WO2003025160A2 - Neuron culture medium and use of cholesterol for cultivating, differentiating or proliferating neurons - Google Patents

Neuron culture medium and use of cholesterol for cultivating, differentiating or proliferating neurons Download PDF

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Abstract

The invention relates to a glia cell- and/or serum-free culture medium that is comprised of cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogues, cholesterol precursors and/or cholesterol-promoting substances. The invention further relates to the use of cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogues, cholesterol precursors and/or cholesterol-promoting substances for cultivating, allowing the survival of, proliferating, differentiating and/or growing neurons.

Description

Nervenzellkulturmedium und Verwendung von Cholesterin zur Kultivierung, Differenzierung oder Proliferation von Nervenzellen Nerve cell culture medium and use of cholesterol for the cultivation, differentiation or proliferation of nerve cells
Die Erfindung betrifft ein Nervenzellkulturmedium, das Gliazellen- und/oder Serum-frei ist und als wichtigen Be- standteil Cholesterin bzw. Cholesterin-Derivate oder -Analoga oder Cholesterin-Vorläufersubstanzen umfasst; die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Cholesterin, -Derivaten, -Analoga, -Vorläufersubstanzen zur Kultivierung von Nervenzellen.The invention relates to a nerve cell culture medium which is free of glial cells and / or serum and comprises cholesterol or cholesterol derivatives or analogs or cholesterol precursors as an important component; the invention further relates to the use of cholesterol, derivatives, analogs, precursors for the cultivation of nerve cells.
Nervenzellen sind hochdifferenzierte Zellen, die zum Empfang, zur Bearbeitung und zur Weiterleitung nervöser Erregung befähigt sind. Diese Zellen kommen beispielsweise im Zentralnervensystem, in den Ganglien und in den Sinnesorga- nen vor. Die Nervenzellen bilden das strukturelle Grundelement des Nervensystems bei Mensch und Tier. Die Nervenzelle besteht aus einem Zellkörper (= Corpus neuroni) und einem Zellkern, der von einem Zytoplasma umgeben ist. Die Zelle selbst wird als Perikaryon bezeichnet. Die Nervenzelle weist weiterhin Neurofibrillen, NISSL-Substanz und Fortsätze auf sowie ein oder mehrere Dendriten: Die Nervenzellmembran mit ihrem funktionsdifferenten Aufbau als Rezeptor, axonaler konduktiler Abschnitt, Dendrit oder Synap- se reagiert auf entsprechende Reize mit unterschiedlichen Permeabilitätsänderungen, wodurch eine Erregungsleitung bzw. ein Membranaktionspotential aufgebaut wird. Insbesondere bei höheren Organismen, wie beispielsweise dem Menschen, spielen die Nervenzellen eine zentrale Rolle, vor allem da sie das Grundelement des Zentralnervensystems bil- den. Daher führen selbst kleinere Verletzungen, Läsionen, Verdrängungen durch gutartige Tumoren oder ähnliches zu einer Einschränkung der physischen und psychischen Leistungen des betreffenden Organismus.Nerve cells are highly differentiated cells that are able to receive, process and transmit nervous excitation. These cells occur, for example, in the central nervous system, in the ganglia and in the sensory organs. The nerve cells form the basic structural element of the nervous system in humans and animals. The nerve cell consists of a cell body (= Corpus neuroni) and a cell nucleus, which is surrounded by a cytoplasm. The cell itself is called a perikaryon. The nerve cell also has neurofibrils, NISSL substance and processes, and one or more dendrites: the nerve cell membrane with its functionally different structure as a receptor, axonal conductile section, dendrite or synapse reacts to corresponding stimuli with different changes in permeability, causing an excitation conduction or a Membrane action potential is built up. Especially in higher organisms, such as humans, the nerve cells play a central role, especially since they form the basic element of the central nervous system. Therefore, even minor injuries, lesions, Repressions by benign tumors or the like lead to a restriction of the physical and psychological performance of the organism in question.
Im Stand der Technik werden Nervengewebe oder Zellstörungen bzw. Zellläsionen von Nervenzellen unter anderem dadurch therapiert, dass die Nervenzellen in einer Zellkultur gezüchtet werden, um sie an den Ort der Läsion oder Störung einzubringen; das heißt, eine zentrale Voraussetzung für die Therapie von Zellschädigungen ist das Vorhandensein von entsprechenden Zellkulturen. Darüber hinaus dienen diese Kulturen auch zur Herstellung von Material für den Gewebe- ersatz, das aus embryonalen Stammzellen gewonnen werden kann. Nervenzellkulturen finden weiterhin eine breite An- endung in der biomedizinischen Forschung sowie bei der Entwicklung von Arzneimitteln und Diagnoseverfahren, wo sie für Funktionsuntersuchungen, Toxizitäts- und Wirksamkeitstests verwendet werden (Culture of Animal Cells, 3. Aufl., R.I. Freshney, 1994, Wiley; Animal Cell Culture Techniques, M. Clynes (Hrsg.), 1998, Springer; Cell and Tissue Culture. Laboratory Procedures in Biotechnology, A. Doyle & J.B. Griffiths (Hrsg.), 1998, Wiley/VCH; Cells. A Laboratory Manual: Vol 1: Culture and Biochemical Analysis of Cells, Spector et al . (Hrsg.), 1998, Cold Spring Harbor Press).In the prior art, nerve tissue or cell disorders or cell lesions of nerve cells are treated, inter alia, by growing the nerve cells in a cell culture in order to bring them to the site of the lesion or disorder; that is, a key prerequisite for the therapy of cell damage is the presence of appropriate cell cultures. In addition, these cultures also serve to manufacture tissue replacement material that can be obtained from embryonic stem cells. Nerve cell cultures continue to find wide application in biomedical research as well as in the development of drugs and diagnostic methods, where they are used for functional examinations, toxicity and efficacy tests (Culture of Animal Cells, 3rd ed., RI Freshney, 1994, Wiley; Animal Cell Culture Techniques, M. Clynes (ed.), 1998, Springer; Cell and Tissue Culture. Laboratory Procedures in Biotechnology, A. Doyle & JB Griffiths (ed.), 1998, Wiley / VCH; Cells. A Laboratory Manual: Vol 1: Culture and Biochemical Analysis of Cells, Spector et al. (Ed.), 1998, Cold Spring Harbor Press).
Primärkulturen von Nervenzellen kommt eine besondere Bedeutung zu (Culturing Nerve Cells, 2. Aufl., G. Banker & K. Goslin (Hrsg.), 1998, MIT Press), denn die außerordentliche Komplexität des Zentralnervensystems und seine geringe ex- perimentelle Zugänglichkeit erfordern den intensiven Einsatz von neuronalen Kulturen in der neurobiologischen Forschung und bei der Entwicklung von Diagnoseverfahren und Arzneimitteln zur Erkennung und Therapie von Verletzungen und Erkrankungen des zentralen Nervensystems . Eine wichtige Voraussetzung für die Kultivierung von Nervenzellen ist die Bestimmung der Kulturbedingungen, welche das Überleben, die Differenzierung und das Wachstum der Zellen sichern. Im lebenden Organismus versorgen sich die verschiedenen Zeiltypen eines Gewebes gegenseitig mit essentiellen Faktoren. Dies trifft auch für das Zentralnervensystem zu: Nervenzellen überleben und wachsen in Gegenwart von Faktoren, welche von Gliazellen sezerniert werden. Viele Kulturen aus dissoziiertem Nervengewebe enthalten im- mer auch Gliazellen, so dass das Überleben der Nervenzellen gesichert ist. Wenn Nervenzellen isoliert werden oder dem Gewebe zu einem Zeitpunkt entnommen werden, wo noch wenige Gliazellen vorhanden sind, werden Gliazellen zum Beispiel in Form von so genannten Feeding Layers hinzugefügt . Als weitere Quelle für Substanzen, welche das Überleben und Wachstum von Nervenzellen unterstützen, dient z.B. auch tierisches oder humanes Serum, welches bis zu 20% den Kulturmedien zugesetzt werden kann.Primary cultures of nerve cells are of particular importance (Culturing Nerve Cells, 2nd ed., G. Banker & K. Goslin (ed.), 1998, MIT Press) because the extraordinary complexity of the central nervous system and its low experimental accessibility require it the intensive use of neuronal cultures in neurobiological research and in the development of diagnostic procedures and medicines for the detection and therapy of injuries and diseases of the central nervous system. An important prerequisite for the cultivation of nerve cells is the determination of the culture conditions, which ensure the survival, differentiation and growth of the cells. In the living organism, the different cell types of a tissue supply each other with essential factors. This also applies to the central nervous system: nerve cells survive and grow in the presence of factors that are secreted by glial cells. Many cultures from dissociated nerve tissue always contain glial cells, so that the survival of the nerve cells is ensured. If nerve cells are isolated or removed from the tissue at a time when there are still a few glial cells, glial cells are added in the form of so-called feeding layers, for example. Animal or human serum, which can be added to the culture media up to 20%, is also used as a further source of substances that support the survival and growth of nerve cells.
