WO2002038567A1 - Verfahren zur vitalitätsmessung an zellen - Google Patents

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WO2002038567A1
WO2002038567A1 PCT/EP2001/012997 EP0112997W WO0238567A1 WO 2002038567 A1 WO2002038567 A1 WO 2002038567A1 EP 0112997 W EP0112997 W EP 0112997W WO 0238567 A1 WO0238567 A1 WO 0238567A1
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Gabriele Gradl
Thomas Schnelle
Torsten Müller
Christoph Reichle
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Evotec Oai Ag
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
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    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48735—Investigating suspensions of cells, e.g. measuring microbe concentration

Definitions

  • the invention relates to a method for non-destructive vitality measurement on biological cells, in particular for the non-destructive determination of apoptosis on cells.
  • the method according to the invention also makes it possible to distinguish apoptotic cells from vital and necrotic damage.
  • the present invention relates to a method for identifying substances influencing apoptosis.
  • necrosis occurs in nature in two different forms, necrosis and apoptosis.
  • Necrosis is cell death due to unspecific physical or chemical damage.
  • its semipermeability to ions especially Ca 2+ , Na + , K +
  • the compartmentalization of the cell is thus removed and the cell contents are poured out. This process now triggers inflammatory reactions in the organism.
  • necrotic damage occurs within seconds to minutes.
  • apoptosis is a programmed cell death.
  • Apoptosis is an organized process that is needed in the development and maintenance of an organism to eliminate unwanted or damaged cells without damaging the whole organism. It is controlled by receptors (glucocorticoid-R, TNFR, Fas, NGFR) and is usually dependent on de novo protein synthesis. Cellular proteases (ICE, caspases) and endonucleases are activated. Since almost all cells in an organism can undergo apoptosis, the trigger of the apoptosis process must be under permanent and careful physiological control. In purely phenological enological terms, apoptosis can be divided into six successive stages. The following are divided: 1. shrinkage, 2.
  • zeiosis (plasma membrane protuberances), 3. chroatin collapse, 4. collapse of the cell nucleus, 5. disruption of the cell nucleus into smaller units and fragmentation of the cellular DNA, 6. pinching of apoptotic vesicles ( Thompson, CB, 1995, Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease, Science 267: 1456-1462).
  • the barrier function of the plasma membrane is retained throughout the process.
  • Apoptosis is triggered both by internal signals from the organism and by external influences, such as. B. radiation, chemical substances or active ingredients. Apoptosis is a process in which the first signs sometimes only become apparent after hours.
  • apoptotic cells In contrast to necrotic cells, apoptotic cells are recognized and removed by neighboring cells or macrophages (Orrenius, S., 1995, Apoptosis: molecular mechanisms and implications for human disease, J. Internal Medicine 237: 529-536). An inflammatory reaction does not occur here.
  • Diseases associated with blocking apoptosis are, in particular, cancers, such as B. Carcinomas with p53 mutations, hormone-dependent tumors; Autoimmune diseases such as B. rheumatoid arthritis, diabetic elitus; and viral infections such as B. Infections from herpes viruses, pox viruses, adenoviruses. Diseases presumably caused by an increased apoptosis rate are AIDS; neurodegenerative diseases, such as B. Alzheimer's, Parkinson's; by toxin, such as B. Large amounts of alcohol caused liver disease (Thompson, C. B., 1995, Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease, Science 267: 1456-1462).
  • a large number of methods based on apoptosis-specific parameters have therefore already been used to determine apoptosis. wraps. For example, these methods are based on the determination of the proportion of phosphatidylserine on the extracellular cell surface by binding Annexin V, the determination of hypodiploid cell nuclei, the determination of the cytosolic cytochrome C or caspase concentration or the determination of caspase activation.
  • Electron microscopy and phase contrast microscopy record the morphological phenomena during apoptosis, such as shrinkage, membrane protuberances and the occurrence of micronuclei (S. Verhaegen 1998, Microscopical Study of Cell Death Via Apoptosis, European Microscopy and Analysis).
  • the quantification of apoptosis in a sample by microscopy requires a high degree of experience of the experimenter in judgment and a manual counting of the cells after optical assessment or a suitable image processing program.
  • Another known method for detecting apoptosis in a sample of suspended cells requires the use of a flow cytometer. Fluorescent dyes that stain DNA are used here (KH Elstein and RM Zucker 1994, Comparison of cellular and Nuclear Flow Cytometric Techniques for Discriminating Apoptotic Subpopulations, Experimental Cell Research 211, 322-331) or a biochemical method is used for which makes the process of DNA fragmentation visible by incorporating fluorescence-labeled nucleotides (e.g.
  • apoptosis-influencing compound must not only be able to modulate apoptosis, but also to penetrate the intact cell membrane.
  • a variety of cellular receptors, Proteins, cell components and cofactors influence the process of apoptosis in living cells.
  • WO 98/02579 describes a screening assay for the identification of apoptosis-regulating substances in a cell-free system.
  • various apoptosis-specific parameters such as cytochrome C or CPP32 protease activity, are determined.
  • a supernatant from the cytosol of non-apoptotic cells obtained at 100,000 x g was used for screening.
  • the determination of substances affecting apoptosis was carried out by adding test compounds to this supernatant which could have a negative, positive or no effect on apoptosis. The results obtained in this way are compared with those of a reference.
  • WO 98/55615 discloses a screening assay for determining therapeutically active substances which influence apoptosis.
  • Cell-free assays are described that are designed to examine compounds that compete with cytochrome C for binding to Apaf-1.
  • assays for the determination of apoptosis-influencing substances are also described, which are determined by examining the proteolytic cleavage of caspase-3 precursors in the presence and absence of potential apoptosis-influencing substances.
  • WO 99/18856 describes a method for finding substances for stimulating or inhibiting enzymes in the apoptosis cascade, in particular caspases.
  • the process is carried out with zen cells or tissues.
  • part of the cells are treated with the test compounds and fluorescence-labeled reporter molecules, whereas another part is treated only with the reporters for control purposes.
  • a change in fluorescence in contrast to the control sample indicates that a substance to be examined influences enzymes in the cascade.
  • Frequently used cell-free assays for example for the determination of cytochrome C and other apoptosis-specific markers, are not suitable for determining the ability of apoptosis-influencing parameters to pass through the intact cell wall.
  • Dielectrophoretic techniques such as B. dielectric single spectroscopy (R. Pethig and GH Markx, 1997, Applications of dielectrophoresis in biotechnology, Trends in Biotechnology 15, 426-432) and electrorotation (T. Schnell, T. Müller and G. Fuhr, 1999, Dielectric Single particle spectroscopy for measurement of dispersion, Medical & Biological Engineering & Computing 37, 264-271) are already known per se.
  • the object of the present invention is to provide an improved method for non-destructive vitality measurement, in particular for the detection of apoptosis, on biological cells.
  • the invention is intended to enable the provision of an improved method for identifying substances influencing apoptosis.
  • the basic idea of the invention is to provide a method for non-destructive vitality measurement on cells by introducing at least one cell to be examined into a microsystem, in which the at least one cell is exposed to high-frequency rotating electrical fields or alternating electrical fields, in particular to impedance test sensors.
  • this method enables the differentiation of vital cells, necrotic cells and cells that are in the state of apoptosis.
  • the invention includes methods for determining apoptosis in suspended cells by dielectrophoretic techniques.
  • the method according to the invention has many advantages over the already known methods. For example, there is no need for specific detection reagents and the time required for sample preparation due to often multi-stage processes, as well as complex image analysis.
  • the method according to the invention also has individual cell sensitivity, specificity for the apoptotic process, enables the differentiation between necrotic and apoptotic cells, the detection and the automatic and rapid detection of apoptosis at an early stage. The cells only need to be in a suspended state for detection. The addition of one or more reagents is not necessary. The effort involved in sample preparation is therefore very low.
  • the method is not limited in terms of the number of cells, the process can be measured on individual cells.
  • the individual measurement is very fast (e.g. approx. 30 seconds in the case of electrorotation) and the recording of a time course on a single cell sample or a single cell is possible.
  • the method has no measurable influence on the vitality of the cells.
  • the method according to the invention for the non-destructive determination of apoptosis at an early stage is characterized in that the at least one cell to be examined is introduced into a microsystem in which the at least one cell is exposed to high-frequency alternating, in particular rotating, electrical fields and / or impedance test fields ,
  • At least one rotation measurement, a dielectrophoresis measurement and / or an impedance measurement is carried out on the cell for at least one frequency range or individual frequencies, from which at least one measurement parameter is determined which is characteristic of the vitality state of the cell.
  • At least one rotation measurement, a dielectrophoresis measurement and / or an impedance measurement is carried out on the at least one cell for at least two frequency ranges or at least two frequencies, with at least one value each for the measurement parameter, these at least two Values are compared with one another, and in this way it is determined in which state of vitality the cell is, in particular whether it is a cell in the state of apoptosis, necrosis or a vital cell.
  • the measurement parameter comprises rotational speed, traveling speed, electrophoretic mobility and / or impedance, in particular magnitude and / or phase.
  • the embodiment described here has the particular advantage that only at least two values have to be determined for a measurement parameter, so that there is considerable time saving compared to the recording of an entire spectrum. This embodiment is therefore particularly suitable for high-throughput screening.
  • a rotation spectrum on the cell by measuring the rotation speed (inverse rotation time) of the at least one cell as a function of the frequency of the rotating electric field, it being desirable that when the rotation speed is recorded, the at least one cell is simultaneously suspended in focus an optical trap, in particular optical tweezers.
  • the rotation measurement is preferably carried out on cells which are suspended in physiological solutions.
  • the conductivity of the solution is preferably in the range of 1 ... 1.6 S / m. However, it is not necessary to record complete spectra.
  • the rotating field preferably at a frequency of the frequency range from 1 to 4 MHz, preferably 2 to 3 MHz, particularly preferably 2.3 to 2.6 MHz, and the Frequency range 5 to 100 MHz, preferably 6 to 50 MHz, particularly preferably 8 to 15 MHz.
  • the rotational speed determined in the higher frequency range is compared to the rotational speed determined in the lower frequency range. If the determined ratio is greater than 1, particularly preferably 1.1 to 1.8, the cell examined is an apoptotic cell.
  • the ratio is less than 1 for necrotic cells, particularly preferably 0.6 to 0.8 and 1 for vital cells.
  • the rotation spectrum of the at least one cell to be examined is compared with the rotation spectrum of a reference cell, the reference cell being a vital, preferably the same cell type as the cell to be examined.
  • the reference cell is a cell brought into the state of apoptosis, preferably of the same cell type as the cell to be examined, or that the reference cell is a cell brought into the state of necrosis, preferably of the same cell type how the cell to be examined is.
  • the state of apoptosis can then preferably be determined in that the rotation spectrum of the cell to be examined, in contrast to the vital or necrotic reference cell, or comparable to the apoptotic reference cell, has its maximum in Frequency range from 5 to 100, preferably 6 to 50 MHz, particularly preferably 8 to 15 MHz.
  • Another embodiment of the method according to the invention is based on the different behavior of normal, necrotic and apoptotic cells in dielectrophoresis (DEP).
  • DEP dielectrophoresis
  • apoptosis For the determination of apoptosis according to the invention, it may therefore also be desirable to measure a dielectrophoresis spectrum, preferably in the frequency range from 0 to 5 MHz, particularly preferably from 1 to 4 MHz, by measuring the traveling speed or the electrophoretic mobility of the at least one cell as a function of the frequency of the electric field to investigate.
  • the at least one cell is kept in the focus of an optical trap.
  • apoptosis is determined in that the frequency crossing of the transition from negative to positive dielectrophoresis in the dielectrophoresis spectrum is in the range from 3.3 to 3.8 MHz, preferably at 3.5 MHz.
  • the traveling speed or the electrophoretic mobility of the at least one cell may also be desirable to determine the traveling speed or the electrophoretic mobility of the at least one cell only at at least 2 frequencies in the frequency range from 0-5 MHz, preferably 1-4 MHz.
  • the frequency crossing of the transition from negative to positive dielectrophoresis is 2.8 to 3.1 MHz, preferably 3 MHz, then the cell examined is a vital cell, it is 1.8 to 2.2 MHz, preferably at 2 MHz, there is a necrotic cell.
  • Apoptosis can also be determined by the fact that the dielectrophoresis spectrum and / or the at least 2 traveling speeds or electrophoretic mobilities of the at least one examining cell with the dielectrophoresis spectrum and / or the at least 2 migration speeds of the electrophoretic mobilities of a reference cell is compared, the reference cell being a vital, preferably the same cell type as the cell to be examined.
