeigt, wird nach Restriktionsverdau der hergestellten Plasmid DNA vom EST AA 281296 ein etwa 2,2 kb großes Fragment aus dem Vektor pT7T3D freigesetzt Anhand einer parallel durchgeführten Polymeraseketten- (PCR) -Reaktion mit spezifischen internen Primern wurde der EST AA281296 überprüft Die Lange der erwarteten PCR Produkte liegt bei 325 und 380 bp und stimmt mit der Lange der experimentell gefundenen Fragmente uberein (vergl Spur 4 und 5 in Fig 3) Damit konnte gezeigt werden, daß der vom Research Genetics, Int (Huntsville) zugesandte E coli-Klon den identifizierten EST als Plasmid beinhaltetThe EST (AA 281296) identified in Example 1 was purchased commercially from Research Genetics, Inc. (Huntsville) in the form of a plasmid transformed in E. coli and analyzed experimentally: As shown in the ethidium bromide-stained agarose gel of FIG. 3, an approximately 2.2 kb fragment from the vector pT7T3D is released after restriction digestion of the plasmid DNA produced by EST AA 281296 using a polymerase chain (PCR) reaction carried out in parallel with specific internal reactions The AA AA121296 was checked for primers. The length of the expected PCR products is 325 and 380 bp and corresponds to the length of the fragments found experimentally (cf. lanes 4 and 5 in FIG. 3). It was thus possible to show that the length obtained by Research Genetics, Int (Huntsville) sent E coli clone contains the identified EST as a plasmid
Nach DNA-Praparation wurden die insgesamt 2176 bp des Inserts durch Doppelstrangsequenzierung identifiziert Ein Sequenzvergleich des Klons AA281296 mit der DNA- Sequenz des C5F-Fragments (vergleiche Beispiel 7) ergab, daß eine 182 bp Deletion vorliegt (Position 2352 bis 2533, Fig 1) und sich somit der offene Leserahmen in diesem Bereich verschiebt Zusammenfassend setzt sich die DNA-Sequenz von Klon AA281296 somit aus den Sequenzinformationen der Fig 1 (Position 1685 bis 2351 und Position 2534 bis 4042) zusammenAfter DNA preparation, the total of 2176 bp of the insert were identified by double-strand sequencing. A sequence comparison of the clone AA281296 with the DNA sequence of the C5F fragment (compare Example 7) showed that there was a 182 bp deletion (positions 2352 to 2533, FIG. 1) and thus the open reading frame shifts in this area. In summary, the DNA sequence of clone AA281296 is thus composed of the sequence information from FIG. 1 (positions 1685 to 2351 and positions 2534 to 4042)
Beispiel 3Example 3
Im tBLASTn Vergleich werden nur die Bereiche mit den höchsten Übereinstimmung zwischen pl23 und EST+i identifiziert (Aminosäuren 438-530, in pl23), wogegen die dazwischenliegenden Aminosäuren nicht berücksichtigt werden Um Aussagen über die Verwandtschaft der Proteinsequenzen über einen größeren Bereich (Aminosäuren 437-554, in p 123) zu treffen, wurde ein „Lipman-Pearson Proteinvergleich" durchgeführt (siehe Fig 4)In the tBLASTn comparison only the areas with the highest agreement between pl23 and EST + i are identified (amino acids 438-530, in pl23), whereas the amino acids in between are not taken into account. Statements about the relationship of the protein sequences over a larger area (amino acids 437- 554, in p 123), a "Lipman-Pearson protein comparison" was carried out (see FIG. 4)
Hierbei wurden 34% identische Aminosäuren bzw 59% Aminosäuren, die entweder identisch oder biochemisch ahnlich sind, gefunden Dieses Ergebnis zeigt, daß sich auch außerhalb der mit dem tBLASTn gefundenen Homologiebereiche die Verwandtschaft zwischen diesen Proteinen fortsetzt34% identical amino acids or 59% amino acids, which are either identical or biochemically similar, were found. This result shows that the relationship between these proteins continues beyond the homology ranges found with the tBLASTn
Wie kurzlich berichtet (Lingner et al, 1997), sind pl23 aus Euplotes aediculatus und est2p aus Saccharomyces cerevisiae zueinander homolog Um den Grad der Verwandtschaft zwischen pl23 und est2p ins Verhältnis zu der hier beschriebenen Homologie zwischen pl23 und EST+i zu stellen, wurde die oben beschriebene Region von pl23 (Aminosäuren 437-554) mit Hilfe des Lipman-Pearson Proteinvergleichs unter Verwendung identischer Parameter auch mit est2p verglichen. Dabei zeigte sich, daß pl23 und est2p in diesem aus- gewählten Bereich zu 21%) identisch sind bzw. 22% identische Aminosäuren oder biochemisch ähnliche Aminosäurereste aufweisen (siehe Fig. 5). Demnach ist die Homologie zwischen EST+] und dem pl23 von Euplotes signifikant höher als zwischen die pl23 und est2p.As recently reported (Lingner et al, 1997), pl23 from Euplotes aediculatus and est2p from Saccharomyces cerevisiae are homologous to each other around the degree of relationship To place the pl23 and est2p in relation to the homology between pl23 and EST + i described here, the region of pl23 (amino acids 437-554) described above was also compared with est2p using the Lipman-Pearson protein comparison using identical parameters. It was found that p123 and est2p are 21% identical in this selected region or 22% identical amino acids or biochemically similar amino acid residues (see FIG. 5). Accordingly, the homology between EST +] and the pl23 of Euplotes is significantly higher than between the pl23 and est2p.
Beispiel 4Example 4
Die Homologie von pl23 zu EST+ι und est2p legt die Schlußfolgerung nahe, daß alle 3 Proteine zur gleichen Proteinfamilie gehören. Um diese Annahme zu bestätigen, wurde est2p unter den in Beispiel 3 erwähnten Bedingungen mit EST+i verglichen (siehe Fig. 6). Dabei zeigte sich, daß EST+i 20% Identität zu est2p hat, also eine vergleichbareThe homology of pl23 to EST + ι and est2p suggests that all 3 proteins belong to the same protein family. To confirm this assumption, est2p was compared to EST + i under the conditions mentioned in Example 3 (see FIG. 6). It turned out that EST + i has 20% identity to est2p, a comparable one
Homologie wie pl23 zu est2p aufweist. Diese vergleichsweise geringe Übereinstimmung bestätigt auch den Befund, daß in der tBLASTn-Suche mit est2p kein signifikanter EST identifiziert wurde (siehe Beispiel 1).Homology like pl23 to est2p. This comparatively low agreement also confirms the finding that no significant EST was identified in the tBLASTn search with est2p (see Example 1).
Beispiel 5Example 5
Um für die Proteinfamilie der katalytischen Telomerase-Untereinheiten aus verschiedenen Spezies wichtige, unter Umständen fünktionelle Domänen, zu identifizieren, wurde ein Computervergleich mit pl23, est2p und phTC durchgeführt (siehe Fig. 7). Bei dieser Analyse fallen insbesondere zwei Bereiche auf, die in allen drei Proteinen enthalten sindIn order to identify important, possibly functional domains for the protein family of the catalytic telomerase subunits from different species, a computer comparison was carried out with pl23, est2p and phTC (see FIG. 7). In this analysis two areas are particularly noticeable, which are contained in all three proteins
(siehe Fig. 7). Dem Bereich, der bei pl23 den Aminosäuren 447 bis 460 entspricht (Fig. 13, Telomerase Motiv ) kann gegenwärtig keine eindeutige Funktion zugeordnet werden. Eine Motiv-Suche mit dem „Wisconsin Sequence Analysis Package" von der „Genetics Computer Group" (GCG) und eine Suche in einer Protein-Datenbank (Swissprot, Ausgabe vom 8.6.1997) ergaben keine signifikanten Erkenntnisse. Dagegen weist ein zweiter, zwischen pl23, est2p und phTC homologer Bereich, der bei pl23 den Aminosäuren 512-526 entspricht, ein Konsensus-Motiv für eine Reverse Transkriptase (RT) auf (Fig 7 und 13) Lingner et al. (1997) konnten zeigen, daß pl23/est2p insgesamt 6 solcher RT-Motive enthalten, die für die katalytische Funktion von pl23/est2p essentiell sind Wie in Fig 7 und 13 dargestellt, sind in der untersuchten(see Fig. 7). No clear function can currently be assigned to the region which corresponds to amino acids 447 to 460 in FIG. 13 (FIG. 13, telomerase motif). A motif search with the "Wisconsin Sequence Analysis Package" from the "Genetics Computer Group" (GCG) and a search in a protein database (Swissprot, edition of June 8th, 1997) did not reveal any significant findings. In contrast, a second region, which is homologous between pl23, est2p and phTC and corresponds to amino acids 512-526 in pl23, has a consensus motif for a reverse transcriptase (RT) (FIGS. 7 and 13) Lingner et al. (1997) were able to show that pl23 / est2p contain a total of 6 such RT motifs which are essential for the catalytic function of pl23 / est2p. As shown in FIGS
Sequenz von phTC auch zwei solcher RT-Motive konserviert Hierbei handelt es sich um die RT-Motive, welche bei pl23/est2p am weitesten N-terminal lokalisiert sind (Lingner et al, 1997)Sequence of phTC also conserves two such RT motifs. These are the RT motifs that are most N-terminally located at pl23 / est2p (Lingner et al, 1997)
Die Primarsequenzen von Reversen Transkriptasen sind stark divergent, nur wenige Aminosäuren sind innerhalb eines separaten Motivs vollständig konserviert (Poch et al, 1989 und Xiong and Eickbush, 1990) Außerdem unterscheiden sich Reverse Transkriptasen, die von Retroviren oder Long Terminal Repeat (LTR) Retrotransposons kodiert werden, durch verschiedene Abstände zwischen den konservierten RT-Motiven von solchen Reversen Transkriptasen, die von Nicht-LTR Retrotransposons oder der Gruppe II Introns kodiert werden (Xiong and Eickbush, 1990) Entsprechend des Aufbaus ihrer RT-Motive sind pl23, est2p und phTC letzterer RT-Gruppe zuzuordnen Interessanterweise entsprechen dabei die Konsensussequenzen der RT-Motive in phTC am genauesten dem postulierten RT-Konsensus-Motiv Von acht Aminosaureresten innerhalb der zwei RT-Motive sind bei phTC 6, bei pl23 und est2p hingegen nur 5 Aminosäuren zu finden (Fig 7 und 13 )The primary sequences of reverse transcriptases are highly divergent, only a few amino acids are fully conserved within a separate motif (Poch et al, 1989 and Xiong and Eickbush, 1990). Reverse transcriptases, which code for retroviruses or long terminal repeat (LTR) retrotransposons, also differ are, by different distances between the conserved RT motifs of such reverse transcriptases, which are encoded by non-LTR retrotransposons or group II introns (Xiong and Eickbush, 1990) According to the structure of their RT motifs, pl23, est2p and phTC are the latter Assign RT group Interestingly, the consensus sequences of the RT motifs in phTC correspond most closely to the postulated RT consensus motif. Of eight amino acid residues within the two RT motifs, 6 are found for phTC, whereas for pl23 and est2p only 5 amino acids (Fig 7 and 13)
Auffällig sind hierbei insbesondere die hydrophoben Aminosäuren wie Leucin und Isoleucin sowie die Aminosäuren Lysin und Arginin in bestimmten Positionen (Fig 7 und 13)Particularly noticeable are the hydrophobic amino acids such as leucine and isoleucine and the amino acids lysine and arginine in certain positions (Fig. 7 and 13)
Zusammenfassend konnte hiermit auf deskriptiver Ebene gezeigt werden, daß der aufgrund seiner Homologie zu pl23 identifizierte Klon AA281296 ein Fragment der katalytischenIn summary, it could be shown at the descriptive level that the clone AA281296 identified on the basis of its homology to pl23 is a fragment of the catalytic one
Untereinheit der humanen Telomerase darstelltSubunit of human telomerase represents
Beispiel 6Example 6
Zur Klonierung des 5'-Endes der hTC-cDNA wurden zusatzlich zu dem in Beispiel 8 aufgeführten Homologiescreening drei aufeinanderfolgende RACE (rapid amplification of cDNA ends)-Reaktionen durchgeführt Als cDNA-Quelle wurde Marathon-Ready cDNA (Fa Clontech) aus der humanen Leukamiezellinie K562 bzw aus humanem Testisgewebe eingesetzt Nachfolgend ist die Durchführung sowie das Ergebnis der einzelnen RACE- Runden beschriebenTo clone the 5 'end of the hTC cDNA, in addition to the homology screening listed in Example 8, three successive RACE (rapid amplification of cDNA ends) reactions were carried out. Marathon-Ready cDNA was used as the cDNA source (Clontech) from the human leukemia cell line K562 or from human testis tissue used. The implementation and the result of the individual RACE rounds are described below
Darüberhinaus wurden die Sequenzinformationen der RACE-Runden genutzt, um per PCR die Einzelfragmente als einen zusammenhangenden cDNA-Klon zu amplifizierenIn addition, the sequence information from the RACE rounds was used to amplify the individual fragments as a coherent cDNA clone by PCR
RACE-Runde 1RACE round 1
In einem Endvolumen von 50 μl wurden 5 μl K562 Marathon-Ready cDNA (Fa Clontech,In a final volume of 50 μl, 5 μl of K562 Marathon-Ready cDNA (Clontech,
Katalognummer 7441-1) mit 10 pmol dNTP-Mix versetzt und in 1 x Kien Taq PCR- Reaktionspuffer und 1 x Advantage Kien Taq Polymerase Mix (Fa Clontech) eine PCR- Reaktion durchgeführt Als Primer wurden 10 pmol des internen genspezifischen Primers GSP2 (5'-GCAACTTGCTCCAGACACTCTTCCGG-3') aus dem 5'-Bereich des hTC- EST-Klons sowie 10 pmol des Marathon Adaptor Primers API (5'-Catalog number 7441-1) was mixed with 10 pmol dNTP mix and a PCR reaction was carried out in 1 x Kien Taq PCR reaction buffer and 1 x Advantage Kien Taq Polymerase Mix (Clontech). 10 pmol of the internal gene-specific primer GSP2 (5th '-GCAACTTGCTCCAGACACTCTTCCGG-3') from the 5 'range of the hTC EST clone and 10 pmol of the Marathon Adapter Primer API (5'-
CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3', Fa Clontech) zugefügt Die PCR wurde in 4 Schritten durchgeführt Nach einer einminutigen Denaturierung bei 94°C wurde über 5 Zyklen für 30 sec bei 94°C denaturiert und anschließend für 4 min bei 72°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert Es folgten 5 Zyklen, bei denen für 30 sec die DNA bei 94°C denaturiert wurde, die anschließende Primerverlangerung aber für 4 min beiCCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ', from Clontech) added. The PCR was carried out in 4 steps. After denaturation at 94 ° C. for one minute, the mixture was denatured for 5 seconds for 30 seconds at 94 ° C. and then the primers were added for 4 minutes at 72 ° C. and the DNA chain extended There followed 5 cycles in which the DNA was denatured at 94 ° C. for 30 seconds, but the subsequent primer extension for 4 minutes
70°C erfolgte Abschließend wurden dann 22 Zyklen durchgeführt, bei denen nach den 30 sec DNA-Denaturierung die Primeranlagerung und Kettenverlangerung für 4 min bei 68°C stattfand.Finally, 22 cycles were carried out, in which after the 30 sec DNA denaturation, the primer attachment and chain extension took place for 4 min at 68 ° C.
