WO2000062072A1 - Methode homogene de detection mettant en jeu un cryptate de terre rare - Google Patents

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WO2000062072A1
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rare earth
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Gérard Mathis
Hervé Bazin
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Cis Bio International
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
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Definitions

  • the invention relates to a homogeneous method for the detection and / or fluorescence determination of a chemical or physicochemical interaction in a measurement medium, in which a rare earth cryptate containing a substituent is used, characterized in that the variation of at least one fluorescence characteristic of the rare earth cryptate induced by the modification of the physicochemical properties of the substituent resulting from said interaction.
  • the methods using fluorescence are particularly sensitive but are liable to be disturbed by the optical properties of the medium.
  • the object of the invention is therefore to use these modifications of the coordination environment of a rare earth ion in a cryptate to detect or measure an enzymatic activity or a biological interaction in homogeneous phase.
  • such a method requires only one fluorescent tracer, namely the rare earth cryptate.
  • said modification influences the solvation sphere of the rare earth ion.
  • Said fluorescence characteristic is for example chosen from the emission lifetime, the fluorescence intensity, the distribution of the lines in the fluorescence spectrum and the polarization.
  • the variation measured in the method according to the invention may for example be an increase or a decrease in the emission lifetime or in the fluorescence intensity, and in particular be due to an agent inducing an enhancement or extinction of fluorescence. .
  • said substituent is negatively charged or acquires a negative charge during a physicochemical process.
  • substituted in the present description is meant both a chemical group such as for example a phosphate, phosphonate, carboxylate group or one of their derivatives, for example an ester or amide derivative, as well as a chemical or biological molecule comprising a such a group, such as for example a nucleic acid, an oligonucleotide or an oligonucleotide consisting of or comprising nucleotide analogs; a nucleotide or nucleoside and their analogs.
  • a chemical group such as for example a phosphate, phosphonate, carboxylate group or one of their derivatives, for example an ester or amide derivative
  • a chemical or biological molecule comprising a such a group, such as for example a nucleic acid, an oligonucleotide or an oligonucleotide consisting of or comprising nucleotide analogs; a nucleotide or nucleoside and their analogs.
  • the interaction that one wishes to detect can for example result from an enzymatic reaction, involving in particular enzymes such as phosphatase, phosphodiesterase, esterase, exonuclease, deoxyribunoclease, ribonuclease, ligase, kinase or polymerase.
  • enzymes such as phosphatase, phosphodiesterase, esterase, exonuclease, deoxyribunoclease, ribonuclease, ligase, kinase or polymerase.
  • Said interaction may also, according to another aspect of the invention, consist of a hybridization or denaturation reaction of nucleic acids, of oligonucleotides, or of oligonucleotides consisting of or comprising nucleotide analogs or in a reaction between said nucleic acids or oligonucleotides with proteins having affinity for them.
  • analog of nucleotides or oligonucleotides is understood to mean molecules different from the corresponding natural molecules by modification of their structure, such as optical isomers (for example ⁇ configuration of the base with respect to sugar), position isomers (by example 2'-5 'sequences of phosphate bridges), or by modification of the substituents of the base (for example diaminopurine) or of the sugar (for example 3'-deoxyribose).
  • optical isomers for example ⁇ configuration of the base with respect to sugar
  • position isomers by example 2'-5 'sequences of phosphate bridges
  • modification of the substituents of the base for example diaminopurine
  • sugar for example 3'-deoxyribose
  • oligonucleotides may, for example, consist of a chain of ribonucleotide or deoxyribonucleotide units or of analogous nucleotide units modified on the sugar or on the base and linked together by natural intemucleotide bonds of the phosphodiester type, part of the intemucleotide bonds. possibly being replaced by phosphonate, phosphoramide or phosphorothioate bonds.
  • These different families of oligonucleotides are described in Goodchild, Bioconjugate Chetnistry, 1 (3),
  • oligonucleotides can also consist of a chain comprising both ribonucleotide or deoxyribonucleotide units linked together by phosphodiester bonds and analogous nucleoside units linked together by amide bonds, commonly known as
  • PNA in English “peptide nucleic acid”
  • the measurement medium is a biological medium, in particular a serum medium.
  • the rare earth cryptate used in the method according to the invention can be linked to the substituent, covalently, either directly or via a spacer arm.
  • direct bonding can be carried out on a functional group previously introduced or generated on one or more atoms of a base or of a pentofuranose unit of the oligonucleotide.
  • the term “functional group” designates any function carried by the nucleotide part or introduced onto this part by any method known by a person skilled in the art and capable of binding by covalent bonding, directly or after activation with a function present on the cryptate or on the spacer arm carried by the cryptate.
  • Such functional groups are in particular the NH 2, COOH, CHO, OH or SH functions as well as the functions capable of giving covenant bonds by substitution (halides, sulfonates, epoxide) or by addition (double bonds of maleimide type). These functions are generally carried by a hydrocarbon chain itself linked to the nucleotide part. Methods for introducing these functional groups are described in particular in C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2 nd edition, LJ Kricka (1995), Ed. Académie press Ltd., London, p. According to a preferred aspect of the invention, the rare earth cryptate is linked to the oligonucleotide via a spacer arm.
  • spacer arm means any means making it possible to link the oligonucleotide covalently with the cryptate at the level of a terminal phosphate, of an atom of a purine or pyrimidine base or of an atom of sugar.
  • said spacer arm consists of a bivalent organic radical, chosen from linear or branched C 1 -C 2 alkylene groups, optionally containing one or more double bonds or triple bonds and / or optionally containing a or several heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s); cycloalkylene groups and C 5 -C 8 arylene groups, C 6 - C i4, said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted by alkyl, aryl or sulfonate groups.
  • a bivalent organic radical chosen from linear or branched C 1 -C 2 alkylene groups, optionally containing one or more double bonds or triple bonds and / or optionally containing a or several heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s); cycloalkylene groups and C 5 -C 8
  • the rare earth cryptate used in the method according to the invention consists of at least one rare earth salt complexed with a macropolycyclic compound of formula
  • said rare earth cryptate corresponds to formula (I) in which the molecular unit is chosen from phenanthroline, anthracene, benzene, naphthalene, bi- and ter-phenyl, azobenzene, azopyridine, pyridine, bipyridines, bisquinolines and compounds of the following formulas:
  • said rare earth cryptate consists of a rare earth salt complexed by one of the macrocyclic compounds below:
  • Such compounds are for example described in patent EP 180 492. It is also possible to use cryptop macropolycyclic compounds complexing rare earth ions in which the molecular unit is chosen. among bipyrazines, bipyrimidines and nitrogen heterocycles comprising N-oxide groups.
  • Macropoiycyclic compounds with bipyrazine units are described in F. Bodar-Houillon et al., New J. Chem., 1996, 20, 1041-1045.
  • Macropoiycyclic compounds with bipyrimidine units are described in J. M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1992, 75, 1221.
  • Macropoiycyclic compounds comprising nitrogen heterocycles comprising N-oxide groups are described in J.M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1991, 74, 572.
  • said rare earth cryptate consists of at least one rare earth salt complexed with a macropolycyclic compound corresponding to one of the formulas II or III below:
  • - Y is a group or a spacer arm which is constituted by a bivalent organic radical, chosen from linear or branched alkylene groups in d to C 20 optionally containing one or more double bonds and / or optionally containing by one or more heteroatoms such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s); from C 5 -C 8 cycloalkylene groups or from C 6 -C 1 arylene groups, said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted with alkyl, aryl or sulfonate groups;
  • - Z is a functional group capable of binding covalently with a biological substance;
  • - R is a methyl group or represents the group -YZ;
  • the rare earth cryptate used according to the invention is a europium, terbium, samarium, dysprosium or neodymium cryptate, europium cryptate being preferred.
  • said rare earth cryptate is the europium cryptate Eu trisbipyridine or Eu [bis-diethoxybipyridine.bipyridine].
  • ACN acetonitrile
  • BSA bovine serum albumin
  • TEA Ac Triethylammonium acetate containing 10% acetonitrile.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Example 1 Modification of the photophysical properties of a cryptate-triphosphate conjugate and measurement of the fluorescence lifetime: 1 °) Preparation of a cryptate-triphosphate conjugate
  • K-11-dUTP a conjugate consisting of a unit [Eu3 + (Trisbipyridine)] functionalized in position 4 of a bipyridine and coupled via a spacer arm in position 5 of a unit 2'-deoxynucleoside-5'- triphosphate this conjugate will be called K-11-dUTP.
  • the compound K-11-dUTP is prepared according to the following procedure:
  • the number 11 indicates the total number of atoms of the spacer arm and of the functional group which links the cryptate structure to the nucleotide (here, the bond is made at position 5 of the pyrimidine).