  • the reference cell is a cell brought into the state of apoptosis, preferably of the same cell type as the cell to be examined, or that the reference cell is a cell brought into the state of necrosis, preferably of the same cell type how the cell to be examined is.
  • the different force effect which is exerted on vital, apoptotic and necrotic cells by an alternating electric field, is used to separate the different cell types.
  • the increase in the internal conductivity and the dielectric constant of necrotic cells compared to vital cells leads to changed values of the real part of the electrical dipole moment.
  • the force effect on necrotic cells is significantly reduced, preferably in the frequency range above 1 MHz, compared to vital and apoptotic cells ( Figure 5), and so dielectric separation is possible.
  • Lowering the electrolyte content of the buffer solution to below a range of 0.3 S / m preferably results in a lower negative DEP in the frequency range up to 3 MHz for apoptotic and necrotic cells compared to vital cells.
  • a frequency range from 3 to 120 MHz there is an overly weakened positive DEP of apoptotic and normal cells compared to necrotic cells.
  • the frequency crossing of the transition from negative to positive DEP is here for apoptotic cells in the range from 3.3 to 3.8 MHz, preferably at 3.5 MHz, for vital cells in the range from 2.8 to 3.1 MHz at 3 MHz and for the necrotic cells in the range from 1.8 to 2.2 MHz, preferably at 2 MHz.
  • This enables an effective separation of all three cell types by dielectrophoretic forces.
  • the proportions of necrotic, apoptotic and vital cells in a sample can be determined (Figure 5B).
  • the apoptosis can also be determined by measuring the impedance property, in particular the amount and / or phase, of the at least one cell as a function of the frequency of the impedance test field.
  • An impedance spectrum is determined, the at least one cell preferably being held in the focus of an optical trap. It is also desirable that the impedance of individual cells between microelectrodes be determined in small volumes. It is also preferred that the impedance of the at least one cell is recorded at at least two frequencies in the frequency range from 1 Hz to 100 kHz, preferably 0.5 kHz to 10 kHz.
  • the impedance of a cell suspension is calculated as follows:
  • the contribution of solution 1 / Rext is small compared to the contribution of the individual cell. This applies either to small frequencies or to a small distance between the cell and the likewise small measuring electrodes (single cell impedance measurement), the single impedance measurement being particularly desirable for determining differences in the cytoplasmic properties in the megahertz range.
  • the cell changes during apoptosis lead to a changed impedance signal in the low-frequency range: 1 Hz - 100 kHz, preferably 0.5 kHz - 10 kHz. To determine apoptosis, it is therefore preferred to record impedance spectra in this frequency range.
  • the impedance spectrum and / or the at least 2 impedances (amount and / or phase) of the at least one cell to be examined with that of a reference cell and / or the at least 2 impedances (amount and / or phase) is compared, the reference cell being a vital, preferably the same cell type as the cell to be examined.
  • the reference cell is a cell brought into the state of apoptosis, preferably of the same cell type as the cell to be examined, or that the reference cell is a cell brought into the state of necrosis, preferably of the same cell type how the cell to be examined is.
  • the state of the apotosis can then preferably be determined by the fact that the impedance spectrum and / or the at least 2 impedances of the cell to be examined, in contrast to the vital one or necrotic reference cell, or comparable to the apoptotic reference cell, in particular in the frequency range from 1 Hz to 100 kHz, preferably 0.5 kHz to 10 kHz.
  • the rotation spectra and / or the at least 2 rotation speeds and / or the dielectrophoresis spectra it may be desirable for the rotation spectra and / or the at least 2 rotation speeds and / or the dielectrophoresis spectra. And / or the at least 2 migration speeds or electrophoretic mobilities and / or the impedance spectra and / or the at least 2 impedances are recorded as a function of time.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the diagnosis and / or therapy control of diseases and / or processes which are associated with an increase in the apoptosis rate, such as, in particular, AIDS, neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's, Parkinson's; liver diseases caused by poisons, especially alcohol; Diseases that produce too little hormone production or release are used.
  • diseases and / or processes which are associated with an increase in the apoptosis rate, such as, in particular, AIDS, neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's, Parkinson's; liver diseases caused by poisons, especially alcohol; Diseases that produce too little hormone production or release are used.
  • the method for determining apoptosis for the diagnosis and / or therapy control of diseases and / or processes associated with a reduction in the apoptosis rate, such as, in particular, malignant and benign hyperproliferative diseases such as cancer, hormone-dependent tumors, leukemia ;
  • autoimmune diseases in particular arthritis, diabetes mellitus and viral infections, in particular diseases caused by herpes viruses, pox viruses or adenoviruses.
  • the method according to the invention also enables cells to be examined, in particular due to its quick feasibility and also the small amounts required.
  • the procedure can even be performed on a single cell. It is therefore very well suited for monitoring the therapy of, in particular, malignant and benign hyperproliferative diseases when carrying out chemotherapy, radiotherapy, immunotherapy, surgery or a combination of these therapies.
  • At least two values are determined for a measurement parameter, and the apoptosis-influencing properties are determined by comparing these at least two values with one another. Furthermore, the apoptosis-influencing properties are determined by comparing at least one value for a measurement parameter of the at least one cell with the at least one cell of a reference sample.
  • the reference sample it is preferred to use a sample of the same cell type as the sample to be examined, before adding the at least one potential apoptosis-influencing substance.
  • the behavior of the at least one cell of the cell culture sample to be examined and the at least one cell of the reference sample in the electric field is examined by recording a rotation spectrum by measuring the rotational speed of each cell as a function of the frequency of the rotating electric fields.
  • the apoptosis-influencing properties of the at least one substance can be determined according to the invention in that the rotation spectrum of the at least one cell of the sample to be examined, in contrast to the spectrum of the at least one cell of the reference sample, a change in particular in the frequency range from 5 to 100, preferably 6 to 50 MHz, particularly preferably 8 to 15 MHz and / or in the frequency range from 1- 4 MHz, preferably 2 to 3 MHz, particularly preferably 2.3-2.6 MHz range.
  • the rotational speed of the cells of the cell sample and of the reference only at at least one frequency of the frequency range 1 to 4 MHz, preferably 2 to 3 MHz, particularly preferably 2.3 to 2.5 MHz and of the frequency range 5 up to 100 MHz, preferably 6 to 50 MHz, particularly preferably 8 to 15 MHz, the rotation speed determined in the higher frequency range being related to the rotation speed determined in the lower frequency range.
  • the ratio is greater than 1, particularly preferably 1.1 to 1.8; for a necrotic cell less than 1, particularly preferably 0.6 to 0.8 and for a vital cell equal to 1.
  • the apoptosis-influencing properties of the at least one substance are determined by the fact that in the dielectrophoresis spectrum the at least one cell to be examined, in contrast to the spectrum of the at least one cell of the reference sample, the frequency crossing of the transition from negative to positive dielectrophoresis is in the range from 3.3 to 3.8 MHz, preferably 3.5 MHz, the dielectrophoresis spectrum of the at least one cell of the sample to be examined is recorded in the frequency range from 0 to 5 MHz, preferably 1 to 4 MHz.
  • the behavior of the at least one cell of the cell culture sample to be examined and the at least one cell of the reference sample in the electrical field is determined by recording an impedance spectrum by measuring the impedance properties (amount and / or phase) of each cell as a function of the frequency of the impedance test field.
  • a further embodiment of the method describes that the apoptosis-influencing properties of the at least one substance are determined by the fact that, in contrast to the spectrum of the at least one cell of the reference sample, changes in the frequency range from 1 Hz to 100 kHz in the impedance spectrum of the at least one cell to be examined, preferably 0.5 kHz - 10 kHz, occur.
  • the at least one cell When recording the rotation spectrum at at least one frequency and / or a dielectrophoresis spectrum and / or an impedance spectrum, it may be desirable for the at least one cell to be kept in the focus of an optical trap.
  • the proportion of apoptotic cells in a sample For this purpose, the cells of a certain volume of the sample and / or of a certain volume of the reference sample to be performed. The separation can be carried out dielectrically. The number of apoptotic cells of the sample to be examined is then determined in relation to the number of apoptotic cells of the reference sample.
  • Apoptosis-increasing substances are characterized by an increase in the number of apoptotic cells in relation to the reference sample.
  • Substances that do not influence apoptosis are characterized by a proportion of apoptotic cells comparable to the reference sample.
  • Apoptosis-inhibiting substances are characterized by a lower number of apoptotic cells compared to the reference sample.
  • the natural apoptosis rate in cell cultures is often very low, it may also be desirable in the determination of potential apoptosis-inhibiting substances to add an apoptosis-increasing substance to the cell culture sample to be examined before or during the addition of the at least one substance to be tested , the cell culture sample mixed with an apoptosis-increasing substance and or a cell culture sample containing the same proportion of apoptosis-increasing substance being used as the reference sample.
  • An apoptosis-lowering substance is now characterized by the fact that it has a smaller proportion of apoptotic cells than the reference sample.
  • the determination of apoptosis according to the present invention enables apoptosis with a simple, efficient, fast and high-throughput method by detection determine early stages of apoptosis without destroying the cell.
  • Another advantage of the method according to the invention is that this method can be applied to cells in their physiological environment without changing the properties of the cell or its surface.
  • the methods for determining apoptosis-influencing substances are able to exactly determine their ability to penetrate the cell, taking into account the influence of receptors and cofactors.
  • the risk of a false positive or false negative determination of substances influencing apoptosis is significantly lower than with the known methods. It is also possible to determine cell-type or organ-specific modulators.
  • no specific fluorescent dyes penetrating the cell wall are necessary to carry out the method according to the invention.
  • FIG. 1 shows light micrographs of a normal (A) and an apoptotic (B) Jurkat cell (clone E6.1 from the European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, England). The apoptotic cell was treated with 5 ⁇ g / ml actinomycin D for 4 hours.
  • Cell (C) an RMA cell (Thymoma cell line from clone C57BL / 6 by Professor Dr. Peter Waiden, Charite, Berlin) (D) held for 40 minutes with 30 mW of optical tweezers of 1080 nm wavelength (D) and one for 4 hours with actinomycin D-treated Jurkat cell (E).
  • FIG. 3 shows the acceleration of the electrorotation and absorption of propidium iodide with necrotic damage to Jurkat Cells are shown by increasing the voltage in a dielectrophoretic octupole field cage.
  • A Rotation speed (inverse rotation time) of a Jurkat cell at 4.3 V
  • B Frequency of rotation of the same Jurkat cell after increasing the voltage to 6.8 V.
  • C Propidium iodide fluorescence of the Jurkat cell at 4 , 3 V
  • D Propidium iodide fluorescence of the same Jurkat cell after increasing the voltage to 6.8 V.
  • the electrorotation was measured as 4.3 V in each case. Three different cells were examined.
  • FIG. 4 shows the propidium iodide fluorescence of a normal U937 cell (A), an apoptotic U937 cell treated with actinomycin D-treated for 4 hours (monocytic cell line from the European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, England) (B) and a necrotic U937 cell (C).
  • FIG. 5 shows the electrorotation and dielectrophoresis of T lymphocytes (Jurkat) as a function of the field frequency.
  • Curves a, b and c belong to normal, necrotic and apoptotic cells.
  • A shows automatic measurements of the electrical rotation in PBS (conductivity 1.5 S / m) as well as curve fits corresponding to multi-shell spherical models with dispersion.
  • B shows the corresponding dielectrophoretic behavior, the indices of the curves corresponding to different external conductivities (1: 0.05 S / m, 2: 0.3 S / m, 3: 1.5 S / m (PBS)).
  • the dispersive material behavior is described as the sum of relaxations (dielectric constant ⁇ , conductivity ⁇ , angular frequency of the electric field ⁇ , relaxation time of the dispersion ⁇ , number of dispersions n): ⁇ k ⁇ k
  • FIG. 6 shows a side view of a microsystem for electrical rotation measurements in microchannels (CC Reichle, T. Schnell, T. Müller, T. Leya and G. Fuhr, 2000, A new microsystem for automated electrorotation measurements using laser tweezers, Biochimica et Biophysica Acta 1459, pp. 218-229).