Ein entscheidender Nachteil der bekannten Kulturen ist, dass die genaue Zusammensetzung des Kulturmediums unbekannt ist, weil die von Gliazellen sezernierten Substanzen und die im Serum enthaltenen Stoffe bisher nur unvollständig charakterisiert sind. Die Kulturen sind daher für eine Vielzahl von Experimenten ungeeignet, beispielsweise wenn es darum geht, die Bedingungen, welche die Entwicklung und Differenzierung von Nervenzellen steuern, zu charakterisieren.A decisive disadvantage of the known cultures is that the exact composition of the culture medium is unknown because the substances secreted by glial cells and the substances contained in the serum have hitherto been incompletely characterized. The cultures are therefore unsuitable for a large number of experiments, for example when it comes to characterizing the conditions which control the development and differentiation of nerve cells.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Glia und/oder Serum-freies Kulturmedium bereitzustellen, welches das Überleben, das Wachstum oder die Differenzierung von isolierten Nervenzellen ermöglicht. Die Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung eines Gliazellen und/oder Serum-freien Nervenzellen-Kulturmediums, umfassend Cholesterin, Cholesterin- Derivate, Cholesterin-Analoga, Cholesterin-Vorläufer und/oder Cholesterin-fördernde Stoffe.The object of the invention is therefore to provide a glia and / or serum-free culture medium which enables the survival, growth or differentiation of isolated nerve cells. The invention solves this technical problem by providing a glial cell and / or serum-free nerve cell culture medium comprising cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogs, cholesterol precursors and / or cholesterol-promoting substances.
Nervenzellen-Kulturmedien im Sinne der Erfindung sind die einem Fachmann bekannten Medien, in denen tierische Zellen kultiviert werden können. Das Kulturmedium ist ein flüssi- ges oder festes Substrat, auf dem sich eine Kultur von Nervenzellen vermehren kann. Es enthält außer Wasser mindestens eine für die Zellen assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quelle. Zusätzlich können eine Phosphat- und Schwefel-Quelle, Mineralstoffe, sowie eventuell benötigte Wuchsstoffe und Vitamine enthalten sein. Darüber hinaus können Stoffe enthalten sein, die spezielle Stoffwechselreaktionen des Organismus bewirken sollen oder auch so genannte Precursor, aus denen bestimmte Metabolite gebildet werden. Der für aerobe Prozesse erforderliche Sauerstoff wird in der Regel während des Prozesses in Form von Luft in das Kulturmedium eingetragen. Solche Medien können z.B. sein: ein Medium, das DMEM (Dulbecco's modified Eagle me- dum)und gegebenenfalls 1 % einer Antibiotikalösung enthält, gepufferte Salz-Lösungen, z.B. Hanks BSS oder PBS, sowie das Kulturmedium PRMI . Diesen Kulturmedien werden, um als Substrat für Nervenzellen eingesetzt werden zu können, Cholesterin, Cholesterin-Derivate, Cholesterin-Analoga, Cholesterin-Vorläufer und/oder Cholesterin-fördernde Stoffe zugesetzt, wodurch das erfindungsgemäße Kulturmedium erhalten wird. Das erfindungsgemäße Kulturmedium kann insbesondere zur Kultivierung von neuronalen Zellen eingesetzt werden. Selbstverständlich eignen sich auch bekannte Kulturmedien für Nervenzellen besonders gut als Substrat, wobei diese Kulturmedien kein Serum enthalten; es kann auch vorgesehen sein, dass diese Medien keine Gliazellen umfassen. Derarti- ge Medien können sein: ein DMEM-Medium mit Glutamin oder gegebenenfalls mit DMSO (Dimethoxysulfoxid) , das synthetische Alpha-Medium, KSFM oder Neurobasal/B27-Medium.Nerve cell culture media in the sense of the invention are the media known to a person skilled in the art, in which animal cells can be cultivated. The culture medium is a liquid or solid substrate on which a culture of nerve cells can multiply. In addition to water, it contains at least one carbon and nitrogen source that can be assimilated by the cells. It can also contain a source of phosphate and sulfur, minerals, and any necessary growth substances and vitamins. It can also contain substances that are supposed to cause special metabolic reactions of the organism or so-called precursors from which certain metabolites are formed. The oxygen required for aerobic processes is usually introduced into the culture medium in the form of air during the process. Such media can be, for example: a medium which contains DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) and optionally 1% of an antibiotic solution, buffered salt solutions, for example Hanks BSS or PBS, and the culture medium PRMI. Cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogs, cholesterol precursors and / or cholesterol-promoting substances are added to these culture media in order to be able to be used as a substrate for nerve cells, as a result of which the culture medium according to the invention is obtained. The culture medium according to the invention can be used in particular for the cultivation of neuronal cells. Of course, well-known culture media for nerve cells are also particularly suitable as substrates, these culture media not containing any serum; it can also be provided that these media do not comprise glial cells. Derarti- ge media can be: a DMEM medium with glutamine or, if appropriate, with DMSO (dimethoxysulfoxide), the synthetic alpha medium, KSFM or Neurobasal / B27 medium.
Frei von Gliazellen oder Serum im Sinne der Erfindung muss nicht die völlige Abwesenheit von Gliazellen oder Serum bedeuten, sondern heißt, dass die Gliazellen oder das Serum in einer Konzentration im Kulturmedium vorkommen, dass die Nervenzellen in einem solchen Kulturmedium nach einem län- geren Zeitraum pathophysiologische Reaktionen zeigen, also dass die Konzentration nicht ausreicht, um eine Kultivierung ohne die genannten Cholesterinsubstanzen zu ermöglichen.Free of glial cells or serum in the sense of the invention does not have to mean the complete absence of glial cells or serum, but means that the glial cells or serum occur in a concentration in the culture medium, that the nerve cells in such a culture medium are pathophysiological after a longer period of time Reactions show that the concentration is not sufficient to enable cultivation without the cholesterol substances mentioned.
Die so gewonnenen neuronalen Kulturen können für unterschiedlichste Fragestellungen eingesetzt werden. So können die Kulturen z.B. alternativ zu Tierversuchen als TestSysteme für neue Substanzen genutzt werden, um mögliche Nebenwirkungen zu analysieren. Außerdem kann die Effektivität neuronaler Wachstumsfaktoren bestimmt werden, die als aussichtsreiche Kandidaten für den therapeutischen Einsatz bei neurologischen Erkrankungen gelten. Die Parameter, nach denen die Kulturen ausgewertet werden können, sind unter anderem das Überleben von Nervenzellen, der Transmitter- metabolismus und die Morphologie. Schließlich können kultivierte Neurone oder Nervenzellen auch gentechnisch verändert werden und für verschiedene Zwecke, z.B. zur Zell- ersatztherapie bei neurodegenerativen Erkrankungen, genutzt werden.The neuronal cultures obtained in this way can be used for a wide variety of questions. For example, the cultures can be used as an alternative to animal testing as test systems for new substances to analyze possible side effects. The effectiveness of neuronal growth factors, which are considered promising candidates for therapeutic use in neurological diseases, can also be determined. The parameters according to which the cultures can be evaluated include survival of nerve cells, transmitter metabolism and morphology. Finally, cultured neurons or nerve cells can also be genetically modified and used for various purposes, e.g. for cell replacement therapy in neurodegenerative diseases.
Die Erfindung beruht also auf der überraschenden Lehre, dass Nervenzellen unter Zusatz einer ausreichenden Menge an Cholesterin oder Cholesterin-Äquivalenten bzw. Cholesterin- fördernden Stoffen oder Cholesterin-Vorläufern in einer Kultur ihre physiologischen Vorgänge - wie Wachstum, Diffe- renzierung, Proliferation und andere - weitestgehend aufrechterhalten können, ohne dass die bekannten Mengen Serum oder Gliazellen eingesetzt werden. Der Zusatz von Cholesterin oder Cholesterin-Äquivalenten, wie Derivaten, Analoga, Vorläufer-Strukturen oder Cholesterin-fördernden Stoffen, zu einem kommerziell erhältlichen Kulturmedium erhöht demgemäß die Überlebens- und Wachstumsraten von isolierten Nervenzellen, wodurch insbesondere auf den Zusatz weiterer Wachstums- und überlebensfördernder Faktoren verzichtet werden kann. Als Derivate des Cholesterins können verwendet werden, z.B. 7-Dehydrocholesterin, 20, 22-Dihydroxycholeste- rin, Ergosterin, Stigmasterin und/oder beta-Sitosterin. Im Sinne der Erfindung sind auch Gallensäure und Steroid-Vitamine Cholesterin-Derivate . Dazu können unter anderem gehö- ren Cholsäure, Desoxy-Cholsäure, Chenodesoxy-Cholsäure, Li- tocholsäure, Vitamin D2, Vitamin D3 und/oder Vitamin D4. Neben Cholesterin oder Cholesterin-Derivaten können selbstverständlich auch Stoffe eingesetzt werden, die den Chole- steringehalt der Zellen erhöhen, beispielsweise Substanzen, die die Cholesterinsynthese oder Aufnahme von Cholesterin erhöhen oder den Cholesterinabbau im Medium oder in der Zelle oder die Freisetzung in der Zelle erniedrigen.The invention is therefore based on the surprising teaching that nerve cells add a sufficient amount of cholesterol or cholesterol equivalents or cholesterol-promoting substances or cholesterol precursors to their physiological processes - such as growth, diffusion differentiation, proliferation and others - can be largely maintained without the known amounts of serum or glial cells being used. The addition of cholesterol or cholesterol equivalents, such as derivatives, analogs, precursor structures or cholesterol-promoting substances, to a commercially available culture medium accordingly increases the survival and growth rates of isolated nerve cells, in particular due to the addition of further growth and survival-promoting factors can be dispensed with. Cholesterol derivatives which can be used are, for example, 7-dehydrocholesterol, 20, 22-dihydroxycholesteryl ester, ergosterol, stigmasterol and / or beta-sitosterol. For the purposes of the invention, bile acid and steroid vitamins are also cholesterol derivatives. These can include cholic acid, deoxy-cholic acid, chenodeoxy-cholic acid, litocholic acid, vitamin D 2 , vitamin D 3 and / or vitamin D 4 . In addition to cholesterol or cholesterol derivatives, it is of course also possible to use substances which increase the cholesterol content of the cells, for example substances which increase the cholesterol synthesis or absorption of cholesterol or reduce the cholesterol breakdown in the medium or in the cell or the release in the cell.