  • the nucleoside triphosphate used is 5- [N- (6-aminocaproyl) -3-aminoallyl] - 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate] (AH-dUTP) prepared by reaction of the N-hydroxysuccinimide trifluoroacetamido-caproate ( M. S Urdea et al., Nucleic acids Res., 1988, .4937) on 5- (3-aminoallyl) -2'-deoxyuridine-5'-triphosphate prepared according to a process in the literature (Langer et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
  • 600 ⁇ l of a K-dUTP solution at a concentration of 1.6 ⁇ 10 ⁇ 6 M in a 0.1 M Tris buffer, pH 9.0 containing 0, are introduced into the tank of an LS50 spectrofluorimeter (Perkin-Elmer). 1 M NaCI and 15mM MgCI 2 .
  • Fluorescence and lifetime measurements under similar conditions are carried out with a solution of K-11-dUTP at a concentration of 3.7.10 ' ⁇ M in the above buffer and then adding 1 ⁇ l of alkaline phosphatase diluted 1/10 th in 0.1 M Tris buffer pH 9.0, which corresponds to 10 enzymatic units.
  • Example 2 Modification of the photophysical properties of a cryptate-triphosphate conjugate and measurement of the fluorescence intensity in time resolved
  • a solution of K-11-dUTP prepared as indicated in example 1 is prepared at a concentration of 3.10 "6 M in a 0.1 M Tris buffer pH 9.0 containing 0.1 M NaCl and 15 mM MgCl2 - At the same time, prepares a KNH2 solution at a concentration of 3.10 "6 M in the same buffer.
  • Each solution is diluted to 1/500 th M in the same buffer and 200 ⁇ l of the diluted solution of K-11-dUTP are placed in 2 rows of 10 wells of a microplate with a dark background. In the same way, 200 ⁇ l of the diluted KNH2 solution are deposited in 2 other rows of 10 wells of the microplate.
  • the activated cryptate [TBP- (Eu3 +)] (NHS / DCC) in acetonitrile as described in Example 1, 1 °) above is prepared extemporaneously from Europium cryptate [(bis-bipy) - (bipy-diacid)] itself obtained from the europium cryptate [(bis-bipy) - (bipy-dimethylester)] described in Example 4, section A, of application EP 0 321 353.
  • the compound of Rt ⁇ 19 min is collected; this fraction is concentrated under vacuum (speed-vac) to a volume of approximately 300 ⁇ l.
  • This purified KAH-P04 solution contains 0.2 ⁇ mol of cryptate and will be used for photophysical measurements.
  • This fraction is analyzed on the same Superdex peptide column eluted with a 25 mM triethylammonium acetate buffer pH 7 containing 10% acetonitrile.
  • Co-injection with Europium cryptate [(bis-bipy) - (bipy-diacid)] shows that the latter migrates with an Rt ⁇ 23.7 min.
  • KAH-PO4 is analyzed by RP18-HPLC (Merck) in an acetonitrile gradient in a 1% aqueous TFA solution (15% isocratic ACN for 5 min, then a linear gradient from 15 to 100% ACN in 30 min).
  • RP18-HPLC Merck
  • Phosphates cleavage sequence Use the KAH-PO4 solution in the Tris buffer described above and then add 2 ⁇ l of a solution diluted to 1 / 100th of alkaline phosphatase (Boehringer) in Tris 0 buffer , 1 M pH 9.0 which corresponds to 2 enzymatic units.
  • the reaction mixture is then left for 16 h at 20 ° C. so that the enzymatic reaction is complete.
  • t 0.45 ms.
  • a modification of the photophysical properties is observed during the hydrolysis of the phosphate functions.
  • Example 4 Hydrolysis of a cryptate conjugate [trisbipyridine (Eu3 +) j> oligonucleotide by phosphatase / phosphodiesterase]
  • a 5 d (T 10 G 4 C AH G) 3 ′ oligodeoxynucleotide (ODN) modified near its 3 ′ end by an aminohexyl arm (AH) is synthesized on a solid support by the method called “phosphite-phosphoramidite” using a DNA synthesizer (Applied Biosystems type 392) according to the manufacturer's protocol.
  • a modified nucleotide is introduced by coupling onto a CPG support grafted with deoxyguanosine (Perkin Elmer / Applied Biosystems), of an N, N-diispropyl- ⁇ - cyanoethyl-phosphoramidite derivative obtained from 5'-O- ( 4,4'-dimethoxytrityl) -N-4- (6- Trifiuoracetamidohexyl) -2'-deoxycytidine prepared by trifluoroacetylation of 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -N-4- (6-Aminohexyl) -2'-deoxycytidine [ROGET et al.
  • the fractions corresponding to a majority peak are evaporated.
  • the partially deprotected oligonucleotide thus obtained is detitylated with 80% acetic acid (room temperature, 30 min)
  • the completely deprotected oligonucleotide is taken up in 50 ⁇ l of triethylammonium hydrogen carbonate (TEAB) 100 mM pH ⁇ 8 and precipitated with 1.5 ml of n-butanol.
  • TEAB triethylammonium hydrogen carbonate
  • the supernatant is removed and the vacuum-dried precipitate is taken up in 200 ⁇ l of water, this mother solution (oligonucleotide called AH-ODN1) is used for labeling with cryptate.
  • the activated cryptate [TBP- (Eu3 +)] (NHS / DCC) is prepared extemporaneously from Europium cryptate [(bis-bipy) - (bipy-diacid)] itself obtained from Europium cryptate [ (bis-bipy) - (bipy-dimethyiester)] described in Example 4, section A, of application EP 0 321 353.
  • the KH-ODN1 conjugate is analyzed by FPLC on a mono-Q column (Pharmacia) using the following conditions (buffer A: 20 mM sodium acetate pH 5 containing 10% acetonitrile. Buffer B: 20 mM sodium acetate pH 5 1M lithium chloride containing 10% acetonitrile Gradient: 0 to 2 min isocratic 20% B, 2 min to 30 min gradient from 20% B to 60% B, flow rate 1 ml / min).
  • the entire excluded fraction from the NAP10 column (200 ⁇ l) is then injected onto the mono-Q column, the fraction corresponding to the K-ODN1 conjugate is collected, concentrated to 300 ⁇ l and desalted on a NAP10 column balanced in a 25 mM TEAAc buffer pH 7 containing 10% acetonitrile. Eluted with the same buffer according to the manufacturer's protocol, the excluded fraction is collected in a volume of 1 ml.
  • This fraction corresponding to the pure KH-ODN1 conjugate is characterized by an ultraviolet spectrum having a maximum at 260 nm (component ODN) is a shoulder around 305 nm (cryptate component).
  • 100 ⁇ l of the diluted solution are placed in the wells of a microtiter plate.
  • 100 ⁇ l of buffer are added and in the following wells 100 ⁇ l of a dilution of uric acid prepared so that the final concentration of uric acid increases by a factor of 2 is added.
  • 100 ⁇ l of a dilution of uric acid prepared so that the final concentration of uric acid increases by a factor of 2 is added.
  • the fluorescence intensity is measured at 620 nm on a Discovery device, the results are shown in Table 4 below.
  • the quenching percentage compared to the control not containing uric acid is calculated by the following relationship:
  • Digestion of the oligonucleotide to give nucleosides is therefore accompanied by a variation in the photophysical properties of the cryptate and an increase in its sensitivity to quenching.
  • Example 5 Modifications of the photophysical properties of a cryptate [trisbipyridine (Eu3 +)] - oligonucleotide conjugate during a hybridization 1 °) Labeling of an AH-kras12M1 ODN by the cryptate.
  • oligonucleotide of sequence 5'-d ( AH C ACG CCA CTA GCT CC) 3 'modified at its 5' end by an aminohexyl arm (AH) synthesized on a solid support is used.
  • AH aminohexyl arm
  • an oligonucleotide labeled with the cryptate on the aminohexyl arm fixed in position 4 of the cytosine derivative located at the 5 ′ end is obtained [sequence 5 d (C KAH ACG CCA CTA GCT CC) 3 'called K-ODN2].
  • the oligonucleotide ODN3 of sequence 5 d (GGAGCTAGTGGCGT) is synthesized
  • a solution containing equivalent amounts of the oligonucleotide K-ODN2 and its complement is placed under denaturing conditions (95 ° C., 5 min) in a 0.1 M NaCl phosphate buffer, then hybridization is encouraged by incubating for 20 min. 30 ° C.
  • the fluorescence lifetime of the cryptate is measured in the case of the single-stranded oligonucleotide K-ODN2 as well as in the case of the hybridized oligonucleotide K-ODN2 on its complement.
  • the measurements are made in pH 7 phosphate buffer containing 0.1 M NaCl, at 20 ° C. on an LS50 device (Perkin Elmer).
  • the decay of a fluorescence signal makes it possible, from the measurements, to calculate the lifetime from the linear relationship which connects the logarithm of the intensities and the time.
  • the linearity of this relationship is estimated by calculating the correlation coefficient (least squares method) using the software supplied with the device.
  • a correlation coefficient greater than 0.999 reflects a monoexponential decrease and the presence of a population of homogeneous molecules as regards their lifespan, while a smaller coefficient generally denotes the coexistence of two different species in the environment.