  • Jurkat cells clone E6.1 from the European Collection of Animal
  • U937 cells Monocytic cell line from the European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, England;
  • RMA cells Thymoma cell line from clone C57BL / 6 by Professor Dr. Peter Waiden, Charite, Berlin, Ref: C. Reichle, K. Sparbier, T. Müller, T. Schnell, P. Waiden and G. Fuhr, in press, Combined laser tweezers and dielectric field cage for the analysis of multivalent receptor ligand interactions on single cells, ELECTROPHORESIS, miniaturization II;
  • PBS Phosphate Buffered Saline, with calcium and magnesium, Seromed / Biochrom, Berlin, Germany
  • RPMI 1640 Medium HEPES buffered, GIBCO Life Technologies
  • Jurkat T lymphoma cells and U937 monocytic cells were cultured in RPMI-1640 medium with the addition of 10% fetal calf serum and 100 IU / ml penicillin and 100 IU / ml streptomycin.
  • Apoptosis was triggered by adding 5 ⁇ g / ml actinomycin D in a culture sown the day before with 2 ⁇ 10 5 cells per ml.
  • the classic morphological changes during apoptosis were recorded photographically (see Figure 1).
  • electrorotation spectra (ER spectra) of ionomycin-treated cells (10 ⁇ g / ml ionomycin) and of cells whose plasma membrane was increased by increasing the voltage from 4 V to 6.8 V or treated with optical tweezers with 30- 60 mW (2.8 A of 1 W Nd: YAG-Laser, TEM 00 , 1064nm, LD 3000i, Laser Quantum Ltd., Machester, UK, PALM System) was damaged over 15 minutes.
  • the cells were transferred individually into the center of the quadrupole or octupole of the microelectrode system.
  • optical tweezers with approx.
  • the device for measuring the electrorotation was set up on a fluorescence correlation spectrometer.
  • the cells were imaged on a 40 x W 1.2 NA lens. They were excited with a helium-neon laser of 543 nm wavelength with 1.5 ⁇ W and the emitted fluorescence through a 585 DF 35 bandpass filter through a 50 ⁇ m pinhole onto a photodiode with which the fluorescence photons were counted.
  • the characteristic ER spectrum of a normal (A) Jurkat cell shown in FIG. 1 shows a broad peak of 1.5 to 7 MHz, at which a maximum rotational speed of the cell is measured, with a maximum around 2.5 MHz (FIG. 2 A).
  • a cell treated with the ionophore ionomycin (Calbiochem, Bad Soden, Germany) differs significantly in the ER spectrum (FIG. 2B) from a normal cell. Ionomycin causes an uptake of calcium from the extracellular space into the cell (JB Smith, T. Zheng and R.- M.
  • Electrorotation measurements at the two frequencies 2.5 MHz (FIG. 2 F) and 10 MHz (FIG. 2G) can already make the difference between these three different cell stages clearly recognizable.
  • the ratio of the rotational speed (in- rotation time) of the measurement at 10 MHz and the measurement at 2.5 MHz is close to 1 for the normal cell (with about 10% deviation).

Abstract

Es wird ein Verfahren zur zerstörungsfreien Vitalitätsmessung an biologischen Zellen, insbesondere zur Bestimmung von Apoptose beschrieben bei dem mindestens eine Zelle hochfrequenten alternierenden, insbesondere rotierenden, elektrischen Feldern und/oder Impedanzprüffeldern ausgesetzt wird und an der Zelle für mindestens einen Frequenzbereich oder einzelne Frequenzen mindestens eine Rotationsmessung, eine Dielektrophoresemessung und/oder eine Impedanzmessung erfolgen, aus denen mindestens ein Messparameter ermittelt wird, der für den Vitalitätszustand der Zelle charakteristisch ist.

Description

Verfahren zur Vitalitätsmessung an Zellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur zerstörungsfreien Vitalitätsmessung an biologischen Zellen, insbesondere zur zerstörungsfreien Bestimmung von Apoptose an Zellen. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es ferner, apoptotische Zellen von vitalen und nekrotisch geschädigten zu unterscheiden. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Apoptose beeinflussenden Substanzen.
Zelltod tritt in der Natur in zwei unterschiedlichen Erscheinungsformen auf, der Nekrose und der Apoptose. Die Nekrose ist der Zelltod durch eine unspezifische physikalische oder chemische Schädigung. Durch Verletzung der Barrierefunktion der Plasmamembran wird ihre Semipermeabilität für Ionen (besonders Ca2+, Na+, K+) gestört. Dadurch entsteht ein massiver Ionen- und Lösungseinstrom in die Zelle, in folge dessen sich die Zelle aufbläht und schließlich platzt. Die Kompartimentierung der Zelle wird somit aufgehoben und der Zellinhalt ausgeschüttet. Dieser Vorgang löst nun im Organismus Entzündungsreaktionen aus. In der Regel erfolgen nekrotische Schädigungen innerhalb von Sekunden bis Minuten.
Im Gegensatz dazu handelt es sich bei der Apoptose um einen programmierten Zelltod. Apoptose ist ein organisierter Prozeß, der in der Entwicklung und Erhaltung eines Organismus benötigt wird, um unerwünschte oder schadhafte Zellen zu eliminieren, ohne den Gesamtorganismus zu schädigen. Sie wird durch Rezeptoren kontrolliert (Glucocorticoid-R, TNFR, Fas, NGFR) und ist in der Regel von einer de-novo Proteinsynthese abhängig. Es werden zelluläre Proteasen (ICE, Caspasen) und Endonukleasen aktiviert. Da nahezu alle Zellen eines Organismus Apoptose durchlaufen können, muß der Auslöser des Apoptoseprozesses unter permanenter und sorgfältiger physiologischer Kontrolle stehen. Rein phäno enolo- gisch kann die Apoptose in sechs aufeinanderfolgende Stadien un- terteilt werden: 1. Schrumpfung, 2. Zeiosis (Plasmamembran- protuberanzen) , 3. Chro atinkollaps, 4. Kollabieren des Zellkerns, 5. Aufbrechen des Zellkerns in kleinere Einheiten und Fragmentierung der zellulären DNA, 6. Abschnüren von apop- totischen Vesikeln (Thompson, C. B., 1995, Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease, Science 267:1456-1462). Während des gesamten Prozesses bleibt die Barrierefunktion der Plasmamembran erhalten. Die Auslösung der Apoptose erfolgt sowohl durch interne Signale des Organismus als auch durch äußere Einflüsse, wie z. B. Strahlung, chemische Substanzen oder Wirkstoffe. Die Apoptose ist ein Vorgang, bei dem erste Anzeichen sich manchmal erst nach Stunden bemerkbar machen. Apoptotische Zellen werden im Gegensatz zu nekrotischen Zellen durch benachbarte Zellen oder Makrophagen erkannt und entfernt (Orrenius, S., 1995, Apoptosis: molecular mechanisms and implications for human disease, J. Internal Medicine 237:529-536). Eine Entzündungsreaktion tritt hier nicht auf.
Neuere Studien belegen, dass Störungen in der Regulation der Apoptose einer Vielzahl von Erkrankungen zu Grunde liegt. Krankheiten die mit einer Blockierung der Apoptose in Verbindung gebracht werden, sind insbesondere Krebserkrankungen, wie z. B. Carcinome mit p53 Mutationen, hormon-abhängige Tumore; Autoim- mun-Krankheiten, wie z. B. rheumatische Arthritis, Diabetis el- litus; und virale Infektionen, wie z. B. Infektionen durch Her- pesviren, Poxviren, Adenoviren. Krankheiten die vermutlich durch eine erhöhte Apoptoserate verursacht werden, sind insbesondere AIDS; neurodegenerative Erkrankungen, wie z. B. Alzheimer, Parkinson; durch Toxin, wie z. B. große Alkoholmengen verursachte Lebererkrankungen (Thompson, C. B., 1995, Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease, Science 267:1456-1462).
Zur Bestimmung der Apoptose wurden daher bereits eine Vielzahl von Verfahren auf der Basis apoptose-spezifischer Parameter ent- wickelt. Beispielsweise basieren diese Methoden auf der Bestimmung des Phosphatidylserin-Anteils auf der extrazellulären Zelloberfläche durch die Bindung von Annexin V, die Bestimmung von hypodiploiden Zellkernen, der Bestimmung der cytosolischen Cy- tochrom C- oder Caspase-Konzentration oder der Bestimmung der Caspase-Aktivierung.
Die Detektion erfolgt durch mikroskopische, fluoreszenzbasierende und biochemische Verfahren. Die Elektronenmikroskopie und die Phasenkontrast-Mikroskopie erfassen beispielsweise die morphologischen Erscheinungen beim Ablauf der Apoptose, wie Schrumpfung, Membranprotuberanzen und das Auftreten von Mikro- nuklei (S. Verhaegen 1998, Microscopical Study of Cell Death Via Apoptosis, European Microscopy and Analysis) . Allerdings erfordert die Quantifizierung der Apoptose in einer Probe über Mikroskopie ein hohes Maß an Erfahrung des Experimentators im Urteilsvermögen und ein manuelles Auszählen der Zellen nach optischer Beurteilung oder ein geeignetes Bildverarbeitungsprogramm.
Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Erfassung von Apoptose in einer Probe suspendierter Zellen erfordert die Verwendung eines Durchflußzytometers. Hier werden Fluoreszenzfarbstoffe, die DNA anfärben, verwendet (K. H. Elstein and R. M. Zucker 1994, Compa- rison of cellular and Nuclear Flow Cytometric Techniques for Discriminating Apoptotic Subpopulations, Experimental Cell Research 211, 322-331) oder es wird ein biochemisches Verfahren eingesetzt, bei dem der Prozeß der DNA-Fragmentierung durch den Einbau fluoreszenzmarkierter Nukleotide sichtbar gemacht wird (z. B. TÜNEL-Methode, R. S. Douglas, A. D. Tarshis, C. H. Plet- cher, P. C. Nowell und J. S. Moore, 1995, A simplified method for the coordinate examination of apoptosis and surface phenoty- pe of murine ly phocytes, Journal of Immunological Methods 188, 219-228) . Ebenso werden für Zeiloberflächenmoleküle spezifische fluoreszenzmarkierte Sonden eingesetzt. Ein Beispiel für eine solche Sonde ist fluoreszenzmarkiertes Annexin-V (G. Koopman, C.P.M. Reutlingsperger, G.A.M. Kuijten, R.M.J. Keehnen, S.T. Pals und M.H.J. van Oers, 1994, Annexin V for Flow Cytometric Detection of Phosphatidylserine Expression on B Cells Undergoing Apoptosis, Blood 84,5, 1415-1420), welches an Phosphatidylserin auf der Zelloberfläche bindet und so eine Umstrukturierung der Plasmamembran im Frühstadium der Apoptose sichtbar macht. Allerdings erfordern alle durchflusszytometrischen-Methoden zur Messung der Apoptose eine Kalibrierung der Methode und des Systems. Zudem ist eine hohe Anzahl von Zellen (ca. 106) für eine Analyse notwendig.
Weitere Methoden zum Nachweis der Apoptose erfordern die Zerstörung aller Zellen einer Probe und den gelelektrophoretischen o- der biochemischen Nachweis der DNA-Fragmentierung (M. Leist, F. Gantner, I. Bohlinger, P. G. Germann, G. Tiegs und A. Wendel, 1994, Murine Hepatocyte Apoptosis Induced In Vitro and In Vivo by TNF-a Requires Transcriptional Arrest, The Journal of Immuno- logy 153, 1778-1788) . Es handelt sich bei diesen biochemischen Methoden um mehrstufige Prozesse unter Verwendung von mehreren Reagenzien. Dies führt zu einer sehr langen Analysendauer von bis zu 6 Stunden. Zudem werden mehrere hundert Zellen für eine Analyse benötigt.
Durch die Relevanz einer gestörten Regulation der Apoptose im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Erkrankungen ist die Untersuchung der Apoptose auch ein zentraler Bestandteil bei der Suche nach neuen pharmazeutischen Wirkstoffen, bei der Beurteilung ihrer Wirksamkeit gegenüber Erkrankungen sowie in der Umweltanalytik. Generell muss eine Apoptose-beeinflussende Verbindung nicht nur dazu in der Lage sein, Apoptose zu modulieren, sondern auch die intakte Zellmembran zu durchdringen. Darüber hinaus wird angenommen, dass eine Vielzahl von zellulären Rezeptoren, Proteinen, Zellbestandteilen und Kofaktoren den Prozeß der Apoptose in lebenden Zellen beeinflusst.
Es wurde daher bereits eine Vielzahl von Screeningverfahren zur Identifizierung Apoptose-beeinflussender Substanzen, die auf der Bestimmung Apoptose-spezifischer Parameter in der Zelle oder in zellfreien Systemen beruhen, entwickelt.