Selbstverständlich ist es auch möglich, Cholesterin mit Hilfe von Trägermolekülen zuzugeben, welche die Löslichkeit erhöhen, beispielsweise natürliche oder künstliche Lipopro- teine wie beispielsweise Cyclodextrinen. Weiterhin ist es möglich, den Gehalt an Cholesterin durch Moleküle zu erhöhen, die die Cholesterinsynthese stimulieren, wie bei- spielsweise sekundäre Botenstoffe, die die Aktivität der Cholesterinsynthese von Schlüsselenzymen steigern. Weiterhin kann die Cholesterinaufnähme durch Moleküle, welche die Dichte von Lipoproteinrezeptoren oder die intrazelläre Verarbeitung von Lipoproteinen in der Zelle vermitteln, erhöht werden. Auch durch den Einsatz von dem Fachmann bekannten Molekülen, die Cholesterinabgaben aus den Nervenzellen zu hemmen, beispielsweise durch Moleküle, die die Freisetzung von Lipoproteinen inhibieren, wird die Konzentration von Cholesterin in den Nervenzellen erhöht . Beispielweise kann auch die Synthetisierung von Steroiden oder Gallenstoffen, die aus Cholesterin umgewandelt werden, durch spezifische Moleküle inhibiert werden, wodurch Cholesterin nicht abgebaut und somit ein hoher Cholesteringehalt im Kulturmedium bzw. in der Nervenzelle aufrechterhalten werden kann. Bei den Nervenzellen, die in dem erfindungsgemäßen Kulturmedium kultiviert werden, kann es sich um Nervenzellen aus Tieren oder Menschen handeln. Beispielsweise ist es möglich, dass adentritische Nervenzellen oder apolare Nervenzellen, die fortsatzlos sind, bzw. bipolare Nervenzellen, als sensible bzw. sensorische Nervenzellen mit je einem polaren Dendriten und Neuriten, wie sie zum Beispiel als Kδrnerzellen der Retina auftreten, oder multipolare Nervenzellen mit mehreren Dendriten und einem langen oder kurzen Neuriten, als motorische Zellen des animalen und autonomen Nervensystems, kultiviert werden. Weiterhin können polyneuritische Nervenzellen mit mehreren Neuriten, beispielsweise als CAJAL- Zelle der Großhirnrinde oder pseudo-unipolare Nervenzellen, wie sie in sensiblen Kopf- und Rückenmarksganglien vorkommen, oder auch unipolare Nervenzellen, bei denen Ursprung- lieh zwei Fortsätze scheinbar zu einem verschmolzen werden, wie sie beispielsweise in Stäbchen- und Zapfen-Riechzellen vorkommen, kultiviert werden. Ferner ist es selbstverständlich auch möglich, neuro-sekretorische Nervenzellen, wie sie beispielsweise aus dem Hypothalamus gewonnen werden können oder Neuromelanozyten zu kultiviern. Weiterhin können Nervenzellen, je nachdem an welchem Ort sie sich im Nervensystem befinden, als präganglionäre oder postganglio- näre Nervenzellen sowie als Zwischennervenzellen des Inter- neurons kultiviert werden. Weitere Zellen, die erfindungs- gemäß als Nervenzellen definiert werden, sind unter anderem amakrine Zellen, Horizontalzellen, Bipolare, GOLGI-Zellen, PURKINJE-Zellen, Motoneurons, Haar-, Pyramiden- und/oder Korbzellen. Amakrine Zellen im Sinne der Erfindung sind multipolare Nervenzellen, insbesondere in der inneren Kδr- nerschicht der Netzhaut des Auges, die kurze Fortsätze besitzen. Horizontalzellen sind Zellen, die mit ihren kernhaltigen Zellkörpern in der inneren Körnerschicht der Netzhaut gelegene Interneuronen der Sehbahn darstellen. Zu den Horizontalzellen können auch die CAJAL-Zellen gehören, die vereinzelt in der oberflächlichsten Großhirnrindenschicht vorkommen und kleine spindelförmige Nervenzellen mit langen horizontal ausgerichteten Fortsätzen sind. Bei den Bipolarzellen oder den bipolaren Neuronen handelt es sich um Nervenzellen mit zwei getrennt abgehenden Fortsätzen, wie sie beispielsweise in den Ganglien des Innenohrs und der Netzhaut vorkommen. GOLGI-Zellen im Sinne der Erfindung sind große Körnerzellen der Kleinhirnrinde mit kurzen Neuriten bzw. Zellen, die unter dem Begriff Cellulae .axiramificatae zu subsumieren sind. PURKINJE-Zellen im Sinne der Erfindung sind große, birnenförmige Nervenzellen im Stratum ganglio- sum der Kleinhirnrinde mit je zwei bis drei senkrecht in die Molekularschicht aufsteigenden und sich dort in einer Ebene verzweigenden Dendriten und den ins Kleinhirnmark absteigenden Neuriten. Als Motoneuron wird das letzte Neuron in der efferenten Innervation der Skelettmuskulatur verstanden, wobei diese aus einer im Vorderhirn des Rückenmarks gelegenen Ganglienzelle und dem Neuriten, der die Nervenzellen innerviert, bestehen. Das Motoneuron bildet eine motorische Einheit des Skelettmuskels und besteht aus einem Alpha-Motoneuron mit allen von diesem Neuron inner- vierten Muskelfasern, wobei jede Muskelfaser nur eine motorische Endplatte besitzt. Als Haarzellen werden Hδrzellen des CORTI verstanden. Es handelt sich hierbei um mit Hörhaaren versehene sekundäre Sinnenzellen zwischen den Stütz- zellen des CORTI-Organes des Innenohres. Sie enden synap- tisch an den Dendriten der bipolaren Ganglienzellen des Ganglion spirale. Pyramidenzellen im Sinne der Erfindung sind pyramidenförmige, multipolare Nervenzellen der Großhirnrinde, deren Spitzendendriten in die Molekularschicht 5. aufsteigen, während sich die kürzeren von den Basisecken horizontal verästeln und deren Neuriten von der Zellbasis markwarts ziehen. Korbzellen im Sinne der Erfindung sind sternförmige Nervenzellen in der Molekularschicht des Kleinhirns, deren reichliche von ihren Neuriten gebildete 0 Verzweigungen als Korbfasern die PURKINJE-Zellen umflechten.It is of course also possible to add cholesterol with the aid of carrier molecules which increase the solubility, for example natural or artificial lipoproteins such as cyclodextrins. It is also possible to increase the cholesterol content by molecules that stimulate cholesterol synthesis, such as secondary messenger substances that increase the activity of cholesterol synthesis by key enzymes. Furthermore, the cholesterol uptake can be increased by molecules which mediate the density of lipoprotein receptors or the intracellular processing of lipoproteins in the cell. Also through the use of those known to the skilled person Molecules that inhibit cholesterol release from the nerve cells, for example by molecules that inhibit the release of lipoproteins, increase the concentration of cholesterol in the nerve cells. For example, the synthesis of steroids or bile substances that are converted from cholesterol can be inhibited by specific molecules, as a result of which cholesterol is not broken down and a high cholesterol content in the culture medium or in the nerve cell can thus be maintained. The nerve cells that are cultivated in the culture medium according to the invention can be nerve cells from animals or humans. For example, it is possible for adentritic nerve cells or apolar nerve cells, which are non-continuous, or bipolar nerve cells, as sensitive or sensory nerve cells, each with a polar dendrite and neurite, as occurs, for example, as granule cells of the retina, or multipolar nerve cells with several Dendrites and a long or short neurite, as motor cells of the animal and autonomic nervous system, are cultivated. Furthermore, polyneuritic nerve cells with several neurites, for example as a CAJAL cell of the cerebral cortex or pseudo-unipolar nerve cells, as they occur in sensitive head and spinal cord ganglia, or also unipolar nerve cells, in which two lentils are apparently merged into one, such as they occur, for example, in rod and cone olfactory cells. Furthermore, it is of course also possible to cultivate neurosecretory nerve cells, such as can be obtained from the hypothalamus, for example, or to cultivate neuromelanocytes. Depending on where they are in the nervous system, nerve cells can also be cultured as preganglionic or postganglionic nerve cells and as intermediate nerve cells of the inter-neuron. Other cells that are defined according to the invention as nerve cells include amacrine cells, horizontal cells, bipolar cells, GOLGI cells, PURKINJE cells, motor neurons, hair, pyramid and / or basket cells. Amacrine cells in the sense of the invention are multipolar nerve cells, in particular in the inner granular layer of the retina of the eye, which have short extensions. Horizontal cells are cells that, with their nucleated cell bodies, represent internal neurons of the visual pathway located in the inner granular layer of the retina. The horizontal cells can also include the CAJAL cells, which are isolated in the most superficial layer of the cerebral cortex and are small spindle-shaped nerve cells with long, horizontally oriented processes. The bipolar cells or the bipolar neurons are nerve cells with two separate outgoing processes, as they occur, for example, in the ganglia of the inner ear and the retina. GOLGI cells in the sense of the invention are large granule cells of the cerebellar cortex with short neurites or cells, which are subsumed under the term Cellulae .axiramificatae. PURKINJE cells in the sense of the invention are large, pear-shaped nerve cells in the stratum gangliosum of the cerebellar cortex, each with two to three dendrites rising vertically into the molecular layer and branching there in one plane and the neurites descending into the cerebellar medulla. The motor neuron is understood to be the last neuron in the efferent innervation of the skeletal muscles, which consist of a ganglion cell located in the forebrain of the spinal cord and the neurite that innervates the nerve cells. The motor neuron forms a motor unit of the skeletal muscle and consists of an alpha motor neuron with all muscle fibers within this neuron, whereby each muscle fiber has only one motor end plate. Hair cells from CORTI are understood as hair cells. These are secondary sensory cells with hearing hair between the supporting cells of the CORTI organ of the inner ear. They end up synap- table at the dendrites of the bipolar ganglion cells of the ganglion spiral. Pyramid cells in the sense of the invention are pyramid-shaped, multipolar nerve cells of the cerebral cortex, the tip dendrites of which rise up into the molecular layer 5, while the shorter branches branch horizontally and the neurites pull from the cell base to the marrow. Basket cells in the sense of the invention are star-shaped nerve cells in the molecular layer of the cerebellum, the plentiful branches formed by their neurites as basket fibers braid the PURKINJE cells.