Im Anschluß an diese PCR wurde das PCR-Produkt 1 50 verdünnt Fünf μl dieser Verdünnung wurden in einer zweiten „nested" PCR zusammen mit 10 pmol dNTP-Mix in 1 x Kien Taq PCR-Reaktionspuffer und 1 x Advantage Kien Taq Polymerase-Mix sowie 10 pmol des Primers GSP2 und 10 pmol des „nested" Marathon Adaptor Primers AP2 (5'- ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3', Fa Clontech) eingesetzt Die PCR-Bedingungen entsprachen den in der ersten PCR gewählten Parametern Als einzige Ausnahme wurden im letzten PCR-Schritt statt 22 Zyklen nur 16 Zyklen gewählt Als Produkt dieser Nested-RACE-PCR wurde ein 1 153 bp langes DNA-Fragment erhalten Dieses wurde in den TA-Cloning Vektor pCR2 1 der Fa InVitrogen kloniert und vollständig doppelstrangig sequenziert (Fig 8 und SEQ ID No. 3).Following this PCR, the PCR product was diluted 1,50. Five μl of this dilution were mixed in a second “nested” PCR together with 10 pmol dNTP mix in 1 × Kien Taq PCR reaction buffer and 1 × Advantage Kien Taq polymerase mix as well 10 pmol of the primer GSP2 and 10 pmol of the “nested” marathon adapter primer AP2 (5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3 ', Clontech) were used. The PCR conditions corresponded to the parameters selected in the first PCR. The only exception were in the last PCR step only 16 cycles selected instead of 22 cycles A 1,153 bp DNA fragment was obtained as the product of this nested RACE PCR. This was cloned into the TA cloning vector pCR2 1 from InVitrogen and completely double-stranded sequenced (FIG. 8 and SEQ ID No. 3).
Die Nukleotide 974 bis 1153 repräsentieren die in Fig 1 dargestellte Nukleotidregion 1629 bis 1808 der hTC-cDNA Bei dem von bp 1-973 reichenden Nukieotidbereich, der keine Homologie zu der in Fig 1 gezeigten hTC-cDNA-Sequenz aufweist, handelt es sich um Intronsequenzen des hTC-Gens (Daten nicht gezeigt) Eine 3'-Splice-Konsensussequenz ist am Exon-Intron-Ubergang zu finden Die Präsenz von Intronsequenzen konnte auf unvollständig gesplicte mRNA als Ausgangssubstanz für die cDNA-Synthese zurückzuführen sein Auch genomische DNA-Kontaminationen in der cDNA konnten das Auffinden von Intronsequenzen erklarenNucleotides 974 to 1153 represent the nucleotide region 1629 to 1808 of the hTC cDNA shown in FIG. 1. The nucleotide region extending from bp 1-973, which has no homology to the hTC cDNA sequence shown in FIG. 1, is intron sequences of the hTC gene (data not shown) A 3'-splice consensus sequence can be found at the exon-intron junction. The presence of intron sequences could be due to incompletely spliced mRNA as the starting substance for cDNA synthesis. Genomic DNA contamination in the cDNA could explain the discovery of intron sequences
RACE-Runde 2'RACE round 2 '
Basierend auf den Sequenzdaten der ersten RACE-Runde wurde eine zweite RACE mit dem genspezifischen Primer GSP5 aus der 5'-Region von RACE-Produkt 1 (5'- GGCAGTGACCAGGAGGCAACGAGAGG-3') sowie dem API -Primer durchgeführt Als cDNA-Quelle wurde Marathon-Ready cDNA aus humanem Testis (Fa Clontech, Katalognummer 7414-1) verwendet Es wurden gleiche PCR-Bedingungen wie bei der 1Based on the sequence data from the first round of RACE, a second RACE was carried out with the gene-specific primer GSP5 from the 5 'region of RACE product 1 (5'-GGCAGTGACCAGGAGGCAACGAGAGG-3') and the API primer. Marathon was used as the cDNA source -Ready cDNA from human testis (Clontech, catalog number 7414-1) was used. The same PCR conditions were used as in the first
PCR in RACE-Runde 1 gewählt Auch in RACE-Runde 2 wurde an die 1 PCR eine 2 „nested" PCR mit verdünntem PCR-Produkt als cDNA-Quelle angeschlossen Als „nested" PCR-Primer wurden der genspezifische Primer GSP6 aus der 5'-Region von RACE- Produkt 1 (5'-GGCACACTCGGCAGGAAACGCACATGG-3') sowie der AP2-Primer genutzt. Die Bedingungen entsprachen den Parametern der Nested-PCR aus RACE-RundePCR selected in RACE round 1 Also in RACE round 2, a 2 "nested" PCR with diluted PCR product was connected to the 1 PCR as a cDNA source. The gene-specific primer GSP6 from FIG. 5 'was used as the "nested" PCR primer. Region of RACE product 1 (5'-GGCACACTCGGCAGGAAACGCACATGG-3 ') and the AP2 primer used. The conditions corresponded to the parameters of the nested PCR from the RACE round
11
Das 412 bp lange PCR-Produkt der Nested-PCR aus RACE-Runde 2 wurde in den TA- Cloning Vektor pCRII-Topo der Fa Invitrogen kloniert und vollständig sequenziert (Fig 9 und SEQ ID No 4) Der Sequenzabschnitt von bp 267 bis bp 412 ist komplett homolog zu dem 5 '-Bereich des Produktes aus RACE 1 Die Region von bp 1 bis bp 266 verlängert RACE-Produkt 1 am 5 '-Ende. Bei diesem RACE-Produkt 2 handelt es sich wahrscheinlich komplett um einen Intronbereich des hTC-Gens (Daten nicht gezeigt).The 412 bp long PCR product of the nested PCR from RACE round 2 was cloned into the TA cloning vector pCRII-Topo from Invitrogen and completely sequenced (FIG. 9 and SEQ ID No 4). The sequence section from bp 267 to bp 412 is completely homologous to the 5 'area of the product from RACE 1 The region extended from bp 1 to bp 266 RACE product 1 at the 5 'end. This RACE product 2 is probably completely an intron region of the hTC gene (data not shown).
RACE-Runde 3 :RACE round 3:
Eine dritte RACE-Runde führte zur Identifizierung von weiter 5 '-gelegenen hTC-cDNA- Regionen. Ausgehend von den Sequenzergebnissen der RACE-Runde 2 wurde ein genspezifischer Primer GSP9 (5'-CCTCCTCTGTTCACTGCTCTGGCC-3') aus dem 5'- B ereich des RACE-Produkts 2 gewählt und zusammen mit dem API -Primer und Marathon- Ready cDNA aus humanem Testis (Fa. Clontech) in einer neuen RACE eingesetzt. DieA third round of RACE led to the identification of further 5'-located hTC cDNA regions. Based on the sequence results of RACE round 2, a gene-specific primer GSP9 (5'-CCTCCTCTGTTCACTGCTCTGGCC-3 ') from the 5' range of RACE product 2 was selected and together with the API primer and marathon-ready cDNA from human Testis (from Clontech) used in a new RACE. The
RACE-Bedingungen glichen denen der 1. PCR in RACE 1 und 2. In der nachfolgenden „nested" RACE, die, entsprechend der „nested"-RACE in Runde 1 und 2, mit dem genspezifischen Primer GSP 10 aus dem 5'-Bereich von RACE-Produkt 2 (5'- CGTAAGTTTATGCAAACTGGACAGG-3') und AP2 erfolgte, wurde ein 1012 bp langes Fragment (Fig. 10 und SEQ ID No. 5) amplifiziert und in den TA-Cloning Vektor pCRII-RACE conditions were the same as for the 1st PCR in RACE 1 and 2. In the subsequent "nested" RACE, which, according to the "nested" RACE in rounds 1 and 2, with the gene-specific primer GSP 10 from the 5 'range from RACE product 2 (5'-CGTAAGTTTATGCAAACTGGACAGG-3 ') and AP2, a 1012 bp fragment (Fig. 10 and SEQ ID No. 5) was amplified and into the TA-cloning vector pCRII-
TOPO kloniert. Die nachfolgende Sequenzierung zeigte, daß die 3 '-Region dieses RACE- Fragments (bp 817 - bp 1012) offensichtlich noch Intronsequenz des hTC-Gens darstellt. Komplett homolog zur 5'-Region von RACE-Produkt 2 ist der Bereich von bp 889-1012. Dagegen ist der 5'-Bereich dieses Fragments von bp 1-bp 816 identisch mit der in Fig. 1 gezeigten Region von bp 814 - bp 1629 der hTC-cDNA. Eine potentielle 5'-Splice-TOPO cloned. The subsequent sequencing showed that the 3 'region of this RACE fragment (bp 817 - bp 1012) still clearly represents the intron sequence of the hTC gene. The area of bp 889-1012 is completely homologous to the 5 'region of RACE product 2. In contrast, the 5 'region of this fragment of bp 1-bp 816 is identical to the region of bp 814-bp 1629 of the hTC cDNA shown in FIG. 1. A potential 5 'splice
Konsensussequenz ist am Exon-Intron-Ubergang zu finden.Consensus sequence can be found at the exon-intron junction.
Beispiel 7Example 7
Zur Klonierung eines zusammenhängenden Fragments aus den Sequenzinformationen vonFor cloning a contiguous fragment from the sequence information of
RACE 2 und dem Klon AA281296 wurde eine PCR durchgeführt. Als cDNA-Quelle wurde Marathon-Ready cDNA aus humanem Testis (Fa. Clontech; Katalognummer 7414-1) verwendet. Der PCR Ansatz erfolgte wie unter RACE 1 (vergleiche Beispiel 6) beschrieben, allerdings mit den Primern C5F (5'-CGAGTGGACACGGTGATCTCTGCC-3') aus der 5' Region von RACE 2 und dem Primer C3B (5'- GCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-A PCR was carried out on RACE 2 and the clone AA281296. Marathon-Ready cDNA from human testis (Clontech; catalog number 7414-1) was used as the cDNA source. The PCR was carried out as described under RACE 1 (compare Example 6), but with the primers C5F (5'-CGAGTGGACACGGTGATCTCTGCC-3 ') from the 5' region of RACE 2 and the primer C3B (5'-GCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-
3 ') aus der 3 ' Region vom Klon AA281296. Die PCR wurde in 2 Schritten durchgeführt. Nach einer einminütigen Denaturierung bei 94°C wurde über 36 Zyklen für 30 sec bei 94°C denaturiert und anschließend für 4 min bei 68°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert.3 ') from the 3' region of clone AA281296. The PCR was carried out in 2 steps. After denaturation at 94 ° C. for one minute, the mixture was at 36 ° C. for 30 seconds over 36 cycles denatured and then the primers attached for 4 min at 68 ° C. and the DNA chain extended.
Als Produkt dieser PCR wurde ein 2486 bp langes DNA-Fragment, im folgenden als C5F- Fragment bezeichnet, erhalten. Dieses wurde in den TA-Cloning Vektor pCRII-TOPO derA 2486 bp DNA fragment, hereinafter referred to as the C5F fragment, was obtained as the product of this PCR. This was used in the TA cloning vector pCRII-TOPO
Fa. Invitrogen kloniert und vollständig doppelsträngig sequenziert. Ein Sequenzvergleich von dem C5F-Fragment mit DNA-Sequenz vom Klon AA281296 ergab, daß zwischen dem RT-Motiv 3 und RT-Motiv 4 eine 182 bp lange in frame Insertion vorliegt (Position 2352 bis 2533, Fig. l). Ein weiterer Vergleich der DNA vom C5F-Fragment mit den Sequenzen der drei RACE-Runden machte deutlich, daß am 3' Ende von C5F ein bereits in RACE 2 identifiziertes Intron vorliegt. Eine 3'-Splice-Konsensussequenz ist am Exon-Intron- Übergang zu finden. Zusammenfassend setzt sich die DNA-Sequenz vom C5F-Fragment somit aus den Sequenzinformationen der Fig. 9 (Position 64 bis 278) und den Sequenzdaten der Fig. 1 (Position 1636 bis 3908) zusammen.Invitrogen cloned and sequenced completely double-stranded. A sequence comparison of the C5F fragment with DNA sequence from clone AA281296 showed that there is a 182 bp long in frame insertion between RT motif 3 and RT motif 4 (positions 2352 to 2533, FIG. 1). A further comparison of the DNA from the C5F fragment with the sequences of the three RACE rounds made it clear that an intron already identified in RACE 2 is present at the 3 'end of C5F. A 3 'splice consensus sequence can be found at the exon-intron junction. In summary, the DNA sequence of the C5F fragment is thus composed of the sequence information of FIG. 9 (positions 64 to 278) and the sequence data of FIG. 1 (positions 1636 to 3908).