  • Tm for the hybridization of K-ODN 2 on its complement under the conditions used here, as estimated by an empirical formula taking into account the length of the oligonucleotide, the NaCl concentration and the proportion in guanine and cytosine (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, 2 n edition 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ⁇ 11.46) is approximately 30 ° C.
  • the lifetime increases with temperature, the observed lifetime being the result of the value close to 1.20 ms observed for the single-stranded form and of the value close to 0.5 ms observed for the double strand (the value of the correlation coefficient indicates the presence of two species).
  • the oligonucleotides K-ODN2 and ODN3 are used, the structures and syntheses of which are described in Example 5.
  • a stock solution of the K-ODN2 conjugate is prepared. This mother solution is diluted in PBS buffer containing 0.1% BSA so as to obtain a solution containing approximately 1.5 ⁇ 10 -8 M of cryptate. At the same time, a mother solution of the hybrid K-ODN2 conjugate is prepared on its complement (ODN3). This mother solution is diluted in PBS buffer containing 0.1% BSA so as to obtain a solution also containing approximately l . ⁇ .lO "8 M of cryptate.
  • 100 ⁇ l of the diluted solution are deposited in the wells of a microtiter plate, in the first two wells 100 ⁇ l of the buffer are added and in the following wells 100 ⁇ i of a dilution of uric acid are deposited in the PBS buffer, prepared so that the final concentration of uric acid increases by a factor of 2 from one well to another according to Table 6 below.
  • the intensity of the fluorescence at 620 nm of the various wells is measured at room temperature (20 ° C) on a Discovery device (measurement in resolved time with a window of 50 to 400 ⁇ s). The results are reported in Table 6 below and the extinction is calculated relative to the control not containing uric acid.
  • the plate is then incubated for 15 min at 60 ° C. and a measurement of the fluorescence intensities at 620 nm of the various wells is immediately carried out at a temperature of 60 ° C. on a Discovery device (measurement in time resolved with a window of 50 to 400 ⁇ s). The results are reported in Table 7 below and the extinction is calculated relative to the control not containing uric acid.
  • N-Hvdroxysuc ⁇ nimide ester An N-hydroxysuccinimide ester is used, which has the advantage of spontaneously hydrolyzing in water at pH 7 with a sufficiently slow speed to facilitate the fluorescence measurements and allow kinetic monitoring of photophysical properties in a simple way
  • the cryptate thus obtained carrying two ester functions [K-di (NHS-Suberate)] is purified by preparative HPLC on a Lichrospher column (Merck) RP-18 (10 ⁇ ) 250-10 elution at 5 ml / min [Solvent A: 1% TFA in H 2 0; solvent B: Pure acetonitrile. Gradient from 15% B to 32% B in 30 min]. containing the pure ester is evaporated under vacuum then dried, an HPLC analysis (analytical conditions above) shows a retention time of 17.2 min.
  • the NHS ester [K-mono-NHS-Suberate)] is prepared, starting from a cryptate- [trisbipyridine (Eu 3+ )] mono-aminoethylcarboxamide derivative obtained by aminolysis in the presence of ethylenediamine Europium cryptate [(bis-bipy) - (bipy-monoethylester)] itself prepared by partial saponification (aqueous NaOH then RP-HPLC purification) of Europium cryptate [(bis-bipy) - (bipy-diethylester)] described in example 4, section A, of application EP 0 321 353.

Abstract

La présente invention concerne une méthode homogène de détection et/ou de détermination par fluorescence d'une interaction chimique ou physicochimique dans un milieu de mesure, dans laquelle on utilise un cryptate de terre rare comportant un substituant, caractérisée en ce qu'on mesure la variation d'au moins une caractéristique de fluorescence du cryptate de terre rare induite par la modification des propriétés physicochimiques du substituant résultant de ladite interaction.

Description

METHODE HOMOGENE DE DETECTION METTANT EN JEU UN CRYPTATE DE TERRE RARE
L'invention concerne une méthode homogène de détection et/ou de détermination par fluorescence d'une interaction chimique ou physicochimique dans un milieu de mesure, dans laquelle on utilise un cryptate de terre rare comportant un substituant, caractérisée en ce qu'on mesure la variation d'au moins une caractéristique de fluorescence du cryptate de terre rare induite par la modification des propriétés physicochimiques du substituant résultant de ladite interaction.
En biologie, il est intéressant de pouvoir mesurer ou étudier l'activité de différentes enzymes ou une interaction entre des biomolécules, qui sont des événements clefs dans la compréhension des phénomènes cellulaires et dans la recherche de nouvelles molécules ou principes actifs.
Des méthodes dites homogènes (permettant de mesurer l'activité ou la liaison sans isoler du milieu les biomolécules étudiées) sont particulièrement intéressantes car elles permettent une automatisation des processus d'étude ou de mesure.
Les méthodes utilisant la fluorescence sont particulièrement sensibles mais sont susceptibles d'être perturbées par les propriétés optiques du milieu.
Une méthode homogène utilisant les cryptâtes de terre rare est particulièrement intéressante mais nécessite l'utilisation de deux marqueurs (G. Mathis et ai., Clin. Chem., 1993, 39, 1251).
Dans la demande WO91/08490, on utilise astucieusement les différentes activités des enzymes à étudier pour apporter une modification chimique à une molécule substrat qui est capable, ou devient capable, de former un complexe en solution avec une terre rare. Cette méthode permet en principe de détecter en phase homogène plusieurs types d'activité enzymatiques. Dans la pratique, la formation in situ du complexe avec la terre rare (en présence du milieu biologique) est un handicap important car le milieu peut contenir des molécules qui vont entrer en compétition avec le substrat modifié pour former le complexe. Cette technique est surtout utilisée dans des dosages hétérogènes où l'on mesure l'activité d'une enzyme utilisée comme traceur (Elisa), lors de l'étude des propriétés photophysiques de différents cryptâtes et en particulier de cryptâtes portant sur des substituants fixés sur les motifs moléculaires donneurs. On a maintenant trouvé qu'une interaction chimique ou physicochimique susceptible de modifier un substituant lié à un cryptate de terre rare pouvait entraîner des modifications dans l'environnement de coordination de l'ion de terre rare et modifier par conséquent les propriétés phytophysiques du cryptate. L'objet de l'invention est donc d'utiliser ces modifications de l'environnement de coordination d'un ion de terre rare dans un cryptate pour détecter ou mesurer une activité enzymatique ou une interaction biologique en phase homogène.
Avantageusement, une telle méthode ne nécessite qu'un seul traceur fluorescent, à savoir le cryptate de terre rare. En particulier, ladite modification influe sur la sphère de solvation de l'ion terre rare.
Ladite caractéristique de fluorescence est par exemple choisie parmi la durée de vie d'émission, l'intensité de fluorescence, la répartition des raies dans le spectre de fluorescence et la polarisation. La variation mesurée dans la méthode selon l'invention peut par exemple être une augmentation ou une diminution de la durée de vie d'émission ou de l'intensité de fluorescence, et notamment être due à un agent induisant une exaltation ou une extinction de fluorescence.
Selon un aspect avantageux de la méthode selon l'invention, ledit substituant est chargé négativement ou acquiert une charge négative au cours d'un processus physicochimique.
Par « substituant », on entend dans la présente description aussi bien un groupement chimique tel que par exemple un groupe phosphate, phosphonate, carboxylate ou un de leurs dérivés, par exemple un dérivé ester ou amide, qu'une molécule chimique ou biologique comportant un tel groupe, telle que par exemple un acide nucléique, un oligonucléotide ou un oligonucléotide constitué de ou comprenant des analogues de nucléotides ; un nuciéotide ou un nucléoside et leurs analogues.
L 'interaction que l'on souhaite détecter peut par exemple résulter d'une réaction enzymatique, mettant en jeu notamment des enzymes telles que phosphatase, phosphodiesterase, esterase, exonuclease, déoxyribunocléase, ribonucléase, ligase, kinase ou polymérase.
Ladite interaction peut également, selon un autre aspect de l'invention, consister en une réaction d'hybridation ou de dénaturation d'acides nucléiques, d'oligonucléotides, ou d'oiigonucléotides constitués de ou comprenant des analogues de nucléotides ou en une réaction entre lesdits acides nucléiques ou oligonucléotides avec des protéines ayant une affinité pour ceux-ci.
On entend par « analogue » de nucléotides ou d'oligonuciéotides des molécules différentes des molécules naturelles correspondantes par modification de leur structure, tels que les isomères optiques (par exemple configuration α de la base par rapport au sucre), les isomères de position (par exemple enchaînements 2'-5' des ponts phosphate), ou par modification des substituants de la base (par exemple diaminopurine) ou du sucre (par exemple 3'-deoxyribose).
