WO2001092886A1

WO2001092886A1 - Biocapteur et procede d'analyse de composantes du sang

Info

Publication number: WO2001092886A1
Application number: PCT/JP2001/004649
Authority: WO
Inventors: Mie Takahashi; Masataka Nadaoka; Hirotaka Tanaka; Fumihisa Kitawaki
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
Priority date: 2000-06-01
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2001-12-06
Also published as: CN1380978A; EP1202061B1; US20080083619A1; US20080085561A1; JP3655283B2; KR20020042630A; US7998752B2; EP1202061A1; KR100513213B1; US20020137200A1; CN1161612C; EP1202061A4; US7915051B2; DE60133982D1

Description

明細書バイオセンサ、及び血液成分分析方法技術分野

本発明は、血液成分を分析するバイオセンサ、及び血液成分分析方法に関し、特に、血球等の細胞成分の影響を低減し、微量の検体量で簡便かつ迅速で高精度な測定が可能なバイォセンサ、及び血液成分分析方法に関するものである。背景技術

人の健康状態を診断する手段として、血液の生化学的検査は広く実施されている。そして、血液中の構成成分である代謝産物、タンパク質、脂質、電解質、酵素、抗原、抗体等の種類や濃度は、全血のまま測定することが困難であり、通常、全血を遠心分離して得られる血漿または血清を検体として測定されている。

ところが、遠心分離には手間と時間とがかかり、特に少数の検体を緊急に処理したいときや、現場検査等には、遠心分離機を必要とする遠心法は不向きである。また、遠心分離して得られる血清量もしくは血漿量は、採血により得られた血液量に対して少量である。

そこで、全血を検体としても血球等の細胞成分の影響を受けない血液成分分析方法として、例えば、特開昭 5 7 - 5 3 6 6 1号公報、及び特開平 8— 5 4 3 8 7号公報に示されるような、平均直径が 0 . 2〜5 μ πιで密度が 0 . 1〜0 . 5 g / c m³のガラス繊維濾紙を用いて血液を滲み出させ、血漿や血清を分離する血球分離方法を用いる血液成分分析方法や、特開平 9— 1 9 6 9 0 8号公報に示されるような、アミノ酸もしくは無機塩の水溶液を全血に混合した後に血球成分を濾別することで、血球による濾過材料の目詰まりを回避し、より少量の血液を用いて、より大量の血漿または血清成分を得る血液調整方法を用いた血液成分分析方法が検討されてきた。

また、特開平 9— 7 2 9 0 4号公報に示されるような、試験片上に担持した界面活性剤によって、血液を溶血させた後に展開溶液を用いて試験片上に検体溶液を展開していく方法が検討されてきた。

しかし、所定の密度のガラス繊維濾紙を用いる方法は、確かに血球分離効率は向上するものの、ほぼ完全に血球を分離するのに、かなりの時間を要するため迅速に測定できないという問題や、検査に必要な検体量を得るのに大量の血液が必要になるばかりでなく、血液の粘度やへマトクリット値に個人差があるためにその分離能に個体差が生じてしまい測定精度が非常に低いという問題があった。また、特別な濾紙が必要になるためにコストがかかるという問題もあった。

また、全血に一定濃度の無機塩またはァミノ酸の水溶液を添加した後に血球成分を濾別する方法は、遠心分離による血球分離の作業は省かれたものの、予め血液に添加液を加えて処理する作業が繁雑であるため、簡易性に欠けるばかりでなく測定に時間を要するという問題があった。

更に、血液を予め溶血させる方法において、溶血とは界面活性剤やサポニンなどの溶血剤を用いて、血球の細胞膜における脂質二重層を破壊し、血球細胞を粉碎するのが基本原理であり、極微量の血液であれば、溶血された後に展開溶液を添加することにより、クロマトデバイス上を展開していくことも可能であるが、展開溶液を用いない場合、細胞片が展開層に目詰まりしてしまうため、展開溶液なくして採血された血液検体を展開することは不可能であるという問題があった。本発明は、上記のような課題を解決するためになされたものであり、全血を検体としても、コストがかからず、予め血液に何らかの処理を施す必要性や、検体溶液を展開するための展開溶液の必要性のない、簡便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行なうことのできるワンステツプのバイォセンサ、及び血液成分分析方法を提供することを目的とする。発明の開示

本発明（請求の範囲第 1項）に係るバイオセンサによれば、単層または複数層の多孔質性材料からなる，試薬保持部位を有しクロマトグラフィーを利用したバィォセンサにおいて、上記試薬保持部位の少なくとも一部、または該試薬保持部位よりもクロマト上流側の少なくとも一部に、細胞収縮剤を担持したものである。このような構成のバイオセンサでは、添加された液体試料中の細胞成分が、細胞収縮剤と接触することによって収縮され、クロマト担体上を細胞成分が効率よく、力つ展開溶液を加えなくとも十分浸透することができ、クロマト下流側に流れる液体量が増加するようになり、全血や細菌溶液を検体としても、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の分析を行なうことができる。なお、ここで示す細胞収縮とは、細胞の膜平衡の性質を利用し、細胞膜を通過可能な物質の高濃度状態下で細胞の浸透圧の作用により細胞を収縮させた状態を示し、細胞収縮剤とは、浸透圧の作用により細胞を収縮させる効果のある物質であることが好ましい。

この発明（請求の範囲第 2項）は、請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、添加する液体試料が、全血であるものとした。

このような構成のバイオセンサでは、予め全血中の血球成分を取り除く作業をする必要が無くなり、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行なうことができる。

この発明（請求の範囲第 3項）は、請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、添加する液体試料が、細菌を含む溶液であるものとした。

このような構成のバイオセンサでは、予め細菌溶液中の細胞成分を取り除いたり、破砕する作業をする必要が無くなり、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の分析を行なうことができる。

この発明（請求の範囲第 4項）は、請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、上記細胞収縮剤が、無機塩であるものとした。

このような構成のバイオセンサでは、添加された液体試料中の細胞成分が、無機塩と接触することによつて収縮され、. クロマト担体上を細胞成分が効率よく、かつ展開溶液を加えなくとも十分浸透することができ、クロマト下流側に流れる液体量が増加するようになり、全血や細菌溶液を検体としても、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の分析を行なうことができる。

この発明（請求の範囲第 5項）は、請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、上記細胞収縮剤が、アミノ酸であるものとした。

このような構成のバイオセンサでは、添加された液体試料中の細胞成分が、了ミノ酸と接触することによって収縮され、クロマト担体上を細胞成分が効率よく、かつ展開溶液を加えなくとも十分浸透することができ、クロマト下流側に流れる液体量が増加するようになり、全血や細菌溶液を検体としても、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の分析を行なうことができる。

