WO1999051765A1 - Verfahren zum nachweis von mikroorganismen in gasen - Google Patents

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WO1999051765A1
WO1999051765A1 PCT/EP1999/002194 EP9902194W WO9951765A1 WO 1999051765 A1 WO1999051765 A1 WO 1999051765A1 EP 9902194 W EP9902194 W EP 9902194W WO 9951765 A1 WO9951765 A1 WO 9951765A1
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membrane
gelatin
microorganisms
organisms
membrane filter
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PCT/EP1999/002194
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Elmar Herbig
Dieter Nussbaumer
Khuong To Vinh
Original Assignee
Sartorius Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y10S435/836—Bacillus licheniformis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of microorganisms in gases, in particular air and gelatin membrane filters for carrying out the method, which are characterized by a particular purity
  • the method can be used for the detection of microorganisms from gaseous media, in particular from air, in the pharmaceutical, biotechnological and food industries, in environmental protection, in waste management and in medical facilities for determining the bacterial count of the media for the collection of bacteria, spores, viruses, yeasts and fungi (microorganisms) in order to be able to determine their concentration in rooms by means of the method according to the invention.
  • Such surveillance is a prerequisite for the timely initiation of measures to prevent people and products from being damaged by excessive concentrations of microorganisms Preserve example in indoor air
  • the air is regularly checked for its microbial content. As a rule, it is filtered air, which naturally has a low content of microorganisms. Large volumes usually have to be examined in order to collect sufficient germs for meaningful results
  • Air germ collecting device as it is sold by the company Sartorius AG under the name "MD8 airscan" is filtered through a suitable filter.
  • MD8 airscan sterile membrane filters with pore sizes in the microfiltration range, mainly based on gelatin, are used, as described, for example, in DE -PS 11 73 640 are described
  • Gelatin membrane filters on which the retained microorganisms are to be kept moist and capable of reproduction are particularly suitable.
  • Gelatin membranes on which the collected microorganisms have a particularly high viability due to the addition of osmoprotective substances are described in DE-PS 197 50 215.
  • the gelatin membrane filters can either incubated on an agar floor, whereby microorganism colonies grow out of the individual collected germ aggregates (the gelatin membrane filter liquefies and disappears and the microorganism colonies can be counted directly on the agar), or in a sterile solution, such as a peptone water or a physiological saline solution be dissolved so that subsets can be incubated on different nutrient media.
  • the analysis results are only available relatively late because the colony growth is usually takes up to 7 days
  • a rapid microbiological analysis process rapid test system for the detection of microorganisms
  • ChemScan the results are available after only 30 to 90 minutes, because this process detects the individual microorganism and the otherwise time-consuming process Microorganism multiplication in the incubator no longer required
  • an aqueous sample containing the living microorganisms is filtered through a 0.22 ⁇ m or 0.45 ⁇ m analysis membrane in order to retain the microorganisms contained in the sample on the analysis membrane.
  • the analysis membrane is kept at 30 ° for 30 minutes C placed on an absorption pad which is soaked with a labeling liquid
  • the labeling liquid has the ability to interact with the cell cytoplasm of living microorganisms via an enzyme-controlled reaction under yellowish fluorescence Microscope, preferably with a laser scan system, every single microorganism can be recognized on the analysis membrane.
  • the gelatin membrane filters, on which the microorganisms were collected from the air only by dissolving the Gelatin membrane filter in a water solution, such as a peptone-water solution, is to be transferred to a sample and this sample is to be analyzed as described above.