Ces oligonucléotides peuvent par exemple être constituées d'un enchaînement d'unités ribonucléotides ou désoxyribonucleotides ou d'unités analogues de nucléotides modifiées sur le sucre ou sur la base et liées entre elles par des liaisons intemucléotidiques naturelles de type phosphodiester, une partie des liaisons intemucléotidiques étant éventuellement remplacée par des liaisons phosphonate, phosphoramide ou phosphorothioate. Ces différentes familles d'oligonuciéotides sont décrites dans Goodchild, Bioconjugate Chetnistry, 1 (3),
May/June 1990, 77-99.
Ces oligonucléotides peuvent également être constitués d'un enchaînement comprenant à la fois des unités ribonucléotides ou désoxyribonucleotides liées entre elles par des liaisons de type phosphodiester et des unités analogues de nucleosides liées entre elles par des liaisons amides, communément dénommés
« PNA » (en anglais « peptide nucleic acid »), tel que décrit dans M. Egholm et al.,
J. Am. Chem. Soc, 1992, 114, 1895-1897 ; de tels composés sont par exemple décrits dans R. Vinayak et al., Nucleoside & Nucleotide, 1997, 16 (7-9), 1653-1656. La méthode selon l'invention permet notamment d'étudier, en temps réel, les aspects cinétiques d'une interaction entre molécules, par exemple l'hybridation, le fait d'utiliser un seul marqueur fluorescent en simplifiant considérablement la mise en œuvre.
Dans un aspect avantageux de l'invention, le milieu de mesure est un milieu biologique, en particulier un milieu sérique. Selon un aspect de l'invention, le cryptate de terre rare mis en œuvre dans la méthode selon l'invention peut être lié au substituant, de manière covalente, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras d'espacement.
Lorsque ledit substituant est un oligonucléotide, la liaison directe peut être réalisée sur un groupe fonctionnel préalablement introduit ou généré sur un ou plusieurs atomes d'une base ou d'une unité pentofuranose de l'oligonucléotide. Dans la présente description, on désigne par groupe fonctionnel toute fonction portée par la partie nucléotidique ou introduite sur cette partie par toute méthode connue par l'homme du métier et capable de se lier par liaison covalente, directement ou après activation avec une fonction présente sur le cryptate ou sur le bras espaceur porté par le cryptate. De tels groupes fonctionnels sont notamment les fonctions NH2, COOH, CHO, OH ou SH ainsi que les fonctions capables de donner des liaisons covaientes par substitution (halogénures, suifonates, époxyde) ou par addition (double liaisons type maléïmide). Ces fonctions sont généralement portées par une chaîne hydrocarbonée elle-même reliée à la partie nucléotidique. Des méthodes d'introduction de ces groupes fonctionnels sont notamment décrites dans C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2nd édition, L.J. Kricka (1995), Ed. Académie press Ltd., Londres, p. 66-72.Selon un aspect préféré de l'invention, le cryptate de terre rare est lié à l'oligonucleotide par l'intermédiaire d'un bras d'espacement . On entend par « bras d'espacement » tout moyen permettant de lier de façon covalente l'oligonucleotide avec le cryptate au niveau d'un phosphate terminal, d'un atome d'une base purique ou pyrimidique ou d'un atome du sucre.
Dans un aspect avantageux, ledit bras d'espacement est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C1-C2o, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons ou triples liaisons et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; les groupes cycloalkylène en C5-C8 et les groupes arylène en C6- Ci4, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate.
En particulier, le bras d'espacement est choisi parmi les groupes de formules :
Figure imgf000007_0001
dans lesquelles n = 2 à 6, et -CONH-(CH2)6-, la liaison via le groupe -CONH ayant lieu au niveau du cryptate.
Le cryptate de terre rare mis en œuvre dans la mathode selon l'invention est constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique de formule
Figure imgf000007_0002
dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarboné, les radicaux bivalents (§) , (§) et (δ) , sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux @ , (§) et © comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire, ledit motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé.
En particulier, ledit cryptate de terre rare répond à la formule (I) dans laquelle le motif moléculaire est choisi parmi la phénanthroline, l'anthracène, le benzène, le naphtalene, les bi- et ter-phényle, l'azobenzène, l'azopyridine, la pyridine, les bipyridines, les bisquinoléines et les composés de formules ci-après :
- C2H - Xi - CβH - X2 - C2H -
- C2H - Xi - CH? - CβH - CH2 - X - C2H - et X2 pouvant être identiques ou différents désignent l'oxygène, l'azote ou le soufre,
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000008_0003
Figure imgf000008_0004
X étant l'oxygène ou l'hydrogène. Avantageusement, ledit cryptate de terre rare est constitué d'un sel de terre rare complexé par l'un des composés macrocycliques ci-après :
(22)phénanthroline ; (22)phénanthroline amide ; (22)anthracène ;
(22)anthracène amide ; (22)bi-isoquinoléine ; (22)biphényl-bis-pyridine ;
(22)bipyridine ; (22)bi-pyridine amide ; les macropoiycycles tris-bipyridine, tris- phénanthroline, phénanthroline-bis-bipyridine, bi-isoquinoléine-bis-bipyridine, bis- bipyridine diphénylbipyridine.
De tels composés sont par exemple décrits dans le brevet EP 180 492. On peut également utiliser des composés macropolycycliques cryptâtes complexant des ions de terre rare dans lesquels le motif moléculaire est choisi parmi les bipyrazines, les bipyrimidines et les heterocycles azotés comportant des groupes N-oxydes.
Des composés macropoiycycliques à unités bipyrazines sont décrits dans F. Bodar-Houillon et al., New J. Chem., 1996, 20, 1041-1045.
Des composés macropoiycycliques à unités bipyrimidines sont décrits dans J. M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1992, 75, 1221.
Des composés macropoiycycliques comprenant des heterocycles azotés comportant des groupes N-oxydes sont décrits dans J.M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1991 , 74, 572.
Selon un autre aspect avantageux, ledit cryptate de terre rare est constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique répondant à l'une des formules II ou III ci-après :
Figure imgf000009_0001
dans lesquels : le cycle de formule
Figure imgf000010_0001
est l'un des cycles suivants
1 ) e [N2O ou cycle (22) e [N2O3] ou cycle (21 )
Figure imgf000010_0002
2) macrocycle bis-bipyridine
Figure imgf000010_0003
- Y est un groupe ou un bras d'espacement qui est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en d à C20 contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et/ou éventuellement contenant par un ou plusieurs hétéroatomes tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; parmi les groupes cycloalkylène en C5 à C8 ou parmi les groupes arylène en C6 à C1 , lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate ;
- Z est un groupe fonctionnel susceptible de se lier de façon covalente avec une substance biologique ; - R est un groupe méthyie ou représente le groupe -Y-Z ;
- R' est l'hydrogène ou un groupe -COOR" dans lequel R" est un groupe alkyle en Ci à Cι0 et représente de préférence le groupe méthyie, éthyle ou tertiobutyle ou bien R' est un groupe -CO-NH-Y-Z. Selon un aspect avantageux, le cryptate de terre rare utilisé selon l'invention est un cryptate d'europium, de terbium, de samarium, de dysprosium ou de neodymium, le cryptate d'europium étant préféré.
Dans un aspect avantageux, ledit cryptate de terre rare est le cryptate d'europium Eu trisbipyridine ou Eu [bis-diéthoxybipyridine.bipyridine]. L'invention est illustrée par les exemples ci-après, dans lesquels on utilisera les abréviations suivantes : ACN : acétonitrile BSA : sérum albumine bovine
NHS/DCC : N-hydroxysuccinimide/dicyciohexylcarbodiimide TEAB : hydrogénocarbonate de triéthylammonnium
TEA Ac : Acétate de triéthylammonium contenant 10 % d'acétonitrile. TFA : acide trifluoroacétique
UF : unité arbitraire de fluorescence (dépend de l'appareil utilisé pour la mesure)
Exemple 1 : Modification des propriétés photophysiques d'un conjugué cryptate-triphosphate et mesure de la durée de vie de fluorescence: 1 °) Préparation d'un conjugué cryptate-triphosphate
On utilise un conjugué constitué d'une unité [Eu3+ (Trisbipyridine)] fonctionnalisée en position 4 d'une bipyridine et couplé par l'intermédiaire d'un bras espaceur à la position 5 d'une unité 2'-déoxynucléoside-5'-triphosphate ce conjugué sera dénommé K-11-dUTP. Le composé K-11-dUTP est préparé selon la procédure suivante :
Dans ce conjugué, le chiffre 11 indique le nombre total d'atomes du bras espaceur et du groupement fonctionnel qui relie la structure cryptate au nucleotide (ici, la liaison se fait en position 5 de la pyrimidine).
Le nucléoside-triphosphate utilisé est le 5-[N-(6-aminocaproyl)-3-aminoallyl]- 2'-désoxyuridine-5'-triphosphate] (AH-dUTP) préparé par réaction du trifluoroacétamido-caproate de N-hydroxysuccinimide (M. S Urdea et al., Nucleic acids Res., 1988,.4937) sur le 5-(3-aminoallyl)-2'-désoxyuridine-5'-triphosphate préparé suivant un procédé de la littérature (Langer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981), 78, 6633-6637), suivi d'une déprotection ammoniacale (NH4OH aqueuse 3 %, 45 min à 60°C). Le composé est purifié sur DEAE-Sepharose ® (Pharmacia) dans un gradient linéaire d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (0,1 M a 0,3 M).