この発明（請求の範囲第 6項）は、請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、上記細胞収縮剤が、糖類であるものとした。

このような構成のバイオセンサでは、添加された液体試料中の細胞成分が、糖類と接触することによって収縮され、クロマト担体上を細胞'成分が効率よく、かつ展開溶液を加えなくとも十分浸透することができ、クロマト下流側に流れる液体量が増加するようになり、全血や細菌溶液を検体としても、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の分析を行なうことができる。

この発明（請求の範囲第 7項）は、請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、上記細胞収縮剤を担持する担体を、自然乾燥または風乾によって乾燥させるものとした。

このような構成のバイオセンサでは、細胞収縮剤の変性等が少なくなり、効率よく細胞成分を収縮させることができる。

この発明（請求の範囲第 8項）は、請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、上記細胞収縮剤を担持する担体を、凍結乾燥によって乾燥させるものとした。

このような構成のバイオセンサでは、細胞収縮剤の結晶が、きめ細かく溶しやすい状態となり、短時間で細胞成分を収縮させることができる。

この発明（請求の範囲第 9項）は、請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、上記細胞収縮剤を担持する担体を、熱乾燥によって乾燥させるものとした。

このような構成のバイォセンサでは、短時間での細胞収縮剤の乾燥が可能となり、製造工程の簡易化が可能となる。

この発明（請求の範囲第 1 0項）は、請求の範囲 1項に記載のバイオセンサにおいて、上記バイオセンサがワンステップの免疫クロマトグラフィ一試験片であるものとした。

このような構成のバイォセンサでは、全血などの細胞成分を含む液体試料を予め前処理する必要性がなく、免疫反応を利用することで、測定対象に対する抗体あるいは抗原を入手することで広い分野における測定対象が測定でき、全血等の細胞成分を含む液体試料を用いた場合において、簡易迅速な測定が可能となる。なお、ここで示すワンステップとは、その測定操作において、全血など細胞成分を含む液体試料の前処理を必要とせず、試験片に液体試料を点着するのみで、液体試料点着の前後に試験片上に液体試料とは異なる展開溶液を用いたり、 BZ F 分離を目的とした洗浄操作を行う等を必要としない操作を示し、免疫クロマトグラフィー試験片とは、クロマト展開する担体上で、抗原抗 ί本反応を利用して液体試料中の被検物質の検出を行うセンサを示す。

この発明（請求の範囲第 1 1項）は、請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、上記バイオセンサが乾式分析要素であるものとした。

このような構成のバイオセンサでは、バイオセンサ全体が乾燥担体であること力、持ち運びが容易であるばかりでなく、保存環境や保存状態を厳密にする必要性がなく、取り扱いが容易で、保存条件を選ばない長期保存の可能なバイオセンサを提供することが可能となる。なお、ここで示す乾式分析要素とは、バイオセンサを構成する全ての部材及び担持された試薬が乾燥状態であるものを示す。本発明（請求の範囲第 1 2項）に係る血液成分分析方法によれば、単層または複数層の多孔質性材料からなる，試薬保持部位を有しクロマトグラフィーを利用したバイォセンサを用いる血液成分分析方法において、上記試薬保持部位の少なくとも一部、または該試薬保持部位よりもクロマト上流側の少なくとも一部の、細胞収縮剤を担持した領域で細胞成分を収縮させ、収縮した細胞成分を分離するものとした。

このような構成の血液成分分析方法では、展開溶液を加えなくとも十分に浸透することが可能となり、クロマト下流側に流れる液体量が増加するようになり、全血を検体としても、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行なうことができる。

この発明（請求の範囲第 1 3項）は、請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、添加する血液試料は、全血であるものとした。

このような構成の血液成分分析方法では、予め全血中の血球成分を取り除く作業をする必要が無くなり、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行なうことができる。

この発明（請求の範囲第 1 4項）は、請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤が、無機塩であるものとした。

このような構成の血液成分分析方法では、展開溶液を加えなくとも十分に浸透することが可能となり、クロマト下流側に流れる液体畺が増加するようになり、全血を検体としても、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行なうことができる。

この発明（請求の範囲第 1 5項）は、請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤が、アミノ酸であるものとした。

このような構成の血液成分分析方法では、展開溶液を加えなくとも十分に浸透することが可能となり、クロマト下流側に流れる液体量が増加するようになり、全血を検体としても、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行なうことができる。 .

この発明（請求の範囲第 1 6項）は、請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤が、糖類であるものとした。

この発明（請求の範囲第 1 7項）は、請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、自然乾燥または風乾によつて乾燥させるものとした。

このような構成の血液成分分析方法では、細胞収縮剤を担持した担体を安定した状態で乾燥することができるため、乾燥中の細胞収縮剤の変性等を抑えることができる。

この発明（請求の範囲第 1 8項）は、請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、凍結乾燥によって乾燥させるものとした。このような構成の血液成分分析方法では、細胞収縮剤の結晶がきめ細かく溶解しゃすい状態になり、短時間で細胞成分を収縮させることができる。

この発明（請求の範囲第 1 9項）は、請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、熱乾燥によって乾燥させるものとした。

このような構成の血液成分分析方法では、細胞収縮剤を担持した担体の乾燥時間が短くなり、短時間での細胞収縮剤の乾燥が可能となり、製造工程の簡易化が可能となる。

この発明（請求の範囲第 2 0項）は、請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分祈方法において、上記細胞収縮剤の濃度が、 0 . 0 5〜0 . 3 Mであるものとした。

このような構成の血液成分分析方法では、細胞成分を最適な大きさに収縮させることができ、この結果、細胞成分分離効率が向上するという効果がある。

この発明（請求の範囲第 2 1項）は、請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、上記バイオセンサがワンステップの免疫クロマトグラフィー試験片であることとした。

このような構成の血液成分分析方法では、全血の細胞成分を除くため予め遠心分離などの前処理をする必要性がなく、免疫反応を利用することで、測定対象に対する抗体あるいは抗原を入手することで広い分野における測定対象が測定でき、全血を用いた場合でも、微量の血液量で簡易迅速な測定が可能である。

この発明（請求の範囲第 2 2項）は、請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、上記バイオセンサが乾式分析要素であることとした。

このような構成の血液成分分析方法では、バイォセンサ全体が乾燥担体であることから持ち運びが容易であるばかりでなく、保存環境や保存状態を厳密にする必要性がなく、取り扱いの容易な血液成分分析方法を提供することができる。本発明（請求の範囲第 2 3項）に係る血液成分分析方法によれば、単層または複数層の多孔質性材料からなる，試薬保持部位を有しクロマトグラフィーを利用したバイォセンサを用いる血液成分分析方法において、上記試薬保持部位の少なくとも一部、または該試薬保持部位よりもクロマト上流側の少なくとも一部の、細胞収縮剤を担持した領域で細胞成分を収縮させ、収縮した細胞成分が混在する状態でクロマト展開するものである。