Beispiel 8Example 8
Zur Klonierung des 5 '-Endes der hTC-cDNA wurden zusätzlich zu dem in Beispiel 6 aufgeführten RACE-Protokoll ein Homologiescreening (Ausubel et al, 1987) durchgeführt. Als cDNA-Quelle wurde eine humane Erythroleukemia 5 '-Stretch Plus cDNA Bibliothek (Fa.To clone the 5 'end of the hTC cDNA, homology screening was carried out in addition to the RACE protocol listed in Example 6 (Ausubel et al, 1987). A human erythroleukemia 5 'stretch plus cDNA library (Fa.
Clontech, Kat. Nr. HL5016b) aus der humanen Leukämiezellinie K562 verwendet. Etwa 3x10 Pfü dieser random und oligo dT geprimten Bibliothek wurden wie bei Ausubel et al, (1987) ausplattiert und zum Screening eingesetzt. Als Probe wurde ein 719 bp langes (Position 1685 bis 2404, entsprechend der Fig. 1) radioaktiv markiertes hTC-DNA- Fragment benutzt.Clontech, cat. No. HL5016b) from the human leukemia cell line K562. About 3x10 pfü of this random and oligo dT primed library were plated as in Ausubel et al, (1987) and used for screening. A 719 bp long (position 1685 to 2404, corresponding to FIG. 1) radioactively labeled hTC-DNA fragment was used as the sample.
Von 20 putativ positiven λ Klonen konnte nach einem Rescreening mit der gleichen hTC- Sonde der λ Klon 12 als positiv verifiziert werden. Nach Plaqueaufreinigung und λ DNA- Präparation (Ausubel et al, 1987) wurde das 4kb Insert in den Vektor pBluescript umkloniert und durchsequenziert (Fig. 11 und SEQ ID No. 6). Ein Vergleich der λ Klon 12-Sequenz mit den Sequenzen der RACE-Klone und der DNA- Sequenz vom Klon AA281296 ergab, daß dieser im Homologie Screening identifizierte Klon für einen 5' Teil der hTC-cDNA kodiert und ein putatives ATG-Startcodon in Position 63 entsprechend der Fig. l aufweist. 5' von diesem ATG liegt kein Stopcodon im gleichen Leserahmen vor. Weitere Sequenzanalysen machen deutlich, daß der λ Klon 12 von Position 1656 bis 2004 wahrscheinlich ein Intron enthält. Sehr gut konservierte 5' und 3 ' Splicestellen belegen diese Hypothese. Die für die hTC-cDNA kodierende Sequenz setzt sich dann von Position 2005 bis Position 2382 fort. Die Sequenz von 2383 bis zum 3 ' Ende vom λ Klon 12 weist einen auffälligen offenen Leserahmen in Leseraster -4 auf. Eine bioinformatorische Analyse der entsprechenden DNA-Sequenz zeigte, daß dieserOut of 20 putatively positive λ clones, λ clone 12 was verified as positive after rescreening with the same hTC probe. After plaque purification and λ DNA preparation (Ausubel et al, 1987), the 4 kb insert was cloned into the vector pBluescript and sequenced (FIG. 11 and SEQ ID No. 6). A comparison of the λ clone 12 sequence with the sequences of the RACE clones and the DNA sequence from clone AA281296 showed that this clone identified in the homology screening codes for a 5 ' part of the hTC cDNA and a putative ATG start codon in position 63 corresponding to FIG. 1. 5 'of this ATG there is no stop codon in the same reading frame. Further sequence analyzes make it clear that λ clone 12 from position 1656 to 2004 probably contains an intron. Very well preserved 5 'and 3 ' splice sites support this hypothesis. The sequence coding for the hTC cDNA then continues from position 2005 to position 2382. The sequence from 2383 to the 3 'end of λ clone 12 has a striking open reading frame in reading frame -4. A bioinformatory analysis of the corresponding DNA sequence showed that this
Leserahmen über etwa 400 bp identisch zu diversen ESTs ist, die in keinem Zusammenhang zur hTC-cDNA stehen. Somit handelt es sich bei dem λ Klon 12 um einen Chimären Klon, der sich im wesentlichen aus dem 5' Ende der hTC cDNA und einem weiteren cDNA-Klon unbekannter Funktion zusammensetzt.Reading frame over about 400 bp is identical to various ESTs that are not related to the hTC cDNA. The λ clone 12 is thus a chimeric clone, which is composed essentially of the 5 'end of the hTC cDNA and another cDNA clone of unknown function.
Eine zusammenfassende schematische Darstellung mit der relativen Orientierung der RACE-Produkte und des Homologiescreenings ist in Fig. 12 dargestellt. Die vollständige Sequenz der hTC-cDNA (Fig. 1) wurde aus dem λ Klon 12 (Position 21 bis 1655 entsprechend der Fig. 11), dem PCR-Produkt C5F (Position 1636 bis 3908 entsprechend der Fig. 1) und dem EST AA281296 (Position 3909 bis 4042 entsprechend der Fig. 1) zusammengesetzt.A summary schematic representation with the relative orientation of the RACE products and the homology screening is shown in FIG. The complete sequence of the hTC cDNA (FIG. 1) was obtained from the λ clone 12 (positions 21 to 1655 corresponding to FIG. 11), the PCR product C5F (positions 1636 to 3908 corresponding to FIG. 1) and the EST AA281296 (Position 3909 to 4042 according to FIG. 1) composed.
Beispiel 9Example 9
Durch einen Vergleich der phTC-Proteinsequenz (Fig. 2 und SEQ ID No. 2) mit einerBy comparing the phTC protein sequence (Fig. 2 and SEQ ID No. 2) with one
Konsensussequenz von Reversen Transkriptasen (Poch et al., 1989, Xiong and Eickbush, 1990) wurden insgesamt sieben Motive für Reverse Transkriptasen (RT-Motive) identifiziert (Fig. 13). Innerhalb dieser Motive sind einige Aminosäuren nicht nur zwischen der RT-Konsensussequenz und dem phTC, sondern auch im Vergleich zu dem Telomerase- protein aus Euplotes hoch konserviert. So sind z.B. in RT-Motiv 5 zwei AsparaginsäurenA consensus sequence of reverse transcriptases (Poch et al., 1989, Xiong and Eickbush, 1990) identified a total of seven motifs for reverse transcriptases (RT motifs) (FIG. 13). Within these motifs, some amino acids are highly conserved not only between the RT consensus sequence and the phTC, but also in comparison to the telomerase protein from Euplotes. For example, in RT motif 5 two aspartic acids
(Position 868 und 869 in Fig. 2) völlig konserviert (Fig. 13). Das aus anderen Reverse Transkriptasen abgeleitete RT-Motiv 7 (Poch et al., 1989, Xiong and Eickbush, 1990) wurde nur in der humanen katalytischen Telomeraseuntereinheit aufgezeigt, nicht in dem Euplotes-Protem (Fig. 13).(Positions 868 and 869 in Fig. 2) fully preserved (Fig. 13). That from other reverse Transcriptase-derived RT motif 7 (Poch et al., 1989, Xiong and Eickbush, 1990) was only shown in the human catalytic telomerase subunit, not in the Euplotes proteme (FIG. 13).
Auffällig sind weiterhin Strukturmerkmale, die sich nur in den Telomeraseproteinen, nicht jedoch in anderen Reverse Transkriptasen aufzeigen lassen. Das Telomerase Motiv (Position 553 und 565 in Fig. 2) ist eine für diese Proteinfamilie spezifische Struktur, da es in keinem bisher bekannten Protein vorkommt. Ein weiteres nur in den katalytischen Telomeraseproteinen identifiziertes Merkmal ist der Abstand zwischen den RT -Motiven 3 und 4, der mit 107 Aminosäuren deutlich größer ist als in anderen RTs. DieseAlso striking are structural features that can only be demonstrated in the telomerase proteins, but not in other reverse transcriptases. The telomerase motif (positions 553 and 565 in FIG. 2) is a structure specific for this protein family, since it does not occur in any protein known to date. Another feature only identified in the catalytic telomerase proteins is the distance between the RT motifs 3 and 4, which at 107 amino acids is significantly larger than in other RTs. This
Besonderheiten erlauben die Schlußfolgerung, daß die katalytischen Untereinheiten der Telomerasen aus verschiedenen Spezies wahrscheinlich eine eigene Untergruppe der RNA- abhängigen DNA-Polymerasen darstellt.Peculiarities allow the conclusion that the catalytic subunits of the telomerases from different species probably represent a separate subset of the RNA-dependent DNA polymerases.
Beispiel 10Example 10
Die Expression der Telomerase RNA-Untereinheit (hTR) korreliert nicht mit der Telomeraseaktivitat, sondern wird ubiquitär beobachtet (Feng et al, 1995). Somit stellt sich die Frage, ob die Ausprägung dier katalytischen Telomerase-Untereinheit mit der Telomeaseaktivität einhergeht.The expression of the telomerase RNA subunit (hTR) does not correlate with the telomerase activity, but is observed ubiquitously (Feng et al, 1995). This raises the question of whether the expression of the catalytic telomerase subunit is associated with the telomease activity.
Um das hTC-Expressionslevel zu analysieren, wurden Northern Blot-Experimente (Ausubel et al, 1987) durchgeführt. Die kommerziell erhältlichen Northern Blots waren entweder mit einer Reihe von RNA-Präparationen aus normalem, humanem Gewebe (Fa. Clontech; Katalognummer 7760-1) oder mit RNA-Proben aus humanen KrebszeUinien (Fa. Clontech;Northern blot experiments (Ausubel et al, 1987) were carried out to analyze the level of hTC expression. The commercially available Northern blots were either with a series of RNA preparations from normal human tissue (Clontech; catalog number 7760-1) or with RNA samples from human cancer cells (Clontech;
Katalognummer 7757-1) bestückt. Als Probe wurde ein 719 bp langes (Position 1685 bis 2404, entsprechend der Fig. l) radioaktiv markiertes hTC-DNA-Fragment benutzt. Die Inkubation der Membranen mit der Probe erfolgte nach Angaben des Herstellers (Fa. Clontech).Catalog number 7757-1). A 719 bp long (position 1685 to 2404, corresponding to FIG. 1) radioactively labeled hTC-DNA fragment was used as the sample. The membranes were incubated with the sample according to the manufacturer (Clontech).
In den acht getesteten humanen Zellinien (3 Leukämiezellinien, 3 Carcinomzellinien, ein Melanom und ein Lymphom) wurden zwei RNA-Haupttranskripte in der Größe von etwa 9,5 kb und 4,4 kb und ein RNA-Nebentranskript von etwa 6 kb nachgewiesen, die mit der Probe kreuzhybridisieren (Fig. 15, Abb. A). Die hTC mRNA wurde im Vergleich am stärksten in den Leukämie Zellinien K-562 und HL-60 exprimiert (Fig. 15, Abb. A). Im Gegensatz dazu war das hTC-Transkript in den getesteten normalen Geweben (Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas) nicht nachzuweisenIn the eight human cell lines tested (3 leukemia cell lines, 3 carcinoma cell lines, one melanoma and one lymphoma), two major RNA transcripts were approximately the size 9.5 kb and 4.4 kb and an RNA subtranscript of approximately 6 kb were detected, which cross-hybridize with the sample (FIG. 15, FIG. A). In comparison, the hTC mRNA was most strongly expressed in the leukemia cell lines K-562 and HL-60 (FIG. 15, FIG. A). In contrast, the hTC transcript could not be detected in the normal tissues tested (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney and pancreas)
(Fig. 15, Abb. B). Diese Beobachtung ist nicht überraschend, da in diesen Geweben auch keine Telomeraseaktivitat nachgewiesen werden konnte (Kim et al, 1994).(Fig. 15, Fig. B). This observation is not surprising since no telomerase activity could be detected in these tissues (Kim et al, 1994).
Diese Daten deuten darauf hin, daß die Induktion der hTC Expression für die Aktivierung der Telomerase während der Tumorentstehung eine wesentliche Rolle spielt.These data indicate that the induction of hTC expression plays an essential role in the activation of telomerase during tumor development.