Das erfindungsgemäße Kulturmedium kann sowohl bei Primärkulturen als auch bei sekundären Zellen wie auch bei Zell- 5 linien von Nervenzellen zum Einsatz kommen. Die Nervenzellen können erfindungsgemäß als einzelne Zellen oder als Gewebekultur in dem erfindungsgemäßen Kulturmedium kultiviert werden, wobei der Begriff "kultiviert werden" das weitest- gehende Aufrechterhalten physiologischer Prozesse von Ner- 0 venzellen und Geweben aus Nervenzellen insbesondere außerhalb des Körpers beschreibt. Der Vorteil des in vitro methodischen Ansatzes besteht in der Reduktion der komplexen in vivo Situation, insbesondere durch die Reduktion oder den Verzicht von Serum und/oder Gliazellen in dem Kulturme- 5 dium. Dies vereinfacht die Analyse von Nervenzellen-relevanten Prozessen. Die Zeil- und Gewebekulturen aus Nervenzellen umfassen alle unterschiedlichen ModellSysteme, die aus Nervenzellen, Nervengewebe oder Organen, die im Wesentlichen Nervenzellen umfassen, bestehen. Die Physiologie 0 dieser ganzen Organe, wie beispielsweise einem Kleinhirn oder Kleinhirnschnitten, kann z.B. durch Perfusion aufrechterhalten werden. Die Größe einzelner Nervenzellen- Gewebestücke, die Explantatkulturen bilden können, wird in vitro durch die Diffusionsstrecken bzw. -zeiten begrenzt. 5 Dieses Problem der Diffusion kann vorteilhafterweise durch die komplette Desintegration von Geweben in einzelne Zellen umgangen werden. Solche zweidimensionalen Dissoziationskulturen sind sehr gut als leicht zugängliche Testsysteme geeignet. Weiterhin ist es selbstverständlich möglich, orga- notypische Schnittkulturen aus Geweben, die im Wesentlichen Nervenzellen umfassen, anzulegen, in denen die gewebstypi- sche 3D-Interaktion vorteilhafterweise beibehalten wird. Bei den organotypischen Schnittkulturen wird die Schnitt- dicke und -richtung durch einen Bereich des zentralen Ner- ensystems (ZNS) beispielsweise so gewählt, dass die Aufrechterhaltung zellulärer Funktionen durch Diffusion sichergestellt ist und gleichzeitig die gewebstypische Konnektivität der Neuronen vorteilhafterweise zumindest teilweise erhalten bleibt. Dieses System ist in vielen Aspekten mit der physiologischen Situation vergleichbar. Durch die weitestgehende Abwesenheit von Gliazellen kann jedoch beispielsweise die Wechselwirkung von Substanzen, wie beispielsweise Arzneimitteln, insbesondere mit den Nervenzellen bzw. mit einem Verband von Nervenzellen analysiert wer- den. Durch die Verwendung von im Wesentlichen Serum-freien Medien ist die Interpretation bzw. Reproduktion der experimentellen Ergebnisse vorteilhafterweise vereinfacht. Das Serum- und/oder Gliazellen-freie Medium kann beispielsweise essentielle Moleküle, wie beispielsweise Insulin, Proge- steron, Putrescin und andere umfassen.The culture medium according to the invention can be used both in primary cultures and also in secondary cells as well as in cell lines of nerve cells. According to the invention, the nerve cells can be cultivated as individual cells or as tissue culture in the culture medium according to the invention, the term “being cultivated” describing the largely maintaining physiological processes of nerve cells and tissues from nerve cells, in particular outside the body. The advantage of the in vitro methodological approach is the reduction of the complex in vivo situation, in particular by reducing or dispensing with serum and / or glial cells in the culture medium. This simplifies the analysis of processes relevant to nerve cells. The cell and tissue cultures from nerve cells encompass all different model systems that consist of nerve cells, nerve tissue or organs that essentially comprise nerve cells. The physiology of these entire organs, such as a cerebellum or cerebellar sections, can be maintained, for example, by perfusion. The size of individual pieces of nerve cell tissue that can form explant cultures is limited in vitro by the diffusion distances or times. 5 This problem of diffusion can advantageously be solved by the complete disintegration of tissues into individual cells can be avoided. Such two-dimensional dissociation cultures are very well suited as easily accessible test systems. Furthermore, it is of course possible to create organ-typical cut cultures from tissues, which essentially comprise nerve cells, in which the tissue-typical 3D interaction is advantageously retained. In the case of organotypic sectional cultures, the section thickness and direction are selected by an area of the central nervous system (CNS), for example, in such a way that the maintenance of cellular functions is ensured by diffusion and at the same time the tissue-typical connectivity of the neurons is advantageously at least partially preserved. In many respects, this system is comparable to the physiological situation. Due to the largely absence of glial cells, however, the interaction of substances, such as drugs, for example, in particular with the nerve cells or with an association of nerve cells, can be analyzed. By using essentially serum-free media, the interpretation or reproduction of the experimental results is advantageously simplified. The serum and / or glial cell-free medium can comprise, for example, essential molecules such as insulin, progesterone, putrescine and others.