このような構成の血液成分分析方法では、クロマト担体上を目詰まりすることなく効率よく、かつ展開溶液を加えなくとも十分に浸透することが可能となり、クロマト下流側に流れる液体量が増加するようになり、全血を検体としても、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行なうことができる。

この発明（請求の範囲第 2 4項）は、請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、添加する血液試料は、全血であるものとした。

この発明（請求の範囲第 2 5項）は、請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤は、無機塩であるものとした。

この発明（請求の範囲第 2 6項）は、請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤が、アミノ酸であるものとした。

このような構成の血液成分分析方法では、クロマト担体上を目詰まりすることなく効率よく、かつ展開溶液を加えなくとも十分に浸透することが可能となり、クロマト下流側に流れる液体量が増加するようになり、全血を検体としても、コストがかからず、靖便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行なうことができる。

この発明（請求の範囲第 2 7項）は、請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤が、糖類であるものとした。

この発明（請求の範囲第 2 8項）は、請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、自然乾燥または風乾によつて乾燥させるものとした。

この発明（請求の範囲第 2 9項）は、請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、凍結乾燥によって乾燥させるものとした。

このような構成の血液成分分析方法では、細胞収縮剤の結晶がきめ細かく溶解しゃすい状態になり、短時間で細胞成分を収縮させることができる。 ·

この発明（請求の範囲第 3 0項）は、請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、熱乾燥によって乾燥させるものとした。

このような構成の血液成分分析方法では、細胞収縮剤を担持した担体の乾燥時間が短くなり、乾燥中の細胞収縮剤の変性等を抑えることができる。

この発明（請求の範囲第 3 1項），は、請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤の濃度が、 0 . 1〜5 . 0 Mであるものとした。このような構成の血液成分分析方法では、細胞成分を最適な大きさに収縮させることができ、この結果、全血を担体上で目詰まりすることなく浸透させることができる。

この発明（請求の範囲第 3 2項）は、請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、上記バイオセンサがワンステップの免疫クロマトグラフィ一試験片であることとした。

このような構成の血液成分分析方法では、全血の細胞成分を除くため予め遠心分離などの前処理をする必要性がなく、免疫反応を利用することで、測定対象に対する抗体あるいは抗原を入手することで広い分野における測定対象が測定でき、全血等の細胞成分を含む液体試料を用いた場合において、簡易迅速な測定が可能な血液成分分析方法を提供することができる。

この発明（請求の範囲第 3 3項）は、請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、上記バイオセンサが乾式分析要素であることとした。

このような構成の血液成分分析方法では、バイォセンサ全体が乾燥担体であることから持ち運びが容易であるばかりでなく、保存環境や保存状態を厳密にする必要性がなく、取り扱いの容易な血液成分分析方法を提供することができる。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の実施の形態 1によるクロマトグラフィ一を利用した横型バィォセンサを示す図である。

第 2図は、本発明の実施の形態 1による横型バイオセンサの、試料添加部を省いて、収縮剤保持部位が試料添加部を兼ねるようにしたものを示す図である。第 3図は、本発明の実施の形態 2によるクロマトグラフィ一を利用した縦型バィォセンサを示す分角军斜視図である。

第 4図は、本発明の実施の形態 2による縦型バイオセンサを、試料添加部側からみた斜視図である。

第 5図は、本発明の実施の形態 2による縦型バイオセンサを、吸水部側からみた斜視図である。

第 6図は、本発明の実施の形態 2による縦型バイォセンサの試料添加部を省いて、収縮剤保持部位が試料添加部を兼ねるようにしたものを示す斜視図である。第 7図は、本発明の実施の形態 2による縦型バイォセンサの試料添加部を省いて、収縮剤保持部位が試料添加部を兼ねるようにしたものを、収縮剤保持部位側からみた斜視図である。

第 8図は、本発明の実施の形態 2による縦型バイオセンサの試料添加部を省いて、収縮剤保持部位が試料添加部を兼ねるようにしたものを、吸水部側からみた斜視図である。第 9図は、本発明の実施例 1による横型バイオセンサの、収縮剤濃度の変化による反応層上の溶液浸透速度を示す図である。

第 1 0図は、本発明の実施例 2による縦型バイオセンサの、収縮剤濃度の変化による反応層への血球付着率を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。

(実施の形態 1 )

第 1図は、本実施の形態 1によるクロマトグラフィーを利用した横型バイオセンサを示す図である。

第 1図に示されるように、本実施の形態 1によるバイオセンサは、吸収性の大きレ、不織布ゃガラス繊維濾紙等からなる，液体試料を添加または塗布するための試料添加部 2と、細胞成分を収縮させる働きがある細胞収縮剤が、不織布やガラス繊維濾紙等に溶解可能に保持された収縮剤保持部位 8と、分析対象物と何ら力の反応を行なう標識試薬が、不織布やガラス繊維濾紙等に溶解可能に保持された標識試薬保持部位 3と、ニトロセルロース等からなる反応層 4と、反応層 4の領域上に特異的タンパク質が固定化された特異的タンパク質固定化部 5と、液体試料を最終的に吸収する吸水部 6とが、プラスチック等からなる担体支持体 1の上部に形成されて'いる。

収縮剤保持部位 8が保持する細胞収縮剤は、例えば、無機塩、アミノ酸、及び糖類等である。なお、ここで無機塩とは、塩ィ匕ナトリウムや塩化カリウム、リン酸ナトリウム等、塩を含む無機化合物を示す。また、ここでアミノ酸とは、グリシンやグルタミン酸等同一分子内にカルボキシル基とアミノ基とを有する化合物を示し、プロリンゃヒドロキシルプロリンのようなイミノ酸も含む。また、ここで糖類とは、グノレコースやスクロース、トレハロース等の糖質や、グルシトール等の糖アルコールを示す。

また、分析対象物と標識試薬との何らかの反応とは、抗原抗体反応のようなリガンドとレセプターとの特異的結合反応、または酵素反応等の任意の特異的な反応を示す。

また、標識試薬保持部位 3が保持する標識試薬は、金コロイド等の金属ゾルや、非金属ゾル、染料ゾル、着色粒子、色素、酵素、タンパク質等を示す。

次に、本実施の形態 1によるバイオセンサを用いた血液成分分析方法について説明する。

まず、全血や細菌溶液等の細胞成分を.含む液体試料が試料添加部 2に添加され、この添加された液体試料が収縮剤保持部位 8に達すると、収縮剤保持部位 8に保持されている収縮剤が、液体試料の浸透により溶解され、細胞成分を収縮させる。これにより、液体試料は、細胞成分が混在下状態でも、目詰まりを起こすことなくクロマト下流側に浸透していく。