  • a water solution such as a peptone-water solution
  • the invention is therefore based on the object of proposing a method for the rapid detection of microorganisms and gelatin membrane filters suitable for this method for collecting these microorganisms from gases
  • the object is achieved by a method for the rapid detection of microorganisms in gases, in which a) the gas for collecting the microorganisms is passed through a gelatin membrane filter free of particles with a diameter of large 0.45 ⁇ m, preferably 0.1 ⁇ m, b) the gelatin membrane filter with the collected microorganisms is dissolved in an aqueous solution which contains an enzymatic marker which produces fluorescence with the microorganisms, c) the solution obtained with the microorganisms through an analysis membrane of a pore size in the range from about 0.2 to about 0.45 ⁇ m is filtered and d) the fluorescent microorganisms remaining on the analysis membrane are paid out
  • gelatin membrane filters are suitable for carrying out the process which are free from particles with sizes which are retained by microfiltration membranes with a pore diameter of at most 0.45 ⁇ m, preferably of at most 0.2 ⁇ m. That is, such Gelatin membrane filters are free of microorganisms, including dead microorganisms.
  • the gelatin membrane filters in a preferred embodiment contain osmoprotective substances, for example methyl methylammonioacetate (betaine), in order to significantly increase the viability of the living microorganisms collected on the gelatin membrane filters.
  • a gelatin freed from such particles as the starting material for the production of the gelatin membrane filter.
  • a solution of commercially available gelatin is filtered through a microfiltration membrane with a pore size of up to approximately 0.45 ⁇ m, preferably of up to about 0.2 ⁇ m and particularly preferably up to 0.1 ⁇ m. It has proven to be expedient to filter the already formulated membrane drawing solution under pressure through a microfiltration membrane of the aforementioned pore size. This ensures that in one work step each component, from which the membrane drawing solution was produced, all particles which have a size are removed so that they are retained by microfiltration membranes of the pore size mentioned.
  • Pressure filtration is to be preferred because, compared to vacuum filtration, volatile solution is used can not evaporate and the quantitative composition of the membrane drawing solution is not changed
  • a hydrophilic, cross-linked 0.2 ⁇ m cellulose hydrate membrane which is marketed under the name Hydrosart by Sartonus AG, Gottingen, has proven to be particularly suitable for filtration.
  • the gelatin membrane filters according to the invention are particularly suitable for rapid microbiological analysis methods for the direct determination of individual microorganisms, in particular living microorganisms, which show fluorescence signals with marking agents.
  • the gelatin membrane filter on which the microorganisms have been collected from gases is brought into a watery solution for dissolution an analysis membrane with pore sizes in the range from about 0.2 to at most 0.45 ⁇ m is filtered in order to retain the microorganisms collected on the gelatin membrane filter on the analysis membrane.
  • the use of microsieve membrane types, as described, for example, in WO 95/13860 AI are preferred, in particular nuclear track membranes with pore sizes of about 0.2 ⁇ m.
  • the use of such analysis membranes is advantageous because they are characterized by a narrow pore size distribution and by the straight pore profile across the membrane surface are characterized by a high filtration rate and because microorganisms remain completely on the surface of these membranes and cannot penetrate into the pore structure as with conventional microfiltration membranes
  • the labeling fluid is added directly to the aqueous solution used to dissolve the gelatin membrane filter, and after a labeling time to be tested, the labeled microorganisms are collected on the analysis membrane.
  • an aqueous homogeneous membrane drawing solution consisting at least of gelatin with a share of 4.5 to 5.6% of the total membrane drawing solution, made of ethanol with a share of 38 to 46 % of the total membrane drawing solution and optionally made from a binder with a content of 0.02 to 0.1% of the total membrane drawing solution.
  • Polyvinyl alcohol for example, can be used as the binding agent.
  • the membrane drawing solution is pressed under pressure through a microfiltration membrane with a maximum pore size of 0.45 ⁇ , preferably filtered to 0.2 ⁇ m, then a thin film of the membrane drawing solution is spread out on a support and the thin film is exposed to air to form a gelled phase.
  • the gelled phase is then introduced into a precipitation bath consisting of methyl acetate for post-treatment
  • the membrane drawing solution additionally contains at least one osmoprotective substance with a proportion of 0.005 to 0.75% based on the gelatin content.
  • trimethylammonioacetate can be used as the osmoprotective substance
  • methyl acetate with an alcohol in particular methanol
  • a proportion of 10 to 20% of the total first hardening bath is used as the first hardening bath with a proportion of 10 to 20% of the total first hardening bath.
