Bioanalytische Erkennungsoberfläche mit optimierter Dichte der Erkennungselemente
Die Erfindung betrifft eine Erkennungsoberfläche auf einem Träger mit einer optimalen (auf die Fläche bezogenen) Bindungskapazität zur Erkennung und Bindung eines oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren mit dieser Oberfläche in Kontakt gebrachten Proben, dadurch gekennzeichnet, dass a) besagte Erkennungsoberfläche eine Mischung von spezifischen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur Erkennung und Bindung besagter Analyten mit gegenüber diesen Analyten „neutralen", d.h. diese Analyten nicht bindenden Komponenten, umfasst und b) besagte spezifische Erkennungselemente, bezogen auf die ganze Erkennungsoberfläche oder eine beliebige Teilfläche davon, weniger als eine vollständige Monoschicht einnehmen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum qualitativen und / oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Proben und gegebenenfalls weitere Reagentien mit einer erfindungsgemässen Erkennungsoberfläche in Kontakt gebracht werden und aus der Bindung des Analyten oder weiterer zum Analytnachweis eingesetzter Nachweissubstanzen resultierende Änderungen von optischen oder elektronischen Signalen gemessen werden.
Zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten aus einer Probe mit einem komplexen Gemisch einer Vielzahl von Stoffen sind Verfahren verbreitet, in denen ein oder mehrere sogenannte Erkennungselemente, welche biologischer, biochemischer oder synthetischer Art sind, auf einem festen Träger immobilisiert werden, bevor sie dann in immobilisierter Form mit besagter Probe in Kontakt gebracht werden und die darin enthaltenen Analyten an die für sie spezifischen Erkennungselemente binden. Dabei kann der feste Träger sowohl makroskopischer Art mit einer Oberfläche von Quadratmillimetern bis Quadratzentimetern, als auch mikroskopischer Art, beispielsweise in Form von sogenannten Beads, d.h. annähernd kugelförmigen Partikeln mit typischen Durchmessern im Mikrometerbereich, sein. Die Oberfläche eines solchen festen
Trägers mit darauf immobilisierten Erkennungselementen soll nachfolgend als eine „Erkennungsoberfläche" bezeichnet werden.
Gegenüber Verfahren, in denen die Analyten und ihre Erkennungselemente als Reaktions- oder Bindungspartner in homogener flüssiger Lösung zusammenkommen, bieten diese an einen festen Träger gebundenen Verfahren eine Vielzahl von Vorteilen, beispielsweise einer leichteren Trennung oder Unterscheidung von gebundenen Analytmolekülen von dem Rest der Probe. Erkauft werden diese Vorteile mit einer Einschränkung der diffusiven Durchmischung zwischen Analytmolekülen und Erkennungselementen.
Für die Herstellung von Erkennungsoberflächen zur hocheffizienten und hochselektiven Bindung eines oder mehrerer in einer Probe nachzuweisender Analyten ist die Beschaffenheit dieser Oberflächen von grosser Bedeutung. Zur Erreichung möglichst tiefer Nachweisgrenzen ist es erwünscht, auf kleinem Raum möglichst viele Erkennungselemente derart zu immobilisieren, dass in dem späteren Nachweisverfahren dann möglichst viele Analytmoleküle einer Sorte gebunden werden können. Zugleich ist es erwünscht, bei der Immobilisierung die Reaktivität und biologische oder biochemische Funktionalität der Erkennungselemente in möglichst hohem Masse zu erhalten, d.h. jegliche Denaturierungserscheinungen infolge der Immobilisierung zu minimieren. Ein weiteres Ziel ist es, unspezifische Bindung oder Adsorption von Analytmolekülen, welche in vielen Fällen limitierend auf die erreichbaren Nachweisgrenzen einwirkt, weitestgehend zu verhindern.
In der WO 84/01031 und in den US-Patenten Nr. 5,807,755, 5,837,551 und 5,432,099 wird die Immobilisierung für den Analyten spezifischer Erkennungselemente in Form kleiner "Spots" mit teilweise deutlich unter 1 mm2 Fläche auf festen Trägern vorgeschlagen. Hierfür wird als Vorteil postuliert, durch Bindung eines nur kleinen Teils vorhandener Analytmoleküle eine nur von der Inkubationszeit abhängige, aber - in Abwesenheit eines kontinuierlichen Flusses - vom absoluten Probenvolumen im wesentlichen unabhängige Konzentrationsbestimmung des Analyten vornehmen zu können. Zugleich ist für eine derartige Anordnung zu erwarten, dass in diesen Spots eine grössere Dichte gebundener Analytmoleküle erreicht wird, als wenn sich diese auf eine vollständig mit Erkennungselementen bedeckte Fläche verteilen würden.
Auch hier kann jedoch, ebenso wie im Falle einer grossflächigen Immobilisierung von Erkennunsgelementen auf einer makroskopischen Oberfläche, eine hohe Dichte der immobilisierten Erkennungselemente in den damit erzeugten Messbereichen limitierend auf die maximale Anzahl von Analytmolekülen wirken, welche an die Oberfläche gebunden werden können. Ein wesentlicher Grund für eine solche Einschränkung der Bindungskapazität kann dabei sterische Hinderung sein.
Die vorliegende Erfindung löst die Aufgabenstellung, eine Erkennungsoberfläche mit einer maximalen Bindungskapazität bereitszustellen, und zugleich das Ausmass ungewollter unspezifischer Bindung an die Oberfläche zu minimieren. Die Mischung aus spezifischen Erkennungselementen und gegenüber den Analyten „neutralen", d.h. diese Analyten nicht bindenden Komponenten wirkt sich ausserdem dadurch fördernd auf die Bindungsfähigkeit besagter spezifischer Erkennungselemente aus, indem eine (die Bindungsfähigkeit beeinträchtigende oder sogar aufhebende) Denaturierung besagter Erkennungselemente auf der Oberfläche des Trägers verhindert oder erschwert wird. Ausserdem wirkt sich diese Mischung fördernd auf eine gleichmässige Verteilung der Erkennungselemente innerhalb der Erkennungsoberfläche aus, indem sie beispielsweise eine Anhäufung der Erkennungselemente in Clustern, nach Aufbringung in flüssiger Lösung und Verdampfen der Lösung, verhindert.
Erster Gegenstand der Erfindung ist eine Erkennungsoberfläche mit einer optimalen (auf die Fläche bezogenen) Bindungskapazität zur Erkennung und Bindung eines oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren mit dieser Oberfläche in Kontakt gebrachten Proben, dadurch gekennzeichnet, dass a) besagte Erkennungsoberfläche eine Mischung von spezifischen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur Erkennung und Bindung besagter Analyten mit gegenüber diesen Analyten „neutralen", d.h. diese Analyten nicht bindenden Komponenten, umfasst und b) besagte spezifische Erkennungselemente, bezogen auf die ganze Erkennungsoberfläche oder eine beliebige Teilfläche davon, weniger als eine vollständige Monoschicht, einnehmen.