次いで、収縮された細胞成分が混在する液体試料が、標識試薬保持部位 3に達すると、標識試薬保持部位 3に保持された標識試薬が、液体試料の浸透により溶解され、反応層 4に浸透する。

そして、反応層 4の領域上の特異的タンパク質固定ィヒ部 5で、標識試薬保持部位 3から溶出した標識試薬との反応が行なわれ、このとき、液体試料中に分析対象物が存在すれば、特異的タンパク質固定ィヒ部 5に何らかの呈色反応が見られる。最終的に、液体試料は吸水部 6に吸収され反応は終了する。

このように、本実施の形態 1によるバイオセンサ、及び血液成分分析方法によれば、収縮剤保持部位に保持された細胞収縮剤が、液体試料中の細胞成分を収縮させるようにじたので、細胞成分が混在した状態でも液体試料が目詰まりを起こすことなくクロマト下流側に浸透するようになり、全血や細菌溶液を検体としても、予め検体を前処理することなく展開することが可能であり、検体溶液をクロマト下流方向へ展開するための展開溶液を必要としないでよいために、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行なうことができる。なお、上記実施の形態 1によるバイオセンサは、その試料添加部を省き、反応層に直接試料を添加する構成にしてもよい。

第 2図は、本発明の実施の形態 1による横型バイオセンサの、試料添加部を省いて、収縮剤保持部位が試料添加部を兼ねるようにしたものを示す図である。第 2図に示されるように収縮剤保持部位が試料添加部を兼ねるようにすることで、部材数、及び工程数を低減することができる。

また、上記実施の形態 1によるバイオセンサは、複数の部材からなるものとしたが、これに限られるものではなく、収縮剤を溶解可能に保持した収縮剤保持領域と、標識試薬を溶解可能に保持した標識試薬保持領域と、特異的タンパク質が固定化された特異的タンパク質固定化部とを、ニトロセルロース等の多孔質性材料からなる反応層に形成した単層の部材からなるものとしてもよい。

また、本発明のバイオセンサは乾式分析要素であってもよい。ここで示す乾式分析要素とは、バイオセンサを構成する全ての部材、及び担持された試薬が乾燥状態であるものを示す。このように試験片を乾燥状態にすることにより、バイオセンサ全体が乾燥担体であることから、持ち運びが容易であるばかりでなく、保存環境や保存状態を厳密にする必要性がなく、取り扱いが容易で、保存条件を選ばない長期保存が可能である。

また、本発明のバイオセンサはワンステップの免疫クロマトグラフィー試験片を有するものであってもよい。ここで示すワンステップとは、その測定操作において、全血など細胞成分を含む液体試料の前処理を必要とせず、試験片に液体試料を点着するのみで、液体試料点着の前後に試験片上に液体試料とは異なる展開溶液を用いたり、洗浄操作を行うなどを必要としない操作を示し、免疫クロマトグラフィー試験片とは、クロマト展開する担体上で、抗原抗体反応を利用して液体試料中の被検物質の検出を行うセンサを示す。このように試験片ををワンステップの免疫クロマトグラフィー試験片とすることにより、全血などの細胞成分を含む液体試料を予め前処理する必要性がなく、免疫反応を利用することで、測定対象に対する抗体あるいは抗原を入手することで広い分野における測定対象が測定でき、全血等の細胞成分を含む液体試料を用いた場合において、簡易迅速な測定が可能となる。

(実施の形態 2 )

第 3図は、本発明の実施の形態 2によるクロマトグラフィーを利用した縦型バィォセンサを示す分解斜視図である。

第 3図に示されるように、本実施の形態 2によるバイオセンサは、吸収性の大きぃ不織布ゃガラス繊維濾紙等からなる，液体試料を添加または塗布するための試料添加部 1 2と、細胞成分を収縮させる働きがある細胞収縮剤が不織布やガラス繊維濾紙等に溶解可能に保持された収縮剤保持部位 1 8と、分析対象物と何らカゝの反応を行なう標識試薬が、不織布やガラス繊維濾紙等に溶解可能に保持された標識試薬保持部位 1 3と、ニトロセルロース等からなる反応層 1 4と、反応層 1 4の領域上に特異的タンパク質が固定化された特異的タンパク質固定化部 1 5 と、液体試料を最終的に吸収する吸水部 1 6と、反応層 1 4上の結果を見るための結果確認窓 1 9とが積層されるように構成されている。

収縮剤保持部位 1 8が保持する細胞収縮剤は、例えば、無機塩、アミノ酸、及び糖類等である。なお、ここで無機塩とは、塩化ナトリウムや塩化カリウム、リン酸ナトリウム等、塩を含む無機化合物を示す。また、ここでアミノ酸とは、グリシンやグルタミン酸等同一分子内に力ルポキシル基とアミノ基とを有する化合物を示し、プロリンゃヒドロキシルプロリンのようなイミノ酸も含む。また、ここで糖類とは、グルコースゃスクローズ、トレハロース等の糖質や、グルシトール等の糖アルコールを示す。

また、分析対象物ど標識試薬との何らかの反応とは、抗原抗体反応のようなリガンドとレセプターとの特異的結合反応、または酵素反応等の任意の特異的な反応を示す。

また、標識試薬保持部位 1 3が保持する標識試薬は、金コロイド等の金属ゾルや、非金属ゾル、染料ゾル、着色粒子、色素、酵素、タンパク質等を示す。第 4図は、本発明の実施の形態 2による縦型バイオセンサを、試料添加部側からみた斜視図であり、第 5図は、本発明の実施の形態 2による縦型バイオセンサを、吸水部側からみた斜視図である。

次に、本実施の形態 2によるバイオセンサを用いた血液成分分析方法について説明する。

まず、全血や細菌溶液等の細胞成分を含む液体試料が試料添加部 1 2に添加され、この添加された液体試料が収縮剤保持部位 1 8に達すると、収縮剤保持部位 1 8に保持されている収縮剤が、液体試料の浸透により溶解され、細胞成分を収縮させる。次いで、収縮された細胞成分が混在する液体試料が、標識試薬保持部位 1 3に達すると、該標識試薬保持部位 1 3に保持された標識試薬が、液体試料の浸透により溶解され、収縮された細胞成分は、標識試薬保持部位 1 3における不織布やガラス繊維濾紙の繊維に絡みつき、分離される。これにより液体成分は、素早く反応層 1 4に浸透する。