On dilue 68 μl d'une solution d'AH-dUTP à 6 μmoie/ml (soit 0,4 μmole) à 250 μl d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (TEAB) 0,1 M pH 7,8 et on ajoute 320 μl d'une solution de cryptate de N-hydroxysuccinimide (4 mg/ml dans l'acétonitrile) préparée comme suit. Le cryptate d'Europium [(bis-bpy)-(bpy-diester)] décrit dans l'exemple 4, section A, de la demande EP 0 321 353 est hydrolyse par NaOH et le cryptate diacide obtenu est purifié sur colonne RP-18 HPLC (gradient d'acétonitrile dans de l'acide trifluoroacétique à 1% dans l'eau). Le cryptate d'Europium [(bis-bpy)-(bpy-diacide)] ainsi obtenu (4mg) est dissout dans 0,5 ml d'acétonitrile anhydre et on ajoute 1 mg de N-hydroxysuccinimide, puis une solution de 1 ,9 mg de dicyclohexylcarbodiimide dissout dans 0,5 ml d'acétonitrile. Après 16 h de réaction, le précipité de dicyclohexylurée est filtré et la solution de cryptate de N-hydroxysuccinimide est utilisée directement pour le couplage.
Après 45 min sous agitation, on ajoute 15 μl de TEAB 1 M pH 8,5 puis on injecte le mélange sur une colonne Superdex 30 ® HR 10/30 (Pharmacia) en éluant par du TEAB 0,05M pH 7 contenant 10 % d'acétonitrile (débit 1 ml/min).
On collecte le composé de Rt =16,4 mn, puis cette fraction dénommée fraction 1 est concentrée sous vide (speed-vac) jusqu'à un volume de 350 μl et contient 8 UA304 nm. En estimant un £304 = 35000, on estime que la concentration en K-dUTP est d'environ 0,72 mM. Une aliquote (90 μl) de cette fraction 1 est injectée sur la même colonne éluée par un tampon triéthylammonium acétate 25 mM pH 7 contenant 5 % d'acétonitrile.
La fraction correspondant au seul pic du chromatogramme est collectée (16 min <
Rt < 19 min) et concentrée sous vide (speed-vac). On obtient 150 μl d'une solution de K-dUTP dénommée fraction 2 contenant 1 ,95 UA304 nm. Le composé est analysé en spectrométrie de masse (électrospray mode positif) :
(M-2H)+ = 1431
(M-2H+CH3COOH)+ = 1491. Le spectre UV dans l'eau présente un maximum à 241 nm caractéristique de la partie nuciéosidique de la molécule fλmax = 289 nm, ε = 7100, λmax = 240 nm ε = 10700) et un maximum à 304 nm proche du λmax de 305 nm (ε = 30000) caractéristique du cryptate d'Europium. On observe un rapport A304/A24i = 0,83 compatible avec la structure proposée.
2°) Mesure de la cinétique d'hydrolyse d'un cryptate-triphosphate rtrisbipyridine
(Eu .3+\ )-11-dUTPl par la phosphatase alcaline par mesure de durée de vie :
On introduit dans la cuve d'un spectrofluorimètre LS50 (Perkin-Elmer) 600 μl d'une solution de K-dUTP à une concentration de 1.6.10'6 M dans un tampon Tris 0,1 M pH 9,0 contenant 0,1 M NaCI et 15mM MgCI2.
On mesure l'intensité de fluorescence à 620 nm ainsi que la durée de vie de fluorescence [réglage du spectrofluorimètre : λexcitation=305 nm, λémission≈ 550 à 750 nm, mode phosphorescence 0,1 ms à 0,4 ms fente excitation=10 nm, fente émission=10 nm] qui donne la valeur initiale ( t = 0).
On ajoute 2 μl d'une solution diluée au 1/100 ème de phosphatase alcaline (Boehringer) dans du tampon Tris 0,1 M pH 9,0, ce qui correspond à 2 unités enzymatiques. Après des temps de 15 min, 30 min, 60 min et 80 min on mesure dans les mêmes conditions que ci-dessus l'intensité de fluorescence à 620 nm (spectre de fluorescence) ainsi que la durée de vie de l'Europium pour les temps 30 min, 60 min et 80 min.
Les valeurs observées sont rapportées dans le tableau 1 suivant.
TABLEAU 1
Figure imgf000013_0001
Des mesures de fluorescences et de durées de vie dans des conditions semblables sont réalisées avec une solution de K-11-dUTP à une concentration de 3,7.10'^M dans le tampon ci-dessus puis on ajoute 1 μl de phosphatase alcaline diluée au 1/10 ème dans tampon Tris 0,1 M pH 9,0, ce qui correspond à 10 unités enzymatiques.
Avant l'ajout de l'enzyme, on observe une durée de vie de 0,61 ms ; après l'ajout de l'enzyme, on observe que la durée de vie diminue très rapidement et se stabilise pour donner une valeur finale de 0,41 ms.
A titre de référence, on mesure le spectre et la durée de vie d'un cryptate [Eu3+ (tris-bipyridine] fonctionnalisé simplement par un bras espaceur, dénommé ci-après KNH2. On observe que la durée de vie du KNH2 dans le tampon Tris 0,1 M pH 9,0 est de 0,39 ms.
Les graphes des cinétiques de l'intensité de fluorescence et de la durée de vie sont représentés respectivement sur les figures 1 et 2.
On observe donc que l'hydrolyse enzymatique de la chaine triphosphate pour donner du phosphore inorganique s'accompagne d'une diminution de l'intensité de fluorescence et d'une diminution de la durée de vie. La cinétique de décroissance de la durée de vie (qui est indépendante de la concentration en composé fluorescent) est fonction de l'activité enzymatique ; elle est plus rapide si on augmente le nombre d'unités enzymatiques introduites.
La valeur finale de la durée de vie t = 0,41 ms après hydrolyse du K-dUTP tend vers la valeur de 0,39 ms observée pour le cryptate non conjugué.
L'hydrolyse des groupes phosphate change donc l'environnement du cryptate d'Europium et modifie ses propriétés photophysiques.
Exemple 2 : Modification des propriétés photophysiques d'un conjugué cryptate-triphosphate et mesure de l'intensité de fluorescence en temps résolu
On prépare une solution de K-11-dUTP préparée comme indiqué dans l'exemple 1 à une concentration 3.10"6 M dans un tampon Tris 0,1 M pH 9,0 contenant 0,1 M NaCI et 15mM MgCl2- Parallèlement, on prépare une solution de KNH2 à une concentration de 3.10"6 M dans le même tampon. Chaque solution est diluée au 1/500 ème M dans le même tampon et on dépose 200 μl de la solution diluée de K-11-dUTP dans 2 rangées de 10 puits d'une microplaque à fond noir. De la même façon on dépose 200 μl de la solution diluée de KNH2 dans 2 autres rangées de 10 puits de la microplaque. On fait une lecture de la fluorescence à 620 nm (en utilisant une fenêtre de 50 à 400 μs) sur les différents puits grâce à un fluorimètre en temps résolu (Discovery) pour avoir les valeurs de fluorescence à to = 0.
On ajoute 2 μl de tampon dans chacun des puits d'une rangée contenant le K-11-dUTP (dénommée KTP-T) et d'une rangée contant le KNH2 (dénommée K-T), on ajoute 2 μl d'une solution de phosphatase alcaline diluée au 1/100 ème (voir exemple 1 ) dans chacun des puits de l'autre rangée contenant le K-dUTP (dénommée KTP-E) et de l'autre rangée contant le KNH2 (dénommée K-E). On fait les moyennes des valeurs de fluorescence de chaque rangée.
On effectue les mesures à 620 nm au bout de 10 min, 35 min et 70 min. On mesure le rapport (Ft/Frj) de la fluorescence (Ft) au temps t sur la fluorescence (FQ) à t0.
Les résultats sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous.
TABLEAU 2
Figure imgf000015_0001
Les résultats montrent qu'en présence de l'enzyme, l'intensité de la fluorescence à 620nm décroît au cours du temps. Cette évolution s'effectue à une vitesse comparable à ce qu'on peut attendre pour l'hydrolyse enzymatique des groupes phosphates d'un nucléoside triphosphate dans les conditions expérimentales choisies.
Par ailleurs, on observe que la fluorescence dans les puits KNH2 avec enzyme (K-E) est à la même intensité que dans les puits KNH2 témoins (K-T) sans enzyme et que dans les deux cas la fluorescence ne varie très peu au cours du temps, ce qui montre que le cryptate par lui-même n'est pas modifié par la présence de l'enzyme. Ces résultats confirment que l'hydrolyse de la chaîne phosphate du K-11-dUTP provoque une modification des propriétés photophysiques du cryptate de terre rare.