  • the membrane remains in this first consolidation bath for a period of one to three hours at room temperature before it is transferred to a second consolidation bath made of pure methyl acetate. Drying and sterilization, preferably with gamma rays, follow. The invention is explained using the following exemplary embodiment
  • Example 1 To produce a gelatin membrane filter, 200 g of commercially available gelatin powder and 2 g of polyvinyl alcohol as a binder (Mowiol type 18-88, Hoechst AG) are dissolved in 2000 g of water with stirring at 60 ° C. for one hour and then with 1645 g ethanol and 0.02 g T ⁇ methylammonioacetat as an osmoprotective substance dissolved in 10 g water.
  • This membrane drawing solution is in dead-end mode at a pressure difference of 3 bar and a temperature of about 40 ° C through a cross-linked cellulose hydrate membrane with a pore size of 0.2 ⁇ m filtered
  • the filtered membrane solution heated to 21 ° C., is spread out on a base to form a film of thickness 350 ⁇ m and exposed to air with a relative humidity of about 45% at room temperature for about 5 minutes.
  • the gelled film is mixed with the Underlay in a first solidifying bath, which consists of methyl acetate with a content of 14% methanol, for 3 hours and then placed in a second solidifying bath made of pure methyl acetate for 3 hours.
  • the gelatin membrane filter is removed from the base, dried and sterilized with gamma rays
  • the gelatin membrane filter thus obtained has an air flow of 140 1 / min cm 2 bar.
  • a gelatin membrane filter produced according to this example and containing 150 mg gelatin was dissolved in 50 ml Peptone water and mixed with 100 ⁇ l delvolase enzyme and fluorescent dye. After an incubation period of The solution was filtered from cellulose nitrate over a 0.4 ⁇ m analysis membrane for 5 minutes at 37 ° C. and the analysis membrane was evaluated under the microscope. No microorganisms were found
  • gelatin membrane filters according to the invention for collecting airborne germs together with a rapid test system for the detection of microorganisms, such as the ChemScan system, represent an extremely precise detection method for very low bacterial counts, which makes them particularly suitable for quality control questions in the pharmaceutical industry and biotechnology by preserving the microbiological Analysis results in just a few minutes support a just-in-time production. There are practically no waiting times for the release of production rooms, since microbiological contamination can be detected in a very short time and, as with conventional methods, incubation times are no longer required for up to a week to arrive at the microbiological finding. This increases the production security significantly

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Mikroorganismen in Gasen, insbesondere Luft und Gelatinemembranfilter zur Durchführung des Verfahrens, die sich durch eine besondere Reinheit auszeichnen. Dazu wird das Gas zur Sammlung der Mikroorganismen durch ein von Partikeln mit einem Durchmesser grösser 0,45 νm, vorzugsweise 0,1 νm freies Gelatinemembranfilter geströmt, der Gelatinemembranfilter mit den gesammelten Mikroorganismen in einer wässrigen Lösung, die ein mit den Mikroorganismen Fluoreszenz hervorrufendes enzymatisches Markierungsmittel enthält, aufgelöst, die erhaltene Lösung mit den Mikroorganismen durch eine Analysenmembran einer Porengrösse im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 0,45 νm filtriert und die auf der Analysenmembran verbleibenden fluoreszierenden Mikroorganismen ausgezählt. Der Erfindungsgegenstand ist in der pharmazeutischen, biotechnologischen und Lebensmittelindustrie, im Umweltschutz, in der Abfallwirtschaft und in medizinischen Einrichtungen zur Bestimmung der Keimzahlbelastung der Medien einsetzbar.