So beschreibt beispielsweise WO 98/02579 einen Screening Assay zur Identifizierung von Apoptose-regulierenden Substanzen in einem zellfreien System. Zur Bestimmung von Apoptose werden hier verschiedene Apoptose-spezifische Parameter, wie beispielweise Cytochrome C oder CPP32 Protease-Aktivität bestimmt. Zum Scree- nen wurde ein bei 100000 x g gewonnener Überstand vom Cytosol nicht-apoptotischer Zellen eingesetzt. Die Bestimmung von Apop- tose-beinflussenden Substanzen wurde durch Zugabe von Testverbindungen, die einen negativen, positiven oder keinen Einfluß auf die Apoptose haben können, zu diesem Überstand, durchgeführt. Die so erzielten Ergebnisse werden mit denen einer Referenz verglichen.
WO 98/55615 offenbart einen Screening Assay zur Bestimmung von therapeutisch wirksamen Substanzen, die Apoptose-beeinflussen. Es werden zellfreie Assays beschrieben, die so ausgelegt sind, Verbindungen zu untersuchen, die mit Cytochrom C um die Bindung an Apaf-1 konkurrieren. Darüber hinaus werden auch Assays zur Bestimmung Apoptose-beeinflussenden Substanzen beschrieben, die auf der Untersuchung der proteolytischen Spaltung von Caspase-3 Vorläufern in Gegenwart und Abwesenheit von potentiellen Apoptose beeinflussenden Substanzen bestimmt.
In WO 99/18856 wird ein Verfahren zur Auffindung von Substanzen zur Anregung oder Inhibierung von Enzymen der Apoptose-Kaskade, insbesondere Caspasen, beschrieben. Das Verfahren wird mit gan- zen Zellen oder Geweben durchgeführt. Hierzu wird ein Teil der Zellen mit den Testverbindungen und fluoreszenz- markierten Reportermolekülen behandelt, wohingegen ein anderer Teil zur Kontrolle nur mit den Reportern behandelt wird. Eine Änderung der Fluoreszenz im Gegensatz zur Kontrollprobe zeigt an, dass eine zu untersuchende Substanz Enzyme der Kaskade beeinflußt.
Insgesamt weisen jedoch alle bisher bekannten Verfahren zur Bestimmung von Apoptose oder Apoptose modulierenden Substanzen eine Vielzahl von Nachteilen auf. So sind sie oft sehr zeitaufwendig aufgrund von aufwendigen experimentellen Schritten und benötigen zudem eine große Menge an z.B. Antikörpern, Farbstoffen und weiteren Reagenzien, die in die Zelle eindringen können. Da- rüberhinaus basieren die meisten Verfahren auf einer abschließenden Lyse der Zellen, was letztendlich zu einer Zerstörung der Zellen führt. Andere untersuchte Parameter, wie z.B. Annexin V sind nicht Apoptose-spezifisch, wieder andere Verfahren benötigen große Mengen an Zellen. Darüber hinaus sind viele Verfahren nur geeignet, späte Stadien der Apoptose zu untersuchen, die häufig in vivo nicht auftreten, da die apoptotischen Zellen in diesem Stadium bereits durch Phagozytose von benachbarten Zellen oder Makrophagen aufgenommen wurden.
Häufig eingesetzte zellfreie Assays wiederum, wie beispielweise zur Bestimmung von Cytochrom C und anderen Apoptose-spezifischen Markern sind nicht dazu geeignet, die Fähigkeit von Apoptose- beeinflussenden Parametern, die intakte Zellwand zu passieren, zu bestimmen.
Darüber hinaus wird angenommen, dass verschiedene Zelltypen unterschiedliche Rezeptoren und Kofaktoren zur Apoptose Modulation besitzen. Es ist aus diesem Grund nicht möglich, mit zellfreien- Assays Zelltyp-spezifische oder organspezifische Apoptose- Modulatoren zu finden. Durch die Vernachlässigung der Bedeutung der zellulären Rezeptoren und anderer Kofaktoren durch die Mehrheit der bekannten Assays ist die Gefahr der Identifizierung von falsch-positiven oder falsch-negativen Apoptose-beeinflussenden Substanzen hoch, da diese Substanzen in lebenden Zellen keine oder nicht die erwartete Wirkung zeigen. Zudem werden Apotose-beeinflussende Substanzen, die Apoptose indirekt über einen dieser Rezeptoren oder Kofaktoren modulieren, nicht erfaßt.
Unter Beachtung der beschriebenen Nachteile der bekannten Verfahren ist es wünschenswert, ein zur eindeutigen Identifizierung von Apoptose und der Bestimmung von Apoptose-modulierenden Substanzen geeignetes Verfahren zur Verfügung zu haben. Dieses Verfahren sollte dazu in der Lage sein, Apoptose in einem frühen Stadium zu erkennen, einfach und mit ganzen Zellen durchführbar sein.
Dielektrophoretische Techniken, wie z. B. die dielektrische Einzelspektroskopie (R. Pethig und G. H. Markx,1997, Applications of dielectrophoresis in biotechnology, Trends in Biotechnology 15, 426-432) und die Elektrorotation (T. Schnelle, T. Müller und G. Fuhr, 1999, Dielectric Single particle spectroscopy for measurement of dispersion, Medical & Biological Engineering & Computing 37, 264-271) sind an sich bereits bekannt.
Es sind auch bereits Vorrichtungen zur Messung der Elektrorotation unter Zuhilfenahme einer optischen Pinzette (T. Schnelle, T. Müller, C. Reichle und G. Fuhr 2000, Combined dielectrophore- tic field cages and laser tweezers for electrorotation, Applied Physics B, Lasers and Optics, Springer-Verlag) und einer automatischen Signalaufnahme (C. Reichle, T. Müller, T. Schnelle und G. Fuhr 1999, Electro-rotation in octopole micro cages, Journal of Physics D: Applied Physics 32, 2128-2135; De Gasperis, Wang, Yang, Becker und Gascoyne 1998, Meas. Sei. Technol. 9, 518-529) bekannt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur zerstörungsfreien Vitalitätsmessung, insbesondere zur Erfassung von Apoptose, an biologischen Zellen bereitzustellen. Die Erfindung soll insbesondere die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Identifizierung von Apoptose- beeinflussenden Substanzen ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch Verfahren mit den Merkmalen gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Die Grundidee der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur zerstörungsfreien Vitalitätsmessung an Zellen durch Einbringen mindestens einer zu untersuchenden Zelle in ein Mikrosystem, bei dem die mindestens eine Zelle hochfrequenten rotierenden elektrischen Feldern oder elektrischen Wechselfeldern, insbesondere Impedanzprüffeidern, ausgesetzt ist.
Insbesondere ermöglicht dieses Verfahren die Unterscheidung von vitalen Zellen, nekrotischen Zellen und Zellen, die sich im Zustand der Apoptose befinden.
Die Erfindung beinhaltet in bevorzugten Ausführungsformen Verfahren zur Feststellung der Apoptose in suspendierten Zellen durch dielektrophoretische Techniken.
Eine Unterscheidung insbesondere von vitalen, nekrotischen und apoptotischen Zellen ist mit den erläuterten herkömmlichen Verfahren nicht möglich. Darüber hinaus weist das erfindungsgemäße Verfahren viele Vorteile gegenüber den bereits bekannten Verfahren auf. So entfällt beispielsweise die Notwendigkeit von spezifischen Nachweisreagenzien sowie der dadurch bedingte Zeitaufwand bei der Probenaufbereitung durch oft mehrstufige Prozesse, wie auch aufwendige Bildanalysen. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt zudem Ein- zelzell-Sensitivität, Spezifität für den apoptotischen Prozeß, ermöglicht die Unterscheidung von nekrotischen und apoptotischen Zellen, den Nachweis und die automatische und schnelle Erfassung der Apoptose in einem frühen Stadium. Für die Erfassung müssen die Zellen lediglich in einem suspendierten Zustand vorliegen. Die Zugabe von einem oder mehreren Reagenzien ist nicht erforderlich. Der Aufwand bei der Probenvorbereitung ist somit sehr gering. Das Verfahren ist bezüglich der Anzahl an Zellen nicht limitiert, der Vorgang kann an einzelnen Zellen gemessen werden. Die Einzelmessung ist sehr schnell (z. B. ca. 30 Sekunden im Falle der Elektrorotation) und die Aufnahme eines zeitlichen Verlaufes an einer einzigen Zellprobe oder einer einzelnen Zelle ist möglich. Zudem hat das Verfahren keinen meßbaren Einfluß auf die Vitalität der Zellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur zerstörungsfreien Bestimmung der Apoptose in einem frühen Stadium zeichnet sich dadurch aus, dass die mindestens eine zu untersuchende Zelle in ein Mikrosystem eingebracht wird, bei dem die mindestens eine Zelle hochfrequenten alternierenden, insbesondere rotierenden, elektrischen Feldern und/oder Impedanzprüffeldern ausgesetzt wird.
Dabei ist es bevorzugt, dass an der Zelle für mindestens einen Frequenzbereich oder einzelne Frequenzen mindestens eine Rotationsmessung, eine Dielektrophorese essung und/oder eine Impedanzmessung durchgeführt wird, aus der mindestens ein Messparameter ermittelt wird, der für den Vitalitätszustand der Zelle charakteristisch ist. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird an der mindestens einen Zelle für mindestens zwei Frequenzbereiche oder mindestens zwei Frequenzen, je mindestens eine Rotationsmessung, eine Dielektrophoresemessung und/oder eine Impedanzmessung durchgeführt, unter Erhalt von je mindestens einem Wert für den Messparameter, diese mindestens zwei Werte miteinander verglichen werden, und so ermittelt wird, in welchem Vitalitätszustand sich die Zelle befindet, insbesondere ob es sich um eine Zelle im Zustand der Apoptose, der Nekrose oder um eine vitale Zelle handelt. Hierbei ist es besonders bevorzugt, dass der Messparameter Rotationsgeschwindigkeit, Wandergeschwindigkeit, elektrophoretische Beweglichkeit und/oder Impedanz, insbesondere Betrag und/oder Phase umfasst.
Die hier beschriebene Ausführungsform hat insbesondere den Vorteil, dass nur mindestens zwei Werte für einen Messparameter bestimmt werden müssen, somit eine erhebliche Zeitersparnis gegenüber der Aufnahme eines gesamten Spektrums vorliegt. Daher ist diese Ausführungsform insbesondere für das Hochdurchsatzscree- ning geeignet.
Besonders bevorzugt ist die Ermittlung eines Rotationsspektrums an der Zelle durch Messung der Rotationsgeschwindigkeit (inverse Rotationszeit) der mindestens einen Zelle in Abhängigkeit von der Frequenz des rotierenden elektrischen Feldes, wobei es wünschenswert ist, dass bei Aufnahme der Rotationsgeschwindigkeit die mindestens eine Zelle gleichzeitig suspendiert im Fokus einer optischen Falle, insbesondere einer optischen Pinzette, gehalten wird. Die Rotationsmessung erfolgt vorzugsweise an Zellen, die in physiologischen Lösungen suspendiert sind. Die Leitfähigkeit der Lösung liegt vorzugsweise im Bereich von 1 ... 1.6 S/m. Es ist allerdings nicht erforderlich, vollständige Spektren aufzunehmen. Vielmehr ist es ausreichend, die Messungen bei einer oder mehreren festgelegten Frequenzen des rotierenden Feldes vorzunehmen, vorzugsweise bei je einer Frequenz des Frequenzbereiches von 1 bis 4 MHz, vorzugsweise 2 bis 3 MHz, besonders bevorzugt 2,3 bis 2,6 MHz, und des Frequenzbereiches 5 bis 100 MHz, vorzugsweise 6 bis 50 MHz besonders bevorzugt 8 bis 15 MHz.
Zur Feststellung, ob eine untersuchte Zelle sich im Zustand der Apoptose befindet, wird die im höheren Frequenzbereich bestimmte Rotationsgeschwindigkeit zu der im niedrigeren Frequenzbereich bestimmten Rotationsgeschwindigkeit ins Verhältnis gesetzt. Ist das ermittelte Verhältnis größer als 1, besonders bevorzugt 1,1 bis 1,8, handelt es sich bei der untersuchten Zelle um eine apoptotische Zelle. Für nekrotische Zellen ist das Verhältnis kleiner 1, besonders bevorzugt 0,6 bis 0,8 und für vitale Zellen gleich 1.