そして、反応層 1 4の領域上の特異的タンパク質固定ィヒ部 1 5で、標識試薬保持部位 1 3から溶出した標識試薬との反応が行なわれ、このとき、液体試料中に分析対象物が存在すれば、特異的タンパク質固定化部 1 5に何らかの呈色反応が見られる。

最終的に、液体試料は吸水部 1 6に吸収され反応は終了する。

このように、本実施の形態 2によるバイオセンサ、及ぴ血液成分分析方法によれば、収縮剤保持部位に保持された細胞収縮剤が、液体試料中の細胞成分を収縮させるようにしたので、下部に積層されている部材の繊維に絡まり分離され、液体試料中の液体成分が素早く反応層に浸透するようになり、全血や細菌溶液を検体としても、コストがかからず、簡便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行なうことができる。

なお、上記実施の形態 2によるバイオセンサは、その試料添加部を省き、反応層に直接試料を添加する構成にしてもよい。

第 6図は、本発明の実施の形態 2による縦型バイォセンサの試料添加部を省いて、収縮剤保持部位が試料添加部を兼ねるようにしたものを示す斜視図であり、第 7図は、本発明の実施の形態 2による縦型バイオセンサの試料添加部を省いて、収縮剤保持部位が試料添加部を兼ねるようにしたものを、収縮剤保持部位側からみた斜視図であり、第 8図は、本発明の実施の形態 2による縦型バイオセンサの試料添加部を省いて、収縮剤保持部位が試料添加部を兼ねるようにしたものを、吸水部側からみた斜視図である。

第 6図ないし第 8図に示されるように収縮剤保持部位が試料添加部を兼ねるようにすることで、部材数、及び工程数を低減することができる。

また、上記実施の形態 1、及び 2によるバイオセンサには、ニトロセルロースゃ不織布あるいはガラス繊維濾紙のような、任意の多孔質性担体で構成されたク口マトグラフィー材料が用いられており、一般に、このような材料からなるバイォセンサは、例えば、抗原抗体反応のような任意の特異的反応による測定原理を用いて、ある特定物質を分析検出し、定性または定量する機能を持っている。ここで、上記実施の形態 1、及び 2では、標識物を用いた抗原抗体反応を例として説明を行なったが、これに限るものではなく、酵素のように反応の前後において何らかの変化が生じるものであれば何を用いるようにしてもよい。

また、本発明のバイオセンサは乾式分析要素であってもよい。ここで示す乾式分析要素とは、バイオセンサを構成する全ての部材、及び担持された試薬が乾燥状態であるものを示す。このように試験片を乾燥状態にすることにより、バイオセンサ全体が乾燥担体であることから、持ち運びが容易であるばかりでなく、保存環境や保存状態を厳密にする必要' feがなく、取り扱いが容易で、保存条件を選ばない長期保存が可能である。

また、本発明のバイオセンサはワンステップの免疫クロマトグラフィー試験片を有するものであってもよい。ここで示すワンステップとは、その測定操作において、全血など細胞成分を含む液体試料の前処理を必要とせず、試験片に液体試料を点着するのみで、液体試料点着の前後に試験片上に液体試料とは異なる展開溶液を用いたり、洗浄操作を行うなどを必要としない操作を示し、免疫ク口マトグラフィー試験片とは、クロマト展開する担体上で、抗原抗体反応を利用して液体試料中の被検物質の検出を行うセンサを示す。このように試験片をワンステツプの免疫クロマトグラフィー試験片とすることにより、全血などの細胞成分を含む液体試料を予め前処理する必要性がなく、免疫反応を利用することで、測定対象に対する抗体あるいは抗原を入手することで広い分野における測定対象が測定でき、全血等の細胞成分を含む液体試料を用いた場合において、簡易迅速な測定が可能となる。

(実施例）

以下の実施例により、本発明を実施する方法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例になんら制約されるものではない。

実施例 1 .

(クロマトグラフィーを利用した横型バイオセンサによる全血中 h C Gの定性）ニトロセルロース膜中に抗 hCG— 抗体固定化ライン、及び抗 hCG— 抗体と金コロイドとの複合体の広いバンドを含む免疫バイオセンサを製造した。このバイオセンサは、第 1図に示されるような形状の横型バイオセンサであり、次のようにして製造した。

a) バイオセンサの調製

リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗 h C G— β抗体溶液を準備した。この抗体溶液を、溶液吐出装置を用いてュトロセルロース膜上に塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に検出用の抗体固定化ラインが得られた。この二トロセルロース膜を乾燥後、 1%スキムミルクを含有する T r i s— HC 1緩衝溶液中に浸漬して 30分間緩やかに振った。 30分後、 T r i s— HC 1緩衝溶液槽に膜を移動し、 10分間緩やかに振った後に、別の T r i s_HC l緩衝溶液槽にて更に 10分間緩やかに振り、膜の洗浄を行なった。 2度洗浄を行なった後に、膜を液槽から取り出して、室温で乾燥させた。

金コロイドは、 0. 01 %塩化金酸の還流中の 100°C溶液に 1 %クェン酸溶液を加えることによって調製した。還流を 30分間続けた後に、室温放置にて冷却した。 0. 2Mの炭酸カリウム溶液によって、 pH 9に調製した前記金コロイド溶液に、抗 h C G _ α抗体を加えて数分間攪拌した後に、 ρΗ9の 10%B S A (牛血清アルブミン）溶液を最終 1%になる量だけ加えて攪拌することで、抗体一金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を 4 °C、 20 00 OGで 50分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液 (1%B SA - リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行なつて、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、 0. 8 μπιのフィルタにて濾過した後に、当初の金コロイド溶液量の 10分の 1に調製して、 4 °Cで貯蔵した。

前記標識抗体溶液を溶液吐出装置にセットして、抗 hCG— 抗体固定化乾燥膜上の抗体固定化位置から離れた位置に塗布した後に、膜を乾燥させた。これによって、固定化膜上に標識試薬保持部位が得られた。

0. 15Mに調製された塩化カリウム水溶液を、不織布に対して単位面積あたり 0. 1 m 1点着した後に、液体窒素にて直ちに凍結し、凍結乾燥を行なう。これによって、塩化カリウムが含浸された収縮剤保持部材が得られた。

こうして調製された標識試薬保持部位を含む抗体固定化膜を、担体支持体上に貼付け、収縮剤保持部材と、試料添加部として不織布を、ガラス繊維濾紙を吸水部として、付け加えてから 0. 5 cm幅の細片に切断して、バイオセンサを作製した。

b) 試料の調製

抗凝固剤としてへパリンを加えた人の血液を、へマトクリツト値 45%になるように調製した。この血液に既知濃度の hCG溶液を加えることにより、さまざまな既知濃度の h C G溶液を調製した。

c) バイオセンサ上の呈色度合の測定

バイオセンサ上の試料添加部に h CGを含む全血を 150 μ 1程度添加して、吸水部方向へと展開処理して、抗原抗体反応をさせて抗体固定化部における呈色反応を行なった。このバイオセンサへの試料添加から 5分後の呈色状況を目視にて確認した。さらに、バイォセンサ上の反応層 2 cmをクロマト下流側まで浸透するために要した時間を測定した。