Description

VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON MIKROORGANISMEN IN GASEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gasen, insbesondere Luft und Gelatinemembranfilter zur Durchführung des Verfahrens, die sich durch eine besondere Reinheit auszeichnen
Das Verfahren ist zum Nachweis von Mikroorganismen aus gasförmigen Medien, insbesondere aus Luft, in der pharmazeutischen, biotechnologischen und Lebensmittelindustrie, im Umweltschutz, in der Abfallwirtschaft und in medizinischen Einrichtungen zur Bestimmung der Keimzahlbelastung der Medien einsetzbar Die erfindungsgemaßen Gelatinemembranfilter dienen beispielsweise in Kombination mit einem Luftkeimsammelgerat zur Sammlung von Bakterien, Sporen, Viren, Hefen und Pilzen (Mikroorganismen), um deren Konzentration in Räumen mittels des erfindungsgemaßen Verfahrens bestimmen zu können Derartige Überwachungen sind Voraussetzung für die rechtzeitige Einleitung von Maßnahmen, um Personen und Produkte vor Schädigungen durch zu hohe Mikroorganismenkonzentrationen zum Beispiel in der Raumluft zu bewahren
In bestimmten Räumen mit besonderen Anforderungen an die Beschaffenheit der Luft, wie m klimatisierten Räumen, Reinraumen und Isolatoren, wird die Luft regelmäßig auf ihren Keimgehalt hin untersucht Da es sich in der Regel um gefilterte Luft handelt, die naturgemäß einen geringen Gehalt an Mikroorganismen aufweist, müssen gewöhnlich große Volumina untersucht werden, um ausreichend Keime für aussagefahige Ergebnisse zu sammeln Dazu wird eine Luftprobe beispielsweise mittels eines Luftkeimsammelgerätes, wie es von der Firma Sartorius AG unter der Bezeichnung „MD8 airscan" vertrieben wird, durch ein geeignetes Filter filtriert Als Filter werden für diesen Zweck sterile Membranfilter mit Porengrößen im Mikrofiltrationsbereich vorwiegend auf der Basis von Gelatine eingesetzt, wie sie beispielsweise in der DE-PS 11 73 640 beschrieben sind
Besonders geeignet sind Gelatinemembranfilter, auf denen die zurückgehaltenen Mikroorganismen feucht und vermehrungsfähig gehalten werden sollen Gelatinemembranen, auf denen die gesammelten Mikroorganismen aufgrund eines Zusatzes osmoprotektiver Substanzen eine besonders hohe Lebensfähigkeit aufweisen, sind in der DE-PS 197 50 215 beschrieben Nach der Probenahme können die Gelatinemembranfilter entweder auf einem Agarnahrboden bebrütet werden, wobei aus den einzelnen gesammelten Keimaggregaten Mikroorganismenkolonien heranwachsen (das Gelatinemembranfilter verflüssigt sich und verschwindet und die Mikroorganismenkolonien können direkt auf dem Agar gezählt werden), oder in einer sterilen Losung, wie einer Pepton-Wasser- oder einer physiologischen Kochsalzlosung gelost werden, so daß Teilmengen auf verschiedenen Nahrmedien bebrütet werden können Allerdings stehen nach diesen Methoden die Analysenergebnisse erst relativ spat zur Verfügung, weil das Koloniewachstum in der Regel bis zu 7 Tagen in Anspruch nimmt Nach einem mit ChemScan bezeichneten schnellen mikrobiologischen Analyseverfahren (Schnelltestsystem für den Nachweis von Mikroorganismen) stehen die Ergebnisse dagegen bereits nach 30 bis 90 Minuten zur Verfügung, weil bei diesem Verfahren der einzelne Mikroorganismus detektiert wird und die sonst übliche zeitaufwendige Mikroorganismen- Vervielfachung im Brutschrank entfallt Dazu wird eine wassrige, die lebenden Mikroorganismen enthaltende Probe durch eine 0,22 μm oder 0,45 μm Analysenmembran filtriert, um die in der Probe enthaltenden Mikroorganismen auf der Analysenmembran zurückzuhalten Die Analysenmembran wird für 30 Minuten bei 30°C auf eine