Vorzugsweise bilden besagte spezifische Erkennungselemente, bezogen auf die ganze Erkennungsoberfläche oder eine beliebige Teilfläche davon, ein Zehntel bis die Hälfte einer vollständigen Monoschicht. Ausserdem wird bevorzugt, dass besagte spezifische Erkennungselemente und gegenüber den Analyten „neutralen" Komponenten, bezogen auf die ganze Erkennungsoberfläche oder eine beliebige Teilfläche davon, zusammen mindestens zwei Drittel einer vollständigen Monoschicht bilden.
Für eine Vielzahl von Anwendungen ist es erwünscht, nicht nur einen einzelnen Analyten, sondern eine Vielzahl von Analyten gleichzeitig zu bestimmen. Ein zweiter Gegenstand der Erfindung ist entsprechend eine strukturierte Erkennungsoberfläche mit einer optimalen (auf die Fläche bezogenen) Bindungskapazität zur Erkennung und Bindung eines oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren mit dieser Oberfläche in Kontakt gebrachten Proben, dadurch gekennzeichnet, dass a) besagte Erkennungsoberfläche in diskreten, räumlich getrennten Messbereichen, eine Mischung von spezifischen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur Erkennung und Bindung besagter Analyten mit gegenüber diesen Analyten „neutralen", d.h. diese Analyten nicht bindenden Komponenten, umfasst und b) besagte spezifische Erkennungselemente, bezogen auf die Fläche der diskreten Messbereiche, weniger als eine vollständige Monoschicht, einnehmen.
Auch für diese Variante wird bevorzugt, dass besagte spezifische Erkennungselemente, bezogen auf die ganze Erkennungsoberfläche oder eine beliebige Teilfläche davon, ein Zehntel bis die Hälfte einer vollständigen Monoschicht bilden. Ausserdem wird auch für eine erfindungsgemässe strukturierte Erkennungsoberfläche bevorzugt, dass dass besagte spezifische Erkennungselemente und gegenüber den Analyten „neutralen" Komponenten, bezogen auf die ganze Erkennungsoberfläche oder eine beliebige Teilfläche davon, zusammen mindestens zwei Drittel einer vollständigen Monoschicht bilden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen räumlich getrennte Messbereiche, als Bestandteil einer erfindungsgemässen Erkennungsoberfläche, durch die Fläche definiert werden, die dort immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente zur Erkennung eines Analyten aus einer flüssigen Probe und die mit den Erkennungselementen
gemischten, gegenüber besagten Analyten „neutralen" Moleküle einnehmen. Diese Flächen können dabei eine beliebige Geometrie, beispielsweise die Form von Punkten, Kreisen, Rechtecken, Dreiecken, Ellipsen oder Linien, haben. Es ist möglich, dass in einer zweidimensionalen Anordnung bis zu 1 000 000 Messbereiche angeordnet sind, wobei ein einzelner Messbereich eine Fläche von 10"4 mm2 - 10 mm2 einnehmen kann. Typischerweise kann die Dichte der Messbereiche mehr als 10, bevorzugt mehr als 100, besonders bevorzugt mehr als 1000 Messbereiche pro Quadratzentimeter betragen.
Üblicherweise wird eine erfindungsgemässe Erkennungsoberfläche auf einem festen Träger erzeugt. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren zur Aufbringung der Erkennungselemente auf einer Trägeroberfläche und verschiedene Arten der Wechselwirkung dieser Erkennungselemente mit der sie tragenden Oberfläche, welche deren Immobilisierung gewährleisten. Beispielsweise kann die Aufbringung und nachfolgende Haftung durch elektrostatische Wechselwirkung oder allgemeiner durch physikalische Adsorption erfolgen. Die Orientierung der Erkennungselemente ist dann im allgemeinen statistisch. Ausserdem besteht die Gefahr, dass bei Zugabe der den Analyten enthaltenden Probe und gegebenenfalls sequentiell weiterer Reagentien zu der Erkennungsoberfläche ein Teil der Erkennungselemente fortgespült wird. Daher kann es von Vorteil sein, wenn zur Immobilisierung biologischer oder biochemischer oder synthetischer Erkennungselemente eine Haftvermittlungsschicht auf der Trägeroberfläche aufgebracht ist. Für viele Anwendungen, beispielsweise im Falle eines Analytnachweises basierend auf optischen Verfahren, ist es von Vorteil, wenn diese Haftvermittlungsschicht mindestens bei einer Anregungswellenlänge transparent ist. Vorzugsweise beträgt die Dicke einer solchen optionalen Haftvermittlungsschicht weniger als 200 nm, jedoch besonders bevorzugt weniger als 20 nm. Die optionale Haftvermittlungsschicht kann beispielsweise eine chemische Verbindung aus den Gruppen von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren und "selbstorganisierten passiven oder funktionalisierten Mono- oder Mehrfachschichten" umfassen.
Es wird bevorzugt, dass diskrete (räumlich getrennte) Messbereiche, als Bestandteil dieser Erkennungsoberfläche, durch räumlich selektive Aufbringung von biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf einer Oberfläche eines Trägers oder auf einer zusätzlich auf einer Trägeroberfläche aufgebrachten Haftvermittlungsschicht erzeugt werden, vorzugsweise unter Verwendung eines oder mehrerer Verfahren aus der Gruppe
von Verfahren, die von "InkJet spotting", mechanischem Spotting mittels Stift, Feder oder Kapillare, „Micro contact printing", fluidischer Kontaktierung der Messbereiche mit den biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen sowie photochemischen oder photolithographischen Immobilisierungsverfahren gebildet wird.
Weiterhin ist von Vorteil, wenn Bereiche zwischen den räumlich getrennten Messbereichen zur Minimierung unspezifischer Bindung von Analyten oder deren Nachweissubstanzen "passiviert werden", d.h. dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen gegenüber dem Analyten oder gegenüber einer seiner Nachweissubstanzen "chemisch neutrale" Verbindungen aufgebracht sind, vorzugsweise beispielsweise bestehend aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Analyten unspezifischen Antikörpern (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Heringsoder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycolen oder Dextranen, gebildet werden.
Die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente können ausgewählt sein aus der Gruppe, die von Proteinen, beispielsweise mono- oder polyklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten, Peptiden, Enzymen, Aptameren, synthetischen Peptidstrukturen, Glycopeptiden, Oligosacchariden, Lektinen, Antigenen für Antikörper (z. B. Biotin für Streptavidin), mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag- Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag-Proteinen") und deren Komplexbildungspartnern gebildet wird. Eine andere Gruppe von Verbindungen, welche als Erkennungselemente ebenfalls bevorzugt werden, umfasst Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotide) und Nukleinsäureanaloga (z. B. PNA) sowie deren Derivate mit künstlichen Basen. Eine dritte bevorzugte Gruppe von Verbindungen als Erkennungselemente umfasst lösliche, membrangebundene und aus einer Membran isolierte Proteine, wie beispielsweise Rezeptoren und deren Liganden.