第 9図は、本発明の実施例 1による横型バイオセンサの、収縮剤濃度の変化による反応層上の溶液浸透速度を示す図である。具体的には、 KC 1濃度を 0. 0 1M、 0. 1M、 0. 15M、 5Mに変更し、それぞれの濃度の KC 1溶液が担持された収縮剤保持部位 3をセンサに組み込み、へマトクリット値 45%の血液を添加した時の、血液が反応層を 2 cm浸透するのに要した時間を示しており、 KC 1を全く含まない場合では、浸透に約 1時間を要したが、 KC 1濃度が 0. 01M、 0. 1M、 0. 1 5Mと増大すると浸透時間は短縮されているのがわかる。

以上の結果から、本実施例 1による横型バイオセンサに設けられた，細胞収縮剤を保持する領域は、反応層上の浸透速度の短縮に、大きく関与していることがわかる。

なお、細胞収縮剤の濃度を 0. 1M〜0. 5 Mに設定することで、細胞成分を最適な大きさに収縮させることができ、この結果、全血を担体上で目詰まりすることなく迅速に浸透させることができる。また、本実施例' 1では、細胞収縮剤を担持する担体（本実施例 1では、塩化力リウム水溶液）を凍結乾燥によって乾燥させるものとしたので、細胞収縮剤の結晶が、きめ細かく溶解しやすい状態となり、短時間で細胞成分を収縮させることができる。

また、本実施例 1では、細胞収縮剤を担持する担体を凍結乾燥によって乾燥させるものとしたがこれに限るものではなく、自然乾燥または風乾によって乾燥させてもよい。これにより、細胞収縮剤の変性等が少なくなり、効率よく細胞成分を収縮させることができる。さらに、細胞収縮剤を担持する担体を、熱乾燥によつて乾燥させてもよい。これにより、短時間での細胞収縮剤の乾燥が可能となり、製造工程の簡易化が可能となる。

また、本記実施例 1によるバイオセンサには、ニトロセルロースやガラス繊維濾紙のような、任意の多孔質性担体で構成されたクロマトグラフィ一材料が用ヽられており、一般に、このような材料からなるバイオセンサは、例えば、抗原抗体反応のような任意の特異的測定原理を用いて、ある特定物質を分析検出し、定性または定量する機能を持っている。ここで、本実施例 1では、標識物を用いた抗原抗体反応を例として説明を行なったが、これに限るものではなく、酵素のように反応の前後において何らかの変化が生じるものであれば何を用いるようにしてもよい。

また、試料添加部として不織布を、ガラス繊維濾紙を吸水部とした複数の多孔質性担体で構成された試験片を例に挙げたが、不織布とガラス繊維濾紙を取り除き、多孔質担体上に固定化された抗体固定化部と標識試薬が溶出可能なように保持された標識試薬保持部位、細胞収縮剤が溶出可能なように保持された収縮剤保持部位が備えられた単層の構成をとってもよい。

実施例 2 .

(クロマトグラフィーを利用した縦型バイオセンサを用いた全血中 h C Gの定 . 性）

抗 h C G— ]3抗体固定化領域を含む-トロセルロースメンプレン膜と、抗 h C G— _α抗体と金コロイドとの複合体からなる標識物を含む標識試薬保持部位と、添加された血液中の血球を収縮させる血球収縮剤を含む収縮剤保持部位からなるバイオセンサを製造した。このバイオセンサは、第 3図に示されるような形状の縦型バイオセンサである。このバイオセンサは、次のようにして製造した。

a)バイオセンサの調製

試料添加部として、ガラス繊維濾紙 GA100 (アドバンテック製）を用意した。

収縮剤保持部位は、 Na C l水溶液を作製し、この水溶液をガラス繊維濾紙 G A 1 00 (ァドバンテック製）に 1 40 μ 1点着し、直ちに液体窒素で凍結後、凍結乾燥を行なった。これにより、収縮剤保持部位が調製された。

金コロイドは、 0. 0 1 %塩化金酸の還流中の 100°C溶液に 1 %クェン酸溶液を加えることによって調製した。還流を 30分間続けた後に、冷却した。 0. 2 Mの炭酸カリウム溶液によって、 H 9に調製した前記金コロイド溶液に、抗 hCG—o;抗体を加えて数分間攪拌した後に、 pH9の 1 0%B SA (牛血清ァノレブミン）溶液を最終 1%になる量だけ加えて攪拌することで、抗体金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を 4 °C、 20000Gで 50 分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液 (1 % B SA - リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行なって、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、 0. 8 μπιのフィルタにて濾過した後に、当初の金コロイド溶液量の 1 0分の 1に調製して、 4°Cで貯蔵した。

この金コロイド溶液をガラス繊維濾紙 G A 1 00 (ァドバンテック製）に 14 μ 1点着し、直ちに液体窒素で凍結後、凍結乾燥を行なった。これにより、標識試薬保持部位が調製された。

リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗 h C G— 抗体溶液を準備した。この抗体溶液を溶液吐出装置を用いて、ニトロセルロース膜上に塗布した。これにより、エトロセルロース膜上に検出用の抗体固定化領域が得られた。このニトロセルロース膜を乾燥後、 1%B SA ' 0. 5%スキムミルクを含有する T r i s— HC 1緩衝溶液中に浸漬して 30分間緩やかに振った。 30分後、 T r i s 一 HC 1緩衝溶液槽に膜を移動し、 10分間緩やかに振った後に、別の T r i s 一 HC 1緩衝溶液槽にて更に 1 0分間緩やかに振り、膜の洗浄を行なった。 2度洗浄を行なった後に、膜を液槽かち取り.出して、室温で乾燥させて、特異的タンパク質固定化部を持つ反応層とした。

吸水部は、反応層上の結果が判定できるよう結果確認窓を設けたガラス繊維濾紙 GA 2 0 0 (アドバンテック製）を用意した。

こうして調製された各部材を、第 3図に示されるように積層し、ケースをかぶせてバイオセンサとした。

b)試料の調製

抗凝固剤としてへパリンを加えた人の血液を、へマトタリット値 4 5 %になるように調製した。この血液に既知濃度の h C G溶液を加えることにより、さまざまな既知濃度の h C G溶液を調製した。