Zur Bestimmung der Apoptose ist es aber auch möglich, dass das Rotationsspektrum der mindestens einen zu untersuchenden Zelle mit dem Rotationsspektrum einer Referenzzelle verglichen wird, wobei es sich bei der Referenzzelle um eine vitale, bevorzugt desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Zelle handeln kann. Es ist aber ebenso wünschenswert, dass es sich bei der Referenzzelle um eine gezielt in den Zustand der Apoptose gebrachte Zelle, bevorzugt desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Zelle handelt, oder dass die Referenzzelle eine gezielt in den Zustand der Nekrose gebrachte Zelle, bevorzugt desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Zelle ist.
Der Zustand der Apoptose läßt sich dann bevorzugt dadurch feststellen, dass das Rotationsspektrum der zu untersuchenden Zelle im Gegensatz zur vitalen oder nekrotischen Referenzzelle, oder vergleichbar zur apoptotischen Referenzzelle sein Maximum im Frequenzbereich von 5 bis 100, bevorzugt 6 bis 50 MHz, besonders bevorzugt 8 bis 15 MHz aufweist.
Eine weitere Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens basiert auf dem unterschiedlichen Verhalten von normalen, nekrotischen und apoptotischen Zellen in der Dielektrophorese (DEP) .
Zur erfindungsgemäßen Bestimmung von Apoptose kann es daher auch wünschenswert sein, durch Messung der Wandergeschwindigkeit oder der elektrophoretischen Beweglichkeit der mindestens einen Zelle in Abhängigkeit von der Frequenz des elektrischen Feldes ein Dielektrophoresespektrum bevorzugt im Frequenzbereich von 0 bis 5 MHz, besonders bevorzugt von 1 bis 4 MHz zu ermitteln. Wobei in einer speziellen Ausführungsform die mindestens eine Zelle im Fokus einer optischen Falle gehalten wird. Erfindungsgemäß wird Apoptose dadurch festgestellt, dass der Frequenzdurchtritt des Überganges von negativer zu positiver Dielektrophorese im Dielektrophoresespektrum im Bereich von 3,3 bis 3,8 MHz, bevorzugt bei 3,5 MHz liegt.
Es kann aber ebenfalls wünschenswert sein, die Wandergeschwindigkeit oder die elektrophoretische Beweglichkeit der mindestens einen Zelle nur bei mindestens 2 Frequenzen des Frequenzbereiches von 0 - 5 MHz, bevorzugt 1 - 4 MHz zu bestimmen.
Liegt der Frequenzdurchtritt des Überganges von negativer zu positiver Dielektrophorese bei 2,8 bis 3,1 MHz, bevorzugt bei 3 MHz, so handelt es sich bei der untersuchten Zelle um eine vitale Zelle, liegt er bei 1,8 bis 2,2 MHz, bevorzugt bei 2 MHz, so liegt eine nekrotische Zelle vor.
Apoptose läßt sich auch dadurch bestimmen, dass das Dielektrophoresespektrum und/der die mindestens 2 Wandergeschwindigkeiten oder elektrophoretischen Beweglichkeiten der mindestens einen zu untersuchenden Zelle mit dem Dielektrophoresespektrum und/oder die mindestens 2 Wandergeschwindigkeiten der elektrophoretischen Beweglichkeiten einer Referenzzelle verglichen wird, wobei es sich bei der Referenzzelle um eine vitale, bevorzugt desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Zelle handeln kann. Es ist aber ebenso wünschenswert, dass es sich bei der Referenzzelle um eine gezielt in den Zustand der Apoptose gebrachte Zelle, bevorzugt desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Zelle handelt, oder dass die Referenzzelle eine gezielt in den Zustand der Nekrose gebrachte Zelle, bevorzugt desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Zelle ist.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die unterschiedliche Kraftwirkung, die durch ein elektrisches Wechselfeld auf vitale, apoptotische und nekrotische Zellen ausgeübt wird, ausgenutzt, um die verschiedenen Zelltypen zu trennen. Die Erhöhung der Innenleitfähigkeit und der Dielektrizitätskonstante von nekrotischen Zellen gegenüber vitalen Zellen, führt zu veränderten Werten des Realteiles des elektrischen Dipolmomentes. In PBS-Puffer ist die Kraftwirkung auf nekrotische Zellen gegenüber vitalen und apoptotischen Zellen bevorzugt im Frequenzbereich über 1 MHz deutlich verringert (Abbildung 5) und so eine dielektrische Separation möglich.
Eine Absenkung des Elektrolytgehaltes der Pufferlösung unter einen Bereich um 0.3 S/m bedingt vorzugsweise im Frequenzbereich bis 3 MHz für apoptotische und nekrotische Zellen eine geringere negative DEP im Vergleich zu vitalen Zellen. In einem Frequenzbereich von 3 bis 120 MHz kommt es dem gegenüber zu stark abgeschwächter positiver DEP von apoptotischen und normalen Zellen im Vergleich zu nekrotischen Zellen. Der Frequenzdurchtritt des Überganges von negativer zu positiver DEP liegt für apoptotische Zellen hier im Bereich von 3,3 bis 3,8 MHz, bevorzugt bei 3,5 MHz, für vitale Zellen im Bereich von 2,8 bis 3,1 MHz, bevorzugt bei 3 MHz und für die nekrotischen Zellen im Bereich von 1,8 bis 2,2 MHz, bevorzugt bei 2 MHz. Somit ist eine effektive Trennung aller drei Zelltypen durch dielektrophoretische Kräfte möglich. So lassen sich beispielsweise die Anteile von nekrotischen, apoptotischen und vitalen Zellen einer Probe ermitteln (Abbildung 5B) .
Entsprechend einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, kann die Bestimmung der Apoptose auch durch Messung der Impedanzeigenschaft, insbesondere Betrag und/oder Phase, der mindestens einen Zelle in Abhängigkeit von der Frequenz des Impedanzprüffeldes erfolgen. Es wird ein Impedanzspektrum ermittelt, wobei vorzugsweise die mindestens eine Zelle im Fokus einer optischen Falle gehalten wird. Ebenfalls wünschenswert ist, dass die Impedanz einzelner Zellen zwischen Mikroelektroden in kleinen Volumina bestimmt wird. Es ist darüber hinaus bevorzugt, dass die Impedanz der mindestens einen Zelle bei mindestens zwei Frequenzen im Frequenzbereich von 1 Hz bis 100 kHz, bevorzugt 0.5 kHz bis 10 kHz aufgezeichnet wird. Die Impedanz einer Zellsuspension berechnet sich zu:
Z(ω) =
+
R. Rr + icoC M J
(Fricke, H., 1923, The electric capacity of cell suspensions, Phys . Rev. 21, 708-709), wobei Rext den externen Lösungswiderstand, Rc den Zytoplasmawiderstand und CM die Membrankapazität darstellen. Für eine genaue Analyse biologischer Zellen sind komplexe Modelle nötig, die die Kapazität und Ohm' sehen Anteile aller Kompartimente widerspiegeln (Irimajiri, A. , Suzaki, T., Asami, K. und Hanai, T., 1991, Dielectric Modeling of Biological Cells. Models and Algorithm, Bull. Inst. Chem. Res. Kyoto Univ. 69/4, S. 421-438) .
Um erfindungsgemäß eine hohe Empfindlichkeit der Messung zu gewährleisten, ist es wünschenswert, dass der Beitrag der Lösung 1/Rext klein gegenüber dem Beitrag der einzelnen Zelle ist. Dies gilt entweder für kleine Frequenzen oder für einen geringen Abstand zwischen der Zelle und den ebenfalls kleinen Messelektroden (Einzelzellimpedanzmessung) , wobei die Einzelimpedanzmessung zur Bestimmung von Differenzen der Zytoplasmaeigenschaften im Megahertz-Bereich besonders wünschenswert ist. Zusätzlich führen die Zellveränderungen während der Apoptose zu einem veränderten Impedanzsignal im niederfrequenten Bereich: 1 Hz - 100 kHz, bevorzugt 0,5 kHz - 10 kHz. Zur Bestimmung der Apoptose ist es daher bevorzugt Impedanzspektren in diesem Frequenzbereich aufzunehmen.
Zur Bestimmung der Apoptose ist es auch möglich, dass das Impedanzspektrum und/oder die mindestens 2 Impedanzen (Betrag und/oder Phase) der mindestens einen zu untersuchenden Zelle mit dem einer Referenzzelle und/oder die mindestens 2 Impedanzen (Betrag und/oder Phase) verglichen wird, wobei es sich bei der Referenzzelle um eine vitale, bevorzugt desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Zelle handeln kann. Es ist aber ebenso wünschenswert, dass es sich bei der Referenzzelle um eine gezielt in den Zustand der Apoptose gebrachte Zelle, bevorzugt desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Zelle handelt, oder dass die Referenzzelle eine gezielt in den Zustand der Nekrose gebrachte Zelle, bevorzugt desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Zelle ist.
Der Zustand der Apotose läßt sich dann bevorzugt dadurch feststellen, dass das Impedanzspektrum und/oder die mindestens 2 Impedanzen der zu untersuchenden Zelle im Gegensatz zur vitalen oder nekrotischen Referenzzelle, oder vergleichbar zur apoptotischen Referenzzelle insbesondere im Frequenzbereich von 1 Hz - 100 kHz, bevorzugt 0,5 kHz - 10 kHz Änderungen aufweist.
Zur Verfolgung der zeitlichen Änderung der Eigenschaften der mindestens einen Zelle, insbesondere zur Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der Apoptose, kann es wünschenswert sein, dass die Rotationsspektren und/oder die mindestens 2 Rotationsgeschwindigkeiten und/oder die Dielektrophoresespektren .und/oder die mindestens 2 Wandergeschwindigkeiten oder elektrophoretischen Beweglichkeiten und/oder die Impedanzspektren und/oder die mindestens 2 Impedanzen in Abhängigkeit von der Zeit aufgenommen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Vorhabens wird folgender Verfahrensverlauf vorgesehen:
- Bereitstellen mindestens einer zu untersuchenden Zellprobe,
- Einbringen der mindestens einen Zelle der zu untersuchenden Zellprobe in ein Mikrosystem und Ermittlung des mindestens einen Messparameters, der für den Vitalitätszustand der Zelle charakteristisch ist,
- Separation der Zellen der zu untersuchenden Zellprobe oder eines bestimmten Volumens dieser Zellprobe nach ihrem Vi- talitätszustand.
Insgesamt eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle von Krankheiten und/oder Prozessen, die mit einer Erhöhung der Apoptoserate verbunden sind, wie insbesondere AIDS, neurodegenerative Erkrankungen, insbesondere Alzheimer, Parkinson; durch Gifte, insbesondere Alkohol, verursachte Leberkrankheiten; Krankheiten, die eine zu geringe Hormonproduktion oder -ausschüttung hervorrufen, eingesetzt werden. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, das Verfahren zur Bestimmung von Apoptose zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle von Krankheiten und/oder Prozessen die mit einer Erniedrigung der Apoptoserate verbunden sind, wie insbesondere maligne und be- nigne hyperproliferative Erkrankungen, wie Krebs, hormonabhängige Tumore, Leukämie; Autoimmunkrankheiten, insbesondere Arthritis, Diabetis mellitus und virale Infektionen, insbesondere durch Herpesviren, Poxviren oder Adenoviren hervorgerufene Krankheiten, einzusetzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht ferner, insbesondere aufgrund seiner schnellen Durchführbarkeit und auch der geringen benötigten Mengen zu untersuchender Zellen. Das Verfahren kann sogar an einer einzelnen Zelle durchgeführt werden. Es ist somit sehr zu gut zur Therapiekontrolle von insbesondere malignen und benignen hyperproliferativen Erkrankungen bei der Durchführung einer Chemotherapie, Radiotherapie, Immuntherapie, Operationen oder einer Kombination dieser Therapien, geeignet.
Erfindungsgemäß ist es auch gelungen ein Verfahren bereitzustellen, dass die Identifizierung von Apoptose-beeinflussenden Substanzen unter Berücksichtigung der zellulären Rezeptoren und anderer Kofaktoren erlaubt und so die Gefahr der Identifizierung von falsch-positiven oder falsch-negativen Apoptose- beeinflussenden Substanzen herabsetzt.