Absorptionsunterlage aufgelegt, die mit einer Markierungsflussigkeit getrankt ist Die Markierungsflussigkeit besitzt die Fähigkeit mit dem Zellcytoplasma lebender Mikroorganismen über eine enzymgesteuerte Reaktion unter gelblicher Fluorescenz in Wechselwirkung zu treten Schließlich kann unter einem Mikroskop, vorzugsweise mit einem Laser- Scan- System, jeder einzelne Mirkoorganismus auf der Analysenmembran erkannt werden Man sollte erwarten, daß zur Anwendung dieses schnellen mikrobiologischen Analyseverfahrens für den Nachweis von Mikroorgansismen in Gasen die Gelatinemembranfilter, auf denen die Mikroorganismen aus der Luft gesammelt wurden, lediglich durch Auflosen der Gelatinemembranfilter in einer wassngen Losung, wie zum Beispiel einer Pepton- Wasser-Losung, in eine Probe zu überführen ist und diese Probe wie vorstehend beschrieben zu analysieren ist Es hat sich aber gezeigt, daß man keine auswertbaren gelblich fluorescierenden Signale auf der Analysenmembran erkennt und die Analysenmembran durchgehend rot gefärbt ist
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Mikroorganismen und für dieses Verfahren geeignete Gelatinemembranfilter zur Sammlung dieser Mikroorganismen aus Gasen vorzuschlagen
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Mikroorganismen in Gasen gelost, bei dem a) das Gas zur Sammlung der Mikroorgansimen durch ein von Partikeln mit einem Durchmesser großer 0,45 μm, vorzugsweise 0, 1 μm freies Gelatinemembranfilter geströmt wird, b) der Gelatinemembranfilter mit den gesammelten Mikroorganismen in einer wassngen Losung, die ein mit den Mikroorganismen Fluorescenz hervorrufendes enzymatisches Markierungsmittel enthalt, aufgelost wird, c) die erhaltene Losung mit den Mikroorganismen durch eine Analysenmembran einer Porengroße im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 0,45 μm filtriert wird und d) die auf der Analysenmembran verbleibenden fluorescierenden Mikroorganismen ausgezahlt werden
Es wurde gefunden, daß Gelatinemembranfilter zur Durchführung des Verfahrens geeignet sind, die frei von Partikeln mit Großen sind, die durch Mikrofiltrationsmembranen mit einem Porendurchmesser von höchstens 0,45 μm, vorzugsweise von höchstens 0,2 μm zurückgehalten werden Das heißt, das derartige Gelatinemembranfilter frei von Mikroorganismen, einschließlich von toten Mikroorganismen sind Um die Lebensfähigkeit der auf den Gelatinemembranfiltern gesammelten lebenden Mikroorganismen deutlich zu erhohen, enthalten die Gelatinemembranfilter in einer bevorzugten Ausführungsform osmoprotektive Substanzen, beispielsweise Tπmethylammonioacetat (Betain)
Überraschenderweise wurde gefunden, daß es bereits ausreicht, eine von derartiken Partikeln befreite Gelatme als Ausgangsstoff für die Herstellung der Gelatinemembranfilter zu verwenden Vorteilhafterweise filtriert man dazu eine Losung handelsüblicher Gelatine durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer Porengroße von bis zu ungefähr 0,45 μm, vorzugsweise von bis zu ungefähr 0,2 μm und besonders vorzugsweise von bis zu 0, 1 μm Dabei hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die bereits formulierte Membranziehlosung unter Druck durch eine Mikrofiltrationsmembran der genannten Porengroße zu filtrieren Damit wird sichergestellt, daß in einem Arbeitsschritt aus jeder Komponente, aus der die Membranziehlosung hergestellt wurde, alle Partikel entfernt werden, die eine Große besitzen, daß sie von Mikrofiltrationsmembranen der genannten Porengroße zurückgehalten werden Die Druckfiltration ist deshalb zu bevorzugen, weil dabei im Vergleich zur Vakuumfiltration