Auch besagte „neutrale", den oder die Analyten nicht bindenden Komponenten, können ausgewählt sein aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Analyten unspezifischen Antikörpern (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycolen oder Dextranen, gebildet werden.
In der WO 00/65352 werden Beschichtungen mit Pfropf-Copolymeren („graft copolymers") mit einer polyionischen, z. B. an einen Träger (elektrostatisch) bindenden Hauptkette und „nicht interaktiven" (adsorptionresistenten) Seitenketten, zur Beschichtung von bioanalytischen Sensorplattformen oder Implantaten für medizinische Anwendungen, beschrieben.
Eine bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemässen Erkennungsoberfläche ist dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungselemente an das freie Ende oder nahe dem freien Ende eines ganz oder teilweise funktionalisierten, „nicht interaktiven" (adsorptionsresistente, ungeladenen) Polymeren gebunden sind, wobei besagtes nicht interaktive" (adsorptionsresistente, ungeladene) Polymer als Seitenkette an ein geladenes, polyionisches Polymer als Hauptkette gebunden ist und mit diesem zusammen ein polyionisches, multifunktionales Co-Polymer bildet.
Eine grosse Gruppe von Ausführungsformen einer erfindungsgemässen Erkennungsoberfläche ist dabei dadurch gekennzeichnet, dass die polyionische Polymerenhauptkette bei annähernd neutralem pH kationisch (positiv) geladen ist. Sie kann beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe von Polymeren, welche Aminosäuren mit positiver Ladung bei annähernd neutralem pH, Polysaccharide, Polyamine, Polymere von quarternären Aminen und geladene synthetische Polymere umfasst. Die kationische Polymerenhauptkette kann auch ein oder mehr Molekulargruppen aus der Gruppe umfassen, welche Lsysin, Histidin, Arginin, Chitosan, partiell deacetyliertes Chitin, Amin-haltige Derivate neutraler Polysaccharide, Polyaminostyrol,
Polyaminacrylate, Polyaminmethhacrylate, Polyethylenimine, Polyaminoethylene, Polyaminostyrole und deren N-Alkyl-Derivate umfasst.
Weitere geeignete molekulare Gruppen als Bestandteil einer polyionischen Hauptkette sind in der WO 00/65352 beschrieben, welche hier vollumfänglich als Bestandteil dieser Beschreibung eingeführt wird.
Kennzeichen einer anderen grossen Gruppe von Ausführungsformen ist, dass die polyionische Polymerenhauptkette bei annähernd neutralem pH anionisch (negativ) geladen ist. Innerhalb dieser Gruppe kann die kationische Hauptkette ausgewählt sein aus der Gruppe von Polymeren umfassend Aminosäuren mit daran geknüpften Gruppen mit negativer Ladung bei annähend neutralem pH, Polysaccharide und geladene synthetische Polymere mit negativ geladenen Gruppen.
Die kationische Polymerenhauptkette kann ein oder mehr Molekülgruppen aus der Gruppe umfassen, welche Polyasparaginsäure, Polyglutaminsäure, Alginsäure oder deren Derivate, Pektin, Hyaluronsäure, Heparin, Heparinsulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Dextransulfat, Polymethylmethacrylsäure, oxidierte Zellulose, Carboxymethylierte Zellulose, Maleinsäure und Fumarsäure umfasst.
Der „nicht interaktive" (ungeladene) Polymer" als Seitenkette kann ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend Poly(alkylenglycole), Poly(alkylenoxide), neutrale wasserlösliche Polysaccharide, Polyvinylalkohole, Poly-N-Vinylpyrrolidone, Phosphorylcholin-Derivate, nicht- kationische Poly(meth)acrylate und deren Kombinationen.
Es wird bevorzugt, dass die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente an die „nicht interaktive" Seitenkette an deren freiem Ende oder nahe zu deren freiem Ende über reaktive Gruppen gebunden sind: Besonders bevorzugt wird, dass besagte reaktive Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Hydroxy (-OH), Carboxy (-COOH), Ester (-COOR), Thiole (-SH), N-Hydroxysuccinimid, Maleimidyl, Chinon, Vinylsulfon, Nitrilotriacetische Säure („nitrilo triacetic acid", NTA) und deren Kombinationen.
Eine Vielzahl weiterer geeigneter Polymeren und bevorzugter Ausführungsformen sind in der WO 00/65352 zusätzlich beschrieben.
Allgemein wird bevorzugt, dass eine erfindungsgemässe Erkennungsoberfläche aufgebracht ist auf einem im wesentlichen optisch transparenten Träger.
Unter der Bezeichnung „im wesentlichen optisch transparent" soll verstanden werden, dass eine hiermit charakterisierte Schicht zumindest bei der Wellenlänge eines von einer äusseren Lichtquelle eingestrahlten Lichts für dessen optischen Weg senkrecht zu besagter Schicht zu mindestens 95 % transparent ist, sofern die Schicht nicht reflektierend ist. Im Falle von teilreflektierenden Schichten wird unter „im wesentlichen optisch transparent" verstanden, dass die Summe von transmittiertem, reflektiertem und gegebenenfalls in eine Schicht eingekoppeltem und darin geleitetem Licht am Ort des Auftreffens des eingestrahlten Lichts mindestens 95 % des eingestrahlten Lichts beträgt.
Ein von einer äusseren Lichtquelle in Richtung der Erkennungsoberfläche, d. h. sowohl durch einen Träger in Richtung der Erkennungsoberfläche als auch von der entgegengesetzten Seite, gegebenenfalls durch ein über der Erkennungsoberfläche befindliches Medium in Richtung der Erkennungsoberfläche eingestrahltes Licht, soll gemäss der vorliegenden Erfindung allgemein als ein „Anregungslicht" bezeichnet werden. Dieses Anregungslicht kann beispielsweise der Anregung einer Lumineszenz, oder spezifischer Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, dienen.
Es wird bevorzugt, dass der im wesentlichen optisch transparente Träger ein Material umfasst aus der Gruppe umfassend form-, spritz- oder fräsbare Kunststoffe, Metalle, Metalloxide, Silikate, wie z. B. Glas, Quarz oder Keramiken.
Eine mögliche Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass die erfindungsgemässe Erkennungsoberfläche auf einer auf dem im wesentlichen optisch transparenten Träger aufgetragenen Haftvermittlungsschicht aufgebracht ist, welche ebenfalls im wesentlichen optisch transparent ist.
Eine spezielle Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass in der Oberfläche besagten Trägers Ausnehmungen zur Erzeugung von Probenbehältnissen strukturiert sind. Diese
Ausnehmungen haben typischerweise eine Tiefe von 20 μm bis 500 μm, bevorzugt von 50 μm bis 300 μm.