。測定

上記のように組立てた分析装置の試料添加部に h C Gを含む血液を 2 0 0 μ 1 添加して、積層されたバイオセンザの下部方向へと展開処理して、抗原抗体反応をさせて抗体固定化部における呈色反応を行なつた。このバイォセンサへの試料添加から 3分後の呈色状況を、バイ:ォセンサ下部にある結果確認窓から目視にて確認を行なった。さらに測定が終了した：バイオセンサを分解し、反応層への血球付着状況を確認した。

第 1 0図は、本発明の実施例 2による縦型バイオセンサの、収縮剤濃度の変化による反応層への血球付着率を示す図である。具体的には、 N a C 1濃度を 5 0 mM、 1 5 O mM 2 0 0 mM、 2 5 0 mM、 3 0 O mM、 3 5 0 mMに変更し、それぞれの濃度の N a C 1溶液が担持された収縮剤保持部位をセンサに組込み、へマトクリツト値 4 5 %の血液を添加した時の、反応層に血球が到達した回数の確率を示しており、 N a C 1を全く含まない場合では、 1 0 0 %の割合で反応層への血球の付着がみられたが、 N a C 1濃度が 5 O mMから増大するに従って、反応層への血球付着率は徐々に低下し、 3 5 0 mMでは血球は全く付着しなくなつたことがわかる。

以上の結果から、本実施例 2による横型バイオセンサに設けられた，細胞収縮剤を保持する領域は、検体中の細胞成分の分離効率の向上に、大きく寄与していることがわかる。なお、細胞収縮剤の濃度をひ. 0 5M 0 . 3 Mに設定することで、細胞成分を最適な大きさに収縮させることができ、この結果、細胞成分分離効率を向上させることができる。

また、本実施例 2では、細胞収縮剤を担持する担体（本実施例 2では、塩化ナトリウム水溶液）を凍結乾燥によって乾燥させるものとしたので、細胞収縮剤の結晶が、きめ細かく溶解しやすい状態となり、短時間で細胞成分を収縮させることができる。

また、本実施例 2では、細胞収縮剤を担持する担体を凍結乾燥によって乾燥させるものとしたがこれに限るものではなく、自然乾燥または風乾によって乾燥させてもよい。これにより、細胞収縮剤の変性等が少なくなり、効率よく細胞成分を収縮させることができる。さらに、細胞収縮剤を担持する担体を、熱乾燥によつて乾燥させてもよい。これにより、短時間での細胞収縮剤の乾燥が可能となり、製造工程の簡易化が可能となる。

また、本実施例 2によるバイオセンサは、金コロイドを標識物として用いているが、固定ィヒ抗体に酵素を標識しておき、酵素反応による呈色反応を生じうる試薬を標識試薬として用いるようにしてもよい。

また、本実施例 2によるバイオセンサには、ニトロセルロースやガラス繊維濾紙のような、任意の多孔質性担体で構成されたクロマトグラフィー材料が用いられており、一般に、このような材料からなるバイオセンサは、例えば、抗原抗体反応のような任意の特異的測定原理を用いて、ある特定物質を分析検出し、定性または定量する機能を持っている。ここで、本実施例 2では、標識物を用いた抗原抗体反応を例として説明を行なったが、これに限るものではなく、酵素のように反応の前後において何らかの変化が生じるものであれば何を用いるようにしてあよい。産業上の利用可能性

以上のように本発明に係るバイオセンサ、及び血液成分分析方法は、全血を検体としても、コストがかからず、予め血液に何らかの処理を施す必要性や、検体溶液を展開するための展開溶液の必要性のない、簡便かつ迅速に、高い精度の血液成分分析を行うことができものであり、特にワンステップのバイオセンサ、及び血液成分の分析方法に適している。

Claims

請求の範囲

1 . 単層または複数層の多孔質性材料からなる，試薬保持部位を有しクロマトグラフィーを利用したバイオセンサにおいて、

上記試薬 ί呆持部位の少なくとも一部、または該試薬保持部位よりもクロマト上流側の少なくとも一部に、細胞収縮剤を担持した、

ことを特徴とするバイオセンサ。

2 . 請求の範囲第 1項に記載のバイォセンサにおいて、

添加する液体試料は、全血である、

ことを特徴とするバイオセンサ。

3 . 請求の範囲第 1項に記載のバイォセンサにおいて、

添加する液体試料は、細菌を含む溶液である、

ことを特徴とするバイオセンサ。

4 . 請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、

上記細胞収縮剤は、無機塩である、

ことを特徴とするバイオセンサ。

5 . 請求の範囲第 1項に記載のバイォセンサにおいて、

上記細胞収縮剤は、アミノ酸である、

ことを特徴とするバイオセンサ。

6 . 請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、

上記細胞収縮剤は、糖類である、

ことを特徴とするバイオセンサ。

7 . 請求の範囲第 1項に記載のバイォセンサにおいて、

上記細胞収縮剤を担持する担体を、自然乾燥または風乾によって乾燥させた、ことを特徴とするバイオセンサ。

8 . 請求の範囲第 1項に記載のバイォセンサにおいて、

上記細胞収縮剤を担持する担体を、凍結乾燥によって乾燥させた、

ことを特徴とするバイオセンサ。

9 . 請求の範囲第 1項に記載のバイォセンサにおいて、上記細胞収縮剤を担持する担体を、熱乾燥によって乾燥させた、

ことを特徴とするバイォセンサ。

1 0 . 請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、

上記バイォセンサがワンステツプの免疫ク口マトグラフィ一試験片である、ことを特徴とするバイオセンサ。

1 1 . 請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、：

上記バイォセンサが乾式分析要素である、

ことを特徴とするバイォセンサ。

1 2 . 単層または複数層の多孔質性材料からなる，試薬保持部位を有しクロマトグラフィ一を利用したバイォセンサを用いる血液成分分析方法にぉレ、て、上記試薬保持部位の少なくとも一部、または該試薬保持部位よりもクロマト上流側の少なくとも一部の、細胞収縮剤を担持した領域で細胞成分を収縮させ、収縮した細胞成分を分離する、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

1 3 . 請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、

添加する血液試料は、全血である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

1 4 . 請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤は、無機塩である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

1 5 . 請求の'範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤は、アミノ酸である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

1 6 . 請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤は、糖類である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

1 7 . 請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤を担持した担体を、自然乾燥または風乾によって乾燥させる、ことを特徴とする血液成分分析方法。

1 8 . 請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤を担持した担体を、凍結乾燥によって乾燥させる、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

1 9 . 請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤を担持した担体を、熱乾燥によって乾燥させる、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 0 . 請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤の濃度は、 0 . 0 5〜0 .. 3 Mである、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 1 . 請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、