fluchtige Losungsmittel nicht abdampfen können und die quantitative Zusammensetzung der Membranziehlosung nicht verändert wird Als zur Filtration besonders geeignet hat sich eine hydrophile, vernetzte 0,2 μm Cellulosehydratmembran erwiesen, die unter dem Namen Hydrosart von der Sartonus AG, Gottingen auf dem Markt vertrieben wird (DE-PS 44 18 831) Eine nach dem ChemScan -Verfahren durchgeführte Analyse handelsüblicher Gelatine und Gelatinemembranfilter, die daraus direkt ohne den erfindungsgemaßen Filtrationsschπtt gefertigt und sterilisiert wurden, zeigte, daß ein Gramm derartiger Produkte zwischen ungefähr 10 000 und mehr als 1 000 000 toter Mikroorganismen enthalten kann Diese Menge an Mikroorganismen ist offensichtlich dafür verantwortlich, daß Gelatinemembranfilter selbst nach ihrer Steπ sierung m Schnelltestverfahren, bei denen Fluorescenz hervorrufende Markierungsmittel eingesetzt werden, wie in dem
ChemScan -Verfahren, nicht verwendet werden können Die bereits im Rohstoff vorhandenen, insbesondere toten Mikroorganismen verursachen offensichtlich eine Verfärbung der Analysenmembran und verhindern dadurch das Erkennen der Flurescenz von lebenden Mikroorganismen
In den erfindungsgemaß hergestellten Gelatinemembranfiltern konnte dagegen eine so weitgehende Reduktion der Mikroorganismen festgestellt werden, daß sie sich zur Sammlung von Mikroorganismen aus Gasen und zum Nachweis der gesammelten Mikroorganismen als geeignet erwiesen
Die erfindungsgemaßen Gelatinemembranfilter sind insbesondere für schnelle mikrobiologische Analyseverfahren zur direkten Bestimmung einzelner Mikroorganismen, insbesondere lebender Mikroorganismen geeignet, die mit Markierungsmitteln Fluorescenz-Signale zeigen Dazu wird das Gelatinemembranfilter, auf dem die Mikroorganismen aus Gasen gesammelt wurden, zur Auflosung in eine wassπge Losung gebracht, durch eine Analysenmembran mit Porengroßen im Bereich von etwa 0,2 bis höchstens 0,45 μm filtriert, um die auf dem Gelatinemembranfilter gesammelten Mikroorganismen auf der Analysenmembran zurückzuhalten Hierbei ist die Verwendung von Mikrosieb-Membranentypen, wie sie beispielsweise in der WO 95/13860 AI beschrieben werden, insbesondere Kernspurmembranen mit Porengroßen von etwa 0,2 μm bevorzugt Die Verwendung derartiger Analysenmembranen ist deshalb von Vorteil, weil sie sich durch eine enge Porengroßenverteilung und aufgrund des geraden Porenverlaufs quer zur Membranflache durch eine hohe Filtrationsgeschwindigkeit auszeichnen und weil Mikroorganismen vollständig auf der Oberflache dieser Membranen zurückbleiben und nicht wie bei herkömmlichen Mikrofiltrationsmembranen in die Porenstruktur eindringen können Die Analysenmembran wird für 30 Minuten bei 30° C auf eine Absorptionsunterlage aufgelegt, die für Mikroorganismen mit einer Fluorescenz hervorrufernden Markierungsflussigkeit getrankt ist In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Markierungsflussigkeit direkt der zur Auflosung des Gelatinemembranfilters dienenden wassngen Losung zugesetzt und nach einer auszutestenden Markierungszeit werden die markierten Mikroorganismen auf der Analysenmembran gesammelt Schließlich werden unter einem Mikroskop oder vorzugsweise mit einem Laser-Scan-System, die einzelnen auf der Analysenmembran fluorescierenden Mirkoorganismus quantitativ erfaßt Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemaßen Gelatinemembranfilter wird im Einzelnen wie folgt durchgeführt Es wird zunächst eine wassrige homogene Membranziehlosung mindestens bestehend aus Gelatine mit einem Anteil von 4,5 bis 5,6 % an der gesamten Membranziehlosung, aus