Beispiel 11Example 11
Bei der PCR-Amplifikation der hTC-cDNA-Fragmente aus verschiedenen cDNA-Banken (Marathon Ready cDNA der Fa. Clontech aus der humanen Leukämiezellinie K562 und aus humanem Testis sowie cDNA aus der humanen prämyeloischen Leukämiezellinie HL60) wurden stets mehrere PCR-Produkte erhalten, die in ihrer Größe minimal voneinander abwichen. Um die Unterschiede zwischen den verschiedenen hTC-PCR-Produkten aufzuklären, wurde mit den Primern C5A (5'-CCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTGC- 3') und C3B (5'-GCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-) ein von bp 1783 bis bp 3901 reichendes Fragment der in Fig. 1 dargestellten hTC-cDNA amplifiziert. Als cDNA-Quelle wurde Marathon-Ready cDNA aus K562-Leukämiezellen (Fa. Clontech; KatalognummerDuring the PCR amplification of the hTC cDNA fragments from various cDNA banks (Marathon Ready cDNA from Clontech from the human leukemia cell line K562 and from human Testis and cDNA from the human premyeloid leukemia cell line HL60), several PCR products were always obtained, that differed minimally in size. In order to clarify the differences between the different hTC-PCR products, a fragment from bp 1783 to bp 3901 with the primers C5A (5'-CCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTGC-3 ') and C3B (5'-GCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-) was used hTC cDNA shown amplified. Marathon-Ready cDNA from K562 leukemia cells (from Clontech; catalog number
7441-1) verwendet (PCR1 und 2). In einer dritten PCR wurde mit den Primern GSPlvor7441-1) used (PCR1 and 2). In a third PCR, GSPl was used with the primers
(5'-GGCTGATGAGTGTGTACGTCGTCGAG-3') und HTRT3A (5'- GGGTGGCCATCAGTCCAGGATGG-3 ') ein hTC-Fragment von bp 1695 bis bp 3463 der hTC-cDNA in Fig. 1 aus HL60-cDNA amplifiziert.(5'-GGCTGATGAGTGTGTACGTCGTCGAG-3 ') and HTRT3A (5'-GGGTGGCCATCAGTCCAGGATGG-3') an hTC fragment from bp 1695 to bp 3463 of the hTC cDNA in Fig. 1 amplified from HL60 cDNA.
Nachfolgend sind die Bedingungen der 3 PCR-Reaktionen beschrieben:The conditions for the 3 PCR reactions are described below:
In der ersten PCR wurden in einem Endvolumen von 50 μl 5 μl K562 Marathon-Ready cDNA mit 10 pmol dNTP-Mix versetzt und in 1 x Kien Taq PCR-Reaktionspuffer und 1 x Advantage Kien Taq Polymerase Mix (Fa. Clontech) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Je 10 pmol der Primer C5A und C5B wurden zugefügt Die PCR wurde in 3 Schritten durchgeführt An eine einminutige Denaturierung bei 94°C schlössen sich 35 PCR-Zyklen an, in denen die DNA zunächst für 30 sec bei 94°C denaturiert wurde und anschließend für 4 min bei 68°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert wurde Zum Abschluß folgte für 10 min eine Kettenverlangerung bei 68°C Die entstandenen PCR-Produkte wurden in den TA-Cloning Vektor pCRII-TOPO der Fa InVitrogen kloniertIn the first PCR, 10 pmol of dNTP mix was added to a final volume of 50 μl of 5 μl of K562 Marathon-Ready cDNA and a PCR reaction was carried out in 1 × Kien Taq PCR reaction buffer and 1 × Advantage Kien Taq polymerase mix (Clontech). Reaction carried out. Each 10 pmol of the primers C5A and C5B were added. The PCR was carried out in 3 steps. A one-minute denaturation at 94 ° C was followed by 35 PCR cycles, in which the DNA was first denatured for 30 sec at 94 ° C and then for 4 min at 68 ° C., the primers were attached and the DNA chain was extended. Finally, the chain was extended for 10 min at 68 ° C. The resulting PCR products were cloned into the TA-cloning vector pCRII-TOPO from InVitrogen
In einer zweiten PCR wurden 5 μl K562 Marathon-Ready cDNA mit je 10 pmol der Primer C5A und C3B, 10 pmol dNTP-Mix und 2 U Taq-DNA-Polymerase (Fa Gibco-BRL) versetzt und in einem Endvolumen von 50 μl eine PCR-Reaktion in lx PCR-Puffer der FaIn a second PCR, 5 μl of K562 Marathon-Ready cDNA were each mixed with 10 pmol of the primers C5A and C3B, 10 pmol of dNTP mix and 2 U Taq DNA polymerase (Gibco-BRL) and one in a final volume of 50 μl PCR reaction in 1 x PCR buffer from
Perkin Eimer durchgeführt Die PCR-Reaktion erfolgte in 3 Schritten Zunächst wurde die DNA für 3 min bei 94°C denaturiert Es folgten 34 Zyklen, bei denen aufeinanderfolgend die DNA für 45 sec bei 94°C denaturiert wurde, anschließend für 1 min bei 68°C die Primeranlagerung erfolgte und danach für 3 min bei 72°C die DNA-Kette verlängert wurde Im letzten PCR-Schritt wurde für 10 min bei 72°C eine abschließende Kettenverlangerung durchgeführt Die entstandenen PCR-Produkte wurden in den TA-Cloning Vektor pCR2 1 der Fa InVitrogen kloniertPerkin Elmer carried out The PCR reaction took place in 3 steps. First the DNA was denatured for 3 min at 94 ° C. 34 cycles followed, in which the DNA was denatured successively for 45 sec at 94 ° C, then for 1 min at 68 ° C the primer was attached and then the DNA chain was extended for 3 min at 72 ° C. In the last PCR step, a final chain extension was carried out for 10 min at 72 ° C. The resulting PCR products were added to the TA cloning vector pCR2 1 cloned by InVitrogen
Für die dritte PCR wurde zunächst mit dem cDNA-Synthese-Kit der Fa Boehringer Mann- heim aus 2 μg DNasel-behandelter Poly A-RNA der humanen pramyeloischen ZellinieFor the third PCR, the cDNA synthesis kit from Boehringer Mannheim, made from 2 μg DNasel-treated poly A-RNA of the human pramyeloid cell line, was first used
HL60 eine cDNA-Synthese entsprechend den Angaben der Hersteller durchgeführt In einem Endvolumen von 50 μl wurde anschließend 1 μl dieser HL60-cDNA mit je 10 pmol der Primer GSPlvor und HTRT3A sowie 10 pmol dNTP-Mix gemischt und nach Zusatz von 1,25 μl DMSO in 1 x Kien Taq PCR-Reaktionspuffer und 1 x Advantage Kien Taq Polymerase Mix (Fa Clontech) eine PCR-Reaktion durchgeführt Die PCR-Reaktion verlief in 3 Schritten Nach einer Denaturierung für 3 min bei 94°C wurde über 37 Zyklen die DNA zunächst für 1 min bei 94°C denaturiert und anschließend für 4 min bei 68°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert Abschließend erfolgte noch eine Inkubation für 10 min bei 68°C Die PCR-Produkte wurden in den TA-Cloning Vektor pCR 2 1-TOPO kloniert Die vollständige Doppelstrangsequenzierung der aus PCR 1 und 2 Monierten hTC-cDNA- Fragmente sowie die partielle Sequenzierung der aus PCR 3 erhaltenen hTC-cDNA- Fragmente zeigte, daß zusatzlich zu der in Fig 1 dargestellten hTC-cDNA 4 Varianten dieser cDNA in humanen Zellen existierenHL60 a cDNA synthesis was carried out according to the manufacturer's instructions. In a final volume of 50 μl, 1 μl of this HL60 cDNA was then mixed with 10 pmol each of the primers GSPlvor and HTRT3A and 10 pmol of dNTP mix and after addition of 1.25 μl of DMSO A PCR reaction was carried out in 1 x Kien Taq PCR reaction buffer and 1 x Advantage Kien Taq Polymerase Mix (Clontech). The PCR reaction was carried out in 3 steps. After denaturation for 3 min at 94 ° C, the DNA was first used over 37 cycles denatured for 1 min at 94 ° C and then the primers attached for 4 min at 68 ° C and the DNA chain extended. Finally there was an incubation for 10 min at 68 ° C. The PCR products were in the TA cloning vector pCR 2 1-TOPO cloned The complete double-strand sequencing of the hTC cDNA fragments cloned from PCR 1 and 2 and the partial sequencing of the hTC cDNA fragments obtained from PCR 3 showed that, in addition to the hTC cDNA shown in FIG. 1, 4 variants of this cDNA exist in human cells
Variante 1 der humanen hTC-cDNA zeichnet sich durch eine 182 bp lange Deletion der Nukleotide 2345 bis 2526 aus Durch diese Deletion kommt es zu einer Verschiebung im ORF und es wird ein verkürztes hTC-Protein abgelesen, dem die RT-Motive 4 bis 7 fehlenVariant 1 of the human hTC cDNA is distinguished by a 182 bp deletion of nucleotides 2345 to 2526. This deletion results in a shift in the ORF and a shortened hTC protein is read, which lacks the RT motifs 4 to 7
Variante 2 der humanen hTC-cDNA weist eine 36 bp lange Deletion der Nukleotide 2184 bis 2219 auf Durch diese Deletion geht das RT-Motiv 3 verloren Der Leserahmen bleibt jedoch erhalten und es wird ein Protein hergestellt, dem selektiv das RT-Motiv 3 fehltVariant 2 of the human hTC cDNA has a 36 bp deletion of nucleotides 2184 to 2219. The RT motif 3 is lost as a result of this deletion. However, the reading frame is retained and a protein is produced which selectively lacks the RT motif 3
Variante 3 der humanen hTC-cDNA stellt eine Kombination der Varianten 1 und 2 dar Sie weist sowohl eine Deletion der bp 2184 bis 2219 als auch der bp 2345 bis 2526 aufVariant 3 of the human hTC cDNA represents a combination of variants 1 and 2. It has both a deletion of bp 2184 to 2219 and bp 2345 to 2526
Variante 4 der humanen hTC-cDNA zeichnet sich durch den Verlust des Nukleotidbereichs von bp 3219 bis 3842 aus Diese fehlende Sequenz ist durch eine nicht zu hTC homologe Sequenz ersetzt Ab bp 3843 ist die Sequenz wieder völlig identisch zu der in Fig 1 darge- stellten hTC-Sequenz Die Sequenz der Variante 4 ist in Fig 14 dargestellt Entsprechend des gewählten 5'-Primers beginnt sie mit bp 1783 der in Fig 1 dargestellten hTC-cDNA Der nicht-homologe Bereich ist fett hervorgehoben und stimmt von Position 3219 bis Position 3451 (Fig 14 und SEQ ID No 7) auf DNA Ebene zu 98,7% mit einem EST (Accession Nr AA299878) aus einem humanen Uterustumor ubereinVariant 4 of the human hTC cDNA is characterized by the loss of the nucleotide region from bp 3219 to 3842. This missing sequence is replaced by a sequence which is not homologous to hTC. From bp 3843, the sequence is again completely identical to the hTC shown in FIG Sequence The sequence of variant 4 is shown in FIG. 14. According to the selected 5 'primer, it begins with bp 1783 of the hTC cDNA shown in FIG 14 and SEQ ID No 7) at DNA level 98.7% with an EST (Accession No. AA299878) from a human uterine tumor
Beispiel 12Example 12
Zur Gewinnung von Antiseren mit Spezifitat für die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase wurde die vorhandene Nukleotidsequenz (Fig 1) in eine Aminosauresequenz übersetzt (Fig 2) Mit Hilfe eines Programms zur Sekundarstrukturvorhersage (PROTEAN, aus dem Softwarepaket DNAStar, DNASTAR Ine , Madison, WI, USA) wurden zwei Peptide ausgewählt, die mit gewisser Wahrscheinlichkeit eine Immunantwort hervorrufen Es handelt sich um folgende Peptide, die im Einbuchstabencode für Aminosäuren dargestellt sind:In order to obtain antisera with specificity for the catalytic subunit of human telomerase, the existing nucleotide sequence (FIG. 1) was translated into an amino acid sequence (FIG. 2) with the aid of a program for secondary structure prediction (PROTEAN, from the software package DNAStar, DNASTAR Ine, Madison, WI, USA), two peptides were selected that are likely to elicit an immune response The following peptides are shown in the one-letter code for amino acids:
B: C-K-R-V-Q-L-R-E-L-S-E-A-E-V-R-Q - CONH2 / Pos. 594 - 608 C: C-Q-E-T-S-P-L-R-D-A-V-V-I-E-Q-S-S-S-L-N-E - CONH2 / Pos. 781-800B: CKRVQLRELSEAEVRQ - CONH 2 / Item 594 - 608 C: CQETSPLRDAVVIEQSSSLNE - CONH 2 / Item 781-800
Die unterstrichenen Cysteine stammen nicht aus der Telomerasesequenz, sondern wurden als Linker für die Kopplung zusätzlich angefügtThe underlined cysteines do not come from the telomerase sequence, but have been added as linkers for the coupling
Die Peptide wurden über das Thiol-reaktive Kopplungsreagenz m-Maleimido-benzoyl-N-The peptides were isolated via the thiol-reactive coupling reagent m-maleimido-benzoyl-N-
Hydroxysuccinimidester (MBS) an Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) gekoppelt. Damit wurden je zwei Kaninchen im Abstand von 2 bis 4 Wochen immunisiert. Vor der Immunisierung wurden 5 ml Blut zur Gewinnung von Preimmunseren entnommen. Nach 4 Immunisierungen wurden ebenfalls 5 ml Blut zur Gewinnung von Immunseren entnommen. Diese Seren wurden in einem Western-Blot Experiment (Ausubel et al, 1987) aufHydroxysuccinimide ester (MBS) coupled to keyhole limpet hemocyanin (KLH). Two rabbits were immunized at intervals of 2 to 4 weeks. Before the immunization, 5 ml of blood were taken to obtain preimmune sera. After 4 immunizations, 5 ml of blood were also taken to obtain immune sera. These sera were found in a Western blot experiment (Ausubel et al, 1987)
Reaktivität mit Fusionsproteinen (Beispiel 13) getestet.Reactivity with fusion proteins (Example 13) tested.
Beispiel 13Example 13
Um das Protein der katalytischen Telomerase-Untereinheit analysieren zu können, wurden bakterielle Expressionversuche durchgeführt.In order to be able to analyze the protein of the catalytic telomerase subunit, bacterial expression experiments were carried out.