上記バイォセンサがワンステツプの免疫クロマトグラフィ一試験片である、ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 2 . 請求の範囲第 1 2項に記載の血液成分分析方法において、

上記バイオセンサが乾式分析要素である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 3 . 単層または複数層の多孔質性材料からなる，試薬保持部位を有しクロマトグラフィーを利用したバイオセンサを用いる血液成分分析方法において、上記試薬保持部位の少なくとも一部、または該試薬保持部位よりもクロマト上流側の少なくとも一部の、細胞収縮剤を担持した領域で細胞成分を収縮させあるいは収縮しながら、収縮した細胞成分が混在する状態でクロマト展開する、ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 4 . 請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、

添加する血液試料は、全血である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 5 . 請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤は、無機塩である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 6 . 請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤は、アミノ酸である、ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 7 . 請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤は、糖類である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 8 . 請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、

2 9 . 請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

3 0 . 請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

3 1 . 請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、

上記細胞収縮剤の濃度は、 0 . 1〜5 . 0 Mである、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

3 2 . 請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、

上記バイォセンサがワンステップの免疫クロマトグラフィ一試験片である、ことを特徴とする血液成分分析方法。

3 3 . 請求の範囲第 2 3項に記載の血液成分分析方法において、

上記バイオセ'ンサが乾式分析要素である、 '

ことを特徴とする血液成分分析方法。

補正書の請求の範囲

[2001年 1 0月 4日（04. 1 0. 01 ) 国際事務局受理：出願当初の請求の範囲

1 1ー34は補正された；新しい請求の範囲 1 0が加えられた；

他の請求の範囲は変更なし。（3頁） ] 上記細胞収縮剤を担持する担体を、熱乾燥によって乾燥させた、

ことを特徴とするバイオセンサ。

10. (追加）請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、

上記細胞収縮剤の濃度が、 0. 05~5. 0Mである、

ことを特徴とするバイオセンサ。

1 1. (補正後）請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、

上記バイォセンサがワンステツプの免疫ク口マトグラフィ一試験片である、ことを特徴とするバイォセンサ。

12. (補正後）請求の範囲第 1項に記載のバイオセンサにおいて、

上記バイオセンサが乾式分析要素である、

ことを特徴とするバイオセンサ。

13. (補正後）単層または複数層の多孔質性材料からなる，試薬保持部位を有しクロマトグラフィーを利用したバイォセンサを用いる血液成分分析方法において、

上記試薬保持部位の少なくとも一部、または該試薬保持部位よりもクロマト上流側の少なくとも一部の、細胞収縮剤を担持した領域で細胞成分を収縮させ、収縮した細胞成分を分離する、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

14. (捕正後）請求の範囲第 13項に記載の血液成分分析方法において、添加する血液試料は、全血である、 ■

ことを特徴とする血液成分分析方法。

15. (補正後）請求の範囲第 13項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤は、無機塩である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

16. (補正後）請求の範囲第 13項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤は、アミノ酸である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

17. (補正後）請求の範囲第 13項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤は、糖類である、補正された用紙（条約第 19条）ことを特徴とする血液成分分析方法。

1 8 . (捕正後）請求の範囲第 1 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、自然乾燥または風乾によって乾燥させる、ことを特徴とする血液成分分析方法。

1 9 . (捕正後）請求の範囲第 1 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、凍結乾燥によって乾燥させる、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 0 . (補正後）請求の範囲第 1 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、熱乾燥によって乾燥させる、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 1 . (補正後）請求の範囲第 1 3項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤の濃度は、 0 . 0 5〜0 . 3 Mである、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 2 . (補正後）請求の範囲第 1 3項に記載の血液成分分析方法において、上記バイオセンサがワンステップの免疫クロマトグラフィー試験片である、ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 3 . (補正後）請求の範囲第 1 3項に記載の血液成分分析方法において、上記バイォセンサが乾式分析要素である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 4 .. (捕正後）単層または複数層の多孔質性材料からなる，試薬保持部位を有しクロマトグラフィーを利用したバイオセンサを用いる血液成分分析方法において、

上記試薬保持部位の少なくとも一部、または該試薬保持部位よりもクロマト上流側の少なくとも一部の、細胞収縮剤を担持した領域で細胞成分を収縮させあるいは収縮しながら、収縮した細胞成分が混在する状態でクロマト展開する、ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 5 . (補正後）請求の範囲第 2 4項に記載の血液成分分析方法において、添加する血液試料は、全血である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

補正された用紙（条約第 19条）

2 6 . (補正後）請求の範囲第 2 4項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤は、無機塩である、

ことを特 ί敷とする血液成分分析方法。

2 7 . (補正後）請求の範囲第 2 4項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤は、アミノ酸である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 8 . (補正後）請求の範囲第 2 4項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤は、糖類である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

2 9 . (補正後）請求の範囲第 2 4項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、自然乾燥または風乾によって乾燥させる. ことを特徴とする血液成分分析方法。

3 0 . (補正後）請求の範囲第 2 4項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、凍結乾燥によつて乾燥させる、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

3 1 . (補正後）請求の範囲第 2 4項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤を担持した担体を、熱乾燥によつて乾燥させる、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

3 2 . (補正後）請求の範囲第 2 4項に記載の血液成分分析方法において、上記細胞収縮剤の濃度は、 0 . 1〜5 . Ο Μである、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

3 3 . (補正後）請求の範囲第 2 4項に記載の血液成分分析方法において、上記バイォセンサがワンステツプの免疫ク口マトグラフィ一試験片である、ことを特徴とする血液成分分析方法。

3 4 . (補正後）請求の範囲第 2 4項に記載の血液成分分析方法において、上記バイォセンサが乾式分析要素である、

ことを特徴とする血液成分分析方法。

補正された用紙（条約第 19条）条約 19条（1) に基づく説明書請求の範囲第 10項は、細胞成分を最適な大きさに収縮させることによって、細胞成分分離効率を向上させることができることを明確にした。

引用例（ J P 1— 262470) は、赤血球を含む血液中の特定成分を定量分析する際に、特定量の塩化ナトリゥムまたは塩化力リゥムを多孔質展開層に含むことを特徴とし、引用例（J P 6— 94718) は、細胞成分と液性成分の展開速度が相異する展開支持体を用いたことを特徴とし、引用例（J P 11— 505

327) は、血液の液体部分を透過するが血液の細胞成分を捕足することができる多孔性物質製のパッドを備えたことを特徴とする。

本発明は、添加された液体試料中の細胞成分が、ノィォセンサに担持した細胞収縮剤と接触することによって収縮される点で、上記引用例とは異なる。すなわち、本発明は、全血や細菌溶液を検体としても、クロマト担体上を細胞成分が効率よく、かつ、展開溶液を加えなくとも十分に浸透することができる効果を得る。