Primärkulturen bezeichnen erfindungsgemäß Kulturen, die sich direkt vom Gewebe ableiten bzw. Nervenzellen darstellen, die direkt aus dem Organismus entnommen wurden. Han- delt es sich hierbei um Nervenzellen bzw. Vorläufernervenzellen, die noch die Fähigkeit der Teilung besitzen, spricht man erfindungsgemäß von sekundären Zellen. Teilungsfähigkeit kann beispielsweise bei embryonalen oder frühen postnatalen Zellen bzw. von Nervenzellen, die spezi- fisch behandelt wurden, gegeben sein und übersteigt dann in der Regel die Teilungsfähigkeit der adulten Zellen. Primäre Kulturen sind von Zelllinien zu unterscheiden, die durch eine proliferative Kapazität definiert sind. Solche Nervenzelllinien werden entweder durch gentechnische Modifikation primärer oder sekundärer Zellen gewonnen oder aber durch Dissoziation von gesundem oder entartetem Gewebe, das im Wesentlichen aus Nervenzellen besteht. Es ist beispielsweise möglich, dem Kulturmedium Moleküle zuzusetzen, die eine enge Bindung der Nervenzellen an die Kulturschale ermögli- chen, da dies eine Voraussetzung für die Bildung neuronaler Fortsätze sein kann. Verschiedene dem Fachmann bekannte Moleküle der • extrazellulären Matrix - wie zum Beispiel Lami- nin oder Fibronectin - stimulieren die Fortsatzbildung als „neurite-promoting factors" und können daher für die Be- Schichtung von Kulturgefäßen verwendet werden. Während Moleküle der extrazellulären Matrix die Fortsatzbildung vorteilhafterweise modulieren, können weitere neurotrophe Faktoren, wie zum Beispiel der Nervenwachstumsfaktor, der ci- liarneurotrophe Faktor, oder der Fibroblasten- wachstumsfaktor-2, die physiologischen Vorgängen der Neuronen bzw. Nervenzellen in der Kultur weiter optimieren. Mit den so kultivierten Primärkulturen, sekundären Zellen bzw. Zelllinien können durch die Abwesenheit von Serum oder Gliazellen zahlreiche biochemische, klinische und/oder me- dizinische Fragestellungen analysiert werden. Es ist jedoch auch möglich, Nervenzellen als Ersatz für zerstörtes Nervenzellgewebe - beispielsweise bei Alzheimer oder Parkinson - zu gewinnen.According to the invention, primary cultures refer to cultures which are derived directly from the tissue or represent nerve cells which have been taken directly from the organism. If these are nerve cells or precursor nerve cells that still have the ability to divide, one speaks according to the invention of secondary cells. The ability to divide can exist, for example, in the case of embryonic or early postnatal cells or of nerve cells which have been treated specifically and then exceeds in usually the ability of the adult cells to divide. Primary cultures are to be distinguished from cell lines that are defined by proliferative capacity. Such nerve cell lines are obtained either by genetic modification of primary or secondary cells or by dissociation of healthy or degenerate tissue, which essentially consists of nerve cells. For example, it is possible to add molecules to the culture medium which enable the nerve cells to bind tightly to the culture dish, since this can be a prerequisite for the formation of neuronal processes. Various molecules of the extracellular matrix known to the person skilled in the art - such as, for example, laminin or fibronectin - stimulate the process of extension as "neurite-promoting factors" and can therefore be used for the coating of culture vessels. While molecules of the extracellular matrix advantageously process the process of formation modulate, further neurotrophic factors, such as the nerve growth factor, the ciliary neurotrophic factor, or the fibroblast growth factor-2, can further optimize the physiological processes of the neurons or nerve cells in the culture, with the cultivated primary cultures, secondary cells or Due to the absence of serum or glial cells, numerous biochemical, clinical and / or medical questions can be analyzed, but it is also possible to obtain nerve cells as a replacement for destroyed nerve cell tissue - for example in Alzheimer's or Parkinson's.
Beispielsweise regulieren in vivo neurotrophe Faktoren während der Ontogenese das Ausmaß des physiologischen Neurontodes . Der ontogenetische Neurontod bezeichnet einen physiologischen Prozess, bei dem zuvor im Überschuss produzierte Neuronen absterben. Dieser Prozess dient unter ande- rem dazu, flexibel eine für das spätere normale Funktionie- ren des wachsenden Organismus ausreichende Zahl von Nervenzellen bereitzustellen. Da neurodegenerative Erkrankungen durch den Verlust von Nervenzellen gekennzeichnet sind, wird .die..Regulation neurotropher Faktoren im Erwachsenenal- ter intensiv untersucht . Da neurotrophe Faktoren das Überleben von Nervenzellen stimulieren, sind diese Faktoren darüber hinaus für neue therapeutische Strategien von Nervensystemerkrankungen und/oder Nervensystemverletzungen von Bedeutung. Insbesondere die genaue Analyse der genannten physiologischen Prozesse macht es erforderlich, in Abwesenheit von Gliazellen und/oder Seren zu forschen, da die genannten bisherigen Kulturmedien-Bestandteile die Ergebnisse zum einen verfälschen bzw. schwerer reproduzierbar gestalten.For example, in vivo neurotrophic factors regulate the extent of physiological neuron death during ontogenesis. Ontogenetic neuron death is a physiological process in which neurons previously produced in excess die. Among other things, this process serves to flexibly to provide sufficient numbers of nerve cells for the growing organism. Since neurodegenerative diseases are characterized by the loss of nerve cells, the regulation of neurotrophic factors in adulthood is being intensively investigated. Since neurotrophic factors stimulate the survival of nerve cells, these factors are also important for new therapeutic strategies for nervous system diseases and / or nervous system injuries. In particular, the exact analysis of the above-mentioned physiological processes makes it necessary to conduct research in the absence of glial cells and / or sera, since the above-mentioned culture media components on the one hand falsify the results or make them more difficult to reproduce.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Kulturmedium Cholesterin, Cholesterin-Derivate, Chole- sterin-Analoga, Cholesterin-Vorläufer. und/oder. Cholesterin- fördernde Stoffe in einer Konzentration von 0,5 - 50 μg/ml, bevorzugt von 2 - 10 μg/ml, ganz besonders bevorzugt 3 - 7 μg/ml. Die Konzentration bezieht sich erfindungsgemäß im Wesentlichen auf die Konzentration an Cholesterin bzw. gleichwirkenden Cholesterin-Derivaten und/oder Cholesterin- Analoga, die in dem Kulturmedium in Wechselwirkung mit den Nervenzellen stehen. Selbstverständlich bezieht sich die genannte Konzentration im Falle der Cholesterin-Vorläufer und/oder Cholesterin-fördernden Stoffe auf den durch diese Substanzen zu erzielenden Cholesteringehalt in dem Kulturmedium, was dem Fachmann aufgrund seiner Erkenntnisse in der Zeil- und Kultivierungsbiologie bekannt ist. Im Falle der Cholesterin-fördernden Stoffe, das heißt von Stoffen, die die Cholesterinsynthese/-Aufnahmen aktivieren, ist die Konzentration durch Routinenversuche so zu wählen, dass in dem Kulturmedium eine Cholesterinkonzentration von 0,5 - 50 μg/ml detektierbar ist. Es ist selbstverständlich möglich, dass die Konzentration der Cholesterin-Vorläufer bzw. Cholesterin-fördernden Stoffe im Bereich von 0,5 - 50 μg/ml liegen kann und durch derartige Substanzen eine Konzentration von 0,5 - 50 μg/ml Cholesterin, Cholesterin-Derivaten und/oder Cholesterin-Analoga in dem Kulturmedium erzielt werden kann. Selbstverständlich kann jeder Bereich innerhalb der Konzentration von 0,5 - 50 μg/ml geeignet sein, um für die vielfältigen, oben genannten Nervenzellen ein optimales Kulturmedium zu bilden; das heißt, die Angabe der Konzentration bezieht sich auf jeden innerhalb der genannten Grenzwerte möglichen Wert.In a preferred embodiment of the invention, the culture medium comprises cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogs, cholesterol precursors. and or. Cholesterol-promoting substances in a concentration of 0.5-50 μg / ml, preferably 2-10 μg / ml, very particularly preferably 3-7 μg / ml. According to the invention, the concentration essentially relates to the concentration of cholesterol or equivalent cholesterol derivatives and / or cholesterol analogues which interact in the culture medium with the nerve cells. Of course, the concentration mentioned in the case of the cholesterol precursors and / or cholesterol-promoting substances relates to the cholesterol content in the culture medium which can be achieved by these substances, which is known to the person skilled in the art on the basis of his findings in cell and cultivation biology. In the case of cholesterol-promoting substances, that is to say substances which activate cholesterol synthesis / uptake, the concentration is to be selected by routine experimentation in such a way that a cholesterol concentration of 0.5-50 μg / ml can be detected in the culture medium. Of course it is possible that the concentration of the cholesterol precursors or cholesterol-promoting substances can be in the range of 0.5-50 μg / ml and, due to such substances, a concentration of 0.5-50 μg / ml cholesterol, cholesterol derivatives and / or cholesterol -Analogues in the culture medium can be achieved. Of course, every range within the concentration of 0.5 - 50 μg / ml can be suitable in order to form an optimal culture medium for the various nerve cells mentioned above; that is, the indication of the concentration relates to every possible value within the stated limit values.