Exemple 3 : Préparation du cryptate [trisbipyridine(Eu3+)-aminohexylphosphate
1°) Préparation d'un conjugué cryptate rtrisbipyridine(Eu3+)-aminohexyl- phosohate (KAH-PO4):
On dissout 2mg (10μmol) d'aminohexylephosphate (Sigma) dans 100 μl d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (TEAB) 0,1 M pH 7,8 et on ajoute 100 μl d'une solution de cryptate [TBP-(Eu3+)] activé (4 mg/ml dans l'acétonitrile) soit 0,26 μmol. Le cryptate [TBP-(Eu3+)] activé (NHS /DCC) dans l'acétonitrile comme décrit dans l'exemple 1 , 1°) ci-dessus est préparée extemporanément à partir de cryptate d'Europium [(bis-bipy)-(bipy-diacide)] lui-même obtenu à partir du cryptate d'Europium [(bis-bipy)-(bipy-dimethylester)] décrit dans l'exemple 4, section A, de la demande EP 0 321 353.
Après 15 min sous agitation on concentre au demi, puis injecte le mélange sur une colonne Superdex peptide HR 10/30 (Pharmacia) en éluant par du TEAAc 25mM pH9 contenant 10% d'acétonitrile (débit 1 ml/min).
On collecte le composé de Rt ≡19 min ; cette fraction est concentrée sous vide (speed-vac) jusqu'à un volume de 300 μl environ. Cette solution de KAH-P04 purifié contient 0,2 μmole de cryptate et servira aux mesures photophysiques. Cette fraction est analysée sur la même colonne Superdex peptide éiuée par un tampon triéthylammonium acétate 25 mM pH 7 contenant 10% d'acétonitrile. On observe un seul pic de Rt ≡ 20 min . La co-injection avec le cryptate d'Europium [(bis-bipy)-(bipy- diacide)] montre que ce dernier migre avec un Rt ≈ 23,7 min. De même on analyse le KAH-PO4 par RP18-HPLC (Merck) dans un gradient d'acétonitrile dans une solution aqueuse de TFA à 1% (ACN 15% isocratique pendant 5mn, puis gradient linéaire de 15 à 100 % d'ACN en 30 min). On observe un pic à Rt ≡ 16,6 min différent du cryptate d'Europium [(bis-bipy)-(bipy-diacide)] qui migre avec un Rt ≡15,9 min.
2°) Propriétés photophysiques du conjugué KAH-PO4 :
A partir de la solution aqueuse du KAH-PO4 préparé comme ci-dessus, on prépare une solution diluée à 1 ,5.10'5 M de KAH-PO4 dans un tampon Tris 0,1 M pH 9,0 contenant 0,1 M NaCI et 15mM MgC^. On mesure l'intensité de fluorescence à 620nm ainsi que la durée de vie de fluorescence [réglage du spectrofluorimètre : λexcitation=305 nm, λémission≈ 550 à 750 nm, mode phosphorescence 0,1 ms à 0,4 ms fente excitation=10 nm, fente émission=10 nm] qui donne la valeur initiale ( t = 0). On observe une durée de vie t = 0,637 ms.
On note que dans les mêmes conditions le cryptate d'Europium [(bis-bipy)- (bipy-diacide)] présente une durée de vie t = 0,21 ms.
3°) Cinétigue de coupure des phosphates : On utilise la solution de KAH-PO4 dans le tampon Tris décrite ci-dessus et on ajoute alors 2μl d'une solution diluée au 1/100ème de phosphatase alcaline (Boehringer) dans du tampon Tris 0,1 M pH 9,0 ce qui correspond à 2 unités enzymatiques.
On effectue les mesures d'intensité de fluorescence et de durée de vie aux temps indiqués dans le tableau 3 ci-dessous :
TABLEAU 3
Figure imgf000017_0001
On laisse ensuite le mélange réactionnel 16h à 20°C pour que la réaction enzymatique soit totale. On observe alors une durée de vie t = 0,45 ms. On observe une modifications des propriétés photophysiques au cours de l'hydrolyse des fonctions phosphate. Au cours de la réaction, la durée de vie tend à se rapprocher de la valeur de durée de vie (t = 0,39 ms)observée pour KNH2 dans le même milieu.
Exemple 4 : Hydrolyse d'un conjugué cryptate [trisbipyridine(Eu3+)j> oligonucléotide par phosphatase / phosphodiesterase]
1 °) Marquage d'un oligodésoxynucléotide par un cryptate :
Un oiigodésoxynucléotide (ODN)de 5d(T10 G4 CAH G)3' modifié près de son extrémité 3' par un bras aminohexyl (AH) est synthétisé sur support solide par la méthode dénommée « phosphite-phosphoramidite » en utilisant un synthétiseur d'ADN (Applied Biosystems type 392) selon le protocole du fabriquant. Un nucleotide modifié est introduit par couplage sur un support CPG greffé avec de la désoxyguanosine (Perkin Elmer /Applied Biosystems) , d'un dérivé N,N-diispropyl-β- cyanoethyl-phosphoramidite obtenu à partir de la 5'-O-(4,4'-diméthoxytrityl)-N-4-(6- Trifiuoracétamidohexyl)-2'-désoxycytidine préparée par trifluoracétylation de la 5'-O- (4,4'-diméthoxytrityl)-N-4-(6-Aminohexyl)-2'-désoxycytidine [ROGET et al. Nucleic Acids Res., 17, 7643-7650, (1989)].On continue ensuite la synthèse de la séquence ci-dessus, à l'issue de la synthèse sur un synthétiseur d'ADN en mode "trityl-on", l'oligonucleotide est est traité par l'ammoniaque concentrée (16h à 55°C) et purifié par HPLC sur une colonne LiChrospher® RP-18E 250-10 (10μm) (Merck, Allemagne) par un gradient d'acétonitrile dans l'acétate de triéthylammonium 50 mM (tampon A: 5% acétonitrile, tampon B: 50% acétonitriie; débit 5ml/min, gradient de 10% B à 60% B en 20 min, isocratique 60% B pendant 5 min, puis gradient de 60% B à 100% B en 5 min) (Oligonucléotide synthesis : A practical approach. Ed M.J. Gait. IRL Press, Oxford) les fractions correspondant à un pic majoritaire (temps de rétention supérieur à 20 min) sont évaporées. Après évaporation et co-évaporation avec de l'eau, l'oligonucleotide partiellement déprotégé ainsi obtenu est détritylé par l'acide acétique à 80% (température ambiante, 30 min), après évaporation et coévaporation, l'oligonucleotide complètement déprotégé est repris dans 50μl de l'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (TEAB) 100mM pH~8 et précipité par 1,5 ml de n-butanol. Après centrifugation le surnageant est éliminé et le précipité séché sous vide est repris par 200 μl d'eau, cette solution mère (oligonucléotide dénommé AH-ODN1) est utilisé pour le marquage au cryptate.
2°) Couplage d'une molécule de cryptate rTBP-(Eu3+)1sur un oligodésoxynucléotide fonctionnalisé par un bras aminohexyl (AH-ODN1V
Une partie aliquote de la solution mère de l'oligonucleotide obtenu ci-dessus est diluée par 150μl d'une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (TEAB) 0,1 M pH 7,8 et on ajoute 60 μl d'une solution de cryptate [TBP-(Eu3+)] activé (4 mg/ml) soit 171 nmol (environ 4 équivalents). Le cryptate [TBP-(Eu3+)] activé (NHS /DCC) est préparée extemporanement à partir de cryptate d'Europium [(bis-bipy)-(bipy-diacide)]lui-même obtenu à partir du cryptate d'Europium [(bis-bipy)-(bipy-dimethyiester)] décrit dans l'exemple 4, section A, de la demande EP 0 321 353.
Après 30 min sous agitation on ajoute 15 μl de TEAB 1M pH 8,5 puis évapore sous vide (speed-vac) jusqu'à un volume de 200 μl, on dépose sur une colonne NAP10 (Pharmacia) équilibrée dans un tampon TEAAc 25 mM pH7 contenant 10% d'acétonitrile, on élue par le même tampon selon le protocole du fabriquant, la fraction exclue est collectée dans un volume de 1 ml et cette fraction est concentrée (speed-vac) jusqu'à un volume de 200 μl.
3°) Purification du conjugué formé d'un cryptate rTBP-(Eu3+)1 et d'un oligodésoxynucléotide fonctionnalisé par un bras aminohexyl (Conjugué KH-ODN1) :
Le conjugué KH-ODN1 est analysé par FPLC sur une colonne mono-Q (Pharmacia)en utilisant les conditions suivantes (tampon A : sodium acétate 20 mM pH 5 contenant 10% d'acétonitrile. tampon B : acétate de sodium 20 mM pH 5 chlorure de lithium 1M contenant 10% d'acétonitrile. Gradient : 0 à 2 min isocratique 20% B, 2 min à 30 min gradient de 20% B à 60% B, débit 1 ml/min).