Ethanol mit einem Anteil von 38 bis 46 % an der gesamten Membranziehlosung und wahlweise aus einem Bindemittel mit einem Gehalt von 0,02 bis 0,1 % an der gesamten Membranziehlosung hergestellt Als Bindemittel kann beispielsweise Polyvinylalkohol eingesetzt werden Die Membranziehlosung wird unter Druck durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer Porengröße von maximal 0,45 μ, vorzugsweise bis 0,2 μm filtriert Dann wird ein dunner Film aus der Membranziehlosung auf einer Unterlage ausgebreitet, und der dünne Film wird zur Ausbildung einer gelierten Phase Luft ausgesetzt Die gelierte Phase wird sodann zur Nachbehandlung in ein Fällbad eingebracht, welches aus Methylacetat besteht In einer bevorzugten Ausfuhrungsform enthalt die Membranziehlosung zusatzlich wenigstens eine osmoprotektive Substanz mit einem Anteil von 0,005 bis 0,75 % bezogen auf den Gehalt an Gelatine Als osmoprotektive Substanz kann beispielsweise Trimethylammonioacetat verwendet werden
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als erstes Verfestigungsbad Methylacetat mit einem Alkohol, insbesondere Methanol, mit einem Anteil von 10 bis 20 % am gesamten ersten Verfestigungsbad verwendet. Die Membran verbleibt in diesem ersten Verfestigungsbad über eine Zeitdauer von ein bis drei Stunden bei Raumtemperatur bevor sie in ein zweites Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat überfuhrt wird Trocknung und Sterilisierung, vorzugsweise mit Gammastrahlen, schließen sich an Die Erfindung wird anhand des nachstehenden Ausführungsbeispiels erläutert
Beispiel Zur Herstellung eines Gelatinemembranfilters werden 200 g handelsübliches Gelatinepulver und 2 g Polyvinylalkohol als Bindemittel (Mowiol Typ 18-88, Hoechst AG) unter einstundigem Ruhren bei 60° C in 2000 g Wasser gelost und anschließend mit 1645 g Ethanol und 0,02 g Tπmethylammonioacetat als osmoprotektiver Substanz gelost in 10 g Wasser versetzt Diese Membranziehlosung wird im Dead-End-Modus bei einer Druckdifferenz von 3 bar und einer Temperatur von etwa 40° C durch eine vernetzte Cellulosehydrat-Membran mit einer Porengroße von 0,2 μm filtriert Die filtrierte und auf 21° C temperierte Membranziehlosung wird zu einem Film der Starke 350 μm auf eine Unterlage ausgebreitet und Luft mit einer relativen Feuchte von etwa 45 % bei Raumtemperatur ungefähr 5 Minuten ausgesetzt Der gelierte Film wird zusammen mit der Unterlage in ein erstes Verfestigungsbad, daß aus Methylacetat mit einem Anteil von 14 % Methanol besteht, für die Dauer von 3 Stunden und danach in ein zweites Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat für die Dauer von 3 Stunden eingebracht Der Gelatinemembranfilter wird von der Unterlage abgezogen, getrocknet und mit Gammastrahlen sterilisiert
Der so erhaltene Gelatinemembranfilter weist einen Luftdurchfluß von 140 1/mιn cm2 bar auf Ein nach diesem Beispiel hergestellter Gelatinemembranfilter, der 150 mg Gelatine enthalt, wurde in 50 ml Peptone-Wasser gelost und mit 100 μl Delvolase Enzym und Fluoreszenzfarbstoff versetzt Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten bei 37° C wurde die Losung über eine 0,4 μm Analysenmembran aus Cellulosenitrat filtriert und die Analysenmembran unter dem Mikroskop ausgewertet Es konnten keine Mikroorganismen gefunden werden
In einem Vergleichsversuch, der analog dem vorstehenden Beispiel durchgeführt wurde, allerdings mit dem Unterschied, daß auf die Filtration der Membranziehlosung verzichtet wurde, zeigte nach Behandlung mit dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Enzym eine durchgehend rot gefärbte Analysenmembran, was auf die Anwesenheit einer Vielzahl toter Mikroorganismen hindeutet