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Kulturmedium als Cholesterin-fördernde Moleküle solche, die den Cholesteringehalt in der Zelle erhöhen. Cholesterin-fördernde Stoffe können Moleküle sein, die auf chemischem Wege durch Synthese im Kulturmedium den Cholesteringehalt erhöhen, bevorzugt sind Moleküle, die den Cholesteringehalt direkt in den Nervenzellen erhöhen. Es kann sich beispielsweise um Substanzen handeln, die die Aufnahme von Cholesterin durch die Membran der Nervenzelle verbessern und somit erhöhen oder auch um Moleküle aus dem Berech der Gentechnik, die die Cholesterin-Synthese innerhalb der Nervenzellen verbessern, beispielsweise um Promotoren, die Enzymen-codierenden Nukleinsäure-Sequenzen vorgeschaltet sind, die mit der Cholesterin-Synthese bzw. dem Transport von Cholesterin innerhalb der Nervenzellen assoziiert sind. Es kann sich hierbei beispielsweise um Moleküle handeln, die die Transkription des Gens für die 3-Hydroxy-3- methylglutaryl-CoA-Reduktase fördern bzw. um Moleküle, die auf DNA- oder Proteinebene mit der physiologischen oder pa- thophysiologischen Wirkung des LDL-Rezeptors assoziiert sind. Selbstverständlich kann es sich auch um Stoffe handeln, die die Umwandlung von Cholesterin in Gestagene, Glu- cokortikoide, Mineralokortikoide, Androgene und/oder Östro- gene inhibieren.In a further preferred embodiment of the invention, the culture medium, as cholesterol-promoting molecules, comprises those which increase the cholesterol content in the cell. Cholesterol-promoting substances can be molecules which chemically increase the cholesterol content by synthesis in the culture medium; preferred are molecules which increase the cholesterol content directly in the nerve cells. For example, they can be substances which improve and thus increase the absorption of cholesterol through the membrane of the nerve cell or also molecules from the calculation of genetic engineering which improve the cholesterol synthesis within the nerve cells, for example promoters which encode enzymes Nucleic acid sequences are connected upstream, which are associated with the cholesterol synthesis or the transport of cholesterol within the nerve cells. For example, these can be molecules which promote the transcription of the gene for the 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase or molecules which on the DNA or protein level have the physiological or pathophysiological effect of the LDL- Receptor are associated. Of course, it can also be substances that convert cholesterol into progestogens, gluc Inhibit cocorticoids, mineralocorticoids, androgens and / or estrogens.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin- d ng sind die Cholesterin-fördernden Stoffe Moleküle, die durch Stimulation der Synthese, durch Aufnahme und/oder Hemmung der Speicherung des Abbaus und/oder der Freisetzung von Cholesterin den Cholesteringehalt der Nervenzellen erhöhen. Mit Vorteil ist es möglich, die Konzentration an Cholesterin in den Nervenzellen durch Moleküle zu erhöhen, die die Endozytose bzw. Pinozytose von Cholesterin durch die Nervenzellen erhöhen. Dem Fachmann sind verschiedene Moleküle und/oder Substanzen bekannt, die diese Art der Substrataufnahme initiieren bzw. steigern. Weiterhin ist es insbesondere möglich, durch Steigerung der Aktivität des Apolipoprotein-E-Gens oder des Gens, • welches für die 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-Reduktase kodiert, zu steigern. Es ist jedoch auch möglich, diese Steigerung auf der Peptid- bzw. Proteinebene zu erzielen. Weiterhin ist es möglich, die Anwesenheit der LDL-Rezeptoren auf oder in den Nervenzellen so zu optimieren, dass der Cholesteringehalt in oder an den Zellen erhöht wird. Ferner können beispielsweise Substanzen, die als Zielmolekül für Gallensäure fungieren, beispielsweise das Protein FXR, optimiert werden. Durch die Stimulierung von FXR kann der Abbau von Cholesterin in den Nervenzellen verlangsamt bzw. vollständig blok- kiert werden. Sämtliche Moleküle, die mit der Umwandlung von Cholesterin und anderen Substanzen bzw. mit der Umwandlung von Vorläufermolekülen in Cholesterin assoziiert sind, können erfindungsgemäß verwendet werden, um den Cholesteringehalt in oder an den Nervenzellen zu erhöhen. Auch durch die Hemmung der Speicherung des Cholesterins kann der Anteil des frei verfügbaren Cholesterins an der Nervenzelle erhöht werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, durch den Einsatz von Lipoproteinen und/oder Beta- Methylcyklodextrin den Cholesteringehalt in den Nervenzellen zu erhöhen.According to a further preferred embodiment of the invention, the cholesterol-promoting substances are molecules which increase the cholesterol content of the nerve cells by stimulating the synthesis, by absorbing and / or inhibiting the storage of the breakdown and / or the release of cholesterol. It is advantageously possible to increase the concentration of cholesterol in the nerve cells by means of molecules which increase the endocytosis or pinocytosis of cholesterol by the nerve cells. Various molecules and / or substances which initiate or increase this type of substrate uptake are known to the person skilled in the art. Furthermore, it is possible in particular • encoding by increasing the activity of the apolipoprotein E gene or the gene for the 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase to increase. However, it is also possible to achieve this increase at the peptide or protein level. It is also possible to optimize the presence of the LDL receptors on or in the nerve cells so that the cholesterol content in or on the cells is increased. Furthermore, for example substances that act as target molecules for bile acid, for example the protein FXR, can be optimized. By stimulating FXR, the breakdown of cholesterol in the nerve cells can be slowed down or completely blocked. All molecules which are associated with the conversion of cholesterol and other substances or with the conversion of precursor molecules into cholesterol can be used according to the invention to increase the cholesterol content in or on the nerve cells. The proportion of freely available cholesterol in the nerve cell can also be increased by inhibiting the storage of cholesterol. Of course, it is also possible to use lipoproteins and / or beta Methylcyclodextrin increases cholesterol in nerve cells.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfin- düng sind die Cholesterin-Vorläufer die Biosynthese von Cholesterin bewirkenden Stoffe. Mevalonsäure, Squalen und Lanosterin bzw. Rezeptoren oder Transportproteine, die mit der Biosynthese von Cholesterin assoziiert sind, sind Cholesterin-Vorläufer im Sinne der Erfindung. Selbstverständ- lieh können auch Amine, Kalzium oder andere Substanzen, die katalytisch oder anders in die Biosynthese von Cholesterin eingreifen können und diese fördern, im Zusammenhang mit Cholesterin-Vorläufern eingesetzt werden.In a further advantageous embodiment of the invention, the cholesterol precursors are the biosynthesis of substances which cause cholesterol. Mevalonic acid, squalene and lanosterol or receptors or transport proteins, which are associated with the biosynthesis of cholesterol, are cholesterol precursors in the sense of the invention. It goes without saying that amines, calcium or other substances which can intervene catalytically or otherwise in the biosynthesis of cholesterol and promote it can also be used in connection with cholesterol precursors.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Cholesterin-Derivate Cholesterinester und/oder Cholesterinsalze . Vorteilhafterweise kann Cholesterin als einwertiger sekundärer Alkohol Ester bilden. Erfindungsgemäß kann es sich beispielsweise um die Cholesterinester der Öl-, Palmitin-, Stearin-, Benzoe- oder Zimtsäure oder alle anderen Verbindungen handeln, die mit Cholesterin Ester bilden können. Bevorzugt ist weiterhin die Verwendung von Cholesterinsalzen, wie z.B. Cholesterinsulfat und andere.In a further preferred embodiment of the invention, the cholesterol derivatives are cholesterol esters and / or cholesterol salts. Advantageously, cholesterol as a monohydric secondary alcohol can form esters. According to the invention, it can be, for example, the cholesterol esters of oleic, palmitic, stearic, benzoic or cinnamic acid or all other compounds which can form esters with cholesterol. The use of cholesterol salts, such as e.g. Cholesterol sulfate and others.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Nervenzellkulturmedium zusätzlich eine Nervenzellkultur, wobei der Begriff Nervenzeil- kultur primäre Nervenzellen genauso wie sekundäre Nervenzellen umfasst.In a further preferred embodiment of the invention, the nerve cell culture medium according to the invention additionally comprises a nerve cell culture, the term nerve cell culture encompassing primary nerve cells as well as secondary nerve cells.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Kulturmediums, wobei man zu einem an sich bekannten Kulturmedium Cholesterin, Cholesterin-Derivate, Cholesterin-Analoga, Cholesterin-Vorläufer und/oder Cholesterin- fördernde Stoffe zusetzt. Die bekannten Kulturmedien können z.B. sein: gepufferte Salz-Lösungen, DMEM-Medien, Alpha- Medien, PRMI und/oder Hanks-Medien.The invention also relates to a method for producing a culture medium, wherein cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogs, cholesterol precursors and / or cholesterol-promoting substances are added to a culture medium known per se. The well-known culture media can eg be: buffered salt solutions, DMEM media, alpha media, PRMI and / or Hanks media.