Bevorzugt wird, dass der im wesentlichen optisch transparente Träger einen durchgehenden oder in einzelne wellenleitende Bereiche aufgeteilten optischen Wellenleiter umfasst. Besonders vorteilhaft ist, wenn der optische Wellenleiter ein optischer Schichtwellenleiter ist mit einer, der Erkennungsoberfläche zugewandten, ersten im wesentlichen optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten, im wesentlichen optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a).
Es wird bevorzugt, dass besagter optischer Schichtwellenleiter im wesentlichen planar ist. Als Träger geeignete planare optische Schichtwellenleiter und deren Abwandlungen sind beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 95/33197, WO 95/33198, WO 96/35940, WO 98/09156, WO 99/40415, PCT/EP 00/04869 und PCT/EP 01/00605 beschrieben. Der Inhalt dieser Patentanmeldungen wird daher vollumfänglich als Bestandteil dieser Beschreibung eingeführt.
Es wird bevorzugt, dass, zur Einkopplung von Anregungslicht in die optisch transparente Schicht (a), diese Schicht in optischem Kontakt zu einem oder mehreren optischen Einkoppelelementen aus der Gruppe steht, die von Prismenkopplem, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern gebildet wird.
Vorteilhaft ist, wenn die Einkopplung von Anregungslicht in die optisch transparente Schicht (a) mithilfe von einer oder mehreren Gitterstrukturen (c) erfolgt, die in der optisch transparenten Schicht (a) ausgeprägt sind.
Charakteristisch für eine weitere Variante ist, dass die Auskopplung von in der optisch transparenten Schicht (a) geführtem Licht mithilfe von einer oder mehreren Gitterstrukturen (c') erfolgt, die in der optisch transparenten Schicht (a) ausgeprägt sind und gleiche oder unterschiedliche Periode und Gittertiefe wie Gitterstrukturen (c) haben.
Weiterer Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zum qualitativen und / oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Proben und gegebenenfalls weitere Reagentien mit einer erfindungsgemässen Erkennungsoberfläche nach einem der vorgenannten Ausführungsformen in Kontakt gebracht werden und aus der Bindung des Analyten oder weiterer zum Analytnachweis eingesetzter Nachweissubstanzen resultierende Änderungen von optischen oder elektronischen Signalen gemessen werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum qualitativen und / oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Proben und gegebenenfalls weitere Reagentien mit einer erfindungsgemässen strukturierten Erkennungsoberfläche nach einer der genannten Ausführungsformen in Kontakt gebracht werden und aus der Bindung des Analyten oder weiterer zum Analytnachweis eingesetzter Nachweissubstanzen resultierende Änderungen von, von den diskreten Messbereichen ausgehenden, optischen oder elektronischen Signalen ortsaufgelöst gemessen werden
Dabei wird bevorzugt, die eine oder mehreren Proben mit einer Mischung aus den verschiedenen Nachweisreagentien zur Bestimmung der in besagten Proben nachzuweisenden Analyten vorinkubiert werden und diese Mischungen dann jeweils in einem einzigen Zugabeschritt mit einer erfindungsgemässen Erkennungsoberfläche in Kontakt gebracht werden.
Ausserdem wird bevorzugt, dass der Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung einer oder mehrerer Lumineszenzen beruht.
Das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen kann in einer Auflichtanregungsanordnung eingestrahlt werden. Es kann auch in einer Transmissionslichtanregungsanordnung eingestrahlt werden.
Bevorzugt wird ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Erkennungsoberfläche, gegebenenfalls vermittelt über eine Haftvermittlungsschicht, auf einem optischen Wellenleiter angeordnet ist, welcher vorzugsweise im wesentlichen planar ist, dass die
eine oder mehrere Proben mit dem einen oder den mehreren darin nachzuweisenden Analyten und gegebenenfalls weitere Nachweisreagentien sequentiell oder nach Mischung mit besagten Proben in einem einzigen Schritt mit besagter Erkennungsoberfläche in Kontakt gebracht werden und dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in den optischen Wellenleiter, analog wie vorangehend für den optischen Schichtwellenleiter beschrieben, eingekoppelt wird.
Kennzeichen einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist, dass der Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf einer Erkennungsoberfläche über einer in der Schicht (a) eines optischen Schichtwellenleiters ausgeprägten Gitterstruktur (c) oder (c') anhand der aus der Bindung des Analyten und / oder weiterer Nachweisreagentien, an deren immobilisierte biologischer oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente, resultierenden Änderungen der Resonanzbedingungen zur Einkopplung eines Anregungslichts in die Schicht (a) eines als Schichtwellenleiter ausgebildeten Trägers oder zur Auskopplung von in der Schicht (a) geführten Lichts erfolgt.
Besonders bevorzugt wird eine Variante des erfindungsgemässen Verfahrens, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass besagter optischer Wellenleiter als optischer Schichtwellenleiter ausgebildet ist mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), dass weiterhin Anregungslicht mithilfe einer oder mehrerer Gitterstrukturen, welche in der optisch transparenten Schicht (a) ausgeprägt sind, in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelt und zu darauf befindlichen Messbereichen (d) als geführte Welle geleitet wird, und dass weiterhin die im evaneszenten Feld besagter geführter Welle erzeugte Lumineszenz von lumineszenzfähigen Molekülen mit einem oder mehreren Detektoren erfasst und die Konzentration eines oder mehrerer Analyten aus der Intensität dieser Lumineszenzsignale bestimmt wird.
Dabei können (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über eine Gitterstruktur (c) oder (c') ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.
Bestandteil des erfindungsgemässen Verfahrens ist, dass zur Erzeugung der Lumineszenz ein Lumineszenzfarbstoff oder lumineszentes Nanopartikel als Lumineszenzlabel verwendet wird, das bei einer Wellenlänge zwischen 300 nm und 1100 nm angeregt werden kann und emittiert.
Es wird bevorzugt, dass das Lumineszenzlabel an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente oder an die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente gebunden ist.
Eine andere Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites oder noch weitere Lumineszenzlabel mit gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden.
Dabei wird bevorzugt, dass das zweite oder noch weitere Lumineszenzlabel bei der gleichen Wellenlänge wie der erste Lumineszenzfarbstoff angeregt werden kann, aber bei anderen Wellenlängen emittieren.
Insbesondere ist von Vorteil, wenn die Anregungsspektren und Emissionsspektren der eingesetzten Lumineszenzfarbstoffe nur wenig oder gar nicht überlappen.
Eine Variante des Verfahrens besteht darin, dass zum Nachweis des Analyten Ladungs- oder optischer Energietransfer von einem als Donor dienenden ersten Lumineszenzfarbstoff zu einem als Akzeptor dienenden zweiten Lumineszenzfarbstoff verwendet wird.
Eine andere Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden.
Eine Weiterentwicklung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden.