Ein erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Apoptose- beeinflussenden Substanzen ist insbesondere durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:
- Bereitstellen mindestens einer zu untersuchenden Zellkulturprobe,
- Zugabe einer potentiellen Apoptose beeinflussenden Substanz oder Mischungen aus mindestens zwei dieser Substanzen, - Einbringen mindestens einer Zelle der zu untersuchenden Zellkulturprobe in ein Mikrosystem und Ermittlung des mindestens einen Messparameters, der für den Vitalitätszustand der Zelle charakteristisch ist, wobei insbesondere die mindestens eine Zelle hochfrequenten alternierenden, insbesondere rotierenden, elektrischen Feldern und/oder Impedanzprüffeldern ausgesetzt wird,
- Bestimmung der Apoptose-beeinflussenden Eigenschaften, insbesondere durch Vergleich des Verhaltens dieser mindestens einen Zelle im elektrischen Feld mit dem mindestens einer Zelle einer Referenzprobe .
In einer bevorzugten Ausführungsform werden mindestens zwei Werte für einen Messparameter bestimmt, und die Apoptose-beeinflussenden Eigenschaften werden durch Vergleich dieser mindestens zwei Werte miteinander bestimmt. Des weiteren werden die Apoptose-beeinflussenden Eigenschaften durch Vergleich mindestens eines Wertes für einen Messparameter der mindestens einen Zelle mit dem mindestens einer Zelle einer Referenzprobe bestimmt.
Bei der Referenzprobe ist es bevorzugt, eine Probe desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Probe, vor Zugabe der mindestens einen potentiellen Apoptose-beeinflussenden Substanz, zu verwenden.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Verhalten der mindestens einen Zelle der zu untersuchenden Zellkulturprobe und der mindestens einen Zelle der Referenzprobe im elektrischen Feld durch Aufnahme eines Rotationsspektrums durch Messung der Rotationsgeschwindigkeit jeder Zelle in Abhängigkeit von der Frequenz der rotierenden elektrischen Felder untersucht.
Die Apoptose-beeinflussenden Eigenschaften der mindestens einen Substanz lassen sich erfindungsgemäß dadurch feststellen, dass das Rotationsspektrum der mindestens einen zu untersuchenden Zelle der Probe im Gegensatz zum Spektrum der mindestens einen Zelle der Referenzprobe eine Änderung insbesondere im Frequenzbereich von 5 bis 100, bevorzugt 6 bis 50 MHz, besonders bevorzugt 8 bis 15 MHz und/oder im Frequenzbereich von 1-4 MHz, bevorzugt 2 bis 3 MHz, besonders bevorzugt 2,3-2,6 MHz Bereich aufweist.
Es kann aber auch bevorzugt sein, dass die Rotationsgeschwindigkeit der Zellen der Zellprobe und der Referenz nur bei mindestens je einer Frequenz des Frequenzbereiches 1 bis 4 MHz, vorzugsweise 2 bis 3 MHz, besonders bevorzugt 2,3 bis 2,5 MHz und des Frequenzbereiches 5 bis 100 MHz, vorzugsweise 6 bis 50 MHz besonders bevorzugt 8 bis 15 MHz bestimmt wird, wobei das die im höheren Frequenzbereich bestimmte Rotationsgeschwindigkeit zu der im niedrigeren Frequenzbereich bestimmten Rotationsgeschwindigkeit ins Verhältnis gesetzt wird.
Für eine apoptotische Zelle ist das Verhältnis größer als 1, besonders bevorzugt 1,1 bis 1,8; für eine nekrotische Zelle kleiner 1, besonders bevorzugt 0,6 bis 0,8 und für eine vitale Zelle gleich 1.
Es kann aber ebenfalls wünschenswert sein, das Verhalten der mindestens einen Zelle der zu untersuchenden Zellkulturprobe und der mindestens einen Zelle der Referenzprobe im elektrischen Feld durch Aufnahme eines Dielektrophoresespektrums durch Messung der Wandergeschwindigkeit oder dielektrischen Beweglichkeit jeder Zelle in Abhängigkeit von der Frequenz der alternierenden elektrischen Felder zu untersuchen.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens werden die Apoptose-beeinflussenden Eigenschaften der mindestens einen Substanz dadurch festgestellt, dass im Dielektrophoresespektrum der mindestens einen zu untersuchenden Zelle im Gegensatz zum Spektrum der mindestens einen Zelle der Referenzprobe der Frequenzdurchtritt des Überganges von negativer zu positiver Dielektrophorese im Bereich von 3,3 bis 3,8 MHz, bevorzugt bei 3,5 MHz liegt, wobei das Dielektrophoresespektrum der mindestens einen zu untersuchenden Zelle der Probe im Frequenzbereich von 0 bis 5 MHz bevorzugt 1 bis 4 MHz aufgezeichnet wird.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Verhalten der mindestens einen Zelle der zu untersuchenden Zellkulturprobe und der mindestens einen Zelle der Referenzprobe im elektrischen Feld durch Aufnahme eines Impedanzspektrums durch Messung der Impedanzeigenschaften (Betrag und/oder Phase) jeder Zelle in Abhängigkeit von der Frequenz des Impedanzprüffeldes untersucht.
Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens beschreibt, dass die Apoptose-beeinflussenden Eigenschaften der mindestens einen Substanz dadurch festgestellt werden, dass im Impedanzspektrum der mindestens einen zu untersuchenden Zelle im Gegensatz zum Spektrum der mindestens einen Zelle der Referenzprobe Änderungen im Frequenzbereich von 1 Hz bis 100 kHz, bevorzugt 0,5 kHz - 10 kHz, auftreten.
Bei Aufnahme des Rotationsspektrums bei mindestens einer Frequenz und/oder eines Dielektrophoresespektrums und/oder eines ImpedanzSpektrums kann es wünschenswert sein, das die mindestens eine Zelle im Fokus einer optischen Falle gehalten wird.
Zur Bestimmung des Einflusses von potentiellen Apoptose- beeinflussenden Substanzen kann es bevorzugt sein, den Anteils an apoptotischen Zellen in einer Probe zu bestimmen. Hierzu kann zunächst eine Separation der Zellen eines bestimmten Volumens der Probe und/oder der eines bestimmten Volumens der Referenz- probe durchgeführt werden. Die Separation kann dielektrisch durchgeführt werden. Anschließend wird die Anzahl der apoptotischen Zellen der zu untersuchenden Probe im Verhältnis zu der Anzahl der apoptotischen Zellen der Referenzprobe ermittelt.
Apoptose-erhöhende Substanzen zeichnen sich demnach durch eine Erhöhung der Anzahl apoptotischer Zellen im Verhältnis zur Referenzprobe aus.
Substanzen, die die Apoptose nicht beeinflussen, sind durch einen zur Referenzprobe vergleichbaren Anteil apoptotischer Zellen charakterisiert .
Apoptose-hemmende Substanzen zeichnen sich demnach durch eine geringere Anzahl apoptotischer Zellen im Verhältnis zur Referenzprobe aus.
Da die natürliche Apoptoserate in Zellkulturen häufig sehr gering ist, kann es bei der Bestimmung von potentiellen Apoptose- hemmenden Substanzen auch wünschenswert sein, vor oder während der Zugabe der mindestens einen zu testenden Substanz, die zu untersuchende Zellkulturprobe mit einer Apoptose-erhöhenden Substanz zu versetzen, wobei als Referenzprobe die mit einer Apoptose-erhöhenden Substanz versetzte Zellkulturprobe und oder eine Zellkulturprobe, die dengleichen Anteil Apoptose-erhöhende Substanz erhält, eingesetzt wird.
Eine Apoptose-erniedrigende Substanz zeichnet sich nun dadurch aus, dass sie im Verhältnis zur Referenzprobe einen geringeren Anteil apoptotischer Zellen aufweist.
Insgesamt ermöglicht die Bestimmung von Apoptose gemäß der vorliegenden Erfindung, Apoptose mit einem einfachen, effizienten, schnellen und hochdurchsatzfähigen Verfahren durch Erkennung früher Stadien der Apoptose ohne Zerstörung der Zelle zu ermitteln. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass dieses Verfahren auf Zellen in ihrer physiologischen Umgebung angewendet werden kann ohne die Eigenschaften der Zelle oder ihrer Oberfläche zu ändern. Die Verfahren zur Bestimmung von Apoptose-beeinflussenden Substanzen sind dazu in der Lage, exakt deren Fähigkeit, in die Zelle einzudringen, unter Berücksichtigung des Einflusses von Rezeptoren und Kofaktoren, zu bestimmen. Die Gefahr einer falsch-positiven oder falschnegativen Ermittlung von Apoptose-beeinflussenden Substanzen ist deutlich geringer als bei den bekannten Methoden. Zudem ist es möglich, Zelltyp- oder Organ-spezifische Modulatoren zu ermitteln. Darüber hinaus sind zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens keine spezifischen, die Zellwand durchdringenden Fluoreszenzfarbstoffe notwendig.
Figur 1 zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen einer normalen (A) und einer apoptotischen (B) Jurkat-Zelle (Klon E6.1 von der Eu- ropean Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, England) . Die apoptotische Zelle wurde für 4 Stunden mit 5 μg/ml Actinomy- cin D behandelt.
Figur 2 zeigt Elektrorotationsspektren einer normalen Jurkat- Zelle (A) , einer für ca. 5 Minuten mit 10 μ Ionomycin- behandelten Jurkat-Zelle (B) , einer für 20 Sekunden mit 50 kHz und Erms = 30 kV/m dielektrophoretisch geschädigten Jurkat-Zelle (C) , einer für 40 Minuten mit 30 mW einer optischen Pinzette von 1080 nm Wellenlänge gehaltenen RMA-Zelle (Thymoma - Zellinie von dem Klon C57BL/6 von Professor Dr. Peter Waiden, Charite, Berlin) (D) und einer für 4 Stunden mit Actinomycin D-behandelten Jurkat-Zelle (E) .
In Figur 3 ist die Beschleunigung der Elektrorotation und Aufnahme von Propidiumiodid bei nekrotischer Schädigung von Jurkat- Zellen durch Erhöhung der Spannung in einem dielektrophoreti- schen Oktupol-Feldkäfig dargestellt. (A) Rotationsgeschwindigkeit (inverse Rotationszeit) einer Jurkat-Zelle bei 4,3 V, (B) Frequenz der Rotation derselben Jurkat-Zelle nach Erhöhen der Spannung auf 6,8 V. (C) Propidiumiodid-Fluoreszenz der Jurkat- Zelle bei 4,3 V, (D) Propidiumiodid-Fluoreszenz derselben Jurkat-Zelle nach Erhöhen der Spannung auf 6,8 V. Die Elektrorotation wurde jeweils mit 4,3 V gemessen. Drei verschiedene Zellen wurden untersucht.
Figur 4 zeigt die Propidiumiodid-Fluoreszenz einer normalen U937-Zelle (A) , einer für 4 Stunden mit Actinomycin D- behandelten, apoptotischen U937-Zelle (Monozytische Zellinie von der European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, England) (B) und einer nekrotischen U937-Zelle (C) .
In Figur 5 sind Elektrorotation und Dielektrophorese von T- Lymphozyten (Jurkat) in Abhängigkeit von der Feldfrequenz dargestellt. Die Kurven a,b und c gehören zu normalen, nekrotischen und apoptotischen Zellen. In A sind automatische Messungen der Elektrorotation in PBS (Leitfähigkeit 1.5 S/m) sowie Kurvenfits entsprechend mehrschaliger sphärischer Modelle mit Dispersion gezeigt. B zeigt das dazu korrespondierende dielektrophoretische Verhalten wobei die Indizes der Kurven zu verschiedenen externen Leitfähigkeiten korrespondieren (1: 0.05 S/m, 2: 0.3 S/m, 3: 1.5 S/m (PBS) ) .
Das dispersive Materialverhalten wird als Summe von Relaxationen beschrieben (Dielektrizitätskonstante ε, Leitfähigkeit σ, Kreisfrequenz des elektrischen Feldes ω, Relaxationszeit der Dispersion τ, Anzahl der Dispersionen n) : τkΔσk
+ mit Δε = -τΔσ
--=1 x + )2
Figur 6 zeigt einen seitlichen Blick auf ein Mikrosystem für E- lektrorotationsmessungen in Mikrokanälen (C. C. Reichle, T. Schnelle, T. Müller, T. Leya und G. Fuhr, 2000, A new micro- system for automated electrorotation measurements using laser tweezers, Biochimica et Biophysica Acta 1459, S. 218-229).