Die Konstrukte für diese Experimente sind im Folgenden beschrieben:The constructs for these experiments are described below:
Für das Expressionskonstrukt pMalEST wurde das Insert des in Beispiel 2 erwähnten KlonsThe insert of the clone mentioned in Example 2 was used for the expression construct pMalEST
AA281296 mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Not I herausgeschnitten, die Schnittstellen mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt (Ausubel et al, 1987) und in den vorgegebenen Leserahmen des Maltose bindenden Proteins des bakteriellen Expressionvektors pMAL-C2 (Fa. New England Biolabs) kloniert. Der Vektor pMAL-C2 wurde mit dem Restriktionsenzym Pst I verdaut und die überstehenden Einzelstrangenden mit der T4 DNA Polymerase entfernt (Ausubel et al, 1987). Das Expressionskonstrukt pMalAl beinhaltet die Nukleotidsequenz der Fig. 1 von Position 1789 bis Position 3908. Dieses DNA-Fragment wurde über PCR mit den Primern C5A (5'- ACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTG-3') und C3B (5'-AA281296 with the restriction enzymes Eco RI and Not I cut out, the interfaces filled in with the Klenow fragment (Ausubel et al, 1987) and cloned into the reading frame of the maltose-binding protein of the bacterial expression vector pMAL-C2 (New England Biolabs). The vector pMAL-C2 was digested with the restriction enzyme Pst I and the protruding single strand ends were removed with the T4 DNA polymerase (Ausubel et al, 1987). The expression construct pMalAl contains the nucleotide sequence of FIG. 1 from position 1789 to position 3908. This DNA fragment was PCR-primed with the primers C5A (5'- ACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTG-3 ') and C3B (5'-
GCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-3 ') aus einer kommerziell erhältlichen K562 Marathon-Ready cDNA Library (Fa. Clontech, Katalognummer 7441-1) amplifiziert und inGCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-3 ') from a commercially available K562 Marathon-Ready cDNA Library (Clontech, catalog number 7441-1) and amplified in
TA-Cloning Vektor pCRII-TOPO der Fa. Invitrogen kloniert. Die PCR-Bedingungen wurden wie im Beispiel 7 beschrieben durchgeführt. Für das Expressionskonstrukt pMalAl wurde das Insert mit dem Restriktionsenzym Eco RI herausgeschnitten, die Schnittstellen mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt (Ausubel et al, 1987) und in den mit dem Restriktionsenzym Xmn I geschnittenen bakteriellen Expressionvektors pMAL-C2 (Fa.TA cloning vector pCRII-TOPO from Invitrogen. The PCR conditions were carried out as described in Example 7. For the expression construct pMalAl, the insert was cut out with the restriction enzyme Eco RI, the cut-outs filled in with the Klenow fragment (Ausubel et al, 1987) and in the bacterial expression vector pMAL-C2 (Fa.
New England Biolabs) kloniert.New England Biolabs) cloned.
Die Proteinexpression unter Verwendung dieser Konstrukte erfolgte in dem Bakterienstamm E. coli DH5α. Die Expressionsbedingungen erfolgten wie in der Betriebsanleitung der Fa. New England Biolabs (Katalognummer 800) beschrieben. Die hergestellten bakteriellen Lysate wurden in einem Western-Blot Experiment (Ausubel et al, 1987) getestet.The protein expression using these constructs was carried out in the bacterial strain E. coli DH5α. The expression conditions were as described in the operating instructions from New England Biolabs (catalog number 800). The bacterial lysates produced were tested in a Western blot experiment (Ausubel et al, 1987).
Beispiel 14Example 14
Die bakteriellen Lysate aus Beispiel 13 wurden unter Zuhilfenahme der Antiseren aus Beispiel 12 in einem Western Blot (Ausubel et al, 1987) analysiert.The bacterial lysates from Example 13 were analyzed with the aid of the antisera from Example 12 in a Western blot (Ausubel et al, 1987).
Da der Fusionsanteil für das Maltose bindende Protein etwa 43 kDa groß ist, werden für die Konstrukte pMalEST und pMalAl Fusionsproteine in der Größe von etwa 74 kDa bzw 106 kDa erwartet.Since the fusion fraction for the maltose-binding protein is approximately 43 kDa, fusion proteins in the size of approximately 74 kDa and 106 kDa are expected for the constructs pMalEST and pMalAl, respectively.
Im Vergleich der Pre-Immunseren mit den Seren nach der ersten Immunisierung wird ersichtlich, daß spezifische Antikörper gegen die Epitope B und C gebildet wurden (Fig. 16). Darüber hinaus wurden neben den erwarteten 74 kDa, bzw. 106 kDa-Proteinen auch kleinere Proteinfragmente beobachtet, die mit den Antiseren reagieren. Diese kleinerenIn comparison of the pre-immune sera with the sera after the first immunization, it can be seen that specific antibodies against epitopes B and C were formed (FIG. 16). In addition to the expected 74 kDa and 106 kDa proteins, smaller protein fragments were also observed that react with the antisera. These smaller ones
Produkte gehen wahrscheinlich auf vorzeitige zurück. Auf dem Fusionsprotein aus der Expression mit pMal EST befindet sich nur das Epitop für Serum B Im Gegensatz dazu befinden sich auf dem Fusionsprotein von pMalAl die Epitope der Seren B und C Aus diesem Grunde erkennt das Antiserum C nicht das Expressionsprodukt von pMalEST und lediglich die größeren Proteinfragmente aus den Expressionversuchen mit pMalAl. Diese Beobachtung unterstreicht die hohe Spezifitat der generierten AntiserenProducts are probably due to premature. Only the epitope for serum B is located on the fusion protein from expression with pMal EST. In contrast, the epitopes of sera B and C are located on the fusion protein of pMalAl. For this reason, antiserum C does not recognize the expression product of pMalEST and only the larger ones Protein fragments from the expression experiments with pMalAl. This observation underlines the high specificity of the generated antisera
Beispiel 15Example 15
Um das Protein der katalytischen Telomerase-Untereinheit analysieren zu können, sollen dieIn order to be able to analyze the protein of the catalytic telomerase subunit, the
Proteinkomponente zusammen mit der RNA-Komponente in vitro rekonstituiert werdenProtein component can be reconstituted together with the RNA component in vitro
Die Konstrukte für diese Experimente sind im folgenden beschriebenThe constructs for these experiments are described below
Die 504 nt lange RNA Komponente (Feng et al, 1995) wurde mit den Primern HTR9BAMThe 504 nt long RNA component (Feng et al, 1995) was primed with HTR9BAM
(5 '-CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTG-3 ') und HTR2BAM (5'-CGCGGATCCCGGCGAGGGGTGACGGATGC-3) aus einer 293 Zell-cDNA-Bibliothek amplifiziert Der Primer HTR9BAM beinhaltet von Nukleotid 10 bis 29 einen T7 Promotor In der PCR wurden in einem Endvolumen von 100 μl 3 μl cDNA aus 293-Zellen mit 10 pmol dNTP-Mix versetzt und in 1 x PCR-Reaktionspuffer mit 0,5 μl(5 '-CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTG-3') and HTR2BAM (5'-CGCGGATCCCGGCGAGGGGTGACGGATGC-3) from a 293 cell cDNA library containing a PCR of 293 cell cDNA in one of the nucleotides HTRotid 100 AMP 3 μl cDNA from 293 cells were mixed with 10 pmol dNTP mix and in 1 x PCR reaction buffer with 0.5 μl
Taq-Polymerase (Fa Gibco) eine PCR-Reaktion durchgeführt Je 10 pmol der Primer HTR9BAM und HTR2BAM wurden zugefügt. Die PCR wurde in 3 Schritten durchgeführt. An eine zehnminutige Denaturierung bei 94°C schlössen sich 35 PCR-Zyklen an, in denen die DNA zunächst für eine Minute bei 94°C denaturiert wurde und anschließend für 2 min bei 62°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert wurde Zum Abschluß folgte für 4 min eine Kettenverlangerung bei 72°C. Die entstandenen PCR-Produkte wurden nach einem Restriktionsverdau mit Bam HI in die Bam HI-Schnittstelle des Vektor pUC19 kloniert, so daß die RNA Komponente unter Kontrolle des T7-Promotors steht Dieses Konstrukt wird im folgenden als HTR504 bezeichnetTaq polymerase (Gibco) carried out a PCR reaction. 10 pmol each of the primers HTR9BAM and HTR2BAM were added. The PCR was carried out in 3 steps. A ten-minute denaturation at 94 ° C was followed by 35 PCR cycles, in which the DNA was first denatured for one minute at 94 ° C and then the primers were attached for 2 min at 62 ° C and the DNA chain was extended This was followed by a chain extension at 72 ° C for 4 min. The resulting PCR products were cloned into the Bam HI site of the vector pUC19 after restriction digestion with Bam HI, so that the RNA component is under the control of the T7 promoter. This construct is referred to below as HTR504
Das 341 1 bp lange cDNA Fragment (Position 60 bis Position 3470, Fig 1) wurde in den Vektor PCRII TOPO (Fa. Invitrogen) kloniert Detailliertere Angaben zur Klonierung sind in Beispiel 8 und 7, bzw. in Fig. 12 beschrieben. In diesem als HTC FL bezeichneten Konstrukt liegt der T7 Promotor 5' vor der hTC cDNA.The 341 1 bp long cDNA fragment (position 60 to position 3470, FIG. 1) was cloned into the vector PCRII TOPO (Invitrogen). Detailed information on the cloning is provided described in Examples 8 and 7, and in Fig. 12, respectively. In this construct, referred to as HTC FL, the T7 promoter lies 5 'in front of the hTC cDNA.
Die Synthese der katalytischen Telomerase-Proteinkomponente erfolgte nach Zugabe des hTC FL-Konstruktes in einem kommerziell erhältlichen Transkriptions/Translation-System nach Angaben des Herstellers (Fa. Promega; Katalognummer L4610). Die erfolgreiche in vitro Translation des erwarteten 127 kDa Produktes wurde mittels 35S-markiertem Cystein in einer SDS-PAGE (Ausubel et al, 1987) kontrolliert (Fig. 17).The catalytic telomerase protein component was synthesized after addition of the hTC FL construct in a commercially available transcription / translation system according to the manufacturer's instructions (Promega; catalog number L4610). The successful in vitro translation of the expected 127 kDa product was checked using 35 S-labeled cysteine in an SDS-PAGE (Ausubel et al, 1987) (FIG. 17).
Die Synthese der Telomerase-RNA-Komponente erfolgte mit einem Transkriptions-System nach Angaben des Herstellers (Fa. Ambion; Katalognummer 1344) oder nach der von Pokrovskaya und Gurevich (1994) beschriebenen Methode.The synthesis of the telomerase RNA component was carried out with a transcription system according to the manufacturer (Ambion; catalog number 1344) or according to the method described by Pokrovskaya and Gurevich (1994).
Für die in vitro Rekonstitution wurden 50 μl des oben beschriebenen Translations- Ansatzes mit dem hTC FL-Konstrukt mit 0,5 μg hTRNA versetzt und 10 min bei 37°C inkubiert. 2 μl dieser Mischung wurden auf ihre enzymatische Aktivität mit Hilfe des TRAP-Assays untersucht (N.W. Kim et al, 1994). Als Positivkontrolle diente eine Aktivitätsmessung nach gleicher Methode von aus HeLa-Zellen gereinigter Telomerase (Shay et al, 1994). Wie in Fig. 18 zu sehen, erzeugen sowohl das rekonstituierte Enzym als auch das native Enzym das gleiche Produktmuster, die für die Telomerase charakteristische Nukleotidleiter. Mit diesemFor the in vitro reconstitution, 50 μl of the translation approach described above were mixed with the hTC FL construct with 0.5 μg hTRNA and incubated at 37 ° C. for 10 min. 2 μl of this mixture were examined for their enzymatic activity using the TRAP assay (N.W. Kim et al, 1994). An activity measurement of telomerase purified from HeLa cells was used as a positive control (Shay et al, 1994). As can be seen in Figure 18, both the reconstituted enzyme and the native enzyme produce the same product pattern, the nucleotide ladder characteristic of telomerase. With this
Ergebnis wurde darüberhinaus belegt, daß eine einzige Proteinkomponente zusammen mit der RNA für die enzymatische Telomeraseaktivitat ausreichend ist.The result was also demonstrated that a single protein component together with the RNA is sufficient for the enzymatic telomerase activity.
Zusätzlich zu dem beschriebenen TRAP-Assay wurden 5 μl der Rekonstitutionsmischung im direkten Telomerase- Assay (Shay et al, 1994) auf ihre Aktivität geprüft. Auch in diesemIn addition to the described TRAP assay, 5 μl of the reconstitution mixture were tested for their activity in the direct telomerase assay (Shay et al, 1994). Also in this
Experiment belegt die charakteristische Nukleotidleiter die erfolgreiche Rekonstitution von rekombinantem hTC Protein und Telomerase-RNA-Komponente.Experiment shows the characteristic nucleotide ladder the successful reconstitution of recombinant hTC protein and telomerase RNA component.