Es wird bevorzugt, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren nach einer der vorgenannten Ausführungsformen zur gleichzeitigen oder sequentiellen, quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Proteinen, wie beispielsweise Antikörpern oder Antigenen, Rezeptoren oder Liganden, Chelatoren, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag-Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag-Proteinen") und deren Komplexbildungspartnern, Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA-Analoga, Enzymen, Enymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen und Kohlehydraten.
Mögliche Ausführungsformen des Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Proben beispielsweise natürlich vorkommende Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Gewebeflüssigkeiten oder Eigelb sind.
Andere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende Probe eine optisch trübe Flüssigkeit, Oberflächenwasser, ein Boden- oder Pflanzenextrakt, eine Bio- oder Syntheseprozessbrühe ist.
Es ist auch möglich, dass die zu untersuchenden Proben aus biologischen Gewebeteilen oder Zellkulturen präpariert sind.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemässen Verfahrens zu quantitativen oder qualitativen Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA-Analytik und die Bestimmung von genomischen oder proteomischen Unterschieden im Genom, wie beispielsweise Einzelnukleotid-Polymorphismen, zur Messung von Protein-DNA- wechselwirkungen, zur Bestimmung von Steuerungsmechanismen für die m-RNA-Expression
und für die Protein(bio)synthese, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofilen, insbesondere zur Bestimmung von biologischen und chemischen Markerstoffen, wie mRNA, Proteinen, Peptiden oder niedermolekularen organischen (Boten-)Stoffen, sowie zum Nachweis von Antikörpern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Protduktforschung und -entwicklung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktforschung und -entwicklung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischehn Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, insbesondere in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
Beispiel:
1. Materialien
Poly(L-Lysin)hydrobromid (Molekulargewicht ca. 20 kDa), Streptavidin von Streptomyces avidinii (Molekulargewicht ca. 60 kDa), Avidin aus Eiweiss (Molekulargewicht ca. 66 kDa), biotinyliertes (d.h. an Biotin gebundenes) Ziegen-anti-Kaninchen Immunoglobulin (anti-R-IgG- Biotin, Molekulargewicht ca. 150 kDa) und biotinyliertes Rinderserum- Albumin (BSA-Biotin, Molekulargewicht ca. 66 kDa) wurden bezogen von Sigma-Aldrich (Buchs, Schweiz). Die N- Hydroxysuccinimidylester von Methoxy-Poly(ethylenglycol)-Propionsäure (MeO-PEG-SPA, Molekulargewicht 2 kDa) und der α-Biotin-ω-N-Hydroxysuccinimidylester von Poly(ethylenglycol)carbonat (Biotin-PEG-CO2-NHS, Molekulargewicht 3.4 kDa) wurden bezogen von Shearwater Polymers Inc. (Huntsville, USA). Kaninchen-Immunoglobulin (antihuman- Albumin) (R-IgG, Molekulargewicht ca. 150 kDa) und Kaninchen-anti-Rinderserum- Albumin (anti-BSA, Molekulargewicht ca. 150 kDa) wurden bezogen von.DAKO (Glostrup, Dänemark). Alle genannten Antikörper-Reagentien waren polyklonal. Kontrollserum N (human) wurde bezogen von Hoffmann-La Röche (Basel, Schweiz). 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l- ethan-sulfonsäure (HEPES) und andere Chemikalien zur Herstellung von Puffern wurden bezogen von Fluka (Buchs, Schweiz).
Alle wässrigen Lösungen wurden mit ultrareinem Wasser (18 MΩcm) aus einem „EasyPure Reverse Osmosis System" (Barnstead Thermolyne, Dubuque, USA) hergestellt.
2. Träger
Als Träger dient ein als Gitterkoppler ausgebildeter Dünnschichtwellenleiter (TiO -SiO2-Solgel als wellenleitender Schicht auf einem Glassubstrat, Periode des Koppelgitters in der wellenleitenden Schicht: 417 nm) (Mikrovakuum Ltd., Budapest, Ungarn) mit einer darauf durch Sputtern aufgebrachten, 12 nm dünnen Nb2O5-Schicht. Vor ihrem ersten Gebrauch wurden diese Träger, mit Nb2O5 als oberster Schicht, 10 Minuten in 0.1 M HC1 beschallt, gründlich gespült mit ultrareinem Wasser, mit Stickstoff trockengeblasen und nachfolgend 2 Stunden lang mit Sauerstoff-Plasma in einem Plasmareiniger / -sterilisator PDC-32G (Harrick, Ossining, USA) behandelt.
3. Synthese von PLL-g-PEG und dessen Derivaten
Die Synthese von PLL-g-PEG wurde von Sawhney und Hubbell beschrieben (A. S. Sawhney, J. A. Hubbell, Biomaterials 13 (1992) 863 - 870). Das für die der vorliegenden Anmeldung zugrundeliegenden Untersuchungen benutzte Verfahren basiert auf einer Vorschrift, welche von Elbert und Hubbell entwickelt wurde (D. L. Elbert, J. A. Hubbell, J. Biomed. Mater. Res. 42 (1998) 55 - 65). Gemäss WO 00/65352 hat sich für PEG-Teilketten mit Molekulargewicht 2 kDa ein Pfropf- Verhältnis („grafting ratio") zwischen g = 3 und g = 5 als ein Optimum zur Immobilisierung einer möglichst hohen Menge von Polymeren auf negativ geladenen Metalloxid-Oberflächen bei gleichzeitiger Gewährleistung einer minimalen unspezifischen Bindung (Adsorption) von Proteinen auf den mit diesem Polymeren beschichteten Metalloxid- Oberflächen erwiesen. Für die in diesem Beispiel beschriebenen Experimente wird ein Verhältnis von g = 3.5 verwendet. Dabei wird der prozentuale Anteil der PEG-Ketten mit daran gebundenem Biotin („biotinyliertem PLL-g-PEG") variiert.
Figur 1 zeigt schematisch die Synthese von PLL-g-PEG. N-Hydroxy-succinimidylester von sowohl biotinyliertem als auch nicht biotinyliertem Poly(ethylenglycol) („PEG") werden mit poly(L-Lysin) („PLL") in stöchiometrischem Verhältnis zur Reaktion gebracht zur Herstellung des erwünschten Produkts. Die Details zu dieser Synthese sind nachfolgend unter 3.1 und 3.2 beschrieben. Für die biotinylierten PEG-Ketten wird eine grössere Kettenlänge als für Methoxy- PEG gewählt zur Gewährleistung einer guten Zugänglichkeit des polymergebundenen Biotins.