BEISPIEL 1
Elektrorotationsmessung
Verwendete Materialien:
Jurkat Zellen: Klon E6.1 von der European Collection of Animal
Cell Cultures, Salisbury, England;
U937 Zellen: Monozytische Zellinie von der European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, England;
RMA Zellen: Thymoma - Zellinie von dem Klon C57BL/6 von Professor Dr. Peter Waiden, Charite, Berlin, Ref: C. Reichle, K. Sparbier, T. Müller, T. Schnelle, P. Waiden und G. Fuhr, in press, Combined laser tweezers and dielectric field cage for the ana- lysis of multivalent receptor ligand interacti- ons on Single cells, ELECTROPHORESIS, Miniaturi- zation II;
Actinomycin D SIGMA Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland; Ionomycin: Calbiochem, Bad Soden, Deutschland;
Propidiumiodid: SIGMA Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland;
PBS: Phosphate Buffered Saline, mit Calcium und Magnesium, Seromed / Biochrom, Berlin, Deutschland; RPMI 1640 Medium: HEPES buffered, GIBCO Life Technologies,
Karlsruhe, Deutschland; Fötales Kälberserum: Seromed / Biochrom, Berlin, Deutschland; Penicillin: Seromed / Biochrom, Berlin, Deutschland; Streptomycin: Seromed / Biochrom, Berlin, Deutschland; Inosit: SIGMA Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland.
Vorrichtung:
Es wurde eine bereits von C. C. Reichle, T. Schnelle, T. Müller, T. Leya und G. Fuhr ( 2000, A new microsystem for automated electrorotation measurements using laser tweezers, Biochimica et Biophysica Acta 1459, S. 218-229.) beschriebene Vorrichtung, eine Kombination aus dieelektrophoretischen Feldkäfigen mit optischen Fallen, insbesondere Laser-Pinzetten, zur Bestimmung der Elektrorotationsspektren eingesetzt (Figur 6) . Eine vergleichbare Vorrichtung ist auch in T. Schnelle, T. Müller, C. Reichle und G. Fuhr 2000, Combined dielectrophoretic field cages and laser tweezers for electrorotation, Applied Physics B, Lasers and Optics, Springer-Verlag beschrieben.
Durchführung:
Jurkat T-Lymphomzellen und U937 monozytische Zellen wurden in RPMI-1640 Medium mit Zusatz von 10% fötalem Kälberserum und 100 IU/ml Penicillin sowie 100 IU/ml Streptomycin kultiviert. Apoptose wurde durch Zugabe von 5 μg/ml Actinomycin D in einer am Vortag mit 2 x 105 Zellen pro ml ausgesäten Kultur ausgelöst. Die klassischen morphologischen Veränderungen während der Apoptose wurden fotografisch festgehalten (siehe Figur 1) . Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde ein Aliquot der Kultur entnommen, in einer Mischung aus isotonischem Phosphatpuffer (PBS, D8662 von SIGMA mit Calcium und Magnesium) und wahlweise 0.3 M Inosit mit der jeweils angegebenen elektrischen Leitfähigkeit aufgenommen und in eine Vorrichtung zur Messung der Elektrorotation in einem Mikro-Elektrodensystem eingeführt. Als Kontrolle wurden unbehan- delte Jurkat-Zellen verwendet (Figur 5) . Zum Vergleich wurden Elektrorotationsspektren (ER-Spektren) von Ionomycin-behandelten Zellen (10 μg/ml Ionomycin) sowie von Zellen, deren Plasmamembran durch eine Erhöhung der Spannung von 4 V auf 6,8 V oder eine Behandlung mit einer optischen Pinzette mit 30-60 mW (2.8 A des 1 W Nd:YAG-Laser, TEM00, 1064nm, LD 3000i, Laser Quantum Ltd., Machester, UK, P.A.L.M. System) über 15 Minuten geschädigt wurde. Die Zellen wurden hierzu einzeln in das Zentrum des Quadrupols bzw. Oktupols des Mikro-Elektrodensystems überführt. Hierzu wurde in den angezeigten Fällen eine optische Pinzette mit ca. 30 mW Leistung am Ort des Haltens zu Hilfe genommen. Die Frequenz der Zellrotation wurde entweder automatisch oder mit Hilfe einer Stoppuhr gemessen (Figur 2) . Die Aufnahme von Propi- diumiodid (5 μM) in nekrotisch geschädigte Zellen bzw. Vergleichsmessungen mit vitalen und apoptotischen Zellen (Figuren 3 und 4) wurden durch konfokale Nanofluorimetrie (Gradl, T. Müller, C. Reichle, T. Schnelle und G. Fuhr, 1999, Micro-Electrode Systems for Cell Analysis, European Journal of Cell Biology, Suppl. 49, Vol. 78; T. Schnelle, T. Müller, G. Gradl, S. G. Shirley und G. Fuhr, 2000, Dielectrophoretic ma- nipulation of suspended submicron particles, ELECTROPHORESIS 2000, 21, S. 66-73) gemessen.
Elektrorotationsmessung:
Die Vorrichtung zur Messung der Elektrorotation wurde auf einem Fluoreszenzkorrelationsspektrometer aufgebaut. Die Zellen wurden über ein 40 x W 1.2 NA Objektiv abgebildet. Sie wurden mit einem Helium-Neon-Laser von 543 nm Wellenlänge mit 1,5 μW angeregt und die ausgestrahlte Fluoreszenz durch einen 585 DF 35 Bandpaßfilter über ein 50 μm großes Pinhole auf eine Photodiode geleitet, mit der die Fluoreszenz-Photonen gezählt wurden.
Ergebnis : Das charakteristische ER-Spektrum einer in Figur 1 gezeigten normalen (A) Jurkat-Zelle zeigt einen breiten Peak von 1,5 bis 7 MHz, bei der eine maximale Rotationsgeschwindigkeit der Zelle gemessen wird, mit einem Maximum um 2,5 MHz (Figur 2 A) . Eine mit dem Ionophor Ionomycin (Calbiochem, Bad Soden, Deutschland) behandelten Zelle unterscheidet sich deutlich im ER- Spektrum (Figur 2 B) von einer normalen Zelle. Ionomycin verursacht in höherer Konzentration eine Aufnahme von Calcium aus dem extrazellulären Raum in die Zelle (J. B. Smith, T. Zheng und R.- M. Lyu, 1989, Ionomycin releases calcium from the sarcoplasmatic reticulum and activates Na+/Ca2+ exchange in vascular smooth muscle cells, Cell Calcium 10, S. 125-134) . Bei der Ionomycin Konzentration von 10 μM zeigen die Fits zu den zugehörigen ER- Spektren, dass zusätzlich eine Aufnahme von Wasser und vermutlich auch von Pufferionen in substanzieller Menge, wie Natrium und Kalium, stattfindet. Dies ist anhand der Zunahme der Leitfähigkeit σ (als Summe von σ0, Δσi und Δσ2) von 0,77 auf 1,15 S rrf1 und der Dielektrizitätskonstante ε∞ von 45 auf 75 innerhalb der Zelle deutlich zu erkennen (C. Reichle, T. Schnelle, T. Müller, T. Leya und G. Fuhr, 2000, A new microsystem for automated electrorotation measurements using laser tweezers, Biochimica et Biophysica Acta 1459, S. 218-229). Sie nähern sich den Werten des umgebenden Puffers PBS an.
Da die dielektrisch wirksame Gesamtkonzentration einer Zelle an den Ionen Natrium und Kalium vor der Behandlung niedriger ist im Vergleich zur Ionenkonzentration des PBS (Phosphate Buffered Saline, mit Calcium und Magnesium, Seromed / Biochrom, Berlin, Deutschland); ca. 0.54 S/m zu 1.5 S/m; erfolgt ein Netto-Einfluß an Ionen und Wasser und die Zelle schwillt an. Im ER-Spektrum schlägt sich dies in einer starken Vergrößerung des 2,5 MHz Peaks nieder und ist mit einer ca. 40%-igen Erhöhung der HF- Leitfähigkeit und einem über 60% igem Anstieg in der Dielektri- zitätskonstante des Zytoplasmas erklärbar. Ein ganz ähnliches Verhalten zeigen Zellen, die eine nekrotische Schädigung durch das Anlegen einer erhöhten Spannung im dielektrischen Feldkäfig erfahren haben (Figur 2 C) . Dieser dielektrische Durchbruch ist mit einer Schädigung der Plasmamembran verbunden, was durch die Aufnahme des DNA-Farbstoffes Propidiumiodid sichtbar gemacht werden kann (Figur 3) . Daraufhin können sich Ionen hier ebenfalls zwischen Zeilinnenraum und umgebendem Puffer austauschen. Das sich ergebende ER-Spektrum ist dem der Ionomycin-behandelten Zelle sehr ähnlich. Auch eine nekrotische Schädigung mit einer optischen Pinzette führt zu der gleichen Erscheinung (Figur 2 D) . Alle bis hierhin beschriebenen Schädigungen sind mit einem Verlust der Integrität der Plasmamembran und einem Angleich des Ionengehaltes von Zeilinnenraum und Außenraum verbunden. Bei Absenken der Leitfähigkeit der Außenlösung unter die der Zelle, würde ein Nettoefflux an Ionen den Elektrolytgehalt der Zelle verringern. Dies führt zu einem weiteren Absinken der Frequenz mit der schnellsten Rotation (fc) und verstärkt die Unterschiede zu den unbehandelten Zellen. Überraschenderweise unterscheidet sich ein charakteristisches Spektrum einer apoptotischen Zelle von dem einer normalen Zellen bzw. dem einer nekrotisch geschädigten Zelle (Figur 2E) . Der Peak bei 2,5 MHz verschwindet völlig. Die höchste Rotationsgeschwindigkeit ist bei etwa 10 MHz zu verzeichnen. Eine typische apoptotische Zelle mit diesem beschriebenen ER-Spektrum weist starke Plasmamembranprotuberanzen auf (s. Figur 1B) . In diesem Stadium ist ihre Plasmamembran jedoch immer noch intakt (Figur 4) . Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, zwischen normalen, apoptotischen und nekrotisch geschädigten Zellen zu unterscheiden.
Elektrorotationsmessungen bei den beiden Frequenzen 2,5 MHz (Figur 2 F) und 10 MHz (Figur 2G) können den Unterschied zwischen diesen drei unterschiedlichen Zellstadien bereits deutlich erkennbar machen. Das Verhältnis der Rotationsgeschwindigkeit (in- versen Rotationszeit) der Messung bei 10 MHz und der Messung bei 2,5 MHz ist für die normale Zelle nahe bei 1 (mit etwa 10% Abweichung) . Für die nekrotisch geschädigte Zelle ist es deutlich kleiner als 1 (0,6 - 0,8) und für die apoptotische Zelle ist es größer als 1 (in diesem Fall 1,4).

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur zerstörungsfreien Vitalitätsmessung an biologischen Zellen, insbesondere zur Bestimmung von Apoptose, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Zelle hochfrequenten alternierenden, insbesondere rotierenden, elektrischen Feldern und/oder Impedanzprüffeldern ausgesetzt wird und an der Zelle für mindestens einen Frequenzbereich oder einzelne Frequenzen mindestens eine Rotationsmessung, eine Dielektrophoresemessung und/oder eine Impedanzmessung erfolgen, aus denen mindestens ein Messparameter ermittelt wird, der für den Vitalitätszustand der Zelle charakteristisch ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass an der mindestens einen Zelle für mindestens zwei Frequenzbereiche oder mindestens zwei Frequenzen je mindestens eine Rotationsmessung, eine Dielektrophoresemessung und/oder eine Impedanzmessung durchgeführt wird, unter Erhalt von je mindestens einem Wert für den Messparameter, diese mindestens zwei Werte miteinander verglichen werden, und so ermittelt wird, in welchem Vitalitätszustand sich die Zelle befindet, insbesondere ob es sich um eine Zelle im Zustand der Apoptose, der Nekrose oder um vitale Zellen handelt.
3. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Messparameter Rotationsgeschwindigkeit, Wandergeschwindigkeit, elektrophoretische Beweglichkeit und/oder Impedanz, insbesondere Betrag und/oder Phase umfasst .
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, bei dem mindestens ein Rotationsspektrum der mindestens einen Zelle durch Erfassung der Rotationsgeschwindigkeit der Zelle in Abhängigkeit von der Frequenz des rotierenden elektrischen Feldes gemessen wird.
5. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 und 4, bei dem die Rotationsgeschwindigkeit der mindestens einen Zelle bei mindestens je einer Frequenz des Frequenzbereiches 1 bis 4 MHz, vorzugsweise 2 bis 3 MHz, besonders bevorzugt 2,3 bis 2,6 MHz und des Frequenzbereiches 5 bis 100 MHz, vorzugsweise 6 bis 50 MHz besonders bevorzugt 8 bis 15 MHz bestimmt wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem als Messparameter der Quotient aus den Rotationsgeschwindigkeiten ermittelt wird, die jeweils im höheren und im niedrigeren Frequenzbereich auftreten.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem eine apoptotische Zelle dadurch bestimmt wird, dass der Quotient größer als 1, besonders bevorzugt 1,1 bis 1,8, ist, wobei der Quotient für nekrotische Zellen kleiner 1, besonders bevorzugt 0,6 bis 0,8 und für vitale Zellen gleich 1 ist.
8. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem Apoptose dadurch bestimmt wird, dass das Rotationsspektrum und/oder die mindestens 2 Rotationsgeschwindigkeiten der mindestens einen zu untersuchenden Zelle mit dem Rotationsspektrum und/oder den mindestens 2 bei denselben Frequenzen, wie der zu untersuchenden Zelle ermittelten Rotationsgeschwindigkeiten einer Referenzzelle, verglichen wird/werden.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem Apoptose dadurch festgestellt wird, dass das Rotationssprektrum der zu untersuchenden Zelle im Gegensatz zur Referenzzelle sein Maximum in einem niedrigeren Frequenzbereich aufweist, wobei die Referenzzelle eine native oder eine gezielt in den Zustand der Nekrose gebrachte Zelle, bevorzugt desselben Zelltyps, ist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem Apoptose dadurch festgestellt wird, dass das Rotationsspektrum der zu untersuchenden Zelle im Gegensatz zur Referenzzelle sein Maximum im Frequenzbereich von 5 bis 100, bevorzugt 6 bis 50 MHz, besonders bevorzugt 8 bis 15 MHz aufweist.
11. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem Apoptose dadurch festgestellt wird, dass das Rotationsspektrum der zu untersuchenden Zelle sein Maximum in einem vergleichbaren Frequenzbereich wie die Referenzzelle aufweist, wobei die Referenzzelle ein gezielt in den Zustand der Apoptose gebrachte Zelle, bevorzugt desselben Zelltyps, ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem Apoptose dadurch festgestellt wird, dass das Rotationsspektrum der zu untersuchenden Zelle genau wie die Referenz sein Maximum im Frequenzbereich von 5 bis 100, bevorzugt 6 bis 50 MHz, besonders bevorzugt 8 bis 15 MHz aufweist.
13. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem mindestens ein Dielektrophoresespektrum der mindestens einen Zelle durch Erfassung der Wandergeschwindigkeit oder der elektrophoretischen Beweglichkeit der Zelle in Abhängigkeit von der Frequenz des elektrischen Feldes gemessen wird.
14. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 13, bei dem die Wandergeschwindigkeit oder elektrophoretische Beweglichkeit der mindestens einen Zelle bei einer externen Leitfähigkeit von insbesondere 0.3 S/m bei mindestens zwei Frequenzen im Frequenzbereich von 0 bis 5 MHz, bevorzugt 1 bis 4 MHz, aufgezeichnet wird.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem Apoptose dadurch festgestellt wird, dass der Frequenzdurchtritt des Überganges von negativer zu positiver Dielektrophorese im Dielektrophoresespektrum im Bereich von 3,3 bis 3,8 MHz, bevorzugt bei 3,5 MHz, liegt.
16. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, 13, 14, 15, bei dem Apoptose dadurch bestimmt wird, dass das Dielektrophoresespektrum und/oder die mindestens 2 Wandergeschwindigkeiten oder elektrophoretischen Beweglichkeiten der mindestens einen zu untersuchenden Zelle mit dem Dielektrophoresespektrum und/oder die mindestens zwei Wandergeschwindigkeiten oder elektrophoretischen Beweglichkeiten einer Referenzzelle verglichen wird.
17. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem mindestens ein Impedanzspektrum der mindestens einen Zelle durch Erfassung der Impedanz, insbesondere Betrag und/oder Phase, der mindestens einen Zelle in Abhängigkeit von der Frequenz des Impedanzprüffeldes ein Impedanzspektrum gemessen wird.
18. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 17, bei dem die Impedanz (Betrag und/oder Phase) der mindestens einen Zelle bei mindestens zwei Frequenzen im Frequenzbereich von 1 Hz bis 100 kHz, bevorzugt 0,5 kHz bis 10 kHz aufgezeichnet wird.
19. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 17 oder 18, bei dem Apoptose dadurch bestimmt wird, dass das Impedanzspektrum und/oder die mindestens zwei Impedanzen (Betrag und/oder Phase) der mindestens einen zu untersuchenden Zelle mit dem Impedanzspektrum und/oder die mindestens zwei Impedanzen (Betrag und/oder Phase) einer Referenzzelle verglichen wird.
20. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 8, 16 oder 19, bei dem es sich bei der Referenzzelle um eine vitale Zelle, eine gezielt in den Zustand der Apoptose gebrachte Zelle, oder eine gezielt in den Zustand der Nekrose gebrachte Zelle, jeweils bevorzugt desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Zelle, handelt.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem Apoptose dadurch festgestellt wird, das das Impedanzspektrum einer apoptotischen Zelle im Gegensatz zu dem einer vitalen oder nekrotischen Zelle Änderungen im Frequenzbereich von 1 Hz bis 100 kHz bevorzugt 0.5 kHz bis 10 kHz zeigt.
22. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21, bei dem die mindestens eine Zelle bei Aufnahme der Rotationsgeschwindigkeit und/oder dielektrophoretischen Beweglichkeit und/oder Impedanz bei mindestens einer Frequenz gleichzeitig suspendiert im Fokus einer optischen Falle gehalten wird.
23. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 22, bei dem Rotationsspektren und/oder die mindestens 2 Rotationsgeschwindigkeiten und/oder die Dielektrophoresespektren und/oder die mindestens zwei Wandergeschwindigkeiten oder elektrophoretischen Beweglichkeiten und/oder die Impedanzspektren und/oder die mindestens zwei Impedanzen (Betrag und/oder Phase) in Abhängigkeit von der Zeit aufgenommen werden.
24. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 23, bei dem das Verfahren, ggf. bei der Durchführung von Chemotherapie, Radiotherapie, Immuntherapie, Operationen oder einer Kombination dieser Therapien, zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle von Krankheiten und/oder Prozessen verwendet wird,
- die mit einer Erhöhung der Apoptoserate verbunden sind, wie insbesondere AIDS, neurodegenerative Erkrankungen, insbesondere Alzheimer, Parkinson; durch Gifte, insbesondere Alkohol, verursachte Leberkrankheiten; Krankheiten, die eine zu geringe Hormonproduktion oder -ausschüttung hervorrufen,
- die mit einer Erniedrigung der Apoptoserate verbunden sind, wie insbesondere maligne und benigne hyperproliferative Erkrankungen, wie Krebs, hormon-abhängige Tumore, Leukämie; Autoimmunkrankheiten, insbesondere Arthritis, Diabetis mellitus und virale Infektionen, insbesondere durch Herpesviren, Poxviren oder Adenoviren hervorgerufene Krankheiten.
25. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 24, bei dem eine Identifizierung von Apoptose-beeinflussenden Substanzen erfolgt.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die folgenden Schritte vorgesehen sind:
- Bereitstellen mindestens einer zu untersuchenden Zellkulturprobe,
- Zugabe einer potentiellen Apoptose-beeinflussenden Substanz oder Mischungen aus mindestens zwei dieser Substanzen,
- Einbringen der mindestens einen Zelle der zu untersuchenden Zellkulturprobe in ein Mikrosystem und Ermittlung des mindestens einen Messparameters, der für den Vitalitätszustand der Zelle charakteristisch ist,
- Bestimmung der Apoptose-beeinflussenden Eigenschaften.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Werte für einen Messparameter bestimmt werden und die Apoptose beeinflussenden Eigenschaften durch Vergleich dieser mindestens zwei Werte miteinander bestimmt werden.
28. Verfahren gemäß Anspruch 26 und/oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Apoptose-beeinflussenden Eigenschaften durch Vergleich mindestens eines Wertes für einen Messparameter der mindestens einen Zelle mit dem mindestens einer Zelle einer Referenzprobe bestimmt werden.
29. Verfahren gemäß Anspruch 28, bei dem als Referenzprobe eine Probe desselben Zelltyps wie die zu untersuchende Probe, vor Zugabe der mindestens einen potentiellen Apoptose beeinflussenden Substanz, verwendet wird.
30. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 25 bis 29, bei dem die Apoptose-beinflussenden Eigenschaften der mindestens einen Substanz dadurch festgestellt werden, dass das Rotationsspektrum der mindestens einen zu untersuchenden Zelle der Probe im Vergleich zum Spektrum der mindestens einen Zelle der Referenzprobe sein Maximum in einem niedrigen Frequenzbereich aufweist .
31. Verfahren gemäß Anspruch 30, bei dem die Apoptose- beeinflussenden Eigenschaften der mindestens einen Substanz dadurch festgestellt werden, dass das Rotationsspektrum der mindestens einen zu untersuchenden Zelle der Probe im Gegensatz zum Spektrum der mindestens einen Zelle der Referenzprobe eine Änderung insbesondere im Frequenzbereich von 5 bis 100, bevorzugt 6 bis 50 MHz, besonders bevorzugt 8 bis 15 MHz und/oder im Frequenzbereich von 1-4 MHz, bevorzugt 2 bis 3 MHz, besonders bevorzugt 2,3-2,6 MHz aufweist.
32. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Apoptose-beeinflussenden Eigenschaften der mindestens einen Substanz dadurch festgestellt werden, dass das Dielektrophoresespektrum der mindestens einen zu untersuchenden Zelle der Probe im Gegensatz zum Spektrum der mindestens einen Zelle der Referenzprobe, eine Änderung insbesondere im Frequenzbereich von 0 bis 5 MHz, bevorzugt 1 bis 4 MHz, aufweist.
33. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Apoptose-beeinflussenden Eigenschaften der mindestens einen Substanz dadurch festgestellt werden, dass das Impedanzspektrum der mindestens einen zu untersuchenden Zelle der Probe im Gegensatz zum Spektrum der mindestens einen Zelle der Referenzprobe, eine Änderung insbesondere im Frequenzbereich von 1 Hz bis 100 kHz, bevorzugt 0,5 kHz bis 10 kHz, aufweist.
34. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 25 bis 33, bei dem eine Separation der Zellen eines bestimmten Volumens der Probe und/oder der eines bestimmten Volumens der Referenzprobe durchgeführt wird.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Separation dielektrisch durchgeführt wird.
36. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Separation mit Hilfe mindestens eines rotierenden, elektrischen und/oder Impedanzprüffeldes durchgeführt wird.
37. Verfahren gemäß Anspruch 34 bis 36, bei dem nach Durchführung der Separation, die Anzahl der apoptotischen Zellen der zu untersuchenden Probe im Verhältnis zu der Anzahl der apoptotischen Zellen der Referenzprobe ermittelt wird.
38. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 25 bis 37, bei dem Apoptose-erhöhende Substanzen durch eine Erhöhung der Anzahl apoptotischer Zellen im Verhältnis zur Referenzprobe charakterisiert sind.
39. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 25 bis 38, bei dem Substanzen, die die Apoptose nicht beeinflussen, durch einen zur Referenzprobe vergleichbaren Anteil apoptotischer Zellen charakterisiert sind.
40. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 25 bis 39, bei dem Apoptose-hemmende Substanzen durch eine niedrigere Anzahl apoptotischer Zellen im Verhältnis zur Referenzprobe charakterisiert sind.
41. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 25 bis 40, bei dem die Zellkulturprobe vor oder während der Zugabe einer potentiellen Apoptose-hemmenden Substanz mit einer Apoptose- erhöhenden Substanz versetzt wird.
42. Verfahren gemäß Anspruch 41, bei dem als Referenzprobe die mit einer Apoptose-erhöhenden Substanz versetzte Zellkulturprobe und oder eine Zellkulturprobe, die den gleichen Anteil Apoptose- erhöhende Substanz erhält, eingesetzt wird.
43. Verfahren gemäß Anspruch 42, bei dem eine Apoptose-hemmende Substanz dadurch charakterisiert ist, dass sie im Verhältnis zur Referenzprobe einen geringeren Anteil apoptotischer Zellen aufweist.
44. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 23, bei dem folgende Schritte vorgesehen sind:
- Bereitstellen mindestens einer zu untersuchenden Zellprobe,
- Einbringen der mindestens einen Zelle der zu untersuchenden Zellprobe in ein Mikrosystem und Ermittlung des mindestens einen Messparameters, der für den Vitalitätszustand der Zelle charakteristisch ist,
- Separation der Zellen der zu untersuchenden Zellprobe oder eines bestimmten Volumens dieser Zellprobe nach ihrem Vi- talitätszustand.
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