Zusammenfassend konnte hiermit auf fünktioneller Ebene gezeigt werden, daß die identifizierte und vollständig klonierte hTC cDNA die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase darstellt. LiteraturvereichnisIn summary, it could be shown on a functional level that the identified and fully cloned hTC cDNA represents the catalytic subunit of human telomerase. Bibliography
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SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LOG
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:(1. GENERAL INFORMATION:
(i) ANMELDER:(i) APPLICANT:
(A) NAME: Bayer AG(A) NAME: Bayer AG
(B) STRASSE: Bayerwerk(B) ROAD: Bayerwerk
(C) ORT: Leverkusen(C) LOCATION: Leverkusen
(E) LAND: Deutschland(E) COUNTRY: Germany
(F) POSTLEITZAHL: D-51368(F) POSTCODE: D-51368
(G) TELEFON: 0214-303688 (H) TELEFAX: 0214-303482(G) TELEPHONE: 0214-303688 (H) TELEFAX: 0214-303482
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Humane katalytische Telomerase- Untereinheit und deren diagnostische und therapeutische Verwendung(ii) DESCRIPTION OF THE INVENTION: Human Telomerase Catalytic Subunit and Its Diagnostic and Therapeutic Use
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 7
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:(iv) COMPUTER READABLE VERSION:
(A) DATENTRDGER: Floppy disk(A) DATA TRDGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30B (EPA)(D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Version # 1.30B (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LUNGE: 4042 Basenpaare(A) LUNG: 4042 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKsLS: cDNA(ii) TYPE OF MOLEKsLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: NEIN(iv) ANTISENSE: NO
(vi) URSPRsNLICHE HERKUNFT:(vi) ORIGINAL ORIGIN:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: Human(C) INDIVIDUUM / ISOLAT: Human
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:
GTTTCAGGCA GCGCTGCGTC CTGCTGCGCA CGTGGGAAGC CCTGGCCCCG GCCACCCCCG 60GTTTCAGGCA GCGCTGCGTC CTGCTGCGCA CGTGGGAAGC CCTGGCCCCG GCCACCCCCG 60
CGATGCCGCG CGCTCCCCGC TGCCGAGCCG TGCGCTCCCT GCTGCGCAGC CACTACCGCG 120CGATGCCGCG CGCTCCCCGC TGCCGAGCCG TGCGCTCCCT GCTGCGCAGC CACTACCGCG 120
AGGTGCTGCC GCTGGCCACG TTCGTGCGGC GCCTGGGGCC CCAGGGCTGG CGGCTGGTGC 180AGGTGCTGCC GCTGGCCACG TTCGTGCGGC GCCTGGGGCC CCAGGGCTGG CGGCTGGTGC 180
AGCGCGGGGA CCCGGCGGCT TTCCGCGCGC TGGTGGCCCA GTGCCTGGTG TGCGTGCCCT 240AGCGCGGGGA CCCGGCGGCT TTCCGCGCGC TGGTGGCCCA GTGCCTGGTG TGCGTGCCCT 240
GGGACGCACG GCCGCCCCCC GCCGCCCCCT CCTTCCGCCA GGTGTCCTGC CTGAAGGAGC 300GGGACGCACG GCCGCCCCCC GCCGCCCCCT CCTTCCGCCA GGTGTCCTGC CTGAAGGAGC 300
TGGTGGCCCG AGTGCTGCAG AGGCTGTGCG AGCGCGGCGC GAAGAACGTG CTGGCCTTCG 360TGGTGGCCCG AGTGCTGCAG AGGCTGTGCG AGCGCGGCGC GAAGAACGTG CTGGCCTTCG 360
GCTTCGCGCT GCTGGACGGG GCCCGCGGGG GCCCCCCCGA GGCCTTCACC ACCAGCGTGC 420 GCAGCTACCT GCCCAACACG GTGACCGACG CACTGCGGGG GAGCGGGGCG TGGGGGCTGC 480 TGCTGCGCCG CGTGGGCGAC GACGTGCTGG TTCACCTGCT GGCACGCTGC GCGCTCTTTG 540 TGCTGGTGGC TCCCAGCTGC GCCTACCAGG TGTGCGGGCC GCCGCTGTAC CAGCTCGGCG 600 CTGCCACTCA GGCCCGGCCC CCGCCACACG CTAGTGGACC CCGAAGGCGT CTGGGATGCG 660 AACGGGCCTG GAACCATAGC GTCAGGGAGG CCGGGGTCCC CCTGGGCCTG CCAGCCCCGG 720 GTGCGAGGAG GCGCGGGGGC AGTGCCAGCC GAAGTCTGCC GTTGCCCAAG AGGCCCAGGC 780 GTGGCGCTGC CCCTGAGCCG GAGCGGACGC CCGTTGGGCA GGGGTCCTGG GCCCACCCGG 840 GCAGGACGCG TGGACCGAGT GACCGTGGTT TCTGTGTGGT GTCACCTGCC AGACCCGCCG 900 AAGAAGCCAC CTCTTTGGAG GGTGCGCTCT CTGGCACGCG CCACTCCCAC CCATCCGTGG 960GCTTCGCGCT GCTGGACGGG GCCCGCGGGG GCCCCCCCGA GGCCTTCACC ACCAGCGTGC 420 GCAGCTACCT GCCCAACACG GTGACCGACG CACTGCGGGG GAGCGGGGCG TGGGGGCTGC 480 TGCTGCGCCG CGTGGGCGAC GACGTGCTGG TTCACCTGCT GGCACGCTGC GCGCTCTTTG 540 TGCTGGTGGC TCCCAGCTGC GCCTACCAGG TGTGCGGGCC GCCGCTGTAC CAGCTCGGCG 600 CTGCCACTCA GGCCCGGCCC CCGCCACACG CTAGTGGACC CCGAAGGCGT CTGGGATGCG 660 AACGGGCCTG GAACCATAGC GTCAGGGAGG CCGGGGTCCC CCTGGGCCTG CCAGCCCCGG 720 GTGCGAGGAG GCGCGGGGGC AGTGCCAGCC GAAGTCTGCC GTTGCCCAAG AGGCCCAGGC 780 GTGGCGCTGC CCCTGAGCCG GAGCGGACGC CCGTTGGGCA GGGGTCCTGG GCCCACCCGG 840 GCAGGACGCG TGGACCGAGT GACCGTGGTT TCTGTGTGGT GTCACCTGCC AGACCCGCCG 900 AAGAAGCCAC CTCTTTGGAG GGTGCGCTCT CTGGCACGCG CCACTCCCAC CCATCCGTGG 960
GCCGCCAGCA CCACGCGGGC CCCCCATCCA CATCGCGGCC ACCACGTCCC TGGGACACGC 1020GCCGCCAGCA CCACGCGGGC CCCCCATCCA CATCGCGGCC ACCACGTCCC TGGGACACGC 1020
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AGCTGCGGCC CTCCTTCCTA CTCAGCTCTC TGAGGCCCAG CCTGACTGGC GCTCGGAGGC 1140AGCTGCGGCC CTCCTTCCTA CTCAGCTCTC TGAGGCCCAG CCTGACTGGC GCTCGGAGGC 1140
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GCGCCGCCGG CCCTCTGCCC TCCGAGGCCG TGCAGTGGCT GTGCCACCAA GCATTCCTGC 3300GCGCCGCCGG CCCTCTGCCC TCCGAGGCCG TGCAGTGGCT GTGCCACCAA GCATTCCTGC 3300
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Ala Leu Val Ala Gin Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60Ala Leu Val Ala Gin Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60
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Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160
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Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gin Gly Ser Trp 245 250 255Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gin Gly Ser Trp 245 250 255
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Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gin His His 290 295 300Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gin His His 290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320
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Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gin 370 375 380Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gin 370 375 380
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Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480
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Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560
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Leu Lys Arg Val Gin Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gin 595 600 605Leu Lys Arg Val Gin Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gin 595 600 605
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Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gin Cys Gin Gly Ile Pro 820 825 830Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gin Cys Gin Gly Ile Pro 820 825 830
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Ser Leu Gin Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gin 995 1000 1005Ser Leu Gin Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gin 995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gin Leu Pro Phe His Gin Gin 1010 1015 1020Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gin Leu Pro Phe His Gin Gin 1010 1015 1020
Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040
Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055
Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gin Trp 1060 1065 1070Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gin Trp 1060 1065 1070
Leu Cys His Gin Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085Leu Cys His Gin Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085
Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gin Thr Gin Leu Ser 1090 1095 1100Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gin Thr Gin Leu Ser 1090 1095 1100
Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120
Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130
[2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:[2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 3:
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TGCTGTTTTC CCTGCTGACT TAGTTCTATC TCAGGCATCT TGACACCCCC ACAAGCTAAG 660TGCTGTTTTC CCTGCTGACT TAGTTCTATC TCAGGCATCT TGACACCCCC ACAAGCTAAG 660
CATTATTAAT ATTGTTTTCC GTGTTGAGTG TTTCTTTAGC TTTGCCCCCG CCCTGCTTTT 720CATTATTAAT ATTGTTTTCC GTGTTGAGTG TTTCTTTAGC TTTGCCCCCG CCCTGCTTTT 720
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GAGACTCACG AGGAGGGCGG TCATCTTGGC CCGTGAGTGT CTGGAGCACC ACGTGGCCAG 960GAGACTCACG AGGAGGGCGG TCATCTTGGC CCGTGAGTGT CTGGAGCACC ACGTGGCCAG 960
CGTTCCTTAG CCAGGGTTGG CTGTGTTCCG GCCGCAGAGC ACCGTCTGCG TGAGGAGATC 1020CGTTCCTTAG CCAGGGTTGG CTGTGTTCCG GCCGCAGAGC ACCGTCTGCG TGAGGAGATC 1020
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CAGAGCCCTG GTCCTCCTGT CTCCATCGTC ACGTGGGCAC ACGTGGCTTT TCGCTCAGGA 60CAGAGCCCTG GTCCTCCTGT CTCCATCGTC ACGTGGGCAC ACGTGGCTTT TCGCTCAGGA 60
CGTCGAGTGG ACACGGTGAT CTCTGCCTCT GCTCTCCCTC CTGTCCAGTT TGCATAAACT 120CGTCGAGTGG ACACGGTGAT CTCTGCCTCT GCTCTCCCTC CTGTCCAGTT TGCATAAACT 120
TACGAGGTTC ACCTTCACGT TTTGATGGAC ACGCGGTTTC CAGGCACCGA GGCCAGAGCA 180TACGAGGTTC ACCTTCACGT TTTGATGGAC ACGCGGTTTC CAGGCACCGA GGCCAGAGCA 180