On injecte ensuite la totalité de la fraction exclue provenant de la colonne NAP10 (200 μl) sur la colonne mono-Q, la fraction correspondant au conjugué K-ODN1 est collectée, concentrée jusqu'à 300μl et dessalée sur une colonne NAP10 équilibrée dans un tampon TEAAc 25 mM pH 7 contenant 10% d'acétonitrile. On élue par le même tampon selon le protocole du fabriquant, la fraction exclue est collectée dans un volume de 1ml. Cette fraction correspondant au conjugué KH-ODN1 pur est caractérisé par un spectre ultra-violet présentant un maximum à 260 nm (composante ODN) est un épaulement vers 305 nm (composante cryptate). On obtient ainsi un oligonucléotide marqué par le cryptate sur le bras aminohexyl fixé en position 4 de la cytosine proche de l'extrémité 3' [séquence 5-d(T10G4CKAH G)3'dénommé K-ODN1].
4°) On utilise une solution mère du conjugué K- ODN1 , cette solution mère est diluée dans du tampon PBS contenant 0,1% BSA.
On dépose 100 μl de la solution diluée dans les puits d'une plaque de microtitration. Dans les deux premiers puits, on ajoute 100 μl du tampon et dans les puits suivants on dépose 100 μl d'une dilution d'acide urique préparée de façon à ce que la concentration finale d'acide urique augmente d'un facteur 2 d'un puits à l'autre selon le tableau 4 ci-dessous.
On mesure l'intensité de fluorescence à 620 nm sur un appareil Discovery, on porte les résultats dans le tableau 4 suivant. On calcule le pourcentage d'extinction (quenching) par rapport au témoin ne contenant pas d'acide urique par la relation suivante :
100-100[E520 (ac. urique / Es20 (standard 0)]
TABLEAU 4
Figure imgf000020_0001
On effectue la même série de mesure après des temps d'incubation croissants (indiqués en heures) et de la même façon on mesure l'extinction (%) en fonction de la concentration en acide urique. Les résultats sont regroupés dans le tableau 5 ci-dessous.
TABLEAU 5
Figure imgf000021_0001
Les résultats montrent que pour une concentration donnée d'acide urique
(50mg/l) qui provoque une extinction faible de la fluorescence du cryptate lorsqu'il est couplé à l'oligonucleotide (environ 20%), on observe au cours du temps une augmentation de l'extinction jusqu'à environ 75% à un temps correspondant à une digestion complète de l'oligonucleotide.
La digestion de l'oligonucleotide pour donner des nucleosides s'accompagne donc d'une variation des propriétés photophysiques du cryptate et une augmentation de sa sensibilité au quenching.
Ces résultats montrent la possibilité de suivre le déroulement d'une réaction par l'évolution des propriétés photophysiques (comme l'extinction) d'un marqueur fluorescent en présence d'un agent d'extinction introduit dans le milieu réactionnel.
Exemple 5 : Modifications des propriétés photophysiques d'un conjugué cryptate [trisbipyridine(Eu3+)]-oligonucléotide au cours d'une hybridation 1°) Marquage d'un ODN AH-kras12M1 par le cryptate.
On utilise un oligonucléotide de séquence 5'-d(AHC ACG CCA CTA GCT CC)3' modifié en son extrémité 5' par un bras aminohexyl (AH) synthétisé sur support solide. En suivant le protocole de marquage de l'exemple 4, on obtient dans ce cas un oligonucléotide marqué par le cryptate sur le bras aminohexyl fixé en position 4 du dérivé de la cytosine situé à l'extrémité 5' [séquence 5d(CKAH ACG CCA CTA GCT CC)3' dénommée K-ODN2]. 2°) On synthétise l'oligonucleotide ODN3 de séquence 5d(GGAGCTAGTGGCGT)
3' , complémentaire à la séquence K-ODN2 décrite ci-dessus.
3°) Comparaison de la durée de vie d'un conjugué oligonucléotide cryptate sous une forme simple brin et sous une forme double brin :
On place en conditions dénaturantes ( 95 °C, 5 min) une solution contenant des quantité équivalentes de l'oligonucleotide K-ODN2 et son complémentaire dans un tampon phosphate 0,1 M NaCI , puis on favorise l'hybridation en incubant 20 min à 30°C.
On mesure la durée de vie de fluorescence du cryptate dans le cas de l'oligonucleotide simple brin K-ODN2 ainsi que dans le cas de l'oligonucleotide K-ODN2 hybride sur son complémentaire. Les mesures sont faites dans du tampon phosphate pH 7 contenant 0,1 M NaCI, à 20°C sur un appareil LS50 (Perkin Elmer).
Sur l'appareil LS50, la décroissance d'un signal de fluorescence (mesure en temps résolu) permet à partir des mesures de calculer la durée de vie à partir de la relation linéaire qui relie le logarithme des intensités et le temps. La linéarité de cette relation est estimée par le calcul du coefficient de corrélation (méthode des moindres carrés) à l'aide du logiciel fournit avec l'appareil.
Un coefficient de corrélation supérieur à 0,999 traduit une décroissance monoexponentielle et la présence d'une population de molécules homogènes quant à leur durée de vie, alors qu'un coefficient plus petit dénote généralement la coexistence de deux espèces différentes dans le milieu. On observe le résultat suivant :
Figure imgf000022_0001
Après 15 min à 60°C, c'est à dire au dessus du Tm (température de fusion caractéristique d'un acide nucléique = la température pour laquelle la moitié des molécules sont sous la forme appariée avec leur séquence complémentaire), on observe les résultats suivants :
Figure imgf000023_0001
La valeur de Tm pour l'hybridation de K-ODN2 sur son complémentaire dans les conditions utilisées ici, telle qu'estimée par une formule empirique tenant compte de la longueur de l'oligonucleotide, de la concentration en NaCI et de la proportion en guanine et cytosine (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, 2n édition 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, § 11.46) est d'environ 30°C.
Après retour aux conditions initiales (favorables à l'hybridation), on observe les résultats suivants :
Figure imgf000023_0002
On observe que, dans le cas de l'oligonucleotide K-ODN2 simple brin, la durée de vie est toujours plus élevée que dans le cas de K-ODN2 sous la forme double brin.
Dans le cas de K-ODN2 sous la forme double brin, la durée de vie augmente avec la température, la durée de vie observée étant la résultante de la valeur proche de 1 ,20 ms observée pour la forme monobrin et de la valeur proche de 0,5 ms observée pour le double brin (la valeur du coefficient de corrélation indique la présence de deux espèces). Après un cycle de dénaturation, un retour aux condition favorables à l'hybridation permet d'observer une diminution de la durée de la forme double brin.
Exemple 6 : Modifications de la sensibilité à l'extinction d'un conjugué cryptate [trisbipyridine(Eu3+)]-oligonucléotide au cours d'une hybridation
On utilise les oligonucléotides K-ODN2 et ODN3 dont les structures et les synthèses sont décrites dans l'exemple 5.
On prépare une solution mère du conjugué K- ODN2. Cette solution mère est diluée dans du tampon PBS contenant 0,1% BSA de façon à obtenir une solution contenant environ 1 ,5.10'8 M de cryptate. Parallèlement, on prépare une solution mère du conjugué K- ODN2 hybride sur son complémentaire (ODN3). Cette solution mère est diluée dans du tampon PBS contenant 0,1 % BSA de façon à obtenir une solution contenant également environ l .δ.lO"8 M de cryptate.
On dépose 100 μl de la solution diluée dans les puits d'une plaque de microtitration, dans les deux premiers puits on ajoute 100μl du tampon et dans les puits suivants on dépose 100 μi d'une dilution d'acide urique dans le tampon PBS, préparée de façon à ce que la concentration finale d'acide urique augmente d'un facteur 2 d'un puits à l'autre selon le tableau 6 ci-dessous.
On mesure l'intensité de la fluorescence à 620 nm des différents puits à température ambiante (20°C) sur un appareil Discovery (mesure en temps résolu avec une fenêtre de 50 à 400 μs). Les résultats sont rapportés dans le tableau 6 suivant et on calcule l'extinction par rapport au témoin ne contenant pas d'acide urique.
TABLEAU 6
Figure imgf000025_0001
On incube ensuite la plaque pendant 15 min à 60°C et on effectue immédiatement une mesure des intensités de fluorescence à 620nm des différents puits à la température de 60°C sur un appareil Discovery (mesure en temps résolu avec une fenêtre de 50 à 400 μs). Les résultats sont rapportés dans le tableau 7 suivant et on calcule l'extinction par rapport au témoin ne contenant pas d'acide urique.