In einer besonderen Ausführungsform wird als an sich bekanntes Kulturmedium Neurobasalmedium..-eingesetzt . Dieses Neurobasalmedium kann einen B27-Zusatz umfassen. Das Neurobasalmedium kann sowohl als NB"- und/oder NB+-Medium eingesetzt werden, wobei bei dem NB+ -Medium auf BDNF, CNTF oder Forskolin vorteilhafterweise verzichtet werden kann.In a special embodiment, neurobasal medium ..- is used as the known culture medium. This neurobasal medium can include a B27 additive. The neurobasal medium can be used both as NB " and / or NB + medium, it being possible advantageously to dispense with BDNF, CNTF or forskolin in the NB + medium.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Cholesterin, Cholesterin-Derivaten, Cholesterin-Analoga, Cholesterin- Vorläufern und/oder Cholesterin-fördernden Stoffen zur Kultivierung, Proliferation und/oder Differenzierung von Ner- venzellen. Kultivieren bedeutet, dass sich die Nervenzellen insbesondere in einer in vitro Situation befinden. In dieser in vitro Situation können die Nervenzellen als Testsystem für Substanzen oder Arzneimittel verwendet werden oder es können zwei- oder dreidimensionale Nervenzellen, Nerven- zellaggregationen oder -gewebe so kultiviert werden, dass sie als Ersatzzellen oder -gewebe in Organismen, insbesondere dem Menschen, eingesetzt werden, um dort defekte oder fehlende Nervenzellen, insbesondere bei neurogenerativen Erkrankungen, zu ersetzen. Die Proliferation von Nervenzel- len ist die Neubildung, Teilung oder Ausbildung von Fortsätzen der Nervenzellen. Die Differenzierung von Nervenzellen umfasst die Bildung von Nervenzellen aus Stammzellen als auch aus allen anderen Zellen, die poly-, toti- und/oder pluripotent sein können und sich in Nervenzellen umwandeln können. Der Begriff der Differenzierung von Nervenzellen bezieht sich aber auch auf die Ausbildung von amakrinen Zellen, Horizontalzellen, Bipolarzellen, GOLGI- Zellen, Purkinje-Zellen, Motoneuronen, Haar-, Pyramiden- und/oder Korbzellen und anderen aus ihren Vorlauferzellen. Selbstverständlich ist es möglich, Cholesterin, Cholesterin-Derivate, Cholesterin-Analoga, Cholesterin-Vorläufer und/oder Cholesterin-fördernde Stoffe auch in einer in vivo Situation einzusetzen, um die Differenzierung und/oder Pro- liferation von Nervenzellen zu initiieren oder zu fördern. Weiterhin ist es mit Vorteil möglich, einen physiologischen Zustand der Nervenzelle in vivo oder in vitro durch die Verwendung der genannten Cholesterinmoleküle, Cholesterin- Vorläufer oder Cholesterin-fördernden Stoffe zu fördern oder zu stabilisieren. Die Verwendung dieser Substanzen kann in Verbindung mit anderen Stoffen erfolgen; so ist es beispielsweise möglich, einem zunächst Serum- oder Gliazellen-freien Kulturmedium in bestimmten Zeitintervallen Serumbestandteile, Serum, Gliazellen-Fragmente oder ■ voll- ständige Gliazellen zuzusetzen, um den Einfluss dieser Strukturen auf das Nervenzellwachstum, die Differenzierung und/oder Proliferation zu untersuchen. Die Nervenzellen können somit insbesondere isoliert- und/oder assoziiert mit anderen Zellen kultiviert oder in vivo mit Cholesterin, Cholesterin-Derivaten, Cholesterin-Analoga, Cholesterin- Vorläufern und/oder Cholesterin-fördernden Stoffen in Kontakt gebracht werde .The invention also relates to the use of cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogs, cholesterol precursors and / or cholesterol-promoting substances for the cultivation, proliferation and / or differentiation of nerve cells. Cultivating means that the nerve cells are particularly in an in vitro situation. In this in vitro situation, the nerve cells can be used as a test system for substances or drugs, or two- or three-dimensional nerve cells, nerve cell aggregations or tissues can be cultivated in such a way that they are used as replacement cells or tissues in organisms, in particular humans to replace defective or missing nerve cells, especially in the case of neurogenerative diseases. The proliferation of nerve cells is the new formation, division or formation of processes of the nerve cells. The differentiation of nerve cells includes the formation of nerve cells from stem cells as well as from all other cells that can be poly-, toti- and / or pluripotent and can convert into nerve cells. The term differentiation of nerve cells also refers to the formation of amacrine cells, horizontal cells, bipolar cells, GOLGI cells, Purkinje cells, motor neurons, hair, pyramid and / or basket cells and others from their progenitor cells. Of course, it is also possible to use cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogs, cholesterol precursors and / or cholesterol-promoting substances in an in vivo situation in order to initiate or promote the differentiation and / or proliferation of nerve cells. Furthermore, it is advantageously possible to promote or stabilize a physiological state of the nerve cell in vivo or in vitro by using the aforementioned cholesterol molecules, cholesterol precursors or cholesterol-promoting substances. These substances can be used in conjunction with other substances; so it is possible, for example, a first serum or glial cell-free culture medium at certain time intervals serum components, serum glial fragments or add ■ fully continuous glial cells in order to investigate the influence of these structures on the nerve cell growth, differentiation and / or proliferation , The nerve cells can thus be cultivated in particular in isolation and / or in association with other cells or brought into contact with cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogs, cholesterol precursors and / or cholesterol-promoting substances in vivo.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungs- gemäßen Kulturmediums zur Testung von Wirkstoffen zur Behandlung oder Prophylaxe neurodegenerativer Erkrankungen. Vorteilhafterweise ist die genaue Zusammensetzung des Kulturmediums aufgrund des Verzichtes von Gliazellen und/oder Serum bekannt, so dass bei dem Einsatz verschiedener Wirk- Stoffe eine Änderung der Proliferation und/oder der Differenzierung oder anderer Parameter der Nervenzellen in direktem Zusammenhang mit dem Einsatz des Wirkstoffes analysiert werden kann. Selbstverständlich ist es möglich, gezielt Gliazellen und/oder Serum dem Medium zuzusetzen, um durch eine Parallelanalyse festzustellen, welche Wirkstoffe direkt auf die Nervenzellen und welche indirekt über Stimulierung der Gliazellen oder eine Modifikation des Serums eine Veränderung der Nervenzellen bewirken.The invention also relates to the use of the culture medium according to the invention for testing active substances for the treatment or prophylaxis of neurodegenerative diseases. The exact composition of the culture medium is advantageously known due to the absence of glial cells and / or serum, so that when different active substances are used, a change in proliferation and / or differentiation or other parameters of the nerve cells is analyzed in direct connection with the use of the active substance can be. Of course, it is possible to specifically add glial cells and / or serum to the medium in order to determine which active ingredients by means of a parallel analysis directly on the nerve cells and which indirectly change the nerve cells by stimulating the glial cells or modifying the serum.
Die Erfindung betrifft auch Gliazellen- und/oder Serumfreie Nervenkulturen, die in einem erfindungsgemäßen Kulturmedium kultivierbar sind. Die erfindungsgemäßen Nervenzellkulturen sind vorteilhafterweise entweder so isoliert, dass sie keine Gliazellen umfassen bzw. keine Bestandteile von Seren. Die isolierten Nervenzellkulturen, das heißt Gliazellen-freien Zellkulturen, können für verschiedene Verwendungen eingesetzt werden, so z.B. als Ersatzmaterial für Nervenzellläsionen im lebenden Organismus.The invention also relates to glial cell and / or serum-free nerve cultures which can be cultivated in a culture medium according to the invention. The nerve cell cultures according to the invention are advantageously either isolated in such a way that they do not comprise glial cells or no constituents of sera. The isolated nerve cell cultures, i.e. glial cell-free cell cultures, can be used for various uses, e.g. as a substitute for nerve cell lesions in the living organism.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nervenzellkultur zur Testung von Wirkstoffen zur Behandlung oder Prophylaxe neurodegenerativer Erkrankungen. Die isolierten. Nervenzellkulturen können zur .direkten Testung von Wirkstoffen eingesetzt werden, da sie keine Zellen umfassen, mit denen die Nervenzellen im lebenden Organismus assoziiert sind, wie z.B. Gliazellen.The invention also relates to the use of the nerve cell culture according to the invention for testing active substances for the treatment or prophylaxis of neurodegenerative diseases. The isolated. Nerve cell cultures can be used for the direct testing of active substances, since they do not comprise any cells with which the nerve cells are associated in the living organism, e.g. Glial cells.
Die Erfindung soll nachfolgend an einem Beispiel näher erläutert werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu sein.The invention will be explained in more detail below using an example, without being limited to this example.
Beispielexample
1. Nervenzellen wurden durch Immunopanning aus dem Hippo- kampus postnataler Mäuse isoliert, auf Kulturschalen ausplattiert und dann in Kulturmedien mit unterschiedlicher Zusammensetzung kultiviert. Nach verschiedenen Zeiträumen wurde ihre Überlebensrate unter den jeweiligen Kulturbedingungen mit Hilfe von MTT-Tests bestimmt. Abb. 1 fasst die Ergebnisse bei verschiedener Zusammensetzung der getesteten Medien zusammen.1. Nerve cells were isolated from the hippocampus of postnatal mice by immunopanning, plated on culture dishes and then cultivated in culture media with different compositions. After various periods of time, their survival rate under the respective culture conditions was determined using MTT tests. Fig. 1 summarizes the Results with different composition of the media tested together.
2. Bisherige Untersuchungen hatten gezeigt, dass Nervenzel- • len~:. in einem kommerziell erhältlichen Medium (Neuroba- sal/B27, Fa. Gibco/lnvitrogen) mehrere Wochen kultiviert werden können (Brewer et al . , 1993, J Neurosci Res 35: 567- 76; Brewer, 1995, J Neurosci Res 42: 674-83). Diese Kulturen enthalten allerdings einen bestimmten Anteil an Glia- zellen.2. Previous investigations had shown that nerve cells • : ~ . can be cultivated for several weeks in a commercially available medium (Neurobalsal / B27, Gibco / Invitrogen) (Brewer et al., 1993, J Neurosci Res 35: 567-76; Brewer, 1995, J Neurosci Res 42: 674 -83). However, these cultures contain a certain proportion of glial cells.