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GTGCGTTTCC TGCCGAGTGT GTGTTGATCC TCTCGTTGCC TCCTGGTCAC TG 412 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:GTGCGTTTCC TGCCGAGTGT GTGTTGATCC TCTCGTTGCC TCCTGGTCAC TG 412 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 5:
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GGGGTCCTGG GCCCACCCGG GCAGGACGCG TGGACCGAGT GACCGTGGTT TCTGTGTGGT 60GGGGTCCTGG GCCCACCCGG GCAGGACGCG TGGACCGAGT GACCGTGGTT TCTGTGTGGT 60
GTCACCTGCC AGACCCGCCG AAGAAGCCAC CTCTTTGGAG GGTGCGCTCT CTGGCACGCG 120GTCACCTGCC AGACCCGCCG AAGAAGCCAC CTCTTTGGAG GGTGCGCTCT CTGGCACGCG 120
CCACTCCCAC CCATCCGTGG GCCGCCAGCA CCACGCGGGC CCCCCATCCA CATCGCGGCC 180CCACTCCCAC CCATCCGTGG GCCGCCAGCA CCACGCGGGC CCCCCATCCA CATCGCGGCC 180
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ACGGTGATCT CTGCCTCTGC TCTCCCTCCT GTCCAGTTTG CATAAACTTA CG 1012 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:ACGGTGATCT CTGCCTCTGC TCTCCCTCCT GTCCAGTTTG CATAAACTTA CG 1012 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 6:
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GAATTCGCGG CCGCGTCGAC GTTTCAGGCA GCGCTGCGTC CTGCTGCGCA CGTGGGAAGC 60GAATTCGCGG CCGCGTCGAC GTTTCAGGCA GCGCTGCGTC CTGCTGCGCA CGTGGGAAGC 60
CCTGGCCCCG GCCACCCCCG CGATGCCGCG CGCTCCCCGC TGCCGAGCCG TGCGCTCCCT 120CCTGGCCCCG GCCACCCCCG CGATGCCGCG CGCTCCCCGC TGCCGAGCCG TGCGCTCCCT 120
GCTGCGCAGC CACTACCGCG AGGTGCTGCC GCTGGCCACG TTCGTGCGGC GCCTGGGGCC 180GCTGCGCAGC CACTACCGCG AGGTGCTGCC GCTGGCCACG TTCGTGCGGC GCCTGGGGCC 180
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GGCCTTCACC ACCAGCGTGC GCAGCTACCT GCCCAACACG GTGACCGACG CACTGCGGGG 480GGCCTTCACC ACCAGCGTGC GCAGCTACCT GCCCAACACG GTGACCGACG CACTGCGGGG 480
GAGCGGGGCG TGGGGGCTGC TGCTGCGCCG CGTGGGCGAC GACGTGCTGG TTCACCTGCT 540GAGCGGGGCG TGGGGGCTGC TGCTGCGCCG CGTGGGCGAC GACGTGCTGG TTCACCTGCT 540
GGCACGCTGC GCGCTCTTTG TGCTGGTGGC TCCCAGCTGC GCCTACCAGG TGTGCGGGCC 600GGCACGCTGC GCGCTCTTTG TGCTGGTGGC TCCCAGCTGC GCCTACCAGG TGTGCGGGCC 600
GCCGCTGTAC CAGCTCGGCG CTGCCACTCA GGCCCGGCCC CCGCCACACG CTAGTGGACC 660GCCGCTGTAC CAGCTCGGCG CTGCCACTCA GGCCCGGCCC CCGCCACACG CTAGTGGACC 660
CCGAAGGCGT CTGGGATGCG AACGGGCCTG GAACCATAGC GTCAGGGAGG CCGGGGTCCC 720 CCTGGGCCTG CCAGCCCCGG GTGCGAGGAG GCGCGGGGGC AGTGCCAGCC GAAGTCTGCC 780CCGAAGGCGT CTGGGATGCG AACGGGCCTG GAACCATAGC GTCAGGGAGG CCGGGGTCCC 720 CCTGGGCCTG CCAGCCCCGG GTGCGAGGAG GCGCGGGGGC AGTGCCAGCC GAAGTCTGCC 780
GTTGCCCAAG AGGCCCAGGC GTGGCGCTGC CCCTGAGCCG GAGCGGACGC CCGTTGGGCA 840GTTGCCCAAG AGGCCCAGGC GTGGCGCTGC CCCTGAGCCG GAGCGGACGC CCGTTGGGCA 840
GGGGTCCTGG GCCCACCCGG GCAGGACGCG TGGACCGAGT GACCGTGGTT TCTGTGTGGT 900GGGGTCCTGG GCCCACCCGG GCAGGACGCG TGGACCGAGT GACCGTGGTT TCTGTGTGGT 900
GTCACCTGCC AGACCCGCCG AAGAAGCCAC CTCTTTGGAG GGTGCGCTCT CTGGCACGCG 960GTCACCTGCC AGACCCGCCG AAGAAGCCAC CTCTTTGGAG GGTGCGCTCT CTGGCACGCG 960
CCACTCCCAC CCATCCGTGG GCCGCCAGCA CCACGCGGGC CCCCCATCCA CATCGCGGCC 1020CCACTCCCAC CCATCCGTGG GCCGCCAGCA CCACGCGGGC CCCCCATCCA CATCGCGGCC 1020
ACCACGTCCC TGGGACACGC CTTGTCCCCC GGTGTACGCC GAGACCAAGC ACTTCCTCTA 1080ACCACGTCCC TGGGACACGC CTTGTCCCCC GGTGTACGCC GAGACCAAGC ACTTCCTCTA 1080
CTCCTCAGGC GACAAGGAGC AGCTGCGGCC CTCCTTCCTA CTCAGCTCTC TGAGGCCCAG 1140CTCCTCAGGC GACAAGGAGC AGCTGCGGCC CTCCTTCCTA CTCAGCTCTC TGAGGCCCAG 1140
CCTGACTGGC GCTCGGAGGC TCGTGGAGAC CATCTTTCTG GGTTCCAGGC CCTGGATGCC 1200CCTGACTGGC GCTCGGAGGC TCGTGGAGAC CATCTTTCTG GGTTCCAGGC CCTGGATGCC 1200
AGGGACTCCC CGCAGGTTGC CCCGCCTGCC CCAGCGCTAC TGGCAAATGC GGCCCCTGTT 1260AGGGACTCCC CGCAGGTTGC CCCGCCTGCC CCAGCGCTAC TGGCAAATGC GGCCCCTGTT 1260
TCTGGAGCTG CTTGGGAACC ACGCGCAGTG CCCCTACGGG GTGCTCCTCA AGACGCACTG 1320TCTGGAGCTG CTTGGGAACC ACGCGCAGTG CCCCTACGGG GTGCTCCTCA AGACGCACTG 1320
CCCGCTGCGA GCTGCGGTCA CCCCAGCAGC CGGTGTCTGT GCCCGGGAGA AGCCCCAGGG 1380CCCGCTGCGA GCTGCGGTCA CCCCAGCAGC CGGTGTCTGT GCCCGGGAGA AGCCCCAGGG 1380
CTCTGTGGCG GCCCCCGAGG AGGAGGACAC AGACCCCCGT CGCCTGGTGC AGCTGCTCCG 1440CTCTGTGGCG GCCCCCGAGG AGGAGGACAC AGACCCCCGT CGCCTGGTGC AGCTGCTCCG 1440
CCAGCACAGC AGCCCCTGGC AGGTGTACGG CTTCGTGCGG GCCTGCCTGC GCCGGCTGGT 1500CCAGCACAGC AGCCCCTGGC AGGTGTACGG CTTCGTGCGG GCCTGCCTGC GCCGGCTGGT 1500
GCCCCCAGGC CTCTGGGGCT CCAGGCACAA CGAACGCCGC TTCCTCAGGA ACACCAAGAA 1560GCCCCCAGGC CTCTGGGGCT CCAGGCACAA CGAACGCCGC TTCCTCAGGA ACACCAAGAA 1560
GTTCATCTCC CTGGGGAAGC ATGCCAAGCT CTCGCTGCAG GAGCTGACGT GGAAGATGAG 1620GTTCATCTCC CTGGGGAAGC ATGCCAAGCT CTCGCTGCAG GAGCTGACGT GGAAGATGAG 1620
CGTGCGGGAC TGCGCTTGGC TGCGCAGGAG CCCAGGTGAG GAGGTGGTGG CCGTCGAGGG 1680CGTGCGGGAC TGCGCTTGGC TGCGCAGGAG CCCAGGTGAG GAGGTGGTGG CCGTCGAGGG 1680
CCCAGGCCCC AGAGCTGAAT GCAGTAGGGG CTCAGAAAAG GGGGCAGGCA GAGCCCTGGT 1740CCCAGGCCCC AGAGCTGAAT GCAGTAGGGG CTCAGAAAAG GGGGCAGGCA GAGCCCTGGT 1740
CCTCCTGTCT CCATCGTCAC GTGGGCACAC GTGGCTTTTC GCTCAGGACG TCGAGTGGAC 1800CCTCCTGTCT CCATCGTCAC GTGGGCACAC GTGGCTTTTC GCTCAGGACG TCGAGTGGAC 1800
ACGGTGATCT CTGCCTCTGC TCTCCCTCCT GTCCAGTTTG CATAAACTTA CGAGGTTCAC 1860ACGGTGATCT CTGCCTCTGC TCTCCCTCCT GTCCAGTTTG CATAAACTTA CGAGGTTCAC 1860
CTTCACGTTT TGATGGACAC GCGGTTTCCA GGCGCCGAGG CCAGAGCAGT GAACAGAGGA 1920CTTCACGTTT TGATGGACAC GCGGTTTCCA GGCGCCGAGG CCAGAGCAGT GAACAGAGGA 1920
GGCTGGGCGC GGCAGTGGAG CCGGGTTGCC GGCAATGGGG AGAAGTGTCT GGAAGCACAG 1980GGCTGGGCGC GGCAGTGGAG CCGGGTTGCC GGCAATGGGG AGAAGTGTCT GGAAGCACAG 1980
ACGCTCTGGC GAGGGTGCCT GCAGGGGTTG GCTGTGTTCC GGCCGCAGAG CACCGTCTGC 2040ACGCTCTGGC GAGGGTGCCT GCAGGGGTTG GCTGTGTTCC GGCCGCAGAG CACCGTCTGC 2040
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TCAGGTCTTT CTTTTATGTC ACGGAGACCA CGTTTCAAAA GAACAGGCTC TTTTTCTACC 2160TCAGGTCTTT CTTTTATGTC ACGGAGACCA CGTTTCAAAA GAACAGGCTC TTTTTCTACC 2160
GGAAGAGTGT CTGGAGCAAG TTGCAAAGCA TTGGAATCAG ACAGCACTTG AAGAGGGTGC 2220GGAAGAGTGT CTGGAGCAAG TTGCAAAGCA TTGGAATCAG ACAGCACTTG AAGAGGGTGC 2220
AGCTGCGGGA GCTGTCGGAA GCAGAGGTCA GGCAGCATCG GGAAGCCAGG CCCGCCCTGC 2280AGCTGCGGGA GCTGTCGGAA GCAGAGGTCA GGCAGCATCG GGAAGCCAGG CCCGCCCTGC 2280
TGACGTCCAG ACTCCGCTTC ATCCCCAAGC CTGACGGGCT GCGGCCGATT GTGAACATGG 2340TGACGTCCAG ACTCCGCTTC ATCCCCAAGC CTGACGGGCT GCGGCCGATT GTGAACATGG 2340
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ACTTCCTTTT TAAACAGAAG TGCGTTTGAG CCCCACATTT GGTATCAGCT TAGATGAAGG 2460ACTTCCTTTT TAAACAGAAG TGCGTTTGAG CCCCACATTT GGTATCAGCT TAGATGAAGG 2460
GCCCGGAGGA GGGGCCACGG GACACAGCCA GGGCCATGGC ACGGCGCCAA CCCATTTGTG 2520 CGCACGGTGA GGTGGCCGAG GTGCCGGTGC CTCCAGAAAA GCAGCGTGGG GGTGTAGGGG 2580GCCCGGAGGA GGGGCCACGG GACACAGCCA GGGCCATGGC ACGGCGCCAA CCCATTTGTG 2520 CGCACGGTGA GGTGGCCGAG GTGCCGGTGC CTCCAGAAAA GCAGCGTGGG GGTGTAGGGG 2580
GAGCTCCTGG GGCAGGGACA GGCTCTGAGG ACCACAAGAA GCAGCTGGGC CAGGGCCTGG 2640GAGCTCCTGG GGCAGGGACA GGCTCTGAGG ACCACAAGAA GCAGCTGGGC CAGGGCCTGG 2640
ATGCAGCACG GCCCGAGCGG GTGGGGGCCC ACCACGCCAT TCTGGTCAAA GGTGTTGTAG 2700ATGCAGCACG GCCCGAGCGG GTGGGGGCCC ACCACGCCAT TCTGGTCAAA GGTGTTGTAG 2700
TCGTAATAGC CGGCCCAGGC GCTCTGAACC TTCAGAGTCT CAAAAGCTGG GACCCTCAGG 2760TCGTAATAGC CGGCCCAGGC GCTCTGAACC TTCAGAGTCT CAAAAGCTGG GACCCTCAGG 2760
GCCAAATGGG GCCACACCTT GTCCTGGAAG AAATCATGGT CCACTTCCAG GTTCGCCGGG 2820GCCAAATGGG GCCACACCTT GTCCTGGAAG AAATCATGGT CCACTTCCAG GTTCGCCGGG 2820
TCCGGTTCTT CCTGCTCAGT GGGGCTACGA CCACCTAGGT AGTTGCTACC TAATCCTTCC 2880TCCGGTTCTT CCTGCTCAGT GGGGCTACGA CCACCTAGGT AGTTGCTACC TAATCCTTCC 2880
CGGCGAAAAT AGGCTCCACT GGTGTCTGCA ACAAGCGGAG TCTCTAGGCC TGGTCCCTGG 2940CGGCGAAAAT AGGCTCCACT GGTGTCTGCA ACAAGCGGAG TCTCTAGGCC TGGTCCCTGG 2940
GGGCAGTGCC ACACATACAC ATACCTTTTC CTCGGCTCCA CAGGTAGCTT GGTGCCCTGC 3000GGGCAGTGCC ACACATACAC ATACCTTTTC CTCGGCTCCA CAGGTAGCTT GGTGCCCTGC 3000
AGGGTGCCAG GCGGCCCCTC TCCAACACCA GCCAGTGCTG CGATTTGCGC AGACCAGGCT 3060AGGGTGCCAG GCGGCCCCTC TCCAACACCA GCCAGTGCTG CGATTTGCGC AGACCAGGCT 3060
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TGATCAGGAG ACATCAGAGA AACTTTGGCT CCCTCCTGCC TCTGCACTTT CACGTTGCTC 3420TGATCAGGAG ACATCAGAGA AACTTTGGCT CCCTCCTGCC TCTGCACTTT CACGTTGCTC 3420
TCCATGGCTG CAGCATCCTT TTCTGAAGCC AGCAAGAGGT AGCCCGAGGG GTTGAACCGG 3480TCCATGGCTG CAGCATCCTT TTCTGAAGCC AGCAAGAGGT AGCCCGAGGG GTTGAACCGG 3480
AGGTCCAGGG GAGGAGCATC GACTACGGCC AGGTACTCAT TGATGTTCCG TAGAAAGCTG 3540AGGTCCAGGG GAGGAGCATC GACTACGGCC AGGTACTCAT TGATGTTCCG TAGAAAGCTG 3540
GCTGAAAAGA GGGAGAGCTG GATGTTCTCA GGCAATGAGA ACTGCTGACA AATCCCACCT 3600GCTGAAAAGA GGGAGAGCTG GATGTTCTCA GGCAATGAGA ACTGCTGACA AATCCCACCT 3600
ACTGAGAGCC CAGTGGAGGC CTGTGAATAC GTGTGGTCCC GTTCCACCAC TAGCACTCGA 3660ACTGAGAGCC CAGTGGAGGC CTGTGAATAC GTGTGGTCCC GTTCCACCAC TAGCACTCGA 3660
ATAGCACCTC GTCTGCTCTC CAGCTTCTTC AGCCAATAGG CCACAGACAA GCCAAGCACC 3720ATAGCACCTC GTCTGCTCTC CAGCTTCTTC AGCCAATAGG CCACAGACAA GCCAAGCACC 3720
CCACCTCCCA CGATCACCAC ATCCGAGTGC TCGGGAGGCA GGTGGCTGGT GTCTTGCAGT 3780CCACCTCCCA CGATCACCAC ATCCGAGTGC TCGGGAGGCA GGTGGCTGGT GTCTTGCAGT 3780
AGATCACAGG ACCTTCCAGG CAGGATCGAC TTGATCTTCT TCTTAATCTC AGACACCTTT 3840AGATCACAGG ACCTTCCAGG CAGGATCGAC TTGATCTTCT TCTTAATCTC AGACACCTTT 3840