In der nachfolgend gewählten Nomenklatur für die Bezeichnung der verschiedenen PLL-g-PEG- Derivate sind die Molekulargewichte der Polymerenteilketten der Co-Polymeren, das Pfropfverhältnis („grafting ratio") sowie der prozentuale Anteil biotinylierten PEGs umfasst. Entsprechend beschreibt „PLL(20)-g/"5.57-PEG(2)/PEG-Biotin(3.4)30%" ein Polymeres, gebildet von einer Hauptkette aus Poly(L-Lysin) mit Molekulargewicht 20 kDa sowie Seitenketten, zu 70 % bestehend aus Poly(ethylenglycol) mit Molekulargewicht 2 kDa und 30 % aus biotinyliertem Poly(ethylenglycol) mit Molekulargewicht 3.4 kDa. Das Pfropfverhältnis („grafting ratio") von 3.5 bedeutet, dass im Durchschnitt an jeweils zwei von sieben Lysin- Gruppen (Lysin-Einheiten) biotinylierte oder nicht biotinylierte PEG-Ketten gebunden sind. Da alle in diesem Beispiel genannten Polymeren aus gleichartigen Vorprodukten hergestellt
wurden, soll alternativ zu „PLL-g-PEG/PEG-Biotin30%" auch die Abkürzung „PPB30" verwendet werden. Für andere prozentuale Anteile biotinylierten PLL-g-PEGs werden entsprechende Abkürzungen verwendet.
3.1 Synthese von PLL(20)-g/3.57-PEG(2)
Poly(L-Lysin)-Hydrobromid („PLL-HBr") wird gelöst in 25 ml Natrium-Tetraboratpuffer (sodium tetraborate buffer, „STBB", 50 mM, pH 8.5) pro Gramm PLL-HBr. Die Lösung wird gerührt und anschliessend gefiltert (0.22 μm Durapore-Membran, sterile Millex GV, Sigma- Aldrich, Buchs, Schweiz) und in ein steriles Kultur-Röhrchen (culture tube) gefüllt. Unter gleichmässigem Rühren der Lösung wird dann MeO-PEG-SPA-Pulver in gemäss dem stöchiometrischen Verhältnis geeigneter Menge hinzugefügt. Nach weiteren sechs Stunden Rührens der Lösung bei Raumtemperatur wird die Lösung umgefüllt in ein Dialyse-Röhrchen (Spectr/Por Dialyse-Röhrchen, Molekulargewichts-Beschränkung („cut-off ') 6 - 8 kDa, Sochochim, Lausanne, Schweiz). Die Dialyse wird 24 Stunden lang in einem Liter phosphatgepufferter Salzlösung („PBS", 10 mM, pH 7.0) durchgeführt, gefolgt von 24 Stunden weiterer Dialyse in einem Liter deionisierten Wassers. Das Produkt wird dann 48 Stunden lang bei einer Temperatur von -50°C und einem Druck von 0.2 mbar gefriergetrocknet.
3.2 Synthese von biotinylierten PLL-g-PEG
Biotinyliertes PLL-g-PEG wird in ähnlicher Weise wie vorangehend beschrieben synthetisiert. Biotin-PEG-CO2-NHS-Pulver wird in gemäss dem stöchiometrischen Verhältnis geeigneter Menge langsam zu der gefilterten Lösung von PLL-HBr-Lösung hinzugegeben und eine Stunde lang gerührt. Anschliessend wird MeO-PEG-SPA in gemäss dem stöchiometrischen Verhältnis geeigneter Menge hinzugegeben, und die entstehende Lösung wird weitere fünf Stunden lang gerührt. Die weiteren Schritte der Dialyse und der Produktgewinnung sind gleichartig wie vorangehend beschrieben.
3.3 Bestimmung des Pfropf- Verhältnisses (grafting ratio) und des prozentualen Biotin- Anteils
Die Abschätzung des Pfropf- Verhältnisses (grafting ratio) und des prozentualen Biotin-Anteils in den biotinylierten PEG-Derivaten erfolgt mithilfe von 1H-NMR. Die lyophilisierten Polymeren werden in D2O gelöst und die Spektren mit einem 300 MHz NMR-Spektrometer aufgenommen. Die daraus bestimmten Werte sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1: Pfropf -Verhältnisse (grafting ratio) und prozentualer Biotin- An teil in biotinylierten PEG-Derivaten, bestimmt mithilfe von 1H-NMR.
4. Bestimmung der Menge oberflächenadsorbierter Moleküle mithilfe eines Gitterkoppler- Sensors als Träger
Die Masse adsorbierten Polymers auf den Nb2θ5-Oberflächen wird anhand des Unterschiedes der Koppelbedingungen für Lichteinkopplung in einen Gitterkoppler-Sensor vor und nach Aufbringung der jeweiligen Polymerenschichten bestimmt. Das Arbeitsprinzip eines Gitterkoppler-Sensors ist beispielsweise in der US -Patentschrift Nr. 4952056 beschrieben. Als Messinstrument wurde ein Gitterkoppler-Aufbau (BIOS I, ASI AG, Zürich, Schweiz) verwendet.
Die Werte der Masse oberflächenadsorbierten Materials werden bestimmt aufgrund der Gleichung von Feijter (J. J. Ramsden, J. Stat. Phys. 73 (1993) 853 - 877). Mithilfe eines Raleigh-Interferometers wurde ein inkrementeller Wert von dn/dc = 0.158 cm3/g für die Adsorption der Polymeren auf einer Oberfläche bestimmt und für die weiteren Rechnungen zugrunde gelegt. Für die Proteinadsorption auf einer Oberfläche wurde ein Wert von dn/dc =
0.182 cm3/g vorausgesetzt (J. J. Ramsden, D. J. Roush, D. S. Grill, R. Kurrat, R. C. Willson, J. Am. Chem. Soc. 117 (1995) 8511 - 8516).
5. Beschichtung der Nb2θs-Oberflächen mit Polymeren
Ein gemäss Abschnitt 2. dieses Beispiels vorbehandelter Träger wird in HEPES-1 -Puffer (10 mM HEPES, pH 7.4) vor einem Experiment mindestens fünf Stunden lang equilibriert, dann in das Gitterkoppler-Messinstrument eingesetzt und dort eine weitere Stunde lang in HEPES-1- Puffer equilibriert, bis eine stabile Basislinie, d.h. ein stabiler Resonanzwinkel zur Einkopplung des Anregungslichts in die hochbrechende wellenleitende Schicht mithilfe des Koppelgitters, erreicht ist.
Lösungen von PLL-g-PEG (15 μM) und PLL-g-PEG/PEG-Biotin in HEPES -1 -Puffer werden durch 0.22 μm Durapore-Membranen gefiltert und unmittelbar vor Gebrauch gemischt. Die Beschichtung der Nb2O5-Oberflächen erfolgt in situ im Gitterkoppler- Aufbau, indem die Metalloxid-Oberfläche des Trägers mit der Lösung der Polymerenmischung in Kontakt gebracht wird. Dieses erfolgt 30 Minuten lang unter konstantem Fluss bei einer Flussrate von 1 ml/h. Der dabei beschichtete Träger wird anschliessend 30 Minuten lang mit HEPES -1 -Puffer gespült.