Die bei der Erarbeitung der Erfindung durchgeführten Tests zeigten, dass dieses Medium, bestehend aus Neurobasal, B27 sowie Glutamin und Pyruvat (NB") , nicht geeignet war, das Überleben von Hippokampusneuronen unter völlig Glia-freien Bedingungen zu unterstützen: Nach 5 Tagen Kultivierung in NB" lag die Überlebensrate der isolierten Nervenzellen bei 20%. Nach 11-13 Tagen, hingegen konnten keine lebenden Nervenzellen mehr gefunden werden.The tests carried out in the development of the invention showed that this medium, consisting of neurobasal, B27 and glutamine and pyruvate (NB " ), was not suitable for supporting the survival of hippocampal neurons under completely glia-free conditions: after 5 days of cultivation in NB " the survival rate of the isolated nerve cells was 20%. After 11-13 days, however, no living nerve cells could be found.
3. Als nächstes wurde geprüft, ob ein komplexeres Medium (NB+) , welches die Langzeitkultivierung von gereinigten re- tinalen Ganglienzellen unterstützt (Meyer-Franke et al . , 1995, Neuron 15: 805-19), auch das Überleben von isolierten Hippocampus-Neuronen ermöglicht. Es wurde gefunden, dass auch dieses Medium nicht optimal war. Gereinigte Hippokam- pusneurone zeigten eine Überlebensrate von 47% nach 5 Tagen und von lediglich 16% nach 11 - 13 Tagen. NB+ enthält einige Fettsäuren wie Linolensäure, Oleinsäure und in geringen Mengen das Steroidhormon Progesteron, jedoch nicht den essentiellen Membranbestandteil Cholesterin. Es wurde daher getestet, ob der Zusatz von Cholesterin die Überlebensrate gereinigter Hippkampusneurone erhöhte. Zunächst wurde der Effekt unterschiedlicher Cholesterinkonzentrationen auf die Langzeitüberlebensrate der Neurone in NB+ untersucht. Cho- lesterin erhöhte die Überlebensrate der Neurone bei allen getesteten Konzentrationen deutlich gegenüber einer Kultivierung in NB+ (Abb. 1) . Dabei lag die optimale Konzentration bei 5 μg ml"1 Cholesterin. Die Cholesterinzugabe er- möglichte darüber hinaus eine Kultivierung in NB+ ohne die teuren Medienzusätze Forskolin, brain-derived neurotrophxc factor und ciliary neurotrophic factor. In NB+/- F,B, C/+Chol-5 lag die Überebensrate nach 11 - 13 Tagen bei 76% (gegenüber 17% in NB+/-F,B,C). Diese Ergebnisse zeigen, dass unter Glia- und Serum-freien Kulturbedingungen Hippo- kampusneurone auf exogenes Cholesterin angewiesen sind. Es werden Kulturbedingungen vorgeschlagen, welche das Überleben und Wachstum von Nervenzellen ermöglichen, die durch geeignete Isolationsverfahren z.B. vollständig von Gliazel- len abgetrennt worden sind. 3. Next, it was examined whether a more complex medium (NB + ), which supports the long-term cultivation of purified final ganglion cells (Meyer-Franke et al., 1995, Neuron 15: 805-19), also survived isolated hippocampus Neurons. It was found that this medium was also not optimal. Cleaned hippocampal neurons showed a survival rate of 47% after 5 days and only 16% after 11-13 days. NB + contains some fatty acids such as linolenic acid, oleic acid and, in small amounts, the steroid hormone progesterone, but not the essential membrane component cholesterol. It was therefore tested whether the addition of cholesterol increased the survival rate of purified hippocampal neurons. First, the effect of different cholesterol concentrations on the long-term survival rate of the neurons in NB + was examined. Cho lesterin significantly increased the survival rate of the neurons at all concentrations tested compared to cultivation in NB + (Fig. 1). The optimal concentration was 5 μg ml "1 cholesterol. The addition of cholesterol also enabled cultivation in NB + without the expensive media additives forskolin, brain-derived neurotrophxc factor and ciliary neurotrophic factor. In NB + / - F, B, C / + Chol-5 had a survival rate of 76% after 11-13 days (compared to 17% in NB + / -F, B, C) These results show that hippocampal neurons were found under culture and serum-free conditions exogenous cholesterol, culture conditions are proposed which enable the survival and growth of nerve cells which, for example, have been completely separated from glial cells by suitable isolation processes.
Legende zu Fig. 1: Zusammensetzung der getesteten Medien.Legend for Fig. 1: Composition of the media tested.
Figure imgf000022_0001
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Claims

Patentansprüche claims
1. Gliazellen- und/oder Serum-freies Nervenzellkulturme- dium, . dadurch gekennzeichnet, dass es Cholesterin,1. glial cell and / or serum-free nerve cell culture medium,. characterized in that it is cholesterol,
Cholesterin-Derivate, Cholesterin-Analoga, ' Cholesterin-Vorläufer und/oder Cholesterin- fördernde Stoffe umfasst.Cholesterol derivatives, cholesterol analogs, ' cholesterol precursors and / or cholesterol-promoting substances.
2. Kulturmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Cholesterin, Cholesterin-Derivate, Cholesterin- Analoga, Cholesterin-Vorläufer und/oder Cholesterin- fördernde Stoffe in einer Konzentration von 0,5 - 50 μg/ml, bevorzugt von 2 - 10 μg/ml, besonders bevorzugt von 3 - 7 μg/ml umfasst.2. Culture medium according to claim 1, characterized in that it contains cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogs, cholesterol precursors and / or cholesterol-promoting substances in a concentration of 0.5-50 μg / ml, preferably 2-10 μg / ml, particularly preferably from 3 to 7 μg / ml.
3. Kulturmedium nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es als Cholesterin-fördernde Stoffe Moleküle umfasst, die die Stimulation einer Cholesterin- Biosynthese, einer Aufnahme, einer Hemmung der Speicherung, einen Abbau und/oder eine Freisetzung von Cholesterin erhöhen.3. Culture medium according to claim 1 or 2, characterized in that it comprises, as cholesterol-promoting substances, molecules which increase the stimulation of cholesterol biosynthesis, uptake, inhibition of storage, breakdown and / or release of cholesterol.
4. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass Cholesterin-Vorläufer mit der4. Culture medium according to one of claims 1 to 3, characterized in that cholesterol precursor with the
Biosynthese von Cholesterin assoziierte Stoffe sind.Biosynthesis of cholesterol-associated substances.
5. Kulturmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Cholesterin-Derivate Cholesterinester und/oder Cholesterinsalze sind.5. Culture medium according to one of the preceding claims, characterized in that the cholesterol derivatives are cholesterol esters and / or cholesterol salts.
6. Kulturmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eine Nervenzellkultur umfasst . 6. Culture medium according to one of the preceding claims, characterized in that it additionally comprises a nerve cell culture.
7. Verfahren zur Herstellung eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass einem an sich bekannten Kulturmedium Cholesterin, Cholesterin-Derivate,, . Cholesterin-Analoga, Choleste- rin-Vorläufer und/oder . Cholesterin-fördernde Stoffe zugesetzt werden.7. A method for producing a culture medium according to any one of claims 1 to 6, characterized in that a known culture medium cholesterol, cholesterol derivatives ,,. Cholesterol analogs, cholesterol precursors and / or. Cholesterol-promoting substances are added.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als an sich bekanntes Kulturmedium Neurobasal- Medium eingesetzt wird.8. The method according to claim 7, characterized in that neurobasal medium is used as the known culture medium.
9. Verwendung von Cholesterin, Cholesterin-Derivaten, Cholesterin-Analoga, Cholesterin-Vorläufern und/oder Cholesterin- fördernden Stoffen zur Kultivierung, zum Wachstum, zur Proliferation und/oder zur Differenzierung von Nervenzellen.9. Use of cholesterol, cholesterol derivatives, cholesterol analogs, cholesterol precursors and / or cholesterol-promoting substances for the cultivation, growth, proliferation and / or differentiation of nerve cells.
10. Verwendung eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zur. Testung von Wirkstoffen, zur Behand- lung und/oder zur Prophylaxe neurodegenerativer Erkrankungen .10. Use of a culture medium according to one of claims 1 to 6, for. Testing of active substances, for the treatment and / or for the prophylaxis of neurodegenerative diseases.
11. Gliazellen und/oder Serum-freie Nervenzellkultur kultiviert in einem Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 6.11. glial cells and / or serum-free nerve cell culture cultivated in a culture medium according to one of claims 1 to 6.
12. Verwendung einer Nervenzellkultur nach Anspruch 11 zur Testung von Wirkstoffen zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe neurodegenerativer Erkrankungen. 12. Use of a nerve cell culture according to claim 11 for testing active substances for the treatment and / or for the prophylaxis of neurodegenerative diseases.
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