CCATCCCAGT CCAGAGAAAA GCCTCCTCTG CGCGTGCCTG GCCTCCGGGT CAAGAGGCCC 3900CCATCCCAGT CCAGAGAAAA GCCTCCTCTG CGCGTGCCTG GCCTCCGGGT CAAGAGGCCC 3900
CGGCCCATGC CGTGCGGCAG AACCCTCCGA ATCATAGCCC CTCTGAGCCC GGGTCGACGC 3960CGGCCCATGC CGTGCGGCAG AACCCTCCGA ATCATAGCCC CTCTGAGCCC GGGTCGACGC 3960
GGCCGCGAAT TC 3972 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:GGCCGCGAAT TC 3972 (2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LDNGE: 2089 Basenpaare(A) LDNGE: 2089 base pairs
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(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
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(ii) ART DES MOLEKsLS: cDNA (v) ART DES FRAGMENTS: linear (vi) URSPRsNLICHE HERKUNFT:(ii) TYPE OF MOLEKsLS: cDNA (v) TYPE OF FRAGMENT: linear (vi) ORIGINAL ORIGIN:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: Human(C) INDIVIDUUM / ISOLAT: Human
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:
CCGGAAGAGT GTCTGGAGCA AGTTGCAAAG CATTGGAATC AGACAGCACT TGAAGAGGGT 60CCGGAAGAGT GTCTGGAGCA AGTTGCAAAG CATTGGAATC AGACAGCACT TGAAGAGGGT 60
GCAGCTGCGG GAGCTGTCGG AAGCAGAGGT CAGGCAGCAT CGGGAAGCCA GGCCCGCCCT 120GCAGCTGCGG GAGCTGTCGG AAGCAGAGGT CAGGCAGCAT CGGGAAGCCA GGCCCGCCCT 120
GCTGACGTCC AGACTCCGCT TCATCCCCAA GCCTGACGGG CTGCGGCCGA TTGTGAACAT 180GCTGACGTCC AGACTCCGCT TCATCCCCAA GCCTGACGGG CTGCGGCCGA TTGTGAACAT 180
GGACTACGTC GTGGGAGCCA GAACGTTCCG CAGAGAAAAG AGGGCCGAGC GTCTCACCTC 240GGACTACGTC GTGGGAGCCA GAACGTTCCG CAGAGAAAAG AGGGCCGAGC GTCTCACCTC 240
GAGGGTGAAG GCACTGTTCA GCGTGCTCAA CTACGAGCGG GCGCGGCGCC CCGGCCTCCT 300GAGGGTGAAG GCACTGTTCA GCGTGCTCAA CTACGAGCGG GCGCGGCGCC CCGGCCTCCT 300
GGGCGCCTCT GTGCTGGGCC TGGACGATAT CCACAGGGCC TGGCGCACCT TCGTGCTGCG 360GGGCGCCTCT GTGCTGGGCC TGGACGATAT CCACAGGGCC TGGCGCACCT TCGTGCTGCG 360
TGTGCGGGCC CAGGACCCGC CGCCTGAGCT GTACTTTGTC AAGGTGGATG TGACGGGCGC 420TGTGCGGGCC CAGGACCCGC CGCCTGAGCT GTACTTTGTC AAGGTGGATG TGACGGGCGC 420
GTACGACACC ATCCCCCAGG ACAGGCTCAC GGAGGTCATC GCCAGCATCA TCAAACCCCA 480GTACGACACC ATCCCCCAGG ACAGGCTCAC GGAGGTCATC GCCAGCATCA TCAAACCCCA 480
GAACACGTAC TGCGTGCGTC GGTATGCCGT GGTCCAGAAG GCCGCCCATG GGCACGTCCG 540GAACACGTAC TGCGTGCGTC GGTATGCCGT GGTCCAGAAG GCCGCCCATG GGCACGTCCG 540
CAAGGCCTTC AAGAGCCACG TCTCTACCTT GACAGACCTC CAGCCGTACA TGCGACAGTT 600CAAGGCCTTC AAGAGCCACG TCTCTACCTT GACAGACCTC CAGCCGTACA TGCGACAGTT 600
CGTGGCTCAC CTGCAGGAGA CCAGCCCGCT GAGGGGTGCC GTCGTCATCG AGCAGAGCTC 660CGTGGCTCAC CTGCAGGAGA CCAGCCCGCT GAGGGGTGCC GTCGTCATCG AGCAGAGCTC 660
CTCCCTGAAT GAGGCCAGCA GTGGCCTCTT CGACGTCTTC CTACGCTTCA TGTGCCACCA 720CTCCCTGAAT GAGGCCAGCA GTGGCCTCTT CGACGTCTTC CTACGCTTCA TGTGCCACCA 720
CGCCGTGCGC ATCAGGGGCA AGTCCTACGT CCAGTGCCAG GGGATCCCGC AGGGCTCCAT 780CGCCGTGCGC ATCAGGGGCA AGTCCTACGT CCAGTGCCAG GGGATCCCGC AGGGCTCCAT 780
CCTCTCCACG CTGCTCTGCA GCCTGTGCTA CGGCGACATG GAGAACAAGC TGTTTGCGGG 840CCTCTCCACG CTGCTCTGCA GCCTGTGCTA CGGCGACATG GAGAACAAGC TGTTTGCGGG 840
GATTCGGCGG GACGGGCTGC TCCTGCGTTT GGTGGATGAT TTCTTGTTGG TGACACCTCA 900GATTCGGCGG GACGGGCTGC TCCTGCGTTT GGTGGATGAT TTCTTGTTGG TGACACCTCA 900
CCTCACCCAC GCGAAAACCT TCCTCAGGAC CCTGGTCCGA GGTGTCCCTG AGTATGGCTG 960CCTCACCCAC GCGAAAACCT TCCTCAGGAC CCTGGTCCGA GGTGTCCCTG AGTATGGCTG 960
CGTGGTGAAC TTGCGGAAGA CAGTGGTGAA CTTCCCTGTA GAAGACGAGG CCCTGGGTGG 1020CGTGGTGAAC TTGCGGAAGA CAGTGGTGAA CTTCCCTGTA GAAGACGAGG CCCTGGGTGG 1020
CACGGCTTTT GTTCAGATGC CGGCCCACGG CCTATTCCCC TGGTGCGGCC TGCTGCTGGA 1080CACGGCTTTT GTTCAGATGC CGGCCCACGG CCTATTCCCC TGGTGCGGCC TGCTGCTGGA 1080
TACCCGGACC CTGGAGGTGC AGAGCGACTA CTCCAGCTAT GCCCGGACCT CCATCAGAGC 1140TACCCGGACC CTGGAGGTGC AGAGCGACTA CTCCAGCTAT GCCCGGACCT CCATCAGAGC 1140
CAGTCTCACC TTCAACCGCG GCTTCAAGGC TGGGAGGAAC ATGCGTCGCA AACTCTTTGG 1200CAGTCTCACC TTCAACCGCG GCTTCAAGGC TGGGAGGAAC ATGCGTCGCA AACTCTTTGG 1200
GGTCTTGCGG CTGAAGTGTC ACAGCCTGTT TCTGGATTTG CAGGTGAACA GCCTCCAGAC 1260GGTCTTGCGG CTGAAGTGTC ACAGCCTGTT TCTGGATTTG CAGGTGAACA GCCTCCAGAC 1260
GGTGTGCACC AACATCTACA AGATCCTCCT GCTGCAGGCG TACAGGTTTC ACGCATGCGT 1320GGTGTGCACC AACATCTACA AGATCCTCCT GCTGCAGGCG TACAGGTTTC ACGCATGCGT 1320
GCTGCAGCTC CCATTTCATC AGCAAGTTTG GAAGAACCCC ACATTTTTCC TGCGCGTCAT 1380GCTGCAGCTC CCATTTCATC AGCAAGTTTG GAAGAACCCC ACATTTTTCC TGCGCGTCAT 1380
CTCTGACACG GCCTCCCTCT GCTACTCCAT CCTGAAAGCC AAGAACGCAG GTATGTGCAG 1440CTCTGACACG GCCTCCCTCT GCTACTCCAT CCTGAAAGCC AAGAACGCAG GTATGTGCAG 1440
GTGCCTGGCC TCAGTGGCAG CAGTGCCTGC CTGCTGGTGT TAGTGTGTCA GGAGACTGAG 1500GTGCCTGGCC TCAGTGGCAG CAGTGCCTGC CTGCTGGTGT TAGTGTGTCA GGAGACTGAG 1500
TGAATCTGGG CTTAGGAAGT TCTTACCCCT TTTCGCATCA GGAAGTGGTT TAACCCAACC 1560TGAATCTGGG CTTAGGAAGT TCTTACCCCT TTTCGCATCA GGAAGTGGTT TAACCCAACC 1560
ACTGTCAGGC TCGTCTGCCC GCCCTCTCGT GGGGTGAGCA GAGCACCTGA TGGAAGGGAC 1620 AGGAGCTGTC TGGGAGCTGC CATCCTTCCC ACCTTGCTCT GCCTGGGGAA GCGCTGGGGG 1680ACTGTCAGGC TCGTCTGCCC GCCCTCTCGT GGGGTGAGCA GAGCACCTGA TGGAAGGGAC 1620 AGGAGCTGTC TGGGAGCTGC CATCCTTCCC ACCTTGCTCT GCCTGGGGAA GCGCTGGGGG 1680
GCCTGGTCTC TCCTGTTTGC CCCATGGTGG GATTTGGGGG GCCTGGCCTC TCCTGTTTGC 1740GCCTGGTCTC TCCTGTTTGC CCCATGGTGG GATTTGGGGG GCCTGGCCTC TCCTGTTTGC 1740
CCTGTGGTGG GATTGGGCTG TCTCCCGTCC ATGGCACTTA GGGCCCTTGT GCAAACCCAG 1800CCTGTGGTGG GATTGGGCTG TCTCCCGTCC ATGGCACTTA GGGCCCTTGT GCAAACCCAG 1800
GCCAAGGGCT TAGGAGGAGG CCAGGCCCAG GCTACCCCAC CCCTCTCAGG AGCAGAGGCC 1860GCCAAGGGCT TAGGAGGAGG CCAGGCCCAG GCTACCCCAC CCCTCTCAGG AGCAGAGGCC 1860
GCGTATCACC ACGACAGAGC CCCGCGCCGT CCTCTGCTTC CCAGTCACCG TCCTCTGCCC 1920GCGTATCACC ACGACAGAGC CCCGCGCCGT CCTCTGCTTC CCAGTCACCG TCCTCTGCCC 1920
CTGGACACTT TGTCCAGCAT CAGGGAGGTT TCTGATCCGT CTGAAATTCA AGCCATGTCG 1980CTGGACACTT TGTCCAGCAT CAGGGAGGTT TCTGATCCGT CTGAAATTCA AGCCATGTCG 1980
AACCTGCGGT CCTGAGCTTA ACAGCTTCTA CTTTCTGTTC TTTCTGTGTT GTGGAGACCC 2040AACCTGCGGT CCTGAGCTTA ACAGCTTCTA CTTTCTGTTC TTTCTGTGTT GTGGAGACCC 2040
TGAGAAGGAC CCTGGGAGCT CTGGGAATTT GGAGTGACCA AAGGTGTGC 2089 TGAGAAGGAC CCTGGGAGCT CTGGGAATTT GGAGTGACCA AAGGTGTGC 2089

Claims

Patentansprüche claims
1. Katalytisch aktive humane Telomerase-Untereinheit, ihre fünktionellen Äquivalente, ihre Varianten und ihre katalytisch aktiven Fragmente.1. Catalytically active human telomerase subunit, its functional equivalents, its variants and its catalytically active fragments.
2. Telomerase gemäß Anspruch 1, enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß Abb. 2 oder deren fünktionelle Äquivalente.2. Telomerase according to claim 1, containing the amino acid sequence according to Fig. 2 or its functional equivalents.
3. Nucleinsauresequenzen codierend für Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 und 2 und ihre fünktionellen Äquivalente.3. Nucleic acid sequences coding for compounds according to claims 1 and 2 and their functional equivalents.
4. Nucleinsauresequenzen gemäß Anspruch 3, enthaltend die DNA-Sequenz aus Abb. 1 oder ihre fünktionellen Äquivalente.4. Nucleic acid sequences according to claim 3, containing the DNA sequence from Fig. 1 or its functional equivalents.
5. Antisense-Nucleinsäuresequenz bindend an die Nucleinsauresequenz gemäß5. Antisense nucleic acid sequence binding to the nucleic acid sequence according to
Anspruch 3 oder 4.Claim 3 or 4.
6. Antikörper gegen Telomerase gemäß den Ansprüchen 1 und 2, gegebenenfalls markiert mit einem oder mehreren Markern.6. Antibodies against telomerase according to claims 1 and 2, optionally labeled with one or more markers.
7. Verwendung von Nucleinsauresequenzen gemäß den Ansprüchen 3 und 4 zur Herstellung von Telomerase.7. Use of nucleic acid sequences according to claims 3 and 4 for the production of telomerase.
8. Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 6 zur Diagnose.8. Use of antibodies according to claim 6 for diagnosis.
9. Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 6 zur Herstellung von Arzneimitteln.9. Use of antibodies according to claim 6 for the manufacture of medicaments.
10. Vektor enthaltend eine Nucleinsauresequenz, insbesondere DNA, gemäß Anspruch 3 und 4.10. Vector containing a nucleic acid sequence, in particular DNA, according to claims 3 and 4.
11. Mikroorganismen enthaltend den Vektor gemäß Anspruch 10. 11. Microorganisms containing the vector according to claim 10.
12. Screening Assay zur Auffindung von Modulatoren der humanen Telomerase enthaltend die Telomerase gemäß den Ansprüchen 1 und 2.12. Screening assay for the detection of modulators of human telomerase containing the telomerase according to claims 1 and 2.
13. Verfahren zur Herstellung der Telomerase gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus gemäß Anspruch 1 1 kultiviert und die Telomerase isoliert. 13. A process for the preparation of the telomerase according to claims 1 and 2, characterized in that the microorganism according to claim 1 1 is cultivated and the telomerase is isolated.
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