6. Durchführung der Protein-Bindungsassays 6.1. Standard-Assay-Protokoll
Für die meisten nachfolgend beschriebenen Experimente werden die Polymer-beschichteten Träger sequentiell unter kontinuierlichem Fluss (Flussrate: 1 ml/h) mit Lösungen von Streptavidin (100 μg/ml), anti-R-IgG-Biotin (100 μg/ml) und schliesslich R-IgG (200 μg/ml) inkubiert. Jeder dieser Inkubationsschritte hat eine Dauer von 15 Minuten, was bei den gewählten Konzentrationen ausreichend ist zur Absättigung aller verfügbaren Bindungsstellen. Anschliessend folgt jeweils ein 30-minütiger Wasch-Schritt mit dem jeweiligen Puffer zur Entfernung nicht gebundener, zuvor zugeführter Moleküle. Es wurden jeweils HEPES- Pufferlösungen verwendet.
6.2. Spezielle Assay-Protokolle
Für weiter nachfolgend beschriebene Untersuchungen des Einflusses der Streptavidin- Oberflächendichten auf das Bindungsverhalten erfolgen gleichartige Verfahrensschritte wie unter 6.1. beschrieben, mit der Ausnahme, dass eine Streptavidin-Konzentration von nur 2.5 μg/ml eingesetzt wird und die Inkubationszeit 45 Minuten beträgt.
Für Untersuchungen der Abhängigkeit der optimalen Oberflächendichte der Erkennungselemente von der Grosse der aus einer zugeführten Probe zu bindenden Moleküle werden BSA-Biotin (100 μg/ml) und Kaninchen-anti-Rinderserum- Albumin („anti-BSA", 200 μg/ml) anstelle von anti-R-IgG-Biotin und R-IgG verwendet.
7. Aufbringung von Polymeren mit teilweise daran gebundenen Erkennungselementen auf einen Träger
Als Träger dient ein als Gitterkoppler ausgebildeter Dünnschichtwellenleiter (TiO2-SiO2-Solgel als wellenleitender Schicht auf einem Glassubstrat, Periode des Koppelgitters in der wellenleitenden Schicht: 417 nm) mit einer darauf aufgebrachten, 12 nm dünnen Nb2O5-Schicht. Bei einem eingestellten pH von 7.4 einer nachfolgend aufgebrachten Lösung ist die Oberfläche von Nb2O5 negativ geladen (isoelektrischer Punkt IEP = 3.6), während PLL-Hauptketten von PLL-g-PEG und PLL-g-PEG/PEG-Biotin stark positiv geladen sind. Es wird angenommen, dass die starke Adsorption von Polymeren, welche PLL als wesentlichen Bestandteil umfassen, auf Nb2O5-beschichteten Oberflächen vor allem auf elektrostatischer Wechselwirkung zwischen dieser Metalloxid-Oberfläche und dem Polymeren als mehrfach geladenem Adsorbat beruht.
Ziel der Aufbringung einer Mischung aus PLL-g-PEG und PLL-g-PEG/PEG-Biotin ist es, eine durch Einstellung des Mischungsverhältnisses eine optimale Bindungskapazität der polymerbeschichteten Oberfläche zu erreichen und zugleich unspezifische Bindung zu minimieren. Biotin, gebunden als Erkennungselement in dem Polymeren PLL-g-PEG/PEG- Biotin, dient als spezifisches Erkennungselement für Moleküle wie beispielsweise Avidin oder Streptavidin, an welche in einem weiteren Bindungsschritt „biotinylierte" Moleküle (d.h. mit
Biotin verknüpfte Moleküle), wie beispielsweise anti-RIgG-Biotin, gebunden werden können, welche ihrerseits als Erkennungselemente für einen Analyten (in diesem Beispiel R-IgG) dienen können.
Infolge der Aufbringung dieser Polymerenmischung mit PLL-g-PEG/PEG-Biotin auf der Nb2θ5-Oberfläche sind die Biotin-Bindungsstellen von nichtbindenden PEG-Ketten umgeben, so dass die Proteinadsorption vermindert wird. Derartige Eigenschaften sind in einer Reihe von Patentschriften (z. B. in den US-Patenten Nr. 5820882, 5232984, 5380536, 6231892, 5462990, 5627233 und 5849839) beschrieben. In der WO 00/65352 sind auch Polymere dieser Art mit daran gebundenen Biotin-Molekülen beschrieben. Es ergibt sich aus diesen Schriften jedoch keinerlei Hinweis darauf, dass - wie gemäss der vorliegenden Erfindung - die Bindungskapazität optimiert werden kann mittels Einstellung des Anteils gebundenen Biotins. Diese Optimierung der Bindungskapazität wird erfindungsgemäss, in diesem Beispiels mittels Einstellung des Anteilverhältnisses zwischen PLL-g-PEG und PLL-g-PEG/PEG-Biotin, eingestellt.
Die Masse adsorbierten Polymers auf den Nb2θ5-Oberflächen wird anhand des Unterschiedes der Koppelbedingungen für Lichteinkopplung in den Gitterkoppler vor und nach Aufbringung der jeweiligen Polymerenschichten bestimmt. Hieraus werden Werte von 167 +/- 8 ng/cm2 adsorbierten Polymers für reines PLL-g-PEG und 213 +/- 13 ng/cm2 für reines PPB20 bestimmt. Unter Berücksichtigung der Molekulargewichte und der mittels NMR bestimmten Pfropfverhältnisse („grafting ratio") werden die Oberflächenkonzentrationen der adsorbierten Polymeren für jedes eingesetzte Mischungsverhältnis bestimmt. Innerhalb der experimentellen Genauigkeit ergibt sich ein einheitlicher Wert von 2.5 +/- 0.1 pmol/cm2, woraus geschlossen wird, dass das Mischungsverhältnis der Polymeren auf der Oberfläche das gleiche ist wie zuvor in Lösung.
8. Bindung von Streptavidin an die Erkennungsoberfläche
Unter Zufuhr einer Lösug von Streptavidin (100 μg/ml) zu Oberflächen mit unterschiedlichen Mischungsverhältnissen (PLL-g-PEG : PPB20), unter kontinuierlichem Fluss, wird ein
Sättigungssignal für die Bindung von Streptavidin an die mit biotinylierten Polymeren beschichtete Oberfläche innerhalb von 15 Minuten erreicht. Nach einem Wasch-Schritt mit HEPES -1 -Puffer wird für die Oberflächen mit den verschiedenen Polymeren- Mischungsverhältnissen jeweils die Menge gebundenen Streptavidins bestimmt. Die Menge oberflächengebundenen Biotins wird bestimmt aus NMR-Messungen und dem Mischungsverhältnis der Polymeren in Lösung.