Die erfindungsgemaßen Gelatinemembranfilter zur Luftkeimsammlung stellen zusammen mit einem Schnelltestsystem zum Nachweis von Mikroorganismen, wie dem ChemScan -System eine extrem genaue Nachweismethode für sehr niedrige Keimzahlen dar, wodurch sie sich besonders für Quahtatskontrollfragen in der pharmazeutischen Industrie und Biotechnologie eignen Durch Erhalt der mikrobiologischen Analysenresultate in wenigen Minuten wird eine Just-in-time Produktion unterstutzt Es treten praktisch keine Wartezeiten bei der Freigabe von Produktionraumen auf, da mikrobiologische Verunreinigungen in sehr kurzer Zeit nachweisbar sind und nicht mehr wie bei herkömmlichen Methoden bis zu einer Woche Inkubationszeiten benotigt werden, um zum mikrobiologischen Befund zu gelangen Dadurch wird die Produktionssicherheit entscheidend erhöht

Claims

9Patentansprüche
1 Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gasen, bei dem a) das Gas zur Sammlung der Mikroorgansimen durch ein von Partikeln mit einem Durchmesser großer 0,45 μm, vorzugsweise 0, 1 μm freies Gelatinemembranfilter geströmt wird, b) der Gelatinemembranfilter mit den gesammelten Mikroorganismen in einer wassrigen Losung, die ein mit den Mikroorganismen Fluorescenz hervorrufendes enzymatisches Markierungsmittel enthalt, aufgelost wird, c) die erhaltene Losung mit den Mikroorganismen durch eine Analysenmembran einer Porengröße im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 0,45 μm filtriert wird und d) die auf der Analysenmembran verbleibenden fluorescierenden Mikroorganismen ausgezahlt werden
2 Gelatinemembranfilter zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 erhaltlich durch a) Filtrieren einer wassrigen homogenen Membranziehlosung, die mindestens aus Gelatine mit einem Anteil von 4,5 bis 5,6 % an der gesamten Membranziehlosung, aus Ethanol mit einem Anteil von 38 bis 46 % an der gesamten Membranziehlosung und wahlweise aus einem Bindemittel mit einem
Gehalt von 0,02 bis 0, 1 % an der gesamten Membranziehlosung besteht, durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer Porengroße von bis zu 0,45 μm, vorzugsweise von bis zu 0, 1 μm, b) Ausbreiten eines dünnen Films aus der Membranziehlosung auf einer Unterlage, c) Aussetzen des dünnen Films feuchter Luft zur Ausbildung einer gelierten Phase, d) Einbringen der gelierten Phase in ein Fallbad aus Methylacetat zur Verfestigung des Gelatinemembranfilters und e) Trocknen des Gelatinemembranfilters 10
3. Gelatinemembranfilter nach Anspruch 2 erhältlich durch Filtrieren der wassrigen homogenen Membranziehlosung, der zusätzlich osmoprotektiven Substanzen mit einem Anteil von 0,005 bis 0,75 % bezogen auf den Gehalt an Gelatine zugesetzt wurden.
4. Gelatinemembranfilter nach Anspruch 3, bei dem der Membranziehlosung als osmoprotektive Substanz Trimethylammonioacetat (Betain) zugesetzt wurde.
5. Gelatinemembranfilter nach Anspruch 2 erhältlich durch Einbringen der gelierten Phase in ein Fällbad, das aus einem ersten Verfestigungsbad aus Methylacetat mit einem Anteil von 10 bis 20% eines Alkohols, vorzugsweise Methanol und aus einem zweiten Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat besteht.
6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem als Analysenmembran ein Mikrosieb, vorzugsweise eine Kernspurmembran mit einer Porengröße im Bereich von etwa 0,45 bis etwa 0,2 μm verwendet wird.
PCT/EP1999/002194 1998-04-02 1999-03-30 Verfahren zum nachweis von mikroorganismen in gasen WO1999051765A1 (de)

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