TABLEAU 7
Figure imgf000026_0001
Ces résultats confirment que la sensibilité du cryptate vis à vis du phénomène d'extinction est différente pour un conjugué cryptate-oligonucleotide lorsque celui ci est sous la forme double brin ou simple brin L'acide urique est un agent d'extinction spécifique de la forme double brin
On peut ainsi suivre le phénomène d'hybridation par mesure de la fluorescence en temps résolu en présence d'un composé permettant une extinction sélective de l'espèce hybπdée
Exemple 7 : Modification des propriétés photophysiques au cours de l'hydrolyse de fonctions esters :
1 °) Préparation de l'ester de N-Hvdroxysucαnimide On utilise un ester de N-hydroxysuccinimide qui présente l'avantage de s'hydrolyser spontanément dans l'eau à un pH 7 avec une vitesse suffisamment lente pour faciliter les mesures de fluorescence et permettre de faire un suivi cinétique des propriétés photophysiques de façon simple
On utilise un dénvé cryptate-[trιsbιpyπdιne(Eu3+)]-bιs-amιnoéthylcarboxamιde (produit dénommé KNH2 dans l'exemple 1) obtenu par aminolyse en présence d'éthylènediamine du cryptate d'Europium [(bis-bipy)-(bipy-diéthylester)] décrit dans l'exemple 4, section A, de la demande EP 0 321 353 (Mathis G. et Lehn J.M.).
On fait réagir ce cryptate sur un excès de DSS (ester bis(N- hydroxysuccinimide de l'acide subérique, Sigma). Le dérivé KNH2 caractérisé en HPLC par un Rt de 12,3 min est transformé en ester de NHS [K-di(NHS-Suberate)] montrant un Rt de 17,2 min [conditions HPLC analytique colonne Lichrospher (Merck) RP-18 (5 μ) 125-4 élution à 1 ml/mn Solvant A : 1 % TFA dans H2O ; solvant B : Acétonitrile pur. Gradient de 15 % B à 32 % B en 30 min]. Le cryptate ainsi obtenu portant deux fonctions ester [K-di(NHS-Suberate)] est purifié par HPLC préparative sur une colonne Lichrospher (Merck) RP-18 (10 μ) 250-10 élution à 5 ml/mn [Solvant A : 1 % TFA dans H20 ; solvant B : Acétonitrile pur. Gradient de 15 % B à 32 % B en 30 min]. La fraction contenant l'ester pur est évaporée sous vide puis séché, une analyse HPLC (conditions analytiques ci- dessus) montre un temps de rétention de 17,2 min.
De façon analogue, on prépare l'ester de NHS [K-mono-NHS-Suberate)], en partant d'un dérivé cryptate-[trisbipyridine(Eu3+)]mono-aminoéthylcarboxamide obtenu par aminolyse en présence d(éthylènediamine du cryptate d'Europium [(bis- bipy)-(bipy-monoéthylester)] lui même préparé par saponification partielle (NaOH aqueux puis purification RP-HPLC) du cryptate d'Europium [(bis-bipy)-(bipy- diéthylester)] décrit dans l'exemple 4, section A, de la demande EP 0 321 353.
Cet ester est purifié par RP-HPLC préparative (conditions ci-dessus), la fraction contenant le mono-ester pur (Rt=15,6 min) est rapidement évaporée sous vide. Ce monoester sera utilisé pour l'étude de la modification des propriétés de fluorescence au cours de l'hydrolyse.
Par analyse HPLC dans le gradient ci-dessus, on observe qu'en solution aqueuse ou en solution tamponnée pH 7, le diester se convertit en dérivé monoacide de Rt 16,0 min puis en dérivé diacide de Rt 14,8 min. Dans l'eau, on observe une hydrolyse de plus de 50 % en 3 h. Par analyse HPLC dans le gradient ci-dessus, on observe qu'en solution aqueuse ou en solution tamponnée pH7, le mono-ester de Rt 15,6 se convertit en dérivé acide de Rt 14,2 mn. Dans l'eau, on observe une hydrolyse de plus de 50 % en 3 h. 2°) Modification des spectres de fluorescence au cours de l'hydrolyse d'un ester de N-hvdroxysuccinimide de crvptate-ftrisbipyridine(Eu3*)l :
On enregistre les spectres d'émission de fluorescence et la durée de vie de fluorescence de cryptate K-NHS-Suberate en solution aqueuse, en effectuant une mesure juste après la dilution puis après 20 h. Dans les mêmes conditions, on enregistre les spectres d'une solution de KNH2 servant de référence (solution de concentration équivalente). On vérifie que l'intensité de la fluorescence émise à 620 nm de cette référence ne varie pas de plus de 2 % en 20 h et que la durée de vie n'est pas modifiée (variation < 0,3 %). Les résultats sont reportés dans le tableau 7 suivant :
TABLEAU 7
Figure imgf000028_0001
On observe qu'au cours de l'hydrolyse de la fonction ester les propriétés photophysiques tel que l'intensité d'émission ou la durée de vie de fluorescence sont modifiées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode homogène de détection et/ou de détermination par fluorescence d'une interaction chimique ou physicochimique dans un milieu de mesure, dans laquelle on utilise un cryptate de terre rare comportant un substituant, caractérisée en ce qu'on mesure la variation d'au moins une caractéristique de fluorescence du cryptate de terre rare induite par la modification des propriétés physicochimiques du substituant résultant de ladite interaction.
2. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ladite modification influe sur la sphère de solvatation de l'ion terre rare.
3. Méthode selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la caractéristique de fluorescence est choisie parmi la durée de vie d'émission, l'intensité de fluorescence, la répartition des raies dans le spectre de fluorescence et la polarisation. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la variation est une augmentation ou une diminution de la durée de vie d'émission ou de l'intensité de fluorescence.
5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que la variation est due à un agent induisant une exaltation ou une extinction de fluorescence. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit substituant est chargé négativement ou acquiert une charge négative au cours d'un processus physicochimique.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit substituant est un groupe phosphate, phosphonate , carboxylate ou un de leurs dérivés, ou une molécule chimique ou biologique comportant ce groupe.
8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite molécule est un acide nucléique , un oligonucléotide ou un oligonucléotide constitué de ou comprenant des analogues de nucléotides ; un nucleotide ou un nucléoside et leurs analogues. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ladite interaction résulte d'une réaction enzymatique.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ladite interaction consiste en une réaction d'hybridation ou de dénaturation d'acides nucléiques, d'oligonuciéotides ou d'oligonuciéotides constitues de ou comprenant des analogues de nucléotides ou en une réaction entre lesdits acides nucléiques ou oligonucléotides avec des protéines ayant une affinité pour ceux-ci
11 Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 a 10, caractérisée en ce que le cryptate de terre rare est lié au substituant de manière covalente, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras d'espacement
12 Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisée en ce que ledit cryptate de terre rare est constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique de formule
Figure imgf000030_0001
dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarbone, les radicaux bivalents @ , (§) et (2) , sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs heteroatomes et sont éventuellement interrompues par un heteromacrocycle, au moins l'un des radicaux © , (§) et (C) comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire, ledit motif moléculaire possédant une énergie de tπplet supérieure a celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé 13 Méthode selon la revendications 12, caractérisée en ce que le cryptate de terre rare est constitué d'un sel de terre rare complexe par l'un des composés macrocycliques ou macropoiycycliques ci-après
(22)phenanthrolιne , (22)phénanthrolιne amide , (22)anthracène ,
(22)anthracène amide , (22)bι-ιsoquιnoléιne , (22)bιphenyl-bιs-pyrιdιne , (22)bιpyπdιne , (22)bι-pyrιdιne amide , les macropolycycles tris-bipyπdine, tπs- phénanthroline, phénanthroiine-bis-bipyπdine, bi-isoquinoléine-bis-bipyπdine, bis- bipyπdine diphénylbipyπdine , un compose macropolycyclique comprenant un motif moléculaire choisi parmi les bipyrazines, les bipyrimidines et les heterocycles azotés comportant des groupements N-oxydes
14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisée en ce que le cryptate de terre rare est constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique répondant à l'une des formules II ou III ci-après :
Figure imgf000031_0001
dans lesquels :
- le cycle de formule
Figure imgf000031_0002
est l'un des cycles suivants :
1 ) e [N204] ou cycle (22) e [N203] ou cycle (21)
Figure imgf000031_0003
2) macrocycle bis-bipyridine
Figure imgf000032_0001
- Y est un groupe ou un bras d'espacement qui est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C, à C20 contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et/ou éventuellement contenant par un ou plusieurs heteroatomes tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; parmi les groupes cycloalkylène en C5 à C8 ou parmi les groupes arylène en C6 à Cι4, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate ;
- Z est un groupe fonctionnel susceptible de se lier de façon covalente avec une substance biologique ;
- R est un groupe méthyie ou représente le groupe -Y-Z ;
- R' est l'hydrogène ou un groupe -COOR" dans lequel R" est un groupe alkyle en Ci à C10 et représente de préférence le groupe méthyie, éthyle ou tertiobutyle ou bien R' est un groupe -CO-NH-Y-Z.
15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que le cryptate de terre rare est un cryptate d'europium, de terbium, de samarium, de dysprosium ou de néodymium. 16. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que le cryptate de terre rare est le cryptate d'europium Eu trisbipyridine ou Eu[bis-diéthoxy bipyridine.bipyridine].
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