In dieser Messreihe mit unterschiedlichen Mischungsverhältnissen oberflächenimmobilisierter Polymere steigt der Anteil gebundenen Streptavidins kontinuierlich mit dem Anteil von PPB20 (siehe Fig. 2). Auf der reinen PLL-g-PEG-Oberfläche wird keinerlei Bindung oder Adsorption beobachtet, während 2.77 pmol/cm2 Streptavidin an eine reine PPB20-Oberfläche (entsprechend 19.2 pmol/cm2 Biotin) gebunden werden. Aus der zweidimensionalen Kristallstruktur von Streptavidin kann geschlossen werden, dass ein einzelnes Streptavidinmolekül eine Grosse von etwas 5.5 nm x 4.5 nm hat (S. A. Darst, M. Ahlers, P. H. Meiler, E. W. Kubalek, R. Blankenburg, H. O. Ribi, H. Ringsdorf, R. D. Kornberg, Biophys. J. 59 (1991) 387 - 396). Demzufolge ist für eine dicht gepackte Streptavidin-Monoschicht eine Oberflächendichte von 6.71 pmol/cm zu erwarten. Folglich entsprechen die unter den Bedingungen des Versuchs zu Fig. 2 an die Oberfläche gebundenen Oberflächendichten von Streptavidin zwischen 0 % und 41 % einer dicht gepackten Monoschicht.
Für alle in dieser Reihe eingesetzten Polymeren-Mischungsverhältnisse beträgt das Verhältnis von gebundenem Streptavidin zu Oberflächen-immobilisiertem Biotin 1 : 6.5. Der relativ hohe Überschuss von Biotin-Teilmolekülen als immobilisierten Erkennungselementen gegenüber gebundenem Streptavidin, welches in einem Überschuss zugeführt wurde, der mengenmässig zur Absättigung aller verfügbaren Bindungsstellen führen müsste, kann dadurch erklärt werden, dass ein Teil der Biotinmolekül an der Oberfläche nicht zugänglich sein, sondern in der PEG- Teilschicht verborgen sein könnte. Andererseits könnte es auch zu einer Bindung von jeweils einem Streptavidin-Molekül an zwei oder mehr Biotin-Moleküle gekommen sein.
Im Falle einer Oberfläche, auf welcher reines PPB50 immobilisiert wird (entsprechend 42 pmol/cm Biotin auf der Oberfläche) werden etwa 6.65 pmol/cm Streptavidin gebunden, was in etwa der Menge einer Monoschicht entspricht. In diesem Fall beträgt das Verhältnis von gebundenem Streptavidin zu immobilisiertem Biotin also etwa 1 : 5.
Im nächsten Schritt wird biotinyliertes Anti-Kaninchen-Immunoglobulin (anti-R-IgG-Biotin) an die vorangehend mit Streptavidin modifizierte Oberfläche gebunden (an die verbleibenden Bindungsstellen für Biotin an Streptavidin). Anschliessend erfolgt ein Wasch-Schritt mit HEPES-1-Puffer.
Fig. 2 zeigt die Menge gebundenen anti-R-IgG-Biotin als Funktion der Konzentration zuerst oberflächengebundenen Biotins. Mit steigender Biotin-Oberflächenkonzentration, d. h. zugleich steigender Konzentration bzw. Oberflächendichte gebundenen Streptavidins, steigt zunächst auch die Menge gebundenen anti-R-IgG-Biotins an. Bei einer Oberflächenkonzentration (- dichte) von ca. 11.2 pmol/cm2 über PEG/Biotin gebundenen Biotins, entsprechend einer Konzentration von 1.68 pmol cm gebundenen Streptavidins (oder x % einer vollständigen Monoschicht), wird ein Maximum der Menge von gebundenem anti-R-IgG-Biotin in Höhe von etwa 0.43 pmol/cm erreicht. Bei einem weiteren Anstieg der Dichte oberflächenimmobilisierten PEG-Biotins und damit des daran gebundenen Streptavidins sinkt die Menge gebundenen anti- R-IgG-Biotin wieder ab.
Die Abnahme der Bindungskapazität für anti-R-IgG-Biotin kann erklärt werden durch sterische Behinderung der verfügbaren Bindungsstellen an Streptavidin. Dabei ist auch zu berücksichtigen, dass das anti-R-IgG-Biotin-Molekül mit einer Grosse ähnlich derer von anti-R- IgG (von 14.3 nm x 5.9 nm x 13.1 nm (H. D. Kratzin, W. Plam, M. Stangel, W. E. Schmidt, J. Friedrich, N. Hilschmann, Biol. Chem. HS 370 (1989) 263 - 272)) eine etwa 2.5 fach grössere Grundfläche als Streptavidin einnimmt, wenn man einen „Fussabdruck" („foot print") der Grosse 14.3 nm x 5.9 nm annimmt.
Zur Prüfung der Hypothese einer Abnahme der Bindungskapazität aufgrund sterischer Hinderung bei einer hohen Dichte relativ grosser oberflächengebundener Erkennungselemente wird in einem weiteren Experiment anstelle von anti-R-IgG-Biotin (Molekulargewicht ca. 150 000) das kleinere Protein BSA-Biotin (Molekulargewicht ca. 50 000) zugeführt, gefolgt von der Zufuhr des Antikörpers anti-BSA im nachfolgenden Schritt.
In Fig. 3 sind die Ergebnisse für die sequentielle Adsorption bzw. Bindung von Streptavidin, BSA-Biotin und anti-BSA an die mit gemischten Polymerschichten bedeckte Trägeroberfläche
dargestellt: Die Menge gebundenen BSA-Biotins steigt kontinuierlich mit der Menge Oberflächen-immobilisierten Biotins an, und zwar deutlich über den Wert hinaus, bei dem für das Streptavidin- / anti-E-IgG-Biotin-System das Maximum erreicht wurde. Bis zu Oberflächenkonzentrationen von 2.77 pmol/cm2 Streptavidin wird kein Maximalwert des gebundenen BSA-Biotins (ca. 0.7 pmol/cm2 bei 2.77 pmol/cm2 Streptavidin bzw. 11.6 pmol/cm2 Oberflächengebundenen PEG/Biotins) erreicht.
In einem weiteren Experiment wird reines PPB50 auf der Trägeroberfläche immobilisiert. Bei den weiteren entsprechenden Assay-Schritten binden 6.65 pmol/cm2 Streptavidin an die Oberfläche, aber nur noch 0.12 pmol/cm2 BSA-Biotin, woraus geschlossen werden kann, dass für dieses kleinere Molekül die Immobilisierungsdichte der Erkennungselemente ebenfalls einen Optimalimalwert hat, dieser aber verschoben ist verschoben ist zu höheren Werten oberflächengebundenen Streptavidins (zwischen 2.77 pmol/cm2 und 6.65 pmol/cm2).
In einem letzten Assay-Schritt wird der zuvor mit anti-R-IgG-Biotin in Kontakt gebrachte „Chip" mit R-IgG als Analyt in Kontakt gebracht, gefolgt von Spülen mit Puffer. Wie aus Fig. 4 ersichtlich, folgt das Bindungsverhalten für R-IgG sehr genau dem Trend der Bindungskurve von anti-R-IgG-Biotin, wie er vorangehend für die Bindung von anti-R-IgG-Biotin beschrieben wurde.